JP6342585B2

JP6342585B2 - ４−フルオロ−チオ含有ａｐｐ２阻害剤、その組成物、および使用方法

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Publication number: JP6342585B2
Application number: JP2017524480A
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Inventors: ウィリアムエイチ．シモンズ，
Original assignee: ウィリアムエイチ．シモンズ，
Priority date: 2014-11-24
Filing date: 2015-10-30
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Description

本発明は、その天然基質がブラジキニンである酵素、膜結合型アミノペプチダーゼＰ２（ＡＰＰ２）を特異的に阻害することができるフルオロ−チオ含有化合物に関する。本化合物は、ブラジキニンの分解を阻害することにより、冠動脈の拡張、心筋虚血／再灌流障害時の心保護作用の提供、新しい血管形成の刺激、慢性心疾患および腎疾患時の臓器機能の改善、および耐糖能およびインスリン感受性の改善を含め、前記化合物が内因性ブラジキニンに体内で有益な作用を発揮させることができるため、医薬品として有用である。また、本発明は、本発明の前記ＡＰＰ２阻害薬を有する医薬組成物、および哺乳類患者、特にヒト患者におけるブラジキニン分解を阻害する方法に関する。

米国では、毎年１００万人以上が心筋梗塞（心臓発作）を発症し、５００，０００例を超える死亡に至っている。「急性心筋梗塞（ＭＩ）の効果的な治療は、心筋の虚血領域への血液の灌流を促す処置、すなわち再灌流療法に基づいている。」Ｆｅｒｄｉｎａｎｄｙｅｔａｌ．，"ＩｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｏｆＲｉｓｋＦａｃｔｏｒｓ，Ｃｏｍｏｒｂｉｄｉｔｉｅｓ，ａｎｄＣｏｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｓｗｉｔｈＩｓｃｈｅｍｉｃ／ＲｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎＩｎｊｕｒｙａｎｄＣａｒｄｉｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎｂｙＰｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ，Ｐｏｓｔｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ，ａｎｄＲｅｍｏｔｅＣｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ，"Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．６６：１１４２−１１７４ａｔ１１４４（Ｏｃｔｏｂｅｒ２０１４）．「しかし、再灌流では不可逆的な心筋細胞死に至ることがあり、これは致死的な心筋再灌流障害と呼ばれる。」同文献。「現在、市場には虚血／再灌流障害の併発に対して有効な治療はなく、ルーチンな医薬品は虚血／再灌流心筋を回復させない。」同文献。「したがって、虚血／再灌流障害による梗塞組織の範囲を限定する心保護薬の開発は、臨床的に大きな重要性を持つ。」同文献。Ｓｉｖａｒａｍａｎ，ｅｔａｌ．，"ＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃＴｈｅｒａｐｙＴｈａｔＳｉｍｕｌａｔｅｓＣｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇｆｏｒＣａｒｄｉａｃＩｓｃｈｅｍｉｃ／ＲｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎＩｎｊｕｒｙ，" Ｊ．ＣａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒＰｈａｒｍ．ａｎｄＴｈｅｒａｐ．，１９（１）８３−９６（２０１４）も参照。

急性心筋梗塞後に虚血／再灌流心筋を治療する１つの選択肢は、心臓が再灌流するとき、すなわち、心臓動脈の血餅が機械的に外れるまたは溶解するときに、ナノペプチドホルモンであるブラジキニンの心臓内濃度を上昇させることである。心臓への血流が回復することで心障害が軽減するが、血流の急速な増加自体が「再灌流障害」と呼ばれる別の種類の障害を引き起こすため、その軽減はそれほど効果的ではない。ブラジキニンはこの種の障害を予防することが知られている。しかし、ブラジキニン自体は患者に投与すると血圧を重篤に低下させる可能性があるため、よい薬とは言えない。ブラジキニンは虚血および再灌流時に心臓自体で産生されるが、効果が出るほど十分な量に増加することはない。これは、ブラジキニンが、血管内皮細胞に存在する膜結合型アミノペプチダーゼＰ２（ＡＰＰ２）とアンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）の２つの酵素によって急速に分解されるためである。ＡＰＰ２を阻害するとブラジキニンが増加し、これが再灌流障害を予防する。再灌流障害を引き起こす生化学的機序とこれを阻害する機序は、ほとんどの臓器に存在すると考えられる。したがって、ＡＰＰ２の阻害は、血流が一定期間停止し（虚血）、再開する（再灌流）ほとんどの状況で保護作用を示すはずである。これには、これに制限するものではないが、腎臓、脳（脳卒中）、肝臓、肺、および四肢の虚血／再灌流（Ｉ／Ｒ）、心肺バイパス手術後、および急速輸液後の心停止および出血性ショックなどの全身Ｉ／Ｒを含む。現在、再灌流障害を予防する既承認薬はない。

プロトタイプであるアミノペプチダーゼＰ阻害薬のアプスタチン（化学式Ｉ）は、摘出した灌流ラット心臓および肺でブラジキニンの分解を軽減することが示された。アプスタチンは静脈内投与されたブラジキニンの血圧低下作用を向上させた。重度高血圧のラットモデルでは、

それ自体は効果がないアプスタチンがＡＣＥ阻害薬と相乗的に作用し、血圧を正常値にまで低下させた［Ｋｉｔａｍｕｒａｅｔａｌ．"ＥｆｆｅｃｔｓｏｆａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅＰｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｎｋｉｎｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄｖａｓｏｄｅｐｒｅｓｓｏｒｒｅｓｐｏｎｓｅｓ，" Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２７６，Ｈ１６６４−Ｈ１６７１（１９９９）］。アプスタチンによるＡＰＰ２阻害でも心保護作用がみられ、摘出した灌流心臓を用いた心臓発作モデルでは、アプスタチンが心障害を７４％減少させた［Ｅｒｓａｈｉｎｅｔａｌ．，"ＣａｒｄｉｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｔｈｅａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅＰｉｎｈｉｂｉｔｏｒａｐｓｔａｔｉｎ：ｓｔｕｄｉｅｓｏｎｉｓｃｈｅｍｉａ／ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎｉｎｊｕｒｙｉｎｔｈｅｉｓｏｌａｔｅｄｒａｔｈｅａｒｔ，" Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，３４，６０４−６１１（１９９９）］。アプスタチンは、同量で再灌流誘導心室細動を抑制した。他の研究室で実施されたその後の研究では、アプスタチン投与によるＡＰＰ２の阻害が、局所的な心虚血を引き起こした未処置ラットの心筋梗塞サイズを実質的に減少させることが示された。［Ｗｏｌｆｒｕｍｅｔａｌ．，"Ａｐｓｔａｔｉｎ，ａｓｅｌｅｃｔｉｖｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｏｆａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅＰ，ｒｅｄｕｃｅｓｍｙｏｃａｒｄｉａｌｉｎｆａｒｃｔｓｉｚｅｂｙａｋｉｎｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｐａｔｈｗａｙ，" Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１３４，３７０−３７４（２００１）；Ｖｅｅｒａｖａｌｌｉｅｔａｌ．，"Ｉｎｆａｒｃｔｓｉｚｅｌｉｍｉｔｉｎｇｅｆｆｅｃｔｏｆａｐｓｔａｔｉｎａｌｏｎｅａｎｄｉｎｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｗｉｔｈｅｎａｌａｐｒｉｌ，ｌｉｓｉｎｏｐｒｉｌａｎｄｒａｍｉｐｒｉｌａｔｉｎｒａｔｓｗｉｔｈｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｍｙｏｃａｒｄｉａｌｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ，" Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｓ．，４８，５５７−５６３（２００３）］後の研究では、アプスタチンは虚血時、ただし、再灌流開始直前に投与しても有効であった。これは、アプスタチンは再灌流が開始したときにのみ虚血心臓組織に到達するため、アプスタチンが再灌流障害を特異的に予防していることを示している。

