JP6368483B2 - トリクロサン誘導体およびその使用 - Google Patents

Description

本発明は、トリクロサン誘導体およびその使用、特にトリクロサン誘導体を含む選択剤およびトリクロサン誘導体を含む選択培地に関する。本発明はまた、トリクロサン誘導体を含む選択剤を使用して混合集団中の特定の細胞の成長を選択的に阻害する方法、およびこのような方法を行うためのキットに関する。

本発明の背景についての以下の考察は、本発明の理解を助けることを意図したものである。しかしながら、この考察は、言及されている材料のいずれかが、本出願の優先日のいずれの管轄においても公開されている、既知である、または当業者にとっての技術常識の一部であることを承認するものでも自認するものでもない。

広域抗菌剤、５−クロロ−２−（２，４−ジクロロフェノキシ）フェノール（「トリクロサン」または「Ｉｒｇａｓａｎ（登録商標）」（Ｃｉｂａ Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社のトリクロサンについての商標名である）とも呼ばれる）は、石鹸、歯磨剤、デオドラントを含むパーソナル衛生製品用、ならびに家庭および工業洗浄製品用に１９７０年代始めから一般的に使用されてきた。トリクロサンは高濃度で殺生物剤であるが、低濃度では静菌剤として機能する。

抗菌剤使用の長い歴史にもかかわらず、トリクロサン単独では、特定の細菌種の優先的成長のための識別培地における選択剤として日常的に使用されてこなかった。Ｔｏｏｒａの米国特許第５４４７８４９号明細書は、エルシニア・エンテロコリチカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）の選択的成長のためのセフスロジンおよびトリクロサンの組み合わせの使用を教示している。Ｒｕｓｓｅｌｌの米国特許第５７４１６６３号明細書は、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）の選択的成長のためのカルベニシリンおよびニトロフラントインと組み合わせたトリクロサンの使用を教示している。Ｇｏｏｄらの米国特許出願公開第２０１０／０２７８８４７号明細書は、エノイルＡＣＰレダクターゼ（ｆａｂ１）のための遺伝子のベクター媒介発現を示す遺伝子組換え（形質転換）大腸菌を識別するために１００ｎＭ〜１０μＭの範囲のトリクロサンを培養培地（アンピシリンも補充された）に添加することを教示している。環境、工業または医学試料中に典型的に見出される型の天然起源細菌および／または真菌の培養に関する開示はＧｏｏｄらには存在しない。

米国特許第５４４７８４９号明細書 米国特許第５７４１６６３号明細書 米国特許出願公開第２０１０／０２７８８４７号明細書

本発明の第１の態様によると、標的および非標的細胞の混合集団中の非標的細胞の選択的阻害に使用するためのトリクロサン誘導体を含む選択剤が提供される。

本明細書および特許請求の範囲を通して、文脈上異なる解釈を要する場合を除き、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、述べられている整数または整数の群の包含を意味するが、任意の他の整数または整数の群の除外を意味しないことが理解されるだろう。

混合集団は、環境、工業および／または臨床試料中に見出される型のものである。開示されるトリクロサン誘導体は、他の抗生物質、阻害染料（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｄｙｅｓ）、殺生物剤または静菌剤を用いずに使用することもできる。微生物が採取の際に存在していた条件ならびに環境資料、工業資料および／または医学試料の輸送の条件は，一般的にストレスが多く潜在的に有害である。結果として、試料中の標的微生物は、抗生物質および他の阻害剤に対する耐性が弱くなるおそれがあり、正常な成長を再開する前により長い遅滞期を要することが多い。多くの実験室では、標的微生物の回復を促進するのに十分な期間、例えば、約１６時間、抗生物質を含まない栄養成長培地中で，試料を前集積培養（ｐｒｅ−ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ｃｕｌｔｕｒｅ）に供している。しかしながら、標的細胞は、非標的微生物よりも少数で存在することが多いため、前集積培養によりこの不均衡が進み、非標的微生物の異常成長および標的微生物のマスキングをもたらすおそれがある。

