JP6368352B2 - 神経変性疾患および神経炎症性疾患を処置するためのポリシアル酸および使用 - Google Patents

Description

本発明は、低分子量ポリシアル酸、医薬品としての使用、特に中枢神経系（ＣＮＳ）および網膜の病理学的過程の処置における使用に関する。

中枢神経系（ＣＮＳ）の神経変性疾患の治療的療法は存在していないため、ほとんどの処置は対症療法である。上記疾患には、数々のＣＮＳ疾患と、ＣＮＳの特殊化した部分である網膜の疾患とが包含される。疾患および関連保険問題のＷＨＯ分類（ＩＣＤ−１０）によれば、これらの疾患には、変性性運動ニューロン疾患（筋萎縮性側索硬化症；ＩＣＤ−１０：Ｇ１２．２）、パーキンソン病（ＩＣＤ−１０：Ｇ２０）、アルツハイマー病（ＩＣＤ−１０：Ｇ３０）、多発性硬化症（ＩＣＤ−１０：Ｇ３５）ならびに黄斑および後極の変性（老人性黄斑変性症）（ＩＣＤ−１０：Ｈ３５．３）が包含される。

数々のデータから、組織マクロファージによって放出された炎症促進性サイトカインが介在する全身性炎症は、動物モデルおよびヒト疾患において神経変性の進行を持続させる原因要素であることが実証されている。また、ミクログリアも全身性炎症のトランスデューサーや神経変性のエフェクターとして作用するかもしれないと考えられていた。また、感染によって発生する全身性炎症は、多発性硬化症およびアルツハイマー病の進行を引き起こす可能性があることも公知である。同様に、炎症過程は、パーキンソン病および筋萎縮性側索硬化症のような神経変性疾患の進行に寄与する。神経変性疾患の根本的な原因は極めて多様であるが、驚くべきことに、ミクログリアの独特な炎症性プロファイルによって、ニューロン損傷の増幅が集中するという強力な証拠がある。マクロファージおよびミクログリアの炎症促進性サイトカイン、特に腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−アルファ）およびスーパーオキシドなどの活性酸素種は、炎症組織およびニューロン損傷の駆動力として作用すると推測することができるが、神経変性疾患における損傷を予防するには限られた療法の選択肢しか現在利用可能ではない。したがって、現在進行中の罹患組織における局所損傷は、なお主要な課題である。

オリゴシアル酸およびポリシアル酸は、シアル酸が繰り返されるホモポリマーである。シアル酸は、ノイラミン酸のＮ−またはＯ−置換誘導体である。ポリシアル酸（ＰＳＡ）は糖タンパク質で見出されており、所定の病原菌の莢膜多糖の構成要素である。細菌において、ＰＳＡのシアル酸単量体は、２．８または２．９結合で連結して、ポリシアル酸を形成することができる。ヒトにおいて、ＰＳＡのシアル酸単量体は、２．８結合で連結して、５位でアセチル化される。５位でＮ−アセチル化されたシアル酸単量体は通常、Ｎｅｕ５Ａｃと略記される。中性ｐＨでは、α（２→８）結合は高度にフレキシブルな直鎖状分子をもたらし、一方で低いｐＨでは、ポリマーの化学構造によりラクトンが形成され、その結果としてより硬い構造が生じる。ポリシアル酸中の単量体の数は２００に達する場合があり、一方で大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１における内因性ＰＳＡ鎖の平均鎖長は、約１５０から１８０個の単量体であることが見出されている。哺乳動物の糖タンパク質である神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）におけるＰＳＡ鎖のほとんどは、様々な程度の数のシアル酸単量体からなる。ヒト神経芽細胞腫の糖タンパク質において、繰り返すことで形成されたポリシアル酸の鎖が観察されている。

ＵＳ２００９／００１０９４４は、１つまたは複数の脱Ｎ−アセチル残基が豊富な非還元末端を有する単離されたアルファ（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体を生産する方法、ならびに大腸菌Ｋ１および髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ）の細菌感染の検出に使用し、がんを診断および処置する方法を開示している。さらに、ポリシアル酸は、タンパク質の薬物動態を改善するのに使用されてきた。したがって、２０ｋＤａから４０ｋＤａの間の相対的に高い分子量を有するポリシアル酸を組換えタンパク質に結合させて、それらの安定性と薬物動態を改善してきた。例えば、Ｘｅｎｅｔｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＰＬＣ、Ｌｏｎｄｏｎ、ＵＫは、組換え第ＶＩＩＩ因子などのタンパク質の半減期を延長させて、安定性を改善するために、天然ポリマーであるポリシアル酸を使用する技術を市販していた。

神経変性疾患の複雑なメカニズムの詳細がますます確認されつつあるにもかかわらず、化合物が、炎症促進性の特徴を示す可能性があるのか、または抗炎症性の特徴を示す可能性があるのかを予測することはほぼ不可能である。

これは、例えば神経変性疾患における活性なエフェクターとしてミクログリアが関与するが、抗炎症性作用も引き起こす可能性があるような場合にはなおさらである。

ＵＳ２００９／００１０９４４

したがって、本発明の根底にある目的は、神経変性および炎症性疾患の処置における使用に適した化合物を提供することであった。

この課題は、以下に示される一般式（１）：
ポリ−（α（２→８または２→９）Ｎｅｕ５Ａｃ）_ｎ（１）
［式中、
Ｎｅｕ５Ａｃは、Ｎ−アセチルノイラミン酸であり、
ｎは、１４から２６の範囲の整数である］
に係る分岐状もしくは非分岐状の遊離のもしくはグリコシド結合したポリシアル酸および／またはそれらの医薬的に許容される塩によって解決される。

さらに、本発明は、活性成分としてポリシアル酸（１）を含む医薬組成物に関し、加えて、医薬品としての使用、特に中枢神経系の変性疾患、脱髄疾患および炎症性疾患、ならびに変性性または炎症性の網膜疾患の処置における使用に関する。

本発明に係る用語「ポリシアル酸」は、１０個より多くの単量体を含むシアル酸のホモポリマーを指す。一方でオリゴシアル酸は、少数の単量体を含み、典型的には２から１０個の間の単量体を含む。

驚くべきことに、一般式（１）に係るポリシアル酸は、中枢神経系（ＣＮＳ）および網膜の病理学的過程の予防および／または処置に使用できることが見出された。約４．３から８ｋＤａの間の分子量または１４から２６の間の単量体鎖長を有する低分子量ポリシアル酸がそれぞれ、細胞の生存能力に干渉することなく、ミクログリアおよび組織マクロファージの炎症促進性メディエータ産生を低減させることが見出された。対照的に、長さが２から６個の間の単量体を有する２．８結合シアル酸は影響を示さなかったが、より高分子量（＞１２ｋＤａ）のポリシアル酸は、ヒトミクログリアの細胞の生存能力を弱めた。したがって、ポリシアル酸誘導体（１）は、炎症性のミクログリアまたはマクロファージが関与する疾患を処置または予防するのに好適である。ポリシアル酸（１）は、ミクログリアまたはマクロファージによる炎症促進性サイトカインまたは活性酸素種の産生を防止することができると考えられる。特別な理論に縛られるつもりはないが、ポリシアル酸（１）は、ミクログリアおよび所定の組織マクロファージで発現されるシアル酸結合免疫グロブリン様レクチン−１１（Ｓｉｇｌｅｃ−１１）と命名されたヒト系統特異的膜タンパク質に結合する可能性があると考えられる。

単糖のＮ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）は、ＩＵＰＡＣ命名法に従って５−アセトアミド−２，４−ジヒドロキシ−６−（１，２，３−トリヒドロキシプロピル）オキサン−２−カルボン酸と表される。ポリシアル酸多糖のＮｅｕ５Ａｃ単量体単位は、グリコシド結合で一緒に結合されている。Ｎｅｕ５Ａｃ単量体を（２→８）または（２→９）結合で連結させて、ポリシアル酸分子を形成することができる。ポリシアル酸（１）は、２．８結合された単量体、または２．９結合された単量体、または例えば交互にもしくは無作為な順番で２．８結合され２．９結合された単量体を包含していてもよい。ポリシアル酸（１）は、ポリ（２．８結合）またはポリ（２．９結合）ポリシアル酸であってもよく、好ましくはポリ（２．８結合）ポリシアル酸である。好ましくは、Ｎｅｕ５Ａｃ単量体は、α（２→８）結合によって連結されている。好ましくは、ポリシアル酸は、ポリ−（α（２→８）Ｎｅｕ５Ａｃ）_ｎポリシアル酸である。

好ましい実施形態において、ｎは、１６から２４の範囲の整数である。さらに好ましい実施形態において、ｎは、１８から２０の範囲の整数である。有利なことに、このような鎖長のポリシアル酸は、中枢神経系および網膜の変性疾患の処置において優れた影響を有することと、迅速に腎臓で尿に濾されることなく、さらに三次構造を形成せずにその直鎖状構造を維持する可能性とを兼ね備えている可能性がある。

ポリシアル酸は、分岐状または非分岐状のポリマーであり得る。本発明に係る用語「非分岐」は、Ｎｅｕ５Ａｃ単量体の直鎖状配列を含む直鎖ポリシアル酸ポリマーを意味すると理解されるものとする。本発明に係る用語「分岐状」は、１つまたは複数の置換基である側鎖または分岐鎖を有する主鎖で構成されるポリシアル酸ポリマーを意味すると理解されるものとする。好ましくは、ポリシアル酸は、非分岐状ポリマーである。好ましい実施形態において、ポリシアル酸は、α（２．８結合）Ｎｅｕ５Ａｃ単量体で構成される直鎖状ポリマーを形成する。２．８結合によって連結されたＮｅｕ５Ａｃ単量体は、ポリシアル酸のヒト形態に相当する。医薬品として使用するために、有利には、ヒト形態が、ポリシアル酸の最もよく適合し有効な形態を提供すると予想される。単量体の鎖長が１４から２６個の間であるα（２．８結合）Ｎｅｕ５Ａｃ単量体で構成される直鎖状ポリマーは、その標的に対する優れた結合能力を付与できる高度にフレキシブルな分子をもたらす。

ポリシアル酸であるポリ−（α（２→８）Ｎｅｕ５Ａｃ）_ｎ（１）は、遊離であってもよいし、またはグリコシド結合していてもよい。本発明に係る用語「グリコシド結合した」は、さらなる糖分子、またはアミノ酸などのグリコシド結合を形成することができる他の分子に結合しているポリシアル酸を意味すると理解されるものとする。好ましくは、ポリシアル酸は、遊離の多糖の形態である。本発明に係る用語「遊離」は、さらなる糖または他の分子に結合していないが、ポリシアル酸分子であるポリ−（α（２→８）Ｎｅｕ５Ａｃ）_ｎ（１）それ自身であるポリシアル酸を意味すると理解されるものとする。

さらなる実施形態において、ポリシアル酸は、グルコース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、フコース、マンノースおよびキシロースからなる群から選択される少なくとも１つの糖にグリコシド結合していてもよい。本発明に係る用語「糖」は、単糖および二糖を意味すると理解されるものとし、これらは一般的に糖と称される。有利には、グルコース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、フコース、マンノースおよびキシロースが、ヒトの体内で不可欠の糖である。ポリシアル酸は、１つの末端糖分子を含んでいてもよいし、または２つまたはそれより多くの糖分子にグリコシド結合していてもよい。さらに、ポリシアル酸または糖がグリコシド結合したポリシアル酸は、１つまたは複数のアミノ酸にグリコシド結合して糖タンパク質を形成していてもよい。１つまたは複数の糖分子またはアミノ酸にグリコシド結合したポリシアル酸は、薬物動態の改善をもたらすことができる。本発明に係る用語「アミノ酸」は、アルファアミノ酸、すなわちアルファ炭素と呼ばれる同じ炭素に結合したアミン官能基とカルボキシル官能基の両方を含有する分子を意味すると理解されるものとする。好ましいアミノ酸は、グリシン、アラニン、セリン、スレオニン、アルギニン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、ロイシン、バリン、イソロイシン、シトシン、メチオニン、ヒスチジンおよび／またはプロリンからなる群から選択される天然に存在するアミノ酸である。

またポリシアル酸の医薬的に許容される塩も好適である。用語「医薬的に許容される塩」は、医薬的に許容される非毒性の塩基または酸から調製された塩を指す。対応する塩は、無機塩基および有機塩基を含む医薬的に許容される非毒性の塩基から都合よく調製することができる。無機塩基から得られた好ましい塩としては、アンモニウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩およびナトリウム塩が挙げられる。医薬的に許容される非毒性の有機塩基から得られた塩としては、第一、第二および第三アミンの塩、加えて環状アミンの塩が挙げられる。好ましくは、医薬的に許容される塩は、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩またはマグネシウム塩からなる群から選択される。

本発明のポリシアル酸は、天然源または合成源から得ることができる。前駆体として単糖単位を使用することによるオリゴ糖および多糖の具体的な合成方法は当業者に周知である。さらにポリシアル酸は、食物源からも得ることができる。好ましくは、オリゴシアル酸は、例えば大腸菌Ｋ１などの細菌由来のポリシアル酸ポリマーから入手可能である。大腸菌Ｋ１における内因性ポリシアル酸鎖の平均鎖長は、約１５０から１８０個の単量体であることが見出されている。大腸菌によって産生された精製ポリシアル酸は市販されており、例えばポリシアル酸前駆体を加熱することによるフラグメント化に使用することができる。次いで反応混合物を、標準的な方法によって、例えば透析、それに続く高速液体クロマトグラフィーを使用したポリシアル酸フラグメントを含む望ましい画分の分離によって精製することができる。

本発明のさらなる態様は、以下に示される一般式（１）：ポリ−（α（２→８または２→９）Ｎｅｕ５Ａｃ）_ｎ（１）［式中、Ｎｅｕ５Ａｃは、Ｎ−アセチルノイラミン酸であり、ｎは、１４から２６の範囲の整数である］に係るポリシアル酸および／またはそれらの医薬的に許容される塩を含む多糖組成物であって、該組成物中のポリシアル酸のフラグメントは、約４．９ｋＤａから７．４ｋＤａの間の平均分子量を有し、該フラグメントの９０重量％以上１００重量％以下は、約４．３ｋＤａから８ｋＤａの間の分子量を有し、該フラグメントの０重量％以上５重量％以下は、３ｋＤａから４．３ｋＤａの間の分子量を有し、該フラグメントの０重量％以上５重量％以下は、８ｋＤａから９．５ｋＤａの間の分子量を有し、ここで該フラグメントの重量％はポリシアル酸フラグメントの総重量に基づく、多糖組成物に関する。

重量パーセント、重量％またはｗｔ．％は、同義語であり、フラグメントの重量をフラグメントの総重量で割って１００を掛けたものとしてのフラグメントの濃度を指す。フラグメントの重量％（ｗｔ．％）は、別段の規定がない限り、フラグメントの総重量に基づいて計算される。組成物の全てのフラグメントの総量は１００ｗｔ．％を超えない。

ポリシアル酸の「平均分子量」という用語は、本出願において、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって決定されるようなポリシアル酸フラグメントの平均分子量を意味すると理解される。ポリシアル酸フラグメントの分子量は、本出願で説明されているように、規定の分子量を有する標準物質と比較して検出することができる。ポリシアル酸の単量体の数は、例えば陰イオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって決定することができる。

一般的に、ポリマーの鎖長は、単量体単位で、分子量として、またはその両方で示すことができる。ポリシアル酸多糖を参照すれば、約４．３ｋＤａから８ｋＤａの間の分子量は、ｎ＝１４個の単量体からｎ＝２６個の単量体からなる鎖長に対応し、一方で約４．９ｋＤａから７．４ｋＤａの間の分子量は、ｎ＝１６個の単量体からｎ＝２４個の単量体からなる鎖長に対応する。

このようなポリシアル酸（１）を含む多糖組成物において、分子量の最高点は、約５ｋＤａから６．５ｋＤａであり得る。

ポリシアル酸（１）は、ポリ（２．８結合）またはポリ（２．９結合）ポリシアル酸であってもよく、好ましくはポリ（２．８結合）ポリシアル酸である。好ましくは、Ｎｅｕ５Ａｃ単量体は、α（２→８）結合によって連結されている。好ましくは、ポリシアル酸は、ポリ−（α（２→８）Ｎｅｕ５Ａｃ）_ｎポリシアル酸である。好ましい実施形態において、ｎは、１６から２４の範囲の整数である。さらに好ましい実施形態において、ｎは、１８から２０の範囲の整数である。好ましくは、ポリシアル酸は、非分岐状ポリマーである。好ましい実施形態において、ポリシアル酸は、α（２．８結合）Ｎｅｕ５Ａｃ単量体で構成される直鎖状ポリマーを形成する。好ましくは、ポリシアル酸は、遊離の多糖の形態である。さらなる実施形態において、ポリシアル酸は、グルコース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、フコース、マンノースおよびキシロースからなる群から選択される少なくとも１つの糖にグリコシド結合していてもよい。さらに、ポリシアル酸または糖がグリコシド結合したポリシアル酸は、１つまたは複数のアミノ酸にグリコシド結合して糖タンパク質を形成していてもよい。

