JP6401163B2 - 慢性炎症に伴う疾病の患者の分子表現型の分類方法 - Google Patents
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Description
(B)疾病は開始、進行、すなわち炎症反応の進展と同時に進み、それに関連する破壊及び器官の機能損失を伴う変質(いわゆるリモデリング)が加わる。
(C)疾病は、患者特有の亜表現型の顕著な特徴を呈する。
(D)開始、持続及び破壊及び変質過程には先天性及び後天性免疫が持続的に関与する。先天性免疫の影響(重要な要素:多様な固定集団を有する抗原提示細胞、及び補体系)は、適応免疫系の細胞の活性化と分化とを生じる。
−細胞破壊により溶解物を生成し、
−第1のGATA−3特異抗体及び/又はTbet特異抗体を被覆したマイクロタイタープレートのウェルに溶解物を添加し、
−マイクロタイタープレートを洗浄し、
−マイクロタイタープレートのウェルに第2のGATA−3特異抗体又はTbet特異抗体を添加し、
−マイクロタイタープレートを洗浄し、
−GATA−3タンパク質又はTbetタンパク質を検出し、定量化するステップ。
−GATA−3/Tbetを発現する細胞を全血のその他の細胞成分から単離し、
−細胞を破壊し、細胞間タンパク質/核タンパク質を放出し、
−GATA−3及び/又はTbetの濃度を測定し、
−判明したGATA−3及び/又はTbetの濃度を正規化するステップ。
(i)好適にはFicoll勾配遠心法により白血球を単離し、
(ii)好適にはサイズ排除濾過により白血球を濃縮し、又は、
(iii)好適には磁気ビーズに結合された細胞特異的抗体を用いてTh1細胞/Th2細胞、特にCD4+T細胞を濃縮するステップ。
a)生物学的単離におけるGATA−3遺伝子発現が所定の基準値よりも高く、
b)生物学的単離におけるGATA−3とTbet遺伝子発現との比率が所定の基準値よりも高いこと。
−患者の生物学的単離細胞からタンパク質又はRNAを放出し、
−GATA−3及び/又はTbetのタンパク質又はmRNAの発現レベルを確定し、
−上記のa)又はb)に記載の条件の少なくとも1つが当てはまる場合は、患者をサブグループ「Th2 high」の1つに分類するステップ。
a)生物学的単離におけるGATA−3遺伝子発現が所定の基準値よりも低い場合、
b)生物学的単離におけるGATA−3とTbet遺伝子発現との比率が所定の基準値よりも低い場合。
−患者の生物学的単離細胞からタンパク質又はRNAを放出し、
−GATA−3及び/又はTbetのタンパク質又はmRNAの発現レベルを確定し、
−前述のa)又はb)の条件の少なくとも1つが該当する場合に患者をサブグループ「Th2 low」に分類するステップ。
a)生物学的単離におけるTbet遺伝子発現が所定の基準値よりも高い、
b)生物学的単離におけるTbetと、GATA−3遺伝子発現との比率が所定の基準値よりも高い。
−患者の生物学的単離細胞からタンパク質又はRNAを放出し、
−Tbet及び/又はGATA−3のタンパク質又はmRNAの発現レベルを確定し、
−前述のa)又はb)に記載の条件の少なくとも1つが該当する場合は、患者をサブグループ「Th1 high」の分子表現型に分類するステップ。
a)生物学的単離におけるTbet遺伝子発現が所定の基準値よりも低く、
b)生物学的単離におけるTbetと、生物学的単離におけるGATA−3遺伝子発現が所定の基準値よりも低いこと。
−患者の生物学的単離細胞からタンパク質又はRNAを放出し、
−Tbet及び/又はGATA−3のタンパク質又はmRNAの発現レベルを確定し、
−上記のa)又はb)に記載の条件の少なくとも1つが当てはまる場合は、患者をサブグループ「Th1 low」の1つに分類するステップ。
例えば、特異抗体の結合に基づく技術で細胞を単離することができる。ここでMiltenyi社(Macs−システム)、Dynal社(DynaBeads)又はBD−Bioscience社(iMAG)から市販されている磁気ビーズが使用される。代替としてこれは、例えばCytomation社(MOFLO)、BD-Bioscience社(FACS−バンテージ)の細胞分別装置において蛍光マーカーで標識された抗体を用いた細胞洗浄によって行われる。標的細胞の純度は好適には、少なくとも80%、より好適には少なくとも95%、最も好適には少なくとも99%である。
