JP6319889B2 - Method for producing lipid using modified acyl-ACP thioesterase - Google Patents
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Description
本発明は、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ改変体及びこれを用いた脂質の製造方法に関する。 The present invention relates to a modified acyl-ACP thioesterase and a method for producing a lipid using the same.
脂肪酸は脂質の主要構成成分の１つであり、生体内においてグリセリンとエステル結合をしてトリアシルグリセロール等の脂質を構成し、多くの動植物においてエネルギー源として貯蔵され利用される物質である。動植物内に蓄えられた脂肪酸や脂質は、食用又は工業用として広く利用されており、例えば、モノアシルグリセロール、ジアシルグリセロール等の食品の中間原料や、その他各種の工業製品の添加剤、中間原料として利用されている。また、炭素数１２〜１８前後の高級脂肪酸を還元して得られる高級アルコールの誘導体は、界面活性剤として用いられている。例えば、アルキル硫酸エステル塩やアルキルベンゼンスルホン酸塩等は陰イオン性界面活性剤として、また、ポリオキシアルキレンアルキルエーテルやアルキルポリグリコシド等は非イオン性界面活性剤として、いずれも洗浄剤又は殺菌剤に利用されている。同じく高級アルコールの誘導体としてアルキルアミン塩やモノ又はジアルキル４級アミン塩は、繊維処理剤や毛髪リンス剤又は殺菌剤として、ベンザルコニウム型４級アンモニウム塩は殺菌剤や防腐剤として日常的に利用されている。さらに、炭素数１８前後の高級アルコールは植物の成長促進剤としても有用である。 Fatty acids are one of the major constituents of lipids, and form a lipid such as triacylglycerol by forming an ester bond with glycerin in vivo, and are stored and used as an energy source in many animals and plants. Fatty acids and lipids stored in animals and plants are widely used for food or industrial use, for example, as intermediate materials for foods such as monoacylglycerol and diacylglycerol, as additives for various industrial products, and as intermediate materials It's being used. In addition, higher alcohol derivatives obtained by reducing higher fatty acids having about 12 to 18 carbon atoms are used as surfactants. For example, alkyl sulfate ester salts and alkylbenzene sulfonates are used as anionic surfactants, and polyoxyalkylene alkyl ethers and alkylpolyglycosides are used as nonionic surfactants. It's being used. Similarly, alkylamine salts and mono- or dialkyl quaternary amine salts as higher alcohol derivatives are routinely used as fiber treatment agents, hair rinsing agents or bactericides, and benzalkonium-type quaternary ammonium salts as bactericides and preservatives. Has been. Furthermore, higher alcohols having about 18 carbon atoms are useful as plant growth promoters.
このように脂肪酸や脂質の利用は多岐にわたり、そのため植物等において生体内での脂肪酸や脂質の生産性を向上させる試みがおこなわれている。さらに、脂肪酸の用途や有用性はその炭素数に依存するため、脂肪酸の炭素数、即ち鎖長を制御する試みも行われている。例えば、ゲッケイジュ（Umbellularia californica（California bay））由来のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼの導入により炭素数１２の脂肪酸を蓄積させる方法（特許文献１、非特許文献１）等が提案されている。 As described above, fatty acids and lipids are widely used, and therefore attempts have been made to improve the productivity of fatty acids and lipids in vivo in plants and the like. Furthermore, since the use and usefulness of fatty acids depend on the number of carbon atoms, attempts have been made to control the number of carbon atoms of fatty acids, that is, the chain length. For example, a method of accumulating fatty acids having 12 carbon atoms by introducing acyl-ACP thioesterase derived from bay ( Umbellularia californica (California bay)) (Patent Document 1, Non-Patent Document 1) and the like has been proposed.
近年、バイオ燃料生産に有用であるとして、藻類が注目を集めている。藻類は、バイオディーゼル燃料として利用可能な脂質を光合成によって生産でき、しかも食料と競合しないことから、次世代のバイオマス資源として注目されている。また、藻類は、植物に比べ、高い脂質生産・蓄積能力を有するとの報告もある。
藻類の脂質合成メカニズムやそれを応用した生産技術について研究が始まってはいるが、未解明な部分も多い。例えば、上述のアシル−ＡＣＰ型チオエステラーゼについても、現在のところ、藻類由来のものはほとんど報告されておらず、珪藻網等でわずかに報告例があるのみである（例えば、非特許文献２）。
In recent years, algae has attracted attention as being useful for biofuel production. Algae are attracting attention as next-generation biomass resources because they can produce lipids that can be used as biodiesel fuel by photosynthesis and do not compete with food. There are also reports that algae have a higher ability to produce and accumulate lipids than plants.
Although research has begun on the algae lipid synthesis mechanism and production technology using it, there are many unexplained parts. For example, as for the above-mentioned acyl-ACP type thioesterase, at the present time, few are derived from algae, and there are only a few reports on diatom nets (for example, Non-Patent Document 2). .
本発明は、野生型アシル−ＡＣＰチオエステラーゼのアミノ酸配列を改変したアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ改変体、及びこれを用いた脂質の製造方法を提供することを課題とする。また、本発明は、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ改変体を導入し脂質の生産能が向上した形質転換体を提供することを課題とする。 An object of the present invention is to provide a modified acyl-ACP thioesterase in which the amino acid sequence of wild-type acyl-ACP thioesterase is modified, and a method for producing a lipid using the same. Another object of the present invention is to provide a transformant in which an acyl-ACP thioesterase variant is introduced to improve lipid production ability.
本発明者らは、ナンノクロロプシス（Nannochloropsis）属に属する藻類由来のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼについて研究を行い、ナンノクロロプシス オキュラータ（Nannochloropsis oculata）の野生型アシル−ＡＣＰチオエステラーゼのアミノ酸配列にランダムな変異を導入し、複数のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ改変体を得た。そして、これらを用いて形質転換を行った結果、いくつかの形質転換体において、野生型アシル−ＡＣＰチオエステラーゼを導入した形質転換体と比較して、脂質、特に炭素数１２又は１４の脂肪酸の生産性が有意に向上することを見出した。本発明はこの知見に基づいて完成するに至ったものである。 The present inventors have studied acyl-ACP thioesterases derived from algae belonging to the genus Nannochloropsis, and randomized the amino acid sequence of the wild-type acyl-ACP thioesterase of Nannochloropsis oculata. Mutations were introduced to obtain multiple acyl-ACP thioesterase variants. As a result of transformation using these, in some transformants, lipids, particularly fatty acids having 12 or 14 carbon atoms, compared to transformants into which wild-type acyl-ACP thioesterase was introduced. We found that productivity was significantly improved. The present invention has been completed based on this finding.
すなわち本発明は、宿主に下記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子を導入して形質転換体を得る工程と、得られた形質転換体から脂質を採取する工程とを含む、脂質の製造方法（以下、「本発明の製造方法」ともいう。）に関する。
（ａ） 配列番号１の１２８位〜２８７位のアミノ酸配列において、下記（１）〜（４）から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を有し、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
（１） 配列番号１の１５０位のアミノ酸がグルタミン酸からグリシンに置換。
（２） 配列番号１の２００位のアミノ酸がアスパラギンからアスパラギン酸に置換。
（３） 配列番号１の２２２位のアミノ酸がアスパラギンからセリン又はアラニンに置換。
（４） 配列番号１の２４５位のアミノ酸がアルギニンからリジンに置換。
（ｂ） （ａ）のタンパク質のアミノ酸配列において、アミノ酸置換されたアミノ酸以外の１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
That is, the present invention includes a step of obtaining a transformant by introducing a gene encoding the following protein (a) or (b) into a host, and a step of collecting a lipid from the obtained transformant. (Hereinafter, also referred to as “the manufacturing method of the present invention”).
(A) The amino acid sequence at positions 128 to 287 of SEQ ID NO: 1 has an amino acid sequence having at least one amino acid substitution selected from the following (1) to (4), and has acyl-ACP thioesterase activity protein.
(1) The amino acid at position 150 of SEQ ID NO: 1 was replaced with glutamic acid from glycine.
(2) The amino acid at position 200 of SEQ ID NO: 1 was substituted from asparagine to aspartic acid.
(3) The amino acid at position 222 of SEQ ID NO: 1 is substituted from asparagine to serine or alanine.
(4) The amino acid at position 245 of SEQ ID NO: 1 was substituted from arginine to lysine.
(B) an acyl-ACP thioesterase having an amino acid sequence in which one or several amino acids other than amino acid-substituted amino acids are deleted, substituted, inserted, or added in the amino acid sequence of the protein of (a) Protein with activity.
また、本発明は、宿主に前記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子を導入して得られる形質転換体（以下、「本発明の形質転換体」ともいう。）に関する。
また、本発明は、前記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質（以下、「本発明のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ改変体」ともいう。）に関する。
また、本発明は、宿主に前記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子を導入して形質転換体を得る工程を含む、脂質の生産性を向上させる方法に関する。
The present invention also relates to a transformant obtained by introducing a gene encoding the protein (a) or (b) into a host (hereinafter also referred to as “transformant of the present invention”).
The present invention also relates to the protein (a) or (b) (hereinafter also referred to as “acyl-ACP thioesterase variant of the present invention”).
The present invention also relates to a method for improving lipid productivity, comprising the step of obtaining a transformant by introducing a gene encoding the protein (a) or (b) into a host.