本発明のさらなる態様は、医薬品として使用するための、以下に示される一般式（１）：
ポリ−（α（２→８または２→９）Ｎｅｕ５Ａｃ）_ｎ（１）
［式中、
Ｎｅｕ５Ａｃは、Ｎ−アセチルノイラミン酸であり、
ｎは、１４から２６の範囲の整数である］
に係る分岐状もしくは非分岐状の遊離のもしくはグリコシド結合したポリシアル酸および／もしくはそれらの医薬的に許容される塩または該ポリシアル酸（１）を含む多糖組成物であって、該ポリシアル酸のフラグメントは、約４．９ｋＤａから７．４ｋＤａの間の平均分子量を有し、該フラグメントの９０重量％以上１００重量％以下は、約４．３ｋＤａから８ｋＤａの間の分子量を有し、該フラグメントの０重量％以上５重量％以下は、３ｋＤａから４．３ｋＤａの間の分子量を有し、該フラグメントの０重量％以上５重量％以下が、８ｋＤａから９．５ｋＤａの間の分子量を有し、ここで該フラグメントの重量％はポリシアル酸フラグメントの総重量に基づく、ポリシアル酸または多糖組成物に関する。

一般式（１）に係るポリシアル酸は、ミクログリアまたはマクロファージによる炎症促進性サイトカインおよび活性酸素種の産生を防止することが可能であり、したがって、ＣＮＳおよび網膜の病理学的過程の予防および／または処置に関して有望な化合物の代表である。

特に、本発明は、中枢神経系の変性疾患、脱髄疾患および炎症性疾患、ならびに変性性または炎症性の網膜疾患からなる群から選択される疾患の治療的および／または予防的処置で使用するための、以下に示される一般式（１）：
ポリ−（α（２→８または２→９）Ｎｅｕ５Ａｃ）_ｎ（１）
［式中、
Ｎｅｕ５Ａｃは、Ｎ−アセチルノイラミン酸であり、
ｎは、１４から２６の範囲の整数である］
に係る分岐状もしくは非分岐状の遊離のもしくはグリコシド結合したポリシアル酸および／もしくはそれらの医薬的に許容される塩または該ポリシアル酸（１）を含む多糖組成物であって、該ポリシアル酸のフラグメントは、約４．９ｋＤａから７．４ｋＤａの間の平均分子量を有し、該フラグメントの９０重量％以上１００重量％以下は、約４．３ｋＤａから８ｋＤａの間の分子量を有し、該フラグメントの０重量％以上５重量％以下は、３ｋＤａから４．３ｋＤａの間の分子量を有し、該フラグメントの０重量％以上５重量％以下は、８ｋＤａから９．５ｋＤａの間の分子量を有し、ここで該フラグメントの重量％はポリシアル酸フラグメントの総重量に基づく、ポリシアル酸または多糖組成物に関する。

用語「予防的処置」は、臨床的症状もしくは障害の発生を予防もしくは阻害すること、または発症する前に明らかな臨床的症状もしくは障害の段階の発症を遅らせることのいずれかを指す。本発明に係る用語「予防的処置」は、ポリシアル酸は、疾患の症状が現れる前に適用してもよいことを意味すると理解されるものとする。特に、用語「予防的処置」は、薬物療法を意味すると理解されるものとする。本発明に係る化合物を、予防的処置で使用することが好ましい可能性がある。

驚くべきことに、ポリシアル酸（１）およびポリシアル酸（１）を含む多糖組成物はそれぞれ、ミクログリアの抗炎症療法において有効な可能性があることが見出された。特に、ポリシアル酸（１）は、黄斑変性症（ｍａｃｕｌａ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）の動物モデルで網膜のミクログリアの活性化を防止することにおいて有効であることを示した。したがって、ポリシアル酸（１）は、変性性または炎症性の網膜疾患の治療的および予防的処置に新規のアプローチを提供する。

本発明に係るポリシアル酸のさらなる特定の利点は、ポリシアル酸（１）は、多発性硬化症の動物モデルで疾患の症状を予防することにおいて有効であることを示したことである。特に、これまでシナプス、軸索またはニューロンの喪失を防止する満足のゆく療法がなかったために、ポリシアル酸（１）は、中枢神経系の変性疾患、脱髄疾患および炎症性疾患の処置における、新しく極めて望ましい使用可能性を提供する。

中枢神経系の変性疾患、脱髄疾患および炎症性疾患、ならびに変性性または炎症性の網膜疾患は、ミクログリアもしくは組織マクロファージによるＴＮＦ−アルファ産生またはミクログリアによる活性酸素種産生と関連しており、ポリシアル酸（１）は、これらを防止することができると考えられる。特別な理論に縛られるつもりはないが、上記疾患は、Ｓｉｇｌｅｃ−１１を発現するミクログリアまたは組織マクロファージに関連する可能性があると考えられる。

好ましい実施形態において、神経変性疾患は、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、軽度認知機能障害、レヴィ小体型認知症、パーキンソン病および睡眠時異常行動からなる群から選択される。本発明に係る用語「筋萎縮性側索硬化症」（ＩＣＤ−１０：Ｇ１２．２）は、予後不良を伴う進行性変性疾患および炎症性の運動ニューロン疾患を意味すると理解されるものとする。用語「パーキンソン病」（ＩＣＤ−１０：Ｇ２０）は、主としてドーパミン作動性ニューロンに作用し錐体外路障害および運動障害を引き起こす進行性の神経変性疾患を指す。本発明に係る用語「睡眠時異常行動」（ＩＣＤ−１０：Ｆ５１．３／Ｆ５１．４）は、パーキンソン病の前駆徴候として頻繁に起こる睡眠中の異常で不自然な行動、挙動、感情、知覚、および夢を伴う睡眠障害を意味すると理解されるものとする。本発明に係る用語「アルツハイマー病」（ＩＣＤ−１０：Ｇ３０）は、細胞外のアミロイド−ベータプラークおよび過リン酸化タウで構成される細胞内神経原線維変化に関連する中枢神経系の変性疾患を指す。用語「軽度認知機能障害」（ＩＣＤ−１０：Ｇ３１．８４）は、しばしば記憶障害を伴い、アルツハイマー病の前駆段階として頻繁に見られる認知障害を指す。用語「レヴィ小体型認知症」（ＩＣＤ−１０：Ｇ３１．８）は、アルツハイマー病とパーキンソン病の両方と密接に関連する認知症のタイプを指す。

ポリシアル酸（１）が、ヒトニューロンおよびヒトミクログリアの共培養系で神経毒性を防止することにおいて有効であったことを示すことができた。さらに、ポリシアル酸（１）は、アルツハイマー病に関連するアミロイド−ベータにより誘導されたヒトミクログリアにおいてスーパーオキシド放出を防止したことを示すことができた。さらに、ポリシアル酸（１）は、食作用およびヒトミクログリアの活性酸素種産生を防止し、パーキンソン病のヒトミクログリア−ニューロン共培養モデルにおけるニューロンへの傷害を防止したことを示すことができた。

好ましい実施形態において、中枢神経系の炎症性疾患は、敗血症性脳症、精神障害の併発を伴う重症敗血症、またはしばしばアルツハイマー病の進行に関連する神経変性疾患に関連する敗血症エピソード（ｓｅｐｔｉｃ ｅｐｉｓｏｄｅｓ）からなる群から選択される。本発明に係る用語「敗血症性脳症」または「重症敗血症」または「敗血症エピソード」は、微生物感染または微生物の毒素により誘発される体の全身性炎症反応として理解されるものとする（ＩＣＤ−１０：Ｒ６５）。重症敗血症は、譫妄および永続的な認知障害に至る可能性がある脳症を伴うことが多い。ポリシアル酸（１）は、細菌毒素であるリポ多糖の繰り返しの適用を経た慢性的な敗血症様状態により誘発される炎症促進性反応を防止することにおいて有効であったことを示すことができた。

好ましい実施形態において、変性性または炎症性の網膜疾患は、加齢性黄斑変性症、遺伝性網膜疾患を含む網膜変性、ブドウ膜炎、および糖尿病性網膜症からなる群から選択される。本発明に係る用語「老人性」または「加齢性黄斑変性症」は、しばしばドルーゼンに関連する黄斑および後極の変性を伴う網膜の萎縮性または滲出性（ＩＣＤ−１０：Ｈ３５．３）の疾患を意味すると理解されるものとする。加齢性黄斑変性症は、色彩および鮮明な視野に必要な網膜の特殊化した部分である黄斑の変性疾患である。この疾患は、活性化ミクログリアが関与する。さらに、新生血管は、漏出の増加およびドルーゼンの沈着を伴う萎縮した網膜色素上皮を示す。加齢性黄斑変性症は、網膜ニューロンの顕著な喪失を引き起こすことから、法的盲の主な原因である。有利なことに、ポリシアル酸（１）は、黄斑変性症の動物モデルにおいて、網膜のミクログリアの活性化および炎症関連の血管漏出を防止することにおいて特に有効であることを示した。本発明に係る用語「ブドウ膜炎」は、免疫系の過剰反応によって引き起こされるブドウ膜の慢性炎症である「自己免疫性ブドウ膜炎」（ＩＣＤ−１０：Ｈ２０）を意味すると理解されるものとし、これは、ブドウ膜路および網膜のあらゆる部分に影響する可能性がある。本発明に係る用語「糖尿病性網膜症」（ＩＣＤ−１０：Ｈ３６）は、網膜損傷に至る、網膜の糖尿病性および炎症性の微小血管変性と理解されるものとする。

好ましい中枢神経系の脱髄疾患は、多発性硬化症である。本発明に係る用語「多発性硬化症」（ＩＣＤ−１０：Ｇ３５）は、ミエリンタンパク質に対する自己免疫の攻撃によって引き起こされ、最終的に軸索変性およびニューロンの喪失に至る中枢神経系の脱髄疾患を意味すると理解されるものとする。本発明に係る用語「デビック病」（ＩＣＤ−１０：Ｇ３６．０）は、グリアの抗原に対する自己免疫の攻撃によって引き起こされ、最終的に軸索変性およびニューロンの喪失に至る視神経および脊髄の脱髄疾患を意味すると理解されるものとする。したがって、多発性硬化症およびデビック病はまた、中枢神経系の脱髄疾患とみなされる場合もある。有利なことに、ポリシアル酸（１）は、多発性硬化症の動物モデルで臨床的な症状を改善することにおいて有効であることを示した。

ポリシアル酸（１）は、ポリ（２．８結合）またはポリ（２．９結合）ポリシアル酸であってもよく、好ましくはポリ（２．８結合）ポリシアル酸である。好ましくは、Ｎｅｕ５Ａｃ単量体は、α（２→８）結合によって連結されている。好ましくは、ポリシアル酸は、ポリ−（α（２→８）Ｎｅｕ５Ａｃ）_ｎポリシアル酸である。好ましい実施形態において、ｎは、１６から２４の範囲の整数である。さらに好ましい実施形態において、ｎは、１８から２０の範囲の整数である。好ましくは、ポリシアル酸は、非分岐状ポリマーである。好ましい実施形態において、ポリシアル酸は、α（２．８結合）Ｎｅｕ５Ａｃ単量体で構成される直鎖状ポリマーを形成する。好ましくは、ポリシアル酸は、遊離の多糖の形態である。さらなる実施形態において、ポリシアル酸は、グルコース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、フコース、マンノースおよびキシロースからなる群から選択される少なくとも１つの糖にグリコシド結合していてもよい。さらに、ポリシアル酸またはグリコシド結合した糖が介在するポリシアル酸は、１つまたは複数のアミノ酸にグリコシド結合して糖タンパク質を形成していてもよい。

ポリシアル酸（１）は、培養されたヒトニューロンにおいて神経毒性を示さなかったことを示すことができた。有利なことに、ポリシアル酸（１）は、全身適用後に血液脳関門を通過して中枢神経系の実質に到達することが可能である。したがって、ポリシアル酸（１）は、神経変性疾患療法で使用するのに好適な薬物動態および薬物毒性を示す。

本発明のさらなる態様は、活性成分として本発明に係るポリシアル酸（１）またはポリシアル酸（１）を含む多糖組成物、および医薬的に許容される担体を含む医薬組成物に関する。本医薬組成物は特に、中枢神経系の変性疾患、脱髄疾患および炎症性疾患、ならびに変性性または炎症性の網膜疾患からなる群から選択される疾患の治療的および／または予防的処置での使用に適している。

製剤用担体は、例えば、固体、液体、または気体であってもよい。好適な担体およびアジュバントは固体または液体であってもよく、医薬製剤の配合技術で一般的に採用される物質に相当するものであってもよい。固体担体の例としては、ラクトース、白土、スクロース、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アカシア、ステアリン酸マグネシウム、およびステアリン酸が挙げられる。液体担体の例は、液糖、落花生油、オリーブ油、および水である。気体状の担体の例としては、二酸化炭素および窒素が挙げられる。医薬組成物は、単位投薬形態で都合よく提供することができ、さらに、滅菌条件下で、薬学分野で周知の標準的な製薬技術を使用して調製することができる。

医薬組成物は、経口、皮膚、直腸、局所、および非経口投与に好適である可能性がある。好ましくは、医薬組成物は、局所的な皮膚または眼への適用と同様に、非経口、経口または直腸経路を介して適用される。非経口投与としては、特に、硝子体内注射、皮下注射、静脈注射または潅流が挙げられる。注射用途または潅流に好適な医薬組成物は、滅菌水溶液または分散液を包含する。さらに、微生物の増殖を防止するために、保存剤が包含されていてもよい。

好ましい実施形態において、医薬組成物は、非経口投与のための滅菌注射用溶液として製剤化される。好ましくは、医薬組成物は、硝子体内注射、皮下注射、静脈注射または潅流として投与される。

また本発明は、医薬品を製造するための、以下に示される一般式（１）：
ポリ−（α（２→８または２→９）Ｎｅｕ５Ａｃ）_ｎ（１）
［式中、
Ｎｅｕ５Ａｃは、Ｎ−アセチルノイラミン酸であり、
ｎは、１４から２６の範囲の整数である］
に係る分岐状もしくは非分岐状の遊離のもしくはグリコシド結合したポリシアル酸および／もしくはそれらの医薬的に許容される塩または該ポリシアル酸（１）を含む多糖組成物の使用であって、該ポリシアル酸のフラグメントは、約４．９ｋＤａから７．４ｋＤａの間の平均分子量を有し、該フラグメントの９０重量％以上１００重量％以下は、約４．３ｋＤａから８ｋＤａの間の分子量を有し、該フラグメントの０重量％以上５重量％以下は、３ｋＤａから４．３ｋＤａの間の分子量を有し、該フラグメントの０重量％以上５重量％以下は、８ｋＤａから９．５ｋＤａの間の分子量を有し、ここで該フラグメントの重量％はポリシアル酸フラグメントの総重量に基づく、使用にも関する。

本発明は、特に、中枢神経系の変性疾患、脱髄疾患および炎症性疾患、ならびに変性性または炎症性の網膜疾患からなる群から選択される疾患の治療的および／または予防的処置のための医薬品を製造するための、以下に示される一般式（１）：
ポリ−（α（２→８または２→９）Ｎｅｕ５Ａｃ）_ｎ（１）
［式中、
Ｎｅｕ５Ａｃは、Ｎ−アセチルノイラミン酸であり、
ｎは、１４から２６の範囲の整数である］
に係る分岐状もしくは非分岐状の遊離のもしくはグリコシド結合したポリシアル酸および／もしくはそれらの医薬的に許容される塩または該ポリシアル酸（１）を含む多糖組成物の使用であって、該ポリシアル酸のフラグメントは、約４．９ｋＤａから７．４ｋＤａの間の平均分子量を有し、該フラグメントの９０重量％以上１００重量％以下は、約４．３ｋＤａから８ｋＤａの間の分子量を有し、該フラグメントの０重量％以上５重量％以下は、３ｋＤａから４．３ｋＤａの間の分子量を有し、該フラグメントの０重量％以上５重量％以下は、８ｋＤａから９．５ｋＤａの間の分子量を有し、ここで該フラグメントの重量％はポリシアル酸フラグメントの総重量に基づく、使用に関する。

本発明のさらなる態様は、中枢神経系の変性性、脱髄性または炎症性疾患、および変性性または炎症性の網膜疾患からなる群から選択される疾患を処置する方法であって、以下に示される一般式（１）：
ポリ−（α（２→８または２→９）Ｎｅｕ５Ａｃ）_ｎ（１）
［式中、
Ｎｅｕ５Ａｃは、Ｎ−アセチルノイラミン酸であり、
ｎは、１４から２６の範囲の整数である］
に係る分岐状もしくは非分岐状の遊離のもしくはグリコシド結合したポリシアル酸および／もしくはそれらの医薬的に許容される塩または該ポリシアル酸（１）を含む多糖組成物の治療有効量を必要とする対象に投与することを含み、該ポリシアル酸のフラグメントは、約４．９ｋＤａから７．４ｋＤａの間の平均分子量を有し、該フラグメントの９０重量％以上１００重量％以下は、約４．３ｋＤａから８ｋＤａの間の分子量を有し、該フラグメントの０重量％以上５重量％以下は、３ｋＤａから４．３ｋＤａの間の分子量を有し、該フラグメントの０重量％以上５重量％以下は、８ｋＤａから９．５ｋＤａの間の分子量を有し、ここで該フラグメントの重量％はポリシアル酸フラグメントの総重量に基づく、方法に関する。