GATA−3及びTbetは、いわゆる転写因子として亜型Th1及びTh2のTヘルパー細胞の効果を発揮するタンパク質である。所定量の生物学的単離、特に所定量の全血でのこれらの両方の核タンパク質の濃度を決定するため、GATA−3及びTbetを形成する細胞を先ず単離し、次いで溶解させなけらばならない。このタンパク質をヒト血清又は血漿から直接検出することは、そこには検出可能な濃度で存在しないため不可能である。したがって、サブグループ「Th2 high」の分子表現型GATA−3及びTbetの分析は4段階で行われる。すなわち、
−GATA−3/Tbetを発現する細胞を全血のその他の細胞成分から単離し、
−細胞を破壊し、細胞内タンパク質/核タンパク質を放出し、
−GATA−3及びTbetの濃度を測定し、
−判明したGATA−3及びTbetの濃度を正規化する。
GATA−3/Tbetの発現細胞を全血のその他の細胞成分から分離して単離するステップ。
−場合によっては、表面マーカーに対する抗体によりTh1/Th2の細胞型の親和性精製、及び白血球を事前に濃縮せずに1段階の方法を実行することができる。
−場合によっては、タンパク質GATA−3及びTbetを定量化するために、白血球の単離をFicoll密度勾配遠心法で行うことで十分である。
−場合によっては、Ficoll密度勾配遠心法の代わりに、96ウェルフォーマットのディープウェルプレート内の特異な表面マーカーに対する抗体によるビードベースの親和性精製を用いることができる。
−場合によっては、Ficoll密度勾配遠心法の代わりに、96ウェルフォーマットのディープウェルプレート内の特異的な表面マーカーに対する抗体によるビードベースの親和性精製を用いることができる。
−場合によっては、白血球調合液を得るために赤血球の低浸透圧溶解を行うことができ、又は、
−場合によっては、全血から直接タンパク質分解を行うことができる。
これは、様々な方法及び原理、特に本発明により以下の方法ステップで達成することができる。
−細胞膜を異なる活性成分の溶解緩衝液で破壊する:
a)細胞の破裂を引き起こす低張緩衝液、
b)細胞膜を破壊することにより細胞内タンパク質を放出する界面活性剤含有緩衝液、
c)細胞から水分を引き出すことにより細胞の完全性を破壊する、イオン強度が高く、又は浸透活性の緩衝液、
−加熱、衝撃凍結又は超音波などの物理的方法、
−均質化又は乳鉢粉砕などの機械的方法。
−高濃度のイオン性界面活性剤(例えばSDS、又はコール酸塩及びその派生物)、又は非イオン性界面活性剤(例えばトリトン又はTween−20)の緩衝液系、
−イオン性と非イオン性界面活性剤の混合物(例えば50mMトリス塩酸(pH7.5)、150mM塩化ナトリウム、1% NP40、0.5%デオキシコール酸ナトリウム、及び0.1%SDS)、
−未知組成の市販の溶解緩衝液(例えばM−PER)。
GATA−3及びTbetの両方の転写因子の濃度は基本的に様々な方法で決定することができる。本発明により、特に、
−ELISA(酵素結合免疫吸着測定法)
−CLIA(化学発光免疫吸着測定法)
−FLIA(蛍光免疫吸着測定法)
−質量分光分析法
−クロマトグラフィー法(例えばガスクロマトグラフィー)
−固相分離による液状化法(例えばHPLC)
ミクロ液体法及びナノ流体法が使用される。
更に、図2a及び図2bから、タンパク質含有量に正規化すると、Th1細胞内のTbetGATA−3との比率はTh2細胞内の対応する比率とは異なっていることが分かる。したがって、Th1細胞内のTbetとGATA−3との比率は約27、すなわち20よりも多いのに対して、Th2細胞内の対応する含有量の比率は約6、すなわち10未満である。