アプスタチンは優れた薬学的特性を有し、妥当な作用強度（マイクロモル）、特異性、および代謝安定性を示す。ただし、その化学的特性は、経口投与で有効な薬物としての有用性を制限する。アプスタチンおよび関連化合物は注射用薬物としての可能性があり、その作用強度および予測される腸吸収速度は、おそらく遅すぎて経口投与後に有効性を発揮することができない。経口生物学的利用能は、前記薬物が、高血圧または慢性心疾患または腎疾患の補助治療など、長期的に使用される場合は重要な性質となる。したがって、アプスタチンよりも作用強度が高い（すなわちＩＣ_５０が低い）ＡＰＰ２阻害薬を発見し、注射用薬物として低用量で投与することができる、および／またはその作用強度および化学的特性のため、経口で許容される形態で投与可能となるようにすることが本発明の目的である。

ブラジキニン値を上昇させる新規化合物は、α−ヒドロキシ、β−アミノトリペプチド〜デカペプチド類似体であり、「ＡｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅＰｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓａｎｄＵｓｅｓＴｈｅｒｅｏｆ」と題したＷｉｌｌｉａｍＨ．Ｓｉｍｍｏｎｓの米国特許第５，６５６，６０３号明細書に開示されている。

ブラジキニン値を上昇させる別の新規化合物は、２００８年６月２４日にＷｉｌｌｉａｍＳｉｍｍｏｎｓに交付された「Ｔｈｉｏ−ＣｏｎｔａｉｎｉｎｇＩｎｈｉｂｉｔｏｒｓＯｆＡｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅＰ，ＡｎｄＣｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓＴｈｅｒｅｏｆ」と題する米国特許第７，３９０，７８９号明細書に開示され、ＡＰＰ２（そこではｍＡＰＰ）およびＡＣＥ阻害薬に関連したその開示の参照により本明細書に組み込まれる。前記第７，３９０，７８９号明細書では、１０〜３４００ｎＭの濃度範囲で、基質としてＡｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ（０．５ｍＭ）を用い、精製ラット膜アミノペプチダーゼＰを５０％阻害する、様々なチオ含有トリペプチド類似体を開示している。しかし、これらの化合物の膜安定性および望みの薬物動態特性を最適化した場合、標的特異性の消失を示した。また、これらの化合物は、持続的で完全にＡＰＰ２を阻害するために必要な血中濃度に近い濃度でＡＣＥを阻害した。

現在の急性心筋梗塞の治療ガイドラインでは、ＡＣＥ阻害薬は主にアンギオテンシンＩＩの形成を阻害することで、血圧を急速に低下させる作用があるため、ＡＣＥ阻害薬を再灌流時に患者に投与すべきではないと述べている。一方、特異的ＡＰＰ２阻害薬は、それ自体は血圧を低下させない。したがって、ＡＰＰ２を阻害するが、ＡＣＥを阻害しない化合物は、内因性ブラジキニンの心保護作用を向上させるため、再灌流時に使用する場合により安全なはずである。そのため、本発明の目的は、ＡＰＰ２を大きく阻害するが、ＡＣＥの阻害は最小限である化合物を見つけることである。
この出願の発明に関連する先行技術文献情報としては、以下のものがある（国際出願日以降国際段階で引用された文献及び他国に国内移行した際に引用された文献を含む）。
（先行技術文献）
（特許文献）
（特許文献１）米国特許第４，５０７，３１２号明細書
（特許文献２）米国特許第４，５４９，９９２号明細書
（特許文献３）米国特許第４，６８４，６６０号明細書
（特許文献４）米国特許第５，５０８，２７２号明細書
（特許文献５）米国特許第５，６５６，６０３号明細書
（特許文献６）米国特許第６，７７７，４４３号明細書
（特許文献７）米国特許第７，３９０，７８９号明細書
（非特許文献）
（非特許文献１）Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｃｉｓ−ａｎｄｔｒａｎｓ−４−Ｆｌｕｏｒｏ−Ｌ−ｐｒｏｌｉｎｅｉｎＡｑｕｅｏｕｓＳｏｌｕｔｉｏｎ，Ｊ．Ｔ．ＧｅｒｉｇａｎｄＲ．Ｓ．ＭｃＬｅｏｄ，ＪＡＣＳ，９５：１７，５７２５−５７２９，Ａｕｇ．２２，１９７３．
（非特許文献２）Ｆｅｒｄｉｎａｎｄｙｅｔａｌ．，"ＩｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｏｆＲｉｓｋＦａｃｔｏｒｓ，Ｃｐｍｏｒｂｉｔｉｅｓ，ａｎｄＣｏｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｓｗｉｔｈＩｓｃｈｅｍｉａ／ＲｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎＩｎｊｕｒｙａｎｄＣａｒｄｉ，"Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．６６：１１４２−１１７４，Ｏｃｔ．２０１４．
（非特許文献３）Ｓｉｖａｒａｍａｎｅｔａｌ．，"ＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃＴｈｅｒａｐｙＴｈａｔＳｔｉｍｕｌａｔｅｓＣｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇｆｏｒＣａｒｄｉａｃＩｓｃｈｅｍｉｃ／ＲｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎＩｎｊｕｒｙ，"Ｊ．Ｃａｒｄｖａｓｃ．ＰｈａｒｍａｃｏｌＴｈｅｒ．，２０１４１９（１）：８３−９６．
（非特許文献４）Ｍｏｃｋｅｔａｌ．，"ＳｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙａｎｄｐＨｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅｏｆＰｒｏｌｉｎｅＣｌｅａｖａｇｅｂｙＰｒｏｌｉｄａｓｅ，"Ｊ．ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍ．，２６５（３２），１５，ｐｐ１９６００−１９６０５（１９９０）．

本出願人は、ＡＰＰ２を選択的に阻害するが、ＡＣＥは阻害しないトリペプチド類似体である、新規４（Ｓ）−フルオロ−チオ−化合物を発見した。これは、ＡＰＰ２およびＡＣＥはいずれも同じ基質であるブラジキニンを分解するが、ＡＣＥの阻害は望ましくない血圧の低下とも関連しているため、哺乳類患者の再灌流障害治療に望ましい特徴である。したがって、最初の態様では、本発明は化学式ＩＩの化合物に関し、

式中、Ｒ_１はＨまたは

であり、
Ｒ_２はＨ、１〜６炭素原子を有するアルキルまたは置換アルキル、または
４〜１２炭素原子を有するシクロアルキル−（ＣＨ_２）_ａ−−、アリール−（ＣＨ_２）_ａ−−、置換アリール−（ＣＨ_２）_ａ−−、またはヘテロアリール−（ＣＨ_２）_ａ−−であり、
Ｒ_３は１〜６炭素原子を有するアルキルまたは置換アルキル、または
４〜１２炭素原子を有するシクロアルキル−（ＣＨ_２）_ａ−−、アリール−（ＣＨ_２）_ａ−−、置換アリール−（ＣＨ_２）_ａ−−、またはヘテロアリール−（ＣＨ_２）_ａ−−であり、
ａは０または１〜６の整数である化合物、
またはその薬学的に許容される塩である。

