JP6387112B2 - 流体の分析および分離 - Google Patents
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Description
(iii)層流流体フローのような接触している第1および第2の流体フローの全体にわたり成分の分配を提供する段階;
(iv)第1の流体フローの一部、第2の流体フローの一部、または第1の流体フローおよび第2の流体フローの一部を分流し、分流した一部は、成分を含む第3の流体フローである段階;
(v)第3の流体フローを、層流を形成するように第4の流体フローと接触させる段階;および
(vi)層流流体フローのような接触している第3および第4の流体フローの全体にわたり成分の分配を提供する段階、
を含む方法を提供する。
(i)第1の流体フローに成分を提供する段階;および
(ii)該流体フローを、層流が発生するように第2の流体フローと接触させる段階、
をさらに含む。この態様では、該方法は、成分の分配をもたらす予備段階を含む。
(vii)第3の流体フローの一部、第4の流体フローの一部、または第3の流体フローおよび第4の流体フローの一部を分流し、分流した一部は、成分を含む第5の流体フローである段階、
をさらに含む。この態様では、1つの成分を、例えば第3の流体フロー中に存在する他の成分から、少なくとも部分的に分離することができる。
(i)第1の流体フローに第1、第2、および第3の成分の混合物を提供する段階;
(ii)第1の流体フローを、層流が発生するように第2の流体フローと接触させる段階;
(iii)層流流体フローのような接触している第1および第2の流体フローの全体にわたり第1、第2、および第3の成分の分配を提供する段階;
(iv)第1の流体フローの一部、第2の流体フローの一部、または第1の流体フローおよび第2の流体フローの一部を分流し、分流した一部は、第3の成分から少なくとも部分的に分離した第1の成分および第2の成分を含む第3の流体フローである段階;
(v)第3の流体フローを、層流を形成するように第4の流体フローと接触させる段階;および
(vi)層流流体フローのような接触している第3および第4の流体フローの全体にわたり第1および第2の成分の分配を提供する段階、
を含む、前記方法を提供する。
1つの態様では、該方法は、第3の流体フローの一部、第4の流体フローの一部、または第3の流体フローおよび第4の流体フローの一部を分流する後続段階(vii)をさらに含む。分流した一部は、第2の成分から少なくとも部分的に分離した第1の成分を含む第5の流体フローである。
(i)第1の流体フローに第1および第2の成分の混合物を提供する段階;
(ii)第1の流体フローを、層流が発生するように第2の流体フローと接触させる段階;
層流流体フローのような接触している第1および第2の流体フローの全体にわたり第1および第2の成分の分配を提供する段階;
(iv)第1の流体フローの一部、第2の流体フローの一部、または第1の流体フローおよび第2の流体フローの一部を分流し、分流した一部は、第3の成分から少なくとも部分的に分離した第1の成分を含む第3の流体フローである段階;
(v)第3の流体フローを、層流を形成するように第4の流体フローと接触させる段階;
(vi)層流流体フローのような接触している第3および第4の流体フローの全体にわたり第1の成分の分配を提供する段階;
(vii)続いて、第1の流体フローの一部、第2の流体フローの一部、または第1の流体フローおよび第2の流体フローの一部を分流し、分流した一部は、第1の成分から少なくとも部分的に分離した第2の成分を含む第3の流体フローである段階;
第3の流体フローを、層流が形成するように第4の流体フローと接触させる段階;および
(ix)層流流体フローのような接触している第3および第4の流体フローの全体にわたり第2の成分の分配を提供する段階;
を含む、前記方法を提供する。
接触している第1および第2のフローのための第1の分離チャネルであって、接触している第1および第2のフロー間で成分の側方移動が可能になるように適応された、前記チャネル;
第1の分離チャネルと流体連通していてその下流にある第1のフローセパレータであって、第1の分離チャネルからの第1の流体フローの一部、第2の流体フローの一部、または第1の流体フローおよび第2の流体フローの一部を分流するように適応されており、分流したフローは第3のフローである、前記セパレータ;ならびに
第1のフローセパレータと流体連通していてその下流にある第2の分離チャネルであって、接触している第3および第4のフローのためのものであり、接触している第3および第4のフロー間で成分の側方移動が可能なるように適応された、前記チャネル、
を含む。本発明のこれらおよび他の観点および態様を、以下にさらに詳細に記載する。
