JP6359314B2 - Medium composition for lipid production and method for lipid production for the red alga Cyanidia - Google Patents
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Description
本発明は、紅藻シアニジウム目に脂質を大量に生産させるための培地組成物および脂質の大量生産方法に関する。より詳細には、紅藻シアニジウム目の細胞増殖を維持したまま、脂質を大量に生産させるための培地組成物および脂質の大量生産方法に関する。 The present invention relates to a medium composition for producing a large amount of lipids in the red alga Cyanidium and a method for mass production of lipids. More specifically, the present invention relates to a medium composition for producing a large amount of lipid while maintaining cell growth of the red alga Cyanidia and a method for mass production of lipid.
近年、急激な工業化などにより大気中の二酸化炭素、窒素酸化物、硫黄酸化物が増加して、地球温暖化や海洋の酸性化が進んでおり、一方で化石燃料も近い将来枯渇すると考えられている。生物由来の脂質は、化石燃料に代わるエネルギーとして利用でき、特に光合成生物由来の脂質は、二酸化炭素の排出を削減することが可能なため、光合成生物由来のバイオマスの燃料の開発が進められている。高い二酸化炭素固定能を持つ藻類は、地球上の光合成による全バイオマス生産の約半分を占め、食料生産と競合しないため、バイオマス由来の燃料に適している。地球表面の７割を占める海洋では、紅藻と、その二次共生により誕生した珪藻や褐藻類などが生態系で重要な位置を占め、海洋バイオマスの基盤をなしているが、地球温暖化と海洋の酸性化により、その生産性が落ちている。 In recent years, due to rapid industrialization, etc., carbon dioxide, nitrogen oxides and sulfur oxides in the atmosphere have increased, leading to global warming and ocean acidification, while fossil fuels are thought to be depleted in the near future. Yes. Biologically-derived lipids can be used as an alternative to fossil fuels. In particular, photosynthetic organism-derived lipids can reduce carbon dioxide emissions, so development of biomass-derived biomass fuels is underway. . Algae with high carbon dioxide fixation capacity are suitable for biomass-derived fuels because they account for about half of total biomass production by photosynthesis on the earth and do not compete with food production. In the ocean, which accounts for 70% of the earth's surface, red algae and diatoms and brown algae born from their secondary symbiosis occupy an important position in the ecosystem and constitute the basis of marine biomass. Productivity is decreasing due to acidification of the ocean.
こうした問題を解決するには、高温や酸性等の悪環境に耐えながら、二酸化炭素を固定して、バイオ燃料の原料となるバイオマスを生産する生物の開発と利用が重要である。実用化には、藻類の生産性向上と開放系培養を可能にする高環境耐性化が必須である。 In order to solve these problems, it is important to develop and use a living organism that produces biomass as a raw material for biofuel by fixing carbon dioxide while enduring a bad environment such as high temperature and acidity. For practical application, it is essential to improve the environmental resistance that enables algal productivity improvement and open culture.
藻類において、バイオ燃料の原料となる脂質は、油滴という細胞小器官に蓄積される。緑藻クラミドモナスの油滴には、約90％のトリアシルグリセロール、約10％の遊離脂肪酸が含まれる（非特許文献１）。油滴は、脂質の生産量に応じて、その数と体積を変化させる。クラミドモナスやドゥナリエラなどの緑藻類において、窒素や硫黄などの飢餓条件で油滴を生産させることが可能であるが、いずれの条件でも生育が阻害され、細胞増殖が停止してしまうか、または非常に遅くなる（非特許文献２〜４）。例えば、クラミドモナスの野生型において、窒素を含む培地から窒素飢餓培地に移すと4日後の油滴生産量は、開始点と比較して5倍になり、4日後の細胞乾燥重量に対する総脂肪酸の割合は、窒素を含む培地（9％）と比較して12％に上昇する（非特許文献３）。しかし細胞は、膨張のためODは倍になるが、細胞分裂は停止する（非特許文献３）。また、ボトリオコッカスは、多くの脂質を細胞内の油滴と細胞外マトリックスに蓄積するが、倍加時間が1週間、至適条件でも約二日と増殖が非常に遅い（非特許文献５）。このように細胞増殖と、油滴の形成にはトレードオフの関係があると考えられてきた。 In algae, lipids that are raw materials for biofuel accumulate in organelles called oil droplets. The oil droplets of the green alga Chlamydomonas contain about 90% triacylglycerol and about 10% free fatty acid (Non-patent Document 1). Oil droplets vary in number and volume depending on the amount of lipid produced. In green algae such as Chlamydomonas and Dunaliella, it is possible to produce oil droplets under starvation conditions such as nitrogen and sulfur, but growth is inhibited under either condition and cell growth is stopped or very slow. (Non-Patent Documents 2 to 4). For example, in Chlamydomonas wild type, when transferred from a medium containing nitrogen to a nitrogen starvation medium, the oil droplet production after 4 days is 5 times the starting point, and the ratio of total fatty acids to the cell dry weight after 4 days Increases to 12% compared to a medium containing nitrogen (9%) (Non-patent Document 3). However, cells doubling due to swelling, but cell division stops (Non-patent Document 3). Botryococcus accumulates a large amount of lipids in intracellular oil droplets and extracellular matrix, but its doubling time is one week and its growth is very slow, about two days even under optimal conditions (Non-patent Document 5). . Thus, it has been considered that there is a trade-off relationship between cell growth and the formation of oil droplets.
例えば窒素の場合について、これまでに報告されている栄養源として使われるものはアンモニウムイオンと硝酸イオンがある。緑藻類、紅藻類ともに一番効率良く資化できる窒素源はアンモニウムイオンであり、細胞増殖が一番速い。しかし、アンモニウムイオンを含む培地で培養すると、油滴の生産は殆ど見られない。培地からアンモニウムイオンを抜くことによって、油滴を生産するが、増殖は停止する。藻類は、アンモニウムイオンの代わりに硝酸イオンを、唯一の窒素源として利用して増殖することができる。海産性緑藻ドゥナリエラでは、硝酸培地へ塩化ナトリウムの添加によって油滴形成量が増加する。しかし、解析時の培地中の硝酸イオンは、ほぼ消費され切っているため、窒素飢餓応答が起こっていると考えられる（非特許文献４）。窒素飢餓を起こさずに油滴を生産させる方法も検討されているが、成功には至っていない。例えば以下の例がある。窒素源としてアンモニウムイオンを含む培地でクラミドモナスを培養し、mid-log phaseとなった培養液にNaClを添加した場合、脂質量が窒素飢餓の場合と同レベルまで上昇したが、細胞の増殖も窒素飢餓時と同様に停止した（非特許文献６）。ほかにも、窒素源を添加した培地で藻類を培養する方法が考案されたが（特許文献２、３）、ある程度細胞が増殖すると、窒素栄養が消費し尽くされ、窒素飢餓状態となる。このように、増殖の早い培地で藻類を培養し、窒素源を消費し尽くさせた後に、自然に窒素飢餓の状況にするという方法では、培養開始時の細胞の状態や細胞数等で効率が変化し得るため、安定した収率を得ることについての懸念が存在する。 For example, in the case of nitrogen, ammonium ions and nitrate ions are used as nutrient sources reported so far. The nitrogen source that can be most efficiently assimilated for both green and red algae is ammonium ion, which has the fastest cell growth. However, when cultured in a medium containing ammonium ions, almost no oil droplets are produced. By extracting ammonium ions from the medium, oil droplets are produced, but growth stops. Algae can grow using nitrate ions instead of ammonium ions as the only nitrogen source. In the marine green alga Dunaliella, the amount of oil droplet formation is increased by adding sodium chloride to the nitrate medium. However, since nitrate ions in the medium at the time of analysis are almost consumed, it is considered that a nitrogen starvation response occurs (Non-patent Document 4). A method for producing oil droplets without causing nitrogen starvation has also been studied, but has not been successful. For example, there are the following examples. When Chlamydomonas was cultured in a medium containing ammonium ions as a nitrogen source and NaCl was added to the culture medium in the mid-log phase, the lipid level increased to the same level as in the case of nitrogen starvation, but cell growth also increased. It stopped in the same way as during starvation (Non-Patent Document 6). In addition, a method for culturing algae in a medium added with a nitrogen source has been devised (Patent Documents 2 and 3). However, when cells grow to some extent, nitrogen nutrients are consumed, resulting in a nitrogen starvation state. As described above, the method of cultivating algae in a fast-growing medium and exhausting the nitrogen source and then naturally bringing it into a nitrogen starvation situation is efficient in terms of the state of cells and the number of cells at the start of culture. There are concerns about obtaining a stable yield because it can vary.