好ましくは、本発明は化学式ＩＩの化合物に関し、
式中、Ｒ_１はＨまたはＲ_３−（ＣＯ）−であり、
Ｒ_２はＨ、または１〜６炭素原子を有するアルキルであり、
Ｒ_３は１〜６炭素原子を有するアルキルである化合物、
またはその薬学的に許容される塩である。

さらに好ましくは、本発明は化学式ＩＩの化合物に関し、
式中、Ｒ_１はＨであり、
Ｒ_２はＨ、または１〜６炭素原子を有するアルキルである化合物、
またはその薬学的に許容される塩である。

最も好ましくは、本発明は化学式ＩＩの化合物に関し、
式中、Ｒ_１はＨであり、Ｒ_２はＨである化合物、
またはその薬学的に許容される塩である。本化合物は、本明細書においてＳＴ−１１５と言及され、また、以下に示す化学式ＩＩＩの化合物である。

その第２の態様では、本発明は、治療有効量の化学式ＩＩの化合物を含む薬学的に許容される担体を有する医薬組成物に関し、

式中、Ｒ_１はＨまたは

であり、
Ｒ_２はＨ、１〜６炭素原子を有するアルキルまたは置換アルキル、または
４〜１２炭素原子を有するシクロアルキル−（ＣＨ_２）_ａ−−、アリール−（ＣＨ_２）_ａ−−、置換アリール−（ＣＨ_２）_ａ−−、またはヘテロアリール−（ＣＨ_２）_ａ−−であり、
Ｒ_３は１〜６炭素原子を有するアルキルまたは置換アルキル、または
４〜１２炭素原子を有するシクロアルキル−（ＣＨ_２）_ａ−−、アリール−（ＣＨ_２）_ａ−−、置換アリール−（ＣＨ_２）_ａ−−、またはヘテロアリール−（ＣＨ_２）_ａ−−であり、
ａは０または１〜６の整数である化合物、
またはその薬学的に許容される塩である。より好ましい組成物は、本明細書の詳細な説明で説明される。

第３の態様では、本発明は哺乳類患者におけるブラジキニン分解を阻害する方法に関し、ブラジキニン分解の阻害が必要な哺乳類患者に、治療有効量の化学式ＩＩの化合物を含む、薬学的に許容される担体を有する医薬組成物を投与する工程を有し、

式中、Ｒ_１はＨまたは

であり、
Ｒ_２はＨ、１〜６炭素原子を有するアルキルまたは置換アルキル、または
４〜１２炭素原子を有するシクロアルキル−（ＣＨ_２）_ａ−−、アリール−（ＣＨ_２）_ａ−−、置換アリール−（ＣＨ_２）_ａ−−、またはヘテロアリール−（ＣＨ_２）_ａ−−であり、
Ｒ_３は１〜６炭素原子を有するアルキルまたは置換アルキル、または
４〜１２炭素原子を有するシクロアルキル−（ＣＨ_２）_ａ−−、アリール−（ＣＨ_２）_ａ−−、置換アリール−（ＣＨ_２）_ａ−−、またはヘテロアリール−（ＣＨ_２）_ａ−−であり、
ａは０または１〜６の整数である化合物、
またはその薬学的に許容される塩である。さらに好適な組成物を用いた本発明の追加の方法が、本明細書の詳細な説明に開示される。

図１は、ベースライン、および虚血性エピソード時（２５分間）、ただし、再灌流を発生させる５分前に生理食塩水、アプスタチン、またはＳＴ−１１５（化学式ＩＩＩの化合物）投与後、マウスの血中尿素窒素（ＢＵＮ）濃度（ｙ軸）をｍｇ／ｄＬであらわした棒グラフである。

最初の態様では、本発明は化学式ＩＩの化合物に関し、

式中、Ｒ_１はＨまたは

「薬学的に許容される塩」の用語は、本明細書に用いるとおり、これに限定されるものではないが、鎮痛薬、治療薬、その他の物質などを含む組成物の、比較的非毒性の無機および有機塩基付加塩を指す。薬学的に許容される塩の例には、アンモニア、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アルミニウム、亜鉛などの過水酸化物、炭酸塩、および重炭酸塩などの無機塩基に由来する塩を含む。塩は、非毒性でそのような塩を形成する十分な強さのものを含む適切な有機塩基により形成される。説明の目的で、そのような有機塩基のクラスには、メチルアミン、ジメチルアミン、およびトリエチルアミンなどのモノー、ジー、およびトリアルキルアミン；モノー、ジー、およびトリエタノールアミンなどのモノー、ジー、またはトリヒドロキシアルキルアミン；アルギニンおよびリジンなどのアミノ酸；グアニジン；Ｎ−メチルグルコサミン；Ｎ−メチルグルカミン；Ｌ−グルタミン；Ｎ−メチルピペラジン；モルホリン；エチレンジアミン；Ｎ−ベンジルフェネチルアミン；（トリヒドロキシメチル）アミノエタンなどを含む。例えば、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，６６：１−１９（１９７７）を参照。

「１〜６炭素原子を有するアルキル」の用語では、直鎖または分岐鎖炭素原子を含むことを意味する。典型的な分岐鎖アルキルは３〜６炭素原子を有し、イソプロピル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔ−ブチル、イソペンチル、ネオペンチル、シクロペンチル、イソへキシル、ｓｅｃ−へキシル、２，２−ジメチルブチル、３−メチルペンタ−３−イル、シクロへキシルなどを含む。

化学式ＩＩの化合物では、Ｒ_１がＲ_３（ＣＯ）−の場合、前記硫黄はアシル化され、チオエステル型（−Ｓ−（ＣＯ）−Ｒ_３）となる。エステルとして、化学式ＩＩの化合物はプロドラックの形態をとる。化学式ＩＩまたは化学式ＩＩＩの化合物が阻害する酵素ＡＰＰ２の活性部位で金属イオンと結合するためには、遊離チオール（−ＳＨ）が存在することが必要である。前記チオエステルのプロドラッグは、患者に投与されるまでＡＰＰ２阻害活性を持たず、患者に投与されると、投与を受けた患者の血中または組織中のエステラーゼによりアシル基が開裂する。本発明の化合物をプロドラッグとして注射または注入により投与すると、注射または注入部位の活性薬物濃度は高くならないことが保証される。このように投与したプロドラッグは、活性化する前に希釈され、体内に分布する。化学式ＩＩの種類にエステルの選択肢がいくつかある理由の１つは、前記エステラーゼにより急速（アセチル）またはゆっくりと開裂するエステルを選択することで、プロドラッグの活性化率をコントロールできるためである。また、化学式ＩＩの化合物のＳ−アシル化プロドラッグ型は保存する場合も化学的に安定であり、遊離スルフヒドリル基（−ＳＨ）が酸化を受け、ジスルフィドホモダイマー（これ自体は不活性）を形成する可能性がある。