本件の方法は、層流に依存するモジュール式の流体の戦略によって複合混合物を分析するための代替的アプローチを提供する。すなわち、溶液を物理的特性に従って定常状態条件下で予備分離した後、その内容物を別の分量を用いて大域解析によって同定する。本件では、該方法は、マイクロ流体のフリーフロー電気泳動を通じてサイズ/電荷比(size over charge ratio)に関して分析物を分離した後、続いて拡散分光測定を介してサイズに基づいて分離を行うことにより実証される。
一般的方法
本発明の第1の観点の方法は、一般に、溶液中の成分を分析、例えば、特性決定または定量化しようとするものである。さらに、またはあるいは、該方法を用いて、多成分混合物中の1つの成分を他の成分から少なくとも部分的に分離することができる。
いくつかの態様では、成分が蛍光分光法などの上記分光法を用いて検出することができる官能性を本質的に持っている場合があるため、成分の標識は必要ない。例えば、成分が蛍光活性基を持つ場合、これらを該成分の蛍光検出に用いることができる。
本発明は、流体フロー中に提供される成分の分離および分析方法を提供する。1つの態様では、流体フローへの言及は液体フローへの言及である。
本発明のデバイスは流体フローと一緒に用いるために適応させることができ、水性流体フローと一緒に用いるために適応させることができる。
1つの態様では、第1の流体で、1つの成分または複数成分が固有の状態をそのまま保つことができる。成分がタンパク質などの生体分子である場合、流体フローは適した緩衝液であることができる。したがって、成分を固有の状態に保持するために、とりわけ塩分およびpHを選択することができる。
標識および変性に関するさらなる詳細は、以下に提供する。
本発明の方法は、第1および第2の流体フローの全体にわたる成分の分配を提供し、続いて第3および第4の流体フローの全体にわたる成分の分配を提供する段階を包含する。分配は、典型的には、第1および第2の流体フローの全体にわたる成分の不均一な分配と、第3および第4の流体フローの全体にわたる成分の不均一な分配である。
横方向の分配は、流体フローに沿った成分の分配と対比することができる。例えば、流体法を用いて、流体チャネル中の種のTaylor分散に基づき流体フロー中の成分を分離できることは、当該技術分野で公知である。例えば、米国特許出願公開第2011/264380号には、多分散種の流体力学半径の決定方法が記載されている。分析する種を単分散標準物質と混合する。得られた混合物を、キャピラリー管に沿って流れるキャリヤー流体に加え、キャピラリー管から出てきたときに混合物のTaylorプロファイルを記録する。米国特許出願公開第2011/264380号の研究は、流体フローに沿って成分の第1の分配を実施した後に、第2の分配段階を実施する段階を包含しない。
分布プロファイルは、成分の分配技術および分配に容認される時間に依存する。典型的には、分配に容認される時間は、第1または第3の流体フロー中の成分が第2または第4の流体フローの境界に達していないような時間である。例えば、分離チャネルにおける第1および第2のフローのフロー滞留時間は、第1の流体フロー中の成分が、採用した分離条件下で境界に達する時間を有さないように、選択することができる。
これに加えて、熱泳動技術は、第1および第2の流体フローの全体にわたり温度勾配による異なる成分の移動を観察するために用いられる。温度勾配は、限定されるものではないが、赤外線レーザーによって誘導することができる。温度勾配による成分の拡散速度は、限定されるものではないが、そのサイズ、電荷、構造および水和殻に依存する。
分離段階は、クロマトグラフ法およびTaylor分離法、ならびに、成分を流体フローに沿って分離するRamseyグループの他の電気泳動技術(キャピラリー電気泳動)と区別することができる。そのような技術は、時間的に成分を分離するとみなすことができる。対照的に、本件に採用される分離法は、空間的に成分を分離する。
分流
本発明の方法は、第1および第2の流体フローの一部を分流する段階を包含する。流体フローの分流した一部は、第1および第2の流体フローの残存部分から分離された成分を含有する。分流いた一部は、第3の流体フローである。
本発明の1つの態様では、複数の流体フローの一部を分流する。層流流体フローの少なくとも1つの分流した一部を分析する。層流の分流した一部が第2の流体フローを包含する場合、その分流した一部を分析する。
本発明の1つの態様では、第1および第2のフローの分流した一部を、分析後にフローの他の部分と再び組み合わせる。したがって、最初の第1および第2の流体フロー中の全成分を、さらに分析および使用するために収集することができる。
本発明の方法は、例えば検出および/または単離を容易にするために、フロー装置内で成分を標識する標識段階を包含することができる。