従って、工業的に油滴を生産させる場合、既知の培地を用いると、細胞を充分に増殖させておいた後に栄養飢餓条件へ培地を置換または塩の添加する、または培養に非常に時間がかかる培地で培養する必要があり、手間、時間、コスト面等で適していない。 Therefore, when producing oil droplets industrially, if a known medium is used, the medium is replaced with nutrient-starved conditions after adding cells sufficiently, or salt is added, or the culture is very time consuming. It is necessary to culture in a medium, which is not suitable for labor, time and cost.
さらに、多くの藻類の場合、ｐＨ中性、室温付近で増殖するため、コストの低い開放培養系では他生物混入のリスクがあり、大量培養するのが困難であるという問題がある。
原始的な紅藻のシアニジウム属は、高温強酸性の温泉という極限環境（30〜60℃の高温、pH 0.5〜5.0の酸性条件）に棲息する単細胞性紅藻であり、バイオマス由来燃料への利用に適した生物である。紅藻のシアニジウム属には、シアニディオシゾン・メローラエ（Cyanidioschyzon merolae）、シアニジウム・カルダリウム（Cyanidium caldarium）、ガルデリア・スルフラリア（Galdieria sulphuraria）が含まれる。なお、シアニディオシゾン・メローラエ（Cyanidioschyzon merolae）を、以降、シゾンと言う。
Furthermore, in the case of many algae, since they grow at pH neutrality and near room temperature, there is a problem that there is a risk of contamination with other organisms in an open culture system with low cost, and it is difficult to culture in large quantities.
Primordial red algae, Cyanidium, is a unicellular red algae that lives in the extreme environment of hot and strongly acidic hot springs (high temperature of 30-60 ° C, acidic conditions of pH 0.5-5.0) and is used for biomass-derived fuels It is a creature suitable for. The cyanidium genus of red alga includes Cyanidioschyzon merolae , Cyanidium caldarium , and Galdieria sulphuraria . In the following, Cyanidioschyzon merolae is referred to as schizon.
特にシゾンは、細胞壁を持っていないため、細胞破砕が容易で、細胞内物質を取り出しやすく、バイオマス生産の基盤となる関連物質の単離などに有利であるとともに、本願の発明者らによって、ゲノムが100％完全解読されており、マイクロアレイや質量分析を用いた高精度なオミクス解析が可能である。さらに遺伝子改変技術が開発されているので、ゲノム情報を基礎及び応用研究に利用することができる。他のシアニジウム属であるシアニジウム・カルダリウムとガルデリア・スルフラリアもゲノム情報が明確で、シゾンと同様に単純な構造である。これらは種ごとに、温度やpH、金属濃度等の可能生育条件の範囲、特徴が異なり、極限環境で生息する生命体の特性の解明と、その高環境耐性の利用などの研究に有用である。 In particular, since schizone does not have a cell wall, cell disruption is easy, cellular material can be easily taken out, and it is advantageous for isolation of related substances that are the basis of biomass production. Is 100% completely deciphered, enabling highly accurate omics analysis using microarrays and mass spectrometry. Furthermore, since genetic modification techniques have been developed, genome information can be used for basic and applied research. The other cyanidium genera, cyanidium caldarium and garderia sulphuraria, also have clear genomic information and a simple structure similar to schizon. These species have different ranges and characteristics of possible growth conditions such as temperature, pH, metal concentration, etc., and are useful for elucidating the characteristics of living organisms that live in extreme environments and using their high environmental resistance. .
紅藻のシアニジウム属は、MA2培地を用いた通常培養では、脂質の検出に用いられる蛍光色素BODIPYで染色される油滴様顆粒が細胞あたりに0〜2個ある（非特許文献7、8）。シアニジウム属の油滴も、色素の染色性の類似性から、クラミドモナスの油滴と同様の組成で、大部分がトリアシルグリセロールと考えられる。シゾンにおいても窒素フリー培地を用いた窒素飢餓条件では、緑藻類同様に生育阻害が見られることが知られている（非特許文献９）。 In the normal culture using the MA2 medium, the red alga Cyanidium has 0 to 2 oil droplet-like granules per cell stained with the fluorescent dye BODIPY used for lipid detection (Non-patent Documents 7 and 8). . Cyanidium oil droplets are also considered to be mostly triacylglycerol with the same composition as Chlamydomonas oil droplets due to the similarity of dye dyeability. In schizon, it is known that under nitrogen starvation conditions using a nitrogen-free medium, growth inhibition is observed as in the case of green algae (Non-patent Document 9).
本発明は、藻類の増殖を維持しながら、脂質を大量に生産させることのできる培地組成物および脂質の生産方法を提供することを目的とする。 An object of the present invention is to provide a medium composition and a lipid production method capable of producing a large amount of lipid while maintaining the growth of algae.
本発明者らは、鋭意検討の結果、窒素栄養源となる硫酸アンモニウム等のアンモニウム塩を十分に含み、さらにリン酸等の無機酸の含量を調節した強酸性の培地組成物であって、塩化ナトリウム等のナトリウム塩を含む培地組成物を用いて紅藻シアニジウム目を培養すると、驚くべきことに、紅藻シアニジウム目の増殖を維持しながら、脂質を大量に生産させることができることを見出した。この培地組成物を用いて紅藻シアニジウム目を培養すると、従来の培地を用いた場合と比べ、細胞増殖と脂質の生産量が向上することを見出し、本発明を完成させた。 As a result of intensive studies, the inventors of the present invention are strongly acidic medium compositions that sufficiently contain an ammonium salt such as ammonium sulfate, which is a nitrogen nutrient source, and in which the content of an inorganic acid such as phosphoric acid is adjusted. It has been surprisingly found that, when a red seaweed cyanidium is cultured using a medium composition containing a sodium salt such as the above, it is possible to produce a large amount of lipid while maintaining the growth of the red seaweed cyanidium. It was found that when this medium composition was used to culture the red alga Cyanidia, cell growth and lipid production were improved as compared to the case of using a conventional medium, and the present invention was completed.