さらに、−ＳＨとＣ末端カルボキシル基のアクリル化により化学式ＩＩのジエステルプロドラッグが生成し、これは十分疎水性であるため、薬物動態予測アルゴリズムに基づき、ＧＩ管から経口吸収される。そのため、前記ジエステルは丸薬またはシロップの形態で患者に投与することができる。代わりに、前記ジエステルを注射または注入により患者に投与した場合、患者の血中または組織中のエステラーゼが両方のエステルを加水分解し、前記チオエステルをその活性型であるスルフヒドリル（−ＳＨ）型に、また前記カルボキシエステルを遊離カルボキシル型に変換する。この化学式ＩＩのチオールカルボキシル型は本発明の活性成分であり、すなわち、ＡＰＰ２の強力で選択性の高い阻害剤である。

化学式ＩＩまたは化学式ＩＩＩのチオエステルの１つの例はアセチル化チオエステルであり、これは本明細書の化学式ＩＶの化合物である。前記化学式ＩＶの化合物は、本明細書の実施例１Ｄによって作成され、

最も好ましくは、本発明は化学式ＩＩの化合物に関し、
式中、Ｒ_１はＨであり、Ｒ_２はＨである化合物、
またはその薬学的に許容される塩である。本化合物は、本明細書において以下に示す化学式ＩＩＩの化合物として言及される。

さらに別の実施形態では、本発明が化学式ＩＩの化合物に関し、式中、Ｒ_１はＲ_３（ＣＯ）−であり、Ｒ_３はメチルであり、Ｒ_２はＨである化合物、またはその薬学的に許容される塩である。この化合物は実施例に示され、本明細書では化学式ＩＶの化合物と言及される。

ヒトモデルの試験では、最新の先行研究である米国特許第７，３９０，７８９号（Ｓｉｍｍｏｎｓ）の非フルオロペプチド類似体（化学式Ｖ、ＶＩ、およびＶＩＩの化合物）と比較し、本発明の化学式ＩＩＩのフルオロ類似体はヒトＡＰＰ２酵素を選択的に抑制するが、ヒトＡＣＥ酵素は抑制しないことが分かったため、本発明の化合物はブラジキニンの抑制に有用である。化学式Ｖ、ＶＩ、およびＶＩＩの化合物の不斉炭素原子は、他に記載のない限り、Ｓ配置である。ペプチド類似体のＡＰＰ２およびＡＣＥ阻害活性を決定する方法は、本明細書の実施例２および３に説明する。比較データは、本明細書の表１に報告する。具体的には、表１では各被験化合物の化学構造、ＡＰＰ２のＩＣ５０（ｎｍｏｌ／Ｌ）、ＡＣＥのＩＣ５０、次にＡＣＥ／ＡＰＰ２に対する本化合物のＩＣ５０比を比較している。表１では、ＡＣＥ／ＡＰＰ２のＩＣ５０比で計算した選択性の低下をもとに、前記化合物を降順に配列した。

表１に開示したとおり、本発明の化学式ＩＩＩの化合物は４（Ｓ）−フルオロを有し、ヒトＡＰＰ２を阻害する優れた能力（ＩＣ５０は３．７ｎＭ／Ｌ）およびヒトＡＣＥを阻害しない優れた能力（ＩＣ５０６８，０００ｎＭ／Ｌ）を示した。これは、ＡＣＥ／ＡＰＰ２に対する本化合物のＩＣ５０比が１８，０００であることに反映されている。４（Ｓ）−フルオロがない比較化合物の次に最適な比率は、先行技術の化学式Ｖの化合物によって示され、ＩＣ５０比が１，９００であった。化学式ＶＩおよびＶＩＩの比較化合物は、実質的にＡＣＥ／ＡＰＰ２に対するＩＣ５０比が小さく、それぞれ１，２００および１６０であった。化学式ＩＩＩの化合物のＡＰＰ２に対する親和性は、予想外にＡＣＥよりも１８，０００倍高かったため、ＡＣＥに対する阻害作用がなく、ＡＰＰ２を完全に阻害する治療用量のＳＴ−１１５を投与することが可能である。したがって、この化学式ＩＩＩの化合物の特性は、再灌流障害を予防するため、再灌流時に心筋梗塞患者に投与される医薬品に理想的である。

化学式ＩＩＩの化合物は、（ｉ）ＡＰＰ２を阻害するため、低濃度でＡＰＰ２のブラジキニン分解を阻害するが、（ｉｉ）非常に高濃度でもＡＣＥを選択的に阻害しないという特性が組み合わさっており、検討された４（Ｓ）−フルオロ化合物よりも優れ、予想外であった。

先行研究では、プロトタイプであるＡＰＰ２阻害剤のアプスタチンが心臓の虚血／再灌流障害を大幅に軽減できることが示された。図１は、アプスタチンおよびＳＴ−１１５（式ＩＩＩの化合物）も腎臓の虚血／再灌流障害を軽減できることを示している。この研究では、マウスの両腎臓への血流が２５分間遮断され、虚血となった。その後、血流は回復した（再灌流）。この腎障害モデルでＡＰＰ２の阻害作用を決定するため、アプスタチン、ＳＴ−１１５、または生理食塩水（対照）を再灌流前に５分間静脈内投与した。再灌流の２日後、血中尿素窒素（ＢＵＮ、腎機能障害のマーカー）を測定した。図１では、データを平均±平均の標準誤差として示している。ウェルチの補正を用いた対応のないｔ−検定により、各薬物を個別に対照と比較した。＊＊アプスタチン対生理食塩水、ｐ<０．０１、＊＊＊ＳＴ−１１５対生理食塩水、ｐ<０．００１。

図１は、生理食塩水投与マウスのＢＵＮ値がマウスのベースライン値と比較して非常に高いことを示しており、重大な腎障害を示している。生理食塩水と比較し、アパスタチンはＢＵＮを４９％低下させたが、ＳＴ−１１５はこれを５６％低下させた。さらに、生理食塩水投与対照マウスの２９％が事前に定義した２日間のＢＵＮ測定点の前に死亡したが、アパスタチンまたはＳＴ−１１５投与マウスで早期死亡は認められなかった。アパスタチンおよびＳＴ−１１５が再灌流直前に投与すると保護効果を示すという事実は、このモデルでは、アパスタチンとＳＴ−１１５が虚血障害ではなく再灌流障害を特異的に遮断していることを示している。したがって、化学式ＩＩＩの４（Ｓ）−フルオロ化合物、および化学式ＩＩの関連４（Ｓ）−フルオロ化合物は、哺乳類患者の組織の再灌流障害を遮断する方法において、医薬品として有用と考えられる。より好適な実施形態では、これらは、哺乳類患者の心臓または腎臓への再灌流障害を遮断する方法において、哺乳類患者に投与する医薬品として有用と考えられる。

アパスタチンおよび化学式ＩＩＩの化合物は、いずれもＡＰＰ２を阻害する、構造的に異なる分子である。いずれも同様の保護作用を示すという事実は、これらの作用機序が同様であり、すなわち、内因性ＡＰＰ２を阻害することを示している。この２つの化合物の機能的な違いは、化学式ＩＩＩの化合物がアパスタチンよりも１８０倍低い用量で効果を示すことであり、これは、ｉｎｖｉｔｒｏでＡＰＰ２を阻害するＩＣ_５０値の違いが大きいことと一致している。ＡＰＰ２の阻害が心臓および腎臓の再灌流障害をいずれも軽減することができるという事実は、再灌流障害を形成および遮断する機序がいずれも、すべてではないとしても全身の多くの他の組織に重複して存在することを示している。したがって、化学式ＩＩＩの４（Ｓ）−フルオロ化合物、および化学式ＩＩの関連４（Ｓ）−フルオロ化合物は、多くのタイプの虚血／再灌流障害を遮断するために有用であるはずである。

