JP6383740B2 - Peptide / β-1,3-glucan complex and pharmaceutical composition containing the same - Google Patents

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Description

本発明は、新規なペプチド／β−１，３−グルカン複合体及びその製造方法並びにそれを含む医薬組成物に関する。   The present invention relates to a novel peptide / β-1,3-glucan complex, a method for producing the same, and a pharmaceutical composition containing the same.

ワクチンによる感染予防の基本的な原理は、人為的な擬似感染により、獲得免疫を誘導し、特定の病原体に対する抗体産生や細胞性免疫を誘導することにある。獲得免疫においては、免疫の「記憶」を担当するＴ細胞やＢ細胞が中心的な役割を果たし、ＤＮＡの再構成による抗体の可変領域の多様性が、無数の抗原への特異的な免疫反応を可能にしていることが知られている。一方、白血球、マクロファージ、樹状細胞等の食細胞が中心的な役割を果たしている自然免疫は、従来、病原体や異物を貪食する非特異的なプロセスであり、獲得免疫成立までの「一時しのぎ」としての役割のみを果たしていると考えられていたが、自然免疫の分子機構に関する研究の進展により、自然免疫においても、自己・非自己の特異的な認識が行われていることや、自然免疫が獲得免疫の成立に必須であることが明らかにされた。より具体的には、樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞等の抗原提示細胞に存在するＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）ファミリーが、様々な病原体と反応し、サイトカインの産生を誘導し、ナイーブＴ細胞のＴｈ１細胞への分化の促進、キラーＴ細胞の活性化等を通して、獲得免疫を誘導することが、最近の研究により明らかにされた。   The basic principle of vaccine infection prevention is to induce acquired immunity by artificial artificial infection, and to induce antibody production and cellular immunity against specific pathogens. In acquired immunity, T cells and B cells responsible for “memory” of immunity play a central role, and the diversity of antibody variable regions due to DNA reconstitution results in specific immune responses to countless antigens. It is known to make it possible. On the other hand, innate immunity, in which phagocytic cells such as leukocytes, macrophages, and dendritic cells play a central role, has traditionally been a non-specific process of phagocytosing pathogens and foreign substances. However, due to the progress of research on the molecular mechanisms of innate immunity, there is a specific recognition of self and non-self in innate immunity and the acquisition of innate immunity. It was revealed that it is essential for the establishment of immunity. More specifically, the Toll-like receptor (TLR) family present in antigen-presenting cells such as dendritic cells, macrophages, and B cells reacts with various pathogens, induces cytokine production, and produces naïve T cells. Recent studies have revealed that acquired immunity is induced through promotion of differentiation into Th1 cells, activation of killer T cells, and the like.

一連のＴＬＲファミリーにより認識される病原体の構成成分は多岐にわたるが、その中の１つに、ＴＬＲ９のリガンドである、ＣｐＧ配列を有するＤＮＡ（ＣｐＧ ＤＮＡ）がある。ＣｐＧ配列は、中心部にシトシン（Ｃ）とグアニン（Ｇ）が並ぶ６個の塩基を基本とする配列で、ほ乳類には少なく、微生物には多く見られる塩基配列である。また、ほ乳類においては、少数存在するＣｐＧ配列の殆どがメチル化を受けている。ほ乳類中に殆ど存在しない非メチル化ＣｐＧ配列は、強力な免疫賦活活性を有している（例えば、非特許文献１〜３参照）。エンドサイトーシスにより細胞内に取り込まれたＣｐＧ ＤＮＡは、ファゴソーム様小胞体に存在するＴＬＲ９により認識され、Ｔｈ１反応を強く誘導する。Ｔｈ１反応は、Ｔｈ２反応が優位なアレルギー反応を抑制すると共に、強い抗腫瘍活性を有する。そのため、ＣｐＧ ＤＮＡは、感染予防に加え、アレルギー疾患、腫瘍性疾患に対するアジュバントとしても期待されている（例えば非特許文献４参照）。   The components of pathogens recognized by a series of TLR families are diverse, one of which is DNA having a CpG sequence (CpG DNA), which is a ligand for TLR9. The CpG sequence is a sequence based on 6 bases in which cytosine (C) and guanine (G) are arranged in the center, and is a base sequence that is rare in mammals and often found in microorganisms. In mammals, most CpG sequences present in a small number are methylated. Unmethylated CpG sequences that are hardly present in mammals have a strong immunostimulatory activity (see, for example, Non-Patent Documents 1 to 3). CpG DNA taken into cells by endocytosis is recognized by TLR9 present in the phagosome-like endoplasmic reticulum and strongly induces a Th1 reaction. The Th1 reaction has a strong antitumor activity while suppressing an allergic reaction that is predominantly a Th2 reaction. Therefore, CpG DNA is expected as an adjuvant for allergic diseases and neoplastic diseases in addition to preventing infection (see Non-Patent Document 4, for example).

しかし、ＣｐＧ ＤＮＡを免疫療法のアジュバントとして使用する場合、細胞質や血漿中のヌクレアーゼによる分解や、タンパク質との非特異的な結合を回避しつつ、いかに標的細胞の内部にＣｐＧ ＤＮＡを到達させるかが問題となる。   However, when CpG DNA is used as an adjuvant for immunotherapy, how to reach CpG DNA inside target cells while avoiding degradation by nucleases in cytoplasm and plasma and non-specific binding to proteins It becomes a problem.

本発明者らは、新規な遺伝子キャリアとしてβ−１，３−グルカン骨格を有する多糖（以下、「β−１，３−グルカン」と略称する場合がある。）に着目し、これまでに、β−１，３−グルカンが核酸医薬（アンチセンスＤＮＡ、ＣｐＧ ＤＮＡ）をはじめとする種々の核酸と新しいタイプの複合体を形成することを見出してきた（例えば、特許文献１、２、非特許文献５〜７参照）。   The present inventors paid attention to a polysaccharide having a β-1,3-glucan skeleton (hereinafter sometimes abbreviated as “β-1,3-glucan”) as a novel gene carrier. It has been found that β-1,3-glucan forms a new type of complex with various nucleic acids including nucleic acid drugs (antisense DNA, CpG DNA) (for example, Patent Documents 1 and 2; References 5-7).

天然では３重らせんで存在するβ−１，３−グルカンを、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等の非プロトン性極性有機溶媒、或いは０．１Ｎ以上のアルカリ溶液に溶解して１本鎖に解離させた後に、１本鎖の核酸を加え、溶媒を水或いは中性に戻すことによって、核酸１分子とβ−１，３−グルカン２分子とからなる３重らせん複合体が形成することを見出した。この場合、３重らせん複合体におけるβ−１，３−グルカン分子と核酸分子とは、主として水素結合と疎水性相互作用により分子間結合を形成しているものと考えられている（非特許文献８参照）。   The β-1,3-glucan that exists in triplicate in nature is dissolved in an aprotic polar organic solvent such as dimethyl sulfoxide (DMSO) or an alkaline solution of 0.1 N or more to be dissociated into a single strand. Later, it was found that a triple helix complex composed of one molecule of nucleic acid and two molecules of β-1,3-glucan was formed by adding a single-stranded nucleic acid and returning the solvent to water or neutrality. In this case, it is considered that the β-1,3-glucan molecule and the nucleic acid molecule in the triple helix complex form an intermolecular bond mainly by a hydrogen bond and a hydrophobic interaction (non-patent document). 8).

上述のように、核酸をβ−１，３−グルカンと複合化することにより、ヌクレアーゼによる核酸分子の加水分解や、血漿タンパク質と核酸との非特異的な結合等の、核酸分子と生体内タンパク質との望ましくない相互作用を抑制しつつ、核酸を細胞の内部に到達させることが可能になった。β−１，３−グルカンと核酸との複合体、さらには抗原性を有するタンパク質を含む３元複合体を利用して、ＣｐＧ ＤＮＡの細胞内へのデリバリーに成功した（例えば、特許文献３、４、非特許文献９〜１１参照）。   As described above, nucleic acid molecules and in vivo proteins such as hydrolysis of nucleic acid molecules by nucleases and nonspecific binding between plasma proteins and nucleic acids by complexing nucleic acids with β-1,3-glucan It was possible to allow nucleic acids to reach the inside of cells while suppressing undesirable interactions with. Successful delivery of CpG DNA into cells using a complex of β-1,3-glucan and a nucleic acid, and further a ternary complex containing a protein having antigenicity (for example, Patent Document 3, 4 and non-patent documents 9 to 11).

国際公開第０１／３４２０７号International Publication No. 01/34207 国際公開第０２／０７２１５２号International Publication No. 02/072152 特開２００７−１７４１０７号公報JP 2007-174107 A 特開２０１０−７０３０７号公報JP 2010-70307 A

Bacterial CpG DNA Activates Immune Cells to Signal Infectious Danger, H. Wagner, Adv. Immunol., 73, 329-368 (1999).Bacterial CpG DNA Activates Immune Cells to Signal Infectious Danger, H. Wagner, Adv.Immunol., 73, 329-368 (1999). CpG Motifs in Bacterial DNA and Their Immune Effects, M. Krieg, Annu. Rev. Immunol., 20, 709-760 (2002).CpG Motifs in Bacterial DNA and Their Immune Effects, M. Krieg, Annu. Rev. Immunol., 20, 709-760 (2002). The discovery of immunostimulatory DNA sequence, S. Yamamoto, T. Yamamoto, and T. Tokunaga, Springer Seminars in Immunopathology, 22, 11-19 (2000).The discovery of immunostimulatory DNA sequence, S. Yamamoto, T. Yamamoto, and T. Tokunaga, Springer Seminars in Immunopathology, 22, 11-19 (2000). 「標準免疫学」第２版、医学書院、２００２年、３３３頁“Standard Immunology”, 2nd edition, Medical School, 2002, page 333 Molecular Recognition of Adenine, Cytosine, and Uracil in a Single-Stranded RNA by a Natural Polysaccharide: Schizophyllan. K. Sakurai and S. Shinkai, J. Am. Chem. Soc., 122, 4520-4521 (2000).Molecular Recognition of Adenine, Cytosine, and Uracil in a Single-Stranded RNA by a Natural Polysaccharide: Schizophyllan.K. Sakurai and S. Shinkai, J. Am. Chem. Soc., 122, 4520-4521 (2000). Polysaccharide-Polynucleotide Complexes. 2. Complementary Polynucleotide Mimic Behavior of the Natural Polysaccharide Schizophyllan in the Macromolecular Complex with Single-Stranded RNA and DNA. K. Sakurai, M. Mizu and S. Shinkai, Biomacromolecules, 2, 641-650 (2001).Polysaccharide-Polynucleotide Complexes. 2. Complementary Polynucleotide Mimic Behavior of the Natural Polysaccharide Schizophyllan in the Macromolecular Complex with Single-Stranded RNA and DNA.K. Sakurai, M. Mizu and S. Shinkai, Biomacromolecules, 2, 641-650 (2001) . Dectin-1 targeting delivery of TNF-α antisense ODNs complexed with β-1,3-glucan protects mice from LPS-induced hepatitis. S. Mochizuki and K. Sakurai, J. Control. Release, 151 (2011) 155-161.Dectin-1 targeting delivery of TNF-α antisense ODNs complexed with β-1,3-glucan protects mice from LPS-induced hepatitis.S. Mochizuki and K. Sakurai, J. Control. Release, 151 (2011) 155-161. Structural Analysis of the Curdlan/Poly (cytidylic acid) Complex with Semiempirical Molecular Orbital Calculations. K. Miyoshi, K. Uezu, K. Sakurai and S. Shinkai, Biomacromolecules, 6, 1540-1546 (2005).Structural Analysis of the Curdlan / Poly (cytidylic acid) Complex with Semiempirical Molecular Orbital Calculations.K. Miyoshi, K. Uezu, K. Sakurai and S. Shinkai, Biomacromolecules, 6, 1540-1546 (2005). A Polysaccharide Carrier for Immunostimulatory CpG DNAs to Enhance Cytokine Secretion, M. Mizu, K. Koumoto, T. Anada, T. Matsumoto, M. Numata, S. Shinkai, T. Nagasaki and K. Sakurai， J. Am. Chem. Soc., 126, 8372-8373 (2004).A Polysaccharide Carrier for Immunostimulatory CpG DNAs to Enhance Cytokine Secretion, M. Mizu, K. Koumoto, T. Anada, T. Matsumoto, M. Numata, S. Shinkai, T. Nagasaki and K. Sakurai, J. Am. Chem. Soc., 126, 8372-8373 (2004). Protection of Polynucleotides against Nuclease-mediated Hydrolysis by Complexation with Schizophyllan, M. Mizu, K. Koumoto, T. Kimura, K. Sakurai and S. Shinkai, Biomaterials, 25, 15, 3109-3116 (2004).Protection of Polynucleotides against Nuclease-mediated Hydrolysis by Complexation with Schizophyllan, M. Mizu, K. Koumoto, T. Kimura, K. Sakurai and S. Shinkai, Biomaterials, 25, 15, 3109-3116 (2004). Synthesis and in Vitro Characterization of Antigen-Conjugated Polysaccharide as a CpG DNA Carrier, N. Shimada, K. J. Ishii, Y. Takeda, C. Coban, Y. Torii, S. Shinkai, S. Akira and K. Sakurai, Bioconjugate Chem., 17 1136-1140 (2006).Synthesis and in Vitro Characterization of Antigen-Conjugated Polysaccharide as a CpG DNA Carrier, N. Shimada, KJ Ishii, Y. Takeda, C. Coban, Y. Torii, S. Shinkai, S. Akira and K. Sakurai, Bioconjugate Chem. , 17 1136-1140 (2006).

しかしながら、上記従来の技術は、以下のような課題を有していた。例えば、非特許文献１１記載のβ−１，３−グルカン／抗原性を有するタンパク質／ＣｐＧ ＤＮＡの３元複合体の製造方法においては、過ヨウ素酸酸化により、β−１，３−グルカンの側鎖のグルコース残基上にホルミル基を生成させ、還元的アミノ化反応により、ホルミル基と抗原性を有するペプチド（以下、「抗原性ペプチド」と略称する場合がある。）のアミノ基とを反応させ、β−１，３−グルカンと抗原性ペプチドとが共有結合した複合体を形成するが、収率がきわめて低いという課題を有していた。かかる事情に鑑みて、例えば、特許文献４記載のβ−１，３−グルカン／抗原性タンパク質（抗原性ペプチド）／ＣｐＧ ＤＮＡの３元複合体の製造方法においては、側鎖にホルミル基を有するβ−１，３−グルカンと抗原性ペプチドとを、アルカリ水溶液中で反応させると同時に中和を行なう、或いはアルカリ水溶液中で反応させて逐次中和を行なうことにより、β−１，３−グルカンの側鎖上のホルミル基と抗原性ペプチドのアミノ基との反応性及び収率を向上させている。しかしながら、ペプチドには複数のアミノ基が存在するため、反応点の制御が困難である。したがって、抗原性ペプチドの反応位置による免疫原性の違いや、β−１，３−グルカンとの反応生成物が複雑な混合物となることに起因する分離精製の困難性等の問題の発生が懸念される。また、水素結合による複合体形成を利用したβ−１，３−グルカンとＤＮＡとの複合体の形成に比べ、β−１，３−グルカンと抗原性ペプチドの共有結合の形成に基づく複合体の形成は煩雑である。これらの点において、特許文献４記載のβ−１，３−グルカン／抗原性ペプチド／ＣｐＧ ＤＮＡの３元複合体の製造方法は、生産性等の点で依然として課題を有している。   However, the above conventional technique has the following problems. For example, in the method for producing a ternary complex of β-1,3-glucan / antigenic protein / CpG DNA described in Non-Patent Document 11, the β-1,3-glucan side is obtained by periodate oxidation. A formyl group is generated on the glucose residue of the chain, and the formyl group is reacted with the amino group of a peptide having antigenicity (hereinafter sometimes abbreviated as “antigenic peptide”) by reductive amination reaction. Thus, a complex in which β-1,3-glucan and an antigenic peptide are covalently bonded is formed, but the yield is extremely low. In view of such circumstances, for example, in the method for producing a ternary complex of β-1,3-glucan / antigenic protein (antigenic peptide) / CpG DNA described in Patent Document 4, the side chain has a formyl group. β-1,3-glucan and an antigenic peptide are reacted in an alkaline aqueous solution and neutralized at the same time, or are reacted in an alkaline aqueous solution to carry out sequential neutralization to obtain β-1,3-glucan. The reactivity and yield of the formyl group on the side chain and the amino group of the antigenic peptide are improved. However, since there are a plurality of amino groups in the peptide, it is difficult to control the reaction point. Therefore, there are concerns about the occurrence of problems such as differences in immunogenicity depending on the reaction position of the antigenic peptide and difficulty in separation and purification due to the reaction product with β-1,3-glucan becoming a complex mixture. Is done. Compared to the formation of a complex between β-1,3-glucan and DNA utilizing the formation of a complex by hydrogen bonding, the complex based on the formation of a covalent bond between β-1,3-glucan and an antigenic peptide Formation is cumbersome. In these respects, the method for producing a ternary complex of β-1,3-glucan / antigenic peptide / CpG DNA described in Patent Document 4 still has problems in terms of productivity and the like.