すなわち、本発明は、これらに限定されるわけではないが以下を包含する。
［１］
紅藻シアニジウム目に脂質を生産させるための培地組成物であって、以下：
（ａ）硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウム、および炭酸アンモニウムからなる群より選択される１以上のアンモニウム塩；および
（ｂ）リン酸、その金属塩、またはこれらの組み合わせを含む１以上の無機酸；および
（ｃ）塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、および硫酸水素ナトリウムからなる群より選択される１以上のナトリウム塩
の組み合わせを含むよう改変された基礎培養体を含み、ここで培地組成物を培地として使用する際において、培地中の無機酸の濃度が無機酸イオン濃度として０．５μＭ〜１ｍＭであり、培地のｐＨが１〜３である、培地組成物。
［２］
１以上の無機酸が、塩酸、硝酸、ホウ酸、これらの金属塩、または１以上のこれらの組み合わせをさらに含む、［１］に記載の培地組成物。
［３］
アンモニウム塩が硫酸アンモニウムであり、無機酸がリン酸二水素カリウムであり、ナトリウム塩が塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、または塩化ナトリウムおよび硫酸ナトリウムである、［１］に記載の培地組成物。
［４］
培地組成物を培地として使用する際において、アンモニウム塩の濃度がアンモニウムイオン濃度として２０ｍＭ〜５０ｍＭであり、ナトリウム塩の濃度がナトリウムイオン濃度として１ｍＭ〜３００ｍＭである、［１］〜［３］のいずれかに記載の培地組成物。
［５］
培地組成物を培地として使用する際において、アンモニウム塩の濃度がアンモニウムイオン濃度として２５ｍＭ〜４０ｍＭであり、無機酸の濃度が無機酸イオン濃度として０．８μＭ〜０．８ｍＭであり、ナトリウム塩の濃度がナトリウムイオン濃度として１．５ｍＭ〜１５０ｍＭである、［４］に記載の培地組成物。
［６］
クエン酸、フマル酸、リンゴ酸、マレイン酸、酢酸、およびこれらの塩からなる群より選択される１以上の有機酸をさらに含む、［１］〜［５］のいずれかに記載の培地組成物。
［７］
液体の形状である、［１］〜［６］のいずれかに記載の培地組成物。
［８］
粉末の形状である、［１］〜［６］のいずれかに記載の培地組成物。
［９］
４０℃以上の温度において紅藻シアニジウム目の培養を行うための、［１］〜［８］のいずれかに記載の培地組成物。
［１０］
（１）以下：
（ａ）硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウム、および炭酸アンモニウムからなる群より選択される１以上のアンモニウム塩；
（ｂ）リン酸、その金属塩、またはこれらの組み合わせを含む１以上の無機酸；および
（ｃ）塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、および硫酸水素ナトリウムからなる群より選択される１以上のナトリウム塩
の組み合わせを含むよう改変された基礎培養体を含み、無機酸の濃度が無機酸イオン濃度として０．５μＭ〜１ｍＭであり、ｐＨが１〜３である培地中で、紅藻シアニジウム目を培養する工程；および
（２）培養した紅藻シアニジウム目由来の脂質を回収する工程
を含む、脂質の生産方法。
［１１］
１以上の無機酸が、塩酸、硝酸、ホウ酸、これらの金属塩、または１以上のこれらの組み合わせをさらに含む、［１０］に記載の方法。
［１２］
工程（１）の培地において、アンモニウム塩が硫酸アンモニウムであり、無機酸がリン酸二水素カリウムであり、ナトリウム塩が塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、または塩化ナトリウムおよび硫酸ナトリウムである、［１０］に記載の方法。
［１３］
工程（１）の培地において、アンモニウム塩の濃度がアンモニウムイオン濃度として２０ｍＭ〜５０ｍＭであり、ナトリウム塩の濃度がナトリウムイオン濃度として１ｍＭ〜３００ｍＭである、［１０］〜［１２］のいずれかに記載の方法。
［１４］
工程（１）の培地において、アンモニウム塩の濃度がアンモニウムイオン濃度として２５ｍＭ〜４０ｍＭであり、無機酸の濃度が無機酸イオン濃度として０．８μＭ〜０．８ｍＭであり、ナトリウム塩の濃度がナトリウムイオン濃度として１．５ｍＭ〜１５０ｍＭである、［１３］に記載の方法。
［１５］
工程（１）の培地が、クエン酸、フマル酸、リンゴ酸、マレイン酸、酢酸、およびこれらの塩からなる群より選択される１以上の有機酸をさらに含む、［１０］〜［１４］のいずれかに記載の方法。
［１６］
紅藻シアニジウム目が、シアニディオシゾン・メローラエ（Cyanidioschyzon merolae）、シアニジウム・カルダリウム（Cyanidium caldarium）、およびガルデリア・スルフラリア（Galdieria sulphuraria）からなる群より選択される一以上の種である、［１０］〜［１５］のいずれかに記載の方法。
［１７］
紅藻シアニジウム目が、独立行政法人 国立環境研究所 微生物系統保存施設に株番号NIES-3377として寄託されたシアニディオシゾン・メローラエ、または独立行政法人 国立環境研究所 微生物系統保存施設に株番号NIES-551もしくはNIES-2137として寄託されたシアニジウム・カルダリウムである、［１６］に記載の方法。
That is, the present invention includes, but is not limited to, the following.
[1]
A medium composition for producing lipids in the red alga Cyanidium, the following:
(A) one or more ammonium salts selected from the group consisting of ammonium sulfate, ammonium nitrate, ammonium chloride, and ammonium carbonate; and (b) one or more inorganic acids including phosphoric acid, metal salts thereof, or combinations thereof; and (C) including a basal culture modified to contain a combination of one or more sodium salts selected from the group consisting of sodium chloride, sodium sulfate, and sodium hydrogensulfate, wherein the medium composition is used as a medium The medium composition in which the concentration of the inorganic acid in the medium is 0.5 μM to 1 mM as the inorganic acid ion concentration, and the pH of the medium is 1 to 3.
[2]
The medium composition according to [1], wherein the one or more inorganic acids further include hydrochloric acid, nitric acid, boric acid, a metal salt thereof, or one or more combinations thereof.
[3]
The medium composition according to [1], wherein the ammonium salt is ammonium sulfate, the inorganic acid is potassium dihydrogen phosphate, and the sodium salt is sodium chloride, sodium sulfate, or sodium chloride and sodium sulfate.
[4]
When using the medium composition as a medium, the ammonium salt concentration is 20 mM to 50 mM as an ammonium ion concentration, and the sodium salt concentration is 1 mM to 300 mM as a sodium ion concentration, any of [1] to [3] A medium composition according to claim 1.
[5]
When the medium composition is used as a medium, the concentration of ammonium salt is 25 mM to 40 mM as ammonium ion concentration, the concentration of inorganic acid is 0.8 μM to 0.8 mM as inorganic acid ion concentration, and the concentration of sodium salt Is a medium composition according to [4], wherein the sodium ion concentration is 1.5 mM to 150 mM.
[6]
The medium composition according to any one of [1] to [5], further comprising one or more organic acids selected from the group consisting of citric acid, fumaric acid, malic acid, maleic acid, acetic acid, and salts thereof. .
[7]
The medium composition according to any one of [1] to [6], which is in a liquid form.
[8]
The medium composition according to any one of [1] to [6], which is in the form of a powder.
[9]
The medium composition according to any one of [1] to [8], for culturing the red alga Cyanidiosis at a temperature of 40 ° C. or higher.
[10]
(1) Following:
(A) one or more ammonium salts selected from the group consisting of ammonium sulfate, ammonium nitrate, ammonium chloride, and ammonium carbonate;
(B) one or more inorganic acids including phosphoric acid, metal salts thereof, or combinations thereof; and (c) a combination of one or more sodium salts selected from the group consisting of sodium chloride, sodium sulfate, and sodium hydrogen sulfate. A step of culturing Cyanidae red algae in a medium containing a basic culture modified so as to contain an inorganic acid ion concentration of 0.5 μM to 1 mM and a pH of 1 to 3; And (2) A method for producing a lipid, comprising a step of recovering a cultured lipid derived from the red alga Cyanidia.
[11]
The method of [10], wherein the one or more inorganic acids further comprises hydrochloric acid, nitric acid, boric acid, a metal salt thereof, or one or more combinations thereof.
[12]
[10] In the medium of step (1), the ammonium salt is ammonium sulfate, the inorganic acid is potassium dihydrogen phosphate, and the sodium salt is sodium chloride, sodium sulfate, or sodium chloride and sodium sulfate. Method.
[13]
In the medium of step (1), the ammonium salt concentration is 20 mM to 50 mM as an ammonium ion concentration, and the sodium salt concentration is 1 mM to 300 mM as a sodium ion concentration, according to any one of [10] to [12]. the method of.
[14]
In the medium of step (1), the ammonium salt concentration is 25 mM to 40 mM as the ammonium ion concentration, the inorganic acid concentration is 0.8 μM to 0.8 mM as the inorganic acid ion concentration, and the sodium salt concentration is sodium ion. The method according to [13], wherein the concentration is 1.5 mM to 150 mM.
[15]
[10] to [14], wherein the medium of step (1) further comprises one or more organic acids selected from the group consisting of citric acid, fumaric acid, malic acid, maleic acid, acetic acid, and salts thereof. The method according to any one.
[16]
The red alga Cyanidium is one or more species selected from the group consisting of Cyanidioschyzon merolae , Cyanidium caldarium , and Galdieria sulphuraria [10] -The method in any one of [15].
[17]
The red alga Cyanidium is deposited at the National Institute for Environmental Studies, Microorganisms Storage Facility as Stock Number NIES-3377, or the National Institute for Environmental Studies, the Microorganisms Storage Facility is the Stock Number NIES. The method according to [16], which is cyanidium caldarium deposited as -551 or NIES-2137.