式中、Ｒ_１はＨまたは

本明細書で用いる「治療有効量」の用語は、その量の薬物または医薬品が、研究者または臨床医が求める組織、系、または動物の生物学的または医学的反応を誘発することを意味する。前記化合物の有効であるが、毒性のない量が治療に用いられる。本発明の化合物により症状を予防または治療する投与法は、前記哺乳類の種類、年齢、体重、性別、および医学的状態、前記症状の重症度、利用する特定化合物の投与経路を含む様々な因子により選択される。当業者の医師または獣医師は、前記状態の進行を予防または停止する薬物の投与経路に基づき、有効量を容易に決定および処方するだろう。そのような進行では、前記医師または獣医師は最初に比較的低用量を利用し、その後、最大反応が得られるまで増量する。

ラットでは、アプスタチンによるブラジキニンの保護は、１時間かけて０．０８〜０．８ｍｇ／ｋｇを静脈内投与した場合に認められた。本発明のより強力な阻害剤は、１０〜１８０倍低い用量で有効であるはずである。例えば、表１を参照。作用強度の低い阻害剤では、同じ治療結果を得るためにより多くの用量が必要である。本発明の化合物の典型的な治療有効量は、静脈内投与した場合に約０．０００３ｍｇ／ｋｇ〜０．８ｍｇ／ｋｇである。

選択した投与経路にかかわらず、毒性はないが、治療有効量である本発明の１若しくはそれ以上の化合物が治療に利用される。本発明の化合物により高血圧症状を予防または治療する、または心筋梗塞／再灌流障害を治療するため、前記患者のタイプ、年齢、体重、性別、および医学的状態、前記症状の重症度、投与経路、および治療に利用する特定化合物により用量を選択する。当業者の医師または獣医師は、前記状態の進行を予防または停止するために必要な薬物の有効量を容易に決定および処方することができる。そのような進行では、前記医師または獣医師は最初に比較的低用量を利用し、その後、最大反応が得られるまで増量することができる。本発明の化合物の１日量は、本発明の化合物のＩＣ_５０によって異なる。しかし、経口用量は、約０．１ｍｇ／ｋｇから約２００ｍｇ／ｋｇの範囲が通常である（好ましくは約２．０〜８４．０ｍｇ／ｋｇの範囲（経口））。

本明細書に用いるとおり、「薬学的に許容される担体」の用語は、望みの特定の投与形態に適した分散または懸濁補助剤、界面活性剤、ｐＨ調製剤、等張剤、増粘または乳化剤、保存料、固体結合剤、潤滑剤などの薬学的に許容される材料、組成物、または溶媒を意味する。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：ＴｈｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅｏｆＰｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈＥｄ．，ｅｄ．Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ，ＬｉｐｐｉｎｃｏｔｔＷｉｌｌｉａｍｓ & Ｗｉｌｋｉｎｓ，２０００では、薬学的に許容される組成物の製剤化に使用される様々な担体およびその調整において既知の技術について開示している。また、Ｓｔｒｉｃｋｌｅｙ，ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈ，２１（２）２０１−２３０（２００４）では、経口または非経口投与用に化合物を可溶化する市販製剤に使用される、薬学的に許容される賦形剤についてレビューしている。望ましくない生物学的作用を生じる、またそれ以外では、薬学的に許容される組成物の他の成分と有害な相互作用を生じるなどにより、従来の担体媒体が本発明の化合物と適合しない範囲を除き、その使用は本発明の範囲内であると考えられる。薬学的に許容される担体として機能することができる材料の例は、これに限定されるものではないが、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レクチン、ヒト血清アルブミンなどの血清蛋白質、リン酸塩、炭酸塩、水酸化マグネシウム、および水酸化アルミニウムなどの緩衝物質、グリシン、ソルビン酸、またはソルビン酸カリウム、飽和植物脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、発熱性物質を含まない水、硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、フタル酸水素カリウム、塩化ナトリウム、および亜鉛塩などの塩または電解質、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸塩、ワックス、ポリエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロックポリマー、羊毛脂；ラクトース、グルコース、スクロース、およびマンニトールなどの糖；トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプンなどのデンプン、セルロースおよびカルボキシルメチル・セルロース・ナトリウム、エチルセルロース、およびセルロース・アセテートなどのその誘導体、粉末トラガカント；モルツ、ゼラチン、タルク；カカオ脂および坐薬ワックスなどの賦形剤；ピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、セサミ油、オリーブ油、トウモロコシ油、および大豆油などのオイル；プロピレングレコールおよびポリエチレングリコールなどのグリコール；オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどのエステル；寒天、アルギン酸、等張食塩水、リンガー液、エタノール、イソプロピルアルコール、ヘキサデシルアルコール、およびグリセロールなどのアルコール；ヒドロキシプロピルｐ−シクロデキストリンおよびスルホブチルエーテルなどのシクロデキストリン；β−シクロデキストリン；ラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤；鉱油および石油などの石油炭化水素を含む。さらに、製剤化の担当者の判断で、着色料、放出剤、コーティング剤、甘味料、香味料および香料、保存料、および抗酸化剤が前記組成物に存在することもできる。

本発明の医薬組成物は、とりわけ従来の顆粒化、混合、溶解、カプセル化、凍結乾燥、または乳化プロセスなどの当該分野で周知の方法により製造される。組成物は、顆粒、沈殿物、または粒子状物質、凍結乾燥、回転乾燥、または噴霧乾燥粉末を含む粉末、アモルファス粉末、錠剤、カプセル、シロップ、坐薬、エマルジョン、エリキシル剤、懸濁液、または溶液を含む様々な形態で製造することができる。

薬学的に許容される担体と併用すると、本発明の化合物は、薬学分野で既知の以下に説明する液体担体を用いた経口、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、または局所投与に適したものとなる。代わりに、本発明の医薬組成物を坐薬またはブージー剤などの形態で経直腸または経膣投与することができる。前記医薬組成物の好適な形態は、経口または静脈内投与用、より典型的には経口投与用に製剤化される。

本発明の経口投与医薬組成物および方法については、本明細書に記載の前述の活性化合物が、典型的には、意図する投与様式および形態、つまり、経口錠剤、カプセル、ソフトカプセル、エリキシル、シロップ、ドロップなどについて適切に選択され、周知の薬学的慣行と一致した、適切な薬学的希釈液、賦形剤、または担体（本明細書では、集合的に「担体」材料と言及する）と混合して提供される。

例えば、錠剤またはカプセルの形態での経口投与では、治療有効量の本発明の１若しくはそれ以上の化合物を、ラクトース、デンプン、スクロース、セルロース、ステアリン酸マグネシウム、第二リン酸カルシウム、硫酸カルシウムマンニトールなどの薬学的に許容される経口非毒性不活性担体、またはその様々な組み合わせと併用する。ソフトカプセル、エリキシル、シロップ、ドロップなどの液剤での経口投与では、治療有効量の活性薬物成分を、水、生理食塩水、エタノール、ポリエチレン、グリコール、プロピレングリコール、トウモロコシ油、綿実油、ピーナッツ油、ゴマ油、ベンジルアルコール、様々な緩衝液などの薬学的に許容される経口非毒性不活性担体、またはその組み合わせと併用する。望ましいまたは必要な場合、適切な結合剤、潤滑剤、崩壊剤、および着色料を前記混合物に組み込むことができる。適切な結合剤には、デンプン、ゼラチン、天然糖、トウモロコシ甘味料、アカシア、アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール、およびワックスなどの天然および合成ゴム、またはその組み合わせを含む。これらの剤形で使用できる潤滑剤には、ホウ酸、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウムなど、またはその組み合わせを含む。崩壊剤には、制限はないが、デンプン、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、グァーガムなど、またはその組み合わせを含む。適切な場合、甘味料および香味料および保存料を含めることができる。