本発明はかかる事情に鑑みてなされたもので、生産性に優れ、高い免疫賦活活性を有するペプチド／β−１，３−グルカン複合体及びその製造方法並びにそれを含む医薬組成物を提供することを目的とする。   The present invention has been made in view of such circumstances, and provides a peptide / β-1,3-glucan complex having excellent productivity and high immunostimulatory activity, a method for producing the same, and a pharmaceutical composition containing the same. With the goal.

本発明の第１の態様は、β−１，３−グルカン骨格を有する多糖と、アミノ酸残基数が８〜１２の抗原性を有するペプチドが、ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体と共有結合を介して結合したペプチド／ポリヌクレオチドコンジュゲートとを含み、前記ペプチド／ポリヌクレオチドコンジュゲートのポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体が、前記β−１，３−グルカン骨格を有する多糖と、水素結合を介して結合し、前記ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体の分子鎖１本と前記β−１，３−グルカン骨格を有する多糖の分子鎖２本とからなる三重螺旋構造を有する複合体を形成していることを特徴とするペプチド／β−１，３−グルカン複合体を提供することにより上記課題を解決するものである。 In the first aspect of the present invention, a polysaccharide having a β-1,3-glucan skeleton and an antigenic peptide having 8 to 12 amino acid residues are covalently bonded to a polynucleotide or a polynucleotide derivative. A peptide / polynucleotide conjugate bound thereto, wherein the polynucleotide or polynucleotide derivative of the peptide / polynucleotide conjugate binds to the polysaccharide having the β-1,3-glucan backbone via a hydrogen bond, A complex having a triple helix structure comprising one molecular chain of the polynucleotide or polynucleotide derivative and two molecular chains of the polysaccharide having the β-1,3-glucan skeleton is formed. The problem is solved by providing a peptide / β-1,3-glucan complex.

本発明の第１の態様に係るペプチド／β−１，３−グルカン複合体において、前記β−１，３−グルカン骨格を有する多糖が、シゾフィラン、レンチナン、スクレログルカン及びカードランのいずれかであることが好ましい。 In the peptide / β-1,3-glucan complex according to the first aspect of the present invention, the polysaccharide having the β-1,3-glucan skeleton is any one of schizophyllan, lentinan, scleroglucan and curdlan. Preferably there is.

本発明の第１の態様に係るペプチド／β−１，３−グルカン複合体において、前記ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体がポリデオキシアデノシンであってもよい。 In the peptide / β-1,3-glucan complex according to the first aspect of the present invention, the polynucleotide or polynucleotide derivative may be polydeoxyadenosine.

本発明の第１の態様に係るペプチド／β−１，３−グルカン複合体において、前記ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体が、ＤＮＡ又はＲＮＡのホスホジエステル結合の少なくとも一部がホスホロチオエート基で置換されたポリヌクレオチド誘導体であることが好ましい。 In the peptide / β-1,3-glucan complex according to the first aspect of the present invention, the polynucleotide or polynucleotide derivative is a polynucleotide in which at least a part of a phosphodiester bond of DNA or RNA is substituted with a phosphorothioate group. It is preferably a nucleotide derivative.

本発明の第１の態様に係るペプチド／β−１，３−グルカン複合体において、ホスホジエステル結合の５０％以上がホスホロチオエート基で置換されていてもよい。 In the peptide / β-1,3-glucan complex according to the first aspect of the present invention, 50% or more of the phosphodiester bond may be substituted with a phosphorothioate group.

本発明の第１の態様に係るペプチド／β−１，３−グルカン複合体において、前記ペプチド／ポリヌクレオチドコンジュゲートを構成する前記抗原性を有するペプチドと前記ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体とが、アルキンとアジド誘導体との付加環化反応、マレイミド基とチオール基との反応、ペプチドＣ末端のシステイン残基のチオール基とチオール修飾核酸のチオール基との反応のいずれかにより生成した共有結合を介して結合していてもよい。 In the peptide / β-1,3-glucan complex according to the first aspect of the present invention, the antigenic peptide constituting the peptide / polynucleotide conjugate and the polynucleotide or polynucleotide derivative are alkynes. Via a covalent bond formed by any of the cycloaddition reaction between azide and an azide derivative, the reaction between a maleimide group and a thiol group, or the reaction between a thiol group of a cysteine residue at the peptide C-terminal and a thiol group of a thiol-modified nucleic acid It may be bonded.

本発明の第２の態様は、本発明の第１の態様に係るペプチド／β−１，３−グルカン複合体において、免疫賦活活性を有する部分塩基配列を有するポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体を更に含み、前記ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体が、前記β−１，３−グルカン骨格を有する多糖と、水素結合を介して結合し、前記ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体の分子鎖１本と前記β−１，３−グルカン骨格を有する多糖の分子鎖２本とからなる三重螺旋構造を有する複合体を形成していることを特徴とするペプチド／β−１，３−グルカン複合体を提供することにより上記課題を解決するものである。 According to a second aspect of the present invention, the peptide / β-1,3-glucan complex according to the first aspect of the present invention further includes a polynucleotide or a polynucleotide derivative having a partial base sequence having immunostimulatory activity. The polynucleotide or polynucleotide derivative is bonded to the polysaccharide having the β-1,3-glucan skeleton through a hydrogen bond, and one molecular chain of the polynucleotide or polynucleotide derivative and the β-1, By providing a peptide / β-1,3-glucan complex characterized in that it forms a complex having a triple helical structure consisting of two polysaccharide molecular chains having a 3-glucan skeleton. Is a solution.

本発明の第２の態様に係るペプチド／β−１，３−グルカン複合体において、前記ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体の、前記三重螺旋構造を有する複合体を形成する部分がポリデオキシアデノシンであることが好ましい。 In the peptide / β-1,3-glucan complex according to the second aspect of the present invention, the portion of the polynucleotide or polynucleotide derivative that forms the complex having the triple helical structure is polydeoxyadenosine. Is preferred.

本発明の第２の態様に係るペプチド／β−１，３−グルカン複合体において、前記ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体の、前記三重螺旋構造を有する複合体を形成する部分が、ＤＮＡ又はＲＮＡのホスホジエステル結合の少なくとも一部がホスホロチオエート基で置換されたポリヌクレオチド誘導体であることが好ましい。 In the peptide / β-1,3-glucan complex according to the second aspect of the present invention, the part of the polynucleotide or polynucleotide derivative that forms the complex having the triple helix structure is a DNA or RNA phospho A polynucleotide derivative in which at least a part of the diester bond is substituted with a phosphorothioate group is preferable.

本発明の第２の態様に係るペプチド／β−１，３−グルカン複合体において、前記ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体の、前記三重螺旋構造を有する複合体を形成する部分において、ＤＮＡ又はＲＮＡのホスホジエステル結合の５０％以上がホスホロチオエート基で置換されていてもよい。 In the peptide / β-1,3-glucan complex according to the second aspect of the present invention, in the part of the polynucleotide or polynucleotide derivative that forms the complex having the triple helix structure, the phospho of DNA or RNA 50% or more of the diester bonds may be substituted with phosphorothioate groups.

本発明の第３の態様は、免疫賦活活性を有する部分塩基配列を有するポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体と、本発明の第１の態様に係るペプチド／β−１，３−グルカン複合体とを含む医薬組成物を提供することにより上記課題を解決するものである。 The third aspect of the present invention includes a polynucleotide or polynucleotide derivative having a partial base sequence having immunostimulatory activity and the peptide / β-1,3-glucan complex according to the first aspect of the present invention. The above-described problems are solved by providing a pharmaceutical composition.

本発明の第３の態様に係る医薬組成物において、前記ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体が、β−１，３−グルカン骨格を有する多糖と、水素結合を介して結合し、前記ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体の分子鎖１本と前記β−１，３−グルカン骨格を有する多糖の分子鎖２本とからなる三重螺旋構造を有するポリヌクレオチド／β−１，３−グルカン複合体を形成していてもよい。 In the pharmaceutical composition according to the third aspect of the present invention, the polynucleotide or polynucleotide derivative binds to a polysaccharide having a β-1,3-glucan skeleton via a hydrogen bond, and the polynucleotide or polynucleotide Even if a polynucleotide / β-1,3-glucan complex having a triple helix structure composed of one molecular chain of a derivative and two molecular chains of a polysaccharide having the β-1,3-glucan skeleton is formed. Good.

本発明の第３の態様に係る医薬組成物において、前記ポリヌクレオチド／β−１，３−グルカン複合体を構成する前記β−１，３−グルカン骨格を有する多糖が、シゾフィラン、レンチナン、スクレログルカン及びカードランのいずれかであることが好ましい。 In the pharmaceutical composition according to the third aspect of the present invention, the polysaccharide having the β-1,3-glucan skeleton constituting the polynucleotide / β-1,3-glucan complex is selected from the group consisting of schizophyllan, lentinan and sclerotio. It is preferably one of glucan and curdlan.

本発明の第４の態様は、本発明の第２の態様に係るペプチド／β−１，３−グルカン複合体を含む医薬組成物を提供することにより上記課題を解決するものである。 The fourth aspect of the present invention solves the above problem by providing a pharmaceutical composition comprising the peptide / β-1,3-glucan complex according to the second aspect of the present invention.

本発明によると、以下のような有利な効果が得られる。
（１）β−１，３−グルカン及び抗原性ペプチドの種類、分子量、組み合わせ等に応じて、β−１，３−グルカンと抗原性ペプチドとの結合様式を、β−１，３−グルカンと抗原性ペプチドとの共有結合、β−１，３−グルカンとペプチド／ポリヌクレオチドコンジュゲートのポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体との間の水素結合から選択できるので、広範なβ−１，３−グルカンと抗原性ペプチドの組み合わせについて、ペプチド／β−１，３−グルカン複合体を得ることができる。According to the present invention, the following advantageous effects can be obtained.
(1) Depending on the type, molecular weight, combination, etc. of β-1,3-glucan and antigenic peptide, the binding mode of β-1,3-glucan and antigenic peptide is changed to β-1,3-glucan Since it can be selected from covalent bonds with antigenic peptides, hydrogen bonds between β-1,3-glucans and polynucleotides or polynucleotide derivatives of peptide / polynucleotide conjugates, a wide range of β-1,3-glucans and Peptide / β-1,3-glucan complexes can be obtained for antigenic peptide combinations.

（２）β−１，３−グルカンと抗原性ペプチドとの共有結合を生成させる反応として、アルキンとアジド誘導体との付加環化反応、マレイミド基とチオール基との反応（マイケル付加反応）のいずれかを用いることにより、水を含む極性溶媒中でも迅速かつ高効率に反応を進行させることができる。したがって、短時間に高収率でペプチド／β−１，３−グルカン複合体が得られ、単離精製に要する手間も軽減することが可能になる。したがって、本発明のペプチド／β−１，３−グルカン複合体は、生産性に優れており、低コストで製造することができる。   (2) As a reaction for generating a covalent bond between β-1,3-glucan and an antigenic peptide, any of cycloaddition reaction of alkyne and azide derivative, reaction of maleimide group and thiol group (Michael addition reaction) By using these, the reaction can proceed rapidly and efficiently even in a polar solvent containing water. Therefore, a peptide / β-1,3-glucan complex can be obtained in a high yield in a short time, and the labor required for isolation and purification can be reduced. Therefore, the peptide / β-1,3-glucan complex of the present invention is excellent in productivity and can be produced at low cost.

（３）本発明のペプチド／β−１，３−グルカン複合体を用いることにより、抗原性ペプチドを単独で使用した場合に比べ、抗原性ペプチドに特異的な免疫応答の誘導をより効果的に行うことができる。   (3) By using the peptide / β-1,3-glucan complex of the present invention, the induction of an immune response specific to the antigenic peptide is more effective than when the antigenic peptide is used alone. It can be carried out.

（４）本発明のペプチド／β−１，３−グルカン複合体を、免疫賦活活性を有する部分塩基配列を有するポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体と組み合わせて用いるか、免疫賦活活性を有する部分塩基配列を有するポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体を更に含み、ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体が、β−１，３−グルカンと水素結合を介して結合し、ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体の分子鎖１本とβ−１，３−グルカンの分子鎖２本とからなる三重螺旋構造を有する複合体を形成しているペプチド／β−１，３−グルカン複合体を用いることにより、より効果的に免疫応答の誘導を行うことができる。   (4) The peptide / β-1,3-glucan complex of the present invention is used in combination with a polynucleotide or polynucleotide derivative having a partial base sequence having immunostimulatory activity, or a partial base sequence having immunostimulatory activity is used. A polynucleotide or polynucleotide derivative further comprising a polynucleotide or polynucleotide derivative bound to β-1,3-glucan via a hydrogen bond, and one molecular chain of the polynucleotide or polynucleotide derivative and β-1 By using a peptide / β-1,3-glucan complex forming a complex having a triple helical structure composed of two molecular chains of, 3-glucan, the immune response is induced more effectively. be able to.

（５）本発明のペプチド／β−１，３−グルカン複合体を含む医薬組成物は、抗原性ペプチドを単独で用いた場合よりも、広範な抗原性ペプチドについて、特異的な免疫応答をより効果的に誘導できる。そのため、ワクチンや免疫賦活剤としての応用が期待できる。   (5) The pharmaceutical composition containing the peptide / β-1,3-glucan complex of the present invention exhibits a more specific immune response for a wide range of antigenic peptides than when the antigenic peptide is used alone. Can be guided effectively. Therefore, application as a vaccine or an immunostimulant can be expected.

実施例１における、ｄＡ４０（Ｓ）（ａｌｋｙｎｅ）とＯＶＡ（Ｎ３）の化学構造である。It is the chemical structure of dA40 (S) (alkyne) and OVA (N3) in Example 1. 実施例１における、抗原性ペプチド／ポリヌクレオチドコンジュゲート体作製の結果を示すＨＰＬＣクロマトグラムである。2 is an HPLC chromatogram showing the results of producing an antigenic peptide / polynucleotide conjugate in Example 1. 実施例２における、抗原性ペプチド−ｄＡ４０（Ｓ）とＳＰＧの複合化の結果を示すゲル電気泳動写真である。2 is a gel electrophoresis photograph showing the result of conjugation of antigenic peptide-dA40 (S) and SPG in Example 2. 実施例３における、各サンプルで免疫誘導したマウスの脾臓細胞を抗原性ペプチドで刺激することで産生された、抗原性ペプチド特異的ＩＦＮ−γの産生量を定量した結果を示すグラフである。It is a graph which shows the result of having quantified the production amount of antigenic peptide-specific IFN-γ produced by stimulating spleen cells of mice immunized with each sample with antigenic peptide in Example 3. 実施例４における、各サンプルで免疫誘導したマウスの脾臓細胞を抗原性ペプチドで刺激し増殖した、抗原性ペプチド特異的細胞傷害性Ｔ細胞の割合を示すグラフである。It is a graph which shows the ratio of the antigenic peptide specific cytotoxic T cell which stimulated the spleen cell of the mouse | mouth immunized with each sample in Example 4, and stimulated with the antigenic peptide. 実施例５における、ペプチド／ＣｐＧ／ＳＰＧ三元複合体の作製の結果を示すゲル電気泳動写真である。6 is a gel electrophoresis photograph showing the results of preparation of a peptide / CpG / SPG ternary complex in Example 5. 実施例６における、各サンプルで免疫誘導したマウスの脾臓細胞を抗原性ペプチドで刺激することで産生された、抗原性ペプチド特異的ＩＦＮ−γの産生量を定量した結果を示すグラフである。In Example 6, it is a graph which shows the result of having quantified the production amount of antigenic peptide-specific IFN-γ produced by stimulating spleen cells of mice immunized with each sample with antigenic peptide. 実施例７における、各サンプルで免疫誘導したマウスの脾臓細胞を抗原性ペプチドで刺激し増殖した、抗原性ペプチド特異的細胞傷害性Ｔ細胞の割合を示すグラフである。It is a graph which shows the ratio of the antigenic peptide specific cytotoxic T cell which stimulated and proliferated the spleen cell of the mouse | mouth immunity-induced in each sample in Example 7 with the antigenic peptide. 実施例８における、各サンプルで免疫誘導したマウスの脾臓細胞を抗原性ペプチドで刺激することで産生された、抗原性ペプチド特異的ＩＦＮ−γの産生量を定量した結果を示すグラフである。In Example 8, it is a graph which shows the result of having quantified the production amount of the antigenic peptide specific IFN-γ produced by stimulating the spleen cells of mice immunized with each sample with the antigenic peptide.