本発明の形質転換体は、野生型アシル−ＡＣＰチオエステラーゼを導入した形質転換体に比べ、脂質、特に炭素数１２又は１４の脂肪酸の生産能に優れる。そのため、当該形質転換体を用いた本発明の脂質の製造方法は、炭素数１２又は１４の脂肪酸及びこれらを構成成分とする脂質の生産性に特に優れる。本発明のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ改変体、形質転換体、及び製造方法は、脂肪酸及び脂質の工業的生産に好適に用いることができる。 The transformant of the present invention is superior in the ability to produce lipids, particularly fatty acids having 12 or 14 carbon atoms, compared to transformants into which wild-type acyl-ACP thioesterase has been introduced. Therefore, the method for producing lipids of the present invention using the transformant is particularly excellent in the productivity of fatty acids having 12 or 14 carbon atoms and lipids containing these as constituents. The acyl-ACP thioesterase variant, transformant, and production method of the present invention can be suitably used for industrial production of fatty acids and lipids.
以下、本発明のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ改変体、これを用いた形質転換体及び脂質の製造方法について順に説明する。
本発明において、脂質には、中性脂肪、ろう、セラミド等の単純脂質；リン脂質、糖脂質、スルホ脂質等の複合脂質；及びこれらの脂質から誘導される、脂肪酸、アルコール類、炭化水素類等の誘導脂質が含まれる。
Hereinafter, the acyl-ACP thioesterase variant of the present invention, a transformant using the same, and a method for producing a lipid will be described in order.
In the present invention, lipids include simple lipids such as neutral fats, waxes and ceramides; complex lipids such as phospholipids, glycolipids and sulfolipids; and fatty acids, alcohols and hydrocarbons derived from these lipids. Derived lipids and the like.
１．アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ改変体
本発明のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ改変体は、配列番号１に示すアミノ酸配列を一部改変したアミノ酸配列を有し、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質である。配列番号１は、ナンノクロロプシス属に属する藻類であるナンノクロロプシス オキュラータ（Nannochloropsis oculata）由来のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（以下、野生型アシル−ＡＣＰチオエステラーゼともいい、ＮｏＴＥとも略記する）のアミノ酸配列である。
アシル−ＡＣＰ（アシルキャリヤープロテイン）チオエステラーゼは、脂肪酸やその誘導体（トリアシルグリセロール（トリグリセリド）等）の生合成系に関与する酵素である。当該酵素は、植物体や藻類では葉緑体等の色素体内において、細菌・真菌や動物体では細胞質内において、脂肪酸生合成過程の中間体であるアシル−ＡＣＰ（脂肪酸残基であるアシル基とアシルキャリヤープロテインとからなる複合体）のチオエステル結合を加水分解し、遊離の脂肪酸を生成する。アシル−ＡＣＰチオエステラーゼの作用によって、ＡＣＰ上での脂肪酸合成が終了し、切り出された脂肪酸はトリアシルグリセロール等の合成に供される。アシル−ＡＣＰチオエステラーゼには、基質であるアシル−ＡＣＰを構成するアシル基（脂肪酸残基）の炭素原子数や不飽和結合数によって異なる反応特異性を示す複数のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼが存在していることが知られており、生体内での脂肪酸組成を決める重要なファクターであると考えられている。
本発明において、「アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有する」とは、アシル−ＡＣＰのチオエステル結合を加水分解する活性を有することをいう。
1. Modified acyl-ACP thioesterase The modified acyl-ACP thioesterase of the present invention is a protein having an amino acid sequence obtained by partially modifying the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and having acyl-ACP thioesterase activity. SEQ ID NO: 1 is an amino acid sequence of an acyl-ACP thioesterase (hereinafter also referred to as wild-type acyl-ACP thioesterase, also abbreviated as NoTE ) derived from an algae belonging to the genus Nannochloropsis, Nannochloropsis oculata It is.
Acyl-ACP (acyl carrier protein) thioesterase is an enzyme involved in the biosynthetic system of fatty acids and derivatives thereof (such as triacylglycerol (triglyceride)). The enzyme contains acyl-ACP (an acyl group that is a fatty acid residue), which is an intermediate in the process of fatty acid biosynthesis, in plastids such as chloroplasts in plants and algae, and in the cytoplasm in bacteria, fungi, and animals. Hydrolysis of the thioester bond of a complex comprising an acyl carrier protein) produces free fatty acids. By the action of acyl-ACP thioesterase, fatty acid synthesis on ACP is completed, and the cut fatty acid is subjected to synthesis of triacylglycerol and the like. Acyl-ACP thioesterases include a plurality of acyl-ACP thioesterases that exhibit different reaction specificities depending on the number of carbon atoms and the number of unsaturated bonds in the acyl group (fatty acid residue) constituting the substrate acyl-ACP. It is known that it is an important factor that determines the fatty acid composition in vivo.
In the present invention, “having acyl-ACP thioesterase activity” means having an activity of hydrolyzing the thioester bond of acyl-ACP.
本発明のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ改変体として、具体的には下記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質が挙げられる。
（ａ） 配列番号１の１２８位〜２８７位のアミノ酸配列において、下記（１）〜（４）から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を有し、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
（１） 配列番号１の１５０位のアミノ酸がグルタミン酸からグリシンに置換。
（２） 配列番号１の２００位のアミノ酸がアスパラギンからアスパラギン酸に置換。
（３） 配列番号１の２２２位のアミノ酸がアスパラギンからセリン又はアラニンに置換。
（４） 配列番号１の２４５位のアミノ酸がアルギニンからリジンに置換。
（ｂ） （ａ）のタンパク質のアミノ酸配列において、アミノ酸置換されたアミノ酸以外の１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列有し、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
Specific examples of the modified acyl-ACP thioesterase of the present invention include the following protein (a) or (b).
(A) The amino acid sequence at positions 128 to 287 of SEQ ID NO: 1 has an amino acid sequence having at least one amino acid substitution selected from the following (1) to (4), and has acyl-ACP thioesterase activity protein.
(1) The amino acid at position 150 of SEQ ID NO: 1 was replaced with glutamic acid from glycine.
(2) The amino acid at position 200 of SEQ ID NO: 1 was substituted from asparagine to aspartic acid.
(3) The amino acid at position 222 of SEQ ID NO: 1 is substituted from asparagine to serine or alanine.
(4) The amino acid at position 245 of SEQ ID NO: 1 was substituted from arginine to lysine.
(B) In the amino acid sequence of the protein of (a), one or several amino acids other than amino acid-substituted amino acids have an amino acid sequence deleted, substituted, inserted or added, and acyl-ACP thioesterase activity A protein having
前記（ａ）のタンパク質は、配列番号１に示す野生型アシル−ＡＣＰチオエステラーゼのアミノ酸配列の１２８位〜２８７位のアミノ酸配列を少なくとも有する。本発明者らは、配列番号１に示す野生型アシル−ＡＣＰチオエステラーゼのアミノ酸配列において、１２８位〜２８７位の領域は、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼとして機能するために重要で、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を示すために必要十分な領域であることを見出した。配列番号１の１２８位〜２８７位のアミノ酸配列からなるタンパク質はアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有する。前記（ａ）のタンパク質は、このアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性にとって必要十分な領域を有し、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼとして機能する。
さらに、前記（ａ）のタンパク質のアミノ酸配列では、配列番号１の１２８位〜２８７位のアミノ酸配列中の、配列番号１の１５０位、２００位、２２２位、及び２４５位から選ばれる少なくとも１つの位置のアミノ酸が、下記（１）〜（４）のように置換されている。
（１） 配列番号１の１５０位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｇｌｕ：Ｅ）からグリシン（Ｇｌｙ；Ｇ）に置換。
（２） 配列番号１の２００位のアミノ酸がアスパラギン（Ａｓｎ：Ｎ）からアスパラギン酸（Ａｓｐ；Ｄ）に置換。
（３） 配列番号１の２２２位のアミノ酸がアスパラギン（Ａｓｎ：Ｎ）からセリン（Ｓｅｒ；Ｓ）、又はアスパラギン（Ａｓｎ：Ｎ）からアラニン（Ａｌａ；Ａ）に置換。
（４） 配列番号１の２４５位のアミノ酸がアルギニン（Ａｒｇ：Ｒ）からリジン（Ｌｙｓ；Ｋ）に置換。
例えば、前記（１）のアミノ酸置換を有する場合、（ａ）のタンパク質が有するアミノ酸配列は、配列番号１の１２８位〜２８７位のアミノ酸配列を基本とし、当該配列中の配列番号１の１５０位に相当するアミノ酸であるグルタミン酸がグリシンで置換されたアミノ酸配列である。
The protein (a) has at least the amino acid sequence at positions 128 to 287 of the amino acid sequence of wild-type acyl-ACP thioesterase shown in SEQ ID NO: 1. In the amino acid sequence of wild-type acyl-ACP thioesterase shown in SEQ ID NO: 1, the region from position 128 to position 287 is important for functioning as an acyl-ACP thioesterase, and the acyl-ACP thioesterase It was found that the region is necessary and sufficient to show activity. The protein consisting of the amino acid sequence at positions 128 to 287 of SEQ ID NO: 1 has acyl-ACP thioesterase activity. The protein (a) has a region necessary and sufficient for this acyl-ACP thioesterase activity and functions as an acyl-ACP thioesterase.
Furthermore, in the amino acid sequence of the protein of (a), at least one selected from positions 150, 200, 222, and 245 of SEQ ID NO: 1 in the amino acid sequence of positions 128 to 287 of SEQ ID NO: 1 The amino acid at the position is substituted as shown in (1) to (4) below.
(1) The amino acid at position 150 of SEQ ID NO: 1 is replaced with glutamic acid (Glu: E) from glycine (Gly; G).
(2) The amino acid at position 200 of SEQ ID NO: 1 was replaced by aspartic acid (Asp; D) from asparagine (Asn: N).