用語「治療有効量」は、本明細書では、対象において臨床的に有意な状態の改善を引き起こすのに十分な量または用量を意味するものとして使用される。

特に他の定義がない限り、本明細書で使用される専門用語や科学用語は、本発明が属する分野の当業者が一般的に理解するのと同じ意味を有する。

以下に示す実施例は、本発明をより詳細に例示するのに役立つが、それらの限定を構成するものではない。

ポリシアル酸（ＰＳＡ）フラグメントの特徴付けを示す図である。図１Ａは、分取用ＨＰＬＣ後の様々な画分を表した、加熱処置によるフラグメント化後の抽出物ＰＳＡ−１８０のポリアクリルアミドゲルを示しており、図１Ｂは、抽出物ＰＳＡ−１８０ならびにプールした画分２から６（ＰＳＡ−２０）および２６から３０（ＰＳＡ−６０）のポリアクリルアミドゲル電気泳動を示す図である。 Ｓｉｇｌｅｃ−１１を発現するヒトミクログリアにおける低分子量ＰＳＡ−２０の毒性を決定した結果を示す図である。図２Ａは、フローサイトメトリーによる、無関係のアイソタイプ抗体（アイソタイプコントロールＡｂ）に対する、ヒトミクログリア株におけるＳｉｇｌｅｃ−１１（Ｓｉｇｌｅｃ−１１Ａｂ）の細胞表面発現を示す。図２Ｂは、様々な濃度のモノシアル酸、オリゴシアル酸およびポリシアル酸で２４時間処置した後に、ＭＴＴアッセイによって決定され、細胞数に正規化した細胞の生存能力を示す。データは、ｎ＝３の独立した実験の平均±ＳＥＭとして示される。^＊＊＊ｐ＜０．００１、ＡＮＯＶＡとそれに続くボンフェローニ。 リポ多糖（ＬＰＳ、１μｇ／ｍｌ）および様々な濃度のモノシアル酸、オリゴシアル酸およびポリシアル酸で２４時間処置した後の、ヒトミクログリア細胞株のＴＮＦ−アルファに関する遺伝子転写物を示す図である。データは、ｎ＝３の独立した実験の平均±ＳＥＭとして示される。^＊ｐ＜０．０５、ＡＮＯＶＡとそれに続くボンフェローニ。 様々な濃度の低分子量ポリシアル酸（ＰＳＡ−２０；ＰＳＡと表示）および線維性アミロイドβ_１−４２（Ａβ、１０μＭ）の添加で処置した、ヒトミクログリア細胞のスーパーオキシド放出（ＤＨＥによって検出した場合）を示す図である。図４Ｂは、アミロイドβ_１−４２（コントロール、黒色のバー）で処置した後のミクログリアの、追加でトロロックスおよびＳＯＤ１で処置したミクログリアと比較した相対的なスーパーオキシド放出を示す。図４Ｃは、Ｉｂａ１に対する抗体で染色されたヒトミクログリア細胞株と、βチューブリンＩＩＩに対する抗体で染色されたヒト人口多能性幹細胞由来ニューロンとの共培養を示す。図４Ｄは、低分子量ポリシアル酸（ＰＳＡ−２０；ＰＳＡと表示）で処置したヒトミクログリア−ニューロン共培養における神経毒性に関する尺度としての、相対的な軸索突起の長さを示す。データは、ｎ＝３の独立した実験の平均±ＳＥＭとして示される。^＊＊ｐ＜０．０１、ＡＮＯＶＡとそれに続くボンフェローニ。図４Ｅは、線維性アミロイドβ_１−４２（Ａβ）またはＰＳＡ−２０およびＡβで処置して、ミクログリアのマーカータンパク質であるＩｂａ１およびニューロンのマーカータンパク質であるｂ−チューブリン−ＩＩＩに対する抗体で二重免疫染色した、ヒトミクログリアおよびニューロンを４８時間共培養した細胞を示す。スケールバー：１００μｍ。図４Ｆは、ヒトニューロンと、４８時間後にミクログリア、アミロイドβ_１−４２、またはミクログリアおよびアミロイドβ_１−４２を添加した後のニューロンとの相対的な軸索突起の長さを示す。データは、ｎ＝３の独立した実験の平均±ＳＥＭとして示される。^＊ｐ＜０．０５、ＡＮＯＶＡとそれに続くボンフェローニ。図４Ｇは、ニューロンの免疫染色により決定した場合のミクログリア−ニューロン共培養物中のヒトニューロンの相対的な軸索突起の長さを示す。データは、ｎ＝３の独立した実験の平均±ＳＥＭとして示される。^＊ｐ＜０．０５、ＡＮＯＶＡとそれに続くボンフェローニ。 リポ多糖によって誘導されたＳｉｇｌｅｃ−１１を発現するヒトマクロファージの腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−アルファ）産生に及ぼす低分子量ＰＳＡ−２０の影響を示す図である。図５Ａは、フローサイトメトリーによる、無関係のアイソタイプ抗体（アイソタイプコントロールＡｂ）に対するヒトマクロファージ株ＴＨＰ−１におけるＳｉｇｌｅｃ−１１（Ｓｉｇｌｅｃ−１１Ａｂ）の細胞表面発現を示す。図５Ｂは、リポ多糖（ＬＰＳ）によりミクログリアを活性化して様々な濃度のＰＳＡ−２０での処置した後のＴＮＦ−アルファの遺伝子転写を、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定してＧＡＰＤＨに正規化したもの示す。データは、ｎ＝３の独立した実験の平均±ＳＥＭとして示される。^＊＊＊ｐ＜０．００１、ＡＮＯＶＡとそれに続くボンフェローニ。 低分子量ＰＳＡ−２０での処置による、ヒト化Ｓｉｇｌｅｃ−１１トランスジェニックマウスの脳における炎症促進性サイトカインの低減を示す図である。図６Ａは、処置スキームを示し、図６Ｂは、脳により決定した場合のＴＮＦ−アルファに関する遺伝子転写物を示し、図６Ｃは、脾臓組織により決定した場合のＴＮＦ−アルファに関する遺伝子転写物を示す。データは、ｎ＝３の独立した実験の平均±ＳＥＭとして示される。ｐ＜０．０１、ＡＮＯＶＡとそれに続くボンフェローニ。 黄斑変性症の動物モデルにおけるＳｉｇｌｅｃ−１１を発現する網膜のミクログリアおよび血管漏出に及ぼす低分子量ＰＳＡ−２０の影響を示す図である。図７Ａは、ヒト網膜におけるＳｉｇｌｅｃ−１１の遺伝子転写物のＲＴ−ＰＣＲによる検出を示す。図７Ｂは、ドルーゼン様組織片（神経組織片（ｎｅｕｒａｌ ｄｅｂｒｉｓ））で刺激した後のミクログリアのスーパーオキシド放出に及ぼすＰＳＡ−２０（ＰＳＡ）の影響を示す。図７Ｃは、ヒト網膜色素上皮細胞から得られたドルーゼン様組織片およびトロロックスコントロールで刺激した後の、ミクログリアのスーパーオキシド放出に及ぼすＰＳＡ−２０の影響を示す。データは、少なくとも３回の独立した実験の平均±ＳＥＭとして示される。ＡＮＯＶＡと後のボンフェローニで、^＊ｐ≦０．０５；^＊＊ｐ≦０．０１。図７Ｄは、ヒト化Ｓｉｇｌｅｃ−１１トランスジェニックにおいて、ＰＳＡ−２０（３μｇ／眼）またはコントロール媒体を硝子体内注射した後の、レーザー損傷から４８時間後におけるＩｂａ−１に対する免疫染色によって決定した場合の総ミクログリアに対するアメーバ状活性化ミクログリアの関係を示す。図７Ｅは、ヒト化Ｓｉｇｌｅｃ−１１トランスジェニックマウスにＰＳＡ−２０（３μｇ／眼）またはコントロール媒体を硝子体内注射した後のレーザー損傷から４８時間後における血管漏出を示す。図７Ｆは、フルオレセイン血管撮影法を示し、図７Ｇは、実験グループ当たりの網膜の数を増加させた（ｎ≧８）、ヒト化Ｓｉｇｌｅｃ−１１トランスジェニックおよびコントロールマウスにおける、網膜のレーザー損傷およびＰＳＡ−２０（３μｇ／眼）またはコントロール媒体の硝子体内注射から４８時間後における血管漏出の分析を示す。図７ＢおよびＤでは、データは、平均±ＳＥＭとして示され、図７Ｅおよび図７Ｇでは平均±ＳＤとして示される。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１。 ＰＳＡ−２０またはコントロール媒体で処置した実験的自己免疫性脳脊髄炎のヒト化Ｓｉｇｌｅｃ−１１トランスジェニックマウスおよびコントロールマウスの臨床スコアを示す図である。図８Ａは、免疫化の日から２５日目までの、ＰＳＡ−２０またはコントロール媒体のいずれかで処置したマウスの平均±ＳＤとしての臨床スコアを示す。図８Ｂは、処置の１日目から２５日目までの、ＰＳＡ−２０またはコントロール媒体のいずれかで処置したＳｉｇｌｅｃ−１１トランスジェニックおよびコントロールマウスの累積的な疾患スコアを示す。データは、平均±ＳＥＭとして示される。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、ＡＮＯＶＡとそれに続くボンフェローニ。 パーキンソン病モデルにおけるＰＳＡ−２０の影響を示す図である。図９Ａは、左側に、未処置またはＰＳＡ−２０（ＰＳＡ）処置のいずれかの、ＬＰＳで活性化されたミクログリア（活性化ミクログリア）を含むニューロンの共焦点レーザー走査画像を示す。スケールバー：１００μｍ。図９Ａは、右側に、定量化した相対的な軸索分岐（ｎｅｕｒｉｔｅ ｂｒａｎｃｈｅｓ）の長さを示す。データは、平均±ＳＥＭとして示される。^＊＊＊ｐ＜０．００１、ＡＮＯＶＡとそれに続くボンフェローニ。図９Ｂは、左側に、神経組織片を取り込んだミクログリア細胞の共焦点３Ｄ再構成を示し、右側に、０．１５μＭ、０．５μＭまたは１．５μＭのＰＳＡ２０で処置したミクログリア細胞に関する食作用の、未処置コントロール細胞と比較したパーセンテージを示す。データは、ｎ＝３の独立した実験の平均±ＳＥＭとして示される。^＊ｐ＜０．０５、ＡＮＯＶＡとそれに続くボンフェローニ。図９Ｃは、左側に、ＰＳＡ−２０の前処置有りまたは無しでの、神経組織片によって引き起こされたミクログリアの、未処置細胞（ＵＴ）と比較した相対的なスーパーオキシド放出を示す。^＊ｐ＜０．０５、ＡＮＯＶＡとそれに続くボンフェローニ。図９Ｃは、右側に、ＰＳＡ−２０の前処置有りまたは無しでの、トロロックスおよびＳＯＤ１で処置した細胞およびコントロール細胞に関する神経組織片による、未処置細胞（ＵＴ）と比較した相対的なスーパーオキシド放出を示す。 ＰＳＡ−２０の薬物動態および薬物毒性を示す図である。図１０Ａは、様々な濃度のＰＳＡ−２０で２４時間処置した際のヒトニューロンの、未処置のコントロール（０）と比較した細胞生存能力を示す。データは、ｎ＝３の独立した実験の平均±ＳＥＭとして示される。^＊ｐ＜０．５、ＡＮＯＶＡ、その後、ＴａｍｈａｎｅのＴ２。図１０Ｂは、１μｇ／ｍｌのＬＰＳおよび様々な濃度のＰＳＡ−２０で２４時間処置した後のヒトミクログリア細胞株および未処置のコントロール（ＵＴ）のＴＮＦ−αに関する遺伝子転写物を示す。データは、平均±ＳＥＭとして示される。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１；^＊＊＊ｐ＜０．００１；ＡＮＯＶＡとそれに続くボンフェローニ。図１０Ｃは、適用前ならびに適用から０．５、１、２、４および８時間後の血清および脳中のＰＳＡ−２０の量（μｇ／ｍｌ）を示す。

ポリシアル酸のフラグメント化および分離
細菌によって産生され数々の手法により精製された市販の精製α２．８−ポリシアル酸（２５０ｍｇ、およそ７０ｋＤａの分子量を有するポリシアル酸、ＵＫ、Ｌｉｐｏｘｅｎ、ここではＰＳＡ−１８０と命名）を、フラグメント化に使用した。分取工程において、サンプルを８０℃で３０分間加熱して自発的な加水分解を誘導した。次いでＰＳＡを５３ｍｌのＨＲＰセファロース陰イオン交換カラム（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で処理し、２０５／２８０ｎｍでのＵＶ光度検出器（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）に連動させ、溶媒として流速４ｍｌ／分の２ＭのＮＨ_４ＨＣＯ_３緩衝液を利用する高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）システムによって分離した（表１）。それぞれ体積８ｍｌを有する９０本の試験管に流出液を収集した。連続３本の試験管をそれぞれプールして、３０画分のＰＳＡ−１８０を得た。

セファロース陰イオン交換カラムを用いたＨＰＬＣから得られた画分を収集した。画分２〜６をプールした（ここではＰＳＡ−２０と表示）。画分２６〜３０をプールした（ここでＰＳＡ−６０と表示）。残留した緩衝液を取り除くために、サンプルを凍結乾燥し、ＰＢＳまたは蒸留水中に溶解させた。ＰＳＡ−２０およびＰＳＡ−６０の濃度の定量化を、チオバルビツール酸ベースの方法を用いて行った。したがって、ポリマーを単一のｎ−アセチルノイラミン酸（シアル酸単量体）に加水分解するために、ポリシアル酸を１ＭのＨ_２ＳＯ_４で８０℃で１時間前処置した。第一の工程におけるそれぞれのサンプルの総体積は、５０μｌ（１０μｌのＰＳＡを含有する画分、加えて３０μｌのｄＨ_２Ｏ、加えて１０μｌの５ＭのＨ_２ＳＯ_４で構成される）と予想される。濃度決定のために、５０μｌ当たり濃縮形態の０〜５０μｇのｎ−アセチルノイラミン酸（ナカライテスク株式会社、日本）を含有する標準物質を調製した。標準物質および試験サンプルを、０．１２５ＭのＨ_２ＳＯ_４中の２５ｍＭ過ヨウ素酸２５μｌで処置し、３７℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション工程後、各サンプルに２０μｌの２％亜ヒ酸ナトリウム溶液（０．５ＮのＨＣｌ中）を添加し、過量の過ヨウ素酸塩を低減させた。室温で２分後、サンプルに、２００μｌの２−チオバルビツール酸（０．１Ｍ、ｐＨ９）を加えた。その後、加熱工程（９９℃で７．５分間）を行ったところ、赤色の複合体の形成が起こった。溶液を氷上で５分間冷却し、その後、５００μｌ／サンプルの酸性のブタノール（ブタン−１−オールに５％の１２ＮのＨＣｌを加える）と共に振盪した。高速の遠心分離により、相分離を促進した。カラフルな上部の相の強度を、スペクトロメーターにより５４９ｎｍで測定した。その後、ｎ−アセチルノイラミン酸標準物質に基づき定量化を行った。

分析のために、ＰＳＡ−１８０および別個の画分を、２０％ポリアクリルアミドゲル（全成分ともＲｏｔｈ ＧｍｂＨより）にローディングして、１３０Ｖでの電気泳動により４時間かけて分離した。「ステインオール」溶液（Ｒｏｔｈ ＧｍｂＨ）によりゲルを一晩染色し、その後蒸留水で洗浄した。図１Ａに、ＨＰＬＣでの分離前および分離後のフラグメント化したＰＳＡ−１８０のポリアクリルアミドゲルを示す。熱処置により、様々なサイズのフラグメントへのＰＳＡ−１８０の自発的な加水分解が起こった。図１Ａに、フラグメント化したＰＳＡ−１８０を示す。ＨＰＬＣでサイズによるフラグメントの分離を行ったところ、３０画分が生じた。画分２〜６（ＰＳＡ−２０）および画分２６〜３０（ＰＳＡ−６０）をそれぞれプールした（図１Ａ）。図１Ｂに、ＰＳＡ−１８０、ＰＳＡ−６０およびＰＳＡ−２０の別のポリアクリルアミドゲルを示す。元の材料であるＰＳＡ−１８０は、２５から８０ｋＤａの間の主要な分子サイズを有していた。図１Ｂからわかるように、画分２６〜３０は、およそ１４．２から３４ｋＤａの間の分子量を有していた（ＰＳＡ−６０）。プールした画分２〜６は、４．３から８．０ｋＤａの間の分子量を有していた。この低分子量ポリシアル酸（ＰＳＡ−２０）も図１Ｂに示す。

４．３から８．０ｋＤａの間の分子量のＰＳＡ−２０画分は、ｎ＝１４個の単量体からｎ＝２６個の単量体の鎖長に対応する。ＰＳＡ−２０画分中の５％未満のフラグメントは、それぞれ４．３ｋＤａより低い分子量または８．０ｋＤａよりも高い分子量を有していた。ＰＳＡ−２０画分のポリシアル酸フラグメントの平均分子量は、約４．９（ｎ＝１６個の単量体）から７．４ｋＤａ（ｎ＝２４個の単量体）の間であった。