以下、本発明を具体化した実施の形態につき説明し、本発明の理解に供する。
本発明の第１の実施の形態に係るペプチド／β−１，３−グルカン複合体は、β−１，３−グルカン骨格を有する多糖（β−１，３−グルカン）と、抗原性を有するペプチド（抗原性ペプチド）が、ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体と共有結合を介して結合したペプチド／ポリヌクレオチドコンジュゲートとを含んでいる。ペプチド／ポリヌクレオチドコンジュゲートのポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体は、β−１，３−グルカンと、水素結合を介して結合し、ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体の分子鎖１本と前記β−１，３−グルカンの分子鎖２本とからなる三重螺旋構造を有する複合体を形成している。Hereinafter, embodiments of the present invention will be described for understanding of the present invention.
The peptide / β-1,3-glucan complex according to the first embodiment of the present invention has an antigenicity with a polysaccharide having a β-1,3-glucan skeleton (β-1,3-glucan). Peptides (antigenic peptides) include polynucleotide / polynucleotide derivatives and peptide / polynucleotide conjugates linked via covalent bonds. The polynucleotide or polynucleotide derivative of the peptide / polynucleotide conjugate binds to β-1,3-glucan via a hydrogen bond, and one molecular chain of the polynucleotide or polynucleotide derivative and the β-1,3 -A complex having a triple helix structure composed of two molecular chains of glucan is formed.

（１）β−１，３−グルカン
β−１，３−グルカンは、ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体の分子鎖１本とβ−１，３−グルカンの分子鎖２本とからなる三重螺旋構造を有する複合体を形成することができるものであれば、任意の種類、分子量のものを特に制限なく用いることができる。β−１，３−グルカン骨格を有する多糖は、ｐｏｌｙ（Ｃ）等の核酸と近似するヘリックスパラメータを有しており（例えば、高橋、小畠、鈴木、Ｐｒｏｇ． Ｐｏｌｙｍ． Ｐｈｙｓ． Ｊｐｎ．２７巻、７６７ページ、及び「Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ」、Ｓｈａｒｗｏｏｄ ａｃａｄｅｍｉｃ ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ、１９９８年を参照）、核酸塩基と水素結合可能な水酸基を有しているため、核酸と相互作用し、三重らせん構造を有する安定な複合体を形成することが知られている。β−１，３−グルカンの具体例としては、シゾフィラン、カードラン、レンチナン、パキマン（ｐａｃｈｙｍａｎ）、グリホラン、スクレログルカン等が挙げられる。これらは、主鎖がβ−結合（β−Ｄ−結合）により結合したグルカンで、側鎖の頻度が異なる天然の多糖である。これらのβ−１，３−グルカンは、化学修飾等の処理を行うことなくそのまま用いてもよいが、通常の過ヨウ素酸化法を用いてその側鎖を適当に間引くことにより、その溶解性を制御することもできる。(1) β-1,3-glucan β-1,3-glucan has a triple helical structure consisting of one molecular chain of a polynucleotide or polynucleotide derivative and two molecular chains of β-1,3-glucan. Any type and molecular weight can be used without particular limitation as long as the complex can be formed. Polysaccharides having a β-1,3-glucan skeleton have helix parameters similar to nucleic acids such as poly (C) (for example, Takahashi, Kominato, Suzuki, Prog. Polym. Phys. Jpn. 27, 767, and “Conformation of Carbohydrates”, Sharwood academic publisher, 1998), which has a hydroxyl group capable of hydrogen bonding with a nucleobase, so that it interacts with nucleic acid and has a stable complex with a triple helix structure. Is known to form. Specific examples of β-1,3-glucan include schizophyllan, curdlan, lentinan, pachyman, glyforan, scleroglucan and the like. These are natural polysaccharides whose main chains are linked by β-linkages (β-D-linkages) and have different side chain frequencies. These β-1,3-glucans may be used as they are without undergoing treatment such as chemical modification, but their solubility can be reduced by thinning out their side chains appropriately using a normal periodate oxidation method. It can also be controlled.

β−１，３−グルカンの分子量は、ペプチド／ヌクレオチドコンジュゲートに含まれるポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体の塩基配列及び塩基長等に応じて適宜調節される。しかし、分子量が小さいと、いわゆるクラスター効果（高分子系の協同現象）が発現し難くなり好ましくない。通常は、核酸と複合体を形成しうるβ−１，３−グルカンの重量平均分子量（分子鎖１本あたり）としては、核酸塩基の種類や高次構造によって異なるが、好ましくは２０００以上、さらに好ましくは４０００以上、より好ましくは６０００以上である。また、ポリヌクレオチド上の核酸塩基と水素結合を形成する水酸基の数は、通常は、５個以上、好ましくは、８個以上、さらに好ましくは、１０個以上必要である。
なお、β−１，３−グルカンの重量平均分子量は、光散乱法、沈降速度法（超遠心法）等の任意の公知の方法を用いて決定することができる。The molecular weight of β-1,3-glucan is appropriately adjusted according to the base sequence and base length of the polynucleotide or polynucleotide derivative contained in the peptide / nucleotide conjugate. However, when the molecular weight is small, the so-called cluster effect (polymeric cooperative phenomenon) is difficult to be exhibited, which is not preferable. Usually, the weight average molecular weight (per molecular chain) of β-1,3-glucan capable of forming a complex with a nucleic acid varies depending on the type of nucleobase and the higher order structure, but preferably 2000 or more, Preferably it is 4000 or more, More preferably, it is 6000 or more. Further, the number of hydroxyl groups that form hydrogen bonds with nucleobases on the polynucleotide is usually 5 or more, preferably 8 or more, and more preferably 10 or more.
The weight average molecular weight of β-1,3-glucan can be determined by using any known method such as a light scattering method or a sedimentation rate method (ultracentrifugation method).

β−１，３−グルカンは、一般に菌類や真性細菌によって産生されるため、これらの微生物を培養後、菌体をホモゲナイズし、細胞溶出分や不溶性残渣等の不純物から超遠心法等の方法により単離することにより得ることができる。一般に、このようにして得られるβ−１，３−グルカンは高分子量（重量平均分子量が数十万程度）で三重らせん構造を取る。必要に応じて低分子化して用いてもよい。低分子化は、β−１，３−グルカンの種類や所望の分子量に応じて、酵素分解、酸加水分解等から適宜適当な方法及び条件を選択して行う。例えば、シゾフィランの場合には、８０％ＤＭＳＯ−硫酸による加水分解等により、種々の分子量を有する一本鎖シゾフィランを得ることができる。   Since β-1,3-glucan is generally produced by fungi and eubacteria, after culturing these microorganisms, the cells are homogenized, and impurities such as cell eluate and insoluble residue are used to obtain a method such as ultracentrifugation. It can be obtained by isolation. In general, the β-1,3-glucan thus obtained has a high molecular weight (weight average molecular weight of about several hundred thousand) and takes a triple helical structure. If necessary, the molecular weight may be lowered. The molecular weight reduction is performed by appropriately selecting appropriate methods and conditions from enzymatic degradation, acid hydrolysis and the like according to the type of β-1,3-glucan and the desired molecular weight. For example, in the case of schizophyllan, single-chain schizophyllan having various molecular weights can be obtained by hydrolysis with 80% DMSO-sulfuric acid.

（２）ペプチド／ポリヌクレオチドコンジュゲート
ペプチド／ポリヌクレオチドコンジュゲートは、抗原性ペプチドと、ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体とが、共有結合を介して結合した複合体である。抗原性ペプチドに結合させたポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体は、上述のとおり、β−１，３−グルカンとの間で三重螺旋構造を有する複合体を形成させることにより、抗原性ペプチドとβ−１，３−グルカンとを結合させる役割を果たす。(2) Peptide / Polynucleotide Conjugate A peptide / polynucleotide conjugate is a complex in which an antigenic peptide and a polynucleotide or polynucleotide derivative are bound via a covalent bond. As described above, the polynucleotide or polynucleotide derivative bound to the antigenic peptide forms a complex having a triple helix structure with β-1,3-glucan, so that the antigenic peptide and β-1 , It plays a role in binding 3-glucan.

「抗原性を有するペプチド」としては、抗原性を有するもの、すなわち、生体の免疫系において異物であると認識され、特異的な抗体産生を引き起こす（免疫応答を誘導する）ものであれば、任意のアミノ酸配列及びアミノ酸残基数を有するものを、特に制限なく用いることができる。本実施の形態に係るペプチド／β−１，３−グルカン複合体の製造に用いられる抗原性ペプチドとしては、食物アレルギー等のアレルギーの原因となるタンパク質、細菌、ウィルス等の病原体、腫瘍細胞等を起源とするタンパク質のうち、エピトープとして作用しうる部分アミノ酸配列を有するものが挙げられる。抗原性ペプチドを構成するアミノ酸残基数は、エピトープとして作用しうる限りにおいて特に制限されないが、多くの場合、５〜３０の範囲内であり、大部分は、８〜１７程度の範囲内にある。   Any “antigenic peptide” may be used as long as it has antigenicity, that is, it is recognized as a foreign substance in the immune system of the living body and causes specific antibody production (induces an immune response). Those having the amino acid sequence and the number of amino acid residues can be used without particular limitation. Examples of antigenic peptides used in the production of the peptide / β-1,3-glucan complex according to the present embodiment include proteins that cause allergies such as food allergies, pathogens such as bacteria and viruses, tumor cells, and the like. Among proteins of origin, those having a partial amino acid sequence that can act as an epitope can be mentioned. The number of amino acid residues constituting the antigenic peptide is not particularly limited as long as it can act as an epitope, but in many cases it is in the range of 5 to 30, and most of it is in the range of about 8 to 17. .

抗原性ペプチドは、起源となるタンパク質の酵素分解、ペプチド合成等の任意の公知の方法を用いて得ることができる。また、抗原性ペプチドのアミノ酸配列は、ペプチドアレイを用いたエピトープ解析等の任意の公知の方法を用いて決定することができる。   The antigenic peptide can be obtained using any known method such as enzymatic degradation of the protein of origin, peptide synthesis and the like. The amino acid sequence of the antigenic peptide can be determined using any known method such as epitope analysis using a peptide array.

抗原性ペプチドに結合させるポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体は、上述のとおり、β−１，３−グルカンとの間で三重螺旋構造を有する複合体を形成できる限りにおいて、任意の塩基配列及び塩基数を有するポリヌクレオチド又はその誘導体を特に制限なく用いることができる。ポリヌクレオチドの具体例としては、β−１，３−グルカンと結合能が高いポリリボアデニル酸（ｐｏｌｙＡ）、ポリリボシチジル酸（ｐｏｌｙＣ）、ポリデオキシリボアデニル酸（ｐｏｌｙ（ｄＡ））、ポリデオキシリボチミジル酸（ｐｏｌｙ（ｄＴ））が挙げられる。ポリヌクレオチドの塩基数は、上述のとおり、β−１，３−グルカンとの間で三重螺旋構造を有する複合体を形成できる限りにおいて特に制限されないが、複合体形成能を向上させるために、ポリヌクレオチドは、β−１，３−グルカンと結合能が高いポリリボアデニル酸（ｐｏｌｙＡ）、ポリリボシチジル酸（ｐｏｌｙＣ）、ポリデオキシリボアデニル酸（ｐｏｌｙ（ｄＡ））、ポリデオキシリボチミジル酸（ｐｏｌｙ（ｄＴ））のいずれかの繰り返し配列を有していることが好ましい。好ましい繰り返し配列を構成する塩基及びヌクレオチドの種類並びに塩基数は、リボヌクレオチド部分の長さ、用いられるβ−１，３−グルカンの種類および分子量等に応じて適宜決定される。例えば、β−１，３−グルカンとしてシゾフィランが用いられる場合には、ポリデオキシヌクレオチド部分が、繰り返し配列としてｐｏｌｙ（ｄＡ）配列を有していることが好ましい。繰り返し配列の長さは、塩基数が少ないと、β−１，３−グルカンとの水素結合による三重螺旋構造の形成が困難であるため、塩基数は、１０以上である必要があり、２０〜８０であることが好ましく、３０〜８０であることが更に好ましい。   As described above, the polynucleotide or polynucleotide derivative to be bound to the antigenic peptide has an arbitrary base sequence and number of bases as long as a complex having a triple helix structure can be formed with β-1,3-glucan. The polynucleotide or derivative thereof can be used without particular limitation. Specific examples of the polynucleotide include polyriboadenylic acid (polyA), polyribocytidylic acid (polyC), polydeoxyriboadenylic acid (poly (dA)), and polydeoxyribothymidylic acid (polyA) having high binding ability to β-1,3-glucan. poly (dT)). The number of bases of the polynucleotide is not particularly limited as long as it can form a complex having a triple helix structure with β-1,3-glucan, as described above, but in order to improve the complex forming ability, Nucleotides are polyriboadenylic acid (polyA), polyribocytidylic acid (polyC), polydeoxyriboadenylic acid (poly (dA)), polydeoxyribothymidylic acid (poly (dT)) having high binding ability to β-1,3-glucan It is preferable to have any of the repeating sequences. The types of bases and nucleotides constituting the repetitive sequence and the number of bases are appropriately determined according to the length of the ribonucleotide portion, the type and molecular weight of β-1,3-glucan used. For example, when schizophyllan is used as β-1,3-glucan, it is preferable that the polydeoxynucleotide moiety has a poly (dA) sequence as a repeating sequence. When the number of bases is small, it is difficult to form a triple helix structure by hydrogen bonding with β-1,3-glucan, so the number of bases must be 10 or more. 80 is preferable, and 30 to 80 is more preferable.

ポリヌクレオチドは、生体内でヌクレアーゼによる分解を受けやすいので、生体内での安定性を向上させるために、ポリヌクレオチドの代わりにポリヌクレオチド誘導体を用いてもよい。ポリヌクレオチド誘導体の例としては、リボヌクレオチドの２’位のヒドロキシル基の全部又は一部がフッ素又はメトキシ基で置換されているもの、ポリリボヌクレオチド（ＲＮＡ）又はポリデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）のホスホジエステル基の全部又は一部がホスホロチオエート基で置換されているもの等が挙げられる。ポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドのホスホジエステル基の一部がホスホロチオエート基で置換されている場合、ホスホジエステル結合の５０％以上がホスホロチオエート基で置換されていることが好ましい。ホスホロチオエート基で置換されるホスホジエステル基の位置は特に制限されず、連続した複数のホスホジエステル基が置換されていてもよく、或いはホスホロチオエート基が互いに隣り合わないように置換されていてもよい。   Since polynucleotides are susceptible to degradation by nucleases in vivo, polynucleotide derivatives may be used instead of polynucleotides in order to improve in vivo stability. Examples of polynucleotide derivatives include those in which all or part of the 2′-position hydroxyl group of ribonucleotide is substituted with fluorine or methoxy group, polyribonucleotide (RNA) or polydeoxyribonucleotide (DNA) phosphodiester And those in which all or part of the group is substituted with a phosphorothioate group. When a part of the phosphodiester group of the polyribonucleotide or polydeoxyribonucleotide is substituted with a phosphorothioate group, it is preferable that 50% or more of the phosphodiester bond is substituted with a phosphorothioate group. The position of the phosphodiester group substituted with the phosphorothioate group is not particularly limited, and a plurality of consecutive phosphodiester groups may be substituted, or the phosphorothioate groups may be substituted so as not to be adjacent to each other.

ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体は、抗原性ペプチドのＮ末端、Ｃ末端、或いは側鎖のいずれに結合していてもよい。両者は、適当な反応性官能基同士の反応により直接結合していてもよく、適当なスペーサーを介して結合していてもよい。反応性官能基としては、抗原性ペプチド及びポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体に存在する官能基をそのまま、或いは化学修飾により活性化したものを用いてもよいが、適当な反応性官能基を導入してもよい。また、ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体は、５’末端側が抗原性ペプチドと結合していてもよく、３’末端側が結合していてもよい。   The polynucleotide or polynucleotide derivative may be bound to any of the N-terminus, C-terminus, or side chain of the antigenic peptide. Both may be directly bonded by a reaction between appropriate reactive functional groups, or may be bonded via an appropriate spacer. As the reactive functional group, the functional group present in the antigenic peptide and the polynucleotide or polynucleotide derivative may be used as it is or by chemical modification, but an appropriate reactive functional group is introduced. Also good. In addition, the polynucleotide or polynucleotide derivative may be bound to the antigenic peptide at the 5 ′ end side or may be bound to the 3 ′ end side.