そのため、96ウェルマイクロタイタプレートのウェルはGATA−3に対する特異抗体で被覆される。サンプル又は標準液を追加した後に、GATA−3は96ウェルプレート上の抗体と結合する。非結合物質の洗浄プロセスの後、GATA−3に対する第2の特異ビオチン化特異抗体が追加される。非結合物質を除去するための更なる洗浄プロセスの後、ペルオキシダーゼを標識したストレプトアビジンが追加される。非結合物質を除去するための更なる洗浄プロセスの後、基質が追加される。発色は、所定の時間後に停止液を追加することにより停止する。発色強度はマイクロタイタープレート読み取り装置によって定量化される。サンプルの定量化は、既知のタンパク質濃度の付随標準液との比較によって行われる。図3は、GATA−3 ELISASに対応する標準曲線を示している。
−96ウェルプレートの範囲内で必要なウェルの数を使用する。
−50μl/ウェル分析緩衝液を追加する
−100μl/ウェル標準/コントロール/サンプルを追加する。
−震とう機で60分間培養する。
−それぞれ400μl/ウェル洗浄緩衝液で全てのウェルを4回洗浄する。
−100μl/ウェル ビオチン化抗GATA−3抗体を追加する。
−震とう機で60分間培養する。
−それぞれ400μl/ウェル洗浄緩衝液で全てのウェルを4回洗浄する。
−100μl/ウェル ペルオキシダーゼを標識したストレプトアビジンを追加する。
−震とう機で30分間培養する。
−それぞれ400μl/ウェル洗浄緩衝液で全てのウェルを4回洗浄する。
−100μl/ウェル基質を培養する。
−30分間培養する。
−100μlの停止液を追加して反応を停止する。
−マイクロタイタープレート読み取り装置により450nmでの光学密度を測定する。
以下の試験原理に基づいてTbetタンパク質を検出する。サンドイッチELISA(酵素結合免疫吸着測定法)を用いてTbetの定量的決定が行われる。そのために96ウェルマイクロタイタープレートのウェルにTbetに対する特異抗体が被覆される。サンプル又は標準液の追加後にTbetが96ウェルプレート上の抗体に結合される。非結合物質の洗浄プロセスの後に、Tbetに対する第2の特異抗体を追加する。非結合物質の更なる洗浄プロセスの後に、Tbet特異抗体に対するぺルオキシダーゼを標識した抗体が追加される。非結合物質を除去するための更なる洗浄プロセスの後、基質が追加される。発色は、所定の時間後に停止液を追加することにより停止する。発色強度はマイクロタイタープレート読み取り装置によって定量化される。サンプルの定量化は、既知のタンパク質濃度の付随標準液との比較によって行われる。図4はTbet ELISASの対応する標準曲線を示している。
−96ウェルプレートの範囲内で必要なウェルの数を使用する。
−50μl/ウェル分析緩衝液を追加する。
−100μl/ウェル標準/コントロール/サンプルを追加する。
−震とう機で60分間培養する。
−400μl/ウェル洗浄緩衝液で全てのウェルを4回洗浄する。
−100μl/ウェル抗Tbet抗体を追加する。
−震とう機で60分間培養する。
−400μl/ウェル洗浄緩衝液で全てのウェルを4回洗浄する。
−100μl/ウェルのぺルオキシダーゼを標識した抗Tbet抗体を追加する。
−震とう機で30分間培養する。
−400μl/ウェル洗浄緩衝液で全てのウェルを4回洗浄する。
−100μl/ウェル基質を追加する。
−30分間培養する。
−100μlの停止液を追加して反応を停止する。
−マイクロタイタープレート読み取り装置により450nmでの光学密度を測定する。
サンプル調製時の差異を考慮に入れるため、GATA−3及びTbetの濃度の正規化を行うことができる。サンプル調製時の差異は以下によって生じることがある。
−溶解される細胞数の差
−個々のサンプルの異なる溶解効率
−細胞調製中に様々な細胞型が異なる含有率となる。
−細胞溶解物の全タンパク質含有量への正規化(「GATA−3及びTbetの濃度測定」を参照)
−溶解した細胞数に基づく正規化(図5を参照)、又は
−特定の細胞型内の特異に判明したマーカータンパク質濃度への正規化
実施例2及び3の変更形態として、実施例4では、サンプル調製のために特異抗体を被覆した磁気ビードを使用してTh1/Th2が濃縮される。次いで、実施例2の条件に基づいてGATA−3の検出がなされる。
実施例2及び3の変更形態として、実施例4では、サンプル調製のためにサイズ排除濾過を用いて溶解物が濃縮される。次いで、実施例2の条件に基づいてGATA−3の検出がなされる。