(3) The amino acid at position 222 of SEQ ID NO: 1 was substituted from asparagine (Asn: N) to serine (Ser; S), or from asparagine (Asn: N) to alanine (Ala; A).
(4) The amino acid at position 245 of SEQ ID NO: 1 was substituted from arginine (Arg: R) to lysine (Lys; K).
For example, in the case of having the amino acid substitution of (1), the amino acid sequence of the protein of (a) is based on the amino acid sequence of positions 128 to 287 of SEQ ID NO: 1, and the 150th position of SEQ ID NO: 1 in the sequence Is an amino acid sequence in which glutamic acid, which is an amino acid corresponding to is substituted with glycine.
以下、配列番号１の１５０位に相当するアミノ酸が、グリシンに置換されたアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ改変体をＮｏＴＥ（Ｅ１５０Ｇ）、２００位に相当するアミノ酸が、アスパラギン酸に置換されたアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ改変体をＮｏＴＥ（Ｎ２００Ｄ）、２２２位に相当するアミノ酸が、セリンに置換されたアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ改変体をＮｏＴＥ（Ｎ２２２Ｓ）、２２２位に相当するアミノ酸が、アラニンに置換されたアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ改変体をＮｏＴＥ（Ｎ２２２Ａ）、２４５位に相当するアミノ酸が、リジンに置換されたアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ改変体をＮｏＴＥ（Ｒ２４５Ｋ）、とそれぞれ略記する。 Hereinafter, an acyl-ACP thioesterase variant in which the amino acid corresponding to position 150 of SEQ ID NO: 1 is substituted with glycine is NoTE (E150G), and the amino acid corresponding to position 200 is substituted with aspartic acid. The esterase variant is NoTE (N200D), the amino acid corresponding to position 222 is substituted with serine-ACP thioesterase variant is NoTE (N222S), the amino acid corresponding to position 222 is acyl substituted with alanine The ACP thioesterase variant is abbreviated as NoTE (N222A), and the acyl-ACP thioesterase variant in which the amino acid corresponding to position 245 is substituted with lysine is NoTE (R245K).
前記（ａ）のタンパク質は、配列番号１の１２８位〜２８７位のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列の他に、他のアミノ酸配列を有していてもよい。他のアミノ酸配列としては、配列番号１の１位〜１２７位のアミノ酸配列若しくはその一部の配列、タンパク質の輸送や分泌に関与するシグナルペプチド配列等が挙げられる。これらの配列は、配列番号１の１２８位〜２８７位のアミノ酸配列のＮ末端側に付加されることが好ましい。他のアミノ酸配列は、脂質生産性の観点から、配列番号１の１位〜１２７位のアミノ酸配列若しくはその一部の配列が好ましい。 The protein (a) may have another amino acid sequence in addition to the amino acid sequence corresponding to the amino acid sequence at positions 128 to 287 of SEQ ID NO: 1. Examples of other amino acid sequences include the amino acid sequence at positions 1 to 127 of SEQ ID NO: 1 or a partial sequence thereof, a signal peptide sequence involved in protein transport and secretion, and the like. These sequences are preferably added to the N-terminal side of the amino acid sequence at positions 128 to 287 of SEQ ID NO: 1. From the viewpoint of lipid productivity, the other amino acid sequence is preferably the amino acid sequence at positions 1 to 127 of SEQ ID NO: 1 or a partial sequence thereof.
前記（ａ）のタンパク質として好ましくは、配列番号１の１位〜１２８位の間の任意の位置から２８７位までのアミノ酸配列において前記（１）〜（４）から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列からなり、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質である。より好ましくは、配列番号１のアミノ酸配列、配列番号１の４９位〜２８７位までのアミノ酸配列、配列番号１の５８位〜２８７位までのアミノ酸配列、配列番号１の７８位〜２８７位までのアミノ酸配列、配列番号１の８７位〜２８７位までのアミノ酸配列、配列番号１の８８位〜２８７位までのアミノ酸配列、配列番号１の９８位〜２８７位までのアミノ酸配列、配列番号１の１０８位〜２８７位までのアミノ酸配列、配列番号１の１１８位〜２８７位までのアミノ酸配列、又は配列番号１の１２８位〜２８７位までのアミノ酸配列において前記（１）〜（４）から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列からなり、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質である。なお、配列番号１のアミノ酸配列、並びに配列番号１において４９位〜２８７位、５８位〜２８７位、７８位〜２８７位、８７位〜２８７位、８８位〜２８７位、９８位〜２８７位、及び１０８位〜２８７位、１２８位〜２８７位のアミノ酸配列からなるタンパク質が、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有することは本発明者らにより確認されている。 Preferably, the protein of (a) comprises at least one amino acid substitution selected from the above (1) to (4) in the amino acid sequence from position 1 to position 128 of SEQ ID NO: 1 to position 287. It is a protein having an amino acid sequence and having acyl-ACP thioesterase activity. More preferably, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, the amino acid sequence of positions 49 to 287 of SEQ ID NO: 1, the amino acid sequence of positions 58 to 287 of SEQ ID NO: 1, and the positions of positions 78 to 287 of SEQ ID NO: 1. Amino acid sequence, amino acid sequence from positions 87 to 287 of SEQ ID NO: 1, amino acid sequence from positions 88 to 287 of SEQ ID NO: 1, amino acid sequence from positions 98 to 287 of SEQ ID NO: 1, 108 of SEQ ID NO: 1 An amino acid sequence from position 287 to position 287, an amino acid sequence from position 118 to position 287 of SEQ ID NO: 1, or an amino acid sequence from position 128 to position 287 of SEQ ID NO: 1, at least selected from (1) to (4) above A protein consisting of an amino acid sequence having one amino acid substitution and having acyl-ACP thioesterase activity. In addition, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, as well as SEQ ID NO: 1, positions 49 to 287, positions 58 to 287, positions 78 to 287, positions 87 to 287, positions 88 to 287, positions 98 to 287, It has been confirmed by the present inventors that the protein consisting of the amino acid sequence of positions 108 to 287 and positions 128 to 287 has acyl-ACP thioesterase activity.
また、前記（ａ）のタンパク質は、前記（１）〜（４）から選ばれるいずれか１つのアミノ酸置換を有することが好ましい。 The protein (a) preferably has any one amino acid substitution selected from (1) to (4).
前記（ｂ）のタンパク質は、前記（ａ）のタンパク質のアミノ酸配列の一部に欠失、置換、挿入、又は付加の変異を有するアミノ酸配列を有し、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質である。ただし、欠失、置換、挿入、又は付加の変異を有するアミノ酸は、前記（ａ）において前記（１）〜（４）から選ばれるアミノ酸置換が施されたアミノ酸以外のアミノ酸である。例えば、（ａ）のタンパク質が前記（１）のアミノ酸置換を有する場合、（ｂ）のタンパク質が有するアミノ酸配列は、配列番号１の１２８位〜２８７位のアミノ酸配列を基本とし、当該配列中の配列番号１の１５０位に相当するアミノ酸がアスパラギン酸からバリンで置換され、さらに、当該配列中の該置換が施された１５０位に相当するアミノ酸以外の１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列である。 The protein (b) has an amino acid sequence having a deletion, substitution, insertion, or addition mutation in a part of the amino acid sequence of the protein (a), and has an acyl-ACP thioesterase activity It is. However, the amino acid having a deletion, substitution, insertion, or addition mutation is an amino acid other than the amino acid subjected to the amino acid substitution selected from (1) to (4) in (a). For example, when the protein of (a) has the amino acid substitution of (1), the amino acid sequence of the protein of (b) is based on the amino acid sequence of positions 128 to 287 of SEQ ID NO: 1, The amino acid corresponding to position 150 in SEQ ID NO: 1 is substituted with valine from aspartic acid, and one or several amino acids other than the amino acid corresponding to position 150 in the sequence are deleted or substituted , Inserted or added amino acid sequence.
一般に、酵素タンパク質をコードしているアミノ酸配列は、必ずしも全領域の配列が保存されていなければ酵素活性を示さないというものではなく、アミノ酸配列が変化しても酵素活性に影響を与えない領域も存在することが知られている。このような酵素活性に必須でない領域においては、アミノ酸の欠失、置換、挿入又は付加といった変異が導入されても酵素本来の活性を維持することができる。本発明においても、このようにアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性が保持され、かつアミノ酸配列が一部欠失等により変化した改変体を用いることができる。
アミノ酸配列に欠失等の変異を導入する方法としては、例えば、アミノ酸配列をコードする塩基配列に変異を導入する方法が挙げられる。
In general, an amino acid sequence encoding an enzyme protein does not necessarily indicate enzyme activity unless the sequence of the entire region is conserved, and there are regions that do not affect enzyme activity even if the amino acid sequence changes. It is known to exist. In such a region that is not essential for enzyme activity, the original activity of the enzyme can be maintained even if a mutation such as amino acid deletion, substitution, insertion or addition is introduced. Also in the present invention, it is possible to use a modified product that retains acyl-ACP thioesterase activity and whose amino acid sequence has been changed due to partial deletion or the like.
Examples of a method for introducing a mutation such as a deletion into an amino acid sequence include a method of introducing a mutation into a base sequence encoding an amino acid sequence.
前記（ｂ）のタンパク質において、「１又は数個のアミノ酸」は、脂質生産性の観点から、１〜１５個であることが好ましく、１〜１０個であることがより好ましく、１〜５個であることがさらに好ましく、１〜２個であることよりさらに好ましい。 In the protein of (b), “1 or several amino acids” is preferably 1 to 15, more preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5 from the viewpoint of lipid productivity. It is more preferable that it is, and it is further more preferable that it is 1-2.