本発明者らは、オルト−フタルアルデヒド(OPA)を潜在的な共有結合性標識として用いることができることを見いだした。OPAは成分の1以上のアミノ基と反応して、検出可能な蛍光標識を形成することができる。OPAは、チオール含有試薬、例えばエタノール(BME)などのアルキルチオールの存在下で、成分のアミノ基と反応させることが好ましい。
あるいは、成分を、組み合わせた一段階で変性および標識することができる。変性および標識を組み合わせた段階は、成分が沈殿するリスクがほとんどない場合に用いることができる。したがって、1つの態様では、標識流体フローは追加的に変性試薬を含む。本明細書中に示すように、分流フローおよび標識フロー(変性剤を含有する)の接触を可能にする合流点は、変性の課題に対応するように適応させることができる。したがって、合流点における流体チャネルの表面は、流体中の成分をはじくようなものであることができ、例えば、親水性表面を用いて、疎水性成分がチャネル表面に付着するのを妨げることができる。分流フローを標識フローまたは変性フローと接触させる場合、フローの内容物が、これが接触するフローの内容物と迅速に混合することができることが好ましい。迅速な混合は、成分の迅速な標識または変性を確実にするためのものである。これは、第1および第2のフローの両方の全体にわたる成分の迅速な分配が必須または望ましいわけではない、第1の流体フローと第2の流体フローを接触させる段階と対比されるべきである。例えば、拡散分離段階では、分離チャネルにおいて成分の均一な分布を早期に確立することは、成分が分離されなくなるので望ましくない。拡散分離では、第1および第2の流体フローの全体にわたり不均一な分布プロファイルを確立することが必要である。
本発明の方法は、流体フロー中の成分を分析、例えば検出する段階を含むことができる。流体フローは、第3または第5の流体フローであることができる。流体フローは、接触している第1および第2の流体フローまたは接触している第3および第4の流体フローであることができる。
本発明は、例えば第1または第2の分配段階における流体中の一成分または複数成分の拡散係数を決定するための方法を提供する。
さらに詳細には、本発明によって、所定サイズの種のカーネルを決定するための正確な数値計算が可能になる。その後、フロー実験で得た拡散プロファイルを、予測されるカーネルの線形重ね合わせに大域的に適合させ、ここで、各カーネルの振幅を、係数を0〜1の区間に限定して分別濃度としてのそれらの物理的解釈を確実にする、制約付き最小二重適合により決定する。適合における残差は、測定誤差の推定量を提供する。その後、第2の一連の最小二乗適合を、今回は最小エントロピー正規化で実施する。エントロピーの項は、正規化された適合の残差が正規化されていない適合の残差とランダム誤差レベルで異なるようになるまで、徐々に大きさを増大させる。その結果、この最終的な適合に関する係数は、実験誤差と一致するもっとも単純な(エントロピーが最小である)解である。
拡散プロファイルは、当分野で公知のように、成分流体中の成分の濃度の決定に用いることもできる。
本発明は、本発明の方法で使用するためのフロー装置も提供する。フロー装置は、流体フローの全体にわたり成分が分配されるのを可能にし、流体フローの一部を分流するのを可能にする、適したフローチャネルを有する。
第1、第2、第3および第4の流体フローを保持するためにマイクロ流体チャネルを使用すると、フローが確実に低レイノルズ数で生じる。本明細書中に記載する拡散分離段階では、対流および拡散のみがシステム内での質量輸送に関連するメカニズムである。したがって、これにより、本明細書中でさらに詳細に記載するように、所定サイズの各成分について正確な数値計算を実施することが可能になる。分離に電気泳動法を用いる場合、対流および電気泳動のみが、システム内での質量輸送に関連するメカニズムである。
第1の分離チャネルは、第1の流体を供給するための1以上のリザーバと流体連通している。第1の分離チャネルは、第2の流体を供給するための1以上のリザーバと流体連通している。
流体デバイスのチャネル表面は、成分が表面に付着するのが妨げられるように適応させることができる。したがって、一態様において、チャネル表面は、表面上への成分の吸収を制限または防止する。
他の優先傾向
本明細書中では、上記態様のあらゆる互換性のある組み合わせを、あらゆる組み合わせが個々に明確に挙げられているかのように、明確に開示する。
本発明のさまざまな他の観点および態様は、本開示を考慮して、当業者には明らかになるであろう。
文脈でそうでないことが示されない限り、上記特徴に関する記載および定義は、本発明の任意の特定の観点または態様に限定されるものではなく、記載されているすべての観点および態様に同等に適用される。
実験
デバイスの製作および操作
