JP6369951B2 - Dipeptidyl peptidase-IV inhibitor - Google Patents

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Description

本発明は、茶葉由来のタンパク質をプロテアーゼ処理して得られる茶葉タンパク質分解物を有効成分とするジペプチジルペプチダーゼ-IV阻害剤、血糖値上昇抑制剤、抗糖尿病剤に関する。   The present invention relates to a dipeptidyl peptidase-IV inhibitor, a blood glucose level increase inhibitor, and an antidiabetic agent, which contain, as an active ingredient, a tea leaf protein degradation product obtained by treating a protein derived from tea leaves with a protease.

糖尿病は、国民の5人に1人以上がその患者か予備軍と言われる疾患であり、血糖値を降下させるホルモンであるインスリンの作用不足によって起こる慢性的な高血糖を特徴とする疾患である。糖尿病では、高血糖が続くことによって血管さらには臓器に障害を生じ、腎症、網膜症、神経症を発症する。また、動脈硬化性疾患のリスクが高まることも知られている。糖尿病には、膵β細胞が破壊されてインスリンが欠乏することによって発症する1型糖尿病と、インスリン分泌の低下と組織におけるインスリン感受性の低下によって発症する2型糖尿病がある。糖尿病と診断される人の90〜95%が2型糖尿病と言われており、2型糖尿病は体質以外にも肥満、運動不足、ストレス、飲酒、喫煙などの生活習慣の乱れが要因となっているため、生活習慣病の1つとして数えられている。   Diabetes is a disease in which more than one in five people is said to be the patient or reserve army, and is characterized by chronic hyperglycemia caused by the lack of action of insulin, a hormone that lowers blood glucose levels . In diabetes, blood sugar and organs are damaged by hyperglycemia, and nephropathy, retinopathy, and neurosis occur. It is also known to increase the risk of arteriosclerotic disease. Diabetes includes type 1 diabetes that develops due to destruction of pancreatic β-cells and lack of insulin, and type 2 diabetes that develops due to decreased insulin secretion and decreased insulin sensitivity in tissues. 90-95% of people diagnosed with diabetes are said to have type 2 diabetes. Type 2 diabetes is caused by disorder of lifestyle such as obesity, lack of exercise, stress, drinking alcohol, and smoking in addition to constitution. Therefore, it is counted as one of lifestyle-related diseases.

近年、2型糖尿病の治療においては、インクレチンと呼ばれる消化管ホルモンが脚光を浴びている。インクレチンは、食事の摂取に伴い消化管から分泌され、膵β細胞に作用してインスリン分泌を促進するホルモンであり、血糖値を上昇させるグルカゴンの分泌抑制作用や、膵β細胞の保護および増殖作用なども有している。このように、インクレチンは血糖値降下に重要な役割を担っているが、血中でジペプチジルペプチダーゼ-IV（dipeptidyl peptidase-IV、以下「DPP-IV」ともいう）により速やかに分解されて不活化するという問題があるため、2型糖尿病の治療戦略の1つとして、DPP-IV阻害剤が開発されている。   In recent years, gastrointestinal hormones called incretins have attracted attention in the treatment of type 2 diabetes. Incretin is a hormone that is secreted from the gastrointestinal tract with food intake and acts on β-cells of the pancreas to promote insulin secretion. It suppresses glucagon secretion, which increases blood glucose levels, and protects and proliferates pancreatic β-cells. It also has a function. Thus, incretin plays an important role in lowering blood glucose levels, but it is rapidly degraded by dipeptidyl peptidase-IV (hereinafter also referred to as “DPP-IV”) in blood. Due to the problem of activation, DPP-IV inhibitors have been developed as one of the treatment strategies for type 2 diabetes.

DPP-IV阻害剤としては、例えばフルオロピロリジン誘導体（特許文献１）、プロリン誘導体（特許文献２）などが知られている。しかし、これらのDPP-IV阻害剤は化学合成品であり、安全性の問題に注意を払わなければならない。   As DPP-IV inhibitors, for example, fluoropyrrolidine derivatives (Patent Document 1), proline derivatives (Patent Document 2) and the like are known. However, these DPP-IV inhibitors are chemically synthesized products and attention must be paid to safety issues.

また、天然物由来のものとしてはカゼイン加水分解物（特許文献３）やチーズの水溶性画分（特許文献４）、コラーゲン酵素処理物（特許文献５）などが報告されているが、茶葉由来のタンパク質をプロテアーゼ処理して得られる茶葉タンパク質分解物がDPP-IV阻害活性を有するという報告はなく、アンジオテンシン変換酵素阻害活性を有するという報告のみである（特許文献６）。   In addition, casein hydrolyzate (Patent Document 3), water-soluble fraction of cheese (Patent Document 4), collagen enzyme-treated product (Patent Document 5) and the like have been reported as those derived from natural products. There is no report that the tea leaf proteolysate obtained by treating the above protein with protease has DPP-IV inhibitory activity, but only reports that it has angiotensin converting enzyme inhibitory activity (Patent Document 6).

特開2007-63286JP2007-63286 特表2007-537231Special table 2007-537231 特開2013-184962JP2013-184962 特開2014-1223JP 2014-1223 WO2012/102308WO2012 / 102308 特開2015-100276JP2015-100276

本発明の目的は、天然物から得られ、安全性が高いDPP-IV阻害剤、血糖値上昇抑制剤、抗糖尿病剤を提供することにある。また新規ペプチドVal-Ala-Tyr-Pro、His-Asp-Tyr又はLeu-Tyr-AsnをDPP-IV阻害剤、血糖値上昇抑制剤、抗糖尿病剤として提供するものである。   An object of the present invention is to provide a DPP-IV inhibitor, a blood glucose level increase inhibitor, and an antidiabetic agent that are obtained from natural products and have high safety. The present invention also provides a novel peptide Val-Ala-Tyr-Pro, His-Asp-Tyr or Leu-Tyr-Asn as a DPP-IV inhibitor, a blood glucose level increase inhibitor, and an antidiabetic agent.

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、茶葉あるいは茶殻をアルカリ溶液で抽出した後、抽出液をプロテアーゼ活性を有する酵素で処理して得られる茶葉タンパク質分解物がDPP-IV阻害活性を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、茶葉タンパク質分解物を有効成分とするジペプチジルペプチダーゼ-IV阻害剤を提供するものであり、ジペプチジルペプチダーゼ-IV活性を阻害し、インクレチンの分解を抑制することによる血糖値上昇抑制剤、抗糖尿病剤を提供するものである。例えば、本発明は（工程１）茶葉にアルカリ溶液を加えて抽出液を得る工程、および、（工程２）工程１で得られる抽出液を、プロテアーゼ活性を有する酵素で処理して酵素反応液を得る工程、を含む製造方法により得られる茶葉タンパク質分解物を利用することができる。
本発明者らは茶葉タンパク分解物中にDPP-IV阻害活性を有するトリペプチドLeu-Gly-Pro、Thr-Gly-Tyr、His-Asp-Tyr、Val-Asp-Tyr及びLeu-Tyr-Asnを見出した。また該トリペプチドの内、His-Asp-Tyr、Leu-Tyr-Asnは今までに報告のない新規ペプチドである。
さらに、本発明者らは茶葉タンパク分解物中に高いDPP-IV阻害活性を有するテトラペプチドVal-Ala-Tyr-Proを見出した。当該テトラペプチドは今までに報告のない、新規ペプチドである。
即ち、本発明はトリペプチドであるLeu-Gly-Pro(以下「LGP」ともいう)、Thr-Gly-Tyr（以下「TGY」ともいう)、His-Asp-Tyr（以下「HDY」ともいう）、Val-Asp-Tyr（以下「VDY」ともいう）、Leu-Tyr-Asn（以下「LYN」ともいう）、テトラペプチドであるVal-Ala-Tyr-Pro（以下「VAYP」ともいう）を有効成分とするDPP-IV阻害剤、血糖値上昇抑制剤、抗糖尿病剤、およびそれらを有効成分として含有するDPP-IV阻害用、血糖値上昇抑制用又は抗糖尿病用飲食品、サプリメント、医薬品および/または医薬部外品を提供するものである。 As a result of intensive studies to solve the above-mentioned problems, the present inventors have discovered that a tea leaf proteolysate obtained by extracting tea leaves or tea husks with an alkaline solution and then treating the extract with an enzyme having protease activity is DPP. The present inventors have found that it has -IV inhibitory activity and have completed the present invention.
That is, the present invention provides a dipeptidyl peptidase-IV inhibitor containing a tea leaf protein degradation product as an active ingredient, which inhibits dipeptidyl peptidase-IV activity and suppresses incretin degradation. The present invention provides a rise inhibitor and an antidiabetic agent. For example, the present invention provides (Step 1) a step of adding an alkaline solution to tea leaves to obtain an extract, and (Step 2) treating the extract obtained in Step 1 with an enzyme having protease activity to produce an enzyme reaction solution. The tea leaf protein degradation product obtained by the manufacturing method including the process of obtaining can be utilized.
The present inventors have included tripeptides Leu-Gly-Pro, Thr-Gly-Tyr, His-Asp-Tyr, Val-Asp-Tyr and Leu-Tyr-Asn having DPP-IV inhibitory activity in the tea leaf proteolysate. I found it. Among the tripeptides, His-Asp-Tyr and Leu-Tyr-Asn are novel peptides not reported so far.
Furthermore, the present inventors have found a tetrapeptide Val-Ala-Tyr-Pro having high DPP-IV inhibitory activity in tea leaf proteolysate. The tetrapeptide is a novel peptide that has not been reported so far.
That is, the present invention is a tripeptide Leu-Gly-Pro (hereinafter also referred to as “LGP”), Thr-Gly-Tyr (hereinafter also referred to as “TGY”), His-Asp-Tyr (hereinafter also referred to as “HDY”). , Val-Asp-Tyr (hereinafter also referred to as “VDY”), Leu-Tyr-Asn (hereinafter also referred to as “LYN”), and the tetrapeptide Val-Ala-Tyr-Pro (hereinafter also referred to as “VAYP”) are effective. DPP-IV inhibitor, blood sugar level increase inhibitor, anti-diabetic agent, and DPP-IV inhibitor, blood sugar level increase or anti-diabetic food and drink, supplement, pharmaceutical and / or Or a quasi-drug is provided.

本発明のDPP-IV阻害剤、血糖値上昇抑制剤、抗糖尿病剤は、高いDPP-IV阻害活性を有し、かつ、天然物である茶葉や茶殻由来のため安全性が高い。また、本発明のDPP-IV阻害剤、血糖値上昇抑制剤、抗糖尿病剤は、茶飲料や茶エキスの製造工程で生じる茶殻を利用して製造することもできるため、製造コストの抑制や未利用資源の有効活用も可能である。   The DPP-IV inhibitor, the blood glucose level increase inhibitor, and the antidiabetic agent of the present invention have high DPP-IV inhibitory activity and are highly safe because they are derived from natural tea leaves and tea leaves. In addition, since the DPP-IV inhibitor, the blood sugar level increase inhibitor, and the antidiabetic agent of the present invention can be produced using tea leaves produced in the production process of tea beverages and tea extracts, the production cost is not reduced. Effective use of resources is also possible.

試験例6で行った、茶葉タンパク質分解物12-Pをゲルろ過クロマトグラフィーに供したクロマトグラム（A）とDPP-IV阻害率（B）を示す図である。Aの縦軸はUV 230nmの吸光度、横軸は保持時間を示す。Bの縦軸はDPP-IV阻害率、横軸は保持時間を示す。It is a figure which shows the chromatogram (A) and DPP-IV inhibition rate (B) which performed the tea leaf protein degradation product 12-P performed in the test example 6 to the gel filtration chromatography. The vertical axis of A indicates the absorbance at UV 230 nm, and the horizontal axis indicates the retention time. The vertical axis of B shows the DPP-IV inhibition rate, and the horizontal axis shows the retention time. 試験例7で行った、各画分におけるDPP-IV阻害活性貢献度を示す。縦軸はDPP-IV阻害活性貢献度、横軸は分取したフラクションを示す。The contribution degree of DPP-IV inhibitory activity in each fraction performed in Test Example 7 is shown. The vertical axis represents the degree of contribution to DPP-IV inhibitory activity, and the horizontal axis represents the fraction collected.

以下、本発明について詳細に説明する。
本発明のDPP-IV阻害剤、血糖値上昇抑制剤、抗糖尿病剤は茶葉タンパク質分解物を有効成分とする。分子量3000以下の茶葉タンパク質分解物が好ましく、例えば、（工程１）茶葉にアルカリ溶液を加えて抽出液を得る工程、および、（工程２）工程１で得られる抽出液を、プロテアーゼ活性を有する酵素で処理して酵素反応液を得る工程を含む製造方法により得られる。 Hereinafter, the present invention will be described in detail.
The DPP-IV inhibitor, the blood sugar level increase inhibitor, and the antidiabetic agent of the present invention contain tea leaf protein degradation product as an active ingredient. Tea leaf proteolysate having a molecular weight of 3000 or less is preferable. For example, (Step 1) a step of adding an alkaline solution to tea leaves to obtain an extract, and (Step 2) the extract obtained in Step 1 is an enzyme having protease activity. It is obtained by a production method including a step of obtaining an enzyme reaction solution by treatment with

本発明のDPP-IV阻害剤、血糖値上昇抑制剤、抗糖尿病剤は、血糖値の上昇を抑制し、高血糖状態の改善、糖尿病の進行を遅らせるために利用できる。なお、抗糖尿病剤とは糖尿病の予防、改善又は治療のために用いることができる剤を意味する。 The DPP-IV inhibitor, the blood glucose level increase inhibitor, and the antidiabetic agent of the present invention can be used to suppress an increase in blood glucose level, improve a hyperglycemic state, and delay the progression of diabetes. The antidiabetic agent means an agent that can be used for the prevention, improvement or treatment of diabetes.

（工程１）で使用する茶葉とは、チャノキ（Camellia sinensis）から得られる生葉、緑茶、白茶、烏龍茶、紅茶、ジャスミン茶などの茶葉を意味し、本発明においては、これら茶葉を原料として茶飲料や茶エキスを製造する際に生じる抽出残渣（茶殻）も茶葉の範疇に含む。茶葉に含まれるポリフェノール類がプロテアーゼを阻害し、茶葉タンパク質の分解効率を損なう恐れがあることから、茶葉を温水や熱水などで抽出してポリフェノール類が除去された茶殻を使用するのが好ましい。また、未利用資源の有効活用という点からも茶殻を使用するのが好ましい。使用する茶葉の大きさは浸漬が可能であれば特に限定されるものではなく、茶葉または茶殻を粉砕機等で粉砕しても良い。   The tea leaves used in (Step 1) mean fresh leaves, green tea, white tea, oolong tea, black tea, jasmine tea, and the like obtained from tea leaves (Camellia sinensis). In the present invention, tea leaves are used as raw materials for these tea leaves. The extraction residue (tea husk) produced during the production of tea extract is also included in the category of tea leaves. Since the polyphenols contained in tea leaves may inhibit protease and impair the efficiency of tea leaf protein degradation, it is preferable to use tea leaves from which tea leaves have been removed by extraction with warm water or hot water. Moreover, it is preferable to use tea leaves from the viewpoint of effective utilization of unused resources. The size of the tea leaf to be used is not particularly limited as long as it can be immersed, and the tea leaf or tea husk may be pulverized by a pulverizer or the like.

アルカリ溶液の調製には、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素ナトリウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウムなどのpH調整剤を用いる。茶葉タンパク質の抽出効率の点から、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウムなどの強アルカリを用いるのが好ましく、これらのpH調整剤を2種類以上混合して用いることも可能である。また、アルカリ溶液の濃度は茶葉タンパク質の抽出が可能な濃度であれば特に限定されるものではないが、茶葉タンパク質の抽出効率の点から、アルカリ溶液の濃度は0.01〜1Mが好ましく、0.02〜0.5Mがより好ましく、0.05〜0.2Mがさらに好ましい。   For the preparation of the alkaline solution, a pH adjuster such as sodium carbonate, potassium carbonate, sodium hydrogen carbonate, sodium hydroxide, potassium hydroxide, calcium hydroxide is used. From the viewpoint of tea leaf protein extraction efficiency, it is preferable to use a strong alkali such as sodium hydroxide, potassium hydroxide or calcium hydroxide, and two or more kinds of these pH adjusters can be used in combination. In addition, the concentration of the alkaline solution is not particularly limited as long as it can extract tea leaf protein, but from the viewpoint of tea leaf protein extraction efficiency, the concentration of the alkaline solution is preferably 0.01 to 1M, 0.02 to 0.5. M is more preferable, and 0.05 to 0.2M is more preferable.

