JP6368780B2 - 分子の結合現象を検出する方法および配置 - Google Patents
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Description
本発明は、特に、ハイスループット用途に適した分子の結合現象を検出する方法および配置に関する。
生体分子間の結合現象および相互作用の知識および理解は、生物学、薬学および医学研究の仕事の必須分野となる。そのため、そこから得られた知識を用いて治療法または薬物を開発することができるようにするために、想定される結合パートナーを突き止め、そのシグナル経路を特徴付けることが目的となる。薬学的に関連のある活性物質は、例えば、ライブラリにカタログ化されている多数の分子または構造を、その結合特性について互いにまたは既知のターゲット構造に対して試験するスクリーニング法を用いて発見される。したがって、多数のカタログ化された構造から、例えば、病原性タンパク質に結合し、結果としてこれを阻害する構造を決定することができる。このような構造を検出する場合、通常は調査する既知のターゲット構造（ターゲット）を、バイオチップの表面に固定相として共有結合させ、次いで、固定されたターゲットを、移動相、即ち多数の想定される結合構造（分子または分子の一部）が含まれた液体に流して接触させる。この接触中、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）または水晶発振子マイクロバランス（ＱＣＭ）に基づく方法によって、固定されたターゲットと可動性構造（分子または分子の一部）との間の会合および解離を測定することができる。
その際には、当然、想定される結合パートナーの膨大な数を考慮し、許容時間内に想定される結合の組み合わせを扱うことができるハイスループット法を適用する必要がある。特に、物質ライブラリは一定速度で増加するため、より高いスループット率を達成することが求められる。しかしながら、基質またはバイオチップ側に対するターゲットの共有結合のため、固定されたターゲットの引き離しを達成することは、極限条件下でのみ可能である。そのため、困難な方法で、試験対象である各ターゲット用のバイオチップを再度調製することが必要となる。特に、ハイスループットによって複数のターゲットのスクリーニングを実施する場合、このようなバイオチップはあまり適当ではない。
ここで、ビオチンとストレプトアビジンとの間の結合を用いてバイオチップを再生する方法が知られている。それに関しては、ストレプトアビジンをバイオチップの表面に共有結合させ、続くステップにおいて、ビオチン化リガンドが固定されたストレプトアビジンに結合し、固定相を形成する。固定相に固定されるので、リガンドの結合特性について試験することができる。しかしながら、共有化学結合の結合強度に等しいビオチンとストレプトアビジンの高い結合親和性のために、共有結合したストレプトアビジンからビオチン化リガンドを解離するには、極限条件（例えば、高温）が必要となる。原理的には、ビオチン化リガンドによって形成された固定相の引き離しは可能であるが、極限条件によってストレプトアビジン分子の部分的または完全な変性がもたらされ、その結果、これらのストレプトアビジン分子に対しては、ビオチン化リガンドのさらなる固定化が不可能、または結合強度が弱くなってしまう。
したがって、本発明は、リガンドの可逆的固定化の可能性を示すことを目的とする。
本発明において、上記目的は、請求項１に記載の方法および請求項９に記載の配置によって達成される。
本発明の有利な実施形態は、従属請求項から導き出すことができる。
本方法は、請求項１に記載の特徴を備える。生理活性表面上の分子の結合現象を検出する本発明に係る方法の場合、第１のステップ（Ｉ）において、共有結合によって生理活性表面上に固定された少なくとも１個の第１の分子に、少なくとも１個の特異的非共有結合の形態で、少なくとも１個の第２の分子を結合する。
第２の分子を、さらなる第３または第４の分子と結合／カップリングすることができるように機能化（機能化）することができる。次いで、ターゲット構造（すなわち、分析物）を含む移動相と接触させることによって［ステップ（Ｉｉ）］、固定された第２、第３または第４の分子と可動性ターゲット構造（分析物）との間で運動実験（会合および解離）を実施することができる。
さらなるステップ（ＩＩ）で、緩衝液を供給することによって、当該少なくとも１個の特異的非共有結合を再度破壊する。ここで、特異的非共有結合を破壊することは、第１の分子からの第２の分子の解離と理解することができ、共有結合した第１の分子は生理活性表面に残り、生理活性表面上に結合していた全ての分子を含む第２の分子は表面から除去される。さらに、同じ第２および／または第３の機能化分子および分析物、あるいは他の第２および／または第３の機能化分子および分析物に対してステップ（Ｉ）およびステップ（ＩＩ）を少なくとももう１回繰り返すことができる。