好ましいペプチド／ポリヌクレオチドコンジュゲートの一例は、下記の式（Ａ）に示すように、ペプチドのＣ末端側に、ホスホロチオエート化ポリデオキシアデニル酸（ｐｏｌｙＡのホスホジエステル基がホスホロチオエート基に置換されたポリヌクレオチド誘導体）の５’末端側が結合した構造を有している。
［抗原性ペプチド］−Ｘ−（ｄＡ（Ｓ））ｘ （Ａ）An example of a preferred peptide / polynucleotide conjugate is a polynucleotide in which phosphorothioated polydeoxyadenylic acid (phosphodiester group of polyA is substituted with a phosphorothioate group on the C-terminal side of the peptide, as shown in the following formula (A) Derivative) has a structure bonded to the 5 ′ end side.
[Antigen peptide] -X- (dA (S)) x (A)

なお、式（Ａ）において、ｄＡ（Ｓ）は、ホスホロチオエート化デオキシアデニル酸を表し、ｘは、例えば２０以上８０以下の整数である。Ｘは、スペーサー又は反応性官能基同士の反応により形成された官能基を表す。スペーサーの一例としては、アルキル基、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等が挙げられる。反応性官能基の組み合わせの例としては、例えば、バイオチップ表面への生体分子の固定に用いられる反応性官能基同士の組み合わせが挙げられ、より具体的には、下記に示すものが挙げられる。   In the formula (A), dA (S) represents phosphorothioated deoxyadenylic acid, and x is an integer of 20 to 80, for example. X represents a functional group formed by a reaction between spacers or reactive functional groups. Examples of the spacer include an alkyl group and polyethylene glycol (PEG). Examples of combinations of reactive functional groups include, for example, combinations of reactive functional groups used for immobilizing biomolecules on the surface of a biochip, and more specifically, those shown below.

（ａ）アルキンとアジド化合物
アルキンとアジド化合物（アジ化物）は、下記に示すような付加環化反応（フイスゲン反応）により、１，２，３−トリアゾール環を形成する。両者は、生体分子を含む多くの有機化合物に導入可能な安定な官能基であり、水を含む溶媒中でも迅速かつほぼ定量的に反応し、殆ど副反応を伴わず、余分な廃棄物を生成しないため、いわゆる「クリックケミストリー」の中心的な反応として、生化学の分野で広く用いられている。アルキン誘導体及びアジド基は、任意の公知の方法を用いて、抗原性ペプチド又はポリヌクレオチド若しくはポリヌクレオチド誘導体に導入することができる。アルキン誘導体としては、プロパルギルアルコール、プロパルギルアミン等の反応性官能基を有するものが容易に入手でき、これらをカルボキシル基やヒドロキシル基等の反応性官能基と直接反応させ、或いはカルボニルジイミダゾール等と共に反応させ、生成するアミド結合、エステル結合、ウレタン結合等を介してアルキン誘導体を導入することができる。アジド基についても、任意の公知の方法を用いて、抗原性ペプチド又はポリヌクレオチド若しくはポリヌクレオチド誘導体に導入することができる。なお、フイスゲン反応は銅触媒の存在下で行われるが、抗原性ペプチド及びリン酸ジエステル基がホスホロチオエート基等の含硫黄官能基で置換されたポリヌクレオチド誘導体には、銅イオンに配位する硫黄原子が存在するため、銅の触媒活性が低下するおそれがある。反応率を向上させるために過剰量の銅を添加することが好ましい。(A) Alkyne and Azide Compound An alkyne and an azide compound (azide) form a 1,2,3-triazole ring by the following cycloaddition reaction (Fisgen reaction). Both are stable functional groups that can be introduced into many organic compounds, including biomolecules, react quickly and almost quantitatively in solvents containing water, with few side reactions and no extra waste. Therefore, it is widely used in the field of biochemistry as a central reaction of so-called “click chemistry”. Alkyne derivatives and azide groups can be introduced into antigenic peptides or polynucleotides or polynucleotide derivatives using any known method. As alkyne derivatives, those having reactive functional groups such as propargyl alcohol and propargylamine are readily available, and these are reacted directly with reactive functional groups such as carboxyl and hydroxyl groups, or reacted with carbonyldiimidazole and the like. The alkyne derivative can be introduced through the amide bond, ester bond, urethane bond, and the like that are generated. An azido group can also be introduced into an antigenic peptide or polynucleotide or polynucleotide derivative using any known method. The Huisgen reaction is carried out in the presence of a copper catalyst, but the antigenic peptide and the polynucleotide derivative in which the phosphodiester group is substituted with a sulfur-containing functional group such as a phosphorothioate group have a sulfur atom coordinated to the copper ion. Since there exists, there exists a possibility that the catalytic activity of copper may fall. It is preferable to add an excessive amount of copper in order to improve the reaction rate.

Figure 0006383740
Figure 0006383740

（ｂ）マレイミド又はビニルスルホンとチオール基
電子求引性のカルボニル基又はスルホン基に隣接する二重結合を有するマレイミド又はビニルスルホンは、中性付近のｐＨで、下記に示すように、チオール基との付加反応（マイケル付加反応）により、安定なチオエーテル誘導体を生成する。適当なスペーサーを有するマレイミド及びビニルスルホン誘導体が市販されているため、抗原性ペプチド又はポリヌクレオチド若しくはポリヌクレオチド誘導体にこれらの官能基を導入することは容易である。抗原性ペプチドにチオール基を導入する場合、システインを含む抗原性ペプチドの場合には、システイン残基側鎖のチオール基を利用できる。ただし、システインは、存在比が低いアミノ酸であるため、抗原性ペプチドのＣ末端側にシステインを導入したものを用いる。チオール基を含むポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体としては、これらの５’末端のヒドロキシル基をチオール基に変換したチオール化ポリヌクレオチドが用いられる。(B) Maleimide or vinyl sulfone and thiol group Maleimide or vinyl sulfone having a double bond adjacent to the electron-withdrawing carbonyl group or sulfone group has a thiol group at a pH near neutrality as shown below. A stable thioether derivative is produced by the addition reaction (Michael addition reaction). Since maleimide and vinyl sulfone derivatives having appropriate spacers are commercially available, it is easy to introduce these functional groups into antigenic peptides or polynucleotides or polynucleotide derivatives. In the case of introducing a thiol group into an antigenic peptide, in the case of an antigenic peptide containing cysteine, the thiol group of the cysteine residue side chain can be used. However, since cysteine is an amino acid having a low abundance ratio, cysteine introduced into the C-terminal side of the antigenic peptide is used. As the polynucleotide or polynucleotide derivative containing a thiol group, a thiolated polynucleotide obtained by converting these 5′-terminal hydroxyl groups into thiol groups is used.

Figure 0006383740
Figure 0006383740

（ｃ）システイン側鎖のチオール基とチオール化ポリヌクレオチドのチオール基
上述のとおり、Ｃ末端側にシステインを導入した抗原性ペプチドのシステイン残基側鎖のチオール基と、チオール化ポリヌクレオチドのチオール基とを反応させ、ジスルフィド基を形成させる。ジスルフィド結合は、還元剤の存在下で切断されるため、上両者に比べ、安定性の点で劣る。(C) The thiol group of the cysteine side chain and the thiol group of the thiolated polynucleotide As described above, the thiol group of the cysteine residue side chain of the antigenic peptide introduced with cysteine on the C-terminal side and the thiol group of the thiolated polynucleotide To form a disulfide group. Since the disulfide bond is cleaved in the presence of a reducing agent, it is inferior in terms of stability compared to the above.

（３）ペプチド／β−１，３−グルカン複合体の製造
シゾフィラン等のβ−１，３−グルカンは、通常、水中で三重らせん構造を呈している。したがって、ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体と複合体を形成するためには、ＤＭＳＯのような溶媒に溶解して分子間水素結合及び疎水性相互作用による会合状態を解いて一本鎖にする。これにポリヌクレオチドを含有する水溶液（又はアルコール等の極性溶媒の溶液）を添加してゆくと、溶媒の極性の増大に伴い、疎水性相互作用によりポリヌクレオチドとβ−１，３−グルカンとが会合し、ポリヌクレオチドの分子鎖を取り込みながら分子内及び分子間でポリヌクレオチドと多糖との会合体が形成される。その結果、１分子のポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体と２分子のβ−１，３−グルカン分子とからなる三重螺旋構造を有する複合体が形成される。複合体の形成は、例えば、ＣＤ（円偏光二色性）スペクトルを測定することにより、コンホメーション変化を調べることによって確認することができる。(3) Production of peptide / β-1,3-glucan complex β-1,3-glucan such as schizophyllan usually exhibits a triple helical structure in water. Therefore, in order to form a complex with a polynucleotide or polynucleotide derivative, it is dissolved in a solvent such as DMSO, and the association state due to intermolecular hydrogen bonding and hydrophobic interaction is released to form a single strand. When an aqueous solution containing a polynucleotide (or a solution of a polar solvent such as alcohol) is added to this, the polynucleotide and β-1,3-glucan are separated by hydrophobic interaction as the solvent polarity increases. The association of the polynucleotide and the polysaccharide is formed within and between the molecules while associating and taking in the molecular chain of the polynucleotide. As a result, a complex having a triple helical structure composed of one molecule of polynucleotide or polynucleotide derivative and two molecules of β-1,3-glucan molecule is formed. The formation of the complex can be confirmed by examining the conformational change, for example, by measuring a CD (circular dichroism) spectrum.

本発明の第２の実施の形態に係るペプチド／β−１，３−グルカン複合体は、β−１，３−グルカン骨格を有する多糖と、アルキンとアジド誘導体との付加環化反応、マレイミド基又はビニルスルホン基とチオール基との反応のいずれかにより生成した共有結合を介して、前β−１，３−グルカン骨格を有する多糖の主鎖又は側鎖上のグルコース残基に結合した抗原性を有するペプチドとを含んでいる。   The peptide / β-1,3-glucan complex according to the second embodiment of the present invention comprises a cycloaddition reaction between a polysaccharide having a β-1,3-glucan skeleton, an alkyne and an azide derivative, a maleimide group Alternatively, antigenicity bound to a glucose residue on the main chain or side chain of a polysaccharide having a pre-β-1,3-glucan skeleton through a covalent bond generated by either a reaction of a vinyl sulfone group and a thiol group And a peptide having

本実施の形態に係るペプチド／β−１，３−グルカン複合体の製造に用いられる抗原性ペプチド、β−１，３−グルカンについては、本発明の第１の実施の形態に係るペプチド／β−１，３−グルカン複合体の製造に用いられるものと同様であるため、詳しい説明を省略する。β−１，３−グルカンと抗原性ペプチドは、アルキンとアジド誘導体との付加環化反応、マレイミド基又はビニルスルホン基とチオール基との反応のいずれかにより生成した共有結合を介して結合している。抗原性ペプチドは、β−１，３−グルカン分子の主鎖及び側鎖のグルコース残基のどちらに結合していてもよいが、立体障害を考慮すると、側鎖のグルコース残基上に結合していることが好ましい。また、抗原性ペプチドは、Ｎ末端側及びＣ末端側のどちらで結合していてもよく、或いは側鎖で結合していてもよいが、抗原提示細胞との接触時の立体障害を考慮すると、Ｎ末端側又はＣ末端側でβ−１，３−グルカンに結合していることが好ましい。β−１，３−グルカン及び抗原性ペプチドへのアルキン誘導体及びアジド基の導入については、本発明の第１の実施の形態に係るペプチド／β−１，３−グルカン複合体の製造におけるペプチド／ヌクレオチドコンジュゲートの場合と同様に、任意の公知の方法を用いて行うことができる。   For the antigenic peptide, β-1,3-glucan used in the production of the peptide / β-1,3-glucan complex according to the present embodiment, the peptide / β according to the first embodiment of the present invention Since it is the same as that used for the production of the -1,3-glucan complex, detailed description thereof is omitted. β-1,3-glucan and the antigenic peptide are bonded via a covalent bond formed by either a cycloaddition reaction between an alkyne and an azide derivative or a reaction between a maleimide group or a vinylsulfone group and a thiol group. Yes. The antigenic peptide may be bound to either the main chain or the side chain glucose residue of the β-1,3-glucan molecule, but in consideration of steric hindrance, it binds to the side chain glucose residue. It is preferable. In addition, the antigenic peptide may be bound at either the N-terminal side or the C-terminal side, or may be bound at the side chain, but in consideration of steric hindrance upon contact with the antigen-presenting cell, It is preferably bound to β-1,3-glucan on the N-terminal side or C-terminal side. Regarding the introduction of the alkyne derivative and the azide group into β-1,3-glucan and the antigenic peptide, the peptide / in the production of the peptide / β-1,3-glucan complex according to the first embodiment of the present invention / As with nucleotide conjugates, any known method can be used.

本発明の第３の実施の形態に係るペプチド／β−１，３−グルカン複合体は、上述の本発明の第１又は第２の実施の形態に係るペプチド／β−１，３−グルカン複合体において、免疫賦活活性を有する部分塩基配列を有するポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体を更に含み、ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体が、β−１，３−グルカンと、水素結合を介して結合し、ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体の分子鎖１本とβ−１，３−グルカンの分子鎖２本とからなる三重螺旋構造を有する複合体（抗原性ペプチド、β−１，３−グルカン、ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体を含む三元複合体）を形成している。   The peptide / β-1,3-glucan complex according to the third embodiment of the present invention is the peptide / β-1,3-glucan complex according to the first or second embodiment of the present invention described above. A polynucleotide or polynucleotide derivative having a partial base sequence having immunostimulatory activity in the body, wherein the polynucleotide or polynucleotide derivative binds to β-1,3-glucan via hydrogen bonding, Or a complex having a triple helical structure consisting of one molecular chain of a polynucleotide derivative and two molecular chains of β-1,3-glucan (antigenic peptide, β-1,3-glucan, polynucleotide or polynucleotide) A ternary complex containing a derivative).

本実施の形態に係るペプチド／β−１，３−グルカン複合体の製造に用いられる抗原性ペプチド、β−１，３−グルカン、ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体中の、β−１，３−グルカンと水素結合を介して結合する部分については、本発明の第１、第２の実施の形態に係るペプチド／β−１，３−グルカン複合体の製造に用いられるものと同様であるため、詳しい説明を省略する。   Β-1,3-glucan in the antigenic peptide, β-1,3-glucan, polynucleotide or polynucleotide derivative used for the production of the peptide / β-1,3-glucan complex according to the present embodiment The portion that binds to a hydrogen bond via a hydrogen bond is the same as that used for the production of the peptide / β-1,3-glucan complex according to the first and second embodiments of the present invention. Description is omitted.

ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体中の、免疫賦活活性を有する部分塩基配列の具体例としては、ＴＬＲ９による認識を介して、自然免疫と獲得免疫の「橋渡し」をすることで免疫を活性化する、バクテリアやウィルスに由来する非メチル化ＣｐＧ ＤＮＡ、ＴＬＲ３による認識を介して、自然免疫と獲得免疫の「橋渡し」をすることで免疫を活性化するウィルス由来の２本鎖ＲＮＡ、ＲＩＧ−Ｉ様受容体（ＲＬＲ）による認識を介して免疫を活性化するウィルスゲノムＲＮＡや人工ＲＮＡ等が挙げられる。   Specific examples of partial nucleotide sequences having immunostimulatory activity in polynucleotides or polynucleotide derivatives include bacteria that activate immunity by “bridging” natural immunity and acquired immunity through recognition by TLR9. Virus-derived double-stranded RNA, RIG-I-like receptor that activates immunity by “bridging” between innate and acquired immunity through recognition by unmethylated CpG DNA, TLR3 Examples thereof include viral genomic RNA and artificial RNA that activate immunity through recognition by (RLR).

上述した免疫賦活活性を有する部分塩基配列を有するＲＮＡ又はＤＮＡと、β−１，３−グルカンと水素結合を介して結合する部分塩基配列を有するポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体とのハイブリッドは、任意の公知の方法を用いて入手又は合成できる。なお、ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体が、ＤＮＡの３’末端側にＲＮＡの５’末端側が結合したキメラ核酸である場合、ＲＮＡとＤＮＡの間のホスホジエステル結合が、特に分解を受けやすくなるため、ＤＮＡと結合したＲＮＡの５’末端側ヌクレオチドにおける２’位のヒドロキシル基をメトキシ基又はフルオロ基で置換し、かつ／又はＤＮＡと結合した最初のリボヌクレオチドの３’位と、それに隣接するＲＮＡの５’位との間のホスホジエステル基をホスホロチオエート基で置換する等の誘導体化を行い、加水分解に対する耐性を向上させておくことが好ましい。   A hybrid of the RNA or DNA having a partial base sequence having the immunostimulatory activity described above and a polynucleotide or polynucleotide derivative having a partial base sequence that binds to β-1,3-glucan via a hydrogen bond is any It can be obtained or synthesized using known methods. When the polynucleotide or polynucleotide derivative is a chimeric nucleic acid in which the 5 ′ end of RNA is bound to the 3 ′ end of DNA, the phosphodiester bond between RNA and DNA is particularly susceptible to degradation. The hydroxyl group at the 2 ′ position in the 5 ′ terminal nucleotide of RNA bound to DNA is substituted with a methoxy group or a fluoro group and / or the 3 ′ position of the first ribonucleotide bound to DNA and the RNA adjacent thereto It is preferable to improve the resistance to hydrolysis by derivatizing the phosphodiester group between the 5′-position and the phosphorothioate group.