大腸菌Ｋ１から調製されたポリシアル酸のフラグメント化および分離
大腸菌Ｋ１から調製されたおよそ７０ｋＤａの分子量を有する精製α２．８−ポリシアル酸（ＰＳＡ−１８０）を使用して、Ｂｉｃｅ Ｉ．ら、Ｅｎｇ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．２０１３、１３、２号、１４０〜１４８で説明されている通りに、ポリシアル酸のフラグメント化および分離を繰り返した。分取用ＨＰＬＣを使用した調製を、実施例１で説明されているようにして行った。上述したように、ＨＰＬＣ画分２から６をプールし、これをＰＳＡ−２０と表示した。

ピークサイズ分析のために、ＰＳＡ−２０および別個の画分を、２０％ポリアクリルアミドゲル（全成分ともＲｏｔｈ ＧｍｂＨより）にローディングし、１３０Ｖでの電気泳動により４時間かけて分離した。標準物質として公知のサイズを有する硫酸化デキストラン（ＴｄＢ Ｃｏｎｓｕｌｔａｎｃｙ）を使用した。その後ゲルを、ＧｏｌｄｂｅｒｇおよびＷａｒｎｅｒ（ＧｏｌｄｂｅｒｇおよびＷａｒｎｅｒ、１９９７）によるプロトコールによって、ステインオール溶液（３０ｍＭトリス、２５％イソプロパノール、７．５％ホルムアミドおよび０．０２５％（ｗ／ｖ）、ｐＨ８．８）を用いて室温で少なくとも２時間染色した。その後ゲルを、２５％イソプロパノールを包含する蒸留水で洗浄して、バックグラウンドをクリアにした。追加の工程として、硝酸銀（１２ｍＭ）溶液を使用して２０分間、および現像液（脱イオン水中、０．２８Ｍ炭酸ナトリウムと、０．１５％（ｖ／ｖ））を使用して５〜３０分間、ゲルを染色した。１０％酢酸で現像液の反応を止めた。

サイズ分布分析のために、ＰＳＡ−２０をＨＲＰ−セファロース陰イオン交換カラム（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で処理し、２０５／２８０ｎｍでのＵＶ光度検出器（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）に連動させた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）システムによって分析した。流出液を分析したところ、シアル酸単量体の数に応じた別個のピークを示した。保持時間から、ポリシアル酸の正確な長さが示された。規定の長さの６Ｎ−アセチルノイラミン酸ポリマーを有する標準物質（ナカライテスク株式会社、日本）を、コントロールとして使用した。

ゲル電気泳動から、プールした画分２から６（ＰＳＡ−２０）は、約４．９（ｎ＝１６個の単量体）から７．４ｋＤａ（ｎ＝２４個の単量体）の間の平均分子量を有していたことが確認された。分析用ＨＰＬＣによって決定した場合、合計で、ＰＳＡ−２０画分の９０重量％またはそれより多くが、ｎ＝１４個からｎ＝２６個の間の単量体のポリマー鎖長を有していた。ＰＳＡ−２０画分のｎ＝１４個の単量体からｎ＝２６個の単量体の鎖長は、４．３から８．０ｋＤａの間の分子量に対応する。それぞれ、ＰＳＡ−２０画分中のフラグメントの５重量％未満が、１４個未満の単量体（４．３ｋＤａより低い分子量）を有し、ＰＳＡ−２０画分中のフラグメントの５重量％未満が、２６個より多くの単量体（８．０ｋＤａより高い）を有していた。

これから、ＰＳＡ−２０の調製は再現可能であることが示された。後述する実験では、実施例１に従って調製されたＰＳＡ−２０を使用した。

様々なシアル酸型のミクログリアに対する細胞毒性の決定
異なる鎖長を有するシアル酸型の影響を研究するために、ＷＯ２０１０／１２５１１０で説明されているような人口多能性幹細胞由来ヒトミクログリア株を使用した。ヒトミクログリア細胞を、５μｇ／ｍｌのポリ−Ｌ−リジン（ｌｙｓｉｎ）（ＰＬＬ、Ｓｉｇｍａ）でコーティングした培養皿で、１％Ｎ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．４８ｍＭのＬ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）および任意選択で１００μｇ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）が補充されたＤＭＥＭ／Ｆ１２培養培地を含有するＮ２−培地（Ｇｉｂｃｏ）中で培養した。細胞を高密度で培養し、必要な場合に１：２に分けた。

図２Ａからわかるように、フローサイトメトリーによって、ヒトミクログリア株でＳｉｇｌｅｃ−１１が検出された。フローサイトメトリー分析のために、本発明者らの研究所で人口多能性幹細胞から生成された、ヒト人口多能性幹細胞由来ミクログリア株を、ポリクローナルビオチン化ヤギ抗ヒトＳｉｇｌｅｃ−１１一次抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、それに続いてストレプトアビジンコンジュゲート蛍光ＰＥ標識二次抗体（Ｄｉａｎｏｖａ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、Ｓｉｇｌｅｃ−１１のタンパク質発現に関して染色した。コントロールサンプルをコントロール抗体と共にインキュベートした。図２Ａからわかるように、フローサイトメトリー分析から、ミクログリア細胞の大部分においてＳｉｇｌｅｃ−１１の発現が確認された。

オリゴシアル酸およびポリシアル酸の様々な長さおよび画分の、ヒトミクログリア株に及ぼす影響を、単量体のシアル酸（ＳＡ、０．３ｋＤａの分子量、ナカライテスク株式会社、日本）および３個の単量体からなるシアル酸（トリ−ＳＡ；０．９ｋＤａの分子量、ナカライテスク株式会社、日本）および６個の単量体からなるシアル酸（ヘキサ−ＳＡ；１．９ｋＤａの分子量、ナカライテスク株式会社、日本）、１４から２６個の間の多数のシアル酸単量体を有するＰＳＡ（ＰＳＡ−２０；物質の９０％より多くが４．３から８ｋＤａの間の低分子量を有するＰＳＡ）、ならびに４６から１１０個の間のシアル酸単量体の長さを有するＰＳＡ（ＰＳＡ−６０；物質の９０％より多くが１４．２から３４ｋＤａの間の中分子量を有するＰＳＡ）での処置後の、細胞数に正規化した細胞の生存能力を決定することによって分析した。

上述したような培地中でミクログリア細胞を培養し、様々なシアル酸型を用いた培養で処置した。

様々な鎖長を有する別個のシアル酸型で処置してから２４時間後に、ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）アッセイによって細胞の生存能力(生存率)を決定し、細胞数に正規化した。生細胞における紫色のホルマザンの吸光度を、分光光度計（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｅｎｖｉｓｉｏｎマルチプレートリーダー）によって５７０ｎｍの波長で決定した。図２Ｂからわかるように、シアル酸単量体（ＳＡ）、３（トリ−ＳＡ）または６（ヘキサ−ＳＡ）単量体を有するオリゴシアル酸、および低分子量ポリシアル酸（ＰＳＡ−２０）は、ミクログリア細胞の代謝活性に影響を与えなかった。しかしながら、細胞の代謝活性は、中分子量ポリシアル酸（ＰＳＡ−６０）を０．１５μＭ、０．５μＭおよび１．５μＭの濃度で添加した後に有意に低減した。加えて、細胞の代謝活性は、高分子量ポリシアル酸（ＰＳＡ−１８０）を０．１５μＭ、０．５μＭおよび１．５μＭの濃度で添加した後に有意に低減した。

したがって、低分子量ＰＳＡ−２０は、Ｓｉｇｌｅｃ−１１を発現するヒトミクログリアにおいて毒性の兆候を引き起こさなかったが、中分子量ポリシアル酸（ＰＳＡ−６０）および高分子量ポリシアル酸（ＰＳＡ−１８０）は、ヒトミクログリア細胞の生存能力に影響を及ぼしたことを示すことができ、これは将来的な薬剤にとって不要な影響である。

活性化されたヒトミクログリアの腫瘍壊死因子−アルファ産生に及ぼす様々なシアル酸型の影響の決定
ポリシアル酸がヒトミクログリアの炎症促進性の表現型に干渉するかどうかを分析するために、培養されたヒトミクログリアをリポ多糖（ＬＰＳ）で活性化し、細菌毒素ＬＰＳにより誘導された炎症促進性サイトカインである腫瘍壊死因子−アルファの遺伝子転写に及ぼす、オリゴシアル酸画分やポリシアル酸画分を含む別個のシアル酸型の影響を決定した。様々な鎖長を有するシアル酸型の影響を研究するために、ＷＯ２０１０／１２５１１０で説明されているような人口多能性幹細胞由来ヒトミクログリア株を使用した。ヒトミクログリア細胞を、５μｇ／ｍｌのポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ、Ｓｉｇｍａ）でコーティングした培養皿で、１％Ｎ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．４８ｍＭのＬ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）および任意選択で１００μｇ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）が補充されたＤＭＥＭ／Ｆ１２培養培地を含有するＮ２−培地（Ｇｉｂｃｏ）中で培養した。細胞を高密度で培養し、必要な場合に１：２に分けた。ヒト人口多能性幹細胞由来ミクログリア株を、リポ多糖（ＬＰＳ、１μｇ／ｍｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および様々な鎖長を有するシアル酸型で２４時間処置した。腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−アルファ）に関する遺伝子転写物を、定量ＲＴ−ＰＣＲによって決定して、ＧＡＰＤＨに正規化した。詳細には、ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＲＮＡの単離を行い、スーパースクリプト第一鎖合成システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて転写を行った。特異的なオリゴヌクレオチド（ＧＡＰＤＨ：ＣＴＧＣＡＣＣＡＣＣＡＡＣＴＧＣＴＴＡＧ（配列番号１）およびＴＴＣＡＧＣＴＣＡＧＧＧＡＴＧＡＣＣＴＴ（配列番号２）；ＴＮＦα：ＧＡＣＡＡＧＣＣＴＧＴＡＧＣＣＣＡＴＧＴ（配列番号３）およびＡＧＧＡＣＣＴＧＧＧＡＧＴＡＧＡＴＧＡＧＧ（配列番号４））を用いた定量ＲＴ−ＰＣＲを、マスターサイクラーｅｐグラジェントＳ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）と共にＳＹＢＲグリーンＰＣＲマスターミックスを使用して行った。結果をＧＡＰＤＨに正規化した。デルタ−ＣＴ方法を使用した定量化を実行した。

図３からわかるように、単量体のノイラミン酸（ＳＡ）としてのシアル酸は、ＬＰＳによって誘導されたＴＮＦ−アルファの遺伝子転写を有意に変化させなかった。同様に、３または６個の長さを有するシアル酸（トリ−ＳＡ、ヘキサ−ＳＡ）も、ＬＰＳによって誘導されたＴＮＦ−アルファの遺伝子転写を有意に変化させなかった。対照的に、低分子量ＰＳＡ（ＰＳＡ−２０）は、図３から解釈できるように、ＬＰＳで刺激されたヒトミクログリアに対してドーズ依存性の効果を有していた。０．１５μＭ、０．５μＭおよび１．５μＭの濃度におけるＰＳＡ−２０は、炎症促進性サイトカインであるＴＮＦ−アルファの遺伝子転写を低減させた。また中型のＰＳＡ（ＰＳＡ−６０）も、図３からわかるように、ＬＰＳによって誘導されたサイトカインであるＴＮＦ−アルファの遺伝子転写を防止することにおいて有意な影響を有していた。しかしながら、高分子量ポリシアル酸（ＰＳＡ−１８０）の、ＬＰＳによって誘導されたサイトカインであるＴＮＦ−アルファの遺伝子転写に対する有意な抗炎症性作用は、図３からわかるように観察されなかった。

したがって、低分子量ポリシアル酸（ＰＳＡ−２０）は、ヒトミクログリアの炎症促進性サイトカイン産生を防止するということを理解することができる。

以下の表２に、細胞毒性を決定した結果、および実施例３から４で決定されたように、ヒトミクログリアの、リポ多糖によって誘導された腫瘍壊死因子−アルファ産生に及ぼす様々なシアル酸の影響の決定をまとめる。

実施例３から４および表２の要約から解釈できるように、低分子量ポリシアル酸（ＰＳＡ−２０）より小さいシアル酸フラグメント、すなわちシアル酸単量体（ＳＡ）、三量体（トリ−ＳＡ）、および六量体（ヘキサ−ＳＡ）は、ヒトミクログリアにおいて毒性の兆候を引き起こさないか、ヒトミクログリアにおいてＴＮＦ−アルファ放出に対する抗炎症性作用を有さないかのいずれかであった。一方で、中分子量ポリシアル酸（ＰＳＡ−６０）およびそれより高い分子量および鎖長を有する高分子量ポリシアル酸（ＰＳＡ−１８０）は、ヒトミクログリアの生存能力に影響を及ぼした。結果として、１４から２６個の単量体の範囲の鎖長を有する低分子量ポリシアル酸フラグメント（ＰＳＡ−２０）のみが、ヒトにおけるミクログリアの抗炎症療法および治療用途に好適であることが立証された。

ヒトミクログリアの活性酸素産生と、アミロイドβ_１−４２によって引き起こされるアルツハイマー病培養モデル系におけるミクログリアが介在する神経毒性とに及ぼす、低分子量ポリシアル酸（ＰＳＡ−２０）の影響の決定
アルツハイマー病は、凝集したアミロイドβ_１−４２ペプチドの細胞外蓄積から始まり、ミクログリアの活性化、活性酸素種の産生ならびにシナプスおよび軸索突起の喪失によって進行する神経変性疾患である。げっ歯類動物モデルは、好適なアルツハイマー病モデル系として部分的にしかヒト疾患をモデル化することができないため、共培養されたヒトニューロンとヒトミクログリアを使用し、そこに、ミクログリア細胞を刺激することが可能な線維性のアルツハイマー病関連アミロイドβ_１−４２ペプチドを添加した。実施例４で説明されているようにして人口多能性幹細胞由来ヒトミクログリア細胞株を使用した。

ａ）ヒトミクログリア細胞のスーパーオキシド産生に及ぼす低分子量ポリシアル酸の影響の決定
アルツハイマー病の脳組織の炎症性シグナル伝達を模擬するために、ヒトミクログリア細胞株を、ヒトアルツハイマー病関連の線維性アミロイド−ベータペプチド（Ａβ）で処置した。Ａβの線維性成分を得るために、合成アミロイド−ベータペプチド（アミロイド−ベータ１−４２、Ｂａｃｈｅｍ／Ｂｒｕｃｋｅｒ、１０μＭ）を３７℃で少なくとも３日間プレインキュベートした。ヒトミクログリア細胞を、様々な濃度の０．１５μＭ、０．５μＭ、または１．５μＭの低分子量ポリシアル酸（ＰＳＡ−２０）で６０分間処置し、続いて線維性Ａβと共に１５分間インキュベートした。次いで、スーパーオキシドのアニオンラジカル産生を測定するために、３０μＭジヒドロエチジウム（ＤＨＥ）を添加し、３７℃で１５分間インキュベートした。４％パラホルムアルデヒドと、０．２５％グルタルアルデヒドで細胞を固定し、共焦点顕微鏡法によって分析した。ＤＨＥ染色強度を定量化するために、実験ごとに６枚の図画を得て、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ）によって分析した。バックグラウンドを差し引いて、染色強度の平均値を比較した。細胞を固定し、ＤＨＥの強度を共焦点顕微鏡法によって定量化した。

図４Ａは、アルツハイマー病関連のアミロイド−ベータ（Ａβ）によって誘導されたスーパーオキシド放出に及ぼす様々な濃度のＰＳＡ−２０の影響を示す。低分子量ポリシアル酸（ＰＳＡ−２０）は、１．５μＭの濃度で、Ａβによって誘導されたスーパーオキシド放出を低減した（図４Ａ）。

ＤＨＥ測定の特異性を確認するために、ヒトミクログリア細胞におけるスーパーオキシド産生に及ぼすＰＳＡ−２０の影響の決定を繰り返した。コントロールとして、ラジカルスカベンジャーである、水溶性ビタミンＥ類似体のトロロックスを系に添加した。さらに、追加のコントロールとして、スーパーオキシドジスムターゼ−１（ＳＯＤ１）を培地に添加した。ＳＯＤ１によるスーパーオキシドの変換が成功した後には、スーパーオキシドは、ＤＨＥ色素によって検出できなくなると予想される。

ヒトミクログリア細胞を単独で培養し、アルツハイマー病のプラーク関連の線維性アミロイドβ_１−４２で処置した後、活性酸素種産生を分析した。ミクログリア細胞によるスーパーオキシドの相対的な産生を測定するために、４つのチャンバーを有する培養皿で細胞をプレーティングした。２４時間後、ヒトミクログリア細胞を１．５μＭの低分子量ポリシアル酸（ＰＳＡ−２０）で６０分間処置し、続いて１０μＭの線維性アミロイドβ_１−４２と共に１５分間インキュベートした。コントロールの培養皿を、１．５μＭのＰＳＡ−２０および４０μＭのトロロックス、または１．５μＭのＰＳＡ−２０および２０μｇ／ｍｌのスーパーオキシドジスムターゼ−１（ＳＯＤ１、Ｓｅｒｖａ）のいずれかで処置した。次いで、細胞をクレブス−ＨＥＰＥＳ−緩衝液で２回洗浄し、その後３０μＭのＤＨＥ溶液（クレブス−ＨＥＰＥＳ−緩衝液で希釈）と共に１５分間インキュベートした。最後に細胞をクレブス−ＨＥＰＥＳ−緩衝液で２回洗浄し、０．２５％グルタルアルデヒドおよび４％ＰＦＡを用いて１５分間固定した。共焦点レーザー顕微鏡検査法（Ｆｌｕｏｖｉｅｗ １０００、オリンパス）によって、合計で実験グループ当たり６枚の画像を無作為に収集した。収集された画像の全ての細胞を、Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェア（ＮＩＨ）によって分析した。