ここで、生理活性表面とは、その材料特性に適する表面ならびに／あるいは、少なくとも第１の分子をその上に固定化することができるように化学修飾によって機能化される、または機能化され得る表面、と理解されるべきである。
そのため、生理活性表面は異なる幾何学的形状に構成することもできる。したがって、例えば、生理活性表面をこの目的のために用意されたバイオセンサチップ上もしくはバイオアッセイに構成することができる、または生理活性表面がナノ粒子もしくはビーズ上に構成される場合には球形に構成することもできる。そのため、生理活性表面を異なる種類の幾何学的構造の表面上に構成することができる。
ステップ（Ｉ）および（ＩＩ）の間、生理活性表面は常に緩衝液（ランニングバッファ）で覆われるものであっても良い。ステップ（Ｉ）においては、特に結合させる分子にとって結合に有利な媒体を有する結合緩衝液を使用することができる。
少なくとも１個の第１の分子と少なくとも１個の第２の分子との間で形成された特異的非共有結合を破壊するために、生理活性表面を、ステップ（ＩＩ）で、特異的非共有結合を破壊するのに適した少なくとも１個の分子を有する緩衝液と接触させられる。ここで、前記分子は、第２の分子と特異的に結合するものであって、第２の分子に対する解離定数ＫＤ（Ｉ）が、第１の分子の有する第２の分子に対する解離定数ＫＤ（ＩＩ）よりも小さい。
破壊のために供給された分子の有する第２の分子に対する解離定数ＫＤ（Ｉ）を、第１の分子の有する第２の分子に対する解離定数ＫＤ（ＩＩ）よりも小さくすることにより、破壊のために供給された分子の第２の分子に対する結合親和性が、第１の分子の第２の分子に対する結合親和性よりも高くなるため、当該供給される分子は非特異的非共有結合を破壊するのに適したものとなる。これにより、第１の分子を第２の分子によって置き換えることができる。破壊に適した分子の濃度を緩衝液との接触中に順次または連続的に増加させる場合、破壊を特に穏やかに行うことができる。なお、破壊に適した分子の濃度は、生理活性表面上に固定された第１の分子の濃度に相当するものであり、これによって調整することができる。
あるいは、特異的非共有結合の破壊は、生理活性表面を、ステップ（ＩＩ）で、ｐＨ値がｐＨ１〜４、好ましくはｐＨ３未満である緩衝液と接触させることによって達成することもできる。また、ｐＨ値をゆっくり低下させることによって（ｐＨ値１を下回ることを意図しない）、穏やかな破壊を達成することができる。
少なくとも１個の第２の分子と少なくとも１個の第１の分子の特異的非共有結合は、少なくとも１個の第２の分子から形成された固定相の固定化とみなすことができ、この固定相は、ステップ（ＩＩ）において、単に緩衝系を変えることによって引き離すことができる。ただし、少なくとも１個の第１の分子から形成される下相は共有結合のために生理活性表面に残る。また、そこに結合している全ての分子を含む第２の分子は表面から除去される。そのため、少なくとも１個の第２の分子によって形成された固定相を、仮固定相とみなすことができ、連続的な仮固定相は異なる固定化／機能化によって異なる特性を有することができる。
そのため、少なくとも１個の第１の分子によって形成され、少なくとも１個の第２の分子によって形成された固定相に化学結合するのに適した相を下相と理解することができる。しかしながら、複雑な方法で構成し、生理活性表面に共有結合される第１の分子も下相として使用することができる。これらは、例えば、第１の分子に共有結合する活性化カルボキシル基に結合したジアミノリンカーであり得、第１の分子は対応するアミノ機能化を有することが意図されている。さらに、第１の分子を例えば、バイオセンサチップの生理活性表面上に固体またはゲル様マトリックスで固定化することが考えられる。
少なくとも１個の第２の分子によって形成された固定相の引き離し後、ステップ（ＩＩ）に続けて、少なくとも１個の第２の分子によって形成されたさらなる固定相の結合を再度行うことができる。
有利には、引き離された第２の分子およびこれに結合したさらなる分子を除去すべく、ステップ（ＩＩ）において、生理活性表面を所定量の緩衝液で洗い流すべきである。そのため、本方法は、流体の流れを容易に変化させることができるフロースルーセル用途に特に適している。
また、本発明は、実質的な中断なしに大量の連続投入および種々の第２の分子、すなわち、異なる仮固定相、の引き離しを実施することができるため、特に、ハイスループット用途にも適している。
第２の分子によって形成された固定相に加え、さらなる分子をステップ（Ｉ）の固定化に供給することもできる。したがって、ステップ（Ｉ）では、少なくとも１個の第３の分子（さらには、少なくとも１個の第４の分子）の結合も、特に少なくとも１個の第２の分子との協同的結合を介して、行うことができる。こうして、異なる特性を有する固定相を得ることができる。