本実施の形態に係るペプチド／β−１，３−グルカン複合体は、下記のいずれかの方法により製造される。
（１）上述のβ−１，３−グルカン、ペプチド／ヌクレオチドコンジュゲート及びポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体を、本発明の第１の実施の形態に係るペプチド／β−１，３−グルカン複合体の製造法と同様の方法を用いて複合化させる。
（２）本発明の第２の実施の形態に係るペプチド／β−１，３−グルカン複合体とポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体を、本発明の第１の実施の形態に係るペプチド／β−１，３−グルカン複合体の製造法と同様の方法を用いて複合化させる。The peptide / β-1,3-glucan complex according to the present embodiment is produced by any of the following methods.
(1) The β-1,3-glucan, peptide / nucleotide conjugate and polynucleotide or polynucleotide derivative described above are converted into the peptide / β-1,3-glucan complex according to the first embodiment of the present invention. The composite is made using the same method as the production method.
(2) The peptide / β-1,3-glucan complex and the polynucleotide or polynucleotide derivative according to the second embodiment of the present invention are combined with the peptide / β-1 according to the first embodiment of the present invention. , 3-glucan complex is synthesized using a method similar to the production method.

本発明の第４の実施の形態に係る医薬組成物（以下、「医薬組成物」と略称する。）は、免疫賦活活性を有する部分塩基配列を有するポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体と、β−１，３−グルカン骨格とが、水素結合を介して結合することにより形成され、ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体の分子鎖１本と前記β−１，３−グルカン骨格を有する多糖の分子鎖２本とからなる三重螺旋構造を有するポリヌクレオチド／β−１，３−グルカン複合体と、本発明の第１又は第２の実施の形態に係るペプチド／β−１，３−グルカン複合体、或いは本発明の第３の実施の形態に係るペプチド／β−１，３−グルカン複合体を含んでいる。   A pharmaceutical composition according to the fourth embodiment of the present invention (hereinafter abbreviated as “pharmaceutical composition”) includes a polynucleotide or polynucleotide derivative having a partial base sequence having immunostimulatory activity, β-1 , A 3-glucan skeleton and a molecular chain of a polynucleotide or a polynucleotide derivative, and two molecular chains of a polysaccharide having the β-1,3-glucan skeleton. A polynucleotide / β-1,3-glucan complex having a triple helix structure and the peptide / β-1,3-glucan complex according to the first or second embodiment of the present invention, or the present invention. The peptide / β-1,3-glucan complex according to the third embodiment is included.

ポリヌクレオチド／β−１，３−グルカン複合体は、ペプチド／ヌクレオチドコンジュゲートの代わりにヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体を用いる以外は、本発明の第１の実施の形態に係るペプチド／β−１，３−グルカン複合体と同様の方法を用いて製造される。   The polynucleotide / β-1,3-glucan complex is a peptide / β-1,3 according to the first embodiment of the present invention, except that nucleotides or polynucleotide derivatives are used instead of peptide / nucleotide conjugates. -Manufactured using the same method as the glucan complex.

医薬組成物の製造には、有効成分としてのペプチド／β−１，３−グルカン複合体及びポリヌクレオチド／β−１，３−グルカン複合体に加え、任意の公知の成分（医薬用途に許容される任意の担体、賦形剤及び添加物）及び製剤方法を用いることができる。例えば、医薬組成物は、錠剤、座剤、カプセル剤、シロップ剤、ナノゲル等のマイクロカプセル剤、滅菌液剤、懸濁液剤等の注射剤、エアゾール剤、スプレー剤等の形態を取ることができる。   In the production of the pharmaceutical composition, in addition to the peptide / β-1,3-glucan complex and the polynucleotide / β-1,3-glucan complex as active ingredients, any known component (acceptable for pharmaceutical use). Any carriers, excipients and additives) and formulation methods can be used. For example, the pharmaceutical composition can take the form of tablets, suppositories, capsules, syrups, microcapsules such as nanogels, sterile liquids, injections such as suspensions, aerosols, sprays, and the like.

医薬組成物は、ヒトまたは温血動物（マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌ、サル等）に対し、経口及び非経口経路のいずれによっても投与可能である。非経口投与経路としては、皮下、皮内及び筋中注射、腹腔内投与、点滴、鼻粘膜や咽頭部への噴霧等が挙げられる。   The pharmaceutical composition can be administered to humans or warm-blooded animals (mouse, rat, rabbit, sheep, pig, cow, horse, chicken, cat, dog, monkey, etc.) by either oral or parenteral routes. . Examples of parenteral administration routes include subcutaneous, intradermal and intramuscular injection, intraperitoneal administration, infusion, spraying on the nasal mucosa and pharynx, and the like.

活性成分であるペプチド／β−１，３−グルカン複合体及びポリヌクレオチド／β−１，３−グルカン複合体の用量は、活性、治療対象となる疾患、投与対象となる動物の種類、体重、性別、年齢、疾患の重篤度、投与方法等に応じて異なる。体重６０ｋｇの成人を例に取ると、経口投与の場合、１日当たりの用量は通常約０．１〜約１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜約５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜約２０ｍｇであり、非経口投与の場合、１日当たりの用量は通常約０．０１〜約３０ｍｇ、好ましくは約０．１〜約２０ｍｇ、より好ましくは約０．１〜約１０ｍｇである。他の動物に投与する場合には、上記用量を単位体重当たりの用量に換算後、投与対象となる動物の体重を乗じて得られた用量を用いる。   The doses of the active ingredient peptide / β-1,3-glucan complex and polynucleotide / β-1,3-glucan complex are the activity, the disease to be treated, the type of animal to be administered, the body weight, It varies according to sex, age, severity of disease, administration method and the like. Taking an adult with a body weight of 60 kg as an example, in the case of oral administration, the daily dose is usually about 0.1 to about 100 mg, preferably about 1.0 to about 50 mg, more preferably about 1.0 to about 20 mg. In the case of parenteral administration, the daily dose is usually about 0.01 to about 30 mg, preferably about 0.1 to about 20 mg, more preferably about 0.1 to about 10 mg. When administered to other animals, the dose obtained by converting the above dose to a dose per unit body weight and multiplying by the body weight of the animal to be administered is used.

医薬組成物は、免疫を活性化することによる細菌、ウィルス等の病原体の感染に起因する感染症、ガン等の腫瘍の治療及び予防のためのワクチン等として用いることができる。   The pharmaceutical composition can be used as a vaccine for the treatment and prevention of infectious diseases caused by pathogens such as bacteria and viruses by activating immunity and tumors such as cancer.

次に、本発明の作用効果を確認するために行った実施例について説明する。   Next, examples carried out for confirming the effects of the present invention will be described.

実施例１：抗原性ペプチド／ポリヌクレオチドコンジュゲートの作製
本実施例において、デオキシアデニン４０量体中のリン酸ジエステル結合が全てホスホロチオエート結合に置換された構造を有するポリヌクレオチド誘導体（以下、「ｄＡ４０（Ｓ）」という。）の５’側にアルキンを導入したポリヌクレオチド誘導体（以下、「ｄＡ４０（Ｓ）（ａｌｋｙｎｅ）」という。）（株式会社 ジーンデザイン社より購入）とオボアルブミン（ＯＶＡ）由来の抗原性ペプチド（アミノ酸配列：ＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号１））のＣ末端にアジド基を導入した抗原性ペプチド（以下、「ＯＶＡ（Ｎ３）」）(株式会社 ジーンデザイン社より購入)との抗原性ペプチド／ポリヌクレオチドコンジュゲート体（以下、「ＯＶＡペプチド−ｄＡ４０（Ｓ）」）の作製について検討を行った。化学構造を図１にそれぞれ示す。Example 1 Preparation of Antigenic Peptide / Polynucleotide Conjugate In this example, a polynucleotide derivative (hereinafter referred to as “dA40”) having a structure in which all phosphoric diester bonds in deoxyadenine 40-mer are replaced with phosphorothioate bonds. S) ")) derived from an alkyne on the 5 'side (hereinafter referred to as" dA40 (S) (alkyne) ") (purchased from Gene Design Co., Ltd.) and ovalbumin (OVA) An antigenic peptide with an antigenic peptide (hereinafter referred to as “OVA (N3)”) (purchased from Gene Design Co., Ltd.) having an azido group introduced at the C-terminus of the antigenic peptide (amino acid sequence: SIINFEKL (SEQ ID NO: 1)) / Polynucleotide conjugate (hereinafter referred to as “OVA peptide-dA40 (S) ) Was examined for the production of. The chemical structures are shown in FIG.

ＯＶＡ（Ｎ３）（最終濃度：１０μＭ〜８００μＭ、溶媒：水＋ＤＭＳＯ）、ｄＡ４０（Ｓ）（ａｌｋｙｎｅ）（最終濃度：１０μＭ、溶媒：水）、硫酸銅(II)五水和物(最終濃度：１．５ｍＭ、溶媒：水)、アスコルビン酸ナトリウム（最終濃度：３．０ｍＭ、溶媒：水）、(トリス(１−ベンジル−１Ｈ−１,２,３−トリアゾール−４−イル)メチル)アミン（最終濃度：０．６ｍＭ、溶媒：ＤＭＳＯ）となるように混合し、室温で１時間、銅触媒を用いたクリックケミストリーを行った。反応後、キレート剤であるｐＨ７．４のエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）溶液（最終濃度：２０ｍＭ以上）でサンプル溶液を希釈した後、ＨＰＬＣ測定を行った。ｄＡ４０（Ｓ）とＨＰＬＣカラムの相互作用が強力で溶出されにくいため、ＥＤＴＡを添加することでその相互作用を弱め、溶出されやすいようにした。   OVA (N3) (final concentration: 10 μM to 800 μM, solvent: water + DMSO), dA40 (S) (alkyne) (final concentration: 10 μM, solvent: water), copper (II) sulfate pentahydrate (final concentration: 1) .5 mM, solvent: water), sodium ascorbate (final concentration: 3.0 mM, solvent: water), (tris (1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl) methyl) amine (final Concentration: 0.6 mM, Solvent: DMSO), and click chemistry using a copper catalyst was performed at room temperature for 1 hour. After the reaction, the sample solution was diluted with a 7.4 ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) solution (final concentration: 20 mM or more) as a chelating agent, and then HPLC measurement was performed. Since the interaction between dA40 (S) and the HPLC column is strong and difficult to elute, the interaction was weakened by adding EDTA so that it was easily eluted.

ＨＰＬＣ測定では、カラムとしてＩｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−３（ジーエルサイエンス社）、溶離液として０．１Ｍトリエチルアミン−酢酸（ＴＥＡＡ）バッファー（ｐＨ７．０）とアセトニトリル、検出器としてダイオードアレイを用い、２６０ｎｍでのｄＡ４０（Ｓ）（ａｌｋｙｎｅ）のＵＶ吸収変化を追跡した。結果を図２に示す。ｄＡ４０（Ｓ）（ａｌｋｙｎｅ）のピークがペプチドを加えることで、１７分付近から２０分付近へペプチド量依存的にシフトしていることが確認された。逆相カラムを用いた測定において、溶出時間が遅くなることは分子がより疎水的になったことを示唆する。この結果から、ＯＶＡペプチド−ｄＡ４０（Ｓ）が生成したことがわかった。   For HPLC measurement, Inertsil ODS-3 (GL Sciences Inc.) was used as a column, 0.1 M triethylamine-acetic acid (TEAA) buffer (pH 7.0) and acetonitrile were used as an eluent, a diode array was used as a detector, and dA40 at 260 nm ( The UV absorption change of S) (alkyne) was followed. The results are shown in FIG. It was confirmed that the peak of dA40 (S) (alkyne) was shifted from around 17 minutes to around 20 minutes depending on the amount of peptide by adding the peptide. In a measurement using a reverse phase column, a slower elution time suggests that the molecule is more hydrophobic. From this result, it was found that OVA peptide-dA40 (S) was produced.

実施例２：抗原性ペプチド／ポリヌクレオチドコンジュゲートとβ−１，３−グルカン骨格を有する多糖の複合化
本実施例において、β−１，３−グルカン骨格を有する多糖として用いたシゾフィラン（ＳＰＧ）は、特開２０１０−１７４１０７号公報の実施例に記載の方法を用いて得た。これを所定の方法にて、精製した。ＧＰＣにより分子量を算出したところ、１本鎖状態では１５万で、３本鎖では４５万であった。このＳＰＧと、実施例１で調製したＯＶＡペプチド−ｄＡ４０（Ｓ）との複合化について検討を行った。Example 2: Conjugation of an antigenic peptide / polynucleotide conjugate and a polysaccharide having a β-1,3-glucan skeleton Schizophyllan (SPG) used as a polysaccharide having a β-1,3-glucan skeleton in this example Was obtained using the method described in the examples of JP 2010-174107 A. This was purified by a predetermined method. When the molecular weight was calculated by GPC, it was 150,000 in the single-stranded state and 450,000 in the triple-stranded state. Conjugation of this SPG and the OVA peptide-dA40 (S) prepared in Example 1 was examined.

上述したとおり、ＳＰＧ等のβ−１，３−グルカンは、アルカリ水溶液中では１本鎖に解離しているが、リン酸緩衝液を添加することにより、β−１，３−グルカンを含む溶液が中和されると、β−１，３−グルカン３分子が水素結合を介して会合し、三重螺旋構造が再生される。このとき、混合物中にｄＡ４０（Ｓ）等のポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体が存在すると、ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体１分子とβ−１，３−グルカン２分子とが、水素結合及び疎水性相互作用を介して会合し、三重螺旋構造を有する複合体が生成することは、本発明者により見出された。本実施例では、ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体の一例であるｄＡ４０（Ｓ）に抗原性ペプチドが結合した抗原性ペプチド−ＤＡ４０（Ｓ）とＳＰＧとの組み合わせにおいても、同様に三重螺旋構造を有する複合体が生成するかについて検証を行った。   As described above, β-1,3-glucan such as SPG is dissociated into a single strand in an alkaline aqueous solution, but a solution containing β-1,3-glucan by adding a phosphate buffer. Is neutralized, three β-1,3-glucan molecules associate through hydrogen bonds, and the triple helix structure is regenerated. At this time, when a polynucleotide or a polynucleotide derivative such as dA40 (S) is present in the mixture, one molecule of the polynucleotide or polynucleotide derivative and two molecules of β-1,3-glucan are bonded with hydrogen bonds and hydrophobic interaction. It has been found by the present inventor that a complex having a triple helix structure is formed through association. In this example, the combination of antigenic peptide-DA40 (S) and SPG in which an antigenic peptide is bound to dA40 (S), which is an example of a polynucleotide or polynucleotide derivative, similarly has a triple helical structure. We verified whether the body generates.

０．２５Ｎ ＮａＯＨ溶液にＳＰＧを溶解し（１５ｍｇ／ｍＬ）、完全に１本鎖に解離させるために２日以上放置したものを用いた。ＯＶＡペプチド−ｄＡ４０（Ｓ）の１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）水溶液（１０体積％のＤＭＳＯを含む水を溶媒とする溶液。以下同じ。）と、リン酸緩衝液（３３０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ４．５）を混合後、上述のＳＰＧ溶液を添加し、撹拌した。なお、ＳＰＧとＯＶＡペプチド−ｄＡ４０（Ｓ）の混合比はモル比で３：１であり、ＳＰＧ溶液とリン酸緩衝液の体積比は１：１となるよう、各溶液の濃度を調整した。４℃で一晩静置させた後、撹拌後の反応混合物のアクリルアミドゲル電気泳動を行った。比較のため、抗原性ペプチド−ｄＡ４０（Ｓ）についてもアクリルアミド電気泳動を行った。SPG was dissolved in a 0.25N NaOH solution (15 mg / mL), and the one that was allowed to stand for 2 days or more to completely dissociate into a single strand was used. 10% dimethyl sulfoxide (DMSO) aqueous solution of OVA peptide-dA40 (S) (a solution containing 10% by volume of DMSO in water. The same applies hereinafter) and a phosphate buffer (330 mM NaH 2 PO 4 , pH 4. After mixing 5), the above SPG solution was added and stirred. The concentration ratio of each solution was adjusted so that the mixing ratio of SPG and OVA peptide-dA40 (S) was 3: 1 by molar ratio, and the volume ratio of SPG solution to phosphate buffer was 1: 1. After allowing to stand overnight at 4 ° C., the reaction mixture after stirring was subjected to acrylamide gel electrophoresis. For comparison, acrylamide electrophoresis was also performed on the antigenic peptide-dA40 (S).