デバイスは、SU8−3025フォトレジスト(MicroChem、米国マサチューセッツ州ニュートン)を3000rpmで回転させて用いるソフトリソグラフィーのアプローチを通じて、25のチャネル高さに製作した。照射および現像したレジストは雌型を形成し、この上に非架橋ポリジメチルシロキサン(PDMS、Sylgard 184、ダウ・コーニング、ミシガン州ミッドランド、米国)を注入して硬化する。硬化したPDMSを剥がし、顕微鏡用スライドガラスにプラズマ接着すると、硬化PDMS中に押し抜かれた弾性管スルーホールに到達可能な密封マイクロチャネルが生じた。電極は、接着したデバイスを78℃のホットプレート上に置き、低融点合金(51%In、32.5%Si、16.5%Sn、Indium Corporation、ニューヨーク州Utica、米国)を自動整合した型に挿入することにより作り出した。半径が25で25離れている一連の柱は、その表面張力によって溶融金属を保持し、温度を低下させると、合金は凝固し、固体壁電極を形成した。
図1は、本発明の一態様に従った流体デバイス3の略図である。そのような流体デバイスを、本明細書中に記載する代表的方法に用いた。
第2の分離チャネル14は、上流の第3の供給チャネル13および上流の第4の供給チャネル15によって供給される。第4の供給チャネル15は、第4の流体リザーバ16(「緩衝液入口」)から第2の分離チャネル14へ第4の流体フローを供給するためのものである。使用時に、第3および第4の流体を、第1のフローセパレータ11および第4の流体リザーバ16から供給チャネル13および15を通って流れることができるようにして、第2の分離チャネル14の上流末端の合流点16で合流させる。第4の流体フローは、第3の流体フローのどちらかの側に提供される。第2の分離チャネル14は、横断面が大きな上流領域と、横断面が小さな下流領域を有する。分離チャネルの上流領域に横断面が大きなチャネルが存在することは、分離チャネルにおける安定な流体フローの形成に関連する。
成分
タンパク質溶液は、pH8.0の5mM HEPES緩衝液中に2mg/mLの濃度で調製した。共有結合標識は、600の潜在的蛍光体(オルトフタルアルデヒド、P0657、シグマ・アルドリッチ、ドーセット、英国)および900の2−メルカプトエタノール(35602、サーモ・サイエンティフィック、クラムリントン、英国)を加えることにより生じさせた。標識試料は、デバイスで使用する前に氷(+4℃)上で少なくとも5分間インキュベートした。その後、タンパク質の相互付着を避けるために、標識タンパク質溶液に20%v/vジメチルスルホキシドを補った。
混合物の分粒に用いる蛍光コロイドはFluoroMaxから入手した(G50およびG200)。それらの半径は、製造者によってそれぞれ23.5および100nmであると決定されていた。
原理上、拡散分粒は、本発明者らによるPCT/GB2013/052757号での特許出願に記載されているように実行した。したがって、いわゆる基底関数Br(y)は、所定サイズrを有する多数の個々の粒子を、対流および拡散によりチャネルに通して伝播させることにより作り出す。その後、拡散モジュールの異なる位置における実験プロファイルをこれらの基底関数の線形結合に適合させて、溶液中の半径rを有する粒子の割合を定量化する係数Crを得る。最適化アルゴリズム自体は、最小エントロピー項を包含する残差の大域的最小点を見いだすために、少なくとも100のランダム移動でベイズンホッピング(basin hopping)手順により行う。
電気泳動モジュールの末端における拡散チャネル内部の一連の蛍光顕微鏡像を、図3に示す。1V〜5Vの印加電圧の段階的増大は、分析物のビーム−これは、潜在的蛍光体で標識した2mg/mLの濃度のβ−ラクトグロブリンからなる−を、分析チャンバー(黄色い矢印を付けてある)の出口に向かって偏向させ、その結果として、拡散モジュール内部のプロファイルの振幅を増大させる。これらの像から、拡散チャネル中の4つの位置(ノズルから2.5、4.7、20.7および64.7mm下流)における蛍光プロファイルを抽出することができる。20%DMSOに溶解し、潜在的蛍光体(OPA)で標識した、2mg/mLのβ−ラクトグロブリンについて0V〜5Vの範囲の電圧で得たプロファイルを、図4(a)の黒色破線により示す。赤線はこれらのデータへの大域的適合であり、図4(b)に図示する基底関数計数をもたらす。この係数のセットは、われわれが分析物のサイズおよび電荷を同時に決定することができることを示している。得られた約3nmの流体力学半径は、われわれの以前の所見に十分に対応している。しかしながら、分離モジュールの選択性はまだ中程度なので、この工程において、電荷に関する値は依然として信頼性が高くない。
本明細書内で言及した文書はすべて、その全体を本明細書中で参考として援用する。