その際、好ましくは、第２の分子の第３または第４の分子に対する解離定数ＫＤ（ＩＩＩ）よりも大きい第２の分子に対する解離定数ＫＤ（ＩＩ）を有する第１の分子を使用すべきである。その結果、ステップ（ＩＩ）において、溶出中（具体的には、ステップ（ＩＩ）で（第１の分子と第２の分子との間の）非共有特異結合を破壊している間）、第２、第３および／または第４の分子を解離することなく、複数の第３および第４の分子から形成された固定相を、少なくとも１個の第１の分子により形成された下相から確実に引き離すことができる。したがって、第１のステップ（Ｉ）において第２、第３、第４の分子から形成された複合体を、下層から完全に引き離し、除去することができる。
また、第１の一本鎖ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）／ＲＮＡ（リボ核酸）または例えば、ＰＮＡ（ペプチド核酸）もしくはＬＮＡ（ロックド核酸）などの分子を含む、あるいはこれらからなる第１の分子を使用することもでき、この第１の分子に、第２の一本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡまたはＰＮＡもしくはＬＮＡ分子を含む、あるいはこれらからなる少なくとも１個の第２の分子を少なくとも領域で相補的に結合させる。よって、固定相は、第２のＤＮＡ／ＲＮＡ一本鎖またはＰＮＡもしくはＬＮＡ分子から形成される。なお、当該第２のＤＮＡ／ＲＮＡ一本鎖またはＰＮＡもしくはＬＮＡ分子は、ＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖またはＰＮＡもしくはＬＮＡ分子複合体の形成によって、少なくとも領域で固定された第１のＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡまたはＬＮＡとハイブリダイズまたは結合する。この場合、ｐＨ値がｐＨ６〜ｐＨ８の生理的緩衝液を使用すべきである。
第１の一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡを第１の分子として使用し、第２の一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡを第２の分子として使用し、第２の一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡが少なくとも領域で、固定され共有結合した第１のＤＮＡまたはＲＮＡと固定相として相補的にハイブリダイズする場合、ステップ（ＩＩ）において、該固定相の切り離しをもたらすために、生理活性表面を、ｐＨ値が３未満の緩衝液と接触させるべきである。なお、ＰＮＡまたはＬＮＡを第１および第２の分子として使用する場合も、手順を同様に行うことができる。
緩衝液と接触させている間のｐＨ値を変化させることにより、ＤＮＡ／ＲＮＡ分子が変性し、ステップ（Ｉ）で形成されたＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖がＤＮＡ／ＲＮＡ一本鎖に解離する。次いで、解離した成分、すなわち、特に第２のＤＮＡ／ＲＮＡ一本鎖を、例えば、緩衝液を流して除去することができる。再生および固定されたＤＮＡ／ＲＮＡ一本鎖との繰り返しの結合のために、中和緩衝液（例えば、リン酸緩衝液、ｐＨ７．４）を供給することができ、その結果として初期ｐＨ値に相当するｐＨ値を固定された第１の分子の領域で達成することができる。
使用される第３の分子は、リガンドを有する、またはリガンドからなり、該リガンドは第３の分子と結合、好ましくは共有結合したまたはしているものであっても良い。特に、第３の分子は、第３の分子と化学共有結合している（いわゆる第２の）リガンドを含む。特に好ましくは、第１および／または第２のリガンドは生理活性表面全体に分布している、すなわち、生理活性表面が第１および／または第２のリガンドで均質に覆われている。第１のリガンドと第２のリガンドは異なるものであっても同一のものであってもよい。リガンドおよび／または第２のリガンドは、タンパク質、ペプチド、脂質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、オリゴ糖および分子質量が２００００Ｄａ以下、好ましくは１００００Ｄａ以下、特に好ましくは３０００Ｄａ以下、特に９００Ｄａ以下である低分子化合物、ならびにこれらの組み合わせからなる群から選択することができる。特に、ＤＮＡ／ＲＮＡを第１および第２の分子として使用する場合、リガンドは、例えば、固定されたＤＮＡ／ＲＮＡ上に遺伝子プローブ（ヌクレオチド配列）の形態でハイブリダイズすることができる。しかしながら、リガンドをタンパク質の形態でＤＮＡ／ＲＮＡとカップリングすることもできる。