本発明によれば、増殖の速い紅藻シアニジウム目を用いて、その増殖を阻害することなく、脂質を大量に生産させることができる。また、本発明の培地組成物は、使用時のｐＨが１〜３と強酸性であり、培養温度を４０℃以上という高温とすることもできるため、他生物混入のリスクを低減した開放培養系に効果的に用いることができる。このように、本発明は藻類由来バイオマス燃料の原料となる脂質の効率のよい製造を可能とする。 According to the present invention, it is possible to produce a large amount of lipid using the fast-growing red alga Cyanidia without inhibiting its growth. Moreover, since the culture medium composition of the present invention has a strong acidic pH of 1 to 3 during use and the culture temperature can be as high as 40 ° C. or higher, the open culture system has reduced the risk of contamination with other organisms. Can be used effectively. Thus, the present invention enables efficient production of lipids that are raw materials for algae-derived biomass fuel.
＜紅藻シアニジウム目＞
紅藻は紅色植物門に属する藻類をいう。本明細書においては、藻類のうち、原始紅藻のシアニジウム目に分類することのできるものを紅藻シアニジウム目と呼ぶ。紅藻シアニジウム目は、自然界においては常温、中性といった通常条件から、高温や強酸性の極限環境にまで広く棲息する単細胞の微細藻類である。
<Red Alga Cyanidium>
Red algae refers to algae belonging to the red plant gate. In the present specification, among the algae, those that can be classified as Cyanidia of the primitive red algae are called Red Algae. The red alga Cyanidia is a single-celled microalgae that inhabits a wide range of natural conditions, from normal conditions such as normal temperature and neutrality, to extreme environments of high temperature and strong acidity.
本発明には高温強酸性で生育可能ないずれの紅藻シアニジウム目を用いてもよいが、たとえばシアニディオシゾン・メローラエ（Cyanidioschyzon merolae）等のシアニディオシゾン属の紅藻、シアニジウム・カルダリウム（Cyanidium caldarium）等のシアニジウム属の紅藻、ガルデリア・スルフラリア（Galdieria sulphuraria）等のガルデリア属の紅藻、およびこれらの変異株および形質転換体、ならびに一以上のこれらの組み合わせを用いることができる。 In the present invention, any red algal cyanidium that can grow at high temperature and strong acidity may be used. For example, cyanidiosizone red algae such as Cyanidioschyzon merolae , cyanidium caldarium ( Cyanidium red algae such as Cyanidium caldarium ), Galderia red algae such as Galdieria sulphuraria , and mutants and transformants thereof, and one or more combinations thereof can be used.
紅藻シアニジウム目は、高温、高硫黄、低ｐＨの環境、たとえば硫酸塩泉から、既報に従って採集し（De Luca P. et al., 1978, Webbia, 33, 37-44）、アレン培地または改変アレン培地において維持培養することができる（Allen, M. B., 1959, Arch. Mikrobiol., 32, 270-277；Kuroiwa, T. et al., 1993, Protoplasma, 175, 173-177；Ohnuma M. et al., 2008, Plant Cell Physiol., 117-120；Kuroiwa T. et al., 2012, Cytologia, 77(3), 289-299）。 The red alga Cyanidia is collected from a high temperature, high sulfur, low pH environment, eg, a sulfate spring, as previously reported (De Luca P. et al., 1978, Webbia, 33, 37-44), Allen medium or modified Can be maintained in allen medium (Allen, MB, 1959, Arch. Mikrobiol., 32, 270-277; Kuroiwa, T. et al., 1993, Protoplasma, 175, 173-177; Ohnuma M. et al , 2008, Plant Cell Physiol., 117-120; Kuroiwa T. et al., 2012, Cytologia, 77 (3), 289-299).
また、シアニディオシゾン・メローラエ（Cyanidioschyzon merolae）については、独立行政法人 国立環境研究所 微生物系統保存施設に株番号NIES-3377として寄託されたシアニディオシゾン・メローラエ 10D株を用いてもよいし、アメリカ培養細胞系統保存機関（American Type Culture Collection）に寄託されたCyanidioschyzon merolae 10D株も用いてもよい。また、シアニジウム・カルダリウム（Cyanidium caldarium）については、独立行政法人 国立環境研究所 微生物系統保存施設に株番号NIES-551として寄託された株、およびNIES-2137として寄託された株等を用いてもよい。
＜紅藻シアニジウム目に脂質を生産させるための培地組成物＞
本発明の一態様は、紅藻シアニジウム目に脂質を生産させるための培地組成物に関する。
In addition, as for Cyanidioschyzon merolae, cyanidiozone merolae 10D strain deposited as strain number NIES-3377 at the National Institute for Environmental Studies, Microbial System Storage Facility may be used. Alternatively, the Cyanidioschyzon merolae 10D strain deposited with the American Type Culture Collection may be used. For Cyanidium caldarium , a strain deposited as the strain number NIES-551 in the National Institute for Environmental Studies Microbial System Storage Facility, a strain deposited as NIES-2137, etc. may be used. .
<Medium composition for producing lipids in the red alga Cyanidum>
One aspect of the present invention relates to a medium composition for producing lipids in the red alga Cyanidium.
紅藻シアニジウム目は、細胞内に「油滴」と呼ばれる細胞小器官を有し、その中に脂質を蓄積する。本発明の培地組成物を用いて紅藻シアニジウム目を培養することにより、油滴の数、体積、または油滴の数および体積が増加し、紅藻シアニジウム目の細胞内に脂質が大量に蓄積される。また、本発明の培地組成物を用いて紅藻シアニジウム目を培養すると、細胞の増殖が良好に維持されるため、大量に脂質を蓄積した紅藻シアニジウム目を大量に得ることができる。 The red alga Cyanidium has an organelle called an “oil droplet” in the cell and accumulates lipid therein. By culturing the red alga Cyanidia using the medium composition of the present invention, the number of oil droplets, the volume, or the number and volume of the oil droplets are increased, and a large amount of lipid accumulates in the cells of the red alga Cyanidia. Is done. In addition, when the red seaweed cyanidium is cultured using the medium composition of the present invention, the growth of the cells is well maintained, so that a large amount of red alga cyanidium that accumulates a large amount of lipid can be obtained.
本発明の培地組成物は、アンモニウム塩、無機酸、ならびに塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、および硫酸水素ナトリウムからなる群より選択される１以上のナトリウム塩の組み合わせを含むよう改変された基礎培養体を含み、培地組成物を培地として使用する際において、培地中の無機酸の濃度が無機酸イオン濃度として０．５μＭ〜１ｍＭであり、培地のｐＨが１〜３であることを特徴とする。 The medium composition of the present invention comprises a basal culture modified to contain a combination of an ammonium salt, an inorganic acid, and one or more sodium salts selected from the group consisting of sodium chloride, sodium sulfate, and sodium hydrogen sulfate. When the medium composition is used as a medium, the inorganic acid concentration in the medium is 0.5 μM to 1 mM as the inorganic acid ion concentration, and the pH of the medium is 1 to 3.
本発明において、基礎培養体とは、従来、紅藻シアニジウム目を培養することができることが知られている培地もしくはその濃縮物、希釈物または乾燥物であればどのようなものを用いてもよい。本明細書において、改変された基礎培養体とは、基礎培養体に１以上の追加の成分を加えたもの、基礎培養体中の１以上の成分の含量を増加または減少させたもの、および基礎培養体中の１以上の成分の含量を増加または減少させたものに１以上の追加の成分を加えたものをいう。本発明における基礎培養体の例としては、アレン培地または改変アレン培地（Allen, M. B., 1959, Arch. Mikrobiol., 32, 270-277；Kuroiwa, T. et al., 1993, Protoplasma, 175, 173-177；Ohnuma M. et al., 2008, Plant Cell Physiol., 117-120；Kuroiwa T. et al., 2012, Cytologia, 77(3), 289-299）を挙げることができるが、これらに限定されない。例として、改変アレン培地２（MA2培地、Ohnuma M. et al., 2008, Plant Cell Physiol., 117-120）の組成を以下に示す。 In the present invention, any basic culture may be used as long as it is a medium that is conventionally known to be capable of culturing the red alga Cyanidia or a concentrate, dilution, or dry product thereof. . As used herein, a modified basal culture refers to a basal culture added with one or more additional components, a basal culture with an increased or decreased content of one or more components, and a basal A product obtained by increasing or decreasing the content of one or more components in a culture and adding one or more additional components. Examples of basal cultures in the present invention include allen medium or modified allen medium (Allen, MB, 1959, Arch. Mikrobiol., 32, 270-277; Kuroiwa, T. et al., 1993, Protoplasma, 175, 173 -177; Ohnuma M. et al., 2008, Plant Cell Physiol., 117-120; Kuroiwa T. et al., 2012, Cytologia, 77 (3), 289-299). It is not limited. As an example, the composition of modified Allen medium 2 (MA2 medium, Ohnuma M. et al., 2008, Plant Cell Physiol., 117-120) is shown below.