アルカリ溶液量には特に制限はなく、茶葉または茶殻100gに対して0.5〜10Lを用いれば良い。抽出後の中和反応と茶葉タンパク質の抽出効率の点から、1〜5Lが好ましく、1.5〜3Lがより好ましい。また、抽出時の抽出温度は茶葉タンパク質の抽出が可能な温度であれば特に限定されるものではないが、40〜95℃が好ましく、60〜90℃がより好ましく、75〜85℃がさらに好ましい。抽出時間は30分〜24時間程度であるが、製造コストと茶葉タンパク質の抽出効率の点から1〜15時間が好ましく、2〜10時間がより好ましく、3〜5時間がさらに好ましい。   There is no restriction | limiting in particular in the amount of alkaline solutions, What is necessary is just to use 0.5-10L with respect to 100g of tea leaves or tea leaves. From the point of the neutralization reaction after extraction and the extraction efficiency of tea leaf protein, 1-5L is preferable and 1.5-3L is more preferable. Further, the extraction temperature at the time of extraction is not particularly limited as long as it is a temperature at which tea leaf protein can be extracted, but is preferably 40 to 95 ° C, more preferably 60 to 90 ° C, and further preferably 75 to 85 ° C. . The extraction time is about 30 minutes to 24 hours, preferably 1 to 15 hours, more preferably 2 to 10 hours, and even more preferably 3 to 5 hours from the viewpoint of production cost and tea leaf protein extraction efficiency.

次に、（工程２）では、（工程１）で得られる抽出液にプロテアーゼ活性を有する酵素を加え、茶葉由来のタンパク質を分解することでDPP-IV阻害活性を有する茶葉タンパク質分解物を含む酵素反応液を得ることができる。酵素の添加に先立ちアルカリ溶液で抽出した残渣を分離しても良いが、得られる茶葉タンパク質分解物のDPP-IV阻害活性が高い点から、残渣を抽出液に混在させたまま（工程２）を行うのが好ましい。
茶葉のタンパク質は膜タンパク質であると推測され、膜に緩く結合している表在性タンパク質はアルカリ溶液で茶葉から抽出することが可能であるが、膜内在性タンパク質はアルカリ溶液では抽出され難く、残渣に残存していると考えられる。このため、残渣が混在する抽出液をプロテアーゼ処理することで、残存している膜内在性タンパク質の一部（親水性部分）が分解され、DPP-IV阻害活性成分と推測されるペプチドが遊離され易くなり、茶葉タンパク質分解物のDPP-IV活性が高まると考えられる。 Next, in (Step 2), an enzyme containing tea leaf proteolysate having DPP-IV inhibitory activity is obtained by adding an enzyme having protease activity to the extract obtained in (Step 1) and degrading tea leaf-derived protein. A reaction solution can be obtained. Prior to the addition of the enzyme, the residue extracted with an alkaline solution may be separated. However, since the DPP-IV inhibitory activity of the obtained tea leaf proteolysate is high, leave the residue mixed in the extract (step 2). It is preferred to do so.
The tea leaf protein is presumed to be a membrane protein, and the superficial protein loosely bound to the membrane can be extracted from the tea leaf with an alkaline solution, but the membrane integral protein is difficult to extract with an alkaline solution, It is thought that it remains in the residue. For this reason, by subjecting the extract mixed with residues to protease treatment, a portion of the remaining membrane integral protein (hydrophilic portion) is decomposed and a peptide presumed to be a DPP-IV inhibitory active ingredient is released. It is considered that the DPP-IV activity of the tea leaf protein degradation product is increased.

本発明における「プロテアーゼ」は、「エンドペプチダーゼ」と「エキソペプチダーゼ」の総称である。さらに「エキソペプチダーゼ」は、「アミノペプチダーゼ」と「カルボキシペプチダーゼ」に分類される。また、プロテアーゼの至適pHによって、それぞれ酸性、中性、アルカリ性という用語を各酵素に付けることがあり、例えば「酸性エキソペプチダーゼ」、「中性アミノペプチダーゼ」、「アルカリ性エンドペプチダーゼ」のように記載することもある。
本発明におけるプロテアーゼ活性を有する酵素の由来は、微生物、植物、動物のいずれであっても良いが、安全性や価格を考慮すると市販の食品用プロテアーゼを用いることが好ましい。エンドペプチダーゼ活性を有するプロテアーゼとしては、ビオプラーゼSP-20FG、ビオプラーゼOP（以上、エイチビィアイ）、スミチームLP-G、スミチームFL-G、スミチームCP、スミチームFP-G、スミチームMP、スミチームBR、スミチームBNP（以上、新日本化学工業株式会社）、ブロメラインF、プロテアーゼA「アマノ」SD、プロテアーゼM「アマノ」SD、プロテアーゼP「アマノ」3SD、サモアーゼPC10F、サモアーゼC100、サモアーゼC160、プロチンSD-NY10、プロテアックス（以上、天野エンザイム株式会社）、精製パパイン（三菱化学フーズ）を例示することができる。エキソペプチダーゼ活性を有するプロテアーゼとしては、スミチームLP-G、スミチームFL-G、スミチームFP-G、スミチームACP-G（以上、新日本化学工業）プロテアーゼA「アマノ」SD、プロテアーゼM「アマノ」SD、プロテアーゼP「アマノ」3SD、プロテアックス（以上、天野エンザイム）を例示することができる。本発明の実施において、プロテアーゼは1種もしくは2種以上を組み合わせても良い。組み合わせる場合には、それぞれのプロテアーゼ処理は同時に行っても良く、別々に行っても良い。茶葉タンパク質の分解効率の点から、エンドペプチダーゼ処理した後、エキソペプチダーゼ処理するのが好適である。 “Protease” in the present invention is a general term for “endopeptidase” and “exopeptidase”. “Exopeptidases” are further classified into “aminopeptidases” and “carboxypeptidases”. In addition, depending on the optimum pH of the protease, terms such as acidic, neutral, and alkaline may be added to each enzyme, for example, “acidic exopeptidase”, “neutral aminopeptidase”, “alkaline endopeptidase”, etc. Sometimes.
The origin of the enzyme having protease activity in the present invention may be any of microorganisms, plants, and animals, but it is preferable to use a commercially available food protease in consideration of safety and price. As proteases having endopeptidase activity, biopulase SP-20FG, biopase OP (above, HB), Sumiteam LP-G, Sumiteam FL-G, Sumiteam CP, Sumiteam FP-G, Sumiteam MP, Sumiteam BR, Sumiteam BNP (and above) Shin Nippon Chemical Industry Co., Ltd.), Bromelain F, Protease A “Amano” SD, Protease M “Amano” SD, Protease P “Amano” 3SD, Samoaase PC10F, Samoaase C100, Samoaase C160, Protin SD-NY10, Proteax ( As described above, Amano Enzyme Co., Ltd.) and purified papain (Mitsubishi Chemical Foods) can be exemplified. Proteases with exopeptidase activity include Sumiteam LP-G, Sumiteam FL-G, Sumiteam FP-G, Sumiteam ACP-G (Shin Nippon Chemical Industry) Protease A “Amano” SD, Protease M “Amano” SD, Examples include protease P “Amano” 3SD and proteax (above, Amano Enzyme). In the practice of the present invention, one or more proteases may be combined. When combined, each protease treatment may be performed simultaneously or separately. From the viewpoint of the degradation efficiency of tea leaf protein, it is preferable to treat with endopeptidase and then with exopeptidase.

プロテアーゼの添加量は特に限定されないが、茶葉あるいは茶殻に対して、0.001〜5重量％の割合で用い、好ましくは0.01〜4重量％、さらに好ましくは0.02〜3重量％の割合で用いる。   The amount of protease added is not particularly limited, but it is used in a proportion of 0.001 to 5% by weight, preferably 0.01 to 4% by weight, more preferably 0.02 to 3% by weight, based on tea leaves or tea leaves.

プロテアーゼ処理の際、抽出液の液量は特に限定されるものではない。茶葉あるいは茶殻100gに対して0.5〜10Lが適しているが、膨潤した抽出残渣が存在する状態での混合、好ましくは撹拌を鑑みると、1〜5Lが好ましく、1.5〜3Lがより好ましい。茶葉あるいは茶殻100gに対して0.5L未満でもプロテアーゼ処理に支障はないが、抽出残渣が撹拌力の低下要因になる可能性がある。また、茶葉あるいは茶殻100gに対して10Lを超えると、濃縮工程にかかる負担が増大し、製造コストが上昇する要因になる。   During the protease treatment, the amount of the extract is not particularly limited. 0.5 to 10 L is suitable for 100 g of tea leaves or tea husks, but 1 to 5 L is preferable and 1.5 to 3 L is more preferable in view of mixing, preferably stirring, in the presence of a swollen extraction residue. Even if it is less than 0.5 L with respect to 100 g of tea leaves or tea husks, there is no problem with protease treatment, but the extraction residue may cause a reduction in stirring power. Moreover, if it exceeds 10L with respect to 100g of tea leaves or tea leaves, the burden concerning a concentration process will increase and it will become a factor which increases manufacturing cost.

プロテアーゼ処理時の反応pHは、プロテアーゼが作用できるpHであれば特に制限はないが、安定的に酵素が作用できるという点で、酵素の至適pH±1.5が好ましく、至適pH±1.0がより好ましく、至適pH±0.5がさらに好ましい。例えば、サモアーゼC160の至適pHは7.0付近であるが、茶葉由来のタンパク質を分解できる反応pHは5.5〜8.5であり、得られる茶葉タンパク質分解物の収量を増加させるためには、反応pHは6.0〜8.0が好ましく、6.5〜7.5がより好ましい。また、スミチームACP-Gの至適pHは4.5付近であるが、茶葉由来のタンパク質を分解できる反応pHは3.0〜6.0であり、得られる茶葉タンパク質分解物の収量を増加させるためには、反応pHは3.5〜5.5が好ましく、4.0〜5.0がより好ましい。   The reaction pH at the time of protease treatment is not particularly limited as long as it is a pH at which protease can act. However, the optimum pH ± 1.5 of the enzyme is preferable, and the optimum pH ± 1.0 is more preferable in that the enzyme can act stably. The optimum pH ± 0.5 is more preferred. For example, although the optimal pH of Samoa C160 is around 7.0, the reaction pH capable of degrading tea leaf-derived protein is 5.5 to 8.5, and the reaction pH is 6.0 in order to increase the yield of the obtained tea leaf protein degradation product. -8.0 is preferable and 6.5-7.5 is more preferable. Moreover, although the optimum pH of Sumiteam ACP-G is around 4.5, the reaction pH capable of degrading tea leaf-derived protein is 3.0 to 6.0, and in order to increase the yield of the obtained tea leaf protein degradation product, the reaction pH Is preferably 3.5 to 5.5, more preferably 4.0 to 5.0.

プロテアーゼ処理時の反応温度は、プロテアーゼの至適温度であることが望ましいが、プロテアーゼが作用できる温度であれば特に制限はない。プロテアーゼ処理中の雑菌汚染などのリスクを回避するためには50℃以上が好ましい。例えばサモアーゼC160の場合、70℃以下の温度で安定であり、至適温度は65℃付近である。茶葉由来のタンパク質を分解できる温度は30〜70℃であり、反応温度は50〜68℃が好ましく、55〜65℃がより好ましい。また、スミチームACP-Gの場合、70℃以下の温度で安定であり、至適温度は50℃付近である。茶葉由来のタンパク質を分解できる温度は30〜70℃であり、反応温度は40〜60℃が好ましく、50〜55℃がより好ましい。   The reaction temperature during the protease treatment is desirably the optimum temperature for the protease, but is not particularly limited as long as the protease can act. In order to avoid risks such as contamination with bacteria during protease treatment, 50 ° C. or higher is preferable. For example, Samoaze C160 is stable at a temperature of 70 ° C. or less, and the optimum temperature is around 65 ° C. The temperature at which the tea leaf-derived protein can be degraded is 30 to 70 ° C, and the reaction temperature is preferably 50 to 68 ° C, more preferably 55 to 65 ° C. In addition, Sumiteam ACP-G is stable at a temperature of 70 ° C. or lower, and the optimum temperature is around 50 ° C. The temperature at which the protein derived from tea leaves can be decomposed is 30 to 70 ° C, and the reaction temperature is preferably 40 to 60 ° C, more preferably 50 to 55 ° C.

本発明においては（工程１）の前および／または後に、植物の細胞壁や細胞間の結合部の主成分であるヘミセルロース、ペクチン、セルロースなどを分解する植物組織分解酵素で茶葉あるいは茶殻を処理し、茶葉の細胞壁や細胞間の結合部を分解することで茶葉タンパク質の抽出効率を高くし、茶葉タンパク質分解物の歩留を上昇させることも可能である。使用可能な植物組織分解酵素としては、微生物、植物、動物由来の酵素ならいずれも使用することができるが、安全性や価格を考慮すれば市販の食品用植物組織分解酵素を用いることが好ましい。食品用植物組織分解酵素としては、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ（キシラナーゼ）、ペクチナーゼ（ポリガラクツロナーゼ、ペクチンリアーゼ、ペクチンエステラーゼ、ペクチンメチルエステラーゼなど）、プロトペクチナーゼなどを例示できる。植物組織分解酵素を含有する酵素としては、スミチームC、スミチームACH、スミチームPX、スミチームSPC、スミチームMP（以上、新日本化学工業）、セルラーゼA「アマノ」3、セルラーゼT「アマノ」4、ヘミセルラーゼ「アマノ」90、ペクチナーゼG「アマノ」、ペクチナーゼPL「アマノ」（以上、天野エンザイム）、スクラーゼA、スクラーゼN、スクラーゼS、スクラーゼC、スクラーゼX（以上、三菱化学フーズ）、ペクチナーゼXP-534 NEO、セルラーゼXL−531、セルラーゼSS（以上、ナガセケムテックス）、マセロチームA、マセレイティングエンザイムY、セルラーゼ“オノズカ”3S、セルラーゼY-NC、ペクチナーゼ3S、ペクチナーゼSS、ペクチナーゼHL（以上、ヤクルト薬品工業）を例示することができる。また、1種の酵素製剤に2種以上の植物組織分解酵素が含有されていることがある。例えば、スクラーゼXはヘミセルラーゼ（キシラナーゼ）の他に、セルラーゼ、ペクチナーゼ、グルカナーゼを含み、スクラーゼCはセルラーゼの他にヘミセルラーゼ（キシラナーゼ）とペクチナーゼを含有する。また、複数の植物組織分解酵素を含有する酵素を使用する場合は、複数の酵素を同時に作用させても、１種類ずつ逐次に作用させても良い。   In the present invention, before and / or after (step 1), the tea leaves or tea shells are treated with a plant tissue degrading enzyme that decomposes hemicellulose, pectin, cellulose, etc., which are the main components of plant cell walls and cell junctions, It is possible to increase the extraction efficiency of tea leaf proteins and increase the yield of tea leaf protein degradation products by degrading the cell walls of tea leaves and the junctions between cells. As plant tissue-degrading enzymes that can be used, any microorganism-derived, plant- or animal-derived enzymes can be used, but in view of safety and price, it is preferable to use commercially available plant tissue-degrading enzymes for food. Examples of plant tissue degrading enzymes for food include cellulase, hemicellulase (xylanase), pectinase (polygalacturonase, pectin lyase, pectin esterase, pectin methyl esterase, etc.), protopectinase and the like. Enzymes containing plant tissue-degrading enzymes include Sumiteam C, Sumiteam ACH, Sumiteam PX, Sumiteam SPC, Sumiteam MP (Shin Nihon Chemical Industry), Cellulase A “Amano” 3, Cellulase T “Amano” 4, Hemicellulase "Amano" 90, pectinase G "Amano", pectinase PL "Amano" (above, Amano Enzyme), sucrase A, sucrase N, sucrase S, sucrase C, sucrase X (above, Mitsubishi Chemical Foods), pectinase XP-534 NEO , Cellulase XL-531, Cellulase SS (above, Nagase ChemteX), Macero Team A, Macerating Enzyme Y, Cellulase “Onozuka” 3S, Cellulase Y-NC, Pectinase 3S, Pectinase SS, Pectinase HL (above, Yakult Pharmaceutical Industries) Can be illustrated. One enzyme preparation may contain two or more plant tissue degrading enzymes. For example, sucrase X contains cellulase, pectinase and glucanase in addition to hemicellulase (xylanase), and sucrase C contains hemicellulase (xylanase) and pectinase in addition to cellulase. When an enzyme containing a plurality of plant tissue degrading enzymes is used, the plurality of enzymes may be allowed to act simultaneously or one by one.

植物組織分解酵素を含有する酵素の添加量は特に限定されないが、茶葉あるいは茶殻あたり、0.001〜5重量％の割合で用いるとよく、好ましくは0.01〜4重量％の割合で、より好ましくは0.02〜3重量％の割合で用いる。   The addition amount of the enzyme containing the plant tissue degrading enzyme is not particularly limited, but it may be used at a rate of 0.001 to 5% by weight, preferably 0.01 to 4% by weight, more preferably 0.02 to 0 per tea leaf or tea husk. Used at a rate of 3% by weight.