上記の如く、下相と結合した固定相の結合安定性に影響を与えることなく、例えば、好ましくは表面プラズモン共鳴分光（ＳＰＲ）、光干渉測定（ＬＩＭ）および／または水晶発振子マイクロバランス（ＱＣＭ）を用いて、リガンド−分析物結合現象を検出するために、ステップ（Ｉ）とステップ（ＩＩ）の間でさらなるステップ（Ｉｉ）を実施することができる。生理活性表面は、好ましくは少なくとも１個の特異的、より好ましくはただ１個の特異的分析物分子（例えば、分析物分子としてのタンパク質）を含む溶液と接触させられる。その後、分析物分子と生理活性表面の結合現象を分析測定によって測定する。ここで、少なくとも１個の第２の分子と結合したリガンドを、溶液の分子にとっての結合パートナーとみなす。また、第３の分子が（いわゆる第２の）リガンドを含む場合、このリガンドも結合パートナーとみなし、両リガンドが分析物分子との結合に参加する場合、結合が特に強くなる。第１、第２および／または第３の分子は、単にリガンド（複数可）のプラットホームとして働き、分析物との結合に参加することを意図していない。したがって、具体的には本発明に係る方法により、潜在的なリガンドを既知の分析物に提供することができ、分析物分子とリガンドとの間の結合現象を測定することができる。特に粒子またはビーズを用いるおよび粒子またはビーズ上での適用中に、ＡＬＰＨＡ（増幅発光近接均質アッセイ）に基づく方法（PerkinElmer）を使用することにより、タンパク質−タンパク質相互作用を検出することができる。さらに、蛍光を利用した粒子ソーティングシステム、例えば、分子結合または分子−分子相互作用を蛍光／化学発光によって検出することができるフロースルー細胞数測定またはＦＡＣＳ（蛍光活性化セルソーティング）などへの利用が考えられる。かかる場合、蛍光色素によるターゲットへのマーキングなどを行うためのさらなるステップ／インキュベーションが必要となり得る。
下相を形成するために、ナノ粒子、ビーズ、バイオアッセイ、またはバイオセンサチップ上に形成された生理活性表面が、さらなる（第１の）分子をカップリングすることができる活性化可能なカルボキシル基を有することができる。
本配置は、請求項９に記載の特徴を備える。分子の結合現象を検出する本発明に係る配置は、共有結合によって生理活性表面上に固定された少なくとも１個の第１の分子を有する。さらに、本発明に係る配置は、特異的非共有結合によって少なくとも１個の第１の分子に結合した少なくとも１個の第２の分子を有し、該特異的非共有結合は破壊可能である。
本発明に係る配置の重要な利点は、生理活性表面がさらなる第２の分子と結合可能となるよう、需要に応じて、第２の分子によって形成された仮固定相の固定化及び再除去ができるという点にある。有利には、少なくとも１個の第１の分子から形成された下相が、その結合特性において、仮固定相の切り離しによって影響を受けず、それゆえに、困難な調製を要することなくほぼ完全に復元され得る。
上記したように、生理活性表面は、その材料特性に適する表面ならびに／あるいは、少なくとも第１の分子をその上に共有結合的に固定化することができるように化学修飾によって機能化される、または機能化され得る表面、と理解される。そのため、本発明に係る配置は、特にバイオセンサチップ、バイオアッセイ、ナノ粒子、ビーズおよびビーズベッド（または成形品ベッド）、特にフロースルーセルに適している。
本発明に係る配置または少なくとも該生理活性表面は、乾燥から保護する生理的緩衝液（ｐＨ中性）で湿らせるべきである。また、同様の理由から、本発明に係る配置をハウジングによって囲んでも良い。
少なくとも１個の第２の分子に、好ましくは少なくとも１個の第３および／または第４の分子（第４の分子は分析物分子に関する分子）を、特に協同的結合を介して結合することができる。その結果、固定相が多数の構成形状、例えば、相互作用するリガンドと分析物の対の固定化を有することができる。
少なくとも１個の第１の分子と少なくとも１個の第２の分子との間で形成された特異的非共有結合を破壊することは、該特異的非共有結合を破壊するのに適した少なくとも１個の分子を含み、第１の分子の有する第２の分子に対する解離定数ＫＤ（ＩＩ）未満となる第２の分子に対する解離定数ＫＤ（Ｉ）を有する緩衝液と接触させることによって達成され得る。
第１の分子は、第２の分子の有する第３または第４の分子に対する解離定数ＫＤ（ＩＩＩ）より大きい第２の分子に対する解離定数ＫＤ（ＩＩ）を有する。その結果、少なくとも１個の第２の分子と第３および／または第４の分子によって形成された固定相の切り離し能力を、固定相自体が解離することなく確保することができる。したがって、少なくとも１個の第２の分子と第３および／または第４の分子から形成された複合体は、固定相の切り離し後も残り、そして表面から除去される。