本発明のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ改変体がアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有することは、例えば、大腸菌等の宿主細胞内で機能するプロモーターの下流にアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子を連結した融合遺伝子を脂肪酸分解系が欠損した宿主細胞へ導入し、導入したアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子が発現する条件で培養して、宿主細胞又は培養液中の脂肪酸組成の変化をガスクロマトグラフィー解析等の方法を用いて分析することにより、確認することができる。
また、大腸菌等の宿主細胞内で機能するプロモーターの下流にアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子を連結した融合遺伝子を宿主細胞へ導入し、導入したアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子が発現する条件で細胞を培養した後、細胞の破砕液に対し、Yuanらの方法（Yuan L, Voelker TA, Hawkins DJ. “Modification of the substrate specificity of an acyl-acyl carrier protein thioesterase by protein engineering” Proc Natl Acad Sci U S A. 1995 Nov 7;92(23), p.10639-10643）によって調製した各種アシル−ＡＣＰを基質とした反応を行うことにより、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を測定することができる。
The modified acyl-ACP thioesterase of the present invention has acyl-ACP thioesterase activity. For example, a fusion gene in which an acyl-ACP thioesterase gene is linked downstream of a promoter that functions in a host cell such as Escherichia coli is converted to a fatty acid. Using a method such as gas chromatography analysis of the change in fatty acid composition in the host cell or culture medium after introducing into the host cell deficient in the degradation system and culturing under the condition that the introduced acyl-ACP thioesterase gene is expressed. This can be confirmed by analysis.
In addition, a fusion gene in which an acyl-ACP thioesterase gene is linked downstream of a promoter that functions in a host cell such as E. coli is introduced into the host cell, and the cells are cultured under conditions such that the introduced acyl-ACP thioesterase gene is expressed. Later, the method of Yuan et al. (Yuan L, Voelker TA, Hawkins DJ. “Modification of the substrate specificity of an acyl-acyl carrier protein thioesterase by protein engineering” Proc Natl Acad Sci US A. 1995 Nov 7; 92 (23), p.10639-10643), by carrying out reactions using various acyl-ACPs as substrates, the acyl-ACP thioesterase activity can be measured.
本発明のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ改変体の取得方法については特に制限はなく、通常行われる化学的或いは遺伝子工学的手法等により得ることができる。例えば、配列番号１に示すアミノ酸配列情報をもとに人工的に合成等することもでき、例えば、インビトロジェン社等のサービスを利用することができる。また、化学合成によりタンパク質合成を行ってもよく、遺伝子組み換え技術により組換えタンパク質を作製してもよい。例えば、ナンノクロロプシス・オキュラータ（Nannochloropsis oculata）からクローニングによって取得したアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子を遺伝子組み換え技術により改変したものを用いることで、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ改変体を得ることができる。 There is no restriction | limiting in particular about the acquisition method of the acyl-ACP thioesterase modified body of this invention, It can obtain by the chemical or genetic engineering method etc. which are performed normally. For example, it can be artificially synthesized based on the amino acid sequence information shown in SEQ ID NO: 1, and for example, services such as Invitrogen can be used. In addition, protein synthesis may be performed by chemical synthesis, or a recombinant protein may be produced by a gene recombination technique. For example, an acyl-ACP thioesterase variant can be obtained by using a gene obtained by modifying an acyl-ACP thioesterase gene obtained by cloning from Nannochloropsis oculata by gene recombination technology.
２．アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ改変体をコードする遺伝子
前記（ａ）及び（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子として具体的には、下記（Ａ）及び（Ｂ）のＤＮＡからなる遺伝子が例示できるが、本発明はこれらに限定されるものではない。
（Ａ）配列番号２の３８２位〜８６４位の塩基配列において、下記（i）〜（iv）から選ばれる少なくとも１つの塩基置換を有する塩基配列を有し、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（i） 配列番号２の４４８位〜４５０位の塩基がグルタミン酸をコードする塩基からグリシンをコードする塩基に置換。
（ii） 配列番号２の５９８位〜６００位の塩基がアスパラギンをコードする塩基からアスパラギン酸をコードする塩基に置換。
（iii） 配列番号２の６６４位〜６６６位の塩基がアスパラギンをコードする塩基からセリンをコードする塩基、又はアスパラギンをコードする塩基からアラニンをコードする塩基に置換。
（iv） 配列番号２の７３３位〜７３５位の塩基がアルギニンをコードする塩基からリジンをコードする塩基に置換。
（Ｂ） （Ａ）のＤＮＡの塩基配列において、塩基置換された塩基以外の１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加された塩基配列を有し、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
2. Genes that code for modified acyl-ACP thioesterase Specific examples of the genes that code for the proteins (a) and (b) include the following genes (A) and (B): The invention is not limited to these examples.
(A) The base sequence from position 382 to position 864 of SEQ ID NO: 2 has a base sequence having at least one base substitution selected from the following (i) to (iv), and has acyl-ACP thioesterase activity DNA encoding a protein.
(I) The bases at positions 448 to 450 in SEQ ID NO: 2 are substituted from the base encoding glutamic acid to the base encoding glycine.
(Ii) The bases at positions 598 to 600 in SEQ ID NO: 2 are substituted from the base encoding asparagine to the base encoding aspartic acid.
(Iii) The bases at positions 664 to 666 of SEQ ID NO: 2 are substituted from the base encoding asparagine to the base encoding serine, or from the base encoding asparagine to the base encoding alanine.
(Iv) The bases at positions 733 to 735 of SEQ ID NO: 2 are substituted from the base encoding arginine to the base encoding lysine.
(B) An acyl-ACP thioesterase having a base sequence in which one or several bases other than the base-substituted base are deleted, substituted, inserted, or added in the base sequence of the DNA of (A) DNA encoding a protein having activity.
配列番号２に示す塩基配列は、ナンノクロロプシス オキュラータ由来の野生型アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子の塩基配列の一例である。 The base sequence shown in SEQ ID NO: 2 is an example of the base sequence of a gene encoding wild-type acyl-ACP thioesterase derived from Nannochloropsis oculiata.
前記（Ａ）のＤＮＡは、配列番号２の３８２位〜８６４位の塩基配列に相当する塩基配列の他に、他の塩基配列を有していてもよい。他の塩基配列としては、配列番号２の１位〜３８１位の塩基配列若しくはその一部の配列、タンパク質の輸送や分泌に関与するシグナルペプチド配列をコードする塩基配列等が挙げられる。これらの配列は、配列番号２の３８２位〜８６４位の塩基配列の５’末端側に付加されることが好ましい。他の塩基配列は、脂質生産性の観点から、配列番号２の１位〜３８１位の塩基配列若しくはその一部の配列が好ましい。 The DNA of (A) may have another base sequence in addition to the base sequence corresponding to the base sequence from position 382 to position 864 of SEQ ID NO: 2. Examples of other base sequences include the base sequence of positions 1 to 381 of SEQ ID NO: 2 or a partial sequence thereof, the base sequence encoding a signal peptide sequence involved in protein transport and secretion, and the like. These sequences are preferably added to the 5 'terminal side of the base sequence from position 382 to position 864 of SEQ ID NO: 2. From the viewpoint of lipid productivity, the other nucleotide sequence is preferably the nucleotide sequence at positions 1 to 381 of SEQ ID NO: 2 or a partial sequence thereof.
前記（Ａ）のＤＮＡとして好ましくは、配列番号２の１位〜３８２位の間の任意の位置から８６４位までの塩基配列において前記（i）〜（iv）から選ばれる少なくとも１つの塩基置換を有する塩基配列からなり、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである。より好ましくは、配列番号２の塩基配列、配列番号２の１４５位〜８６４位までの塩基配列、配列番号２の１７２位〜８６４位までの塩基配列、配列番号２の２３２位〜８６４位までの塩基配列、配列番号２の２５９位〜８６４位までの塩基配列、配列番号２の２６２位〜８６４位までの塩基配列、配列番号２の２９２位〜８６４位までの塩基配列、配列番号２の３２２位〜８６４位までの塩基配列、配列番号２の３５２位〜８６４位までの塩基配列、又は、配列番号２の３８２位〜８６４位までの塩基配列において前記（i）〜（iv）から選ばれる少なくとも１つの塩基置換を有する塩基配列からなり、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである。 Preferably, the DNA of (A) comprises at least one base substitution selected from (i) to (iv) in the base sequence from position 1 to position 382 of SEQ ID NO: 2 to position 864. DNA encoding a protein consisting of a base sequence having an acyl-ACP thioesterase activity. More preferably, the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 from position 145 to 864, the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 from position 172 to 864, the sequence of SEQ ID NO: 2 from position 232 to 864 Base sequence, base sequence from position 259 to 864 of SEQ ID NO: 2, base sequence from position 262 to 864 of SEQ ID NO: 2, base sequence from position 292 to 864 of SEQ ID NO: 2, 322 of SEQ ID NO: 2 Selected from the above (i) to (iv) in the base sequence from position 864 to position 864, the base sequence from position 352 to position 864 in SEQ ID NO: 2, or the base sequence from position 382 to position 864 in SEQ ID NO: 2 A DNA encoding a protein consisting of a base sequence having at least one base substitution and having acyl-ACP thioesterase activity.
前記（Ａ）のＤＮＡは、前記（i）〜（iv）から選ばれるいずれか１つの塩基置換を有することが好ましい。 The DNA of (A) preferably has any one base substitution selected from the above (i) to (iv).