本発明のトリクロサン誘導体およびこのようなトリクロサン誘導体を含む組成物は、抗生物質または他の殺生物剤を用いない培養を可能にするので、多くの試料について前集積培養をする必要が無くなり、時間を節約でき、前集積回復培養を行うために試料の追加の取り扱いをしなければならないというリスクを回避できる。

本発明はさらに、標的および非標的細胞の混合集団中の非標的細胞の選択的阻害のための選択剤としてのトリクロサン誘導体の使用を提供する。

トリクロサンに関連して本明細書で使用する用語「誘導体」は、一般的に直接的にまたは修飾もしくは部分置換によりトリクロサンから得られる化学物質を指す。

細胞は真核細胞（例えば、哺乳動物細胞、真菌細胞または酵母細胞）であり得るが、より典型的には細菌細胞である。特に、標的および非標的細胞は通常両者とも細菌を含む。

本明細書で使用する用語「阻害」は、一般的に細胞の減少、細胞の成長の緩徐化または停止による細胞の成長の阻害を指す。本明細書で使用する場合、「成長」は、大きさの増加もしくは増殖または両者を意味する。したがって、本発明の化合物は、細胞の死滅、細胞の大きさの増大を阻害にすることより細胞を阻害することができ、ならびに／あるいは細胞が分裂増殖してその数が増加するのを防ぐことができる。全体的に見ると、このような阻害は、生菌数の純増を防ぐことになる。

好ましい実施形態は、選択剤は細菌成長培地に添加されるための組成物である。

好ましくは、トリクロサン誘導体はトリクロサンのグリコシド誘導体である。換言すれば、選択剤はアグリコンがトリクロサンであるグリコシドである。糖部分はＯ−結合を通してトリクロサン部分に結合している。トリクロサンは炭水化物部分のアノマー炭素に結合している。

好ましくは、トリクロサンのグリコシド誘導体はピラノシド誘導体（すなわち、トリクロサンのグリコピラノシド）である。換言すれば、グリコシドのグリコン部分（すなわち、糖部分）はピラノース環を含む。

好ましい実施形態は、トリクロサングリコシド誘導体は、
トリクロサン−α−Ｄ−アラビノピラノシド、
トリクロサン−β−Ｄ−アラビノピラノシド、
トリクロサン−α−Ｄ−ガラクトピラノシド、
トリクロサン−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、
トリクロサン−α−Ｄ−グルコピラノシド、
トリクロサン−β−Ｄ−グルコピラノシド、および
トリクロサン−α−Ｄ−マンノピラノシド
から選択される。

好ましい実施形態は、選択剤は一般式（Ｉ）：

（式中、Ｒ_１はグリコンである（すなわち、Ｒ_１は糖部分である））
を有する。好ましくは、Ｒ_１基はピラノース環を含む。

好ましい実施形態では、非標的細胞と接触すると非標的細胞に毒性効果を及ぼす一方で、標的細胞と接触しても標的細胞に毒性効果を及ぼさない選択剤を使用することができる。本発明の選択剤は、細胞の混合集団の一部に阻害を引き起こしたい場合に使用することもできる。

選択剤は、非標的細胞と接触すると非標的細胞の成長を適切に阻害するが、標的細胞と接触した場合に、標的細胞がストレスを受けていてもストレスを受けていなくても標的細胞に対しては本質的に非阻害性である。細菌細胞を適切な成長培地に入れると、生菌細胞の正味の数が増加しない、またはゆっくりと増加するに過ぎない「遅滞期」が存在する。遅滞期後、培養は、平均「世代時間」（すなわち、細胞の分裂増殖において一分裂に必要とされる平均時間）が最短である指数増殖期に入る。「本質的に非阻害性である」と考えられるものの例としては、選択剤が２５％未満、好ましくは２０％未満、より好ましくは１５％未満の遅滞期の増加を引き起こす場合、およびこれが指数増殖期中に２０％未満、好ましくは１０％未満、より好ましくは５％未満の平均世代時間の増加を引き起こす場合に、通常，選択剤は特定の濃度で標的細胞に本質的に非阻害性であると考えられる。