本発明に係る配置のさらなる有利な実施形態では、第１の分子は、少なくとも１個の第１の一本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡまたはＰＮＡもしくはＬＮＡを含む、あるいはこれらから形成され、これに第２の一本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡまたはＰＮＡもしくはＬＮＡを含む、あるいはこれらからなる第２の分子が少なくとも領域で相補的に結合する。この場合、第２のＤＮＡ／ＲＮＡまたはＰＮＡもしくはＬＮＡが切り離し可能な固定相を形成し、第１のＤＮＡ／ＲＮＡまたはＰＮＡもしくはＬＮＡと第２のＤＮＡ／ＲＮＡまたはＰＮＡもしくはＬＮＡとの間で形成される特異的非共有結合は、ｐＨ値がｐＨ３未満である緩衝液と接触中に切り離し可能である。
リガンドと分析物（ターゲット構造）との間の結合現象を測定するために、固定相を、分析物が存在する移動液相で洗い流すまたはこれと接触させることができる。少なくとも１個の第２の分子に加えて、少なくとも１個の第３の分子は、好ましくは第３の分子と共有結合しているリガンドを有する、またはからなるものであっても良い。さらに好ましくは、第１および／または第２のリガンドは生理活性表面全体に分布している、すなわち、生理活性表面が第１および／または第２のリガンドで均質に覆われている。リガンドは、例えば、タンパク質、ペプチド、脂質、ＤＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡおよび／またはＲＮＡ、オリゴ糖、分子質量が２００００Ｄａ以下、好ましくは１００００Ｄａ以下、特に好ましくは３０００Ｄａ以下、特に９００Ｄａ以下である低分子化合物（小分子）、ならびにこれらの組み合わせにも関することができる。移動相で洗い流している／と接触させている間、そこに含まれる分析物（ターゲット構造）は固定されているリガンドと相互作用を起こす。
さらなる実施形態では、本発明に係る配置の下相が、第１の分子の固定化に適したさらなる共有結合分子を有することができる、または分子から形成された複合体を有することができる。これらの分子はカルボキシル基を有する分子に関するものとすることができる。
本発明に係る配置は、一般に、（例えば、リガンドおよび配置上に固定された特異的分析物分子の）分子の結合現象の分析的検出、特にフロースルーセルでのハイスループット用途ならびに表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、光干渉測定（ＬＩＭ）によるおよび／または水晶発振子マイクロバランス（ＱＣＭ）を介した測定に適している。この配置を用いることによって、該配置における生理活性表面上への溶液の特異的分析物分子の結合現象を選択的に検出することができる。これにより、少なくとも１個の第２の分子を含むリガンドは、溶液の分析物分子にとっての結合パートナーとみなされる。同様に第３の分子がリガンドを有する場合、このリガンドも結合パートナーとみなされ、両リガンドが分析物分子との結合に参加する場合、結合が特に強くなる。第１、第２および／または第３の分子は、単にリガンド（複数可）のためのプラットホームとして働き、分析物との結合に参加することを意図していない。したがって、具体的には本発明に係る配置でおよび可逆的様式で、既知の分析物に対する潜在的なリガンドを提供することができ、分析物分子とリガンドとの間の結合現象を測定することができる。分子−分子相互作用を検出するために、本発明に係る配置を特に粒子もしくはビーズに対してまたはこれらの上に適用する場合、例えば、ＦＡＣＳ（蛍光活性化セルソーティング）フロースルーサイトメトリなどの蛍光活性化粒子ソーティングの原理に基づく測定法／検出法に使用することもできる。この場合、生理活性表面上に結合される、または固定される少なくとも１個の分子と特異的に結合する適当な蛍光マーカー（標識）を使用する。
本発明に係る配置は、ＡＬＰＨＡと併せてさらなる用途を見出す。
続いて、本発明およびその有利な実施形態を、例として与えられる実施形態を参照しながら説明する。
図１は、バイオセンサチップの投入および再生を示し、初期状態Ａのバイオセンサチップは、第１の分子として共有結合したＤＮＡ一本鎖３の固定化を有する。生理活性表面１上のＤＮＡ一本鎖３は、共有結合した複合体２に共有結合的に固定される。少なくともＤＮＡ一本鎖３と共有結合した複合体２から形成された下相を符号８で示す。本方法のステップ（Ｉ）では、下相８を、第２のＤＮＡ一本鎖４を第２の分子として含む緩衝液と接触させる。第２のＤＮＡ一本鎖４は共有結合的にカップリングしたリガンド６を有する。緩衝液との接触中、第２のＤＮＡ一本鎖４は、ＤＮＡ二本鎖の形成によって、固定されたＤＮＡ一本鎖３と相補的に、すなわち特異的に非共有結合的にハイブリダイズする。ここで、上側固定相を形成する領域を符号７で表す。