図４Ｂは、ミクログリアをアミロイドβ_１−４２で処置した後の、追加でトロロックスおよびＳＯＤ１で処置したミクログリアと比較した相対的なスーパーオキシド放出を示す。^＊ｐ＜０．０５、ＡＮＯＶＡとそれに続くボンフェローニ。図４Ｂから解釈できるように、アミロイドβ_１−４２でミクログリアを処置することで、スーパーオキシド産生が刺激されたが、１．５μＭのＰＳＡ−２０は、アミロイドβ_１−４２によって誘導されるスーパーオキシド産生の刺激を抑えた。トロロックスは、アミロイドβ_１−４２によって引き起こされるスーパーオキシド分子を捕捉した。加えて、スーパーオキシドジスムターゼ−１（ＳＯＤ１）がアミロイドβ_１−４２によって引き起こされるスーパーオキシド放出を中和したことから、細胞膜においてラジカルが産生されたことが示される。したがって、トロロックスおよびＳＯＤ１コントロールから、ＤＨＥが、スーパーオキシドの細胞外産生を検出したことが確認された。

これは、インビトロのモデルにおいてＰＳＡ−２０はヒトアルツハイマー病において神経保護作用があり、アルツハイマー病のプラーク関連の繊維性アミロイドβ_１−４２によって刺激されたヒトミクログリア細胞のスーパーオキシド産生を十分阻害したことを示す。

ｂ）ミクログリアの神経毒性に及ぼす低分子量ポリシアル酸（ＰＳＡ−２０）の影響の決定
次に、ヒトミクログリア株を、人口多能性幹細胞由来ニューロンと共に２４時間共培養し、ミクログリアの神経毒性に及ぼす低分子量ポリシアル酸（ＰＳＡ−２０；１．５μＭ）の影響を評価した。ヒトニューロンをヒト人口多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）から生成した。インビトロにおけるニューロンへの分化を短く改変したプロトコールを使用して実行し、これを使用して原始神経前駆体を誘導した。詳細に言えば、ｉＰＳ細胞をフィーダー細胞上で培養して、小さいコロニーを形成した。次に培地を、ＬＩＦならびに３種の小分子ＣＨＩＲ９９０２１（ＧＳＫ−３βの阻害剤）およびＳＢ４３１５４２（ＴＧＦ−βおよびアクチビン受容体の阻害剤）、および化合物Ｅ（γ−セクレターゼの阻害剤）の存在下で、１０日間、神経誘導培地に交換した。神経前駆体を拡大するために、アキュターゼによって細胞を単一の細胞に分離させて、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、ＣＨＩＲ９９０２１およびＳＢ４３１５４２の存在下で誘導培地を含むポリ−Ｌ−オルニチン／フィブロネクチンでコーティングした細胞培養皿でプレーティングした。ニューロンへの分化を誘導するために、神経前駆体細胞をアキュターゼによって分離させ、神経誘導培地中のポリ−Ｌ−オルニチン／ラミニンでコーティングした細胞培養皿に添加して、細胞を付着させて小さいコロニーを形成させた。次いで、培地を、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）およびグリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）を含むニューロン分化培地に２週間交換した。２日に１回培地を交換した。共培養実験のために、ヒトミクログリア細胞を掻き取り、これを、１：４のミクログリア：ニューロンの比率で、１．５μＭのＰＳＡ−２０含有および非含有のニューロン分化培地中でニューロンに２４時間添加した。細胞を洗浄し、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）中で１５分間固定し、ブロッキングし、ウシ血清アルブミン１０×（ＢＳＡ）および５％正常ヤギ血清（ｎＧＳ）および０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含有する溶液で６０分間透過処理した。次に、一次抗体（ニューロンに対してはβ−チューブリン−ＩＩＩ、ミクログリア細胞に対してはＩｂａ−Ｉ）で４℃で一晩、続いて二次抗体で室温で９０分間、細胞を免疫染色した。共焦点レーザー顕微鏡検査法（Ｆｌｕｏｖｉｅｗ １０００、オリンパス）によって条件ごとに１０枚の無作為な写真を撮り、Ｎｅｕｒｏｎ Ｊソフトウェア（ＮＩＨ）によってニューロン分岐（ｎｅｕｒｏｎａｌ ｂｒａｎｃｈｅｓ）の長さを測定した。

図４Ｃは、共培養の免疫染色を示す。共培養された細胞をパラホルムアルデヒドで固定して、ミクログリアのマーカータンパク質であるＩｂａ１およびニューロンのマーカータンパク質であるβチューブリンＩＩＩに対する抗体で、続いて適切な蛍光標識二次抗体で共に免疫染色した。図４Ｄは、共培養およびＰＳＡ−２０（ＰＳＡ）添加の２４時間後における、βチューブリンＩＩＩに対する抗体を用いたニューロンの免疫染色により決定した場合の相対的な軸索突起の長さを示す。ヒトミクログリア株は、相対的な軸索突起の長さを低減した。図４Ｄからわかるように、ＰＳＡ−２０は、ヒトニューロンに対するヒトミクログリアの神経毒作用を十分防止した。

ｃ）４８時間の共培養時間におけるミクログリアの神経毒性に及ぼす低分子量ポリシアル酸の影響の決定
ヒト人口多能性幹細胞由来ミクログリア（ｉＰＳｄＭ）を、ｉＰＳ細胞から得た。この研究には、ｉＬＢ−Ｃ−３５ｍ−ｒｌクローン（Ｂｏｎｎ）から生成したｉＰＳｄＭ−１株を使用した。ｉＰＳｄＭ−１（ここではミクログリアまたはミクログリア細胞と命名）を、１％Ｎ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．４８ｍＭのＬ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）および１００μｇ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）が補充されたＤＭＥＭ／Ｆ１２培養培地からなるＮ２−培地（Ｇｉｂｃｏ）中で培養した。細胞を高密度で培養し、１：５に分けた。層剥離後、細胞を回収し、新しい培養皿に再度付着させた。

ヒト胚性幹細胞から原始神経前駆体を得るために使用される改変されたプロトコールに従って、原始神経幹細胞（ｐＮＳＣ）の生成およびそれらのニューロンへの分化のために、ヒト由来多能性幹（ｉＰＳ）細胞（Ｆｏｒｅｓｋｉｎ−１、ＷｉＣｅｌｌ）を使用した。簡単に言えば、ｉＰＳ細胞をフィーダー細胞上で培養して、小さいコロニーを形成した。次に、培地を、白血病抑制因子（ＬＩＦ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、１０ｎｇ／ｍｌ）および３種の小分子ＣＨＩＲ９９０２１（ＧＳＫ−３βの阻害剤、Ａｘｏｎ Ｍｅｄｃｈｅｍ、４μＭ）およびＳＢ４３１５４２（ＴＧＦ−βおよびアクチビン受容体の阻害剤；Ａｘｏｎ Ｍｅｄｃｈｅｍ、３μＭ）、および化合物Ｅ（γ−セクレターゼの阻害剤；Ａｘｏｎ Ｍｅｄｃｈｅｍ、０．１μＭ）の存在下で１０日間、神経幹細胞培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２：Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ；ＧＩＢＣＯ）に交換した。ニューロンへの分化を誘導するために、ｐＮＳＣをアキュターゼ（ＰＡＡ）によって分離させ、ポリ−Ｌ−オルニチン（Ｓｉｇｍａ、０．１５ｍｇ／ｍｌ）と、ラミニン（Ｓｉｇｍａ、１μｇ／ｍｌ）でコーティングした細胞培養皿上で、神経幹細胞培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２：Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌと、ＬＩＦ、ＣＨＩＲ９９０２１およびＳＢ４３１５４２）の中で、細胞が付着して小さいコロニーが形成されるまで培養した。次いで、培地を、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ；１０ｎｇ／ｍｌ）およびグリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ；Ｐｒｏｓｐｅｃｔ、１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で２週間、ニューロン分化培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２と、Ｎ２およびＢ２７サプリメント、ＧＩＢＣＯ）に交換した。２日に１回、神経栄養因子を含有する培地を交換した。

共培養実験において、ミクログリアとニューロンとが１：５の比率のミクログリア細胞（ヒトｉＰＳ細胞由来ミクログリア株であるｉＰＳｄＭ１）および１μＭ繊維性アミロイドβ_１−４２を、実施例２に従って調製されたＰＳＡ−２０の存在または非存在下で、ｉＰＳ細胞由来ニューロンに４８時間添加した。ＰＳＡ−２０を用いないコントロール実験において、ｉＰＳ細胞由来ニューロンに、ミクログリア細胞、１μＭ繊維性アミロイドβ_１−４２、またはミクログリア細胞および１μＭ繊維性アミロイドβ_１−４２を４８時間添加し、一方でコントロールとしてｉＰＳ細胞由来ニューロンの単一培養を提供した。

細胞を４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で１５分間固定し、ブロッキングし、ウシ血清アルブミン（１０％ＢＳＡ）および正常ヤギ血清（５％ｎＧＳ）および０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含有する溶液で６０分間透過処理した。次に、ポリクローナルウサギ抗ｉｂａ１（Ｄａｋｏ）およびモノクローナル抗β−チューブリン−ＩＩＩ（Ｓｉｇｍａ）抗体を用いて４℃で一晩、続いてウサギＩｇＧに対する二次Ａｌｅｘａ４８８−コンジュゲート抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）およびマウスＩｇＧに対するＣｙ３−コンジュゲートヤギ抗体（Ｄｉａｎｏｖａ）を用いて室温で２時間、免疫染色した。共焦点レーザー顕微鏡検査法（Ｆｌｕｏｖｉｅｗ １０００、オリンパス）によって、実験設定ごとに１０枚の画像をから無作為に収集し、β−チューブリン−ＩＩＩで染色された軸索突起からのニューロン分岐の合計の長さの決定を、ＮＩＨのＩｍａｇｅＪ／ＮｅｕｒｏｎＪソフトウェアによって行った。

図４Ｅは、繊維性アミロイドβ_１−４２（Ａβ）またはＰＳＡ−２０およびＡβで処置して、ミクログリアのマーカータンパク質であるＩｂａ１およびニューロンのマーカータンパク質であるｂ−チューブリン−ＩＩＩに対する抗体で二重免疫染色した、ヒトミクログリアおよびニューロンの長期共培養の細胞を示す。スケールバー：１００μｍ。図４Ｅから解釈できるように、ＰＳＡ−２０の添加は、アミロイドβ_１−４２で処置した共培養物中で観察された軸索突起の喪失を防止した。

図４Ｆは、ＰＳＡ−２０を用いないコントロール実験のニューロンの免疫染色により決定した場合の、ヒトニューロンと、４８時間後にミクログリア、アミロイドβ_１−４２、またはミクログリアおよびアミロイドβ_１−４２を添加した後のニューロンとの相対的な軸索突起の長さを示す。データは、ｎ＝３の独立した実験の平均±ＳＥＭとして示される。^＊ｐ＜０．０５、ＡＮＯＶＡとそれに続くボンフェローニ。図４Ｆから解釈できるように、ミクログリアの添加は、相対的な軸索突起の長さを低減した。アミロイドβ_１−４２単独では相対的な軸索突起の長さに影響を与えなかったが、ミクログリア−ニューロン共培養物に添加された繊維性アミロイドβ_１−４２はさらに、相対的な軸索突起の長さを低減した。詳細には、相対的な軸索突起の長さを、１±０．０３から、ミクログリア添加後には０．７６±０．０２に、ミクログリアとアミロイドβ_１−４２との添加後には０．６４±０．０３に低減した。アミロイドβ_１−４２単独では、適用された濃度で、軸索突起を低減する影響はなかった。

図４Ｇは、ニューロンの免疫染色により決定した場合のミクログリア−ニューロン共培養物中のヒトニューロンの相対的な軸索突起の長さを示す。データは、ｎ＝３の独立した実験の平均±ＳＥＭとして示される。^＊ｐ＜０．０５、ＡＮＯＶＡとそれに続くボンフェローニ。図４Ｇから解釈できるように、ＰＳＡ−２０は、ミクログリアの全般的に軸索突起を低減する影響に干渉しなかったが、繊維性アミロイドβ_１−４２の軸索突起を低減する影響を十分に阻害した。詳細に言えば、繊維性アミロイドβ_１−４２の添加は、相対的な軸索突起の長さを０．７６±０．０２から０．６４±０．０３に低減したが、ＰＳＡ−２０での処置は、この神経毒作用を相殺した（０．８２±０．０３）。したがって、アミロイドβ_１−４２によって誘導された相対的な軸索突起の長さの低減は、ＰＳＡ−２０によって相殺された。

まとめると、ＰＳＡ−２０は、ヒト脳培養モデルにおいてアルツハイマー病関連のアミロイドβ_１−４２の神経毒性を防止したことを示すことができた。さらに、ＰＳＡ−２０は、ヒトミクログリアをアルツハイマー病関連のアミロイドβ_１−４２と共にインキュベートすることにより誘導された酸化ストレスも十分に阻害した。

ヒトマクロファージの炎症促進性サイトカイン産生に及ぼす低分子量ポリシアル酸の影響の決定
ヒト単球細胞株ＴＨＰ−１（ＡＴＣＣ ＴＩＢ−２０２）を、７５ｍｌ細胞培養フラスコ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）で、１０％ＦＣＳ、１％ピルビン酸ナトリウムおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシン（１００×）（全てＧｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＲＰＭＩ培地中で培養した。組織マクロファージへの分化のために、この細胞株を、０．５μＭの１３−酢酸１２−ミリスチン酸ホルボール（Ｓｉｇｍａ）を含有する正常細胞培養培地中で３時間培養し、その後１３−酢酸１２−ミリスチン酸ホルボール非含有培地で少なくとも２４時間培養した。

フローサイトメトリー分析を行って、Ｓｉｇｌｅｃ−１１を発現するヒトマクロファージ株におけるＳｉｇｌｅｃ−１１の発現を分析した。ＴＨＰ−１細胞を、ビオチン−コンジュゲートＳｉｇｌｅｃ−１１特異的抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、続いてストレプトアビジン−ＦＩＴＣで免疫染色した。無関係のアイソタイプ抗体（アイソタイプコントロール抗体；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、コントロールとして使用した（アイソタイプコントロールＡｂ）。細胞をフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ、ＢＤ）によって分析した。図５Ａからわかるように、フローサイトメトリーによって、ヒトマクロファージ株ＴＨＰ−１の部分集団でＳｉｇｌｅｃ−１１（Ｓｉｇｌｅｃ−１１Ａｂ）の発現が検出された。

図５Ｂは、炎症促進性サイトカインであるＴＮＦ−アルファに及ぼす低分子量ＰＳＡ（ＰＳＡ−２０）の影響を例示する。ヒトマクロファージ細胞株ＴＨＰ−１を、リポ多糖（ＬＰＳ、１μｇ／ｍｌ）およびＰＳＡ−２０（様々な濃度）で２４時間処置した。腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦα）に関する遺伝子転写物を、定量ＲＴ−ＰＣＲによって決定して、ＧＡＰＤＨに正規化した。詳細に言えば、ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＲＮＡの単離を行い、スーパースクリプト第一鎖合成システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて転写を行った。特異的なオリゴヌクレオチド（ＧＡＰＤＨ：ＣＴＧＣＡＣＣＡＣＣＡＡＣＴＧＣＴＴＡＧ（配列番号１）およびＴＴＣＡＧＣＴＣＡＧＧＧＡＴＧＡＣＣＴＴ（配列番号２）；ＴＮＦα：ＧＡＣＡＡＧＣＣＴＧＴＡＧＣＣＣＡＴＧＴ（配列番号３）およびＡＧＧＡＣＣＴＧＧＧＡＧＴＡＧＡＴＧＡＧＧ（配列番号４））を用いた定量ＲＴ−ＰＣＲを、マスターサイクラーｅｐグラジェントＳ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）と共にＳＹＢＲグリーンＰＣＲマスターミックスを使用して行った。結果をＧＡＰＤＨに正規化した。デルタ−ＣＴ方法を使用した定量化を実行した。図５Ｂからわかるように、低分子量ポリシアル酸（ＰＳＡ−２０）は、０．１５μＭおよび０．５μＭの濃度において、ＬＰＳによって誘導されたＴＮＦ−アルファの遺伝子転写を低減した。

したがって、実施例５および６から、低分子量ポリシアル酸ＰＳＡ−２０は、ミクログリアおよび他の組織マクロファージの広範な抗炎症性作用を有することが示される。実施例５において、ＰＳＡ−２０は、ミクログリアによる活性酸素種スーパーオキシドの産生を防止する。実施例６において、ＰＳＡ−２０は、ヒトマクロファージにおいて炎症促進性サイトカインであるＴＮＦ−アルファの産生を防止する。さらに実施例５は、低分子量ＰＳＡ−２０は、アミロイド−ベータによって誘導されたミクログリアによる活性酸素種産生および神経毒性を防止することを例示しており、したがってアルツハイマー病においてＰＳＡ−２０は神経変性を予防する有益な影響を有することが示唆される。