電気泳動後、アクリルアミドゲルをＳＹＢＲ Ｇｏｌｄで染色し、蛍光画像を撮影した結果を図３に示す。撹拌後の反応混合物のレーン（レーン２：ｃｏｍｐｌｅｘ（ｐｅｐｔｉｄｅ／ＳＰＧ））では、レーン１（ｐｅｐｔｉｄｅ−ｄＡ４０Ｓ）において観測されるＯＶＡペプチド−ｄＡ４０（Ｓ）のバンドが消失していることが確認された。この結果から、ＯＶＡペプチド−ｄＡ４０（Ｓ）がＳＰＧと複合化し、より高分子量の複合体（ＯＶＡペプチド−ｄＡ４０（Ｓ）／ＳＰＧ複合体）が生成したことがわかった。   FIG. 3 shows the result of staining the acrylamide gel with SYBR Gold after electrophoresis and photographing the fluorescence image. In the lane of the reaction mixture after stirring (lane 2: complex (peptide / SPG)), it was confirmed that the band of OVA peptide-dA40 (S) observed in lane 1 (peptide-dA40S) disappeared. . From this result, it was found that OVA peptide-dA40 (S) was complexed with SPG to produce a higher molecular weight complex (OVA peptide-dA40 (S) / SPG complex).

実施例３：マウス脾細胞における、抗原性ペプチドによる抗原特異的免疫応答に抗原性ペプチドとＳＰＧとの複合化が及ぼす影響の評価
（１）オボアルブミン（ＯＶＡ）由来のアミノ酸配列（配列番号１）を有する抗原性ペプチド（ＯＶＡペプチド）（５μｇ）、（２）ＯＶＡペプチド（５μｇ）及びＣｐＧ ＤＮＡ（塩基配列：ＡＴＣＧＡＣＴＣＴＣＧＡＧＣＧＴＴＣＴＣ（配列番号２））（３０μｇ）、（３）ＯＶＡペプチド−ｄＡ４０（Ｓ）／ＳＰＧ複合体（実施例１参照、５μｇ）、（４）ＯＶＡペプチド−ｄＡ４０（Ｓ）／ＳＰＧ複合体（実施例１で調製、５μｇ）及びＣｐＧ ＤＮＡ（３０μｇ）、（５）ＯＶＡペプチド−ｄＡ４０（Ｓ）／ＳＰＧ複合体（５μｇ）及びフロイトの不完全アジュバント（ＩＦＡ）（３０μｇ）のいずれかを、マウス（Ｃ５７ＢＬ／６マウス、雄性、７週齢）皮内に投与（１回）した。投与から１週間後に、マウスより脾細胞を採取後、９６ウェルに播種し（１．０×１０６ ｃｅｌｌｓ／ウェル）、ＯＶＡペプチドで刺激（１０μｇ/ｍＬ）し、抗原特異的なインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）が誘導されるかについて検討した。Example 3: Evaluation of the effect of complexation of antigenic peptide and SPG on antigen-specific immune response by antigenic peptide in mouse splenocytes (1) Amino acid sequence derived from ovalbumin (OVA) (SEQ ID NO: 1) (2) OVA peptide (5 μg) and CpG DNA (base sequence: ATCGAACTCTCGAGCGTCTC (SEQ ID NO: 2)) (30 μg), (3) OVA peptide-dA40 (S) / SPG complex (see Example 1, 5 μg), (4) OVA peptide-dA40 (S) / SPG complex (prepared in Example 1, 5 μg) and CpG DNA (30 μg), (5) OVA peptide-dA40 ( S) / SPG complex (5 μg) and Freud's incomplete adjuvant (IFA) (30 μg) Was intradermally administered (once) to mice (C57BL / 6 mice, male, 7 weeks old). One week after administration, spleen cells were collected from mice, seeded in 96 wells (1.0 × 10 6 cells / well), stimulated with OVA peptide (10 μg / mL), and antigen-specific interferon-γ ( Whether IFN-γ) was induced was examined.

ＯＶＡペプチドによる脾細胞への刺激２４時間後に、酵素結合免疫測定（ＥＬＩＳＡ）を用いて、培地中のＩＦＮ−γ量を定量した。結果を図４に示す。ＯＶＡペプチドのみ投与した場合、ＯＶＡペプチド及びＣｐＧ ＤＮＡを同時投与した場合、ＯＶＡペプチド−ｄＡ４０（Ｓ）／ＳＰＧ複合体のみを投与した場合については、ＯＶＡペプチドに特異的なインターフェロン応答は見られなかった。ＯＶＡペプチド−ｄＡ４０（Ｓ）／ＳＰＧ複合体を市販のアジュバントであるフロイトの不完全アジュバント（ＩＦＡ）と同時投与した場合においても、その応答は非常に小さいものであった。しかし、ＯＶＡペプチド−ｄＡ４０（Ｓ）／ＳＰＧ複合体をＣｐＧ ＤＮＡと同時に投与した場合、顕著な免疫応答（ＩＦＮ−γの産生量の増大）が誘起できることが確認された。ＯＶＡペプチドのみを投与した場合には、体内から速やかに排除されてしまうのに対し、ＯＶＡペプチド−ｄＡ４０（Ｓ）をＳＰＧと複合化させることにより、抗原提示細胞への取り込みが促進され、そこに、ＴＬＲ９に対するＣｐＧ ＤＮＡの刺激が加わることにより、抗原特異的Ｔ細胞の割合が増加したためと考えられる。   After 24 hours of stimulation of splenocytes with OVA peptide, the amount of IFN-γ in the medium was quantified using enzyme-linked immunoassay (ELISA). The results are shown in FIG. When OVA peptide alone was administered, when OVA peptide and CpG DNA were coadministered, and when only OVA peptide-dA40 (S) / SPG complex was administered, no interferon response specific to OVA peptide was observed. . Even when the OVA peptide-dA40 (S) / SPG complex was co-administered with Freud's incomplete adjuvant (IFA), a commercially available adjuvant, the response was very small. However, it was confirmed that when the OVA peptide-dA40 (S) / SPG complex was administered simultaneously with CpG DNA, a significant immune response (an increase in the amount of IFN-γ production) could be induced. When only the OVA peptide is administered, it is quickly eliminated from the body, whereas by combining OVA peptide-dA40 (S) with SPG, the uptake into antigen-presenting cells is promoted, This is probably because the ratio of antigen-specific T cells increased due to the addition of CpG DNA stimulation to TLR9.

実施例４：抗原性ペプチド特異的細胞傷害性Ｔ細胞の誘導能に抗原性ペプチドとＳＰＧとの複合化が及ぼす影響の評価
実施例３において、（１）ＯＶＡペプチド、（２）ＯＶＡペプチド及びＣｐＧ ＤＮＡ、（３）ＯＶＡペプチド−ｄＡ４０（Ｓ）／ＳＰＧ複合体、（４）ＯＶＡペプチド−ｄＡ４０（Ｓ）／ＳＰＧ複合体及びＣｐＧ ＤＮＡのいずれかを皮内投与したマウスより採取し、ＯＶＡペプチド−ｄＡ４０（Ｓ）／ＳＰＧ複合体で刺激したマウス脾細胞を６日間培養し、抗体染色後、フローサイトメーターを用いて、ＯＶＡペプチドに特異的な細胞傷害性（ＣＤ８陽性）Ｔ細胞の割合を評価した。Example 4: Evaluation of the effect of complexing antigenic peptide and SPG on the ability to induce antigenic peptide-specific cytotoxic T cells In Example 3, (1) OVA peptide, (2) OVA peptide and CpG DNA, (3) OVA peptide-dA40 (S) / SPG complex, (4) OVA peptide-dA40 (S) / SPG complex, and CpG DNA were collected from mice administered intradermally, and OVA peptide- Mouse splenocytes stimulated with dA40 (S) / SPG complex were cultured for 6 days, and after antibody staining, the percentage of cytotoxic (CD8 positive) T cells specific for OVA peptide was evaluated using a flow cytometer did.

脾細胞中のＯＶＡペプチドに特異的なＣＤ８陽性Ｔ細胞の割合を図５に示す。ＯＶＡペプチドのみ投与した場合（ｐｅｐｔｉｄｅ）、ＯＶＡペプチド及びＣｐＧ ＤＮＡを同時投与した場合（ｐｅｐｔｉｄｅ＋ＣｐＧ）、ＯＶＡペプチド−ｄＡ４０（Ｓ）／ＳＰＧ複合体のみを投与した場合（ｐｅｐｔｉｄｅ／ＳＰＧ）のいずれについても、ＯＶＡペプチドに特異的なＣＤ８陽性Ｔ細胞の割合は少ないが、ＯＶＡペプチド−ｄＡ４０（Ｓ）／ＳＰＧ複合体をＣｐＧ ＤＮＡと同時に投与した場合（ｐｅｐｔｉｄｅ／ＳＰＧ＋ＣｐＧ）には、ＯＶＡペプチドに特異的なＣＤ８陽性Ｔ細胞の割合が有意に増加していることが確認された。   The ratio of CD8 positive T cells specific for OVA peptide in splenocytes is shown in FIG. When only OVA peptide is administered (peptide), when OVA peptide and CpG DNA are administered simultaneously (peptide + CpG), when only OVA peptide-dA40 (S) / SPG complex is administered (peptide / SPG), Although the proportion of CD8 positive T cells specific for OVA peptide is small, when OVA peptide-dA40 (S) / SPG complex is administered simultaneously with CpG DNA (peptide / SPG + CpG), CD8 specific for OVA peptide It was confirmed that the proportion of positive T cells was significantly increased.

実施例５：抗原性ペプチド、免疫賦活活性を有する部分塩基配列を有するポリヌクレオチド誘導体及びβ−１，３−グルカン骨格を有する多糖の複合化
ＳＰＧと、ＯＶＡペプチド−ｄＡ４０（Ｓ）、ＣｐＧ ＤＮＡ−ｄＡ４０（Ｓ）との同時複合化について検討を行った。Example 5: Conjugation of an antigenic peptide, a polynucleotide derivative having a partial base sequence with immunostimulatory activity and a polysaccharide having a β-1,3-glucan skeleton SPG, OVA peptide-dA40 (S), CpG DNA- The simultaneous complexing with dA40 (S) was examined.

０．２５Ｎ ＮａＯＨ溶液にＳＰＧを溶解し（１５ｍｇ／ｍＬ）、完全に１本鎖に解離させるために２日以上放置したものを用いた。ＣｐＧ ＤＮＡ−ｄＡ４０（Ｓ）（ＣｐＧ ＤＮＡの３’−末端側にｄＡ４０（Ｓ）が結合した構造を有するポリヌクレオチド誘導体）の水溶液と、ＯＶＡペプチド−ｄＡ４０（Ｓ）の１０％ＤＭＳＯ水溶液と、リン酸緩衝液（３３０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４，ｐＨ４．５）を混合し、上述のＳＰＧ溶液を添加し、撹拌した。なお、ＳＰＧとＯＶＡペプチド−ｄＡ４０（Ｓ）の混合比、ＳＰＧとＣｐＧ ＤＮＡ−ｄＡ４０（Ｓ）の混合比は、共にモル比で３：１であり、ＳＰＧ溶液とリン酸緩衝液の体積比は１：１となるよう、各溶液の濃度を調整した。SPG was dissolved in a 0.25N NaOH solution (15 mg / mL), and the one that was allowed to stand for 2 days or more to completely dissociate into a single strand was used. An aqueous solution of CpG DNA-dA40 (S) (a polynucleotide derivative having a structure in which dA40 (S) is bound to the 3′-terminal side of CpG DNA), a 10% DMSO aqueous solution of OVA peptide-dA40 (S), phosphorus An acid buffer (330 mM NaH 2 PO 4 , pH 4.5) was mixed, and the above SPG solution was added and stirred. The mixing ratio of SPG and OVA peptide-dA40 (S) and the mixing ratio of SPG and CpG DNA-dA40 (S) are both 3: 1 by molar ratio, and the volume ratio of SPG solution to phosphate buffer is The concentration of each solution was adjusted to be 1: 1.

電気泳動後、アクリルアミドゲルをＳＹＢＲ Ｇｏｌｄで染色し、蛍光画像を撮影した結果を図６に示す。撹拌後の反応混合物のレーン（レーン３：ｃｏｍｐｌｅｘ（ｐｅｐｔｉｄｅ／ＣｐＧ／ＳＰＧ））では、レーン１において観測されるＯＶＡペプチド−ｄＡ４０（Ｓ）のバンド及びレーン２において観測されるＣｐＧ ＤＮＡ−ｄＡ４０（Ｓ）のバンドが共に消失していることが確認された。この結果から、抗原性ペプチド−ｄＡ４０（Ｓ）及びＣｐＧ ＤＮＡ−ｄＡ４０（Ｓ）の両者がＳＰＧと複合化し、より高分子量の複合体（ＯＶＡペプチド−ｄＡ４０（Ｓ）／ＣｐＧ ＤＮＡ−ｄＡ４０（Ｓ）／ＳＰＧ三元複合体）が生成したことがわかった。本実施例では、三元複合体１分子当たり、最大７本のｄＡ４０（Ｓ）の分子鎖が含まれるよう、ＳＰＧ、ＯＶＡペプチド−ｄＡ４０（Ｓ）及びＣｐＧ ＤＮＡ−ｄＡ４０（Ｓ）のモル比を調節している。また、ＯＶＡペプチド−ｄＡ４０（Ｓ）及びＣｐＧ ＤＮＡ−ｄＡ４０（Ｓ）のモル比は１：１であり、両者の間にＳＰＧとの複合体形成能に差はないと考えられることから、三元複合体が生成していると考えられる。   FIG. 6 shows the result of staining the acrylamide gel with SYBR Gold after electrophoresis and photographing the fluorescence image. In the lane of the reaction mixture after stirring (lane 3: complex (peptide / CpG / SPG)), the band of OVA peptide-dA40 (S) observed in lane 1 and CpG DNA-dA40 (S ) Band disappeared together. From this result, both antigenic peptide-dA40 (S) and CpG DNA-dA40 (S) were complexed with SPG, and a higher molecular weight complex (OVA peptide-dA40 (S) / CpG DNA-dA40 (S) / SPG ternary complex). In this example, the molar ratio of SPG, OVA peptide-dA40 (S) and CpG DNA-dA40 (S) is set so that up to 7 molecular chains of dA40 (S) are included per molecule of the ternary complex. It is adjusting. In addition, the molar ratio of OVA peptide-dA40 (S) and CpG DNA-dA40 (S) is 1: 1, and it is considered that there is no difference in complex formation ability with SPG between them. It is considered that a complex is formed.

ＯＶＡペプチド以外の抗原性ペプチドとして、下記のアミノ酸配列を有する抗原性ペプチド／ヌクレオチドコンジュゲートについて、上述の方法により三元複合体を調製した。   As an antigenic peptide other than the OVA peptide, a ternary complex was prepared by the above-described method for an antigenic peptide / nucleotide conjugate having the following amino acid sequence.

Figure 0006383740
Figure 0006383740

実施例６：抗原性ペプチド／ＣｐＧ／ＳＰＧ三元複合体によるペプチド特異的免疫応答の評価
（１）実施例２で調製したＯＶＡペプチド−ｄＡ４０（Ｓ）／ＳＰＧ複合体（５μｇ）、（２）ＯＶＡペプチド−ｄＡ４０（Ｓ）／ＳＰＧ複合体（５μｇ）及びＣｐＧ ＤＮＡ（３０μｇ）、（３）ＯＶＡペプチド−ｄＡ４０（Ｓ）／ＳＰＧ複合体（５μｇ）及びＣｐＧ ＤＮＡ−ｄＡ４０（Ｓ）／ＳＰＧ複合体（ＯＶＡペプチド−ｄＡ４０（Ｓ）の１０％ＤＭＳＯ水溶液を用いない以外は、実施例５と同様の方法により調製：３０μｇ）、（４）実施例５で調製したＯＶＡペプチド−ｄＡ４０（Ｓ）／ＣｐＧ ＤＮＡ−ｄＡ４０（Ｓ）／ＳＰＧ三元複合体（５μｇ）のいずれかを、マウス（Ｃ５７ＢＬ／６マウス、雄性、７週齢）皮内に投与（１回）した。投与から１週間後に、マウスより脾細胞を採取後、９６ウェルに播種し（１．０×１０６ ｃｅｌｌｓ／ウェル）、ＯＶＡペプチドで刺激（１０μｇ/ｍＬ）し、抗原特異的なインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）が誘導されるかについて検討した。Example 6: Evaluation of peptide-specific immune response by antigenic peptide / CpG / SPG ternary complex (1) OVA peptide-dA40 (S) / SPG complex (5 μg) prepared in Example 2 (2) OVA peptide-dA40 (S) / SPG complex (5 μg) and CpG DNA (30 μg), (3) OVA peptide-dA40 (S) / SPG complex (5 μg) and CpG DNA-dA40 (S) / SPG complex (Prepared by the same method as in Example 5 except that 10% DMSO aqueous solution of OVA peptide-dA40 (S) is not used: 30 μg), (4) OVA peptide-dA40 (S) / CpG prepared in Example 5 Any of DNA-dA40 (S) / SPG ternary complex (5 μg) was intradermally administered to mice (C57BL / 6 mice, male, 7 weeks old) (once). . One week after administration, spleen cells were collected from mice, seeded in 96 wells (1.0 × 10 6 cells / well), stimulated with OVA peptide (10 μg / mL), and antigen-specific interferon-γ ( Whether IFN-γ) was induced was examined.