植物組織分解酵素を含有する酵素を用いて処理する際の反応pHは、安定的に酵素が作用できるという点で、酵素の至適pH±1.5が好ましく、至適pH±1.0がより好ましく、至適pH±0.5がさらに好ましい。また、工程数を増加させることなく植物組織分解酵素を作用させるには、プロテアーゼとの併用となるため、pHが5.0〜9.0で安定的に作用できる植物組織分解酵素を含有する酵素が望ましく、スクラーゼC、スクラーゼX、ペクチナーゼXP-534 NEO、セルラーゼSS、マセレイティングエンザイムYを例示することができる。   The reaction pH when treating with an enzyme containing a plant tissue degrading enzyme is preferably an optimum pH of ± 1.5, more preferably an optimum pH of ± 1.0, from the viewpoint that the enzyme can act stably. A suitable pH ± 0.5 is more preferred. In order to allow plant tissue degrading enzymes to act without increasing the number of steps, since it is used in combination with protease, an enzyme containing plant tissue degrading enzymes that can act stably at a pH of 5.0 to 9.0 is desirable. Examples include C, sucrase X, pectinase XP-534 NEO, cellulase SS, and macerate enzyme Y.

植物組織分解酵素を含有する酵素を用いる際の反応温度は、酵素製剤に含有される植物組織分解酵素が安定的に作用できる温度であれば良く、至適温度であることが望ましい。しかしながら、酵素反応中の雑菌汚染などのリスクを回避するためには50℃以上で酵素分解を行うことが好ましい。例えばスクラーゼXの場合、65℃以下の温度で安定であり、至適温度は60℃付近である。茶葉の植物組織を分解できる温度は30〜70℃であり、反応温度は40〜65℃以下が好ましく、50〜60℃がより好ましい。   The reaction temperature at the time of using the enzyme containing a plant tissue degrading enzyme may be a temperature at which the plant tissue degrading enzyme contained in the enzyme preparation can act stably, and is preferably an optimum temperature. However, in order to avoid risks such as contamination of bacteria during the enzymatic reaction, it is preferable to perform enzymatic degradation at 50 ° C. or higher. For example, sucrase X is stable at a temperature of 65 ° C. or lower, and the optimum temperature is around 60 ° C. The temperature at which the plant tissue of tea leaves can be decomposed is 30 to 70 ° C, and the reaction temperature is preferably 40 to 65 ° C or less, more preferably 50 to 60 ° C.

プロテアーゼ処理した酵素反応液のpHを2.0〜5.0、好ましくは2.5〜4.5、より好ましくは3.0〜4.0に調整して、未分解の茶葉タンパク質を等電点沈澱させた後、遠心分離や珪藻土などのろ過助剤を用いてろ過することにより、純度の高いDPP-IV阻害活性を有する茶葉タンパク質分解物を得ることができる。この時に使用するpH調整剤は、pH2.0〜5.0に調整できるものであれば特に限定されないが、飲食物への利用を考慮して塩酸、硫酸、酢酸、リン酸、クエン酸、シュウ酸、酒石酸、乳酸、フマル酸、リンゴ酸、コハク酸など使用する。凝集沈殿の効率や製造後の除去のし易さを考えると、塩酸、硫酸、酢酸を使用することが好ましい。複数のpH調整剤を併用してもよい。酵素反応液に抽出残渣を含む場合は、等電点沈殿処理した後に沈殿した未分解の茶葉タンパク質と同時に抽出残渣を遠心分離や珪藻土などのろ過助剤を用いたろ過により除去することができるし、等電点沈殿処理前に抽出残渣を遠心分離や珪藻土などのろ過助剤を用いたろ過で除去した後、未分解の茶葉タンパク質を等電点沈殿処理することも可能である。また、上述のpH調整の前後で、プロテアーゼや植物組織分解酵素を加熱失活させることも可能である。加熱失活の温度は80〜100℃、好ましくは90〜95℃、加熱失活の時間は10秒〜30分、好ましくは1〜25分である。   After adjusting the pH of the enzyme-treated solution treated with protease to 2.0 to 5.0, preferably 2.5 to 4.5, more preferably 3.0 to 4.0, isoelectric point precipitation of undegraded tea leaf protein, such as centrifugation or diatomaceous earth By filtering using a filter aid, it is possible to obtain a tea leaf protein degradation product having a high purity DPP-IV inhibitory activity. The pH adjuster used at this time is not particularly limited as long as it can be adjusted to pH 2.0 to 5.0, but hydrochloric acid, sulfuric acid, acetic acid, phosphoric acid, citric acid, oxalic acid, Use tartaric acid, lactic acid, fumaric acid, malic acid, succinic acid, etc. In view of the efficiency of coagulation precipitation and ease of removal after production, hydrochloric acid, sulfuric acid, and acetic acid are preferably used. A plurality of pH adjusting agents may be used in combination. When the enzyme reaction liquid contains an extraction residue, the extraction residue can be removed by centrifugation or filtration using a filter aid such as diatomaceous earth at the same time as the undegraded tea leaf protein precipitated after isoelectric focusing. It is also possible to subject the undegraded tea leaf protein to isoelectric point precipitation after removing the extraction residue by filtration using a filter aid such as diatomaceous earth before isoelectric point precipitation. It is also possible to heat inactivate proteases and plant tissue degrading enzymes before and after the above pH adjustment. The temperature for heat deactivation is 80 to 100 ° C., preferably 90 to 95 ° C., and the time for heat deactivation is 10 seconds to 30 minutes, preferably 1 to 25 minutes.

また、酵素反応液から目的とする茶葉タンパク質分解物を得るために、未分解の茶葉タンパク質および使用されたプロテアーゼなどを除去する方法としては、抽出残渣などの不溶物を除去した酵素反応液をそのまま限外ろ過膜を用いて膜処理し、透過液として茶葉タンパク質分解物を得る方法もある。限外ろ過膜を利用する場合はDPP-IV阻害活性成分であるペプチドを透過させることができるものであれば何でもよいが、好ましくは分画分子量1000〜100000、より好ましくは分画分子量2500〜50000、さらに好ましくは分画分子量3000〜5000以下が適している。酵素反応液から茶葉タンパク質分解物を得るためには、上述の限外ろ過膜のいずれか１種を用いて限外ろ過膜処理を行えば十分であるが、溶解性と色調により優れた茶葉タンパク質分解物を得るためには、例えば初めに分画分子量10000〜100000の限外ろ過膜処理を行い、透過液をさらに分画分子量1000〜10000の限外ろ過膜処理を行うなど、2種以上の限外ろ過膜を用いても良い。限外ろ過膜の分画分子量を100000より大きくした場合、透過液に未分解の茶葉タンパク質が多く含まれるため、得られる茶葉タンパク質分解物の溶解性が悪くなる可能性がある。限外ろ過膜の分画分子量が1000未満の場合、透過液の茶葉タンパク質分解物中のDPP-IV阻害活性成分であるペプチドの含有量が低下することが考えられるため、限外ろ過膜として好ましくない。   In addition, in order to obtain the desired tea leaf protein degradation product from the enzyme reaction solution, as a method for removing undegraded tea leaf protein and used protease, the enzyme reaction solution from which insoluble matter such as extraction residue has been removed is used as it is. There is also a method of performing membrane treatment using an ultrafiltration membrane to obtain a tea leaf protein degradation product as a permeate. When an ultrafiltration membrane is used, it may be anything as long as it can permeate the peptide that is a DPP-IV inhibitory active ingredient, but preferably has a molecular weight cut-off of 1000 to 100,000, more preferably a molecular weight cut-off of 2500 to 50000. More preferably, the molecular weight cutoff is 3000 to 5000 or less. In order to obtain a tea leaf protein degradation product from the enzyme reaction solution, it is sufficient to perform ultrafiltration membrane treatment using any one of the above-mentioned ultrafiltration membranes, but tea leaf protein having superior solubility and color tone. In order to obtain a decomposition product, for example, first, ultrafiltration membrane treatment with a fractional molecular weight of 10,000 to 10,000 is performed, and the permeate is further subjected to ultrafiltration membrane treatment with a fractional molecular weight of 1,000 to 10,000. An ultrafiltration membrane may be used. When the molecular weight cut off of the ultrafiltration membrane is greater than 100,000, the permeate contains a large amount of undegraded tea leaf protein, so that the solubility of the resulting tea leaf protein degradation product may deteriorate. When the molecular weight cut off of the ultrafiltration membrane is less than 1000, the content of the peptide that is a DPP-IV inhibitory active ingredient in the tea leaf proteolysate in the permeate may be reduced. Absent.

得られた茶葉タンパク質分解物には塩化ナトリウムなどの無機塩が含まれているが、電気透析やイオン交換樹脂、ナノろ過膜を用いて無機塩を除去することができる。また、酵素反応液を等電点沈澱処理した後に得られる茶葉タンパク質分解物に含まれる色素は、澄明な清涼飲料等の飲食品に違和感を与える可能性があるため、活性炭などの吸着剤を用いて色素を減少させ、添加した清涼飲料などの飲食品から違和感を除去することもできる。   The obtained tea leaf proteolysate contains an inorganic salt such as sodium chloride, but the inorganic salt can be removed using electrodialysis, an ion exchange resin, or a nanofiltration membrane. In addition, since the pigment contained in the tea leaf protein degradation product obtained after isoelectric point precipitation of the enzyme reaction solution may give a sense of incongruity to foods and drinks such as clear soft drinks, an adsorbent such as activated carbon is used. Thus, the pigment can be reduced and the unpleasant sensation can be removed from the food and drink such as the added soft drink.

さらに、得られた茶葉タンパク質分解物の溶液をそのままスプレードライやフリーズドライなどの方法により乾燥して粉末化することもできる。より好ましい方法としては、得られた茶葉タンパク質分解物溶液に、澱粉、加工澱粉、デキストリン、環状デキストリン、還元水飴、水飴、難消化性デキストリン、オリゴ糖、α化澱粉・アラビアガムなどの粉末化基材を添加溶解後、スプレードライやフリーズドライなどの方法により乾燥して茶葉タンパク質分解物を粉末化し、食品素材あるいは食品添加剤とすることもできる。   Furthermore, the obtained tea leaf proteolysate solution can be directly dried into a powder by a method such as spray drying or freeze drying. As a more preferable method, the obtained tea leaf protein degradation product solution may be used in a powdered group such as starch, modified starch, dextrin, cyclic dextrin, reduced starch syrup, starch syrup, indigestible dextrin, oligosaccharide, pregelatinized starch and gum arabic. After the material is added and dissolved, it can be dried by a method such as spray drying or freeze drying to pulverize the tea leaf proteolysate into a food material or food additive.

また、本発明の茶葉タンパク質分解物からなるDPP-IV阻害剤、血糖値上昇抑制剤、抗糖尿病剤を経口的に投与する場合の剤形は各種適宜選択することができ、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、シロップなどの経口投与剤を例示することができる。   In addition, the dosage form in the case of orally administering a DPP-IV inhibitor, a blood glucose level increase inhibitor, and an antidiabetic agent comprising the tea leaf protein degradation product of the present invention can be appropriately selected from various forms, powders, granules, Oral administration agents such as tablets, capsules and syrups can be exemplified.

本発明で得られる茶葉タンパク質分解物はDPP-IV阻害活性を有するため、DPP-IV阻害剤、血糖値上昇抑制剤、抗糖尿剤として経口的に摂取して、生体においてDPP-IVを阻害することにより血糖値の上昇を抑制することができる。また、本発明のDPP-IV阻害剤、血糖値上昇抑制剤、抗糖尿病剤は呈味性（旨味、コク、重厚感）、溶解性および色調（非呈色性、透明性）に優れているため、飲料、農水産加工品、乳製品、菓子、調味料、フリーズドライ食品、レトルト食品などの食品や健康食品に含有させることができる。DPP-IV阻害用、血糖値上昇抑制用又は抗糖尿病用の飲食品としては特に制限はされないが、具体的に対象となる食品としては、以下のものが挙げられる。茶系飲料、コーヒー飲料、ココア飲料、炭酸飲料、果実飲料、果実、野菜飲料、清涼飲料（ボトルドウォーター）、乳飲料類、乳酸菌飲料類、ドリンク剤類、スポーツドリンク、豆乳、粉末飲料などの飲料類；アイスクリーム、アイスミルク、ラクトアイス、氷菓、ヨーグルト、プリン、ゼリーなどのデザート類；饅頭、羊羹、キャラメル、キャンディー、錠菓、スナック、クラッカー、ビスケット、クッキー、パイ、チョコレート、チューインガムなどの菓子類；和風スープ、洋風スープ、中華スープ、味噌汁などのスープ類；パン類；ジャム類；マヨネーズ、ドレッシングなどの調味料類；レトルトカレーなどのレトルト食品などを挙げることができる。   Since the tea leaf proteolysate obtained in the present invention has DPP-IV inhibitory activity, it is taken orally as a DPP-IV inhibitor, a blood sugar level increase inhibitor, or an antidiabetic, and inhibits DPP-IV in the living body. As a result, an increase in blood sugar level can be suppressed. In addition, the DPP-IV inhibitor, the blood sugar level increase inhibitor, and the antidiabetic agent of the present invention are excellent in taste (umami, richness, profound feeling), solubility and color tone (non-coloration, transparency). Therefore, it can be contained in foods such as beverages, processed agricultural products, dairy products, confectionery, seasonings, freeze-dried foods, retort foods, and health foods. There are no particular restrictions on foods and drinks for DPP-IV inhibition, blood glucose level increase suppression, or antidiabetic use, but specific foods include the following. Tea beverages, coffee beverages, cocoa beverages, carbonated beverages, fruit beverages, fruits, vegetable beverages, soft drinks (bottled water), milk beverages, lactic acid bacteria beverages, drinks, sports drinks, soy milk, powdered beverages, etc. Beverages: Ice cream, ice milk, lacto ice, ice confectionery, yogurt, pudding, jelly and other desserts; Examples: Soups such as Japanese-style soup, Western-style soup, Chinese soup, miso soup; breads; jams; seasonings such as mayonnaise and dressing; retort foods such as retort curry.

飲食品に対する本発明の茶葉タンパク分解物の配合量は、特に制限されないが、対象となる飲食品により配合量を適宜設定する。添加量としては飲食品一食あたり10〜2000mg、好ましくは50〜1000mg、より好ましくは100〜600mgであることがより好ましい。 Although the compounding quantity of the tea leaf proteolysate of this invention with respect to food / beverage products is not restrict | limited in particular, A compounding quantity is suitably set with the food / beverage products used as object. The amount added is 10 to 2000 mg, preferably 50 to 1000 mg, more preferably 100 to 600 mg per food and drink.

また、本発明はVal-Ala-Tyr-Pro（VAYP）を有効成分とするジペプチジルペプチダーゼ-IV阻害剤、血糖値上昇抑制剤、抗糖尿病剤を提供するものである。本発明におけるVal-Ala-Tyr-Pro（VAYP）は、公知の有機化学合成法により得ることが出来る。また本発明記載の茶葉タンパク質分解物から単離することも可能である。 The present invention also provides a dipeptidyl peptidase-IV inhibitor, a blood glucose level increase inhibitor, and an antidiabetic agent containing Val-Ala-Tyr-Pro (VAYP) as an active ingredient. Val-Ala-Tyr-Pro (VAYP) in the present invention can be obtained by a known organic chemical synthesis method. It can also be isolated from the tea leaf protein degradation product of the present invention.

アミノ酸から有機合成方法によってVal-Ala-Tyr-Pro（VAYP）を製造する場合、種々の既知精製手段を選択し、組合わせて行うことができる。例えば、ペプチド合成法としては、アジド法、酸クロライド法、酸無水物法、混合酸無水物法、DCC法(ジシクロヘキシルカルボジイミド法)、活性エステル法、カルボイミダール法、酸加還元法等のペプチ合成法を例示することが出来る。これらのペプチド合成法は固相合成法と液相合成法（例えば特開2003-183298号公報参照）があり、固相合成法ではFmoc法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、Boc法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）が公知の方法として知られているが、いずれの方法で合成してもよい。 When producing Val-Ala-Tyr-Pro (VAYP) from an amino acid by an organic synthesis method, various known purification means can be selected and combined. For example, peptide synthesis methods include peptides such as the azide method, acid chloride method, acid anhydride method, mixed acid anhydride method, DCC method (dicyclohexylcarbodiimide method), active ester method, carboimidazole method, and acid addition / reduction method. A synthesis method can be exemplified. These peptide synthesis methods include a solid phase synthesis method and a liquid phase synthesis method (see, for example, JP-A-2003-183298). In the solid phase synthesis method, the Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method), the Boc method (t -Butyloxycarbonyl method) is known as a known method, but may be synthesized by any method.