前記（Ｂ）のＤＮＡの塩基配列において、「１又は数個の塩基」は、脂質生産性の観点から、１〜１５個であることが好ましく、１〜１０個であることがより好ましく、１〜５個であることがさらに好ましく、１〜２個であることよりさらに好ましい。
欠失等の変異を導入する方法としては、例えば、部位特異的な変異導入法が挙げられる。具体的な部位特異的変異の導入方法としては、Splicing overlap extension（SOE）PCR反応（Horton et al.，Gene 77，61−68，1989）を利用した方法、ＯＤＡ法（Hashimoto-Gotoh et al.，Gene，152，271-276，1995））、Kunkel法（Kunkel，T. A.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，1985，82，488）等が挙げられる。また、Site-Directed Mutagenesis System Mutan-SuperExpress Kmキット（タカラバイオ社）、Transformer TM Site-Directed Mutagenesisキット（Clonetech社）、KOD-Plus-Mutagenesis Kit（東洋紡社）等の市販のキットを利用することもできる。また、ランダムな遺伝子変異を与えた後、適当な方法により酵素活性の評価及び遺伝子解析を行うことにより目的遺伝子を取得することもできる。
In the base sequence of the DNA of (B), “1 or several bases” is preferably 1-15, more preferably 1-10, from the viewpoint of lipid productivity. It is more preferable that it is ˜5, and it is more preferable that it is 1-2.
Examples of the method for introducing mutation such as deletion include site-specific mutagenesis. As a specific method for introducing site-specific mutation, a method using a Splicing overlap extension (SOE) PCR reaction (Horton et al., Gene 77, 61-68, 1989), an ODA method (Hashimoto-Gotoh et al. , Gene, 152, 271-276, 1995), Kunkel method (Kunkel, TA, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1985, 82, 488). Also, commercially available kits such as Site-Directed Mutagenesis System Mutan-SuperExpress Km Kit (Takara Bio), Transformer TM Site-Directed Mutagenesis Kit (Clonetech), KOD-Plus-Mutagenesis Kit (Toyobo) may be used. it can. Moreover, after giving a random gene mutation, the target gene can also be obtained by performing enzyme activity evaluation and gene analysis by an appropriate method.
アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ改変体をコードする遺伝子の調製方法の一例としては、まず、ナンノクロロプシス オキュラータ（Nannochloropsis oculata） NIES2145株よりクローニングした野生型アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子の塩基配列（配列番号２で示される塩基配列）を、In-Fusion（登録商標） HD Cloning Kit（Clonthech, Mountain View, California）を用いてベクターに組み込む。次いで、得られたベクターＤＮＡを鋳型にして、配列番号１で示されるアミノ酸配列において前記（１）〜（４）のアミノ酸変異を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、ＰＣＲ法によってＤＮＡ断片を増幅する。ここで、ＰＣＲの反応条件の好ましい一例としては、２本鎖ＤＮＡを１本鎖にする熱変性反応を９４℃で３０秒間行い、プライマー対を１本鎖ＤＮＡにハイブリダイズさせるアニーリング反応を５５℃で約３０秒間行い、ＤＮＡポリメラーゼを作用させる伸長反応を７２℃で約７０秒間行い、これらを１サイクルとしたものを３０サイクル行うことが挙げられる。
ＰＣＲ反応で増幅したＤＮＡを、メチル化ＤＮＡを特異的に切断するDpnＩ酵素で処理し、これを用いて大腸菌を形質転換し、抗生物質含有プレート培地で選択する。形質転換された大腸菌よりプラスミド抽出することで、目的のアミノ酸変異が導入されたアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ改変体をコードする遺伝子を取得することができる。
As an example of a method for preparing a gene encoding an acyl-ACP thioesterase variant, first, the base sequence of the wild-type acyl-ACP thioesterase gene cloned from Nannochloropsis oculata NIES2145 strain (SEQ ID NO: 2) The base sequence shown) is incorporated into a vector using In-Fusion® HD Cloning Kit (Clonthech, Mountain View, California). Next, using the obtained vector DNA as a template, an oligonucleotide containing a base sequence encoding the amino acid sequence having the amino acid mutation of (1) to (4) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is used as a primer, A DNA fragment is amplified by the PCR method. Here, as a preferable example of the PCR reaction conditions, a heat denaturation reaction for converting double-stranded DNA into a single strand is performed at 94 ° C. for 30 seconds, and an annealing reaction for hybridizing the primer pair to the single-stranded DNA is performed at 55 ° C. For about 30 seconds, an extension reaction for allowing DNA polymerase to act is performed at 72 ° C. for about 70 seconds, and these are defined as one cycle for 30 cycles.
The DNA amplified by the PCR reaction is treated with a Dpn I enzyme that specifically cleaves methylated DNA, and E. coli is transformed with this enzyme and selected on a plate medium containing antibiotics. By extracting a plasmid from the transformed Escherichia coli, a gene encoding an acyl-ACP thioesterase variant into which the target amino acid mutation has been introduced can be obtained.
３．形質転換体（組換え体）
本発明の形質転換体は、宿主に前記（ａ）及び（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子を導入して得られる。当該形質転換体では、野生型アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子を導入した形質転換体に比べ、脂質の生産能、特に炭素数１２又は１４の脂肪酸及びこれを構成成分とする脂質の生産能が有意に向上する。また、当該形質転換体では、野生型アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子を導入した形質転換体と比べ、脂質中の脂肪酸組成が改変される。なお、野生型アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ及びアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ改変体の脂肪酸及び脂質の生産能については、実施例で用いた方法により測定することができる。
3. Transformant (recombinant)
The transformant of the present invention is obtained by introducing a gene encoding the proteins (a) and (b) into a host. Compared with the transformant into which the wild-type acyl-ACP thioesterase gene has been introduced, the transformant has significantly higher lipid production ability, in particular, the ability to produce fatty acids having 12 or 14 carbon atoms and lipids composed thereof. improves. Moreover, in the said transformant, the fatty acid composition in lipid is modified compared with the transformant which introduce | transduced the wild type acyl-ACP thioesterase gene. The ability to produce fatty acids and lipids of wild-type acyl-ACP thioesterase and acyl-ACP thioesterase variants can be measured by the methods used in the examples.
本発明の形質転換体は、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ改変体をコードする遺伝子を、通常の遺伝子工学的方法によって宿主に導入することで得られる。具体的には、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ改変体をコードする遺伝子を宿主細胞中で発現させることのできる発現ベクターを調製し、これを宿主細胞に導入して宿主細胞を形質転換させることにより作製できる。 The transformant of the present invention can be obtained by introducing a gene encoding an acyl-ACP thioesterase variant into a host by an ordinary genetic engineering method. Specifically, it can be prepared by preparing an expression vector capable of expressing a gene encoding an acyl-ACP thioesterase variant in a host cell, introducing the vector into the host cell, and transforming the host cell. .
形質転換体の宿主としては特に限定されず、微生物、植物体、又は動物体を用いることができる。なお、本発明において微生物には藻類や微細藻類が含まれる。製造効率及び得られた脂質の利用性の点から、宿主は微生物又は植物体であることが好ましく、微生物であることがより好ましい。
前記微生物は原核生物、真核生物のいずれであってもよく、エシェリキア（Escherichia）属に属する微生物やバシラス（Bacillus）属に属する微生物等の原核生物、又は酵母や糸状菌等の真核微生物を用いることができる。なかでも、脂質生産性の観点から、エシェリキア属に属する微生物である大腸菌（Escherichia coli）、バシラス属に属する微生物である枯草菌（Bacillus subtilis）、酵母に属する微生物である赤色酵母（Rhodosporidium toruloides）、又は糸状菌に属する微生物であるモルチエレラ エスピー（Mortierella sp．）が好ましく、大腸菌がより好ましい。
また、前記微生物としては、微細藻類も好ましい。前記微細藻類としては、遺伝子組換え手法が確立している観点から、クラミドモナス（Chlamydomonas）属に属する藻類、クロレラ（Chlorella）属に属する藻類、ファエオダクティラム（Phaeodactylum）属に属する藻類、又はナンノクロロプシス属に属する藻類が好ましく、ナンノクロロプシス属に属する藻類がより好ましい。ナンノクロロプシス属に属する藻類として具体的には、Nannochloropsis oculata、Nannochloropsis gaditana、Nannochloropsis salina、Nannochloropsis oceanica、Nannochloropsis atomus、Nannochloropsis maculata、Nannochloropsis granulata、又はNannochloropsis sp．、等が挙げられる。なかでも、脂質生産性の観点から、Nannochloropsis oculata、又はNannochloropsis gaditanaが好ましく、Nannochloropsis oculataがより好ましい。
前記植物体としては、種子に脂質を高含有する観点から、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）、ナタネ、ココヤシ、パーム、クフェア、又はヤトロファが好ましく、シロイヌナズナがより好ましい。
The host of the transformant is not particularly limited, and microorganisms, plants, or animals can be used. In the present invention, the microorganism includes algae and microalgae. From the viewpoint of production efficiency and availability of the obtained lipid, the host is preferably a microorganism or a plant, and more preferably a microorganism.
The microorganism may be either a prokaryote or a eukaryote, and may be a prokaryote such as a microorganism belonging to the genus Escherichia or a genus Bacillus, or a eukaryotic microorganism such as a yeast or filamentous fungus. Can be used. Among them, from the viewpoint of the lipid productivity, E. (Escherichia coli) is a microorganism belonging to Escherichia, Bacillus subtilis (Bacillus subtilis) is a microorganism belonging to the genus Bacillus, red yeast is a microorganism belonging to yeast (Rhodosporidium toruloides), Or Mortierella sp. Which is a microorganism belonging to filamentous fungi is preferable, and Escherichia coli is more preferable.