ＯＶＡペプチドによる脾細胞への刺激２４時間後に、酵素結合免疫測定（ＥＬＩＳＡ）を用いて、培地中のＩＦＮ−γ量を定量した。結果を図７に示す。実施例３に示したように、ＯＶＡペプチド−ｄＡ４０（Ｓ）／ＳＰＧ複合体のみではＯＶＡペプチドに特異的なインターフェロン応答が誘導できないが、ＯＶＡペプチド−ｄＡ４０（Ｓ）／ＳＰＧ複合体及びＣｐＧ ＤＮＡを同時に投与すると、強いインターフェロン応答が誘導された。さらに、ＯＶＡペプチド−ｄＡ４０（Ｓ）／ＣｐＧ ＤＮＡ−ｄＡ４０（Ｓ）／ＳＰＧ三元複合体の投与によっても、ＯＶＡペプチド−ｄＡ４０（Ｓ）／ＳＰＧ複合体及びＣｐＧ ＤＮＡを同時に投与した場合と同程度のインターフェロン誘導が確認された。興味深いことには、ＯＶＡペプチド−ｄＡ４０（Ｓ）／ＳＰＧ複合体及びＣｐＧ ＤＮＡ−ｄＡ４０（Ｓ）／ＳＰＧ複合体を同時に投与した場合に、強いインターフェロン応答が誘導されることが確認された。これらの結果より、ＯＶＡペプチド−ｄＡ４０（Ｓ）／ＣｐＧ ＤＮＡ−ｄＡ４０（Ｓ）／ＳＰＧ三元複合体の投与によっても、抗原提示細胞へのＯＶＡペプチドの取り込み及びＣｐＧ ＤＮＡによるＴＬＲ９を介した細胞刺激のそれぞれの効果が発揮できていることがわかる。   After 24 hours of stimulation of splenocytes with OVA peptide, the amount of IFN-γ in the medium was quantified using enzyme-linked immunoassay (ELISA). The results are shown in FIG. As shown in Example 3, the OVA peptide-dA40 (S) / SPG complex alone cannot induce an interferon response specific to the OVA peptide, but the OVA peptide-dA40 (S) / SPG complex and CpG DNA When administered simultaneously, a strong interferon response was induced. Furthermore, the administration of OVA peptide-dA40 (S) / CpG DNA-dA40 (S) / SPG ternary complex is similar to the case where OVA peptide-dA40 (S) / SPG complex and CpG DNA are administered simultaneously. Induction of interferon was confirmed. Interestingly, it was confirmed that a strong interferon response was induced when the OVA peptide-dA40 (S) / SPG complex and the CpG DNA-dA40 (S) / SPG complex were administered simultaneously. From these results, even when OVA peptide-dA40 (S) / CpG DNA-dA40 (S) / SPG ternary complex was administered, uptake of OVA peptide into antigen-presenting cells and cell stimulation via CLR DNA by CpG DNA It can be seen that each of the effects can be demonstrated.

実施例７：抗原性ペプチド／ＣｐＧ／ＳＰＧ三元複合体によるペプチド特異的細胞傷害性Ｔ細胞の誘導能の評価
実施例６において、（１）ＯＶＡペプチド、（２）ＯＶＡペプチド及びＣｐＧ ＤＮＡ、（３）ＯＶＡペプチド及びＣｐＧ ＤＮＡ−ｄＡ４０（Ｓ）／ＳＰＧ複合体、（４）実施例５で調製したＯＶＡペプチド−ｄＡ４０（Ｓ）／ＣｐＧ ＤＮＡ−ｄＡ４０（Ｓ）／ＳＰＧ三元複合体のいずれかを皮内投与したマウスより採取し、ＯＶＡペプチド−ｄＡ４０（Ｓ）／ＳＰＧ複合体で刺激したマウス脾細胞を６日間培養し、抗体染色後、フローサイトメーターを用いて、ＯＶＡペプチドに特異的な細胞傷害性（ＣＤ８陽性）Ｔ細胞の割合を評価した。Example 7: Evaluation of inducing ability of peptide-specific cytotoxic T cells by antigenic peptide / CpG / SPG ternary complex In Example 6, (1) OVA peptide, (2) OVA peptide and CpG DNA, ( 3) OVA peptide and CpG DNA-dA40 (S) / SPG complex, (4) any of OVA peptide-dA40 (S) / CpG DNA-dA40 (S) / SPG ternary complex prepared in Example 5 Mouse spleen cells collected from mice administered intradermally and stimulated with OVA peptide-dA40 (S) / SPG complex were cultured for 6 days. After antibody staining, specific for OVA peptide using a flow cytometer The percentage of cytotoxic (CD8 positive) T cells was evaluated.

ＣＤ８陽性Ｔ細胞中のうち、ＯＶＡペプチドに特異的なＣＤ８陽性Ｔ細胞の割合を図８に示す。ＯＶＡペプチドのみ投与した場合（ｐｅｐｔｉｄｅ）、ＯＶＡペプチド及びＣｐＧ ＤＮＡを同時投与した場合（ｐｅｐｔｉｄｅ＋ＣｐＧ）と比較して、ＯＶＡペプチド−ｄＡ４０（Ｓ）／ＳＰＧ複合体及びＣｐＧ ＤＮＡ−ｄＡ４０（Ｓ）／ＳＰＧ複合体を投与した場合（ｐｅｐｔｉｄｅ＋ＣｐＧ／ＳＰＧ）、或いはＯＶＡペプチド−ｄＡ４０（Ｓ）／ＣｐＧ ＤＮＡ−ｄＡ４０（Ｓ）／ＳＰＧ三元複合体を投与した場合（ｐｅｐｔｉｄｅ／ＣｐＧ／ＳＰＧ）に、ＯＶＡペプチドに特異的なＣＤ８陽性Ｔ細胞の割合を増大させることができた。   FIG. 8 shows the proportion of CD8-positive T cells specific for the OVA peptide among CD8-positive T cells. OVA peptide-dA40 (S) / SPG complex and CpG DNA-dA40 (S) / SPG complex when OVA peptide alone is administered (peptide), compared to when OVA peptide and CpG DNA are coadministered (peptide + CpG) Specific to OVA peptide when administered (peptide + CpG / SPG) or OVA peptide-dA40 (S) / CpG DNA-dA40 (S) / SPG ternary complex (peptide / CpG / SPG) The proportion of typical CD8 positive T cells could be increased.

実施例８：メラノーマ細胞特異的抗原タンパク質由来ペプチドに対する免疫応答（抗原性ペプチド／ＣｐＧ／ＳＰＧ三元複合体によるペプチド特異的免疫応答の評価）
（１）マウスメラノーマ細胞特異的抗原タンパク由来のアミノ酸配列（ＥＧＳＲＮＱＤＷＬ（配列番号３））を有する抗原性ペプチド（ｇｐ１００）を用いて実施例１、２に従い同様に調製したｇｐ１００ペプチド−ｄＡ４０（Ｓ）／ＳＰＧ複合体（５μｇ）及びＣｐＧ ＤＮＡ−ｄＡ４０（Ｓ）／ＳＰＧ複合体（３０μｇ）、（２）実施例５に従い同様に調製したｇｐ１００ペプチド−ｄＡ４０（Ｓ）／ＣｐＧ ＤＮＡ−ｄＡ４０（Ｓ）／ＳＰＧ三元複合体（５μｇ）のいずれかを、マウス（Ｃ５７ＢＬ／６マウス、雄性、７週齢）皮内に投与（１回）した。投与から１週間後に、マウスより脾細胞を採取後、９６ウェルに播種し（１．０×１０６ ｃｅｌｌｓ／ウェル）、ｇｐ１００ペプチドで刺激（１０μｇ/ｍＬ）し、抗原特異的なインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）が誘導されるかについて検討した。Example 8: Immune response to peptide derived from melanoma cell-specific antigen protein (Evaluation of peptide-specific immune response by antigenic peptide / CpG / SPG ternary complex)
(1) gp100 peptide-dA40 (S) prepared in the same manner according to Examples 1 and 2 using an antigenic peptide (gp100) having an amino acid sequence (EGSRNQDWL (SEQ ID NO: 3)) derived from a mouse melanoma cell-specific antigen protein / SPG complex (5 μg) and CpG DNA-dA40 (S) / SPG complex (30 μg), (2) gp100 peptide-dA40 (S) / CpG DNA-dA40 (S) / Any of the SPG ternary complexes (5 μg) was administered (once) intradermally in mice (C57BL / 6 mice, male, 7 weeks old). One week after administration, spleen cells were collected from mice, seeded in 96 wells (1.0 × 10 6 cells / well), stimulated with gp100 peptide (10 μg / mL), and antigen-specific interferon-γ ( Whether IFN-γ) was induced was examined.

ｇｐ１００ペプチドによる脾細胞への刺激２４時間後に、酵素結合免疫測定（ＥＬＩＳＡ）を用いて、培地中のＩＦＮ−γ量を定量した。結果を図９に示す。実施例３に示したように、ｇｐ１００ペプチド−ｄＡ４０（Ｓ）／ＳＰＧ複合体のみではｇｐ１００ペプチドに特異的なインターフェロン応答が誘導できなかった（ｄａｔａ ｎｏｔ ｓｈｏｗｎ）。しかし、ｇｐ１００ペプチド−ｄＡ４０（Ｓ）／ＳＰＧ複合体及びＣｐＧ ＤＮＡ−ｄＡ４０（Ｓ）／ＳＰＧ複合体を同時に投与すると、強いインターフェロン応答が誘導された。さらに、ｇｐ１００ペプチド−ｄＡ４０（Ｓ）／ＣｐＧ ＤＮＡ−ｄＡ４０（Ｓ）／ＳＰＧ三元複合体の投与によっても、同様にインターフェロン誘導が確認された。これらの結果より、ＯＶＡペプチド以外の抗原性ペプチドを含む抗原性ペプチド／ＣｐＧ／ＳＰＧ三元複合体をマウスに投与することによっても、ペプチド特異的な免疫応答が誘導されたことがわかる。   After 24 hours of stimulation of spleen cells with gp100 peptide, the amount of IFN-γ in the medium was quantified using enzyme-linked immunoassay (ELISA). The results are shown in FIG. As shown in Example 3, the gp100 peptide-dA40 (S) / SPG complex alone could not induce an interferon response specific for the gp100 peptide (data not shown). However, when the gp100 peptide-dA40 (S) / SPG complex and the CpG DNA-dA40 (S) / SPG complex were administered simultaneously, a strong interferon response was induced. Furthermore, the induction of interferon was similarly confirmed by administration of the gp100 peptide-dA40 (S) / CpG DNA-dA40 (S) / SPG ternary complex. From these results, it can be seen that a peptide-specific immune response was also induced by administering an antigenic peptide / CpG / SPG ternary complex containing an antigenic peptide other than the OVA peptide to mice.

実施例９：異なる抗原性ペプチドでの免疫応答
ＯＶＡペプチド以外の抗原性ペプチドを用いて、実施例５に記載の方法により、抗原性ペプチド−ｄＡ４０（Ｓ）／ＣｐＧ ＤＮＡ−ｄＡ４０（Ｓ）／ＳＰＧ三元複合体を調製し、実施例６に記載の手順により、ペプチド特異的免疫応答の評価を行った。用いた抗原性ペプチドのアミノ酸配列及び実験結果（抗原性ペプチドに特異的なＩＦＮ−γの誘導の有無）を、下記の表２に示す。なお、Ｎｏ．２に示したアミノ酸配列（配列番号２８）は、ＯＶＡペプチド（Ｎｏ．１）のランダム配列である。表２中の、Ｎｏ．１、３、４では、マウスより採取後、ウェルに播種した脾細胞の刺激に、三元複合体に含まれる抗原性ペプチドを用いたが、Ｎｏ．２については、アミノ酸組成は同一であるがアミノ酸配列の異なるＯＶＡペプチドを用いた。また、表２のＩＦＮ応答の列中、「＋」は、ＩＦＮ−γの産生が観測されたことを示し、「−」は、ＩＦＮ−γの誘導が観測されなかったことを示す。マウスに投与した三元複合体に用いた抗原性ペプチドと同一のアミノ酸配列を有するペプチドで脾細胞を刺激した場合（Ｎｏ．１、３、４、５）には、抗原性ペプチド特異的なＩＦＮ応答が観察されたのに対し、異なるアミノ酸配列を有するペプチドで脾細胞を刺激した場合（Ｎｏ．２）には、全くＩＦＮ産生が観測されなかった。これらの結果より、マウスに投与した三元複合体により、ペプチド特異的な免疫応答が誘導されたことがわかる。Example 9: Immune response with different antigenic peptides Antigenic peptides-dA40 (S) / CpG DNA-dA40 (S) / SPG were prepared according to the method described in Example 5 using antigenic peptides other than OVA peptides. A ternary complex was prepared and the peptide-specific immune response was evaluated by the procedure described in Example 6. The amino acid sequence of the antigenic peptide used and the experimental results (presence or absence of induction of IFN-γ specific to the antigenic peptide) are shown in Table 2 below. In addition, No. The amino acid sequence (SEQ ID NO: 28) shown in FIG. 2 is a random sequence of OVA peptide (No. 1). In Table 2, No. In Nos. 1, 3, and 4, antigenic peptides contained in the ternary complex were used for stimulation of splenocytes seeded in wells after collection from mice. For OVA, OVA peptides having the same amino acid composition but different amino acid sequences were used. In the IFN response column of Table 2, “+” indicates that IFN-γ production was observed, and “−” indicates that no induction of IFN-γ was observed. When splenocytes were stimulated with a peptide having the same amino acid sequence as the antigenic peptide used in the ternary complex administered to the mouse (No. 1, 3, 4, 5), an antigenic peptide-specific IFN While a response was observed, no IFN production was observed when splenocytes were stimulated with peptides having different amino acid sequences (No. 2). From these results, it can be seen that a peptide-specific immune response was induced by the ternary complex administered to mice.

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実施例１０：ＳＰＧの主鎖又は側鎖上のグルコース残基への抗原性ペプチドの導入によるペプチド／β−１，３−グルカン複合体の調製（１）
アルキンとアジド化合物の「クリック反応」（フイスゲン反応）を利用したＳＰＧの主鎖又は側鎖上のグルコース残基への抗原性ペプチドの導入を検討した。反応スキームを以下に示す。カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）とプロパルギルアミン（ＰＡ）をＳＰＧのグルコース残基の６−位に存在する第１級アルコールと反応させ、生成するカルバメート結合を介して、ＳＰＧの主鎖又は側鎖グルコース残基上に位置選択的にアルキンを導入した（ＳＰＧ−ＰＡ）。ＳＰＧに導入されたアルキン残基数のグルコース残基数に対する比が１０〜２０％であったことから、主鎖のグルコース残基周りの立体障害により、大部分が側鎖のグルコース残基上に導入されていると考えられる。このようにして得られたＳＰＧ誘導体を、胴触媒の存在下、Ｃ末端がアジド基で修飾された抗原性ペプチド（ｐｅｐｔｉｄｅ（Ｎ３）：ジーンデザイン（株）より購入。本実施例では、アジド修飾ＯＶＡペプチドを使用した。）と反応させ、クリック反応により、ペプチド／β−１，３−グルカン複合体を調製した。Example 10: Preparation of peptide / β-1,3-glucan complex by introducing an antigenic peptide into a glucose residue on the main chain or side chain of SPG (1)
The introduction of an antigenic peptide into a glucose residue on the main chain or side chain of SPG using a “click reaction” (Fisgen reaction) between an alkyne and an azide compound was examined. The reaction scheme is shown below. Carbonyldiimidazole (CDI) and propargylamine (PA) are reacted with a primary alcohol present at the 6-position of the glucose residue of SPG, and the main chain or side chain glucose residue of SPG is formed through the resulting carbamate bond. Alkynes were introduced regioselectively on the base (SPG-PA). Since the ratio of the number of alkyne residues introduced into SPG to the number of glucose residues was 10 to 20%, the steric hindrance around the glucose residues in the main chain caused most of the residues on the glucose residues in the side chain. It is thought that it has been introduced. The SPG derivative thus obtained was purchased from an antigenic peptide (peptide (N3): Gene Design Co., Ltd.) whose C-terminus was modified with an azide group in the presence of a body catalyst. PVA / β-1,3-glucan complex was prepared by a click reaction.