特に好ましい実施形態では、選択剤は、標的細胞がサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）の種であり、非標的細胞が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）および／または他の大腸菌群である場合に使用される。選択剤はサルモネラ属菌株の成長に影響を与えない一方で，競合大腸菌群を阻害する（すなわち、生菌数の純増を防ぐ）。選択剤は、サルモネラ属菌株（ストレスを受けている場合においても）に実質的に非阻害性である。したがって、サルモネラ属菌株の成長が阻害されないので、サルモネラ属菌株（元の試料中に存在する場合）が存在するかを確認するための任意の分析（例えば、ＥＬＩＳＡ、ＰＣＲ等）において，陽性の結果を得るために必要な細胞密度に達するために要する全体的な培養時間を減少させることができる。

別の実施形態では、選択剤は、標的細胞がカンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）の種である場合に使用される。換言すれば、選択剤は、カンピロバクター属の種に選択的である。

また、上に定義される選択剤を含む、標的および非標的細胞の混合集団中の非標的細胞の選択的阻害のための培地も提供される。選択培地は、典型的には非標的および標的細胞の混合集団中の非標的細胞の阻害をもたらす培養培地である。培地は液体であっても固体であってもよく、栄養ベース、ペプトン、酵母エキス、寒天（または他の固形化剤）、塩、緩衝剤、指示染料などの、慣用的および適切に培地に含まれ得る成分のいずれかを含んでもよい。好ましくは、選択剤は、非標的細胞を阻害するための有効量で提供される。

培地は適切な誘導物質を含んでもよい。適切な誘導物質を使用することにより、選択剤の阻害活性が増加する。適切な誘導物質としては、メチルグリコシド、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド、ｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−アラビノピラノシドまたはｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−キシロピラノシドが挙げられる。

選択剤は、標的細胞が成長できるが，非標的細胞を阻害する適切な濃度で培地中に適切に提供される。

適切には、本発明はまた、標的および非標的細胞の混合集団と接触する、上に定義される培地も提供する。

特に好ましい実施形態では、上に定義される選択剤を含む、サルモネラ属を識別するための培養培地が提供される。これは、サルモネラ属を、例えば大腸菌などの大腸菌群から識別するための培地を提供する。標的細胞はサルモネラ属の種であり、非標的細胞は大腸菌群、好ましくは大腸菌である。この実施形態では、選択剤は好ましくはトリクロサンβ−Ｄ−ガラクトピラノシドである。

別の実施形態では、上に定義される選択剤を含む、カンピロバクター属の種を計数するための培養培地が提供される。これは、カンピロバクター属のコロニーの成長および計数用培養培地を提供する。本出願人は、本発明の培養培地が、多剤耐性グラム陰性種の存在からの偽陽性を減少させるまたは防ぐことを見出した。この実施形態では、選択剤は好ましくはトリクロサンβ−Ｄ−ガラクトピラノシドまたはトリクロサンα−Ｄ−アラビノピラノシドである。本発明はまた、カンピロバクター属の成長および計数用の上に定義される選択剤または培地の使用を提供する。

本発明はさらに、標的および非標的細胞の混合集団中の非標的細胞の選択的阻害用の選択剤としてまたは選択培地への上記好ましい特徴のいずれかを有するトリクロサン誘導体の使用を提供する。

さらなる態様では、本発明は、
試料細胞を、非標的細胞には阻害性であるが、標的細胞には本質的に非阻害性である上に定義される選択剤と接触させる工程と、
標的細胞の成長を可能にする条件下で細胞を培養する工程と
を含む、標的および非標的細胞の混合集団を含むと思われる試料中の細菌、真菌または酵母細胞を培養する方法を提供する。この方法は上に定義される培地を利用してもよい。

この方法は、試料を、選択剤を含まない前集積培地と接触させずに行ってもよい。

培養する工程の前に、混合集団中の非標的細胞の数は、混合集団中の標的細胞の数よりも大きくてもよい。

本発明による方法は、選択的成長条件で成長することができる生物を同定することを可能にし得る。したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、選択剤を含む培養で成長することができる標的細胞生物を同定するさらなる工程を含んでもよい。あるいは、またはさらに、この方法は、選択剤を含む培養で成長することができる標的細胞生物のコロニーを単離する工程を含んでもよい。このような同定および／または単離方法は当業者にとって自明なものである。