本発明の培地組成物は、上記基礎培養体がアンモニウム塩、無機酸、ならびに塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、および硫酸水素ナトリウムからなる群より選択される１以上のナトリウム塩の組み合わせを含むよう改変されたものを含み、培地組成物を培地として使用する際において、培地中の無機酸の濃度が無機酸イオン濃度として０．５μＭ〜１ｍＭであり、培地のｐＨが１〜３であることを特徴とする。 The medium composition of the present invention has been modified so that the basal culture contains an ammonium salt, an inorganic acid, and a combination of one or more sodium salts selected from the group consisting of sodium chloride, sodium sulfate, and sodium hydrogen sulfate. When the medium composition is used as a medium, the concentration of the inorganic acid in the medium is 0.5 μM to 1 mM as the inorganic acid ion concentration, and the pH of the medium is 1 to 3 .
本発明の培地組成物を培地として使用することには、培地組成物にそのまま紅藻シアニジウム目を添加して培養すること、本発明の培地組成物を適切な溶媒で希釈したものに紅藻シアニジウム目を添加して培養すること、粉末等の固体形状である培地組成物を適切な溶媒に溶解したものに紅藻シアニジウム目を添加して培養することを含む。本明細書において「培地組成物を培地として使用する際」とは、培地組成物にそのまま紅藻シアニジウム目を添加して培地として用いるか、培地組成物を希釈したものを培地として用いるか、培地組成物を溶媒に溶解して用いるか、培地組成物に他の担体を混合したものを培地として用いるかを問わず、紅藻シアニジウム目の細胞体を培養のために培地に添加する時点、または紅藻シアニジウム目の細胞体を培地に添加した直後の時点をいう。 In order to use the medium composition of the present invention as a medium, the culture medium composition is directly added to the red algae cyanidium and cultured, or the medium composition of the present invention is diluted with a suitable solvent to the red algae cyanidium. Incubating with the addition of eyes, and adding and culturing red algae cyanidium eyes to a solid composition such as a powder dissolved in an appropriate solvent. In the present specification, “when using the medium composition as a medium” means that the medium composition is used as a medium by adding the red alga Cyanidia as it is, or a diluted medium composition is used as the medium. Regardless of whether the composition is used dissolved in a solvent, or a medium composition mixed with another carrier is used as the medium, the red alga cyanidium cell body is added to the medium for culture, or This refers to the time immediately after the cell body of the red alga Cyanidiosis is added to the medium.
本発明に用いるアンモニウム塩としては、アンモニアと酸または酸性酸化物との反応によって生じる、アンモニウムイオンを含むイオン結晶であれば何を用いてもよいが、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウム、および炭酸アンモニウムからなる群より選択される１以上のアンモニウム塩を例示することができる。本発明には、硫酸アンモニウムを好適に用いることができる。本発明の培地組成物に含まれるアンモニウム塩の含量は、培地組成物を培地として使用する際における培地中の濃度がアンモニウムイオン濃度として２０ｍＭ〜５０ｍＭであることが好ましく、２０ｍＭ〜４５ｍＭであることがより好ましく、２５ｍＭ〜４０ｍＭであることがさらに好ましい。 Any ammonium salt may be used as the ammonium salt used in the present invention as long as it is an ionic crystal containing ammonium ions generated by the reaction of ammonia with an acid or an acidic oxide. From ammonium sulfate, ammonium nitrate, ammonium chloride, and ammonium carbonate. One or more ammonium salts selected from the group consisting of In the present invention, ammonium sulfate can be preferably used. The content of the ammonium salt contained in the medium composition of the present invention is such that the concentration in the medium when the medium composition is used as the medium is preferably 20 mM to 50 mM as the ammonium ion concentration, and preferably 20 mM to 45 mM. More preferably, it is 25 mM-40 mM.
本発明に用いる無機酸としては、無機化合物の酸のうちリン酸、その金属塩、またはこれらの組み合わせが含まれていれば何を用いてもよい。必要に応じて、硫酸、塩酸、硝酸、ホウ酸、およびこれらの金属塩からなる群より選択される１以上の無機酸と、リン酸、その金属塩、またはこれらの組み合わせとを組み合わせて用いてもよい。リン酸およびその金属塩の例としては、リン酸二水素カリウムを挙げることができるが、これに限定されない。本発明の培地組成物において、無機酸は、使用時における濃度が無機酸イオン濃度として０．５μＭ〜１ｍＭであることが好ましく、０．６μＭ〜０．９ｍＭであることがより好ましく、０．８μＭ〜０．８ｍＭであることがさらに好ましい。 As the inorganic acid used in the present invention, any inorganic acid may be used as long as it contains phosphoric acid, a metal salt thereof, or a combination thereof. If necessary, one or more inorganic acids selected from the group consisting of sulfuric acid, hydrochloric acid, nitric acid, boric acid, and metal salts thereof, and phosphoric acid, metal salts thereof, or combinations thereof are used in combination. Also good. Examples of phosphoric acid and its metal salts include, but are not limited to, potassium dihydrogen phosphate. In the culture medium composition of the present invention, the concentration of the inorganic acid at the time of use is preferably 0.5 μM to 1 mM, more preferably 0.6 μM to 0.9 mM, more preferably 0.8 μM as the inorganic acid ion concentration. More preferably, it is -0.8 mM.
本発明の培地組成物に含まれる基礎培養体は、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、および硫酸水素ナトリウムからなる群より選択される１以上のナトリウム塩を含むよう改変されていることを特徴とする。ナトリウム塩は、培地組成物を培地として使用する際における培地中の濃度がナトリウムイオン濃度として１ｍＭ〜３００ｍＭであることが好ましく、１．２ｍＭ〜２００ｍＭであることがより好ましく、１．５ｍＭ〜１５０ｍＭであることがさらに好ましい。 The basal culture contained in the medium composition of the present invention is characterized by being modified to contain one or more sodium salts selected from the group consisting of sodium chloride, sodium sulfate, and sodium hydrogen sulfate. The sodium salt preferably has a sodium ion concentration of 1 mM to 300 mM, more preferably 1.2 mM to 200 mM, more preferably 1.5 mM to 150 mM, when the medium composition is used as a medium. More preferably it is.
本発明の培地組成物は、使用時におけるｐＨが０．５〜５であることが好ましく、１〜３であることがさらに好ましい。本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者であれば、目的に応じて適宜ｐＨを調整することができる。 The medium composition of the present invention preferably has a pH of 0.5 to 5 during use, and more preferably 1 to 3. Anyone who has ordinary knowledge in the technical field to which the present invention pertains can appropriately adjust the pH according to the purpose.
本発明の培地組成物には、上記の成分のほかに、有機酸を含んでいてよい。本発明の培地組成物に含まれる有機酸は、有機物の酸であれば何を用いてもよいが、たとえばクエン酸、フマル酸、リンゴ酸、マレイン酸、酢酸、およびこれらの塩からなる群より選択される１以上の有機酸を例示することができる．本発明には、クエン酸を好適に用いることができる。この場合、クエン酸の濃度は適宜設定してよいが、たとえば培地組成物を培地として使用する際における培地中の濃度が０．０１〜１０重量％とすることが好ましく、０．０５〜８．０重量％とすることがより好ましく、０．１〜５．０重量％とすることがさらに好ましい。 In addition to the above components, the medium composition of the present invention may contain an organic acid. The organic acid contained in the medium composition of the present invention may be any organic acid as long as it is an organic acid, for example, citric acid, fumaric acid, malic acid, maleic acid, acetic acid, and salts thereof. One or more selected organic acids can be exemplified. In the present invention, citric acid can be preferably used. In this case, the concentration of citric acid may be appropriately set. For example, when the medium composition is used as a medium, the concentration in the medium is preferably 0.01 to 10% by weight, and 0.05 to 8. It is more preferable to set it as 0 weight%, and it is still more preferable to set it as 0.1-5.0 weight%.