血管内、腹腔内、皮下、または筋肉内投与では、本発明の１若しくはそれ以上の化合物を、水、等張食塩水、水性デキストロースなどの適切な担体と併用する。局所投与では、本発明の１若しくはそれ以上の化合物を、薬学的に許容されるクリーム、オイル、ワックス、ゲルなどと併用することができる。選択した投与経路にかかわらず、本発明の化合物は、当業者に既知の従来の方法で薬学的に許容される形態に製剤化する。前記化合物は、薬学的に許容される塩基付加塩を用いて製剤化することもできる。さらに、前記化合物またはその塩は、適切な水和型で使用することができる。

ＡＰＰ２拮抗薬としての活性のおかげで、化学式ＩＩの化合物はブラジキニン（Ｂｋ）の分解を阻害する上で有用であり、これは同様に、（本明細書で既に議論した腎および冠動脈などの）動脈拡張、心虚血／再灌流障害の軽減、新しい血管の形成刺激、および腎灌流および機能の上昇といった有益な作用を有する。結果として、本発明の化合物は、哺乳類患者、好ましくはヒト患者のブラジキニン分解阻害、高血圧の治療、心筋虚血／再灌流障害の治療、または腎機能向上を目的とした活性薬物として有用である。当業者の医師または獣医師は、患者が高血圧、心筋虚血、または腎機能低下を示しているか否かを容易に決定することができる。好適な効果は、哺乳類患者の虚血／再灌流障害軽減と関連する。

本明細書で用いるとおり、「哺乳類患者」はラット、マウス、ウマ、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、または霊長類など、治療を必要とする哺乳類を意味する。好ましくは、哺乳類患者は霊長類である。より好ましくは、前記霊長類はヒトである。

好ましくは、本発明の医薬組成物は化学式ＩＩの化合物であり、
式中、Ｒ_１はＨまたはＲ_３−（ＣＯ）−であり、
Ｒ_２はＨ、または１〜６炭素原子を有するアルキルであり、
Ｒ_３は１〜６炭素原子を有するアルキルである化合物、
またはその薬学的に許容される塩である。

さらに好ましくは、本発明の医薬組成物は化学式ＩＩの化合物であり、
式中、Ｒ_１はＨであり、
Ｒ_２はＨ、または１〜６炭素原子を有するアルキルである化合物、
またはその薬学的に許容される塩である。

最も好ましくは、本発明の医薬組成物は化学式ＩＩの化合物であり、
式中、Ｒ_１はＨであり、Ｒ_２はＨである化合物、
またはその薬学的に許容される塩である。本化合物は、本明細書においてＳＴ−１１５と呼ばれ、また、化学式ＩＩＩの化合物である。

第３の態様では、本発明は哺乳類患者におけるブラジキニン分解を阻害する方法に関し、ブラジキニン分解の阻害が必要な哺乳類患者に、薬学的に許容される担体を有する医薬組成物、および治療有効量の化学式ＩＩの化合物を投与する工程を有し、

式中、Ｒ_１はＨまたは

好ましくは、本発明の方法において、前記医薬組成物は化学式ＩＩの化合物であり、
式中、Ｒ_１はＨまたはＲ_３−（ＣＯ）−であり、
Ｒ_２はＨ、または１〜６炭素原子を有するアルキルであり、
Ｒ_３は１〜６炭素原子を有するアルキルである化合物、
またはその薬学的に許容される塩である。

さらに好ましくは、本発明の方法において、前記医薬組成物は化学式ＩＩの化合物であり、
式中、Ｒ_１はＨであり、
Ｒ_２はＨ、または１〜６炭素原子を有するアルキルである化合物、
またはその薬学的に許容される塩である。

最も好ましくは、本発明の方法において、前記医薬組成物は化学式ＩＩの化合物であり、
式中、Ｒ_１はＨであり、Ｒ_２はＨである化合物、
またはその薬学的に許容される塩である。本化合物は、本明細書においてＳＴ−１１５と言及され、また、化学式ＩＩＩの化合物である。

別の実施形態では、哺乳類患者におけるブラジキニン分解の阻害方法が、虚血エピソード後の哺乳類患者における再灌流障害の予防または改善と関連している。典型的には、上記の方法において、虚血エピソード後に再灌流障害を受ける哺乳類患者の組織が、腎臓、肺、肝臓、心筋、脳、四肢、または心停止後の全身である。好ましくは、前記組織が前記腎臓または前記心筋である。さらに好ましくは、前記組織が前記心筋である。

実施例１
［（Ｓ）−２−メルカプト−４−メチルペンタノイル］−４（Ｓ）−フルオロ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−［（３Ｒ）−β−Ｐｒｏ］−ＯＨの調製
上記の化学式ＩＩＩのタイトル化合物［（Ｓ）−２−メルカプト−４−メチルペンタノイル］−４（Ｓ）−フルオロ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−［（３Ｒ）−β−Ｐｒｏ］−ＯＨは、ＣＰＣＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＩｎｃ．（米国カリフォルニア州Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ）が契約合成業者として商業的に調製した。合成方法を以下に説明する。

Ｂ．（Ｒ）−２−ブロモ−４−メチルペンタン酸の調製
（Ｒ）−２−アミノ−４−メチルペンタン酸（Ｈ−Ｄ−Ｌｅｕ−ＯＨ、４ｇ、３０．５ｍｍｏｌ）をＨＢｒ４８％（９．６ｍＬ、８４ｍｍｏｌ）とＨ_２Ｏ（３０ｍＬ）の混合物に溶解した。０℃で、ＮａＮＯ_２（２．６２ｇ、３８ｍｍｏｌ）のＨ_２Ｏ（１５ｍＬ）溶液を６０分かけて追加した。前記反応液を０℃で１．５時間、室温で１．５時間攪拌した。前記反応混合物は真空で脱気し、酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）（３ｘ５０ｍＬ）で抽出した。前記抽出物を水（５０ｍＬ）、乾燥（Ｎａ_２ＳＯ_４）、ろ過、留去し、油状物質として４．５２ｇの粗生成物が得られた。前記油状物質は高真空で蒸留し、油状物質として３．５６ｇの（Ｒ）−２−ブロモ−４−メチルペンタン酸が得られた。

Ｃ．（Ｓ）−２−アセチルチオ−４−メチルペンタン酸の調製
（Ｒ）−２−ブロモ−４−メチルペンタン酸（３．５６ｇ、１８．３ｍｍｏｌ）を６０ｍｌのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解し、ＣＨ_３ＣＯＳＫ（３．１３ｇ、２７．４ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（３０ｍＬ）溶液を窒素雰囲気下０℃で追加した。前記反応混合物を２時間攪拌し、留去した。前記残渣をＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）に再溶解し、５％硫酸水素カリウム（４５ｍＬ）および水（４５ｍＬ）および１ＮＨＣｌ（４５ｍＬ）および生理食塩水（４５ｍＬ）で洗浄、乾燥（Ｎａ_２ＳＯ_４）、留去し、３．２ｇの（Ｓ）−２−アセチルチオ−４−メチルペンタン酸を淡黄色の油状物質として得た。