Val-Ala-Tyr-Pro（VAYP）を本発明の茶葉タンパク分解物から得ようとする場合は、種々の既知精製手段を選択し、組合わせて行うことができる。例えば限外ろ過、ゲルろ過、高速液体クロマトグラフやイオンクロマトグラフ等の精製手段が挙げられる。 When obtaining Val-Ala-Tyr-Pro (VAYP) from the tea leaf proteolysate of the present invention, various known purification means can be selected and combined. For example, purification means such as ultrafiltration, gel filtration, high performance liquid chromatograph and ion chromatograph can be mentioned.

当該ペプチド（VAYP）を有効成分とするDPP-IV阻害剤、血糖値上昇抑制剤、抗糖尿病剤は、経口的に摂取して生体においてDPP-IVを阻害することによりインクレチンの分解を抑制し、血糖値の上昇を抑制することができる。利用の形態は特に限定されないが、たとえば液剤、粉末状、顆粒状などが挙げられ、食品または栄養補助品として通常用いられる形態、たとえば散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、シロップ剤などの経口投与剤を例示することができる。   DPP-IV inhibitors, blood sugar level increase inhibitors, and antidiabetics containing the peptide (VAYP) as an active ingredient suppress incretin degradation by ingesting orally and inhibiting DPP-IV in the body. , Increase in blood sugar level can be suppressed. The form of use is not particularly limited, and examples thereof include liquids, powders, granules, etc., and forms usually used as food or nutritional supplements, such as powders, granules, tablets, capsules, syrups, and oral administration Agents can be exemplified.

当該ペプチド（VAYP）を有効成分とするDPP-IV阻害剤、血糖値上昇抑制剤、抗糖尿病剤は、当該ペプチドだけからなるものであってもよい。あるいは他の成分との組み合わせで調製してもよい。例えば他の血糖値上昇抑制剤、（スルホニル尿素薬、インスリン抵抗性改善薬、ビクアナイド薬、α―グルコシダーゼ阻害薬、グリニド薬など）、各種ビタミン剤（例えばビタミンＡ，ビタミンＢ１、Ｂ２、Ｂ６、Ｂ１２、ビタミンＣ，ビタミンＤ，ビタミンＥなど）などと併用してもよい。 The DPP-IV inhibitor, blood glucose level increase inhibitor, and antidiabetic agent containing the peptide (VAYP) as an active ingredient may be composed only of the peptide. Or you may prepare in combination with another component. For example, other blood glucose level increase inhibitors (sulfonylurea drugs, insulin resistance improving drugs, biguanide drugs, α-glucosidase inhibitors, glinide drugs, etc.), various vitamin drugs (for example, vitamin A, vitamin B 1 , B 2 , B 6 , B 12 , vitamin C, vitamin D, vitamin E, etc.).

本発明のVAYPを有効成分とするのDPP-IV阻害剤、血糖値上昇抑制剤、抗糖尿病剤を医薬品または医薬部外品として用いる場合は、日本薬局方に収められている医薬品または医薬部外品で口に含むことができれば特に限定されるものではなく、上記有効成分に薬学的に許容される担体を添加して、経口用の製剤とすることが出来る。製剤形態としては、錠剤、顆粒剤、細粒剤、丸剤、散剤、カプセル剤、トローチ剤、チュアブル剤、液剤（ドリンク剤）、健康飲料、ビタミン含有保健剤などが挙げられる。 When using the DPP-IV inhibitor, blood glucose level increase inhibitor, and antidiabetic agent comprising the VAYP of the present invention as an active ingredient as a drug or quasi drug, the drug or quasi drug contained in the Japanese Pharmacopoeia The product is not particularly limited as long as it can be contained in the mouth, and can be made into an oral preparation by adding a pharmaceutically acceptable carrier to the active ingredient. Examples of the dosage form include tablets, granules, fine granules, pills, powders, capsules, troches, chewables, liquids (drinks), health drinks, vitamin-containing health agents, and the like.

医薬品または医薬部外品に対する本発明のペプチド（VAYP）の配合量は、特に制限されない。対象となる医薬品または医薬部外品により配合量を適宜設定するが、一般的には、最終製品中でVAYPを0.001〜30重量％好ましくは0.01〜10重量％程度を含有する製剤形態に調製することが好ましい。 The compounding quantity of the peptide (VAYP) of this invention with respect to a pharmaceutical or a quasi drug is not restrict | limited in particular. The compounding amount is appropriately set depending on the target pharmaceutical or quasi-drug, but in general, it is prepared in a dosage form containing about 0.001 to 30% by weight, preferably about 0.01 to 10% by weight of VAYP in the final product. It is preferable.

また本発明のVAYPを有効成分とするDPP-IV阻害剤、血糖値上昇抑制剤、抗糖尿病剤を含有する飲食品として用いる場合はどのような形態であってもよく、例えば、水溶液や混濁物や乳化物などの液状形態であっても、ゲル状やペースト状の半固形状形態であっても、粉末や顆粒やカプセルやタブレットなどのサプリメント等の固形状形態であってもよい。また、呈味性（旨味、コク、重厚感）、溶解性および色調（非呈色性、透明性）に優れているため、飲料、農水産加工品、乳製品、菓子、調味料、フリーズドライ食品、レトルト食品などの食品や健康食品に含有させることができる。 In addition, when used as a DPP-IV inhibitor containing the VAYP of the present invention as an active ingredient, a blood sugar level increase inhibitor, a food or drink containing an antidiabetic agent, it may be in any form, for example, an aqueous solution or a turbid substance. Or a liquid form such as an emulsion, a semi-solid form such as a gel or paste, or a solid form such as a supplement such as powder, granule, capsule or tablet. In addition, it is excellent in taste (umami, richness, profound feeling), solubility and color (non-coloration, transparency), so beverages, processed agricultural products, dairy products, confectionery, seasonings, freeze-dried It can be contained in foods such as foods and retort foods and health foods.

本発明のペプチド（VAYP）を有効成分とするDPP-IV阻害剤、血糖値上昇抑制剤、抗糖尿病剤を含有する飲食品としては特に制限はされないが、具体的に対象となる食品としては、以下のものが挙げられる。
即席食品類（即席めん、カップめん、レトルト・調理食品、調理缶詰め、電子レンジ食品、即席味噌汁・吸い物、スープ缶詰め、フリーズドライ食品など）、炭酸飲料、柑橘類（グレープフルーツ、オレンジ、レモンなど）の果汁や果汁飲料や果汁入り清涼飲料、柑橘類の果肉飲料や果粒入り果実飲料、トマト、ピーマン、セロリ、ウリ、ニンジン、ジャガイモ、アスパラガスなどの野菜を含む野菜系飲料、豆乳・豆乳飲料、コーヒー飲料、お茶飲料、粉末飲料、濃縮飲料、スポーツ飲料、ボトルドウォーター（清涼飲料水）、栄養飲料、タバコなどの嗜好飲料・嗜好品類、マカロニ・スパゲッティ、麺類、ケーキミックス、唐揚げ粉、パン粉、ギョーザの皮などの小麦粉製品、キャラメル・キャンディー、チューイングガム、チョコレート、クッキー・ビスケット、ケーキ・パイ、スナック・クラッカー、和菓子・米菓子・豆菓子、デザート菓子などの菓子類、しょうゆ、みそ、ソース類、トマト加工調味料、みりん類、食酢類、甘味料などの基礎調味料、風味調味料、調理ミックス、カレーの素類、たれ類、ドレッシング類、めんつゆ類、スパイス類などの複合調味料・食品類、バター、マーガリン類、マヨネーズ類、植物油などの油脂類、牛乳・加工乳、乳飲料、ヨーグルト類、乳酸菌飲料、チーズ、アイスクリーム類、調製粉乳類、クリームなどの乳・乳製品、和風スープ、洋風スープ、中華スープ、味噌汁などのスープ類、レトルトカレーなどのレトルト食品、素材冷凍食品、半調理冷凍食品、調理済み冷凍食品などの冷凍食品、水産缶詰め、果実缶詰め・ペースト類、魚肉ハム・ソーセージ、水産練り製品、水産珍味類、水産乾物類、佃煮類などの水産加工品、畜産缶詰め・ペースト類、畜肉缶詰め、果実缶詰め、ジャム・マーマレード類、漬物・煮豆類、農産乾物類、シリアル（穀物加工品）などの農産加工品、ベビーフード、ふりかけ・お茶漬けのりなどの市販食品などを挙げることが出来る。 The DPP-IV inhibitor containing the peptide (VAYP) of the present invention as an active ingredient, a blood sugar level increase inhibitor, and a food or drink containing an antidiabetic agent are not particularly limited. The following are mentioned.
Instant foods (instant noodles, cup noodles, retort / cooked foods, canned foods, microwave foods, instant miso soup / soup, canned soups, freeze-dried foods, etc.), carbonated drinks, citrus fruits (grapefruits, oranges, lemons, etc.) Fruit juice drinks and soft drinks with fruit juices, fruit drinks with citrus fruits and fruit drinks with fruits, vegetable drinks containing vegetables such as tomatoes, peppers, celery, cucumbers, carrots, potatoes, asparagus, soy milk and soy milk drinks, coffee drinks, Tea drinks, powdered drinks, concentrated drinks, sports drinks, bottled water (soft drinks), nutrition drinks, tobacco and other favorite drinks / paste goods, macaroni / spaghetti, noodles, cake mix, fried powder, bread crumbs, gyoza Flour products such as leather, caramel candy, chewing gum, chocolate Cookies / biscuits, cakes / pies, snacks / crackers, Japanese confectionery / rice confectionery / bean candy, dessert confectionery, soy sauce, miso, sauces, tomato processed seasonings, mirins, vinegars, sweeteners, etc. Seasonings, flavor seasonings, cooking mixes, curry ingredients, sauces, dressings, noodle soup, spices and other complex seasonings and foods, butter, margarines, mayonnaise, vegetable oils and fats, milk・ Processed milk, milk drinks, yogurts, lactic acid bacteria drinks, cheese, ice creams, formula milk, cream and other milk and dairy products, Japanese-style soups, Western-style soups, Chinese soups, miso soups, retort curry, etc. Retort food, frozen food, semi-cooked frozen food, frozen food such as cooked frozen food, canned fish, canned fruits and pastes, Meat ham, sausage, marine products, marine products such as marine delicacies, marine dried foods, boiled fish, canned livestock cans / pastes, canned meat, canned fruits, jams / marmalades, pickles / boiled beans, dried agricultural products, Agricultural processed products such as cereals (processed cereals), baby foods, and commercial foods such as sprinkles and tea pickles.

また、本発明の茶葉タンパク質分解物またはペプチド(VAYP)を含有するDPP-IV阻害用、血糖値上昇抑制用、又は抗糖尿病用の飲食品の例として、血糖値上昇抑制機能を有する特定保健用食品あるいは機能性表示食品、血糖値上昇抑制作用またはインスリン分泌亢進作用を有することによって高血糖に起因する疾患の予防または治療のために用いられる特定保健用食品あるいは機能性表示食品も含まれる。 Further, as examples of food and drink for DPP-IV inhibition, blood sugar level elevation suppression, or anti-diabetic use containing the tea leaf protein degradation product or peptide (VAYP) of the present invention, for specific health use having a function of inhibiting blood sugar level elevation Also included are foods or functional labeling foods, foods for specified health use or functional labeling foods that are used for the prevention or treatment of diseases caused by hyperglycemia by having a blood glucose level increase inhibitory action or an insulin secretion enhancing action.

本発明のトリペプチドであるLeu-Gly-Pro(LGP)、Thr-Gly-Tyr（TGY)、His-Asp-Tyr（HDY）、Val-Asp-Tyr（VDY）、Leu-Tyr-Asn（LYN）は、公知の有機化学合成法により得ることが出来る。また、本発明記載の茶葉タンパク質分解物から単離することも可能である。本発明の茶葉タンパク分解物から得ようとする場合は、種々の既知精製手段を選択し、組合わせて行うことができる。例えば限外ろ過、ゲルろ過、高速液体クロマトグラフやイオンクロマトグラフ等の精製手段が挙げられる。また、前記記載のVal-Ala-Tyr-Pro（VAYP）と同様にアミノ酸から有機合成方法によってトリペプチドLGP、TGY、HDY、VDY、LYNを製造することができる。 The tripeptides of the present invention are Leu-Gly-Pro (LGP), Thr-Gly-Tyr (TGY), His-Asp-Tyr (HDY), Val-Asp-Tyr (VDY), Leu-Tyr-Asn (LYN ) Can be obtained by a known organic chemical synthesis method. It can also be isolated from the tea leaf protein degradation product of the present invention. When trying to obtain from the tea leaf protein degradation product of the present invention, various known purification means can be selected and combined. For example, purification means such as ultrafiltration, gel filtration, high performance liquid chromatograph and ion chromatograph can be mentioned. In addition, tripeptides LGP, TGY, HDY, VDY, and LYN can be produced from amino acids by organic synthesis in the same manner as Val-Ala-Tyr-Pro (VAYP) described above.

本発明のトリペプチドLGP、TGY、HDY、VDY、LYNのアミノ酸からの合成方法は、例えば、ペプチド合成法としては、アジド法、酸クロライド法、酸無水物法、混合酸無水物法、DCC法(ジシクロヘキシルカルボジイミド法)、活性エステル法、カルボイミダール法、酸加還元法等のペプチ合成法を例示することが出来る。これらのペプチド合成法は固相合成法と液相合成法（例えば特開2003-183298号公報参照）があり、固相合成法ではFmoc法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、Boc法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）が公知の方法として知られているが、いずれの方法で合成してもよい。 The method for synthesizing tripeptides LGP, TGY, HDY, VDY, and LYN of the present invention from amino acids, for example, as peptide synthesis methods, azide method, acid chloride method, acid anhydride method, mixed acid anhydride method, DCC method Peptide synthesis methods such as (dicyclohexylcarbodiimide method), active ester method, carboimidazole method, acid addition / reduction method and the like can be exemplified. These peptide synthesis methods include a solid phase synthesis method and a liquid phase synthesis method (see, for example, JP-A-2003-183298). In the solid phase synthesis method, the Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method), the Boc method (t -Butyloxycarbonyl method) is known as a known method, but may be synthesized by any method.

本発明のトリペプチドLGP、TGY、HDY、VDY、LYNを本発明の茶葉タンパク分解物から得ようとする場合は、種々の既知精製手段を選択し、組合わせて行うことができる。例えば限外ろ過、ゲルろ過、高速液体クロマトグラフやイオンクロマトグラフ等の精製手段が挙げられる。 When the tripeptides LGP, TGY, HDY, VDY, and LYN of the present invention are to be obtained from the tea leaf proteolysate of the present invention, various known purification means can be selected and combined. For example, purification means such as ultrafiltration, gel filtration, high performance liquid chromatograph and ion chromatograph can be mentioned.

当該トリペプチドであるLGP、TGY、HDY、VDY及びLYNのいずれか1種または2種以上を有効成分とするDPP-IV阻害剤、血糖値上昇抑制剤、抗糖尿病剤は、経口的に摂取して生体においてDPP-IVを阻害することによりインクレチンの分解を抑制し、血糖値の上昇を抑制することができる。利用の形態は特に限定されないが、たとえば液剤、粉末状、顆粒状などが挙げられ、食品または栄養補助品として通常用いられる形態、たとえば散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、シロップ剤などの経口投与剤を例示することができる。   The tripeptides LGP, TGY, HDY, VDY, and LYN are one or more of DPP-IV inhibitors, blood glucose level increase inhibitors, and antidiabetics that are active ingredients. By inhibiting DPP-IV in the living body, it is possible to suppress degradation of incretin and suppress an increase in blood glucose level. The form of use is not particularly limited, and examples thereof include liquids, powders, granules, etc., and forms usually used as food or nutritional supplements, such as powders, granules, tablets, capsules, syrups, and oral administration Agents can be exemplified.

当該トリペプチドであるLGP、TGY、HDY、VDY及びLYNのいずれか1種または2種以上を有効成分とするDPP-IV阻害剤、血糖値上昇抑制剤、抗糖尿病剤は、当該トリペプチドだけからなるものであってもよい。あるいは他の成分との組み合わせで調製してもよい。例えば他の血糖値上昇抑制剤、（スルホニル尿素薬、インスリン抵抗性改善薬、ビクアナイド薬、α―グルコシダーゼ阻害薬、グリニド薬など）、各種ビタミン剤（例えばビタミンＡ，ビタミンＢ１、Ｂ２、Ｂ６、Ｂ１２、ビタミンＣ，ビタミンＤ，ビタミンＥなど）などと併用してもよい。 DPP-IV inhibitors, blood glucose level increase inhibitors, and antidiabetic agents, which contain any one or more of LGP, TGY, HDY, VDY, and LYN, which are the tripeptides, as active ingredients are only from the tripeptides. It may be. Or you may prepare in combination with another component. For example, other blood glucose level increase inhibitors (sulfonylurea drugs, insulin resistance improving drugs, biguanide drugs, α-glucosidase inhibitors, glinide drugs, etc.), various vitamin drugs (for example, vitamin A, vitamin B 1 , B 2 , B 6 , B 12 , vitamin C, vitamin D, vitamin E, etc.).