方法ステップ（Ｉｉ）では、固定相７を、移動相で洗い流すことにより接触させ、移動相中に存在する構造９（分析物）がリガンド６と会合することができる。方法ステップ（Ｉｉ）中、例えば、水晶発振子マイクロバランスによって、会合および解離を測定することができる。
再生（仮固定相、符号７の切り離し）のために、ステップ（ＩＩ）で生理活性表面１を、所定流量で洗い流すことによって緩衝液と接触させる。該緩衝液は、最初はｐＨ値がｐＨ８〜ｐＨ６の範囲にあり、接触中に３未満のｐＨ値まで徐々に低下させられる。
緩衝液との接触中におけるｐＨ値変化の結果として、ＤＮＡ一本鎖３および４から形成された二本鎖が変性し、第２のＤＮＡ一本鎖４が第１の固定されたＤＮＡ一本鎖３から解離する。それによって、固定相７が緩衝液の流れによって切り離し、除去される。そして、ｐＨ６〜ｐＨ７の範囲の生理的ｐＨ値を有する中和緩衝液またはランニングバッファを供給し、固定されたＤＮＡ一本鎖３を復元することができる。
図２ａで、上記の２本のＤＮＡ一本鎖のハイブリダイゼーション（Ａ’；Ａ）を、ＱＣＭシグナル図から理解できるように、移動相（ハイブリダイゼーション緩衝液）中に存在し、シクロスポリンＡ（ＣｓＡ）と抱合しているＤＮＡ一本鎖Ａは、固定されたＤＮＡ一本鎖Ａ’とハイブリダイズする。ハイブリダイゼーションによって固定された第２の分子、すなわち、ＣｓＡ抱合ＤＮＡ Ａを切り離すために、２．５ｍＭ ＨＣｌを用いてセンサチップの表面を１２０秒間洗い流すまたはインキュベートすることができる。さらに、図２ａから推論することができるように、ハイブリダイゼーションサイクル、すなわち、固定されたＤＮＡ一本鎖Ａ’ ５１、５２、５３とＤＮＡカップリングとの繰り返しが、対応するＱＣＭシグナルを示している。
図２ｂ〜図２ｄで、図２ａに記載される、固定されたＣｓＡ分子と、シクロフィリンＡ（ＣｙｐＡ、図２ｂ）、変異型シクロフィリンＡ変異体（ＣｙｐＡ変異体、図２ｃ）、シクロフィリン４０（Ｃｙｐ４０、図２ｄ）、との間の結合工程（会合および解離）を測定するための運動実験を、ＱＣＭシグナル図を参照しながら示す。
先ず、図２ａに記載される、ＤＮＡ ＡとカップリングしたＣｓＡ分子が固定されているＱＣＭチップを、タンパク質結合緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、１μｍ ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、ｐＨ７．４）で洗浄し、シクロフィリンＡ（ＣｙｐＡ、図２ｂ）、シクロフィリンＡ変異体（ＣｙｐＡ変異体、図２ｃ）およびシクロフィリン４０（Ｃｙｐ４０、図２ｄ）を種々の濃度でタンパク質結合緩衝液にそれぞれ添加する。対応するシクロフィリン分子濃度は、図２ｂ〜図２ｄの図から推論され得るように、より強いＱＣＭシグナルとして表れる。種々の分子濃度のシクロフィリンＡ（ＣｙｐＡ、図２ｂ）、シクロフィリンＡ変異体（ＣｙｐＡ変異体、図２ｃ）およびシクロフィリン４０（Ｃｙｐ４０、図２ｄ）の注入（接触）を、それぞれ２５μｌ／分の流量、２２℃で８４秒の注入期間行った。
図２ｂは、９番目のハイブリダイゼーションまたは脱ハイブリダイゼーション（dehybridization）サイクルにおけるＱＣＭセンサチップ上のＣｙｐＡの結合および解離を示している。ここで、ＣｙｐＡは以下の濃度のものを使用した：６．２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、２５ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭおよび２００ｎＭ。ＱＣＭシグナルの測定後には、それぞれセンサチップを１％ラウリル硫酸ナトリウム緩衝液（ＳＤＳ）で１２０秒間洗い流して洗浄した。
図２ｃは、ＱＣＭセンサチップ上のＣｙｐＡ変異体の結合および解離を示しており、ＣｙｐＡ変異体を３１．２５ｎＭ、６２．５ｎＭ、１２５ｎＭ、２５０ｎＭ、５００ｎＭおよび１０００ｎＭの濃度で供給した。
図２ｄは、ＱＣＭセンサチップ上のＣｙｐ４０の結合および解離を示しており、Ｃｙｐ４０を３１．２５ｎＭ、６２．５ｎＭ、１２５ｎＭ、２５０ｎＭ、５００ｎＭおよび１０００ｎＭの濃度で供給した。
図２ｂ〜図２ｄに使用されている本発明に係るＱＣＭセンサチップのいずれにおいても、結合実験（２ｂ〜２ｄ）の実施中に、１％ＳＤＳ緩衝液による洗浄工程の結果としてのＤＮＡ二重螺旋（Ａ’；Ａ）の脱ハイブリダイゼーションが確立されなかった。ＣｓＡカップリングＤＮＡ鎖Ａの切り離しまたは脱ハイブリダイゼーションは、ｐＨ低下によってのみ達成することができる。