敗血症性脳症の動物モデルにおける、細菌毒素によって全身的にチャレンジされたマウスの脳での炎症促進性サイトカイン発現に及ぼす低分子量ポリシアル酸（ＰＳＡ−２０）の影響の決定
敗血症は、酸化ストレスおよび補体活性化の増加に関連する食細胞機能不全を特徴とする過剰な炎症性の状況を伴うことが多い。敗血症の際の過剰な炎症性の状況は、細菌性リポ多糖（ＬＰＳ）などの細菌から放出される生成物、加えて損傷を受けた細胞からの生成物によって引き起こされる。マクロファージなどの免疫細胞およびミクログリア細胞ならびに腫瘍壊死因子−ａ（ＴＮＦ−ａ）などのそれらの炎症性メディエータは、敗血症性脳症に関与する。

この実験では、ミクログリア中、Ｉｂａ１−プロモーターの下でヒトＳｉｇｌｅｃ−１１を発現するヒト化Ｓｉｇｌｅｃ−１１トランスジェニックマウス（Ｗａｎｇ Ｙの２００９年の学位論文、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｎｎ、ユニバーサルリソースネーム：ｕｒｎ：ｎｂｎ：ｄｅ：ｈｂｚ：５Ｎ−１８０９５）および野生型の同腹子のコントロールマウスを使用した。遺伝子転写分析のために、トリゾール、続いてＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて脳からＲＮＡを単離した。スーパースクリプトＩＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および六量体ランダムプライマー（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を用いてＲＮＡの逆転写を行い、特異的なオリゴヌクレオチドを用いた定量ＲＴ−ＰＣＲを、ＡＢＩ５７００配列検出システム（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）およびＡＢＩ５７００配列検出システムのための増幅プロトコールを使用して、ＳＹＢＲグリーンＰＣＲマスターミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により行った。以下のプライマーを使用した：ＴＮＦα用のフォワードプライマー：５’−ＴＣＴＴＣＴＣＡＴＴＣＣＴＧＣＴＴＧＴＧＧ−３’（配列番号５）、ＴＮＦα用のリバースプライマー：５’−ＡＧＧＧＴＣＴＧＧＧＣＣＡＴＡＧＡＡＣＴ−３’（配列番号６）、ＧＡＰＤＨ用のフォワードプライマー：５’−ＡＣＡＡＣＴＴＴＧＧＣＡＴＴＧＴＧＧＡＡ−３’（配列番号７）、ＧＡＰＤＨ用のリバースプライマー：５’−ＧＡＴＧＣＡＧＧＧＡＴＧＡＴＧＴＴＣＴＧ−３’（配列番号８）。融解曲線の分析によって増幅特異性を確認した。プライマー対ごとの反応効率を確立した後、ＡＢＩ５７００配列検出システムｖ．１．３を用いて結果を分析した。デルタ−ＣＴ方法を使用した定量化を実行した。

図６Ａは、ヒト化Ｓｉｇｌｅｃ−１１トランスジェニックマウス（Ｓｉｇｌｅｃ１１）および同腹子のコントロールマウス（コントロールマウス）のための処置スキームを示す。４×リポ多糖（サルモネラ・アボルタス・エクイ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ａｂｏｒｔｕｓ ｅｑｕｉ）Ｓ型（ＥＮＺＯ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）由来ＬＰＳ、体重１グラム当たり１μｇ）または４×ＬＰＳ（体重１グラム当たり１μｇ）と、４×ＰＳＡ−２０（体重１グラム当たり１μｇ）または４×ＰＢＳのいずれかでマウスを腹腔内処置した。ＬＰＳ、ＰＢＳおよびＰＳＡ−２０を４日間毎日適用した。最後の適用から２４時間後にマウスを分析した。

最後の適用から２４時間後に、全ての脳組織からＴＮＦ−アルファに関する遺伝子転写物をｑＲＴ−ＰＣＲによって決定した。図６Ｂは、ＰＳＡ−２０またはコントロール媒体で処置したＳｉｇｌｅｃ−１１トランスジェニックマウスおよびコントロールマウスの脳からの正規化した遺伝子転写物を示す。ＰＳＡ−２０で処置したＳｉｇｌｅｃ−１１トランスジェニックマウスは、脳組織においてＴＮＦ−アルファの遺伝子転写レベルの低減を示した。図６Ｃは、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定した場合の、最後の適用から２４時間後の脾臓におけるＴＮＦ−アルファに関する遺伝子転写物を示す。脾臓では、転写レベルの変化は観察されなかった。

まとめると、ＰＳＡ−２０は、脳において炎症促進性サイトカインであるＴＮＦ−αの遺伝子転写の増加を抑え、それによって脳の炎症が予防されることを示すことができた。したがって、亜致死性敗血症動物モデルにおいて、ＰＳＡ−２０は、全身適用後に脳の炎症および敗血症性脳症を予防することができる。

網膜の黄斑変性症の動物モデルにおける低分子量ポリシアル酸（ＰＳＡ−２０）の硝子体内注射
これらの実験では、ヒト網膜、ヒトミクログリアおよびヒト化Ｓｉｇｌｅｃ−１１トランスジェニックマウス（Ｗａｎｇ Ｙの２００９年の学位論文、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｎｎ、ユニバーサルリソースネーム：ｕｒｎ：ｎｂｎ：ｄｅ：ｈｂｚ：５Ｎ−１８０９５）および同腹子のコントロールマウスを使用した。

ａ）ヒト網膜におけるＳｉｇｌｅｃ−１１の遺伝子転写の分析
まず、ヒト網膜におけるＳｉｇｌｅｃ−１１の遺伝子転写を分析した。ヒト網膜のトータルＲＮＡを生検から単離した。スーパースクリプトＩＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびランダム六量体プライマー（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を使用してＲＮＡの逆転写を行った。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってｃＤＮＡを３５サイクルで増幅した。反応のために、１μｇの各試験ｃＤＮＡを使用した。使用されたＰＣＲプログラムは、９４℃で２分で最初の変性、９４℃で９０秒で変性、６２．５℃で１分でアニーリング、６８℃で１分で伸長、６８℃で１０分で最後の伸長であった。プライマー配列は、結果として３５２ｂｐのＰＣＲ産物をもたらすフォワードＡＣＡＧＧＡＣＡＧＴＣＣＴＧＧＡＡＡＡＣＣＴ（配列番号９）およびリバースＡＧＧＣＡＧＧＡＡＣＡＧＡＡＡＧＣＧＡＧＣＡＧ（配列番号１０）であった。プライマーは、１０ｐＭの濃度で使用された。試験ｃＤＮＡサンプルを、Ｃ５７ＢＬ／６コントロールマウスおよびＳｉｇｌｅｃ−１１トランスジェニックマウスの脳、加えてヒト網膜から得た。網膜の非転写ＲＮＡを、ＰＣＲ陰性コントロールとして利用した。図７Ａからわかるように、ヒト網膜でＳｉｇｌｅｃ−１１に関する遺伝子転写物が検出された。

ｂ）神経組織片で刺激されたミクログリアに及ぼすＰＳＡ−２０の影響の決定
第二に、神経組織片で刺激されたミクログリアに及ぼすＰＳＡ−２０の影響を分析した。ドルーゼンを含有する組織片は、老人性黄斑変性症の特徴の一つである。網膜のミクログリアに及ぼす変性物質の影響を研究するために、本発明者らは、人口多能性幹細胞由来ヒトニューロンを低張でかつ機械的に溶解させることによって神経組織片を調製した。次いで、本発明者らは、人口多能性幹細胞由来ヒトミクログリア株を処置して、ＰＳＡ−２０の影響を分析した。スーパーオキシド放出を、蛍光色素であるＤＨＥによって決定した。神経組織片およびＰＳＡ−２０またはコントロール媒体（ＰＢＳ）を添加した後、スーパーオキシドのアニオンラジカル産生を測定するために、３０μＭジヒドロエチジウム（ＤＨＥ）を添加して３７℃で３０分間インキュベートした。４％パラホルムアルデヒドと、０．２５％グルタルアルデヒドで細胞を固定し、共焦点顕微鏡法によって分析した。ＤＨＥ染色強度を定量化するために、実験ごとに６枚の図画を得て、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ）によって分析した。バックグラウンドを差し引いて、染色強度の平均値を比較した。細胞を固定し、ＤＨＥの強度を共焦点顕微鏡法によって定量化した。図７Ｂで示されるように、神経組織片の添加は、ミクログリアによるスーパーオキシド産生を増加させた。図７Ｂからわかるように、ＰＳＡ−２０は、神経組織片によって誘導されるミクログリアによるスーパーオキシド産生の増加を防止した。

神経組織片で刺激されたミクログリアに及ぼすＰＳＡ−２０の影響の決定を上述したようにして繰り返し、ただしスーパーオキシド産生を捕捉するためのコントロールとして、トロロックス（６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸）、水溶性ビタミンＥ類似体を使用した。さらに、上述したようにしてミクログリアを組織片でチャレンジしたが、神経組織片の代わりにより多くのドルーゼン様組織片を適用した。

網膜からドルーゼン様組織片を得るために、ヒト網膜色素上皮ＡＲＰＥ−１９細胞を、８０ｎＭオカダ酸で、３７℃および５％ＣＯ２で２４時間処置し、遠心分離し、ＰＢＳで３回洗浄し、ペレットを−２０℃で凍結した。培養したヒトミクログリアを、１０μｇ／ｍｌのＰＳＡ−２０の存在または非存在下で、５μｇ／μｌの網膜色素上皮組織片および３０μＭジヒドロエチジウム（ＤＨＥ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共に３７℃で３０分間インキュベートした。コントロール媒体はＰＢＳのみを使用して行われた。コントロールとして、ラジカルスカベンジャーであるトロロックス（４０μＭ）を添加した。細胞を固定し、スーパーオキシド放出をＤＨＥ色素の強度によって定量化した。図７Ｃは、ドルーゼン様組織片およびトロロックスコントロールで刺激した後のミクログリアのスーパーオキシド放出に及ぼすＰＳＡ−２０（ＰＳＡ２０）の影響を示す。図７Ｃから解釈できるように、ドルーゼン様神経組織片の添加は、ミクログリアによるスーパーオキシド産生を増加させたが、ＰＳＡ−２０はミクログリアによるスーパーオキシド産生の増加を十分防止した。詳細に言えば、ＰＳＡ−２０は、ドルーゼン様神経組織片で刺激されたヒトミクログリア細胞による相対的なスーパーオキシド産生を１．３８±０．０２から０．９２±０．２２に低減した。これから、ＰＳＡ−２０は、ドルーゼン様組織片でチャレンジされたヒトミクログリアの酸化的バースト（ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｂｕｒｓｔ）を十分防止したことが示される。

ｃ）黄斑変性症の動物モデルにおけるＰＳＡ−２０の影響の決定
レーザー技術により黄斑変性症の動物モデル症を誘発した。レーザーを使用したマウス網膜の実験的な傷害は、加齢性黄斑変性症に関して広く容認されている動物モデルである。ブルック膜のレーザー凝固と直接的な傷害により、急速にミクログリアおよび補体の活性化が起こり、血管漏出が誘発される。蛍光血管撮影法は、網膜中の血管漏出を検出するための確立された方法である。

この実験では、ヒト化Ｓｉｇｌｅｃ−１１トランスジェニックマウス（Ｗａｎｇ Ｙの２００９年の学位論文、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｎｎ、ユニバーサルリソースネーム：ｕｒｎ：ｎｂｎ：ｄｅ：ｈｂｚ：５Ｎ−１８０９５）または同腹子のコントロールマウスを使用した。

マウスの網膜中に３つのアルゴンレーザーによる凝固スポットを誘発した（１２５ｍＷ、１００ｍｓ、１００μｍ、Ｖｉｒｉｄｉｓ、Ｑｕａｎｔｅｌ Ｍｅｄｉｃａｌ、Ｆｒａｎｃｅ）。その直後、マウスにＰＳＡ−２０（３μｇ／眼）またはＰＢＳコントロール媒体を硝子体内注射した。

レーザー損傷から４８時間後に、免疫組織化学によって網膜組織を分析した。そのため、ポリクローナルウサギ抗イオン化カルシウム結合アダプター分子１（Ｉｂａ１）抗体、続いてウサギ免疫グロブリン（ＩｇＧ）に対するフルオレセイン（ＦＩＴＣ）−コンジュゲート二次抗体で、全載免疫染色を行った。網膜からの内網状層の共焦点像を収集し、ＰＳＡ−２０で処置したＳｉｇｌｅｃ−１１およびコントロールマウスのレーザー損傷の内部および外部における、総Ｉｂａ１陽性ミクログリアに対するアメーバ状活性化ミクログリアのパーセンテージを決定した。図７Ｄからわかるように、Ｓｉｇｌｅｃ−１１トランスジェニックマウスにおいて、コントロール媒体（ＰＢＳ）注射後、ミクログリアは、レーザー損傷内部でアメーバ状の活性化型を示したが、低分子量ポリシアル酸ＰＳＡ−２０の注射後、レーザー損傷の内部でミクログリアの活性化は抑制された。正常なマウスでは、ミクログリアのＩｂａ１免疫反応性に及ぼすＰＳＡ−２０の影響は観察されなかった。図７Ｄからわかるように、ＰＳＡ−２０で処置したＳｉｇｌｅｃ−１１トランスジェニックマウスにおいて、ミクログリアの活性化は有意に低減した。

炎症が介在する血管漏出を決定するために、網膜のレーザー凝固傷害から４８時間後にフルオレセイン血管撮影法を用いた。詳細に言えば、麻酔した動物に、０．９％滅菌ＮａＣｌ中の０．１ｍｌの２．５％フルオレセインを腹腔内注射した。血管漏出を可視化するために、フルオレセイン注射の１１分後に、Ｓｐｅｃｔｒａｌｉｓ ＨＲＡ２網膜血管造影装置（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）で後期の血管撮影写真を撮った。Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇのアイ・エクスプローラー・ソフトウェアから血管撮影写真をｊｐｅｇファイルとしてエクスポートした。写真１枚当たり６つの関心領域（ｒｏｉ）のピクセル強度をＩｍａｇｅＪで定量化し、バックグラウンドの蛍光を差し引いた。

血管撮影法の４８時間前に、Ｓｉｇｌｅｃ−１１トランスジェニックまたは同腹子のコントロールマウスの網膜中に３つのアルゴンレーザーによる凝固スポットを誘発した（１２５ｍＷ、１００ｍｓ、１００μｍ、Ｖｉｒｉｄｉｓ、Ｑｕａｎｔｅｌ Ｍｅｄｉｃａｌ、Ｆｒａｎｃｅ）。マウスにＰＳＡ−２０（３μＭ／眼）またはＰＢＳコントロール媒体を硝子体内注射した。図７Ｅからわかるように、ＰＳＡ−２０を注射したＳｉｇｌｅｃ１１動物は、ＰＢＳを注射したコントロールおよびＳｉｇｌｅｃ１１マウスと比較して有意に低減した血管漏出（血管撮影法によって決定した場合）を示した。統計学的に有意なグループを、一元配置ＡＮＯＶＡおよびスチューデントのｔ検定によって決定した。

この血管漏出の低減に及ぼすＰＳＡ−２０の影響の有意性および信頼度を確認するために、上述したようにして決定を繰り返したが、実験グループ当たり網膜の数を少なくとも８つ増加させ、観察者、すなわち盲検化した評価者を用いた。

再度、上述したようにヒト化Ｓｉｇｌｅｃ−１１トランスジェニックマウスまたは同腹子のコントロールにおいて網膜のレーザー傷害を誘発した。その後、ＰＳＡ−２０またはＰＢＳコントロール媒体を硝子体内注射した。網膜のレーザー凝固から４８時間後に、炎症が介在する血管漏出を決定するために、フルオレセイン血管撮影法を行った。図７Ｆは、血管撮影写真を示し、図７Ｇは、右側に、網膜の血管漏出の分析を示す。単一のデータポイントは、分析された個々の眼を提示する。通常の一元配置ＡＮＯＶＡ、続いてテューキーの多重比較検定によってデータを分析した。ＰＳＡ−２０を注射したＳｉｇｌｅｃ−１１トランスジェニック動物は、血管撮影法によって決定した場合、ＰＢＳを注射した同腹子のコントロールおよびＳｉｇｌｅｃ−１１マウスと比較して有意に低減した血管漏出を示した（図７Ｆ）。詳細に言えば、Ｓｉｇｌｅｃ−１１トランスジェニックマウスをＰＳＡ−２０で処置した後、血管漏出は、１１７．８±７．８から８４．０７±８．２に低減した。したがって、ＰＳＡ−２０は、レーザー損傷を受けたＳｉｇｌｅｃ−１１トランスジェニックマウスにおいて血管漏出を有意に低減させた。