本発明のトリペプチドであるLGP、TGY、HDY、VDY及びLYNのいずれか1種または2種以上を有効成分とするDPP-IV阻害剤、血糖値上昇抑制剤、抗糖尿病剤を医薬品または医薬部外品として用いる場合は、日本薬局方に収められている医薬品または医薬部外品で口に含むことができれば特に限定されるものではなく、上記有効成分に薬学的に許容される担体を添加して、経口用の製剤とすることが出来る。製剤形態としては、錠剤、顆粒剤、細粒剤、丸剤、散剤、カプセル剤、トローチ剤、チュアブル剤、液剤（ドリンク剤）、健康飲料、ビタミン含有保健剤などが挙げられる。 A DPP-IV inhibitor, a blood glucose level increase inhibitor, or an antidiabetic agent comprising one or more of LGP, TGY, HDY, VDY and LYN, which are the tripeptides of the present invention, as an active ingredient. When used as an external product, it is not particularly limited as long as it can be included in the mouth with pharmaceuticals or quasi-drugs contained in the Japanese Pharmacopoeia, and a pharmaceutically acceptable carrier is added to the above active ingredients. Thus, it can be made into an oral preparation. Examples of the dosage form include tablets, granules, fine granules, pills, powders, capsules, troches, chewables, liquids (drinks), health drinks, vitamin-containing health agents, and the like.

医薬品または医薬部外品に対する本発明のトリペプチドであるLGP、TGY、HDY、VDY及びLYNのいずれか1種または2種以上の配合量は、特に制限されない。対象となる医薬品または医薬部外品により配合量を適宜設定するが、一般的には、最終製品中で前記トリペプチドの合計配合量を0.001〜30重量％好ましくは0.01〜10重量％程度を含有する製剤形態に調製することが好ましい。 The amount of LGP, TGY, HDY, VDY, and LYN, which are the tripeptides of the present invention for pharmaceuticals or quasi drugs, is not particularly limited. The compounding amount is appropriately set depending on the target drug or quasi-drug, but generally the total compounding amount of the tripeptide in the final product is 0.001 to 30% by weight, preferably about 0.01 to 10% by weight. It is preferable to prepare in the formulation form.

また本発明のトリペプチドであるLGP、TGY、HDY、VDY及びLYNのいずれか1種または2種以上を有効成分とするDPP-IV阻害剤、血糖値上昇抑制剤、抗糖尿病剤を含有する飲食品として用いる場合はどのような形態であってもよく、例えば、水溶液や混濁物や乳化物などの液状形態であっても、ゲル状やペースト状の半固形状形態であっても、粉末や顆粒やカプセルやタブレットなどのサプリメント等の固形状形態であってもよい。また、呈味性（旨味、コク、重厚感）、溶解性および色調（非呈色性、透明性）に優れているため、飲料、農水産加工品、乳製品、菓子、調味料、フリーズドライ食品、レトルト食品などの食品や健康食品に含有させることができる In addition, a food and drink containing a DPP-IV inhibitor, a blood glucose level increase inhibitor, and an antidiabetic agent containing one or more of LGP, TGY, HDY, VDY and LYN, which are the tripeptides of the present invention, as active ingredients When used as a product, it may be in any form, for example, a liquid form such as an aqueous solution, turbidity or emulsion, a gel-like or paste-like semi-solid form, a powder or It may be a solid form such as a granule, a supplement such as a capsule or a tablet. In addition, it is excellent in taste (umami, richness, profound feeling), solubility and color (non-coloration, transparency), so beverages, processed agricultural products, dairy products, confectionery, seasonings, freeze-dried Can be contained in foods such as foods and retort foods and health foods

本発明のトリペプチドLGP、TGY、HDY、VDY及びLYNのいずれか1種または2種以上を有効成分とするDPP-IV阻害剤、血糖値上昇抑制剤、抗糖尿病剤を含有する飲食品としては特に制限はされないが、具体的に対象となる食品としては、以下のものが挙げられる。
即席食品類（即席めん、カップめん、レトルト・調理食品、調理缶詰め、電子レンジ食品、即席味噌汁・吸い物、スープ缶詰め、フリーズドライ食品など）、炭酸飲料、柑橘類（グレープフルーツ、オレンジ、レモンなど）の果汁や果汁飲料や果汁入り清涼飲料、柑橘類の果肉飲料や果粒入り果実飲料、トマト、ピーマン、セロリ、ウリ、ニンジン、ジャガイモ、アスパラガスなどの野菜を含む野菜系飲料、豆乳・豆乳飲料、コーヒー飲料、お茶飲料、粉末飲料、濃縮飲料、スポーツ飲料、ボトルドウォーター（清涼飲料水）、栄養飲料、タバコなどの嗜好飲料・嗜好品類、マカロニ・スパゲッティ、麺類、ケーキミックス、唐揚げ粉、パン粉、ギョーザの皮などの小麦粉製品、キャラメル・キャンディー、チューイングガム、チョコレート、クッキー・ビスケット、ケーキ・パイ、スナック・クラッカー、和菓子・米菓子・豆菓子、デザート菓子などの菓子類、しょうゆ、みそ、ソース類、トマト加工調味料、みりん類、食酢類、甘味料などの基礎調味料、風味調味料、調理ミックス、カレーの素類、たれ類、ドレッシング類、めんつゆ類、スパイス類などの複合調味料・食品類、バター、マーガリン類、マヨネーズ類、植物油などの油脂類、牛乳・加工乳、乳飲料、ヨーグルト類、乳酸菌飲料、チーズ、アイスクリーム類、調製粉乳類、クリームなどの乳・乳製品、和風スープ、洋風スープ、中華スープ、味噌汁などのスープ類、レトルトカレーなどのレトルト食品、素材冷凍食品、半調理冷凍食品、調理済み冷凍食品などの冷凍食品、水産缶詰め、果実缶詰め・ペースト類、魚肉ハム・ソーセージ、水産練り製品、水産珍味類、水産乾物類、佃煮類などの水産加工品、畜産缶詰め・ペースト類、畜肉缶詰め、果実缶詰め、ジャム・マーマレード類、漬物・煮豆類、農産乾物類、シリアル（穀物加工品）などの農産加工品、ベビーフード、ふりかけ・お茶漬けのりなどの市販食品などを挙げることが出来る。 As a food and beverage containing a DPP-IV inhibitor, a blood glucose level increase inhibitor, and an antidiabetic agent containing one or more of the tripeptides LGP, TGY, HDY, VDY and LYN of the present invention as active ingredients Although it does not restrict | limit in particular, As the food specifically targeted, the following are mentioned.
Instant foods (instant noodles, cup noodles, retort / cooked foods, canned foods, microwave foods, instant miso soup / soup, canned soups, freeze-dried foods, etc.), carbonated drinks, citrus fruits (grapefruits, oranges, lemons, etc.) Fruit juice drinks and soft drinks with fruit juices, fruit drinks with citrus fruits and fruit drinks with fruits, vegetable drinks containing vegetables such as tomatoes, peppers, celery, cucumbers, carrots, potatoes, asparagus, soy milk and soy milk drinks, coffee drinks, Tea drinks, powdered drinks, concentrated drinks, sports drinks, bottled water (soft drinks), nutrition drinks, tobacco and other favorite drinks / paste goods, macaroni / spaghetti, noodles, cake mix, fried powder, bread crumbs, gyoza Flour products such as leather, caramel candy, chewing gum, chocolate Cookies / biscuits, cakes / pies, snacks / crackers, Japanese confectionery / rice confectionery / bean candy, dessert confectionery, soy sauce, miso, sauces, tomato processed seasonings, mirins, vinegars, sweeteners, etc. Seasonings, flavor seasonings, cooking mixes, curry ingredients, sauces, dressings, noodle soup, spices and other complex seasonings and foods, butter, margarines, mayonnaise, vegetable oils and fats, milk・ Processed milk, milk drinks, yogurts, lactic acid bacteria drinks, cheese, ice creams, formula milk, cream and other milk and dairy products, Japanese-style soups, Western-style soups, Chinese soups, miso soups, retort curry, etc. Retort food, frozen food, semi-cooked frozen food, frozen food such as cooked frozen food, canned fish, canned fruits and pastes, Meat ham, sausage, marine products, marine products such as marine delicacies, marine dried foods, boiled fish, canned livestock cans / pastes, canned meat, canned fruits, jams / marmalades, pickles / boiled beans, dried agricultural products, Agricultural processed products such as cereals (processed cereals), baby foods, and commercial foods such as sprinkles and tea pickles.

また、本発明のトリペプチドであるLGP、TGY、HDY、VDY及びLYNのいずれか1種または2種以上を含有する飲食品として、DPP-IV阻害用、血糖値上昇抑制用又は抗糖尿病用の飲食品が例示できる。更には、血糖値上昇抑制機能を有する特定保健用食品あるいは機能性表示食品、血糖値上昇抑制作用またはインスリン分泌亢進作用を有することによって高血糖に起因する疾患の予防または治療のために用いられる特定保健用食品あるいは機能性表示食品も含まれる。 In addition, as a food or drink containing one or more of LGP, TGY, HDY, VDY and LYN, which are the tripeptides of the present invention, for DPP-IV inhibition, for suppressing blood sugar level elevation or for antidiabetics Food and drink can be exemplified. Furthermore, specific health foods or functional indication foods that have a blood glucose level increase inhibitory function, specific that is used for the prevention or treatment of diseases caused by hyperglycemia by having a blood glucose level increase inhibitory action or an insulin secretion enhancing action Health foods or functional foods are also included.

飲食品に対する本発明のトリペプチドLGP、TGY、HDY、VDY及びLYNの1種または2種以上の配合量は、特に制限されないが、対象となる飲食品により配合量を適宜設定する。一般的には、最終製品中で0.001〜30重量％であることが好ましく、0.001〜5重量％であることがより好ましい。 The blending amount of one or more of the tripeptides LGP, TGY, HDY, VDY and LYN of the present invention with respect to the food or drink is not particularly limited, but the blending amount is appropriately set depending on the target food or drink. Generally, it is preferably 0.001 to 30% by weight in the final product, and more preferably 0.001 to 5% by weight.

本発明のトリペプチドHis-Asp-Tyr(HDY)、Leu-Tyr-Asn(LYN)は、後述の検索結果より新規ぺプチドであることが確認できた。 The tripeptides His-Asp-Tyr (HDY) and Leu-Tyr-Asn (LYN) of the present invention were confirmed to be novel peptides from the search results described below.

以下に実施例を挙げ、本発明をさらに詳しく説明する。ただし、本発明の範囲はこれに限定されるものではなく、以下の例示以外についても本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更実施し得る。   The following examples further illustrate the present invention. However, the scope of the present invention is not limited to this, and modifications other than the following examples can be made as appropriate without departing from the spirit of the present invention.

［試験例1］各種プロテアーゼで処理した茶葉タンパク質分解物の調製
（茶葉タンパク質分解物の調製）
緑茶の乾燥茶殻1.5gに0.05M水酸化カリウム水溶液を21mL加えた後、50℃で3時間振とう抽出して抽出残渣が混在する抽出液を得た。2M塩酸水溶液を添加して抽出液のpHを5.0に調整した後、プロテアーゼM「アマノ」SD（天野エンザイム株式会社製） 12.0mgを加えて50℃で4時間酵素反応を行って酵素反応液を得た。酵素反応液を沸騰水浴中で20分間加熱して酵素を失活させた後、2M塩酸水溶液を加えてpH3.3に調整して遠心分離（3000g、60分間）を行った。得られた上清に1M水酸化カリウム水溶液を添加してpH5.4に調整した後凍結乾燥を行い、茶葉タンパク質分解物の粉末245.2mgを得た。 [Test Example 1] Preparation of tea leaf proteolysate treated with various proteases (preparation of tea leaf proteolysate)
After adding 21 mL of 0.05M potassium hydroxide aqueous solution to 1.5 g of dry tea husk of green tea, the mixture was extracted by shaking at 50 ° C. for 3 hours to obtain an extract mixed with extraction residues. After adjusting the pH of the extract to 5.0 by adding 2M aqueous hydrochloric acid, add 12.0mg of protease M “Amano” SD (Amano Enzyme Co., Ltd.) and perform the enzyme reaction at 50 ° C for 4 hours. Obtained. The enzyme reaction solution was heated in a boiling water bath for 20 minutes to inactivate the enzyme, and then 2M hydrochloric acid aqueous solution was added to adjust to pH 3.3, followed by centrifugation (3000 g, 60 minutes). A 1M aqueous potassium hydroxide solution was added to the resulting supernatant to adjust the pH to 5.4, followed by lyophilization to obtain 245.2 mg of tea leaf protein decomposed powder.

［試験例2］各種プロテアーゼで処理した茶葉タンパク質分解物の調製とDPP-IV阻害率
（茶葉タンパク質分解物の調製）
緑茶の乾燥茶殻1.5gに0.05M水酸化カリウム水溶液を21mL加えた後、50℃で3時間振とう抽出して抽出残渣が混在する抽出液を得た。2M塩酸水溶液を添加して抽出液のpHを5.0に調整した後、プロテアーゼM「アマノ」SD（天野エンザイム株式会社製） 12.0mgと[スクラーゼX](三菱化学フーズ株式会社製) 2.5mgを加えて50℃で4時間酵素反応を行って酵素反応液を得た。酵素反応液を沸騰水浴中で20分間加熱して酵素を失活させた後、2M塩酸水溶液を加えてpH3.3に調整して遠心分離（3000g、60分間）を行った。得られた上清に1M水酸化カリウム水溶液を添加してpH5.4に調整後、超純水を加えて50mLに定容して茶葉タンパク質分解物の水溶液を得た。この茶葉タンパク質分解物の水溶液を後述するDPP-IV阻害活性の測定に用い、残りは凍結乾燥して茶葉タンパク質分解物1の粉末304.5mgを得た。
プロテアーゼの種類・添加量、反応pHを変更する以外は同じ操作を行い、各種プロテアーゼで処理した茶葉タンパク質分解物を計11種類調製した（プロテアーゼの種類・添加量、反応pHを表1に示す）。また、プロテアーゼ処理を実施しない以外は同じ操作を行い、茶葉タンパク質を82.4mg調製し、比較対照とした。 [Test Example 2] Preparation of tea leaf proteolysate treated with various proteases and DPP-IV inhibition rate (preparation of tea leaf proteolysate)
After adding 21 mL of 0.05M potassium hydroxide aqueous solution to 1.5 g of dry tea husk of green tea, the mixture was extracted by shaking at 50 ° C. for 3 hours to obtain an extract mixed with extraction residues. Add 2M hydrochloric acid aqueous solution to adjust the pH of the extract to 5.0, then add protease M "Amano" SD (Amano Enzyme) 12.0mg and [Sucrase X] (Mitsubishi Chemical Foods) 2.5mg The enzyme reaction was carried out at 50 ° C. for 4 hours to obtain an enzyme reaction solution. The enzyme reaction solution was heated in a boiling water bath for 20 minutes to inactivate the enzyme, and then 2M hydrochloric acid aqueous solution was added to adjust to pH 3.3, followed by centrifugation (3000 g, 60 minutes). A 1M aqueous potassium hydroxide solution was added to the resulting supernatant to adjust the pH to 5.4, and then ultrapure water was added to adjust the volume to 50 mL to obtain an aqueous solution of tea leaf protein degradation product. This aqueous solution of tea leaf protein degradation product was used for measurement of DPP-IV inhibitory activity described later, and the rest was freeze-dried to obtain 304.5 mg of tea leaf protein degradation product 1 powder.
The procedure was the same except that the protease type / addition amount and reaction pH were changed, and a total of 11 tea leaf proteolysates treated with various proteases were prepared (the protease type / addition amount and reaction pH are shown in Table 1). . In addition, the same operation was performed except that protease treatment was not performed, and 82.4 mg of tea leaf protein was prepared as a comparative control.