図３は、バイオセンサチップの生理活性表面上への分子の結合現象を検出する本発明に係る方法原理の概略図であり、方法の進行を矢印で示す。初期状態Ａにおいて、バイオセンサチップの生理活性表面１は、結合緩衝液によって完全に覆われており、チップ１と化学的共有結合している一本鎖ＤＮＡに関する少なくとも第１の分子３の固定化を有する。この化学的共有結合固定化は、例えば、チップを、ＥＤＣ／ｓＮＨＳの存在下で遊離アミノ基（ＮＨ２−ｓｓＤＮＡ）を有する一本鎖ＤＮＡと遊離カルボキシル基を反応させることによって達成することができる。同様に、遊離カルボキシル基を有するいずれのリガンド６ａ、６ｂも、ＮＨ２−ｓｓＤＮＡ４、５およびＥＤＣ／ｓＮＨＳと反応するよう作成される。結果として、リガンド６ａ、６ｂと化学的共有結合した本発明に係る第２の分子４および／または第３の分子５を作成することができる。
ステップ（Ｉ）で、最初に、現在一本鎖ＤＮＡに関する第２の分子４を、少なくとも１個の特異的非共有結合（ヌクレオチド塩基間の水素架橋結合）の形態で、少なくとも１個の第１の分子３と結合（ハイブリダイゼーション）する。第２の分子４は、リガンド６ａとの（例えば、化学的共有）結合を有する。さらに、第３の分子５もステップ（Ｉ）で第２の分子４と結合することができる。第３の分子は、（いわゆる第２の）リガンド６ｂとの（例えば、化学的共有）結合を有し、この例では、２つのリガンド６ａ、６ｂは異なっている。
方法ステップ（Ｉｉ）において、分子を、移動相で流すことによってリガンドと接触させ、移動相中に存在する分子９（例えば、分析物としての特異的タンパク質）とリガンド６ａ、６ｂとを会合させることができる。方法ステップ（Ｉｉ）中、固定されたリガンド６ａ、６ｂと構造９との間の会合および解離を、例えば、表面プラズモン共鳴分光によって分析的に測定することができる。
ステップ（ＩＩ）では、生理活性表面１を、所定流量で流すことによって、ｐＨ値が３未満の緩衝液と接触させる（図示せず）。低ｐＨ値によって、一本鎖ＤＮＡのハイブリダイゼーションは切り離され（解離）、バイオチップの表面１に化学的共有結合的に固定されている第１の分子３はその位置に残る。すなわち、バイオチップが再生され、第２および場合により第３の分子との新たな会合の準備ができる。以上の如く、方法全体が可逆性をもち、バイオチップを測定のために連続して何回も使用することができる。
なお、ステップ（ＩＩ）の後、ｐＨ値３を中性ｐＨ値に調整するために、生理活性表面１をランニングバッファ（好ましくは、ｐＨ７のリン酸緩衝液ＰＢＳ）ですすぐようにしても良い。
Claims (16)
- ステップ（Ｉ）で、
共有結合によって生理活性表面（１）上に固定された、一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡおよびＰＮＡからなる群から選択される少なくとも１個の第１の分子（３）に、
少なくとも１個の特異的非共有結合の形態で、一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡおよびＰＮＡからなる群から選択され、リガンド（６ａ）と化学的共有結合している、またはした少なくとも１個の第２の分子（４）を結合し、
少なくとも１個の第３の分子（５）と前記少なくとも１個の第２の分子（４）の結合が、少なくとも１個の特異的非共有結合を介して達成されるものであり、前記少なくとも１個の第３の分子（５）は一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡおよびＰＮＡからなる群から選択されるものであって、前記少なくとも１個の第３の分子（５）は第２のリガンド（６ｂ）と共有結合している、または共有結合したものであり、
分析物分子（９）を含む第１の緩衝液を前記表面（１）と接触させ、前記分析物分子（９）と前記リガンド（６ａ）及び前記第２のリガンドとの間の結合現象を分析的測定法によって検出し、
ステップ（ＩＩ）で、
前記第１の分子（３）と前記第２の分子（４）との間の前記特異的非共有結合を破壊し、前記表面上に非共有結合した分子を前記表面から除去するように、第２の緩衝液を前記表面（１）と接触させ、
その後、ステップ（Ｉ）および（ＩＩ）を少なくとも１回繰り返す、生理活性表面上の分子の結合現象を検出する方法。 - 前記リガンド（６ａ）が、ペプチド、タンパク質、脂質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、オリゴ糖および分子質量が２００００Ｄａ以下である低分子化合物からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