本発明の培地組成物は、公知の添加剤、たとえばグルコース、ガラクトース、マンニトール等の糖を含む炭素源；亜鉛、マンガン、セレン等の微量金属元素；ペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン等の抗生物質；フェノールレッド、ブロモフェノールブルー等のｐＨ指示薬を含んでいてよい。 The medium composition of the present invention comprises a known additive, for example, a carbon source containing sugars such as glucose, galactose and mannitol; trace metal elements such as zinc, manganese and selenium; antibiotics such as penicillin, streptomycin and gentamicin; phenol red In addition, a pH indicator such as bromophenol blue may be included.
本発明の培地組成物の形状は、たとえば液体の形状、ペレット状、タブレット状、顆粒状等の固体の形状、および粉末の形状とすることができるが、これらに限定されない。
本発明の培地組成物は、液体の形状としたものにそのまま紅藻シアニジウム目を添加して液体培地として用いることができる。また、本発明の培地組成物は、真空濃縮等の方法によって濃縮した液体の形状としてもよく、噴霧乾燥、凍結乾燥、真空乾燥等の方法によって固体、または粉末の形状としてもよい。濃縮または乾燥した培地組成物は、適切な溶媒で希釈するか、適切な溶媒に溶解したものに紅藻シアニジウム目を添加して液体培地として用いることができる。さらに、本発明の培地組成物、もしくはその希釈物または溶解物は、さらに担体と混合して、プレート培地等の固形培地または半固形培地として用いてもよい。固形培地または半固形培地のために本発明の培地組成物に混合することのできる担体としては、ゲランガム、アガロース、寒天等の多糖類を例示することができるが、４０℃以上の高温で培養を行う場合は、ゲランガムを用いることが好ましい。
＜脂質の生産方法＞
本発明の別の態様は、上記培地組成物を用いた脂質の生産方法に関する。具体的には
（１）アンモニウム塩、および無機酸の組み合わせを含むよう改変された基礎培養体を含む培地であって、培地中の無機酸の濃度が無機酸イオン濃度として０．５μＭ〜１ｍＭであり、培地のｐＨが１〜３である培地中で紅藻シアニジウム目を培養する工程；および
（２）培養した紅藻シアニジウム目由来の脂質を回収する工程
を含む、脂質の生産方法に関する。
The shape of the medium composition of the present invention can be, for example, a liquid shape, a pellet shape, a tablet shape, a solid shape such as a granule shape, and a powder shape, but is not limited thereto.
The medium composition of the present invention can be used as a liquid medium by adding the red alga Cyanidia as it is to a liquid form. The medium composition of the present invention may be in the form of a liquid concentrated by a method such as vacuum concentration, or may be in the form of a solid or powder by a method such as spray drying, freeze drying, or vacuum drying. The concentrated or dried medium composition can be used as a liquid medium by diluting with an appropriate solvent, or by adding a red alga cyanidium to a solution dissolved in an appropriate solvent. Furthermore, the medium composition of the present invention, or a diluted or lysed product thereof may be further mixed with a carrier and used as a solid medium such as a plate medium or a semi-solid medium. Examples of the carrier that can be mixed with the medium composition of the present invention for a solid medium or a semi-solid medium include polysaccharides such as gellan gum, agarose, and agar. When performed, it is preferable to use gellan gum.
<Lipid production method>
Another aspect of the present invention relates to a method for producing lipids using the medium composition. Specifically, (1) a medium containing a basic culture modified to contain a combination of an ammonium salt and an inorganic acid, wherein the concentration of the inorganic acid in the medium is 0.5 μM to 1 mM as the inorganic acid ion concentration And a method for producing lipid, comprising the step of culturing the red alga Cyanidium in a medium having a pH of 1 to 3; and (2) recovering the lipid derived from the cultured red algae Cyanidia.
ここで、工程（１）における紅藻シアニジウム目の培養条件は、当業者が適宜設定することができる。たとえば紅藻シアニジウム目の培養温度は、４０℃〜５０℃とすることができ、４２℃〜４５℃としてもよい。また、通気条件としては、好気条件および嫌気条件のいずれをも用いることができる。光の照射条件としては、光条件および暗条件のいずれをも用いることができるが、光量５０００（１Ｘ）を維持することが好ましい。また、
本発明の方法によれば、紅藻シアニジウム目の良好な増殖を保つことができるため、培地中に含まれる紅藻シアニジウム目の細胞濃度に制限はない。
Here, the culture conditions for the red alga Cyanidium in step (1) can be appropriately set by those skilled in the art. For example, the culture temperature of the red alga Cyanidium may be 40 ° C to 50 ° C, or 42 ° C to 45 ° C. Further, as the aeration condition, any of an aerobic condition and an anaerobic condition can be used. As light irradiation conditions, both light conditions and dark conditions can be used, but it is preferable to maintain a light quantity of 5000 (1 ×). Also,
According to the method of the present invention, since good growth of the red algae cyanidium can be maintained, the cell concentration of the red algae cyanidium contained in the medium is not limited.
工程（２）において培養した紅藻シアニジウム目由来の脂質を回収する方法は、目的と用途に応じて当業者が適宜決定することができる。工程（１）で培養した紅藻シアニジウム目の細胞体は大量の脂質を含むため、該細胞体を含む培養物をそのまま、紅藻シアニジウム目由来の脂質として用いてよい。また、培養物を遠心分離や濾過分離等に供して、細胞体を濃縮した濃縮物を、紅藻シアニジウム目由来の脂質として用いることもできる。また、工程（１）で培養した紅藻シアニジウム目の細胞体を含む培養物、または細胞体の濃縮物や破砕物を、必要に応じて乾燥させたのち、適切な有機溶媒で処理して脂質を抽出してもよい。
＜紅藻シアニジウム目の細胞増殖および脂質生産の定量＞
本発明は、紅藻シアニジウム目の良好な増殖を維持しつつ、脂質を大量に生産させることのできる培地組成物および脂質の生産方法に関する。
A person skilled in the art can appropriately determine the method for recovering the lipid derived from the red alga Cyanidium cultured in step (2) according to the purpose and application. Since the cell body of the red algae cyanidium cultivated in the step (1) contains a large amount of lipid, the culture containing the cell body may be used as it is as a lipid derived from the red algae cyanidium. In addition, a concentrate obtained by subjecting the culture to centrifugation or filtration separation to concentrate cell bodies can be used as a lipid derived from the red alga Cyanidium. In addition, the culture containing the cell bodies of the red alga Cyanidium cultured in step (1), or the cell body concentrate or crushed material is dried as necessary, and then treated with an appropriate organic solvent to obtain lipids. May be extracted.
<Quantification of cell growth and lipid production of the red alga Cyanidiosis>
The present invention relates to a medium composition and a lipid production method capable of producing a large amount of lipid while maintaining good growth of the red alga Cyanidia.
紅藻シアニジウム目の増殖の指標として、培地中の紅藻シアニジウム目の細胞数を測定することができる。たとえば、紅藻シアニジウム目を培養した、あるいは培養中の培地の750 nmにおける光学密度（Optical Density、OD）を、分光光度計等を用いて測定することにより、紅藻シアニジウム目細胞の数を見積もることができる。たとえば、シゾンではODをHITACHI U-1800 Spectrophotometerで測定した場合、培地１ｍｌあたりの細胞数＝２×１０７×ＯＤ７５０＋３×１０６として求めることができる。 As an indicator of the growth of the red algae cyanidium, the number of red algae cyanidium in the medium can be measured. For example, by estimating the optical density (Optical Density, OD) at 750 nm of the culture medium of red algae, or using a spectrophotometer, the number of red algae cells is estimated. be able to. For example, when OD is measured with a HITACHI U-1800 Spectrophotometer in schizon, the number of cells per 1 ml of medium = 2 × 10 7 × OD 750 + 3 × 10 6 can be obtained.