Further, as the microorganism, microalgae are also preferable. From the viewpoint of establishing a genetic recombination technique, the microalgae include algae belonging to the genus Chlamydomonas , algae belonging to the genus Chlorella , algae belonging to the genus Phaeodactylum , Algae belonging to the genus Chloropsis is preferred, and alga belonging to the genus Nannochloropsis is more preferred. Specific examples of algae belonging to the genus Nannochloropsis include Nannochloropsis oculata , Nannochloropsis gaditana , Nannochloropsis salina , Nannochloropsis oceanica , Nannochloropsis atomus , Nannochloropsis maculata , Nannochloropsis granulata , or Nannochloropsis sp. , Etc. Among these, from the viewpoint of lipid productivity, Nannochloropsis oculata or Nannochloropsis gaditana is preferable, and Nannochloropsis oculata is more preferable.
The plant body is preferably Arabidopsis thaliana , rapeseed, coconut palm, palm, coffea, or jatropha, more preferably Arabidopsis , from the viewpoint of high lipid content in the seed.
発現ベクターの母体となるベクターとしては、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ改変体をコードする遺伝子を宿主に導入することができ、宿主細胞内で当該遺伝子を発現可能なベクターであればよい。例えば、導入する宿主の種類に応じたプロモーターやターミネーター等の発現調節領域を有するベクターであって、複製開始点や選択マーカー等を有するベクターを用いることができる。また、プラスミド等の染色体外で自立増殖・複製するベクターであってもよいし、染色体内に組み込まれるベクターであってもよい。
具体的なベクターとしては、微生物を宿主とする場合には、例えば、pBluescript（pBS） II SK(-)（Stratagene社製）、pUC系ベクター（宝酒造社製）、pET系ベクター（タカラバイオ社製）、pGEX系ベクター（GEヘルスケア社製）、pCold系ベクター（タカラバイオ社製）、pHY300PLK（タカラバイオ社製）、pUB110（Mckenzie，T. et al.,（1986）,Plasmid 15（2）；p.93-103）、pBR322（タカラバイオ社製）、pRS403（ストラタジーン社製）、又はpMW218/219（ニッポンジーン社製）が挙げられる。特に、宿主が大腸菌の場合は、pBluescript II SK(-)、又はpMW218/219が好ましく用いられる。
藻類を宿主とする場合には、例えば、P66（Chlamydomonas Center）、P-322（Chlamydomonas Center）、pPha-T1（前記非特許文献２参照）、又はpJET1（コスモ・バイオ社製）が挙げられる。特に、宿主がナンノクロロプシス属に属する藻類の場合は、pPha-T1、又はpJET1が好ましく用いられる。また、宿主がナンノクロロプシス属に属する藻類の場合には、Oliver Kilian, et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, Dec 27;108(52), 2011、の文献記載の方法を参考にして、本発明の遺伝子、プロモーター及びターミネーターからなるＤＮＡ断片を用いて宿主を形質転換することもできる。このＤＮＡ断片としては、例えば、ＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片や制限酵素切断ＤＮＡ断片が挙げられる。
植物細胞を宿主とする場合には、例えば、pRI系ベクター（タカラバイオ社製）、pBI系ベクター（クロンテック社製）、又はIN3系ベクター（インプランタイノベーションズ社製）が挙げられる。特に、宿主がシロイヌナズナの場合は、pRI系ベクター又はpBI系ベクターが好ましく用いられる。
The vector serving as the parent of the expression vector may be any vector that can introduce a gene encoding an acyl-ACP thioesterase variant into a host and can express the gene in a host cell. For example, a vector having an expression regulatory region such as a promoter or terminator according to the type of host to be introduced, and a vector having a replication origin or a selection marker can be used. Further, it may be a vector that grows and replicates autonomously outside the chromosome, such as a plasmid, or may be a vector that is integrated into the chromosome.
As specific vectors, when a microorganism is used as a host, for example, pBluescript (pBS) II SK (-) (Stratagene), pUC vector (Takara Shuzo), pET vector (Takara Bio) ), PGEX vectors (GE Healthcare), pCold vectors (Takara Bio), pHY300PLK (Takara Bio), pUB110 (Mckenzie, T. et al., (1986), Plasmid 15 (2) P.93-103), pBR322 (manufactured by Takara Bio Inc.), pRS403 (manufactured by Stratagene), or pMW218 / 219 (manufactured by Nippon Gene). In particular, when the host is Escherichia coli, pBluescript II SK (−) or pMW218 / 219 is preferably used.
In the case of using algae as a host, for example, P66 (Chlamydomonas Center), P-322 (Chlamydomonas Center), pPha-T1 (see Non-Patent Document 2), or pJET1 (manufactured by Cosmo Bio) may be mentioned. In particular, when the host is an algae belonging to the genus Nannochloropsis, pPha-T1 or pJET1 is preferably used. When the host is an algae belonging to the genus Nannochloropsis, the literature description of Oliver Kilian, et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, Dec 27; 108 (52), 2011. With reference to the above method, a host can also be transformed with a DNA fragment comprising the gene, promoter and terminator of the present invention. Examples of the DNA fragment include a PCR amplified DNA fragment and a restriction enzyme cleaved DNA fragment.
When a plant cell is used as a host, for example, a pRI vector (manufactured by Takara Bio Inc.), a pBI vector (manufactured by Clontech), or an IN3 vector (manufactured by Implanta Innovations) can be mentioned. In particular, when the host is Arabidopsis thaliana, pRI vectors or pBI vectors are preferably used.
プロモーターやターミネーター等の発現調節領域や選択マーカーの種類も特に限定されず、通常使用されるプロモーターやマーカー等を導入する宿主の種類に応じて適宜選択して用いることができる。
具体的なプロモーターとしては、例えば、lacプロモーター、trpプロモーター、tacプロモーター、trcプロモーター、T7プロモーター、SpoVGプロモーター、カリフラワーモザイルウイルス35SRNAプロモーター、ハウスキーピング遺伝子（チューブリン、アクチン、ユビキチン等）のプロモーター、ナタネ由来Napin遺伝子プロモーター、植物由来Rubiscoプロモーター、又はナンノクロロプシス属由来のビオラキサンチン／クロロフィルａ結合タンパク質遺伝子のプロモーターが挙げられる。
また、選択マーカーとしては、抗生物質耐性遺伝子（アンピシリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ブラストサイジンＳ耐性遺伝子、ビアラホス耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、パロモマイシン耐性遺伝子、又はハイグロマイシン耐性遺伝子）等の薬剤耐性遺伝子が挙げられる。さらに、栄養要求性に関連する遺伝子の欠損等を選択マーカー遺伝子として使用することも可能である。
The types of expression regulatory regions such as promoters and terminators and the types of selectable markers are not particularly limited, and can be appropriately selected and used depending on the type of host into which a commonly used promoter or marker is introduced.
Specific promoters include, for example, the promoters of lac promoter, trp promoter, tac promoter, trc promoter, T7 promoter, SpoVG promoter, cauliflower mozil virus 35 SRNA promoter, housekeeping genes (tubulin, actin, ubiquitin, etc.), rapeseed Examples include a promoter of a derived Napin gene promoter, a plant-derived Rubisco promoter, or a violaxanthin / chlorophyll a binding protein gene derived from the genus Nannochloropsis.
Selectable markers include antibiotic resistance genes (ampicillin resistance gene, chloramphenicol resistance gene, erythromycin resistance gene, neomycin resistance gene, kanamycin resistance gene, spectinomycin resistance gene, tetracycline resistance gene, blasticidin S resistance And drug resistance genes such as genes, bialaphos resistance genes, zeocin resistance genes, paromomycin resistance genes, or hygromycin resistance genes. Furthermore, it is also possible to use a gene defect associated with auxotrophy as a selection marker gene.
上記ベクターにアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ改変体をコードする遺伝子を、制限酵素処理やライゲーション等の通常の手法によって組み込むことにより形質転換に用いる発現ベクターを構築することができる。
形質転換方法としては、宿主に目的遺伝子を導入しうる方法であれば特に限定されるものではない。例えば、カルシウムイオンを用いる方法、一般的なコンピテントセル形質転換方法（J．Bacterial．93，1925（1967））、プロトプラスト形質転換法（Mol．Gen．Genet．168，111（1979））、エレクトロポレーション法（FEMS Microbiol．Lett．55，135（1990））又はLP形質転換方法（T．Akamatsu及びJ．Sekiguchi，Archives of Microbiology，1987，146，p.353-357；T．Akamatsu及びH．Taguchi，Bioscience，Biotechnology，and Biochemistry，2001，65，4，p.823-829）等を用いることができる。宿主がナンノクロロプシス属に属する藻類の場合、Randor Radakovits, et al., Nature Communications, DOI:10.1038/ncomms1688, 2012、に記載のエレクトロポレーション法を用いて形質転換を行うこともできる。
An expression vector used for transformation can be constructed by incorporating a gene encoding an acyl-ACP thioesterase variant into the vector by a usual technique such as restriction enzyme treatment or ligation.
The transformation method is not particularly limited as long as it is a method capable of introducing a target gene into a host. For example, a method using calcium ions, a general competent cell transformation method (J. Bacterial. 93, 1925 (1967)), a protoplast transformation method (Mol. Gen. Genet. 168, 111 (1979)), electro Polation method (FEMS Microbiol. Lett. 55, 135 (1990)) or LP transformation method (T. Akamatsu and J. Sekiguchi, Archives of Microbiology, 1987, 146, p.353-357; Taguchi, Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 2001, 65, 4, p.823-829) and the like can be used. When the host is an algae belonging to the genus Nannochloropsis, transformation can also be performed using the electroporation method described in Randor Radakovits, et al., Nature Communications, DOI: 10.1038 / ncomms1688, 2012.