- 前記第２のリガンド（６ｂ）が、ペプチド、タンパク質、脂質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、オリゴ糖および分子質量が２００００Ｄａ以下である低分子化合物からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
- 前記リガンド（６ａ）と前記第２のリガンド（６ｂ）が同一である、または異なることを特徴とする、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
- 前記結合現象を表面プラズモン共鳴分光（ＳＰＲ）、光干渉測定（ＬＩＭ）および／または水晶発振子マイクロバランス（ＱＣＭ）によって検出することを特徴とする、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
- 前記少なくとも１個の分析物分子（９）が、ペプチド、タンパク質、脂質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、オリゴ糖および分子質量が２００００Ｄａ以下である低分子化合物からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
- ステップ（ＩＩ）で前記生理活性表面（１）と接触させる前記緩衝液は、ｐＨ値が３未満であることを特徴とする、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
- 前記特異的非共有結合を破壊した後に、前記生理活性表面（１）を、ｐＨ値がｐＨ６〜ｐＨ８の範囲にある中和緩衝液と接触させることを特徴とする、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
- 一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡおよびＰＮＡからなる群から選択される少なくとも１個の第１の分子（３）が共有結合によって生理活性表面（１）上に固定されており、
一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡおよびＰＮＡからなる群から選択され、リガンド（６ａ）と化学的共有結合している少なくとも１個の第２の分子（４）が特異的非共有結合によって前記少なくとも１個の第１の分子（３）と結合されており、
少なくとも１個の第３の分子（５）が、少なくとも１個の特異的非共有結合を介して前記少なくとも１個の第２の分子（４）と結合しており、前記少なくとも１個の第３の分子（５）が、一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡおよびＰＮＡからなる群から選択されるものであって、前記少なくとも１個の第３の分子（５）が、第２のリガンド（６ｂ）と共有結合しており、
前記第１の分子と第２の分子（３、４）の前記特異的非共有結合が、前記表面（１）を緩衝液と接触させることによって破壊可能である、分子の結合現象を検出する配置。 - 前記リガンド（６ａ）が、ペプチド、タンパク質、脂質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、オリゴ糖および分子質量が２００００Ｄａ以下である低分子化合物からなる群から選択されることを特徴とする、請求項９に記載の配置。
- 前記第２のリガンド（６ｂ）が、ペプチド、タンパク質、脂質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、オリゴ糖および分子質量が２００００Ｄａ以下である低分子化合物からなる群から選択されることを特徴とする、請求項９または１０に記載の配置。
- 前記リガンド（６ａ）と前記第２のリガンド（６ｂ）が同一である、または異なることを特徴とする、請求項９から１１のいずれか１項に記載の配置。
- 前記生理活性表面（１）が、結合現象の分析測定に適していることを特徴とする、請求項９から１２のいずれか１項に記載の配置。
- 少なくとも１個の分析物分子（９）が、非共有結合を介して前記生理活性表面（１）と結合しており、前記分析物分子がペプチド、タンパク質、脂質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、オリゴ糖および分子質量が２００００Ｄａ以下である低分子化合物からなる群から選択されることを特徴とする、請求項９から１３のいずれか１項に記載の配置。
- 前記特異的非共有結合が、ｐＨ値がｐＨ３未満である緩衝液と接触させることによって破壊可能であることを特徴とする、請求項９から１４のいずれか１項に記載の配置。
- 前記表面（１）が乾燥していることを特徴とする、請求項９から１５のいずれか１項に記載の配置。
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