ｄ）ヒト網膜におけるオリゴ／ポリシアル酸の生理学的な発現の決定
オリゴ／ポリシアル酸の生理学的な発現に関して、長鎖ポリシアル酸（ＰＳＡ−ＮＣＡＭ）、短鎖ＰＳＡ（ＣＤ５６）およびシアル酸三量体（Ａ２Ｂ５）の免疫染色によってヒト網膜を分析した。網膜をスライスし、−８０℃で凍結した。染色のために、スライドを室温で１０〜１５分間乾燥させ、ＰＢＳで２回洗浄した。切片を、１０％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｓｉｇｍａ）、５％ヤギ血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００で２０〜３０分間ブロッキングした。切片を、以下の一次抗体：ウサギ抗Ｉｂａ１（１：１０００、和光）、マウス抗ＰＳＡ−ＮＣＡＭ（１：５００、ポリシアル酸、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ラット抗ＣＤ５６（１：２００、オリゴシアル酸、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）またはマウス抗Ａ２Ｂ５（１：２００、トリシアル酸、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の１種と共に４℃で一晩インキュベートした。切片をＰＢＳで３回洗浄し、次いで対応するＣｙ３−コンジュゲート二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ）と共に室温で４時間インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄工程を行った後、切片を核色素ＴＯ−ＰＲＯ（登録商標）ヨウ化物（１：２０００、ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と共に室温で１５分間インキュベートし、ムービオーラにマウントした。細胞核をＴＯ−ＰＲＯ（登録商標）（核染色）で対比染色した。対応するアイソタイプ抗体を、コントロールとして使用した。少なくとも３回の独立した実験からの代表的な画像を分析した。網膜の外側では３種全てのシアル酸種が弱く発現されたが、内網状層（ＩＰＬ）、ヒト網膜の神経節細胞層（ＧＣＬ）および神経線維層中では強い発現が見出された。内網状層および神経節細胞層中ではオリゴシアル酸／ポリシアル酸が検出された。これから、ポリシアル酸は網膜の正常な成分であるため、ＰＳＡ−２０がこの機能を模擬することが可能になることが示される。

まとめると、黄斑変性症の動物モデルにおいて硝子体内に適用されたＰＳＡ−２０は、病原性のミクログリア活性化を防止し、血管漏出を低減したことを示すことができた。具体的な理論に縛られるつもりはないが、ポリシアル酸は、網膜の正常な神経保護性の成分であるため、ＰＳＡ−２０がこの機能を模擬することが可能になると考えられる。したがって、ＰＳＡ−２０は、黄斑変性症の動物モデルにおいて、網膜のミクログリア活性化および変性関連の血管漏出を防止することができる。

多発性硬化症の動物モデルにおける低分子量ポリシアル酸（ＰＳＡ−２０）の腹膜内注射
ヒト化Ｓｉｇｌｅｃ−１１トランスジェニックマウス（ヒト化Ｓｉｇｌｅｃ−１１マウス）および同腹子のコントロールマウス（正常なコントロールマウス）において、実験的自己免疫性脳脊髄炎を誘発した。したがって、６〜８週齢の成体雌ヒト化Ｓｉｇｌｅｃ−１１トランスジェニックマウス（Ｗａｎｇらの２００９年の学位論文、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｎｎ、ユニバーサルリソースネーム：ｕｒｎ：ｎｂｎ：ｄｅ：ｈｂｚ：５Ｎ−１８０９５）および同腹子のコントロールマウスを、不完全フロイントアジュバント中の１００μｇのミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質ＭＯＧ（アミノ酸３５〜５５；Ｓｅｑｌａｂ）（両方ともＤＩＦＣＯ；ＢＤ ＧｍｂＨ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で免疫化した。免疫化の０日目および２日目に、百日咳毒素（２００ｎｇ；Ｌｉｓｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｅｐｓｏｍ、ＵＫ）を注射した。臨床兆候を以下の通りにスコア付けした：０、臨床兆候なし；１、完全な尾の引きずり；２、完全な尾の引きずりおよび後脚の衰弱；３、少なくとも１本の後脚の対不全麻痺；４、完全な後脚の対不全麻痺および前脚の衰弱；ならびに５、前脚と後脚の麻痺または瀕死。２０日目までに疾患が発病したマウス（≧１の臨床スコア）だけを実験に使用した。

疾患が発病した日に（少なくとも１の臨床スコア）、続いてそれから３日間連続して毎日、低分子量ＰＳＡ−２０（体重１ｇ当たり１μｇ）をマウスの腹腔内に適用した。図８Ａから解釈できるように、ＰＳＡ−２０で処置したヒト化Ｓｉｇｌｅｃ−１１トランスジェニックマウスは、１４日目以降、コントロール媒体で処置したマウスと比較して改善された臨床兆候を示した。処置の１日目から２５日目までの累積的な疾患スコアを決定した。図８Ｂからわかるように、ＰＳＡ−２０での処置は、疾患の臨床兆候を改善した。

したがって、実施例７から９より、ＣＮＳおよび網膜の様々な神経変性および神経炎症性疾患モデルにおいて、低分子量ポリシアル酸（ＰＳＡ−２０）は、マイクロモル濃度の範囲で有益な治療効果を有することが示される。実施例７からわかるように、ＰＳＡ−２０は、細菌毒素であるＬＰＳで全身的にチャレンジされた後に脳の炎症促進性反応を防止することから、敗血症性脳症および全身性炎症関連のアルツハイマー病の進行に対して有益な治療効果があることが示唆される。実施例８からわかるように、黄斑変性症の動物モデルにおいて、ＰＳＡ−２０は、網膜において、ミクログリアの活性化、ミクログリアによるスーパーオキシド産生および炎症関連の血管漏出を防止する。実施例９からわかるように、多発性硬化症の動物モデルにおいて、ＰＳＡ−２０は、疾患の症状を予防する。興味深いことに、動物モデルにおける全てのＰＳＡ−２０の影響が、ヒト化Ｓｉｇｌｅｃ−１１トランスジェニックマウスで観察された。

ヒト培養モデル系においてパーキンソン病関連の酸化ストレスにより誘導された神経変性のＰＳＡ−２０による処置
パーキンソン病は、主としてドーパミン作動性ニューロンに影響を及ぼし、活性化ミクログリアおよび活性酸素種産生の増加が関与する神経変性疾患である。脳中の酸化ストレスの増加が、パーキンソン病の主要な特徴である。また、一次食作用（ファゴプトーシス（ｐｈａｇｏｐｔｏｓｉｓ）と命名）による神経変性も説明されている。ＬＰＳなどの毒素の適用を、パーキンソン病に関する動物モデルとして使用した。げっ歯類動物モデルは、げっ歯類とヒトとの種間の差のためにヒト慢性神経変性疾患モデルに限定的な適性しか有さないため、近年、パーキンソン病のＬＳＰ毒素によって誘導された動物モデルの代用品として、ヒトニューロンおよびヒトミクログリアのヒト毒素および組織片によって誘導された培養モデル系が使用されている。

パーキンソン病モデル系として、毒素リポ多糖（ＬＰＳ）で刺激したヒトニューロンおよびヒトミクログリアを使用した。ヒトニューロンとヒトミクログリアの両方を、人口多能性幹細胞から誘導した。ミクログリアの酸化性の傷害による軸索突起の喪失を決定した。さらに、変性した神経細胞（神経組織片）で刺激されたミクログリアの食作用および酸化的バーストを決定した。

細胞培養
ヒト人口多能性幹細胞由来ミクログリア（ｉＰＳｄＭ）を、人口多能性幹（ｉＰＳ）細胞から誘導した。この研究には、ｉＬＢ−Ｃ−３５ｍ−ｒｌクローン（Ｂｏｎｎ）から生成したミクログリアｉＰＳｄＭ株１（ｉＰＳｄＭ−１）を使用した。ｉＰＳｄＭ−１（ここではミクログリアまたはミクログリア細胞と命名）を、１％Ｎ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．４８ｍＭのＬ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）および１００μｇ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）が補充されたＤＭＥＭ／Ｆ１２培養培地からなるＮ２−培地（Ｇｉｂｃｏ）中で培養した。ヒト胚性幹細胞から原始神経前駆体を得るために使用される改変されたプロトコールに従って、原始神経幹細胞（ｐＮＳＣ）の生成およびそれらのニューロンへの分化のために、ヒト由来多能性幹（ｉＰＳ）細胞（Ｆｏｒｅｓｋｉｎ−１、ＷｉＣｅｌｌ）を使用した。簡単に言えば、ｉＰＳ細胞をフィーダー細胞上で培養して、小さいコロニーを形成した。次に、培地を、白血病抑制因子（ＬＩＦ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、１０ｎｇ／ｍｌ）および３種の小分子ＣＨＩＲ９９０２１（ＧＳＫ−３βの阻害剤、Ａｘｏｎ Ｍｅｄｃｈｅｍ、４μＭ）およびＳＢ４３１５４２（ＴＧＦ−βおよびアクチビン受容体の阻害剤；Ａｘｏｎ Ｍｅｄｃｈｅｍ、３μＭ）、および化合物Ｅ（γ−セクレターゼの阻害剤；Ａｘｏｎ Ｍｅｄｃｈｅｍ、０．１μＭ）の存在下で１０日間、神経幹細胞培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２：Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ；ＧＩＢＣＯ）に交換した。ニューロンへの分化を誘導するために、ｐＮＳＣをアキュターゼ（ＰＡＡ）によって分離させ、ポリ−Ｌ−オルニチン（Ｓｉｇｍａ、０．１５ｍｇ／ｍｌ）と、ラミニン（Ｓｉｇｍａ、１μｇ／ｍｌ）でコーティングした細胞培養皿で、神経幹細胞培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２：Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌと、ＬＩＦ、ＣＨＩＲ９９０２１およびＳＢ４３１５４２；ＧＩＢＣＯ）中で、細胞が付着して小さいコロニーが形成されるまで培養した。次いで、培地を、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ；Ｐｒｏｓｐｅｃｔ、１０ｎｇ／ｍｌ）およびグリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ；１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で２週間、ニューロン分化培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２と、Ｎ２およびＢ２７サプリメント、ＧＩＢＣＯ）に交換した。２日に１回、神経栄養因子を含有する培地を交換した。

ａ）ヒトＬＰＳ毒素によって誘導されたミクログリア−ニューロン共培養系中でのＰＳＡ−２０の神経保護作用の決定
ｉＰＳ細胞由来ヒトニューロンを、１．５μＭのＰＳＡ−２０の存在または非存在下で、ヒトの正常なリポ多糖（ＬＰＳ）で事前に活性化されたミクログリア（活性化ミクログリア）と４８時間共培養した。活性化ミクログリアにおいて、パーキンソン病で説明したような酸化ストレスが１μｇ／ｍｌのＬＰＳ毒素によって誘導された。ＰＳＡ−２０の非存在または存在下で、ヒトニューロンにヒトミクログリア細胞を１：５（ミクログリア：ニューロン）の比率で４８時間添加した。次いで、細胞を４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ、Ｓｉｇｍａ）で１５分間固定し、ブロッキングし、１０％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｓｉｇｍａ）および５％正常ヤギ血清（ｎＧＳ、Ｄｉａｎｏｖａ、Ｈａｍｂｕｒｇ）および０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（細胞核染色用、０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、Ｓｉｇｍａ）を含有する溶液で６０分間透過処理した。次に、モノクローナル抗−β−チューブリン−ＩＩＩ（Ｓｉｇｍａ）およびポリクローナルウサギ抗ｉｂａ１（Ｄａｋｏ）抗体を用いて４℃で一晩、続いてウサギＩｇＧに対する二次Ａｌｅｘａ４８８−コンジュゲート抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）およびマウスＩｇＧに対するＣｙ３−コンジュゲートヤギ抗体（Ｄｉａｎｏｖａ）を用いて室温で２時間、細胞を免疫染色した。

共焦点レーザー顕微鏡検査法（Ｆｌｕｏｖｉｅｗ １０００、オリンパス）によって、条件ごと実験ごとに１０枚の写真を撮った。ニューロン分岐の測定をＩｍａｇｅＪ／ＮｅｕｒｏｎＪソフトウェア（ＮＩＨ）によって行い、相対的な神経分岐（ｎｅｕｒａｌ ｂｒａｎｃｈｅｓ）の長さを定量化した。図９Ａは、左側に、未処置またはＰＳＡ−２０（ＰＳＡ）処置のいずれかの、ミクログリアを含まない、正常なミクログリアを含む、およびＬＰＳで活性化されたミクログリアを含むニューロンの少なくとも３回の独立した実験からの代表的な画像を示す。図９Ａは、右側に、定量化した相対的な軸索分岐の長さを示す。データは、平均±ＳＥＭとして示される。^＊＊＊ｐ＜０．００１、ＡＮＯＶＡとそれに続くボンフェローニ。

図９Ａから解釈できるように、共焦点像から、ニューロンに正常なミクログリアを添加することによって、相対的な神経分岐の長さが低減され、ＬＰＳで事前に活性化されたミクログリア（活性化ミクログリア）を添加した後若干さらに減少したことが実証される。共培養物をＰＳＡ−２０で処置することにより、活性化ミクログリアにより誘導された相対的な軸索分岐の長さの低減が相殺された。詳細に言えば、共培養系中で、毒素で活性化されたミクログリアが添加された後、相対的な軸索突起の長さが０．７６±０．０１から０．６４±０．０１に減少した。追加のＰＳＡ−２０適用は、この神経毒作用を防止し、そこで相対的な軸索突起の長さは０．９１±０．０２であった。これから、ＰＳＡ−２０は、ヒトＬＰＳによって引き起こされた酸化ストレスを受けた共培養パーキンソン病モデル系において神経保護作用があることが示される。

ｂ）ミクログリアの食作用におけるＰＳＡ−２０の防止的作用の決定
ヒトミクログリアを蛍光標識された神経組織片でチャレンジし、組織片の細胞への取り込みを、共焦点顕微鏡法および３Ｄ再構成によって決定した。

組織片を得るために、神経幹細胞を４０ｎＭオカダ酸（Ｓｉｇｍａ）と共に２４時間インキュベートした。次いで、組織片を収集し、遠心分離した。組織片をＰＢＳで洗浄し、「Ｄｉｌ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｆｏｒ Ｌｏｎｇ−Ｔｅｒｍ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｌａｂｅｌｉｎｇ」Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で、供給元のマニュアルに従って染色した。ミクログリア細胞を、０．１５μＭ、０．５μＭまたは１．５μＭの濃度のＰＳＡ−２０と共に１時間プレインキュベートし、続いて５μｇ／ｍｌの予備染色された神経組織片と共に１時間インキュベートした。細胞を固定し、抗ｉｂａ１抗体（和光、日本）、続いて二次Ａｌｅｘａ４８８−コンジュゲート抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅｓ）と共にインキュベートした。分析のために、画像を無作為にスキャンして、共焦点レーザー顕微鏡（Ｆｌｕｏｖｉｅｗ １０００、オリンパス）によって３Ｄ再構成を得た。蛍光標識された材料を取り込んだ細胞の比率を決定するために、実験グループ当たり６枚の画像を得て、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ）を使用して画像上の全ての細胞を定量化した。

図９Ｂは、左側に、神経組織片を取り込んだミクログリア細胞の代表的な共焦点３Ｄ再構成を示す。ミクログリア細胞への神経組織片の取り込みの定量化を行った。図９Ｂは、右側に、０．１５μＭ、０．５μＭまたは１．５μＭのＰＳＡ２０で処置したミクログリア細胞に関する食作用の、未処置コントロール細胞と比較したパーセンテージを示す。データは、ｎ＝３の独立した実験の平均±ＳＥＭとして示される。^＊ｐ＜０．０５、ＡＮＯＶＡとそれに続くボンフェローニ。共焦点像から解釈できるように、ミクログリアへの神経組織片の明らかな取り込みが観察された。ＰＳＡ−２０での処置後、神経組織片の取り込みを示すミクログリアの数は減少した。詳細に言えば、０．５μＭおよび１．５μＭのＰＳＡ−２０は、神経組織片を取り込んだミクログリアのパーセンテージを、３２％±０．０２から、それぞれ２５％±０．０２％および２２％±０．０１に低減したことから、１．５μＭの濃度で神経組織片の取り込みを有意に防止した。これから、ＰＳＡ−２０は、ミクログリアの一次食作用を防止したことが実証される。

ｃ）食作用に関連する酸化的バーストの決定
ミクログリア細胞によるスーパーオキシドの相対的な産生を測定するために、４つのチャンバーを有する培養皿でヒトミクログリア細胞をプレーティングした。２４時間後、０．１５μＭ、０．５μＭまたは１．５μＭ濃度でＰＳＡ−２０と１時間プレインキュベートして、またはしないで、細胞を５ｍｇ／ｍｌの神経組織片で１５分間処置した。次いで、細胞をクレブス−ＨＥＰＥＳ−緩衝液で２回洗浄した。スーパーオキシド放出を検出するために、その後細胞を、クレブス−ＨＥＰＥＳ−緩衝液で希釈した３０μＭのスーパーオキシド感受性蛍光色素であるジヒドロエチジウム（ＤＨＥ）溶液と共に１５分間インキュベートした。最後に、細胞をクレブス−ＨＥＰＥＳ−緩衝液で２回洗浄し、０．２５％グルタルアルデヒドおよび４％ＰＦＡを用いて１５分間固定した。共焦点レーザー顕微鏡検査法（Ｆｌｕｏｖｉｅｗ １０００、オリンパス）によって、合計で実験グループ当たり６つの画像を無作為に収集した。収集された画像の全ての細胞を、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ）によって分析した。

図９Ｃは、左側に、ＰＳＡ−２０の前処置有りまたは無しでの、神経組織片によって引き起こされたミクログリアの、未処置細胞（ＵＴ）と比較した相対的なスーパーオキシド放出を示す。^＊ｐ＜０．０５、ＡＮＯＶＡとそれに続くボンフェローニ。図９Ｃから解釈できるように、神経組織片でのミクログリアの処置は、スーパーオキシド産生を１±０．０６から１．５±０．０８に刺激したが、一方で神経組織片によって引き起こされたスーパーオキシド放出は、０．５μＭおよび１．５μＭのＰＳＡ−２０によって阻害された。特に、１．５μＭのＰＳＡ−２０は、組織片によって誘導されたスーパーオキシド産生の刺激を１．５±０．０８から０．９±０．０５に低減した。