目的遺伝子断片が導入された形質転換体の選択は、選択マーカー等を利用することで行うことができる。例えば、ベクター由来の薬剤耐性遺伝子が、形質転換時に目的ＤＮＡ断片とともに宿主細胞中に導入された結果、形質転換体が獲得する薬剤耐性を指標に行うことができる。また、ゲノムを鋳型としたＰＣＲ法等によって、目的ＤＮＡ断片の導入を確認することもできる。 Selection of the transformant introduced with the target gene fragment can be performed by utilizing a selection marker or the like. For example, the drug resistance gene acquired by the transformant as a result of introducing a vector-derived drug resistance gene into the host cell together with the target DNA fragment at the time of transformation can be used as an indicator. The introduction of the target DNA fragment can also be confirmed by PCR method using a genome as a template.
４．脂質の製造方法
次いで、上記で得られた形質転換体を用いて脂質を生産する。
本発明の製造方法は、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ改変体をコードする遺伝子を導入した形質転換体から脂質を採取する工程を含む。当該工程は、脂質の生産性向上の観点から、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ改変体をコードする遺伝子を導入した形質転換体を適切な条件にて培養又は生育して培養物又は生育物を得る工程、及び得られた培養物又は生育物から脂質を採取する工程を含むことが好ましい。ここで、培養物とは、培養した後の培養液及び形質転換体をいい、生育物とは、生育した後の形質転換体をいう。
4). Lipid production method Next, lipid is produced using the transformant obtained above.
The production method of the present invention includes a step of collecting lipid from a transformant introduced with a gene encoding an acyl-ACP thioesterase variant. The step is a step of obtaining a culture or a growth by culturing or growing a transformant introduced with a gene encoding an acyl-ACP thioesterase variant under appropriate conditions from the viewpoint of improving lipid productivity. And a step of collecting lipid from the obtained culture or growth. Here, the culture refers to the culture solution and transformant after culturing, and the growth refers to the transformant after growth.
培養又は生育条件は、形質転換体の宿主に応じて適宜選択することができ、その宿主に対して通常用いられる培養又は生育条件を使用できる。
また、脂質の生産効率の点から、培地中に、例えばアシル−ＡＣＰチオエステラーゼの基質或いは脂肪酸生合成系に関与する前駆物質としてグリセロール、酢酸、又はマロン酸等を添加してもよい。
Culture or growth conditions can be appropriately selected depending on the host of the transformant, and culture or growth conditions that are usually used for the host can be used.
From the viewpoint of lipid production efficiency, for example, glycerol, acetic acid, malonic acid, or the like may be added to the medium as a substrate of acyl-ACP thioesterase or a precursor involved in the fatty acid biosynthesis system.
一例として、大腸菌を宿主として用いた形質転換体の場合、ＬＢ培地又はOvernight Express Instant TB Medium（Novagen社）で、３０〜３７℃、０．５〜１日間培養を行うことが挙げられる。また、シロイヌナズナを宿主として用いた形質転換体の場合、土壌で温度条件２０〜２５℃、白色光を連続照射又は明期１６時間・暗期８時間等の光条件下で１〜２か月間栽培を行うことが挙げられる。 As an example, in the case of a transformant using Escherichia coli as a host, culturing is performed at 30 to 37 ° C. for 0.5 to 1 day in an LB medium or Overnight Express Instant TB Medium (Novagen). In addition, in the case of a transformant using Arabidopsis as a host, it is cultivated for 1 to 2 months under light conditions such as temperature irradiation of 20 to 25 ° C., white light or 16 hours of light period or 8 hours of dark period in soil. Can be mentioned.
形質転換の宿主が藻類の場合、以下の培地及び培養条件を用いることができる。
培地は天然海水又は人工海水をベースにしたものを使用してもよいし、市販の培養培地を使用してもよい。具体的な培地としては、ｆ／２培地、ＥＳＭ培地、ダイゴＩＭＫ培地、Ｌ１培地、ＭＮＫ培地、等を挙げることができる。なかでも、脂質の生産性向上及び栄養成分濃度の観点から、ｆ／２培地、ＥＳＭ培地、又はダイゴＩＭＫ培地が好ましく、ｆ／２培地、又はダイゴＩＭＫ培地がより好ましく、ｆ／２培地がさらに好ましい。藻類の生育促進、中鎖脂肪酸の生産性向上のため、培地に、窒素源、リン源、金属塩、ビタミン類、微量金属等を適宜添加することができる。
培地に接種する藻類の量は特に限定されないが、生育性の点から、培地当り１〜５０％（vol/vol）が好ましく、１〜１０％（vol/vol）がより好ましい。培養温度は、藻類の増殖に悪影響を与えない範囲であれば特に制限されないが、通常、５〜４０℃の範囲である。藻類の生育促進、中鎖脂肪酸の生産性向上、及び生産コストの低減の観点から、好ましくは１０〜３５℃であり、より好ましくは１５〜３０℃である。
また、藻類の培養は、光合成ができるよう光照射下で行うことが好ましい。光照射は、光合成が可能な条件であればよく、人工光でも太陽光でもよい。光照射時の照度としては、藻類の生育促進、中鎖脂肪酸の生産性向上の観点から、好ましくは１００〜５００００ルクスの範囲、より好ましくは３００〜１００００ルクスの範囲、さらに好ましくは１０００〜６０００ルクスの範囲である。また、光照射の間隔は、特に制限されないが、前記と同様の観点から、明暗周期で行うことが好ましく、２４時間のうち明期が好ましくは８〜２４時間、より好ましくは１０〜１８時間、さらに好ましくは１２時間である。
また、藻類の培養は、光合成ができるように二酸化炭素を含む気体の存在下、又は炭酸水素ナトリウムなどの炭酸塩を含む培地で行うことが好ましい。気体中の二酸化炭素の濃度は特に限定されないが、生育促進、中鎖脂肪酸の生産性向上の観点から０．０３（大気条件と同程度）〜１０％が好ましく、より好ましくは０．０５〜５％、さらに好ましくは０．１〜３％、よりさらに好ましくは０．３〜１％である。炭酸塩の濃度は特に限定されないが、例えば炭酸水素ナトリウムを用いる場合、生育促進、中鎖脂肪酸の生産性向上の観点から０．０１〜５質量％が好ましく、より好ましくは０．０５〜２質量％、さらに好ましくは０．１〜１質量％である。
培養時間は特に限定されず、脂質を高濃度に蓄積する藻体が高い濃度で増殖できるように、長期間（例えば１５０日程度）行なってもよい。藻類の生育促進、中鎖脂肪酸の生産性向上、及び生産コストの低減の観点から、培養期間は、好ましくは３〜９０日間、より好ましくは３〜３０日間、さらに好ましくは７〜３０日間である。なお、培養は、通気攪拌培養、振とう培養又は静置培養のいずれでもよく、通気性の向上の観点から、振とう培養が好ましい。
When the host for transformation is algae, the following medium and culture conditions can be used.
A medium based on natural seawater or artificial seawater may be used, or a commercially available culture medium may be used. Specific examples of the medium include f / 2 medium, ESM medium, Daigo IMK medium, L1 medium, and MNK medium. Among these, from the viewpoint of improving lipid productivity and nutrient concentration, f / 2 medium, ESM medium, or Daigo IMK medium is preferable, f / 2 medium or Daigo IMK medium is more preferable, and f / 2 medium is further included. preferable. In order to promote the growth of algae and improve the productivity of medium chain fatty acids, a nitrogen source, a phosphorus source, a metal salt, vitamins, trace metals and the like can be appropriately added to the medium.
The amount of algae inoculated into the medium is not particularly limited, but is preferably 1 to 50% (vol / vol) and more preferably 1 to 10% (vol / vol) from the viewpoint of growth. Although culture | cultivation temperature will not be restrict | limited especially if it is a range which does not have a bad influence on the growth of algae, Usually, it is the range of 5-40 degreeC. From the viewpoint of promoting the growth of algae, improving the productivity of medium chain fatty acids, and reducing the production cost, it is preferably 10 to 35 ° C, more preferably 15 to 30 ° C.
Moreover, it is preferable to culture algae under light irradiation so that photosynthesis is possible. The light irradiation may be performed under conditions that allow photosynthesis, and may be artificial light or sunlight. The illuminance at the time of light irradiation is preferably in the range of 100 to 50000 lux, more preferably in the range of 300 to 10000 lux, and still more preferably 1000 to 6000 lux, from the viewpoint of promoting the growth of algae and improving the productivity of medium chain fatty acids. Range. Further, the light irradiation interval is not particularly limited, but from the same viewpoint as described above, it is preferably performed in a light-dark cycle, and the light period is preferably 8-24 hours, more preferably 10-18 hours, More preferably, it is 12 hours.
Moreover, it is preferable to perform culture | cultivation of algae in the presence of the gas containing carbon dioxide so that photosynthesis is possible, or the culture medium containing carbonates, such as sodium hydrogencarbonate. Although the density | concentration of the carbon dioxide in gas is not specifically limited, From a viewpoint of growth promotion and productivity improvement of medium chain fatty acid, 0.03 (same as atmospheric conditions) -10% is preferable, More preferably, 0.05-5 %, More preferably 0.1 to 3%, and still more preferably 0.3 to 1%. The concentration of the carbonate is not particularly limited. For example, when sodium bicarbonate is used, it is preferably 0.01 to 5% by mass, more preferably 0.05 to 2% by mass from the viewpoint of promoting growth and improving productivity of medium chain fatty acids. %, More preferably 0.1 to 1% by mass.