Ｄ．［（Ｓ）−２−アセチルチオ−４−メチルペンタノイル］−４（Ｓ）−フルオロ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−［（３Ｒ）−β−Ｐｒｏ］−ＯＨ（化学式ＩＶの化合物）の調製
ＤＭＦ（４５ｍＬ）を加えたＨ−４（Ｓ）−フルオロ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−［（３Ｒ）−β−Ｐｒｏ］−ＣＴＣ−樹脂（２ｍｍｏｌ、ＣＰＣＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＩｎｃ．（米国Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ）から入手）入り反応容器に、（Ｓ）−２−アセチルチオ−４−メチルペンタン酸（１．１５ｇ、６ｍｍｏｌ）、ＤＩＣ（９４０μＬ、６ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（８１０ｍｇ、６ｍｍｏｌ）、およびＤＩＥＡ（１．０４ｍＬ、６ｍｍｏｌ）を加えた。一晩室温で振盪後、ニンヒドリン試験によりカップリングが終了したことが示された。前記樹脂をＤＭＦ（３ｘ３０ｍＬ）およびジクロロメタン（３ｘ３０ｍＬ）で洗浄し、続いて、室温で１時間１％トリフルオロ酢酸／ジクロロメタン（ＴＦＡ／ＤＣＭ）（１５０ｍＬ）で開裂した。前記樹脂を減圧下ろ過により取り除き、１％ＴＦＡ／ＤＣＭ（５０ｍＬ）で洗浄した。前記ろ液を合わせ、３０℃未満でロータリーエバポレーターのガラス状膜に濃縮した。冷ジエチルエーテル（３０ｍＬ）を沈殿物であるペプチドに加えた。前記ペプチドをろ取し、冷エーテル（２×５ｍＬ）で洗浄した。乾燥後、タイトルの粗ペプチド（６７０ｍｇ）が得られた。

Ｅ．［（Ｓ）−２−メルカプト−４−メチルペンタノイル］−４（Ｓ）−フルオロ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−［（３Ｒ）−β−Ｐｒｏ］−ＯＨ（化学式ＩＩＩの化合物）の調製
粗Ｎ−［（Ｓ）−２−アセチルチオ−４−メチルペンタノイル］−４（Ｓ）−フルオロ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−［（３Ｒ）−β−Ｐｒｏ］−ＯＨ（６７０ｍｇ）を脱気したテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（５０ｍＬ）に溶解し、１ＮＮａＯＨ（１０ｍＬ）をＮ_２雰囲気下、０℃で追加した。前記反応混合物を室温で４時間攪拌した。２ＮＨＣｌでｐＨ４に酸性化後、前記溶媒を留去した。前記残渣（５８０ｍｇ）をＣ−１８カラムと調製用逆相ＨＰＬＣを用いて精製し、水（０．１％ＴＦＡを含む）−アセトニトリル勾配で溶出した。前記カラム分画を分析用ＨＰＬＣで分析し、生成物を含む分画（純度９７％超）をプールし、凍結乾燥後、タイトルペプチド（化学式ＩＩＩの化合物）１８５ｍｇが得られた。このペプチドの質量スペクトル分析では、４５７．６でＭＳ^＋のピーク、４７９．３でＭ＋Ｎａ^＋のピークが明らかとなった。

実施例２
Ａ．腎臓の高度精製ヒトアミノペプチダーゼＰ２の調製
ＣｏｏｐｅｒａｔｉｖｅＨｕｍａｎＴｉｓｓｕｅＮｅｔｗｏｒｋから得られたヒト腎組織を本明細書で用いる精製ヒトＡＰＰ２源とした。以下の実施例２Ｂに説明するとおり、ＡＰＰ２酵素活性を測定した。膜結合型ＡＰＰ２を以下の手順によりヒト腎臓組織から精製した。１）腎組織を３０倍の容積のＴｒｉｔｏｎＸ−１００界面活性剤を含む緩衝液にホモジナイズ、遠心分離し、２）前記ペレットをオクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド界面活性剤を含む緩衝液で洗浄、懸濁、遠心分離し、３）前記上清に１０単位のホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼＣ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（米国ジョージア州、Ｅｕｇｅｎｅ）を処理し、ＡＰＰ２のグリコシル−ホスファチジルイノシトール脂質膜アンカーの疎水性部分を除き、透析し、４）前記透析物質をオクチル―セファロースクロマトグラフィーを通過させ、５）前記溶出物を遠心分離し、ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ−１５Ｕｌｔｒａｃｅｌ−１０ｋフィルター（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＣｏｒｐ、米国マサチューセッツ州、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ）で限外濾過により濃縮し、６）前記滞留物を透析し、ＨｉＴｒａｐＱ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＸＬイオン交換クロマトグラフィーカラムにかけた。線形ＫＣｌ塩勾配によりヒトＡＰＰ２酵素活性を溶出した。

Ｂ．ヒトＡＰＰ２活性の決定
内部クエンチした蛍光基質を用い、ヒトアミノペプチダーゼＰ２（ＡＰＰ２）の酵素活性を決定した。Ｈ−Ｌｙｓ（２−アミノベンゾイル）−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−ｐ−ニトロアニリド（Ｂａｃｈｅｍ、米国カリフォルニア州、Ｔｏｒｒａｎｃｅ）は阻害剤の研究では１μＭ（＝Ｋ_ｍ）、酵素精製試験では５μＭとした。前記試験緩衝液は０．１ＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４であり、前記試験温度は３０℃であった。前記酵素による前記基質の開裂により、Ｈ−Ｌｙｓ（２−アミノベンゾイル）が放出されるため、蛍光が増加する。励起波長３２０ｎｍおよび放射波長４０５ｎｍを用いて、酵素速度をＦ_ｍａｘ蛍光プレートリーダー（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ、米国カリフォルニア州、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ）で決定した。阻害剤の結合親和性を推定し、ＩＣ_５０値として表した（活性を５０％阻害する濃度）。

実施例３
ヒトＡＣＥ活性の決定
ヒト組み換えアンジオテンシン変換酵素（ｈｒＡＣＥ）はＲ&Ｄシステム（米国ミネソタ州、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ）から得た。内部クエンチした蛍光基質ＥＳ００５：（７−メトキシクマリン−４−イル）アセチル−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−（２，４−ジニトロフェニル）−Ｌｙｓ（Ｒ&ＤＳｙｓｔｅｍｓ、米国ミネソタ州、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ）を用い、その酵素活性を決定した。前記試験緩衝液は０．１ＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４であり、温度は３０℃とした。基質濃度はＫ_ｍ未満であった（≦４０μＭ）。励起波長３２０ｎｍおよび放射波長４０５ｎｍを用いて、酵素速度をＦ_ｍａｘ蛍光プレートリーダー（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ、米国カリフォルニア州、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ）で決定した。阻害剤の結合親和性を推定し、ＩＣ_５０値として表した（活性を５０％阻害する濃度）。