〔評価試験：DPP-IV阻害活性の測定〕
DPP-IV阻害活性の測定にはDPP(IV) Inhibitor Screening Assay Kit（item No. 700210、ケイマンケミカルカンパニー U.S.A）を用いた。
緩衝液：20mM Tris-HCl緩衝液（pH8.0、100mM NaClおよび1mM EDTAを含む）
酵素液：ヒト組換えDPP-IV（キット付属の酵素液を緩衝液で5倍希釈した）
基質液：0.2mMグリシルプロリン-4-メチルクマリル-7-アミド（AMC）
緩衝液30μL、酵素液10μLおよび茶葉タンパク質分解物または茶葉タンパク質の水溶液10μLを96ウェルプレートの各ウェルに入れた後、基質液50μLを加えた。DPP-IVによって遊離する7-アミノ-4-メチルクマリンの蛍光を37℃で30分間反応させながら、プレートリーダーCYTOFLUOR Series 4000（パーセプティブバイオシステムズ）を用い、5分間隔で測定した。励起波長は360nm、蛍光波長は460nmとした。
茶葉タンパク質分解物の水溶液の代わりに超純水10μLを加えた場合の蛍光を100とし、茶葉タンパク質分解物の水溶液を添加した場合の蛍光を100から差し引いた分をDPP-IV阻害率（%）とした。その結果を表１に示す。 [Evaluation test: Measurement of DPP-IV inhibitory activity]
DPP (IV) Inhibitor Screening Assay Kit (item No. 700210, Cayman Chemical Company USA) was used for measurement of DPP-IV inhibitory activity.
Buffer: 20 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0, containing 100 mM NaCl and 1 mM EDTA)
Enzyme solution: Human recombinant DPP-IV (The enzyme solution supplied with the kit was diluted 5-fold with buffer)
Substrate solution: 0.2 mM glycylproline-4-methylcoumaryl-7-amide (AMC)
30 μL of buffer solution, 10 μL of enzyme solution and 10 μL of tea leaf protein degradation product or tea leaf protein aqueous solution were placed in each well of a 96-well plate, and then 50 μL of substrate solution was added. The fluorescence of 7-amino-4-methylcoumarin liberated by DPP-IV was measured at a 5-minute interval using a plate reader CYTOFLUOR Series 4000 (Perceptive Biosystems) while reacting at 37 ° C. for 30 minutes. The excitation wavelength was 360 nm and the fluorescence wavelength was 460 nm.
DPP-IV inhibition rate (%) is the fluorescence when adding 10 μL of ultrapure water instead of the aqueous solution of tea leaf protein degradation product to 100 and subtracting the fluorescence when adding the aqueous solution of tea leaf protein degradation product from 100 It was. The results are shown in Table 1.

表１に示す結果の通り、プロテアーゼ処理を施していない茶葉タンパク質のDPP-IV阻害率18.2%に対し、各種プロテアーゼ処理を施した茶葉タンパク質分解物のDPP-IV阻害率は33.1〜67.3%と、茶葉タンパク質のプロテアーゼ処理によってDPP-IV阻害活性が顕著に向上していることが分かった。   As shown in Table 1, the DPP-IV inhibition rate of the tea leaf protein not treated with protease treatment was 18.2%, while the DPP-IV inhibition rate of the tea leaf protein degradation product treated with various proteases was 33.1 to 67.3%, It was found that DPP-IV inhibitory activity was significantly improved by protease treatment of tea leaf protein.

［試験例3］茶葉タンパク質分解物の調製
緑茶葉50gを95℃の水1.25kgを用いて1時間抽出を行い、再度同じ条件で抽出を行って水分を含む茶殻115gを得た。茶殻115gに0.05M水酸化カリウム水溶液を0.71kg加えた後、50℃で3時間撹拌抽出して抽出残渣が混在する抽出液を得た。4M塩酸水溶液を添加して抽出液のpHを7.0に調整し、サモアーゼC160 0.58gを加えて50℃で15時間酵素反応を行った。次に4M塩酸水溶液でpHを4.4に調整し、スミチームACP-G 0.50gを加えて50℃で1.5時間酵素反応を行って酵素反応液を得た。酵素反応液を90℃で10分間加熱して酵素を失活させた後、4M塩酸水溶液で酵素反応液のpHを3.3に調整し、珪藻土ろ過を行った。得られたろ液を濃縮し、2M水酸化カリウム水溶液を用いてpH5.4に調整した後凍結乾燥を行い、茶葉タンパク質分解物を8.86g得た。 [Test Example 3] Preparation of tea leaf proteolysate 50 g of green tea leaf was extracted with 1.25 kg of water at 95 ° C. for 1 hour, and extracted again under the same conditions to obtain 115 g of tea husk containing water. After adding 0.71 kg of 0.05M potassium hydroxide aqueous solution to 115 g of tea husk, the mixture was extracted with stirring at 50 ° C. for 3 hours to obtain an extract mixed with extraction residues. A 4M aqueous hydrochloric acid solution was added to adjust the pH of the extract to 7.0, 0.58 g of Samoa C160 was added, and the enzyme reaction was carried out at 50 ° C. for 15 hours. Next, the pH was adjusted to 4.4 with 4 M hydrochloric acid aqueous solution, 0.50 g of Sumiteam ACP-G was added, and the enzyme reaction was performed at 50 ° C. for 1.5 hours to obtain an enzyme reaction solution. The enzyme reaction solution was heated at 90 ° C. for 10 minutes to inactivate the enzyme, and then the pH of the enzyme reaction solution was adjusted to 3.3 with a 4M hydrochloric acid aqueous solution, followed by diatomaceous earth filtration. The obtained filtrate was concentrated, adjusted to pH 5.4 with 2M aqueous potassium hydroxide solution, and lyophilized to obtain 8.86 g of tea leaf protein degradation product.

［試験例4］茶葉タンパク質分解物の調製
緑茶葉50gを95℃の水1.25kgを用いて1時間抽出を行い、再度同じ条件で抽出を行って水分を含む茶殻115gを得た。茶殻115gに0.05M水酸化カリウム水溶液を0.71kg加えた後、50℃で3時間撹拌抽出して抽出残渣が混在する抽出液を得た。4M塩酸水溶液を添加して抽出液のpHを7.0に調整し、サモアーゼC160 0.58gとスクラーゼX（三菱化学フーズ株式会社製）0.083gを加えて50℃で15時間酵素反応を行った。次に4M塩酸水溶液でpHを4.4に調整し、スミチームACP-G 0.50gを加えて50℃で1.5時間酵素反応を行って酵素反応液を得た。酵素反応液を90℃で10分間加熱して酵素を失活させた後、4M塩酸水溶液で酵素反応液のpHを3.3に調整し、珪藻土ろ過を行った。得られたろ液を濃縮し、2M水酸化カリウム水溶液を用いてpH5.4に調整した後凍結乾燥を行い、茶葉タンパク質分解物12を11g得た。 Test Example 4 Preparation of Tea Leaf Proteolysate 50 g of green tea leaf was extracted with 1.25 kg of water at 95 ° C. for 1 hour, and extracted again under the same conditions to obtain 115 g of tea husk containing water. After adding 0.71 kg of 0.05M potassium hydroxide aqueous solution to 115 g of tea husk, the mixture was extracted with stirring at 50 ° C. for 3 hours to obtain an extract mixed with extraction residues. A 4M aqueous hydrochloric acid solution was added to adjust the pH of the extract to 7.0, 0.58 g of Samoa C160 and 0.083 g of Sucrase X (Mitsubishi Chemical Foods) were added, and the enzyme reaction was carried out at 50 ° C. for 15 hours. Next, the pH was adjusted to 4.4 with 4 M hydrochloric acid aqueous solution, 0.50 g of Sumiteam ACP-G was added, and the enzyme reaction was performed at 50 ° C. for 1.5 hours to obtain an enzyme reaction solution. The enzyme reaction solution was heated at 90 ° C. for 10 minutes to inactivate the enzyme, and then the pH of the enzyme reaction solution was adjusted to 3.3 with a 4M hydrochloric acid aqueous solution, followed by diatomaceous earth filtration. The obtained filtrate was concentrated, adjusted to pH 5.4 using 2M aqueous potassium hydroxide solution, and lyophilized to obtain 11 g of tea leaf protein degradation product 12.

［試験例５］茶葉タンパク質分解物の限外ろ過
試験例４で得た茶葉タンパク質分解物12（9.09g）を超純水180mLに溶解し、遠心式限外ろ過ユニットAmicon Ultra-15 3K（分画分子量3000、メルクミリポア）に15mLずついれ、遠心分離（3000g、60分間）を行った。得られた透過液を回収し、保持液側に超純水10mLを加えて遠心分離（3000×g、60分間）を行う操作を3回繰り返した。保持液と透過液を回収後、凍結乾燥を行い、分子量3000を超える画分（茶葉タンパク質分解物12-R）1.99gと分子量3000以下の画分（茶葉タンパク質分解物12-P）6.82gを得た。試験例２の方法により、DPP-IV阻害率を測定し、試験例９に従いIC50値を算出した。その結果、試験例４で得た茶葉タンパク質分解物のDPPIV阻害活性（IC50値）は579μg/ml、茶葉タンパク質分解物12-RのDPPIV阻害活性（IC50値）は542μg/ml、茶葉タンパク質分解物12-PのDPPIV阻害活性（IC50値）は519μg/mlであった。茶葉タンパク質分解物中における12-R、12-Pの画分の寄与率を以下の式で計算した。
12-Rの寄与率（％）＝[試験例４の茶葉タンパク質分解物のIC50（579μg/ml）/12-RのIC50（542μg/ml）]×試験例４記載の茶葉タンパク質分解物中の12-Rの含有量（21.9％）
12-Pの寄与率（％）＝[試験例４の茶葉タンパク質分解物のIC50（579μg/ml）/12-PのIC50（519μg/ml）]×試験例４記載の茶葉タンパク質分解物中の12-P含有量（75.0％）
その結果、12-Rの寄与率は23.4%、12-Pの寄与率は83.7%であった。この結果から、分子量3000以下の画分である12-Pが、茶葉タンパク質分解物中でのDPP-IV阻害活性に寄与していることが明らかになった。 [Test Example 5] Ultrafiltration of tea leaf protein degradation product The tea leaf protein degradation product 12 (9.09 g) obtained in Test Example 4 was dissolved in 180 mL of ultrapure water, and the centrifugal ultrafiltration unit Amicon Ultra-15 3K (min. 15 mL each in a molecular weight of 3000, Merck Millipore), and centrifuged (3000 g, 60 minutes). The obtained permeate was collected, and 10 mL of ultrapure water was added to the retentate side and centrifugation (3000 × g, 60 minutes) was repeated three times. After collecting the retentate and permeate, freeze-drying to obtain 1.99g of a fraction with a molecular weight of more than 3000 (tea leaf protein degradation product 12-R) and a fraction with a molecular weight of 3000 or less (tea leaf protein degradation product 12-P) 6.82g Obtained. The DPP-IV inhibition rate was measured by the method of Test Example 2, and the IC 50 value was calculated according to Test Example 9. Consequently, DPPIV inhibitory activity (IC 50 value) of the tea protein hydrolyzate obtained in Test Example 4 579μg / ml, DPPIV inhibitory activity (IC 50 value) of the tea protein hydrolyzate 12-R is 542μg / ml, tea protein The DPPIV inhibitory activity (IC 50 value) of the degradation product 12-P was 519 μg / ml. The contribution ratio of the 12-R and 12-P fractions in the tea leaf protein degradation product was calculated by the following formula.
12-R contribution rate (%) = [IC 50 of tea leaf protein degradation product of Test Example 4 (579 μg / ml) / 12-R IC 50 (542 μg / ml)] × tea leaf protein degradation product of Test Example 4 Content of 12-R (21.9%)
Contribution rate of 12-P (%) = [IC 50 of tea leaf protein degradation product of Test Example 4 (579 μg / ml) / 12-P IC 50 (519 μg / ml)] × Tea leaf protein degradation product of Test Example 4 12-P content (75.0%)
As a result, the contribution ratio of 12-R was 23.4%, and the contribution ratio of 12-P was 83.7%. From this result, it was clarified that 12-P, which is a fraction having a molecular weight of 3000 or less, contributes to DPP-IV inhibitory activity in the tea leaf proteolysate.

［試験例６］分子量3000以下の茶葉タンパク質分解物のゲルろ過
試験例５で得た茶葉タンパク質分解物12-P 300mgを超純水10mLに溶解し、10%エタノール水溶液で平衡化したSephadex G-15カラム（26mm×970mm、GEヘルスケア）により分画した。移動相：10%エタノール水溶液、流速：50mL/hr、検出：UV 230nm。送液開始から100分経過後、カラムからの溶出液をフラクションコレクターにより5分12秒毎に1フラクションずつ採集した（フラクション1〜100）。試験例２の方法により奇数フラクションのDPP-IV阻害率を測定した。ゲルろ過クロマトグラムとDPP-IV阻害率を図１に示す。 [Test Example 6] Gel filtration of tea leaf proteolysate having a molecular weight of 3000 or less Sephadex G--300 mg of tea leaf protein hydrolyzate 12-P obtained in Test Example 5 was dissolved in 10 mL of ultrapure water and equilibrated with 10% ethanol aqueous solution. Fractionation was performed using 15 columns (26 mm × 970 mm, GE Healthcare). Mobile phase: 10% aqueous ethanol, flow rate: 50 mL / hr, detection: UV 230 nm. After elapse of 100 minutes from the start of liquid feeding, the eluate from the column was collected by a fraction collector every 5 minutes and 12 seconds (fractions 1 to 100). The DPP-IV inhibition rate of the odd fraction was measured by the method of Test Example 2. The gel filtration chromatogram and DPP-IV inhibition rate are shown in FIG.

図１に示す結果の通り、フラクション43〜53の画分（茶葉タンパク質分解物12-P-1）とフラクション67〜72の画分（茶葉タンパク質分解物12-P-2）に高いDPP-IV阻害活性が認められた。この2つの画分を凍結乾燥して茶葉タンパク質分解物12-P-1を65.5mg、茶葉タンパク質分解物12-P-2を21.8mg得た。   As shown in FIG. 1, high DPP-IV in fractions 43-53 (tea leaf protein degradation product 12-P-1) and fractions 67-72 (tea leaf protein degradation product 12-P-2) Inhibitory activity was observed. These two fractions were freeze-dried to obtain 65.5 mg of tea leaf protein degradation product 12-P-1 and 21.8 mg of tea leaf protein degradation product 12-P-2.

〔試験例７〕分取HPLCによるゲルろ過画分中のペプチドの精製
試験例６記載のゲルろ過画分12-P-1、12-P-2をそれぞれ分取HPLCに供し、さらに精製を行った。分取HPLCの条件は以下の通りである。
HPLCシステム：PLC761 分取HPLCシステム、ＧＬサイエンス株式会社製
カラム：CAPCELLPAK MG 20i.d.×150mm、5μm、株式会社 資生堂社製
カラム温度：40℃
流速:15mL/分
移動相：(A) 水/MeCN/HCOOH=100/2/0.1(容量比)
(B) 水/MeCN/HCOOH=60/40/0.1(容量比)
グラジエントプログラム：0〜10分 B 0%、10〜30分 B 0〜100%、30.1〜40分 B 0%
検出器:UV270nmとした。
ピークが検出される測定開始3〜25分までの間を20個のフラクションに分けて回収した。各画分について、エバポレータで濃縮し、凍結乾燥に供した。収量を確認後、各画分を2mg/mlの濃度になるよう、5％メタノール水溶液で溶解し、上記記載の〔評価試験：DPP-IV阻害活性の測定〕に準じて試験を行い、活性の強さを評価した。また、DPP-IV阻害率を算出後に、収量から各画分のDPP-IV阻害活性貢献度(％)を算出した。各画分の2mg/mlの[DPP-IV阻害率（％）×収量（mg）]の値を算出し、フラクション1から20それぞれの[DPP-IV阻害率（％）×収量（mg）]の値の合計値に対する1つの画分の[DPP-IV阻害率（％）×収量（mg）]の値が占める割合をDPP-IV阻害活性貢献度とした。
各画分の2mg/mlのDP各画分におけるDPP-IV阻害活性貢献度を図２に示した。これらのHPLC画分をさらにLC-MS分析に供し、含有されるペプチドの同定を行った。LC-MS分析条件を以下に記す。 [Test Example 7] Purification of peptides in gel filtration fraction by preparative HPLC Gel filtration fractions 12-P-1 and 12-P-2 described in Test Example 6 were each subjected to preparative HPLC and further purified. It was. Preparative HPLC conditions are as follows.
HPLC system: PLC761 preparative HPLC system, manufactured by GL Sciences Inc.
Column: CAPCELLPAK MG 20i.d. × 150mm, 5μm, manufactured by Shiseido Co., Ltd. Column temperature: 40 ° C
Flow rate: 15 mL / min Mobile phase: (A) Water / MeCN / HCOOH = 100/2 / 0.1 (volume ratio)
(B) Water / MeCN / HCOOH = 60/40 / 0.1 (volume ratio)
Gradient program: 0 to 10 minutes B 0%, 10 to 30 minutes B 0 to 100%, 30.1 to 40 minutes B 0%
Detector: UV270nm.
The period from 3 to 25 minutes from the start of measurement at which a peak was detected was collected in 20 fractions. Each fraction was concentrated by an evaporator and subjected to lyophilization. After confirming the yield, each fraction was dissolved in a 5% aqueous methanol solution to a concentration of 2 mg / ml and tested according to the above-mentioned [Evaluation Test: Measurement of DPP-IV Inhibitory Activity]. Strength was evaluated. Further, after calculating the DPP-IV inhibition rate, the DPP-IV inhibitory activity contribution percentage (%) of each fraction was calculated from the yield. Calculate the value of [DPP-IV inhibition rate (%) x yield (mg)] of 2 mg / ml of each fraction, and fractions 1 to 20 for each [DPP-IV inhibition rate (%) x yield (mg)] The ratio of the value of [DPP-IV inhibition rate (%) × yield (mg)] of one fraction to the total value of the values was defined as the DPP-IV inhibitory activity contribution.
FIG. 2 shows the contribution of DPP-IV inhibitory activity to each fraction of DP at 2 mg / ml. These HPLC fractions were further subjected to LC-MS analysis, and the contained peptides were identified. The LC-MS analysis conditions are described below.