また、紅藻シアニジウム目による脂質生産の指標としては、たとえば、紅藻シアニジウム目の細胞小器官である油滴をBODIPY等の脂質特異的な色素で染色し、油滴の細胞あたりの数を定量する方法（Kuroiwa T. et al., 2012, Cytologia, 77(3), 289-299）や、紅藻シアニジウム目から抽出した脂質の量をＴＬＣ分析、ガスクロマトグラフィー等によって定量する方法等が挙げられる。 In addition, as an index of lipid production by the red alga, Cyanidia, for example, oil droplets, which are organelles of the red alga, Cyanidia are stained with lipid-specific dyes such as BODIPY, and the number of oil droplets per cell is determined (Kuroiwa T. et al., 2012, Cytologia, 77 (3), 289-299) and the method of quantifying the amount of lipid extracted from the red alga Cyanidia by TLC analysis, gas chromatography, etc. It is done.
以下、本発明を実施例に基づいてより具体的に説明する。なお、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described more specifically based on examples. The present invention is not limited to these examples.
紅藻シアニジウム目および培地
紅藻シアニジウム目としては、シアニディオシゾン・メローラエ（以後、単にシゾンという）、シアニジウム・カルダリウム、およびガルデリア・スルフラリアを用いた。シゾンは、独立行政法人 国立環境研究所 微生物系統保存施設に株番号NIES-3377として寄託された株と同じものを用いた。
As the red alga Cyanidia and the medium red algae Cyanidia, cyanidiosizone merolae (hereinafter simply referred to as schizon), cyanidium caldarium, and Garderia sulphuraria were used. The same strain as the strain deposited as the strain number NIES-3377 at the National Institute for Environmental Studies Microbial System Storage Facility was used.
本実施例で用いたLDQ1培地、LDQ2培地の詳細な組成は図1の表に示した。LDQ1培地は、KH2PO4をMA2培地（非特許文献７）の100分の1濃度、すなわち0.08 mM含み、NaClを15 mM添加している。LDQ2培地は、KH2PO4をMA2培地（非特許文献７）の100分の1濃度、すなわち0.08 mM含み、(NH4)2SO4をMA2培地の8分の5濃度、すなわち25 mMふくむ。LDQ2培地はさらにNa2SO4をN−（窒素フリー）培地（非特許文献9）の8分の3濃度、すなわち15 mM含んでいる。本実施例では、濃硫酸を1リットルあたり0.3 ml添加することにより、pHを２程度に調整した。
シアニディオシゾン・メローラエ（シゾン）の培養実験
シゾン細胞をOD750＝0.5になるようLDQ1培地、LDQ2培地で希釈した後、24穴プレートに2 mlずつ分注し、アネロパウチケンキ（三菱ガス化学株式会社製 二酸化炭素発生剤、酸素吸収剤）とともに密封して40℃、連続明条件下で培養した。対照として、アンモニウムイオンを窒素源とするMA2培地と窒素源を含まない窒素飢餓培地のN−培地を用いた（非特許文献7、8）。16日後に増殖の指標として各培養のOD750を測定した（図２）。また、BODIPY染色後、細胞あたりの油滴の数を計数し、平均値を算出した（n≧10）。さらに、顕微定量法により油滴中の油の生産量を比較した。
The detailed composition of the LDQ1 medium and LDQ2 medium used in this example is shown in the table of FIG. The LDQ1 medium contains KH 2 PO 4 at a concentration that is 1/100 of that of the MA2 medium (Non-patent Document 7), that is, 0.08 mM, and NaCl is added at 15 mM. The LDQ2 medium contains KH 2 PO 4 at 1 / 100th of the MA2 medium (Non-patent Document 7), that is, 0.08 mM, and (NH 4 ) 2 SO 4 contains 5/5 of MA2 medium, that is, 25 mM. . The LDQ2 medium further contains Na 2 SO 4 at a concentration of 3/8, that is, 15 mM, of N- (nitrogen-free) medium (Non-patent Document 9). In this example, the pH was adjusted to about 2 by adding 0.3 ml of concentrated sulfuric acid per liter.
Cianidiozone / Mellorae (Shizon) culture experiment Dilute cisone cells with LDQ1 medium and LDQ2 medium so that OD 750 = 0.5, and then dispense 2 ml each into a 24-well plate. Sealed with carbon dioxide generator, oxygen absorber), and cultured at 40 ° C. under continuous light conditions. As controls, MA2 medium containing ammonium ion as a nitrogen source and N-medium of nitrogen starvation medium containing no nitrogen source were used (Non-patent Documents 7 and 8). After 16 days, OD 750 of each culture was measured as an index of growth (FIG. 2). In addition, after BODIPY staining, the number of oil droplets per cell was counted, and an average value was calculated (n ≧ 10). Furthermore, the amount of oil produced in the oil droplets was compared by a microscopic quantitative method.
実験の結果、図3のグラフに示すように、LDQ1培地、LDQ2培地で培養すると、対照となるMA2培地ほどの増殖速度はないものの、窒素飢餓となるN−培地の約5〜6倍の細胞の増殖が見られた。 As a result of the experiment, as shown in the graph of FIG. 3, when cultured in LDQ1 medium and LDQ2 medium, the growth rate is not as high as that of MA2 medium as a control, but about 5 to 6 times as many cells as N-medium that becomes nitrogen starved. Growth was observed.
細胞中の平均の油滴の数に関しては、図４に示すように、LDQ1培地、LDQ2培地では8個以上の形成が見られたが、MA2培地では殆ど形成されず、N−培地では3個前後形成されるに留まった。各培地で培養した細胞の油滴をBODIPYで染色した後の蛍光顕微鏡写真を図5に示した。LDQ1培地、LDQ2培地で培養した場合、分裂期の細胞、間期の細胞ともに大量に油滴を生産していた。MA2培地で培養した場合は、間期の細胞と同様、分裂期の細胞にも殆ど油滴が生産されていなかった。N−培地では、間期の細胞に数個の油滴が見られたが、細胞が小さくなり、分裂期の細胞自体が見られなかった。これら油滴の蛍光強度を顕微定量法により定量したのが図6のグラフである。図6に示すように、LDQ1培地、LDQ2培地ともに油滴量はMA2培地の約100倍、N−培地の約5〜6倍となった。 Regarding the average number of oil droplets in the cells, as shown in FIG. 4, 8 or more formations were observed in the LDQ1 medium and LDQ2 medium, but almost no formation was observed in the MA2 medium, and 3 in the N-culture medium. Stayed around being formed. FIG. 5 shows a fluorescence micrograph after staining oil droplets of cells cultured in each medium with BODIPY. When cultured in LDQ1 and LDQ2 media, both mitotic and interphase cells produced large amounts of oil droplets. When cultured in MA2 medium, almost no oil droplets were produced in the cells in the mitotic phase, as in the cells in the interphase. In the N-medium, several oil droplets were seen in the interphase cells, but the cells were small and the mitotic cells themselves were not seen. The graph of FIG. 6 shows the fluorescence intensity of these oil droplets quantified by a microscopic quantification method. As shown in FIG. 6, the amount of oil droplets was about 100 times that of MA2 medium and about 5 to 6 times that of N-medium in both LDQ1 medium and LDQ2 medium.
また、MA2培地、Ｎ−培地、LDQ1培地、およびLDQ2培地のそれぞれについて、培養16日目における培地1 mlあたりの総脂質生産量（細胞量（OD750）×細胞あたりの脂質量として計算）を図7に示す。LDQ1培地またはLDQ2培地でシゾンを培養した場合、MA2培地またはＮ−培地でシゾンを培養した場合と比べて、脂質の生産を顕著に増加させることができることが示された。 In addition, for each of MA2 medium, N-medium, LDQ1 medium, and LDQ2 medium, the total lipid production per 1 ml of medium (calculated as cell volume (OD 750 ) x lipid volume per cell) on the 16th day of culture It is shown in FIG. It has been shown that when schizon is cultured in LDQ1 medium or LDQ2 medium, lipid production can be remarkably increased as compared with the case where schizone is cultured in MA2 medium or N-medium.