実施例４
両側性腎虚血／再灌流プロトコール：
ＨａｒｌａｎＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（米国インディアナ州、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ）の雄ＣＤ−１（ＩＣＲ）マウス（３６〜４７ｇ）を使用した。５０ｍｇ／ｋｇのペントバルビタールナトリウム（ＡｋｏｒｎＩｎｃ、米国イリノイ州、ＬａｋｅＦｏｒｅｓｔ）で皮下注射することで各マウスを麻酔し、３７℃の加温器に入れた。手術のため腹部を剪毛し、マウスを加温プレートに移動して、フィードバックによる温度コントロールを行った（ＴＣＡＴ−２ＤＦ、ＨａｒｖａｒｄＡｐｐａｒａｔｕｓＨｏｌｌｉｓｔｏｎ、米国マサチューセッツ州）。処置中、前記マウスの体温を３６．９±０．１℃に維持した。前記腹部の皮膚をアルコールで洗い、正中切開を行って腎臓を曝露させた。腎茎の脂肪組織を切除後、毛細血管瘤クランプを各椎弓根に配置し、２５分間両腎臓に出入りする血流を遮断した（虚血期と呼ぶ）。２０分の時点で、生理食塩水または薬物（アプスタチンまたはＳＴ−１１５）を含む生理食塩水０．１５ｍｌを大腿静脈から静脈内投与した。前記用量はアプスタチンで１．８ｍｇ／ｋｇ、ＳＴ−１１５で１０μｇ／ｋｇとした。薬物注入の５分後、前記クランプを椎弓根から外し、両腎臓に出入りする血流を回復させた（再灌流期）。再灌流を確認後、水分補給用に大腿上方に生理食塩水を皮下注射し、切開部を縫合して閉じた。再灌流の最初０．５時間以上温度コントロールを維持した。前記マウスを３７℃の加温器に入れ、麻酔から回復させた後ホームケージに移動した。再灌流２日後、前記マウスを失血により殺処分した。血液を凝固させた後、遠心分離させ、血清を得た。Ｓｔａｎｂｉｏ（Ｂｏｅｒｎｅ、米国テキサス州）のキットを用い、血清の腎障害マーカーである尿素（血中尿素窒素−ＢＵＮ）濃度を試験した。明らかに感染している、または腎臓が完全に再灌流できなかった場合はそのマウスを分析から除外した（ｎ＝２）。対応のないｔ検定とウェルチの補正（ＧｒａｐｈｐａｄＰｒｉｓｍｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｐａｃｋａｇｅ、米国カリフォルニア州、ＬａＪｏｌｌａ）を用い、各薬物と生理食塩水対照の値を比較してＢＵＮのデータポイント（２０）を分析した。虚血／再灌流プロトコールを行わなかったマウスのＢＵＮ値を求め、尿素の「ベースライン」濃度を示した。

Claims

下記式の化合物またはその薬学的に許容される塩であって、

式中、Ｒ_１はＨまたはＲ_３−（ＣＯ）−であり、
Ｒ_２はＨ、１〜６炭素原子を有するアルキルまたは置換アルキル、または４〜１２炭素原子を有するシクロアルキル−（ＣＨ_２）_ａ−−、アリール−（ＣＨ_２）_ａ−−、置換アリール−（ＣＨ_２）ａ−−、またはヘテロアリール−（ＣＨ_２）_ａ−−であり、
Ｒ_３は１〜６炭素原子を有するアルキルまたは置換アルキル、または４〜１２炭素原子を有するシクロアルキル−（ＣＨ_２）_ａ−−、アリール−（ＣＨ_２）_ａ−−、置換アリール−（ＣＨ_２）_ａ−−、またはヘテロアリール−（ＣＨ_２）_ａ−−であり、
ａは０または１〜６の整数である、化合物またはその薬学的に許容される塩。
請求項１記載の化合物において、Ｒ_１はＨである化合物。
請求項２記載の化合物において、Ｒ_２はＨまたは１〜６炭素原子を有するアルキルである化合物。
請求項３記載の化合物において、Ｒ_２はＨである化合物。
請求項３記載の化合物において、Ｒ_２は１〜４炭素原子を有するアルキルである化合物。
請求項１記載の化合物において、Ｒ_１はＲ_３−（ＣＯ）−である化合物。
請求項６記載の化合物において、Ｒ_３は１〜６炭素原子を有するアルキルである化合物。
請求項７記載の化合物において、Ｒ_２は１〜６炭素原子を有するアルキルである化合物。
薬学的に許容される担体および治療有効量の式ＩＩの化合物またはその薬学的に許容される塩を有する医薬組成物であって、

式中、Ｒ_１はＨまたはＲ_３−（ＣＯ）−であり、
Ｒ_２はＨ、１〜６炭素原子を有するアルキルまたは置換アルキル、または４〜１２炭素原子を有するシクロアルキル−（ＣＨ_２）_ａ−−、アリール−（ＣＨ_２）_ａ−−、置換アリール−（ＣＨ_２）_ａ−−、またはヘテロアリール−（ＣＨ_２）_ａ−−であり、
Ｒ_３は１〜６炭素原子を有するアルキルまたは置換アルキル、または４〜１２炭素原子を有するシクロアルキル−（ＣＨ_２）_ａ−−、アリール−（ＣＨ_２）_ａ−−、置換アリール−（ＣＨ_２）_ａ−−、またはヘテロアリール−（ＣＨ_２）_ａ−−であり、
ａは０または１〜６の整数である、医薬組成物。
請求項９記載の医薬組成物において、Ｒ_１はＨである医薬組成物。
請求項１０記載の医薬組成物において、Ｒ_２はＨまたは１〜６炭素原子を有するアルキルである医薬組成物。
請求項１１記載の医薬組成物において、Ｒ_２はＨである医薬組成物。
請求項１１記載の医薬組成物において、Ｒ_２は１〜４炭素原子を有するアルキルである医薬組成物。
請求項９記載の医薬組成物において、Ｒ_１はＲ_３−（ＣＯ）−である医薬組成物。
請求項１４記載の医薬組成物において、Ｒ_３は１〜６炭素原子を有するアルキルである医薬組成物。
請求項１５記載の医薬組成物において、Ｒ_２は１〜６炭素原子を有するアルキルである医薬組成物。
哺乳類患者におけるブラジキニン分解を阻害するために使用される医薬製剤であって、薬学的に許容される担体および治療有効量の式ＩＩの化合物またはその薬学的に許容される塩を有し、

式中、Ｒ_１はＨまたは

であり、
Ｒ_２はＨ、１〜６炭素原子を有するアルキルまたは置換アルキル、または４〜１２炭素原子を有するシクロアルキル−（ＣＨ_２）_ａ−−、アリール−（ＣＨ_２）_ａ−−、置換アリール−（ＣＨ_２）_ａ−−、またはヘテロアリール−（ＣＨ_２）_ａ−−であり、
Ｒ_３は１〜６炭素原子を有するアルキルまたは置換アルキル、または４〜１２炭素原子を有するシクロアルキル−（ＣＨ_２）_ａ−−、アリール−（ＣＨ_２）_ａ−−、置換アリール−（ＣＨ_２）_ａ−−、またはヘテロアリール−（ＣＨ_２）_ａ−−であり、
ａは０または１〜６の整数である、医薬製剤。
請求項１７記載の医薬製剤において、哺乳類患者における前記ブラジキニン分解の阻害は、前記哺乳類患者における再灌流障害の予防または改善と関連する医薬製剤。
請求項１８記載の医薬製剤において、Ｒ_２はＨまたは１〜６炭素原子を有するアルキルである医薬製剤。
請求項１９記載の医薬製剤において、Ｒ_１はＨである医薬製剤。