作用を確認するために、上述したようなコントロール実験において、１．５μＭのＰＳＡ−２０を使用して、ただし培地に４０μＭのトロロックスまたは２０μｇ／ｍｌの（ＳＯＤ１）のいずれかを添加して、スーパーオキシドのスカベンジャーとしてトロロックス、およびスーパーオキシドの調節剤としてスーパーオキシドジスムターゼ−１（ＳＯＤ１）を使用した。図９Ｃは、右側に、ＰＳＡ−２０の前処置有りまたは無しでの、トロロックスおよびＳＯＤ１で処置した細胞およびコントロールに関する神経組織片による、未処置細胞（ＵＴ）と比較した相対的なスーパーオキシド放出を示す。図９Ｃから解釈できるように、ラジカルスカベンジャーであるトロロックスおよびスーパーオキシドジスムターゼＳＯＤ１は、神経組織片によって引き起こされるスーパーオキシド放出を中和し、さらにコントロールとして、ＤＨＥがスーパーオキシドの細胞外産生を検出したことが確認された。

まとめると、ＰＳＡ−２０は、ヒトミクログリアの食作用および活性酸素種産生を防止したことを示すことができた。その上、ＰＳＡ−２０は、ヒトミクログリア−ニューロン共培養系において、酸化ストレスが介在するニューロンへの傷害を防止した。パーキンソン病においてニューロンはミクログリアの酸化ストレスにより損傷を受けているために、ＰＳＡ−２０は、療法に好適な分子組成物である。

実施例１０
ＰＳＡ−２０の薬物動態および薬物毒性の決定
神経変性疾患の療法のためのほとんどの薬物が、神経毒性（ｎｅｕｒｏｔｏｘｃｉｔｙ）または限られた脳実質への侵入のために失敗に終わっている。ＰＳＡ−２０のあらゆる神経毒作用を評価するために、ヒト人口多能性幹（ｉＰＳ）細胞由来ニューロンを使用して、ＰＳＡ−２０のあらゆる毒作用を検出した。さらに、ＬＰＳによって誘導されたＴＮＦ−αの遺伝子転写物の抑制的調節に関するＰＳＡ−２０の有効濃度を検出するために、ヒトｉＰＳ細胞由来ミクログリアを使用した。脳におけるＰＳＡ−２０の生物学的利用率を決定するために、ビオチン−コンジュゲートＰＳＡ−２０を腹腔内に適用し、様々な期間後の血清および脳組織中の濃度を分析した。

ａ）ＭＴＴアッセイによるヒトｉＰＳ細胞由来ニューロンの細胞生存能力に及ぼすＰＳＡ−２０の影響の決定
ヒト胚性幹細胞から原始神経前駆体を得るために記述された改変されたプロトコールに従って、原始神経幹細胞（ｐＮＳＣ）の生成およびそれらのニューロンへの分化のために、ヒト由来多能性幹（ｉＰＳ）細胞（Ｆｏｒｅｓｋｉｎ−１、ＷｉＣｅｌｌ）を使用した。簡単に言えば、ｉＰＳ細胞をフィーダー細胞上で培養して、小さいコロニーを形成した。次に、培地を、白血病抑制因子（ＬＩＦ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、１０ｎｇ／ｍｌ）および３種の小分子ＣＨＩＲ９９０２１（ＧＳＫ−３βの阻害剤、Ａｘｏｎ Ｍｅｄｃｈｅｍ、４μＭ）およびＳＢ４３１５４２（ＴＧＦ−βおよびアクチビン受容体の阻害剤；Ａｘｏｎ Ｍｅｄｃｈｅｍ、３μＭ）、および化合物Ｅ（γ−セクレターゼの阻害剤；Ａｘｏｎ Ｍｅｄｃｈｅｍ、０．１μＭ）の存在下で１０日間、神経幹細胞培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２：Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ；ＧＩＢＣＯ）に交換した。ニューロンへの分化を誘導するために、ｐＮＳＣをアキュターゼ（ＰＡＡ）によって分離させ、ポリ−Ｌ−オルニチン（Ｓｉｇｍａ、０．１５ｍｇ／ｍｌ）と、ラミニン（Ｓｉｇｍａ、１μｇ／ｍｌ）でコーティングした細胞培養皿上で、神経幹細胞培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２：Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌと、Ｌ１Ｆ、ＣＨＩＲ９９０２１およびＳＢ４３１５４２）の中で、細胞が付着して小さいコロニーが形成されるまで培養した。次いで、培地を、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ；Ｐｒｏｓｐｅｃｔ、１０ｎｇ／ｍｌ）およびグリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ；１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で２週間、ニューロン分化培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２と、Ｎ２およびＢ２７サプリメント、ＧＩＢＣＯ）に交換した。２日に１回、神経栄養因子を含有する培地を交換した。

細胞生存能力を、（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）アッセイ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）によって決定した。細胞を、５ｎＭ、１５ｎＭ、５０ｎＭ、１５０ｎＭ、５００ｎＭ、１．５μＭ、５μＭ、１５μＭ、５０μＭまたは１５０μＭのＰＳＡ−２０で２４時間処置した。刺激から２０時間後、１０μｌのＭＴＴ試薬を添加して、細胞をさらに４時間培養した。次いで、ホルマザン色素を測定するために、０．０４ＭのＨＣｌを含有するイソプロパノール１Ｍで細胞を溶解させた。紫色のホルマザン色素の吸光度を、分光光度計（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｅｎｖｉｓｉｏｎマルチプレートリーダー）によって、５７０ｎｍの波長で、６３０ｎｍの参照波長を用いて決定した。細胞の生存能力の相対変化を知るために、全ての値を刺激されていないコントロール細胞と比較した。

図１０Ａは、様々な濃度のＰＳＡ−２０で２４時間処置した際のヒトニューロンの、未処置のコントロール（０）と比較した細胞生存能力を示す。データは、ｎ＝３の独立した実験の平均±ＳＥＭとして示される。^＊ｐ＜０．５、ＡＮＯＶＡ、その後、ＴａｍｈａｎｅのＴ２。図１０Ａから解釈できるように、様々なＰＳＡ−２０濃度を添加した後でも細胞の生存能力は低減しなかった。１５０μＭの比較的高濃度であっても、ニューロン性細胞の生存能力への干渉は観察されなかった。

ｂ）ＬＰＳから誘導されたＴＮＦ−αの遺伝子転写の５０％低減をもたらす半分の最大有効濃度の決定
ヒト人口多能性幹細胞由来ミクログリア（ｉＰＳｄＭ）を、ｉＰＳ細胞から得た。この研究には、ｉＬＢ−Ｃ−３５ｍ−ｒｌクローン（Ｂｏｎｎ）から生成したｉＰＳｄＭ−１株を使用した。ｉＰＳｄＭ−１（ここではミクログリアまたはミクログリア細胞と命名）を、１％Ｎ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．４８ｍＭのＬ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）および１００μｇ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）が補充されたＤＭＥＭ／Ｆ１２培養培地からなるＮ２−培地（Ｇｉｂｃｏ）中で培養した。細胞を高密度で培養し、１：５に分けた。層剥離後、細胞を回収し、新しい培養皿に再度付着させた。

細胞を、１μｇ／ｍｌのリポ多糖（ＬＰＳ）および５ｎＭ、１５ｎＭ、５０ｎＭ、１５０ｎＭ、５００ｎＭ、１．５μＭ、５μＭ、１５μＭ、５０μＭまたは１５０μＭのＰＳＡ−２０で２４時間処置した。ＴＮＦ−αの遺伝子転写分析のために、ＲＮｅａｓｙキットシステム（Ｑｕｉａｇｅｎ）によって細胞からＲＮＡを収集した。スーパースクリプトＩＩＩ逆転写酵素（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および六量体ランダムプライマー（Ｒｏｃｈｅ）を使用してＲＮＡの逆転写を行った。ＡＢＩ５７００配列検出システム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して、ＳＹＢＲグリーンＰＣＲマスターミックス（Ｑｉａｇｅｎ）により特異的なオリゴヌクレオチドを用いた定量ＲＴ−ＰＣＲを行った。上記ＰＣＲと同じプライマーを使用して、６０℃のＴｍでｑＲＴ−ＰＣＲを４０サイクル泳動した。ｑＲＴ−ＰＣＲ定量化のために、内部標準物質としてＧＡＰＤＨを用いたδδＣＴ法を行った。

図１０Ｂは、未処置のコントロール（ＵＴ）と比較した、１μｇ／ｍｌのＬＰＳおよび様々な濃度のＰＳＡ−２０で２４時間処置した後のヒトミクログリア細胞株のＴＮＦ−αに関する遺伝子転写物を示す。データは、平均±ＳＥＭとして示される。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１；^＊＊＊ｐ＜０．００１；ＡＮＯＶＡとそれに続くボンフェローニ。図１０Ｂから解釈できるように、０．０５μＭの濃度またはそれより高い濃度は、ＬＰＳによって誘導されたＴＮＦ−αの遺伝子転写を低減した。ヒトミクログリアにおけるＥＣ５０は、０．０９μＭと決定された。治療指数を決定するための毒性濃度と有効な濃度との比較から、ＰＳＡ−２０は、このヒト培養系において相対的に高い治療指数を示したことが確認された。

ｃ）腹膜内適用後における血清および脳中のビオチン化ＰＳＡ−２０の決定
まず、ＰＳＡ−２０をビオチンとコンジュゲートさせて、ビオチン化ＰＳＡ−２０を検出するための高感度ＥＬＩＳＡを確立した。ＰＳＡ−２０鎖の末端におけるシアル酸の第６の炭素原子で、ＰＳＡ−２０とビオチン分子とをカップリングした。そのため、過ヨウ素酸ナトリウムによってＰＳＡ−２０の末端をアルデヒドに酸化した。その後、ヒドラジドがカップリングされたビオチンを室温でアルデヒド基にコンジュゲートして、ヒドラゾン結合を形成した。脱塩カラムを用いて（ＨｉＴｒａｐ脱塩カラム、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）精製を実行した。

ビオチンコンジュゲートＰＳＡ−２０（体重１ｇ当たり１０μｇ）を、腹膜内適用により成体マウスに適用した。ＥＬＩＳＡ法を使用して、血清および脳中のビオチン化ＰＳＡ−２０を検出した。ＥＬＩＳＡのために、ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎでコーティングしたプレブロッキング済みプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）で３回洗浄した。洗浄後、血漿および脳のホモジネート、加えて標準物質として規定濃度のビオチン化ＰＳＡ−２０で、プレートを室温で１時間処理した。プレートを３回洗浄し、オリゴシアル酸に対するモノクローナル抗体（ラット抗マウスＣＤ５６、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ番号５５６３２５）と共に４℃で一晩インキュベートした。翌日、プレートを３回洗浄し、ペルオキシダーゼ−ＨＲＰとコンジュゲートしたヤギ抗マウス免疫グロブリン（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）と共にインキュベートした。次いで、プレートを洗浄し、１００μｌのＴＭＢ試薬と共に室温で３０分間インキュベートした。１００μｌの１ＮのＨＣｌの添加によって反応を止め、ＥＬＩＳＡリーダーでシグナルを検出した。

適用前に、ならびに適用後０．５、１、２、４および８時間に、１匹のマウスの血清および脳組織を分析した。最大のＰＳＡ−２０レベルは、血清中では０．５時間に、脳中では２時間に検出された。血清および脳中でのＰＳＡ−２０の半減期は、２から３時間の間と概算された。血清と比較した脳中でのＰＳＡ−２０の生物学的利用率は、１から３％の間と概算された。図１０Ｃは、適用後０．５、１、２、４および８時間における血清および脳中のＰＳＡ−２０の量（μｇ／ｍｌ）を示す。図１０Ｃから解釈できるように、血清および脳中でＰＳＡ−２０が検出された。血清中のＰＳＡ−２０のピーク濃度は０．５時間に生じ、一方で脳中のピーク濃度は２時間に生じた。

まとめると、ＰＳＡ−２０は、培養されたヒトニューロンにおいて神経毒性を示さなかった。さらにＰＳＡ−２０は、全身適用後に、血液脳関門を通過して中枢神経系の実質に到達した。したがって、ＰＳＡ−２０は、神経変性疾患療法で使用するのに好適な薬物動態および薬物毒性を示す。

Claims (6)

1. 中枢神経系の変性疾患および脱髄疾患、ならびに変性性または炎症性の網膜疾患からなる群から選択される疾患の治療的および／または予防的処置で使用するための、以下に示される一般式（１）：
   （α（２→８または２→９）Ｎｅｕ５Ａｃ） _ｎ （１）
   ［式中、
   Ｎｅｕ５Ａｃは、Ｎ−アセチルノイラミン酸であり、
   ｎは、１４から２６の範囲の整数である］
   に係る分岐状もしくは非分岐状のポリシアル酸および／もしくは該ポリシアル酸の医薬的に許容される塩または該ポリシアル酸（１）を含む多糖組成物であって、該ポリシアル酸のフラグメントは、４．９ｋＤａから７．４ｋＤａの間の平均分子量を有し、該フラグメントの９０重量％以上１００重量％以下は、４．３ｋＤａから８ｋＤａの間の分子量を有し、該フラグメントの０重量％以上５重量％以下は、３ｋＤａから４．３ｋＤａの間の分子量を有し、該フラグメントの０重量％以上５重量％以下は、８ｋＤａから９．５ｋＤａの間の分子量を有し、ここで該フラグメントの重量％はポリシアル酸フラグメントの総重量に基づく、ポリシアル酸および／もしくはポリシアル酸塩または多糖組成物。
2. 神経変性疾患が、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、軽度認知機能障害、レヴィ小体型認知症、パーキンソン病および睡眠時異常行動からなる群から選択される疾患であって、該神経変性疾患に使用するための、請求項１に記載のポリシアル酸および／もしくはポリシアル酸塩または多糖組成物。
3. 変性性または炎症性の網膜疾患または眼疾患が、加齢性黄斑変性症、遺伝性網膜疾患を含む網膜変性、ブドウ膜炎、および糖尿病性網膜症からなる群から選択される疾患であって、該網膜疾患または眼疾患に使用するための、請求項１に記載のポリシアル酸および／もしくはポリシアル酸塩または多糖組成物。
4. 中枢神経系の脱髄疾患が、多発性硬化症またはデビック病であって、該脱髄疾患に使用するための、請求項１に記載のポリシアル酸および／もしくはポリシアル酸塩または多糖組成物。
5. 中枢神経系の変性疾患および脱髄疾患、ならびに変性性または炎症性の網膜疾患からなる群から選択される疾患の治療的および／または予防的処置で使用するための、活性成分として、以下に示される一般式（１）：
   （α（２→８または２→９）Ｎｅｕ５Ａｃ） _ｎ （１）
   ［式中、
   Ｎｅｕ５Ａｃは、Ｎ−アセチルノイラミン酸であり、
   ｎは、１４から２６の範囲の整数である］
   に係る分岐状もしくは非分岐状のポリシアル酸および／もしくは該ポリシアル酸の医薬的に許容される塩または該ポリシアル酸（１）を含む多糖組成物であって、該ポリシアル酸のフラグメントは、４．９ｋＤａから７．４ｋＤａの間の平均分子量を有し、該フラグメントの９０重量％以上１００重量％以下は、４．３ｋＤａから８ｋＤａの間の分子量を有し、該フラグメントの０重量％以上５重量％以下は、３ｋＤａから４．３ｋＤａの間の分子量を有し、該フラグメントの０重量％以上５重量％以下は、８ｋＤａから９．５ｋＤａの間の分子量を有し、ここで該フラグメントの重量％はポリシアル酸フラグメントの総重量に基づく、ポリシアル酸および／もしくはポリシアル酸塩または多糖組成物、および医薬的に許容される担体を含む医薬組成物。
6. 中枢神経系の変性疾患および脱髄疾患、ならびに変性性または炎症性の網膜疾患からなる群から選択される疾患の治療的および／または予防的処置のための医薬品を製造するための、以下に示される一般式（１）：
   （α（２→８または２→９）Ｎｅｕ５Ａｃ） _ｎ （１）
   ［式中、
   Ｎｅｕ５Ａｃは、Ｎ−アセチルノイラミン酸であり、
   ｎは、１４から２６の範囲の整数である］
   に係る分岐状もしくは非分岐状のポリシアル酸および／もしくはそれらの医薬的に許容される塩または該ポリシアル酸（１）を含む多糖組成物であって、該ポリシアル酸のフラグメントは、４．９ｋＤａから７．４ｋＤａの間の平均分子量を有し、該フラグメントの９０重量％以上１００重量％以下は、４．３ｋＤａから８ｋＤａの間の分子量を有し、該フラグメントの０重量％以上５重量％以下は、３ｋＤａから４．３ｋＤａの間の分子量を有し、該フラグメントの０重量％以上５重量％以下は、８ｋＤａから９．５ｋＤａの間の分子量を有し、ここで該フラグメントの重量％はポリシアル酸フラグメントの総重量に基づく、ポリシアル酸および／もしくはポリシアル酸塩または多糖組成物の使用。

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