本発明によると、上に定義される選択剤を含む培地または同培地を調製するための成分を含む、上に定義される方法とともに使用するためのキットがさらに提供される。このキットは、本発明による方法を行うための説明書をさらに含んでもよい。

本発明によると、トリクロサンのグリコシド誘導体を含む組成物も提供される。好ましい実施形態では、トリクロサンのグリコシド誘導体はピラノシド誘導体である。特に好ましい実施形態では、トリクロサンのピラノシド誘導体は、
トリクロサン−α−Ｄ−アラビノピラノシド、
トリクロサン−β−Ｄ−アラビノピラノシド、
トリクロサン−α−Ｄ−ガラクトピラノシド、
トリクロサン−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、
トリクロサン−α−Ｄ−グルコピラノシド、
トリクロサン−β−Ｄ−グルコピラノシド、および
トリクロサン−α−Ｄ−マンノピラノシド
から選択される。

アラビノシド、ガラクトシド、グルコシドおよびマンノシドという用語は、本明細書において関連するグリコン部分を指すための省略表現として使用される。

好ましい実施形態では、選択剤は一般式（Ｉ）：

（式中、Ｒ_１はグリコンである（すなわち、Ｒ_１は糖部分である））
を有する。好ましくは、Ｒ_１基はピラノース環を含む。

ここで本発明の好ましい実施形態を、付随する図面を参照して単なる例としてより具体的に記載する。

３７℃のトリクロサン−β−Ｄ−ガラクトシド（２μｇ／ｍｌ）を含むニュートリエントブロスＮｏ．２中での大腸菌６０７およびネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）７２２の混合培養の成長のグラフを示す図である。

トリクロサン誘導体
本発明のトリクロサン誘導体は殺生物剤のグリコシド誘導体を含み、ここではトリクロサンのフェノール基はアノマー糖ヒドロキシルと結合している。トリクロサングリコシドを製造する代表的な方法は実施例１〜４に提供される。グリコシドの例としては、それだけに限らないが、α−Ｄ−アラビノピラノシド、β−Ｄ−アラビノピラノシド、α−Ｄ−ガラクトピラノシド、β−Ｄ−ガラクトピラノシド、α−Ｄ−グルコピラノシド、β−Ｄ−グルコピラノシド、およびα−Ｄ−マンノピラノシドが挙げられる。

表１に示されるように、実質的に全ての微生物が、遊離トリクロサンよりもトリクロサングリコシド誘導体で高い最小発育阻止濃度（ＭＩＣ；minimum inhibitory concentration）を示した。トリクロサン（Ｉｒｇａｓａｎ（登録商標）、Ｃｉｂａ Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社）またはトリクロサン−β−Ｄ−ガラクトシドを異なる濃度でニュートリエントブロスＮｏ．２（Ｏｘｏｉｄ ＣＭ００６７、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に添加した。表１に示される細菌種を３７℃で約２４時間インキュベートした。各選択剤の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を、２４時間のインキュベーション時間中に成長を完全に阻害するのに要する最低濃度（μｇ／ｍｌ）（Ｂｉｏｓｃｒｅｅｎ装置（Ｏｙ Ｇｒｏｗｔｈ Ｃｕｒｖｅｓ Ａｂ社）を使用して６００ｎｍで吸収を測定することにより決定した）として決定した。

試験した生物の全てがトリクロサンにより阻害されたが、いくつかはそのグリコシドに完全に耐性であった（表１）。

糖のアセチル化
アルゴン雰囲気下、糖３０．０ｍｍｏｌの無水ピリジン１０ｍｌ（１２９ｍｍｏｌ）中懸濁液を、攪拌しながら氷中で冷却した。次いで、無水酢酸（１０ｍｌ、０．０９ｍｏｌ）を滴加し、反応物を室温で１８時間攪拌した。次いで、溶液を真空中で濃縮し、トルエンと共沸した。結果として生じる残渣をジクロロメタン（５０ｍｌ）に溶解し、１Ｍ ＨＣｌ（２×５０ｍｌ）、飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液（２×５０ｍｌ）および食塩水（２×５０ｍｌ）で洗浄した。次いで、ジクロロメタン層を、硫酸マグネシウムを用いて乾燥させ、真空中で濾過および濃縮して白色粉末として生成物を得た。