以上のように、LDQ1やLDQ2培地を用いることにより、細胞増殖を阻害することなく、紅藻シアニジウム目に脂質を大量に生産させることが可能になった。
このように、窒素源としてアンモニウムイオンを添加した培地でも、リン酸濃度を減らし、塩を添加することにより、細胞増殖を維持したまま油滴を大量に生産させることが可能であることがわかった。特に、リン酸と塩の濃度が重要であり、アンモニウムイオンが40 mM含まれるとき、リン酸を0.8 mM以上含むと細胞増殖は良いが油滴は生産せず、0.8 μＭ以下しか含まないと細胞増殖が阻害されることを実験により確認した。
As described above, by using LDQ1 or LDQ2 medium, it became possible to produce a large amount of lipids in the red alga Cyanidium without inhibiting cell growth.
Thus, it was found that even in a medium supplemented with ammonium ions as a nitrogen source, it was possible to produce a large amount of oil droplets while maintaining cell growth by reducing the phosphate concentration and adding a salt. . In particular, the concentration of phosphoric acid and salt is important. When ammonium ion is contained at 40 mM, cell growth is good when phosphoric acid is contained at 0.8 mM or more, but no oil droplets are produced. Experiments confirmed that growth was inhibited.
NaClを添加したLDQ1培地とNa2SO4を添加したLDQ2培地でともに油滴の生産が著しく増加したことから、油滴の生産には塩化物イオンや硫酸イオンではなくナトリウムイオンが有効である。LDQ1培地を改変してNaCl濃度を変化させたところ、NaClを1.5 mM以上含むと細胞あたりの油滴数が倍になり、徐々に増加して150 mMでは3倍になることを実験により確認した。
シアニジウム・カルダリウムおよびガルデリア・スルフラリアの培養実験
また、シゾン以外の紅藻シアニジウム目として、シアニジウム・カルダリウムおよびガルデリア・スルフラリアについても、シゾンと同様に培養実験を行った。その結果を図８に示す。LDQ1培地またはLDQ2培地を用いてこれらの紅藻シアニジウム目を培養した場合、細胞の増殖を維持しつつ、MA2培地またはＮ−培地でシゾンを培養した場合と比べて、油滴の生産を顕著に増加させることができることが示された。
Since the production of oil droplets was remarkably increased in both LDQ1 medium added with NaCl and LDQ2 medium added with Na 2 SO 4 , sodium ions, not chloride ions or sulfate ions, were effective in producing oil droplets. When the NaCl concentration was changed by modifying the LDQ1 medium, it was confirmed by experiment that the number of oil droplets per cell doubled when NaCl contained 1.5 mM or more, and gradually increased to 3 times at 150 mM. .
Culture experiment of cyanidium caldarium and galderia sulphuraria In addition, cyanidium caldarium and garderia sulphuraria as a red alga cyanidium other than schizon were also cultured in the same manner as schizon. The result is shown in FIG. When these red algae cyanidium eyes are cultured using LDQ1 medium or LDQ2 medium, the production of oil droplets is markedly greater than when schizone is cultured in MA2 medium or N-medium while maintaining cell growth. It was shown that it can be increased.
本発明の培地組成物および脂質の生産方法は、増殖速度の速い紅藻シアニジウム目を増殖させ、かつ脂質を蓄積させることができるため、バイオマス燃料の原料等となりうる脂質を極めて高効率に製造することができる。また、本発明の培地組成物および脂質の生産方法は、高温、強酸性条件下で紅藻シアニジウム目を増殖させ、かつ脂質を蓄積させることができるため、野外における開放培養系においても紅藻シアニジウム目を優占的に培養することができるので、バイオマス燃料の原料等となり得る脂質を極めて低コストで製造することができる。 The medium composition and the lipid production method of the present invention can proliferate the red alga Cyanidium having a high growth rate and accumulate lipids, so that lipids that can be used as raw materials for biomass fuels are produced with extremely high efficiency. be able to. In addition, the medium composition and the method for producing lipids of the present invention can proliferate red algal cyanids and accumulate lipids under high temperature and strong acid conditions, so that red alga cyanidium can also be used in open culture systems in the field. Since the eyes can be preferentially cultured, lipids that can be used as raw materials for biomass fuels can be produced at extremely low cost.
Claims (12)
（ａ）硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウム、および炭酸アンモニウムからなる群より選択される１以上のアンモニウム塩；
（ｂ）リン酸、その金属塩、またはこれらの組み合わせを含む１以上の無機酸；および
（ｃ）塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、および硫酸水素ナトリウムからなる群より選択される１以上のナトリウム塩
の組み合わせを含むよう改変された基礎培養体を含み、ここで培地組成物を培地として使用する際において、培地のｐＨが１〜３であり、
紅藻シアニジウム目が、シアニディオシゾン・メローラエ（Cyanidioschyzon merolae）、シアニジウム・カルダリウム（Cyanidium caldarium）、およびガルデリア・スルフラリア（Galdieria sulphuraria）からなる群より選択される一以上の種であり、
培地組成物を培地として使用する際において、アンモニウム塩の濃度がアンモニウムイオン濃度として５０ｍＭ〜８０ｍＭであり、無機酸の濃度が無機酸イオン濃度として０．８μＭ〜０．８ｍＭであり、ナトリウム塩の濃度がナトリウムイオン濃度として１．５ｍＭ〜１５０ｍＭである、培地組成物。 A medium composition for producing lipids in the red alga Cyanidium, the following:
(A) one or more ammonium salts selected from the group consisting of ammonium sulfate, ammonium nitrate, ammonium chloride, and ammonium carbonate;
(B) one or more inorganic acids including phosphoric acid, metal salts thereof, or combinations thereof; and (c) a combination of one or more sodium salts selected from the group consisting of sodium chloride, sodium sulfate, and sodium hydrogen sulfate. When the medium composition is used as a medium here, the pH of the medium is 1 to 3,
The red alga Cyanidium is one or more species selected from the group consisting of Cyanidioschyzon merolae, Cyanidium caldarium, and Galdieria sulphuraria,
When the medium composition is used as a medium, the concentration of ammonium salt is 50 mM to 80 mM as ammonium ion concentration, the concentration of inorganic acid is 0.8 μM to 0.8 mM as inorganic acid ion concentration, and the concentration of sodium salt Is a medium composition having a sodium ion concentration of 1.5 mM to 150 mM.
（ａ）硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウム、および炭酸アンモニウムからなる群より選択される１以上のアンモニウム塩；
（ｂ）リン酸、その金属塩、またはこれらの組み合わせを含む１以上の無機酸；および
（ｃ）塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、および硫酸水素ナトリウムからなる群より選択される１以上のナトリウム塩
の組み合わせを含むよう改変された基礎培養体を含む培地であって、ｐＨが１〜３である培地中で、紅藻シアニジウム目を培養する工程；および
（２）培養した紅藻シアニジウム目由来の脂質を回収する工程
を含む、脂質の生産方法であって、
紅藻シアニジウム目が、シアニディオシゾン・メローラエ（Cyanidioschyzon merolae）、シアニジウム・カルダリウム（Cyanidium caldarium）、およびガルデリア・スルフラリア（Galdieria sulphuraria）からなる群より選択される一以上の種であり、
培地組成物を培地として使用する際において、アンモニウム塩の濃度がアンモニウムイオン濃度として５０ｍＭ〜８０ｍＭであり、無機酸の濃度が無機酸イオン濃度として０．８μＭ〜０．８ｍＭであり、ナトリウム塩の濃度がナトリウムイオン濃度として１．５ｍＭ〜１５０ｍＭである、方法。 (1) Following:
(A) one or more ammonium salts selected from the group consisting of ammonium sulfate, ammonium nitrate, ammonium chloride, and ammonium carbonate;
(B) one or more inorganic acids including phosphoric acid, metal salts thereof, or combinations thereof; and (c) a combination of one or more sodium salts selected from the group consisting of sodium chloride, sodium sulfate, and sodium hydrogen sulfate. A medium containing a basal culture modified so as to contain a pH of 1 to 3, and (2) a lipid derived from the cultured red algae Cyanididae; A method for producing lipid, comprising a step of collecting,
The red alga Cyanidium is one or more species selected from the group consisting of Cyanidioschyzon merolae, Cyanidium caldarium, and Galdieria sulphuraria,
When the medium composition is used as a medium, the concentration of ammonium salt is 50 mM to 80 mM as ammonium ion concentration, the concentration of inorganic acid is 0.8 μM to 0.8 mM as inorganic acid ion concentration, and the concentration of sodium salt There is a 1.5mM~150mM as sodium ion concentration, method.
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