[試験例８］LC-MS分析
試験例７で得た茶葉タンパク質分解物12-P-1と12-P-2のHPLC画分をLC-MS分析に供した。LC-MS分析条件は以下の通りである。
HPLCシステム：Surveyor HPLCシステム（サーモフィッシャー）
カラム：Poroshell 120 EC-C18（2.1mm×75mm、粒子径2.7μm、アジレント）
カラム温度：40℃
流速：0.2mL/min
移動相：（A）水/MeCN/HCOOH=100/2/0.1(容量比)
（B）水/MeCN/HCOOH=50/50/0.1（容量比）
グラジエントプログラム：0〜3分 B 0%、3〜12分 B 0〜80%、12〜16分 B 80%、
16〜22分 B 0%
MSシステム：LCQ DECA XP PLUS（サーモフィッシャー）
イオン化：ESI
スプレー電圧：5kV
キャピラリー温度：350℃
ポラリティ：ポジティブ [Test Example 8] LC-MS analysis The HPLC fractions of tea leaf protein degradation products 12-P-1 and 12-P-2 obtained in Test Example 7 were subjected to LC-MS analysis. LC-MS analysis conditions are as follows.
HPLC system: Surveyor HPLC system (Thermo Fisher)
Column: Poroshell 120 EC-C18 (2.1mm x 75mm, particle size 2.7μm, Agilent)
Column temperature: 40 ° C
Flow rate: 0.2mL / min
Mobile phase: (A) Water / MeCN / HCOOH = 100/2 / 0.1 (volume ratio)
(B) Water / MeCN / HCOOH = 50/50 / 0.1 (volume ratio)
Gradient program: 0 to 3 minutes B 0%, 3 to 12 minutes B 0 to 80%, 12 to 16 minutes B 80%,
16-22 minutes B 0%
MS system: LCQ DECA XP PLUS (Thermo Fisher)
Ionization: ESI
Spray voltage: 5kV
Capillary temperature: 350 ° C
Polarity: Positive

LC-MS分析の結果、複数の画分でペプチドが確認された。このうち、茶葉タンパク質分解物12-P-1のHPLC画分からは以下のペプチドが検出された。フラクション4からはVal-Trp（VW）が検出された。フラクション5および6からAla-Trp（AW）が検出された。フラクション10からはHis-Asp-Tyr（HDY）が検出された。フラクション13からはIle-Pro（IP）、Ile-Trp(IW)、Ala-Asn-Leu（ANL）、Leu-Gly-Pro（LGP）が検出された。フラクション14からはIle-Pro（IP）、Val-Asp-Tyr（VDY）、 Leu-Gly-Pro（LGP）が検出された。フラクション15でVal-Ala-Tyr-Pro（VAYP）が検出された。
また、12-P-2のHPLC画分からは以下のペプチドが検出された。フラクション6でVal-Trp（VW）、Val-Asp-Tyr（VDY）、Thr-Gly-Tyr（TGY）、Leu-Tyr-Asn（LYN）が検出された。フラクション7でVal-Trp（VW）が検出された。フラクション9、10でLeu-Tyr（LY）、Ile-Tyr（IY）が検出された。
これらの検出されたペプチドのうち、ジペプチドは市販品（Bachem AG）を合成標準品とし、トリペプチドは株式会社医学生物学研究所に、またテトラペプチドは株式会社スクラムに合成を委託して作製させたものを合成標準品とした。これらの合成標準品を使用して、各フラクションで見られたペプチドと一致するか、LC-MSを用いて、多段階質量分析により、確認を行った。その結果、リテンションタイム、および4次までのプロダクトイオンのマススペクトルが合成標準品と全て一致し、これらのペプチドを同定した。 As a result of LC-MS analysis, peptides were confirmed in a plurality of fractions. Among these, the following peptides were detected from the HPLC fraction of tea leaf protein degradation product 12-P-1. From fraction 4, Val-Trp (VW) was detected. Ala-Trp (AW) was detected from fractions 5 and 6. From fraction 10, His-Asp-Tyr (HDY) was detected. From fraction 13, Ile-Pro (IP), Ile-Trp (IW), Ala-Asn-Leu (ANL), and Leu-Gly-Pro (LGP) were detected. From fraction 14, Ile-Pro (IP), Val-Asp-Tyr (VDY), and Leu-Gly-Pro (LGP) were detected. In fraction 15, Val-Ala-Tyr-Pro (VAYP) was detected.
The following peptides were detected from the HPLC fraction of 12-P-2. In fraction 6, Val-Trp (VW), Val-Asp-Tyr (VDY), Thr-Gly-Tyr (TGY), and Leu-Tyr-Asn (LYN) were detected. In fraction 7, Val-Trp (VW) was detected. In fractions 9 and 10, Leu-Tyr (LY) and Ile-Tyr (IY) were detected.
Among these detected peptides, dipeptides are produced by using commercially available products (Bachem AG) as synthesis standard, tripeptides are commissioned by the Institute of Medical Biology, and tetrapeptides are commissioned by Scrum Corporation. Was used as a synthetic standard. Using these synthetic standards, it was confirmed by multi-stage mass spectrometry using LC-MS whether they were consistent with the peptides found in each fraction. As a result, the retention time and the mass spectrum of product ions up to the fourth order all coincided with the synthetic standard, and these peptides were identified.

〔試験例９〕含有ペプチドのIC50値算出
次に茶葉タンパク質分解物中に存在することが確認されたペプチドについてDPP-IVの阻害活性を評価した。評価対象は表２に記載のペプチドとし、試験例８の各合成標準品を使用して、DPP-IV阻害活性を調べた。評価方法は上記記載の〔評価試験：DPP-IV阻害活性の測定〕に準じて行った。各ペプチドのDPP-IV阻害活性の強さを比較するため、DPP-IV阻害活性におけるIC50値（50%阻害濃度）を調べた。この値が低いものほど阻害活性が高く、少量で効率的にDPP-IV活性を阻害する評価基準となる。具体的には、各ペプチドをそれぞれ秤量し、2％アセトニトリル水溶液で溶解後、同溶液で段階的に5段階の濃度に希釈した。それぞれのサンプルについてDPP-IV阻害活性を確認した。濃度を横軸、阻害率を縦軸として、各濃度における阻害率をグラフ化して近似曲線を作成した。近似曲線から阻害率50％の時の濃度を算出し、IC50値とした。
各ペプチドのIC50値を表２に記す。 [Test Example 9] Calculation of IC 50 value of contained peptide Next, the inhibitory activity of DPP-IV was evaluated for peptides confirmed to be present in the tea leaf protein degradation product. The evaluation target was the peptides shown in Table 2, and the DPP-IV inhibitory activity was examined using each of the synthetic standards of Test Example 8. The evaluation method was performed according to the above-mentioned [Evaluation test: measurement of DPP-IV inhibitory activity]. In order to compare the strength of DPP-IV inhibitory activity of each peptide, the IC 50 value (50% inhibitory concentration) in DPP-IV inhibitory activity was examined. The lower the value, the higher the inhibitory activity, and it becomes an evaluation standard for efficiently inhibiting DPP-IV activity in a small amount. Specifically, each peptide was weighed and dissolved in a 2% acetonitrile aqueous solution, and then diluted stepwise with the same solution to 5 concentrations. DPP-IV inhibitory activity was confirmed for each sample. An approximate curve was created by graphing the inhibition rate at each concentration with the horizontal axis representing the concentration and the vertical axis representing the inhibition rate. The concentration at an inhibition rate of 50% was calculated from the approximate curve and used as the IC 50 value.
The IC 50 values for each peptide are listed in Table 2.

各ペプチドのIC50値を算出したところ、Val-Ala-Tyr-Pro（VAYP）で最も強いDPP-IV阻害活性があることが見出された。また、Val-Ala-Tyr-Pro（VAYP）をScifinder(化学関連情報検索サイト)で検索したところ、今までに報告のない新規ペプチドであることが確認できた。
また、His-Asp-Tyr(HDY)、Leu-Tyr-Asn(LYN)も同様にScifinderで検索したところ、新規ペプチドであることが確認できた。 When the IC 50 value of each peptide was calculated, it was found that Val-Ala-Tyr-Pro (VAYP) had the strongest DPP-IV inhibitory activity. Moreover, when Val-Ala-Tyr-Pro (VAYP) was searched with Scifinder (Chemical-related information search site), it was confirmed that it was a novel peptide that has not been reported so far.
Further, His-Asp-Tyr (HDY) and Leu-Tyr-Asn (LYN) were also similarly searched with Scifinder, and confirmed to be novel peptides.

〔試験例１０〕茶葉タンパク質分解物中のDPP-IV阻害活性ペプチドの定量分析
試験例９でDPP-IV阻害活性を有することが見出されたペプチドについて、試験例５で得られた分子量3000以下の茶葉タンパク質分解物画分中の含有量を調べた。尚、試験例８の合成標準品をスタンダードとして使用した。結果を表3に記す。定量分析のためのLC-MS分析条件は以下の通りである。
分析機器： AgilentHPLCシステム（アジレント）
カラム：Poroshell 120 EC-C18（2.1mm×75mm、粒子径2.7μm、アジレント）
カラム温度：40℃
流速：0.2mL/min
移動相：（A）水/MeCN/HCOOH=100/2/0.1(容量比)
（B）水/MeCN/HCOOH=50/50/0.1（容量比）
グラジエントプログラム：0〜3分 B 0%、3〜12分 B 0〜80%、12〜16分 B 80%、
16〜22分 B 0%
MSシステム：3200QTRAP（ABSCIEX）
Ion Spray Voltage(IS)：5500.0
Temperature (TEM)：550
Curtain Gas (CUR)：10
Collision Gas (CAD): 3
スキャンモード：MRM(Multiple Reaction Monitoring) (各ペプチドのMRM設定を表に記した) [Test Example 10] Quantitative Analysis of DPP-IV Inhibitory Activity Peptides in Tea Leaf Proteolysate For the peptides found to have DPP-IV inhibitory activity in Test Example 9, the molecular weight of 3000 or less obtained in Test Example 5 The content in the tea leaf proteolysate fraction was examined. The synthetic standard product of Test Example 8 was used as a standard. The results are shown in Table 3. LC-MS analysis conditions for quantitative analysis are as follows.
Analytical instrument: Agilent HPLC system (Agilent)
Column: Poroshell 120 EC-C18 (2.1mm x 75mm, particle size 2.7μm, Agilent)
Column temperature: 40 ° C
Flow rate: 0.2mL / min
Mobile phase: (A) Water / MeCN / HCOOH = 100/2 / 0.1 (volume ratio)
(B) Water / MeCN / HCOOH = 50/50 / 0.1 (volume ratio)
Gradient program: 0 to 3 minutes B 0%, 3 to 12 minutes B 0 to 80%, 12 to 16 minutes B 80%,
16-22 minutes B 0%
MS system: 3200QTRAP (ABSCIEX)
Ion Spray Voltage (IS): 5500.0
Temperature (TEM): 550
Curtain Gas (CUR): 10
Collision Gas (CAD): 3
Scan mode: MRM (Multiple Reaction Monitoring) (MRM settings for each peptide are listed in the table)

表３に記載したペプチドの合成標準品を約1mg/mlになるように2％アセトニトリル水溶液で溶解した。このペプチド溶液を1mlずつ試験管に入れ、さらに3mlの2％アセトニトリル水溶液を足して、合計10mlのペプチドスタンダート溶液を調整した。このペプチドスタンダート溶液を2％アセトニトリル水溶液で段階的に希釈し、スタンダートを調整した。茶葉タンパク分解物は5ml容量のメスフラスコに30mg程度計り取り、2％アセトニトリル水溶液で溶解した。0.45μmのフィルター(HP045AN;アドバンテック株式会社製)でろ過をしてから、上記のLC-MS分析に供した。測定終了後にまず各ペプチドスタンダードの検量線を作成した。横軸に各ペプチドスタンダートの濃度、縦軸に各ペプチドの検出されたMRM面積値とし、検量線を作成した。茶葉タンパク質分解物中に検出されたペプチド含量をこの検量線より算出した。 Peptide synthesis standards listed in Table 3 were dissolved in a 2% aqueous acetonitrile solution at about 1 mg / ml. Each 1 ml of this peptide solution was placed in a test tube, and 3 ml of 2% acetonitrile aqueous solution was added to prepare a total of 10 ml of peptide standard solution. This peptide standard solution was diluted stepwise with 2% aqueous acetonitrile to prepare a standard. About 30 mg of tea leaf proteolysate was weighed into a 5 ml volumetric flask and dissolved in 2% acetonitrile aqueous solution. The solution was filtered through a 0.45 μm filter (HP045AN; manufactured by Advantech Co., Ltd.) and then subjected to the above LC-MS analysis. After completion of the measurement, first, a calibration curve for each peptide standard was prepared. A calibration curve was prepared with the horizontal axis representing the concentration of each peptide standard and the vertical axis representing the detected MRM area value of each peptide. The peptide content detected in the tea leaf protein degradation product was calculated from this calibration curve.

定量分析の結果、表４に示したぺプチドが試験例5で得た分子量3000以下の茶葉タンパク質分解物中に含まれることを確認した。次に各ペプチドの茶葉タンパク質分解物中におけるDPP-IV阻害活性への関与を調べるために含量から寄与率を算出した。寄与率の算出方法は、以下の通りである。
寄与率（％）＝（分子量3000以下の茶葉タンパク質分解物のIC50 / 各ペプチドのIC50）×分子量3000以下の茶葉タンパク質分解物中の各ペプチド含有量（％）
尚、上記式の分子量3000以下の茶葉タンパク質分解物のIC50は、試験例５より、519 μg/mlであること。また各ペプチドとは、表４に記載の単体のペプチドであり、寄与率（％）は、式中の各ペプチドのIC50、分子量3000以下の茶葉タンパク質分解物中の各ペプチド含有量（％）は同じペプチドの値より算出した。各ペプチドのIC50は表２の値を使用した。
各ペプチドの試験例5で得た分子量3000以下の茶葉タンパク質分解物中の含有量（％）とDPP-IV阻害活性の寄与率（％）を表4に記す。
各ペプチドのうち茶葉タンパク質分解物中に多く含まれているのはTGY、IP、LGPであり、茶葉タンパク質分解物のDPP-IV阻害活性への寄与率が高いのはIP、VAYP、LGPであることが確認された。 As a result of quantitative analysis, it was confirmed that the peptides shown in Table 4 were contained in the tea leaf protein degradation product having a molecular weight of 3000 or less obtained in Test Example 5. Next, in order to investigate the involvement of each peptide in DPP-IV inhibitory activity in the tea leaf proteolysate, the contribution rate was calculated from the content. The calculation method of the contribution rate is as follows.
Contribution rate (%) = each peptide content (molecular weight of 3,000 or less tea leaf IC 50 / IC 50 of each peptide of a protein hydrolyzate) × molecular weight of 3,000 or less tea leaf protein hydrolyzate in (%)
The IC 50 of the tea leaf protein degradation product having a molecular weight of 3000 or less in the above formula is 519 μg / ml from Test Example 5. Each peptide is a single peptide shown in Table 4, and the contribution ratio (%) is the content (%) of each peptide in the tea leaf proteolysate having an IC 50 and a molecular weight of 3000 or less. Was calculated from the value of the same peptide. The IC 50 of each peptide used the values in Table 2.
Table 4 shows the content (%) in the tea leaf protein degradation product having a molecular weight of 3000 or less obtained in Test Example 5 for each peptide and the contribution rate (%) of DPP-IV inhibitory activity.
Among the peptides, TGY, IP, and LGP contain a large amount in the tea leaf proteolysate, and IP, VAYP, and LGP contribute to the DPP-IV inhibitory activity of tea leaf proteolysate. It was confirmed.