臭素化
０℃に冷却した実施例１からのアセチル化糖１３．０ｍｍｏｌに、氷酢酸（４５％ｗ／ｖ）中ＨＢｒ３６．７ｍｍｏｌを滴加した。溶液を０℃で３時間攪拌し、次いで、これを氷上に注ぎ、ＣＨ_２Ｃｌ_２（２×１００ｍｌ）で抽出した。合わせた抽出物を飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液（２×１００ｍｌ）で洗浄し、次いで、無水硫酸マグネシウムを用いて乾燥させ、真空中で濾過および濃縮して透明なオレンジ色シロップを得た。シロップを酢酸エチルに溶解し、白色粉末として結晶化した。

グリコシド化の方法１
ケーニッヒス−クノール法を使用することにより、確実にグリコシドのトランスアノマー型のみ形成されるようにした。

トリクロサン（４．０４ｇ、１４．０ｍｍｏｌ）を、１Ｍ水酸化ナトリウム溶液１４ｍｌ（１４ｍｍｏｌ）を含む水１００ｍｌおよびアセトン４０ｍｌに溶解した。次いで、攪拌した溶液に、アセトブロモガラクトース（１３．２ｍｍｏｌ）のアセトン中溶液６０ｍｌを１回で添加した。反応混合物を室温で１８時間攪拌し、次いで、溶媒を真空中で除去した。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲルをヘキサン／酢酸エチルの３：２混合物で溶出）により精製して生成物を得た。

グリコシド化の方法２
代替法として、α−とβ−アノマーの両方を形成し、フラッシュクロマトグラフィーを使用して分離してもよい。

アルゴン下、アセチル化糖（１７．０ｍｍｏｌ）を無水ジクロロメタン１００ｍｌに溶解し、次いで、トリクロサン（１８．０ｍｍｏｌ）を添加した。次いで、０℃の攪拌した溶液に、三フッ化ホウ素エーテラート（５１．０ｍｍｏｌ）を添加した。次いで反応物を室温に加温させ、１８時間攪拌した。水（２０ｍｌ）を添加して反応物をクエンチし、次いで、これをさらに１５分間攪拌した。次いで、ジクロロメタン５０ｍｌを添加し、溶液を水（２×１５０ｍｌ）および食塩水（２×１５０ｍｌ）で洗浄し、硫酸マグネシウムを用いて乾燥させた。濾過した後、溶媒を真空中で除去し、粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲルをヘキサン／酢酸エチルの３：２混合物で溶出）により精製した。

一般的手順：脱保護
アルゴン下、保護された糖（１当量）を無水ＭｅＯＨ（１ｍｌ／ｍｍｏｌ）に溶解した。次いで、Ｋ_２ＣＯ_３（１当量）を添加した。次いで、反応物をＴＬＣ分析により完了したとみなされるまで攪拌した。次いで、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲ−１２０（プラス）樹脂を添加し、反応物をさらに３０分間攪拌した。次いで、樹脂を濾過して取り除き、濾液を真空中で濃縮して所望の生成物を得た。

図１は、３７℃のトリクロサン−β−Ｄ−ガラクトシド（２μｇ／ｍｌ）を含むニュートリエントブロスＮｏ．２中での大腸菌６０７およびネズミチフス菌７２２の混合培養の成長を示している。試料を約３０分毎に採取し、ニュートリエント寒天培地上に蒔いた。大腸菌６０７は３０分後に１．０×１０^４から１．８６×１０^４ｃｆｕ／ｍｌまでわずかな増加を示したが、その後７時間後には３．９８×１０^３ｃｆｕ／ｍｌに減少した。対照的に、ネズミチフス菌７２２は、１．５時間の短い遅滞期の後、正常な対数増殖期（倍加時間＝２８．５分）に入り、７時間後には２．５１×１０^５ｃｆｕ／ｍｌに増加した。典型的試料においては背景微生物が標的生物よりはるかに多数存在するので、この実験のために混合培養中の大腸菌の初期数をネズミチフス菌より１．５対数ｃｆｕ／ｍｌ高くした。