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2 拡散分離ユニット
3 流体デバイス
4 第1の分離チャネル
5 電極
6 第1の供給チャネル
7 第2の供給チャネル
8 第1の流体リザーバ
9 第2の流体リザーバ
10 合流点
11 第1の流体セパレータ
12 収集チャンバー
13 第3の供給チャネル
14 第2の分離チャネル
15 第4の供給チャネル
16 第4の流体リザーバ
Claims (10)
- 成分の分析方法であって、
(i)第1の流体フローに成分を提供する段階;
(ii)第1の流体フローを、層流が発生するように第2の流体フローと接触させる段階;
(iii)第2の流体フロー中への成分の電気泳動的または熱泳動的移動を提供する段階;
(iv)第1の流体フローの一部、第2の流体フローの一部、または第1の流体フローおよび第2の流体フローの一部を分流し、当該分流した一部は、成分を含む第3の流体フローである段階;
(v)第3の流体フローを、層流が発生するように第4の流体フローと接触させる段階;
(vi)第4の流体フロー中への成分の拡散を提供する段階;
(vii)第3の流体フローの一部、第4の流体フローの一部、または第3の流体フローおよび第4の流体フローの一部を分流し、当該分流した一部は、成分を含む第5の流体フローである段階;
(viii)第3の流体フローまたは第5の流体フロー中の成分を標識する段階、
を含む方法。 - 以下の後続段階:
(ix)第5の流体フローを、層流を形成するように第6の流体フローと接触させる段階;
(x)層流流体フローのような接触している第5および第6の流体フローの全体にわたり成分の分配を提供する段階、
をさらに含む、請求項1に記載の方法。 - 以下の後続段階:
(xi)第5の流体フローの一部、第6の流体フローの一部、または第5の流体フローおよび第6の流体フローの一部を分流し、当該分流した一部は、成分を含む第7の流体フローである段階、
をさらに含む、請求項2に記載の方法。 - 段階(iii)が、第2の流体フロー中への成分の電気泳動的移動を含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 流体フロー中の成分を分析する段階をさらに含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 電気泳動的移動が等電点電気泳動を含む、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 成分を分析するためのフロー装置であって、
接触している第1および第2の流体フローのための第1の分離チャネルであって、接触している第1および第2の流体フロー間で成分の電気泳動的な側方移動が可能になるように適応された、前記チャネル;
第1の分離チャネルと流体連通していてその下流にある第1のフローセパレータであって、第1の分離チャネルからの第1の流体フローの一部、第2の流体フローの一部、または第1の流体フローおよび第2の流体フローの一部を分流するように適応されており、当該分流した一部は第3のフローである、前記セパレータ;ならびに
第1のフローセパレータと流体連通していてその下流にある第2の分離チャネルであって、接触している第3および第4の流体フローのためのものであり、接触している第3および第4の流体フロー間で成分の電気泳動的な側方移動が可能になるように適応された、前記チャネル、
を含み、
第2の分離チャネルと流体連通していてその下流にある第2のフローセパレータであって、第2の分離チャネルからの第3の流体フローの一部、第4の流体フローの一部、または第3の流体フローおよび第4の流体フローの一部を分流するように適応されており、当該分流した一部は第5の流体フローである、前記セパレータ;ならびに
第3の流体フローに試薬を導入するための試薬フローチャネルかまたは第5の流体フローに試薬を導入するための試薬チャネルであって、試薬は標識であるかまたは成分との反応により検出可能な標識を発生可能である、前記チャネル、
をさらに含む、前記装置。 - 第2のフローセパレータと流体連通していてその下流にある第3の分離チャネルをさらに含み、該第3の分離チャネルは、接触している第5および第6の流体フローのためのものであり、接触している第5および第6のフロー間で成分の側方移動が可能になるように適応されている、請求項7に記載のフロー装置。
- フローセパレータの下流にあってこれと流体連通している分析ゾーンをさらに含む、請求項7に記載のフロー装置。
- 第1および第2の分離チャネルの少なくとも1つが、チャネルの長さに沿って電極を備える、請求項7に記載のフロー装置。
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