GATA−3特異のDNAザイムは、OVA誘発性の「Th2 high」のアレルギー性気道炎症のマウスモデルで治療効果を示す。
GATA−3特異DNAザイムは、Th2優位の慢性アレルギー性気道炎症のマウスモデルに顕著な治療効果を示している。
Claims (10)
- 生物学的試料におけるTh2細胞特異の転写因子GATA−3のタンパク質発現を測定し、所定の基準値と比較することにより、「Th2 high」または、「Th2 low」のいずれかの分子表現型のサブグループに分類し、
当該分類は、
タンパク質量で前記GATA−3の発現レベルが判定され、前記タンパク質量が、免疫分析のうち、ELISA検査、放射免疫分析、電気化学発光免疫分析、CLIA(化学発光結合免疫吸着分析)、FLIA(蛍光結合免疫吸着分析)、又は多重分析のいずれかによって決定され、及び/又は、
前記GATA−3の前記発現レベルがmRNA量によって決定され、該mRNA量がPCR又はマイクロアレイチップを用いて定量的に判定されることを特徴とする、慢性炎症に伴う疾病の患者の分子表現型の分類方法。 - 前記生物学的試料における前記GATA−3のタンパク質発現が所定の基準値よりも高い場合に、前記サブグループ「Th2 high」の前記分子表現型に前記患者を分類する、請求項1に記載の方法。
- 前記生物学的試料における前記GATA−3のタンパク質発現が所定の基準値よりも低い場合に、前記サブグループ「Th2 low」の前記分子表現型に前記患者を分類する、請求項1に記載の方法。
- 前記GATA−3のタンパク質発現の判定の他に、血清IgE濃度及び/又は好酸性顆粒球数が判定され、且つ/又はFeNO値が判定されることを特徴とする、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記慢性炎症に伴う疾患が、アレルギー性気管支喘息、鼻炎結膜炎、アレルギー性副鼻腔炎、アトピー性皮膚炎、食物アレルギー、天疱瘡、潰瘍性結腸炎、寄生虫疾患を含むTh2関連の慢性炎症疾患、又は疥癬、アレルギー性接触性皮膚炎、クローン病、COPD、リウマチ性関節炎、自己免疫性疾患、1型糖尿病、MSを含むTh1関連の慢性炎症疾患のいずれかであることを特徴とする、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
- 慢性炎症に伴う疾病に罹患している分子表現型を有する患者を治療する薬剤であって、
該薬剤は、GATA−3特異的DNAザイムを含み、
該GATA−3特異的DNAザイムが、前記患者の生物学的試料におけるGATA−3のタンパク質発現に基づいて、前記請求項1から5のいずれかの方法により分類された、サブグループ「Th2 high」の前記分子表現型に割り当てられた前記患者の治療に用いられることを特徴とする、薬剤。 - 外水相W1、該外水相W1に分散させた油相O、及び該油相O内に分散させた内水相W2を含み、該内水相に分散させた少なくとも1つの電解質がハロゲン化アルカリ及びハロゲン化アルカリ土類及びその硫酸塩群から選択され、少なくとも1つの前記GATA−3を含み、前記外水相W1は、エチレンオキシド及びプロピレンオキシドである親水性乳化剤を含み、前記油相Oがトリアシルグリセルドから形成され、ジメチコーン群の親油性乳化剤を含むことを特徴とする、請求項6に記載の薬剤。
- 慢性炎症を伴う疾病を患うヒト患者の分子表現型を分類するキットであって、
前記患者の生物学的試料中のタンパク質量及び/又はGATA−3のmRNA量を定量的に決定するための請求項1から5のいずれか一項に記載の方法に用いられる、キット。 - 前記タンパク質量を定量的に決定するため、前記GATA−3に対する特異的な抗体を含み、免疫分析のうち、ELISAを実行するための構成を含むことを特徴とする、請求項8に記載のキット。
- mRNA量を定量的に判定するため、前記GATA−3のタンパク質用の配列特異的なサンプル、及び/又はプライマーを含むことを特徴とする、請求項8に記載のキット。
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