アシネトバクター・バウマンニおよび腸内細菌科の種を含む多剤耐性グラム陰性微生物が、広範な農業抗生物質使用のために、食物連鎖に現れ始めている。これらの微生物は、カンピロバクター属のための計数寒天上で偽陽性として現れるおそれがある。

カンピロバクター属の種は、成長のためにアミノ酸およびＴＣＡ回路中間体のみを必要とし、炭水化物を利用しないという点で、その栄養要求において珍しい。本発明者らは、カンピロバクター属がトリクロサンのグリコシド誘導体に耐性であることを発見した。トリクロサン−β−Ｄ−ガラクトシドとトリクロサン−α−アラビノシドの両方が、腸内細菌科の生物に関して低いＭＩＣ値を有するので、試験のために選択された。トリクロサン化合物をＢｒｉｌｌｉａｎｃｅ ＣａｍｐｙＣｏｕｎｔ寒天（Ｏｘｏｉｄ）に添加し、生物を板の表面上に複数点接種した。板を微好気条件下３７℃で２４時間インキュベートした。両化合物は試験したアシネトバクター・バウマンニ菌株の全ての成長を阻害した（表２）。トリクロサン−β−ガラクトシドは、５μｇ／ｍｌで使用すると、肺炎桿菌の２種のカルバペネマーゼ産生株の阻害において特に活性であった一方で、カンピロバクター菌株は５０μｇ／ｍｌもの高い濃度のトリクロサン−α−アラビノシドに耐性であった。

トリクロサンの種々のグリコシド誘導体を６４μｇ／ｍｌでニュートリエントブロスＮｏ．２に添加して、各選択剤の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を決定した。その結果を表１に示す。試験は誘導物質を添加して繰り返した。主な誘導物質としてメチルグリコシドを使用したが、他の適切な誘導物質としてはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド、ｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−アラビノピラノシドおよびｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−キシロピラノシドが挙げられる。誘導物質の濃度は、全ての場合で１００μｇ／ｍｌとした。

表１から、トリクロサン−α−Ｄ−マンノシドを６４μｇ／ｍｌでニュートリエントブロスに添加すると、特に乳児調製粉乳中に見られる重要な病原体であるクロノバクター・サカザキの成長および回収が可能になるが、通常この生物と共に単離される多くの生物の成長が阻害されることがわかる。したがって、シトロバクター・フロインデイ、エンテロバクター・クロアカ、大腸菌、エシェリキア・ハーマニイ、ハフニア・アルベイ、クレブシエラ属、プロテウス属、サルモネラ属およびブドウ球菌属の全ての菌株がこの濃度により阻害された。さらに、１６μｇ／ｍｌのトリクロサン−β−Ｄ−アラビノシドは、サルモネラ属の選択的回収を可能にし、トリクロサン−α−Ｄ−グルコシドはストレプトコッカス属の病原性菌株の選択的回収を可能にするだろう。

誘導物質を添加することにより、トリクロサングリコシドの阻害活性が実質的に増加することも観察された。

ニュートリエント寒天培地中の最小発育阻止濃度の決定法
トリクロサン−グリコシドをニュートリエント寒天培地（Ｏｘｏｉｄ ＣＭ０００３；Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に添加し、生物を複数点接種装置（Ｏｘｏｉｄ Ｃａｔｈｒａ、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を使用して寒天培地表面上に移した。後者は本質的にはいくつかのニードルを含む金属板である。各ニードルチップ（通常３６個／板）を生物懸濁液（リン酸緩衝食塩水；ＰＢＳ中）に浸漬し、次いで、ニードルを寒天培地上に動かし、その表面上に下げる。このようにして、最大３６種の異なる生物のコロニーの成長を１つの寒天培地上で観察することができる。