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実施例１１：ＳＰＧの主鎖又は側鎖上のグルコース残基への抗原性ペプチドの共有結合を介した導入によるペプチド／β−１，３−グルカン複合体の調製（２）
α，β−不飽和ケトンとチオールのマイケル付加反応を利用したＳＰＧの主鎖又は側鎖上のグルコース残基への抗原性ペプチドの導入を検討した。反応スキームを以下に示す。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）の存在下、ＳＰＧの側鎖のグルコース残基の６−位に存在する第一級アルコールに対し、カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）と２−アミノエチルメタクリレート（ＡＥＭＡ）を反応させ、生成するカルバメート結合を介して、メタクリロイル基を導入した（ＳＰＧ−ＡＥＭＡ）。その後、Ｃ末端にシステインを導入した抗原性ペプチド（ｐｅｐｔｉｄｅ（−ＳＨ）：ジーンデザイン（株）より購入。）を、トリス（２−カルボカイシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）の存在下、ＳＰＧ−ＡＥＭＡと反応させ、ペプチド／β−１，３−グルカン複合体を調製した。 Example 11: Preparation of peptide / β-1,3-glucan complex by introduction of antigenic peptide via covalent bond to glucose residue on main chain or side chain of SPG (2)
The introduction of antigenic peptides into glucose residues on the main chain or side chain of SPG using the Michael addition reaction of α, β-unsaturated ketone and thiol was examined. The reaction scheme is shown below. In the presence of N, N-diisopropylethylamine (DIPEA), carbonyldiimidazole (CDI) and 2-aminoethyl methacrylate (AEMA) for the primary alcohol present at the 6-position of the glucose residue in the side chain of SPG And a methacryloyl group was introduced through the resulting carbamate bond (SPG-AEMA). Thereafter, an antigenic peptide (peptide (-SH): purchased from Gene Design Co., Ltd.) having cysteine introduced at the C-terminus was obtained in the presence of tris (2-carbokaisiethyl) phosphine hydrochloride (TCEP) in the presence of SPG- A peptide / β-1,3-glucan complex was prepared by reacting with AEMA.

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実施例１２：共有結合を介して、β−１，３−グルカン骨格を有する多糖の側鎖上のグルコース残基に抗原性ペプチドが結合した、抗原性ペプチド／ＣｐＧ／ＳＰＧ三元複合体による抗原性ペプチド特異的免疫応答の評価
実施例１０、１１で調製したペプチド／β−１，３−グルカン複合体を、実施例２、５に記載の方法と同様の方法を用いて、ＣｐＧ ＤＮＡ−ｄＡ４０（Ｓ）と複合化させ、抗原性ペプチド／ＣｐＧ／ＳＰＧ三元複合体を調製した。これを、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（雄性、７週齢）の皮内に１回投与（ＣｐＧ ＤＮＡ３０μｇ相当量）した。投与から１週間後に、マウスより脾細胞を採取後、９６ウェルに播種し（１．０×１０６ ｃｅｌｌｓ／ウェル）、ＯＶＡペプチドで刺激（１０μｇ/ｍＬ）し、抗原特異的なインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）が誘導されるかについて検討した。用いた抗原性ペプチドのアミノ酸配列及び実験結果（抗原性ペプチドに特異的なＩＦＮ−γの誘導の有無）を、下記の表３に示す。なお、実施例９と同様、Ｎｏ．２に示したアミノ酸配列（配列番号２８）は、ＯＶＡペプチド（Ｎｏ．１）のランダム配列である。表３中の、Ｎｏ．１、３、４では、マウスより採取後、ウェルに播種した脾細胞の刺激に、三元複合体に含まれる抗原性ペプチドを用いたが、Ｎｏ．２については、アミノ酸組成は同一であるがアミノ酸配列の異なるＯＶＡペプチドを用いた。また、表３のＩＦＮ応答の列中、「＋」は、ＩＦＮ−γの産生が観測されたことを示し、「−」は、ＩＦＮ−γの誘導が観測されなかったことを示す。実施例９の結果と同様、マウスに投与した三元複合体に用いた抗原性ペプチドと同一のアミノ酸配列を有するペプチドで脾細胞を刺激した場合（Ｎｏ．１、３、４）には、抗原性ペプチド特異的なＩＦＮ応答が観察されたのに対し、異なるアミノ酸配列を有するペプチドで脾細胞を刺激した場合（Ｎｏ．２）には、全くＩＦＮ産生が観測されなかった。これらの結果より、マウスに投与した三元複合体により、ペプチド特異的な免疫応答が誘導されたことがわかる。Example 12: Antigen by an antigenic peptide / CpG / SPG ternary complex in which an antigenic peptide is bound to a glucose residue on a side chain of a polysaccharide having a β-1,3-glucan skeleton through a covalent bond Evaluation of Sex Peptide Specific Immune Response The peptide / β-1,3-glucan complex prepared in Examples 10 and 11 was subjected to CpG DNA-dA40 using the same method as described in Examples 2 and 5. Complexed with (S) to prepare antigenic peptide / CpG / SPG ternary complex. This was administered once (equivalent to 30 μg of CpG DNA) into the skin of C57BL / 6 mice (male, 7 weeks old). One week after administration, spleen cells were collected from mice, seeded in 96 wells (1.0 × 10 6 cells / well), stimulated with OVA peptide (10 μg / mL), and antigen-specific interferon-γ ( Whether IFN-γ) was induced was examined. Table 3 below shows the amino acid sequences of the used antigenic peptides and the experimental results (presence or absence of induction of IFN-γ specific to the antigenic peptide). In addition, as in Example 9, No. The amino acid sequence (SEQ ID NO: 28) shown in FIG. 2 is a random sequence of OVA peptide (No. 1). In Table 3, No. In Nos. 1, 3, and 4, antigenic peptides contained in the ternary complex were used for stimulation of splenocytes seeded in wells after collection from mice. For OVA, OVA peptides having the same amino acid composition but different amino acid sequences were used. In the IFN response column of Table 3, “+” indicates that IFN-γ production was observed, and “−” indicates that IFN-γ induction was not observed. Similar to the results of Example 9, when spleen cells were stimulated with a peptide having the same amino acid sequence as the antigenic peptide used in the ternary complex administered to mice (No. 1, 3, 4), A sex peptide-specific IFN response was observed, whereas when splenocytes were stimulated with a peptide having a different amino acid sequence (No. 2), no IFN production was observed. From these results, it can be seen that a peptide-specific immune response was induced by the ternary complex administered to mice.

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なお、本発明は、本発明の広義の精神と範囲を逸脱することなく、様々な実施形態及び変形が可能とされるものである。また、上述した実施形態は、本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。つまり、本発明の範囲は、実施形態ではなく、特許請求の範囲によって示される。そして、特許請求の範囲内及びそれと同等の発明の意義の範囲内で施される様々な変形が、本発明の範囲内とみなされる。   It should be noted that the present invention can be variously modified and modified without departing from the broad spirit and scope of the present invention. Further, the above-described embodiment is for explaining the present invention, and does not limit the scope of the present invention. That is, the scope of the present invention is shown not by the embodiments but by the claims. Various modifications within the scope of the claims and within the scope of the equivalent invention are considered to be within the scope of the present invention.

本出願は、２０１４年２月６日に出願された日本国特許出願２０１４−２１３３３号に基づくものであり、その明細書、特許請求の範囲、図面および要約書を含むものである。上記日本国特許出願における開示は、その全体が本明細書中に参照として含まれる。   This application is based on the Japan patent application 2014-21333 for which it applied on February 6, 2014, and the specification, a claim, drawing, and an abstract are included. The entire disclosure in the above Japanese patent application is incorporated herein by reference.

Claims (14)

β−１，３−グルカン骨格を有する多糖と、
アミノ酸残基数が８〜１２の抗原性を有するペプチドが、ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体と共有結合を介して結合したペプチド／ポリヌクレオチドコンジュゲートとを含み、
前記ペプチド／ポリヌクレオチドコンジュゲートのポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体が、前記β−１，３−グルカン骨格を有する多糖と、水素結合を介して結合し、前記ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体の分子鎖１本と前記β−１，３−グルカン骨格を有する多糖の分子鎖２本とからなる三重螺旋構造を有する複合体を形成していることを特徴とするペプチド／β−１，３−グルカン複合体。 a polysaccharide having a β-1,3-glucan skeleton,
An antigenic peptide having 8 to 12 amino acid residues, comprising a peptide / polynucleotide conjugate bound to a polynucleotide or a polynucleotide derivative via a covalent bond;
A polynucleotide or polynucleotide derivative of the peptide / polynucleotide conjugate binds to the polysaccharide having the β-1,3-glucan skeleton through a hydrogen bond, and one molecular chain of the polynucleotide or polynucleotide derivative. A peptide / β-1,3-glucan complex characterized in that it forms a complex having a triple helix structure consisting of two molecular chains of polysaccharides having the β-1,3-glucan skeleton. 前記β−１，３−グルカン骨格を有する多糖が、シゾフィラン、レンチナン、スクレログルカン及びカードランのいずれかであることを特徴とする請求項１記載のペプチド／β−１，３−グルカン複合体。 Polysaccharides having a beta-1,3-glucan skeleton, schizophyllan, lentinan, scleroglucan and peptide / beta-1,3-glucan complex according to claim 1, wherein a is any one of curdlan . 前記ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体がポリデオキシアデノシンであることを特徴とする請求項１又は２記載のペプチド／β−１，３−グルカン複合体。 The peptide / β-1,3-glucan complex according to claim 1 or 2, wherein the polynucleotide or polynucleotide derivative is polydeoxyadenosine. 前記ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体が、ＤＮＡ又はＲＮＡのホスホジエステル結合の少なくとも一部がホスホロチオエート基で置換されたポリヌクレオチド誘導体であることを特徴とする請求項１から３のいずれか１項記載のペプチド／β−１，３−グルカン複合体。 The peptide according to any one of claims 1 to 3 , wherein the polynucleotide or polynucleotide derivative is a polynucleotide derivative in which at least a part of a phosphodiester bond of DNA or RNA is substituted with a phosphorothioate group. / Β-1,3-glucan complex. 前記ＤＮＡ又はＲＮＡのホスホジエステル結合のうち少なくとも一部がホスホロチオエート基で置換されたポリヌクレオチド誘導体において、ホスホジエステル結合の５０％以上がホスホロチオエート基で置換されていることを特徴とする請求項４記載のペプチド／β−１，３−グルカン複合体。 Polynucleotide derivative at least part of which is substituted with phosphorothioate group of the phosphodiester bond of the DNA or RNA, as claimed in claim 4, wherein at least 50% of the phosphodiester bond, characterized in that it is substituted with phosphorothioate groups Peptide / β-1,3-glucan complex. 前記ペプチド／ポリヌクレオチドコンジュゲートを構成する前記抗原性を有するペプチドと前記ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体とが、アルキンとアジド誘導体との付加環化反応、マレイミド基とチオール基との反応、ペプチドＣ末端のシステイン残基のチオール基とチオール修飾核酸のチオール基との反応のいずれかにより生成した共有結合を介して結合していることを特徴とする請求項１から５のいずれか１項記載のペプチド／β−１，３−グルカン複合体。 The antigenic peptide constituting the peptide / polynucleotide conjugate and the polynucleotide or polynucleotide derivative are subjected to cycloaddition reaction of alkyne and azide derivative, reaction of maleimide group and thiol group, peptide C-terminal The peptide according to any one of claims 1 to 5 , wherein the peptide is bound via a covalent bond generated by any of the reaction of the thiol group of the cysteine residue of cysteine and the thiol group of the thiol-modified nucleic acid. / Β-1,3-glucan complex. 請求項１から６のいずれか１項記載のペプチド／β−１，３−グルカン複合体において、
免疫賦活活性を有する部分塩基配列を有するポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体を更に含み、
前記ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体が、前記β−１，３−グルカン骨格を有する多糖と、水素結合を介して結合し、前記ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体の分子鎖１本と前記β−１，３−グルカン骨格を有する多糖の分子鎖２本とからなる三重螺旋構造を有する複合体を形成していることを特徴とするペプチド／β−１，３−グルカン複合体。 In the peptide / β-1,3-glucan complex according to any one of claims 1 to 6 ,
Further comprising a polynucleotide or polynucleotide derivative having a partial base sequence having immunostimulatory activity,
The polynucleotide or polynucleotide derivative binds to the polysaccharide having the β-1,3-glucan skeleton through a hydrogen bond, and one molecular chain of the polynucleotide or polynucleotide derivative and the β-1,3 -A peptide / β-1,3-glucan complex characterized in that it forms a complex having a triple helical structure consisting of two molecular chains of polysaccharide having a glucan skeleton. 前記ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体の、前記三重螺旋構造を有する複合体を形成する部分がポリデオキシアデノシンであることを特徴とする請求項７記載のペプチド／β−１，３−グルカン複合体。 The peptide / β-1,3-glucan complex according to claim 7, wherein a portion of the polynucleotide or polynucleotide derivative forming the complex having the triple helical structure is polydeoxyadenosine. 前記ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体の、前記三重螺旋構造を有する複合体を形成する部分が、ＤＮＡ又はＲＮＡのホスホジエステル結合の少なくとも一部がホスホロチオエート基で置換されたポリヌクレオチド誘導体であることを特徴とする請求項７又は８記載のペプチド／β−１，３−グルカン複合体。 A portion of the polynucleotide or polynucleotide derivative forming the complex having the triple helix structure is a polynucleotide derivative in which at least a part of a phosphodiester bond of DNA or RNA is substituted with a phosphorothioate group. The peptide / β-1,3-glucan complex according to claim 7 or 8 . 前記ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体の、前記三重螺旋構造を有する複合体を形成する部分において、ＤＮＡ又はＲＮＡのホスホジエステル結合の５０％以上がホスホロチオエート基で置換されていることを特徴とする請求項９記載のペプチド／β−１，３−グルカン複合体。 The polynucleotide or polynucleotide derivative, in the portion of forming a complex with the triple helical structure, according to claim more than 50% of the phosphodiester bond of DNA or RNA, characterized in that they have been substituted with phosphorothioate group 9 The described peptide / β-1,3-glucan complex. 免疫賦活活性を有する部分塩基配列を有するポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体と、
請求項１から６のいずれか１項記載のペプチド／β−１，３−グルカン複合体とを含む医薬組成物。 A polynucleotide or polynucleotide derivative having a partial base sequence having immunostimulatory activity;
A pharmaceutical composition comprising the peptide / β-1,3-glucan complex according to any one of claims 1 to 6 . 前記ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体が、β−１，３−グルカン骨格を有する多糖と、水素結合を介して結合し、前記ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体の分子鎖１本と前記β−１，３−グルカン骨格を有する多糖の分子鎖２本とからなる三重螺旋構造を有するポリヌクレオチド／β−１，３−グルカン複合体を形成していることを特徴とする請求項１１記載の医薬組成物。 The polynucleotide or polynucleotide derivative binds to a polysaccharide having a β-1,3-glucan skeleton via a hydrogen bond, and one molecular chain of the polynucleotide or polynucleotide derivative and the β-1,3- 12. The pharmaceutical composition according to claim 11, wherein a polynucleotide / β-1,3-glucan complex having a triple helical structure composed of two molecular chains of a polysaccharide having a glucan skeleton is formed. 前記ポリヌクレオチド／β−１，３−グルカン複合体を構成する前記β−１，３−グルカン骨格を有する多糖が、シゾフィラン、レンチナン、スクレログルカン及びカードランのいずれかであることを特徴とする請求項１２記載の医薬組成物。 The polysaccharide having the β-1,3-glucan skeleton constituting the polynucleotide / β-1,3-glucan complex is any one of schizophyllan, lentinan, scleroglucan and curdlan. The pharmaceutical composition according to claim 12 . 請求項７から１０のいずれか１項記載のペプチド／β−１，３−グルカン複合体を含む医薬組成物。 A pharmaceutical composition comprising the peptide / β-1,3-glucan complex according to any one of claims 7 to 10 .
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