〔試験例１１〕飲料中のDPP-IV阻害活性ペプチドの定量分析
定量分析の条件は試験例１０記載の方法に準じて行った。飲料100mlをメスシリンダーで計り取り、エバポレーターで濃縮乾固させた。少量の2％アセトニトリル水溶液で洗い込みながら、全量を5ml容量のメスフラスコに移し、2％アセトニトリル水溶液でメスアップした。フィルター(HP045AN;アドバンテック株式会社製)でろ過をした後に試験例１０記載の定量方法で分析を行った。 [Test Example 11] Quantitative Analysis of DPP-IV Inhibitory Activity Peptides in Beverages The conditions for quantitative analysis were the same as those described in Test Example 10. 100 ml of the beverage was weighed with a graduated cylinder and concentrated to dryness with an evaporator. While rinsing with a small amount of 2% acetonitrile aqueous solution, the whole amount was transferred to a 5 ml volumetric flask and diluted with 2% acetonitrile aqueous solution. After filtration through a filter (HP045AN; manufactured by Advantech Co., Ltd.), analysis was performed by the quantitative method described in Test Example 10.

合成法によるペプチドの合成を下記に示す。
アプライドバイオシステムズ社のペプチド自動合成機（ABI433Aモデル）を使用し、Fmoc法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）によりペプチド鎖を延長し目的の保護ペプチド樹脂の合成をおこなった。 The synthesis of the peptide by the synthesis method is shown below.
Using an automated peptide synthesizer (ABI433A model) from Applied Biosystems, the peptide chain was extended by the Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method) to synthesize the desired protected peptide resin.

樹脂上へのペプチドの構築が終了した後、保護ペプチド樹脂を乾燥した。得られた保護ペプチドの脱保護基とペプチドの樹脂担体からの切り離しはトリフルオロ酢酸（trifluoroacetic acid (TFA)） cocktail solution (4.125mL TFA, 0.25mL H2O, 0.375g フェノール（phenol）, 0.125 mL エタンジチオール（ethanedithiol）, 0.25mL チオアニソール（thioanisole）, 120 min) によって行った。得られた粗ペプチドは精製水に溶解し、0.45μmのフィルター (HP045AN;アドバンテック株式会社製) で濾過し、得られた粗ペプチドを高速液体クロマトグラフィーに供し精製を行い、目的のペプチドを得た。
カラム：SunFireC18OBD (30 i.d.×250 mm, 5μm, Waters社製)
移動相：Buffer A：H2O, 0.1% TFA（0.1体積％TFA水溶液）
Buffer B：Acetonitrile, 0.1% TFA（0.1体積％TFAアセトニトリル溶液）
勾 配：0〜10分：0% Buffer B, 10〜90分：0〜40% Buffer B
流 速：20 mL / min
検 出：UV 220 nm After the construction of the peptide on the resin was completed, the protected peptide resin was dried. Deprotection of the resulting protected peptide and the peptide from the resin carrier is trifluoroacetic acid (TFA) cocktail solution (4.125mL TFA, 0.25mL H 2 O, 0.375g phenol, 0.125 mL Ethanedithiol, 0.25 mL thioanisole, 120 min). The obtained crude peptide was dissolved in purified water, filtered through a 0.45 μm filter (HP045AN; manufactured by Advantech Co., Ltd.), and the obtained crude peptide was subjected to purification by high performance liquid chromatography to obtain the desired peptide. .
Column: SunFireC18OBD (30 id × 250 mm, 5μm, Waters)
Mobile phase: Buffer A: H 2 O, 0.1% TFA (0.1 vol% TFA aqueous solution)
Buffer B: Acetonitrile, 0.1% TFA (0.1 vol% TFA acetonitrile solution)
Gradient: 0 to 10 minutes: 0% Buffer B, 10 to 90 minutes: 0 to 40% Buffer B
Flow rate: 20 mL / min
Detection: UV 220 nm

精製ペプチドの純度はODSカラムを用いた高速液体クロマトグラフィーで測定した。
カラム：SunFireC18 (4.6 i.d.×150 mm, 5 μm, Waters社製)
移動相：Buffer A：H2O, 0.1% TFA（0.1体積％TFA水溶液）
Buffer B：Acetonitrile, 0.1% TFA（0.1体積％TFAアセトニトリル溶液）
勾 配：0〜20分：5〜40% Buffer B
流 速：1 mL / min
検 出：UV 220 nm The purity of the purified peptide was measured by high performance liquid chromatography using an ODS column.
Column: SunFireC18 (4.6 id × 150 mm, 5 μm, Waters)
Mobile phase: Buffer A: H 2 O, 0.1% TFA (0.1 vol% TFA aqueous solution)
Buffer B: Acetonitrile, 0.1% TFA (0.1 vol% TFA acetonitrile solution)
Gradient: 0-20 minutes: 5-40% Buffer B
Flow rate: 1 mL / min
Detection: UV 220 nm

Val-Ala-Tyr-Pro（VAYP）の合成
出発アミノ酸担体はH-Pro-Trt-Resin樹脂を使用し、アミノ酸誘導体Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Val-OHを用いてペプチド鎖を伸長した。上記の方法で精製を行い、Val-Ala-Tyr-Proの精製物を得た。上記の方法で精製物の純度を測定した結果、100.0%であった。 Synthesis of Val-Ala-Tyr-Pro (VAYP) The starting amino acid carrier uses H-Pro-Trt-Resin resin, and amino acid derivatives Fmoc-Tyr (tBu) -OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Val-OH Was used to extend the peptide chain. Purification was performed by the above method to obtain a purified product of Val-Ala-Tyr-Pro. As a result of measuring the purity of the purified product by the above method, it was 100.0%.

His-Asp-Tyr（HDY）の合成
出発アミノ酸担体はH-Tyr(tBu)-Trt-Resin樹脂を使用し、アミノ酸誘導体Fmoc-Asp-OH, Fmoc-His(Trt)-OHを用いてペプチド鎖を伸長した。上記の方法で精製を行い、His-Asp-Tyrの精製物を得た。上記の方法で精製物の純度を測定した結果、99.8%であった。 Synthesis of His-Asp-Tyr (HDY) The starting amino acid carrier is H-Tyr (tBu) -Trt-Resin resin, and the amino acid derivatives Fmoc-Asp-OH and Fmoc-His (Trt) -OH are used as peptide chains. Stretched. Purification was performed by the above method to obtain a purified product of His-Asp-Tyr. As a result of measuring the purity of the purified product by the above method, it was 99.8%.

Leu-Tyr-Asn（LYN）の合成
出発アミノ酸担体はH-Asn(Trt)-Trt-Resin樹脂を使用し、アミノ酸誘導体Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OHを用いてペプチド鎖を伸長した。上記の方法で精製を行い、Leu-Tyr-Asnの精製物を得た。上記の方法で精製物の純度を測定した結果、99.3%であった。 Synthesis of Leu-Tyr-Asn (LYN) The starting amino acid carrier is H-Asn (Trt) -Trt-Resin resin, and amino acid derivatives Fmoc-Tyr (tBu) -OH, Fmoc-Leu-OH are used as peptide chains. Stretched. Purification was performed by the above method to obtain a purified product of Leu-Tyr-Asn. As a result of measuring the purity of the purified product by the above method, it was 99.3%.

製造例1：烏龍茶飲料
烏龍茶葉（色種）30ｇを70℃のイオン交換水900ｇで5分間抽出し、続いて濾紙（No.2、アドバンテック株式会社製）で濾過することにより茶葉を除去して、820gの烏龍茶抽出液（pH5.5、Brix 0.9 °、タンニン濃度250mg/100mL）を得た。この烏龍茶抽出液を30℃ 以下まで冷却し、飲用濃度（タンニン濃度50mg/100mL）となるようにイオン交換水で希釈し、L-アスコルビン酸(30mg/100mL)と本発明のペプチド(VAYP)を飲用濃度50mg/100mLとなるよう添加した。これに炭酸水素ナトリウムを添加してpH6に調製した烏龍茶調合液を得た。これを容器に充填し、レトルト殺菌処理（121℃、7分間）を行って、烏龍茶飲料を得た。 Production example 1: Oolong tea beverage Oolong tea leaves (color type) 30g was extracted with 900g of ion-exchanged water at 70 ° C for 5 minutes, and then filtered through filter paper (No.2, manufactured by Advantech Co., Ltd.) to remove the tea leaves. 820 g of oolong tea extract (pH 5.5, Brix 0.9 °, tannin concentration 250 mg / 100 mL) was obtained. This oolong tea extract is cooled to 30 ° C or less, diluted with ion-exchanged water to a drinking concentration (tannin concentration 50 mg / 100 mL), and L-ascorbic acid (30 mg / 100 mL) and the peptide of the present invention (VAYP) are added. Added to a drinking concentration of 50 mg / 100 mL. To this was added oolong tea preparation solution adjusted to pH 6 by adding sodium bicarbonate. This was filled in a container and subjected to retort sterilization treatment (121 ° C., 7 minutes) to obtain oolong tea beverage.

製造例２：紅茶飲料
紅茶葉（ディンブラ）30ｇを70℃のイオン交換水900ｇで5分間抽出し、続いて濾紙（No.2、アドバンテック社製）で濾過することにより茶葉を除去して、780gの紅茶抽出液（pH5.0、Brix 1.0 °、タンニン濃度300mg/100mL）を得た。この紅茶抽出液を30℃ 以下まで冷却し、飲用濃度（タンニン濃度60mg/100mL）となるようにイオン交換水で希釈し、L-アスコルビン酸（30mg/100mL）と本発明のペプチド(VAYP)を飲用濃度50mg/100mLとなるよう添加した。これに炭酸水素ナトリウムを溶解してpH6に調製した紅茶調合液を得た。殺菌方法はＵＨＴ殺菌（１３５℃、３０秒）を行い、ＰＥＴボトルに充填し、紅茶飲料を得た。 Production Example 2: 30 g of tea beverage black tea leaf (dimbra) is extracted with 900 g of ion-exchanged water at 70 ° C. for 5 minutes, followed by filtration with filter paper (No. 2, manufactured by Advantech) to remove tea leaf, 780 g Of black tea (pH 5.0, Brix 1.0 °, tannin concentration 300 mg / 100 mL) was obtained. This black tea extract is cooled to 30 ° C. or less, diluted with ion-exchanged water so as to have a drinking concentration (tannin concentration 60 mg / 100 mL), and L-ascorbic acid (30 mg / 100 mL) and the peptide (VAYP) of the present invention are added. Added to a drinking concentration of 50 mg / 100 mL. This was dissolved in sodium bicarbonate to obtain a black tea preparation prepared to pH 6. As a sterilization method, UHT sterilization (135 ° C., 30 seconds) was performed and filled in a PET bottle to obtain a tea beverage.

製造例３：錠剤
以下の配合になるように各原料を混合した。
１．VAYP ３５．０重量％
２．結晶セルロース ３０．０重量％
３．乳糖 ２０．０重量％
４．澱粉分解物 １０．０重量％
５．グリセリン脂肪酸エステル ５．０重量％
混合して得られた粉末を１錠あたり0.35gとなるように打錠成型することにより、VAYPを含有する錠剤を得た。 Production Example 3: Each raw material was mixed so as to have a formulation of tablets or less.
1. VAYP 35.0% by weight
2. Crystalline cellulose 30.0% by weight
3. Lactose 20.0% by weight
4). Starch degradation product 10.0% by weight
5. Glycerin fatty acid ester 5.0% by weight
Tablets containing VAYP were obtained by tableting the powder obtained by mixing to 0.35 g per tablet.

製造例４：粉末緑茶飲料
以下の配合になるように各原料を混合し、本発明のVAYPを含有する粉末緑茶飲料を調製した。
１．デキストリン ６０．０重量％
２．緑茶エキスパウダー ２６．０重量％
３．VAYP １０．０重量％
４．ビタミンＣ ４．０重量％ Production Example 4: Powdered green tea beverage Each raw material was mixed so as to have the following composition to prepare a powdered green tea beverage containing VAYP of the present invention.
1. Dextrin 60.0% by weight
2. Green tea extract powder 26.0% by weight
3. VAYP 10.0% by weight
4). Vitamin C 4.0% by weight

製造例５：食品素材
以下の配合になるように各原料を混合し、茶葉タンパク質分解物（分子量3000以下）を含有する食品素材を調製した。なお、茶葉タンパク質分解物は試験例５で調製したタンパク質分解物を使用した。
１．茶葉タンパク質分解物（分子量3000以下） ８０．０重量％
２．デキストリン １５．０重量％
３．シクロデキストリン ５．０重量％ Production Example 5: Food material Each raw material was mixed so as to have the following composition to prepare a food material containing tea leaf protein degradation product (molecular weight 3000 or less). The tea leaf protein degradation product used was the protein degradation product prepared in Test Example 5.
1. Tea leaf protein degradation product (molecular weight 3000 or less) 80.0% by weight
2. Dextrin 15.0% by weight
3. Cyclodextrin 5.0% by weight

本発明のDPP-IV阻害剤、血糖値上昇抑制剤、抗糖尿病剤は、糖尿病予防・治療剤として使用できる。また、安全性が高い本発明のDPP-IV阻害剤、血糖値上昇抑制剤、抗糖尿病剤を飲食品中に配合することで、血糖値上昇抑制作用を有する飲食品を開発することができる。また、抽出残渣である茶殻を利用して本発明のDPP-IV阻害剤、血糖値上昇抑制剤、抗糖尿病剤を製造することで、未利用資源の有効活用ともなる。   The DPP-IV inhibitor, the blood sugar level increase inhibitor, and the antidiabetic agent of the present invention can be used as a diabetes preventive / therapeutic agent. Moreover, the food / beverage products which have the blood glucose level raise inhibitory effect can be developed by mix | blending the DPP-IV inhibitor of this invention with high safety | security, a blood glucose level rise inhibitor, and an antidiabetic agent in food / beverage products. Further, by using the tea leaves that are the extraction residue to produce the DPP-IV inhibitor, the blood sugar level increase inhibitor, and the antidiabetic agent of the present invention, it is possible to effectively utilize unused resources.

Claims (8)

茶葉タンパク質分解物を有効成分とするジペプチジルペプチダーゼ（DPP）-IV阻害剤であって、前記茶葉タンパク質分解物に、Leu-Tyr及びIle-Proの配列からなるペプチドの1種または2種を含有するDPP-IV阻害剤（但し、茶葉タンパク質分解物中の環状ジペプチドを除く）。 A dipeptidyl peptidase (DPP) -IV inhibitor containing tea leaf proteolysate as an active ingredient, the tea leaf proteolysate containing one or two of the peptides consisting of sequences of Leu-Tyr and Ile-Pro DPP-IV inhibitors (except for cyclic dipeptides in tea leaf protein degradation products). 茶葉タンパク質分解物から得られるVal-Ala-Tyr-Proを有効成分とするDPP-IV阻害剤。 A DPP-IV inhibitor containing Val-Ala-Tyr-Pro obtained from tea leaf protein degradation product as an active ingredient . Val-Ala-Tyr-Pro、Thr-Gly-Tyr、His-Asp-Tyr及びLeu-Tyr-Asnの配列からなるペプチドの1種または2種以上を有効成分とするDPP-IV阻害剤。 Val-Ala-Tyr-Pr o , Thr-Gly-Tyr, His-Asp-Ty r 及 beauty Leu-Tyr-Asn 1 or peptides consisting of the sequences or DPP-IV inhibitor containing as an active ingredient of two or more . 請求項1乃至３に記載の剤を有効成分として含有するDPP-IV阻害用である飲食品。 Claims 1 to a DPP-IV for inhibition which comprises, as an active ingredient food products the agent described in 3. 請求項１乃至３に記載の剤を有効成分として含有するDPP-IV阻害用であるサプリメント。 The supplement for DPP-IV inhibition containing the agent of Claim 1 thru | or 3 as an active ingredient. 請求項１乃至３に記載の剤を有効成分として含有するDPP-IV阻害用である医薬品および/または医薬部外品。 Claims 1 to pharmaceuticals and / or a quasi-drug is a DPP-IV for inhibition which comprises, as an active ingredient the agent according to 3. Val-Ala-Tyr-Proの配列からなる新規テトラペプチド、及びHis-Asp-Tyr又はLeu-Tyr-Asnの配列からなる新規トリペプチド。   A novel tetrapeptide comprising the sequence of Val-Ala-Tyr-Pro and a novel tripeptide comprising the sequence of His-Asp-Tyr or Leu-Tyr-Asn. 請求項７に記載のペプチドの１種または2種以上を含有する飲食品。 Food-drinks containing the 1 type (s) or 2 or more types of the peptide of Claim 7 .
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