ニュートリエント寒天培地Ｎｏ．２を製造業者の説明書にしたがって調製し、オートクレーブし、５０℃に冷却した。次いで、試験化合物を濾過滅菌溶液（５０：５０脱イオン水：エタノール）として添加して、倍加希釈で２５６μｇ／ｍｌ〜０μｇ／ｍｌの最終濃度となるようにした。誘導物質も０．１ｍｇ／ｍｌの最終濃度で添加した。混合物を攪拌し、次いで４枚の寒天培地（２５ｍｌ溶解寒天）に注いだ。次いで，ラミナーフローキャビネット中で乾燥させ、複数点接種装置を使用して滅菌生理食塩水に２回１０倍希釈した生物の一晩培養（約１０^７ｃｆｕ／ｍｌ）を接種した。次いで、３７℃で２４時間インキュベートした。成長が観察されない濃度をＭＩＣとして決定した。

結果を表３に示す。板から得られたＭＩＣは、ブロスで得られたものと類似であり、寒天の表面張力が何等細胞にストレスを与えないことを示した。これはまた、感受性生物から放出された遊離トリクロサンは板上のより耐性の生物を阻害しないので、グリコシドを混合培養の回収に使用することができることも示した。

Claims (13)

1. トリクロサン誘導体を含む選択剤を含む、標的および非標的細胞の混合集団中の非標的細胞の選択的阻害のための培地であって、
   前記標的細胞がサルモネラ属の種、又はカンピロバクター属の種であり、
   前記選択剤が前記非標的細胞を阻害するための有効量であり、
   前記トリクロサン誘導体は，
   トリクロサン−α−Ｄ−アラビノピラノシド、
   トリクロサン−β−Ｄ−アラビノピラノシド、
   トリクロサン−α−Ｄ−ガラクトピラノシド、
   トリクロサン−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、
   トリクロサン−α−Ｄ−グルコピラノシド、
   トリクロサン−β−Ｄ−グルコピラノシド、および
   トリクロサン−α−Ｄ−マンノピラノシド
   から選択される、トリクロサンのグリコシド誘導体である、
   培地。
2. 非標的細胞と接触すると非標的細胞に毒性効果を及ぼす一方で、標的細胞と接触しても標的細胞に毒性効果を及ぼさない、請求項１に記載の培地。
3. 非標的細胞と接触すると非標的細胞の成長を阻害するが、標的細胞と接触しても、それがストレスを受けていてもストレスを受けていなくても標的細胞に本質的に非阻害性である請求項１又は２に記載の培地。
4. 前記標的細胞がサルモネラ属の種であり、前記非標的細胞が大腸菌および／または他の大腸菌群である、請求項１から３のいずれかに記載の培地。
5. 前記標的細胞がカンピロバクター属の種である、請求項１から４のいずれかに記載の培地。
6. 標的および非標的細胞の混合集団と接触する、請求項１から５のいずれかに記載の培地。
7. 請求項１から４のいずれかに記載の培地を含む、サルモネラ属の種を識別するための培地。
8. 請求項１，２，３または５に記載の培地を含む、カンピロバクター属の種を計数するための培地。
9. 試料細胞を、非標的細胞には阻害性であるが、標的細胞には本質的に非阻害性である請求項１から８のいずれかに記載の培地と接触させる工程と、
   標的細胞の成長を可能にする条件下で前記細胞を培養する工程と
   を含み、前記選択剤が前記非標的細胞を阻害するための有効量である、
   標的および非標的細胞の混合集団を含むと思われる試料中の細菌、真菌または酵母細胞を培養する方法。
10. 前記試料を、前記選択剤を欠く前集積培地と接触させずに行われる、請求項９に記載の方法。
11. 前記培養する工程の前に、前記混合集団中の非標的細胞の数が、前記混合集団中の標的細胞の数よりも大きい、請求項９または１０に記載の方法。
12. 請求項１から８のいずれかに記載の培地または同培地を調製するための成分を含む、請求項９から１１のいずれかに記載の方法に使用するためのキット。
13. 請求項９から１１のいずれかに記載の方法を行うための説明書をさらに含む、請求項１２に記載のキット。
    

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