The culture time is not particularly limited, and may be performed for a long period of time (for example, about 150 days) so that algal bodies that accumulate lipids at a high concentration can grow at a high concentration. From the viewpoint of promoting the growth of algae, improving the productivity of medium chain fatty acids, and reducing the production cost, the culture period is preferably 3 to 90 days, more preferably 3 to 30 days, and even more preferably 7 to 30 days. . In addition, culture | cultivation may be any of aeration stirring culture, shaking culture, or stationary culture, and a shaking culture is preferable from a viewpoint of an improvement in aeration.
形質転換体において産生された脂質を採取する方法としては、通常生体内の脂質成分等を単離する際に用いられる方法、例えば、前述の培養物、生育物又は形質転換体から、ろ過、遠心分離、細胞の破砕、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、クロロホルム／メタノール抽出法、ヘキサン抽出法、又はエタノール抽出法等により脂質成分を単離、回収する方法が挙げられる。より大規模な場合は、培養物、生育物又は形質転換体より油分を圧搾又は抽出により回収後、脱ガム、脱酸、脱色、脱蝋、脱臭等の一般的な精製を行い、脂質を得ることができる。このように脂質成分を単離した後、単離した脂質を加水分解することで脂肪酸を得ることができる。脂質成分から脂肪酸を単離する方法としては、例えば、アルカリ溶液中で７０℃程度の高温で処理をする方法、リパーゼ処理をする方法、又は高圧熱水を用いて分解する方法等が挙げられる。 As a method for collecting lipid produced in the transformant, a method usually used for isolating lipid components in a living body, for example, filtration, centrifugation from the culture, growth or transformant described above. Examples thereof include a method for isolating and recovering lipid components by separation, cell disruption, gel filtration chromatography, ion exchange chromatography, chloroform / methanol extraction method, hexane extraction method, ethanol extraction method, or the like. In the case of a larger scale, oil is recovered from the culture, growth or transformant by pressing or extraction, and then subjected to general purification such as degumming, deoxidation, decolorization, dewaxing, deodorization, etc. to obtain lipids be able to. Thus, after isolating a lipid component, a fatty acid can be obtained by hydrolyzing the isolated lipid. Examples of the method for isolating the fatty acid from the lipid component include a method of treating at a high temperature of about 70 ° C. in an alkaline solution, a method of treating with lipase, a method of decomposing using high-pressure hot water, and the like.
本発明の製造方法では、本発明のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ改変体を用いることで、野生型アシル−ＡＣＰチオエステラーゼを用いた場合と比べ、脂質の生産性、特に炭素数１２又は１４の脂肪酸及びこれを構成成分とする脂質の生産性を有意に向上させることができる。
本発明の製造方法において製造される脂質は、その利用性の点から、単純脂質及び誘導脂質から選ばれる１種以上を含んでいることが好ましく、誘導脂質を含んでいることがより好ましく、脂肪酸又はそのエステルを含んでいることがさらに好ましい。脂質中に含まれる脂肪酸又はそのエステルは、界面活性剤等への利用性から、炭素原子数１２〜１６の脂肪酸又はそのエステルが好ましく、炭素原子数１２〜１４の脂肪酸又はそのエステルがより好ましく、炭素原子数１２の脂肪酸又はそのエステルがさらに好ましく、ラウリン酸又はそのエステルがよりさらに好ましい。これらの高級脂肪酸を還元して得られる高級アルコールの誘導体は、界面活性剤として利用できる。
採取された総脂質成分中の炭素原子数１２〜１４の脂肪酸の含有量は、界面活性剤として利用する観点から、好ましくは２０質量％以上、より好ましくは２５質量％以上である。さらに、採取された総脂質成分中に含まれる炭素原子数１２の脂肪酸の含有量は、界面活性剤として利用する観点から、好ましくは５質量％以上、より好ましくは７質量％以上である。ここで、「採取された総脂質成分」とは、実施例で用いられた方法により算出された総脂質成分をいう。
In the production method of the present invention, by using the modified acyl-ACP thioesterase of the present invention, compared to the case of using wild-type acyl-ACP thioesterase, lipid productivity, in particular, a fatty acid having 12 or 14 carbon atoms and The productivity of lipids comprising this as a constituent can be significantly improved.
The lipid produced in the production method of the present invention preferably contains one or more selected from simple lipids and derived lipids, more preferably contains derived lipids, and fatty acids from the viewpoint of its availability. Or it is more preferable that the ester is included. The fatty acid or ester thereof contained in the lipid is preferably a fatty acid having 12 to 16 carbon atoms or an ester thereof, more preferably a fatty acid having 12 to 14 carbon atoms or an ester thereof, from the viewpoint of availability to a surfactant or the like. A fatty acid having 12 carbon atoms or an ester thereof is more preferred, and lauric acid or an ester thereof is more preferred. Derivatives of higher alcohols obtained by reducing these higher fatty acids can be used as surfactants.
The content of the fatty acid having 12 to 14 carbon atoms in the collected total lipid component is preferably 20% by mass or more, more preferably 25% by mass or more from the viewpoint of utilization as a surfactant. Furthermore, the content of the fatty acid having 12 carbon atoms contained in the collected total lipid component is preferably 5% by mass or more, more preferably 7% by mass or more from the viewpoint of utilization as a surfactant. Here, “collected total lipid component” refers to the total lipid component calculated by the method used in the examples.
本発明の製造方法、形質転換体により得られる脂肪酸や脂質は、食用として用いる他、化粧品等の乳化剤、石鹸や洗剤等の洗浄剤、繊維処理剤、毛髪リンス剤、又は殺菌剤や防腐剤として利用することができる。 Fatty acids and lipids obtained by the production method of the present invention and transformants are used as food, as emulsifiers for cosmetics, detergents such as soaps and detergents, fiber treatment agents, hair rinse agents, or bactericides and preservatives. Can be used.
上述した実施形態に関し、本発明はさらに以下の方法、形質転換体、タンパク質を開示する。 The present invention further discloses the following methods, transformants, and proteins with respect to the above-described embodiments.
＜１＞ 宿主に下記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子を導入して形質転換体を得る工程と、得られた形質転換体から脂質を採取する工程とを含む、脂質の製造方法。
（ａ） 配列番号１の１２８位〜２８７位のアミノ酸配列において、下記（１）〜（４）から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を有し、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
（１） 配列番号１の１５０位のアミノ酸がグルタミン酸からグリシンに置換。
（２） 配列番号１の２００位のアミノ酸がアスパラギンからアスパラギン酸に置換。
（３） 配列番号１の２２２位のアミノ酸がアスパラギンからセリン又はアラニンに置換。
（４） 配列番号１の２４５位のアミノ酸がアルギニンからリジンに置換。
（ｂ） （ａ）のタンパク質のアミノ酸配列において、アミノ酸置換されたアミノ酸以外の１又は数個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、よりさらに好ましくは１〜２個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
<1> Lipid production comprising the steps of obtaining a transformant by introducing a gene encoding the protein (a) or (b) below into a host, and collecting the lipid from the obtained transformant Method.
(A) The amino acid sequence at positions 128 to 287 of SEQ ID NO: 1 has an amino acid sequence having at least one amino acid substitution selected from the following (1) to (4), and has acyl-ACP thioesterase activity protein.
(1) The amino acid at position 150 of SEQ ID NO: 1 was replaced with glutamic acid from glycine.
(2) The amino acid at position 200 of SEQ ID NO: 1 was substituted from asparagine to aspartic acid.
(3) The amino acid at position 222 of SEQ ID NO: 1 is substituted from asparagine to serine or alanine.
(4) The amino acid at position 245 of SEQ ID NO: 1 was substituted from arginine to lysine.
(B) In the amino acid sequence of the protein of (a), one or several amino acids other than amino acid-substituted amino acids, preferably 1 to 15, more preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, and even more A protein having an amino acid sequence in which preferably 1 to 2 amino acids have been deleted, substituted, inserted, or added, and having acyl-ACP thioesterase activity.
＜２＞ 前記宿主が微生物である、＜１＞項記載の製造方法。
＜３＞ 前記微生物が微細藻類、好ましくはナンノクロロプシス属に属する藻類である、＜２＞項記載の製造方法。
＜４＞ 前記微生物が大腸菌である、＜２＞項記載の製造方法。
＜５＞ 前記脂質が炭素数１２の脂肪酸又はそのエステルを含む、＜１＞〜＜４＞のいずれか１項に記載の製造方法。
＜６＞ 前記脂質中に、炭素数１２の脂肪酸が５質量％以上含有される、＜１＞〜＜５＞のいずれか１項に記載の製造方法。
＜７＞ 前記（ａ）のタンパク質が、配列番号１の１位〜１２８位の間の任意の位置から２８７位までのアミノ酸配列において前記（１）〜（４）から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列からなり、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質である、＜１＞〜＜６＞のいずれか１項に記載の製造方法。
＜８＞ 前記（ａ）のタンパク質が、配列番号１のアミノ酸配列、配列番号１の４９位〜２８７位までのアミノ酸配列、配列番号１の５８位〜２８７位までのアミノ酸配列、配列番号１の７８位〜２８７位までのアミノ酸配列、配列番号１の８７位〜２８７位までのアミノ酸配列、配列番号１の８８位〜２８７位までのアミノ酸配列、配列番号１の９８位〜２８７位までのアミノ酸配列、配列番号１の１０８位〜２８７位までのアミノ酸配列、配列番号１の１１８位〜２８７位までのアミノ酸配列、又は配列番号１の１２８位〜２８７位までのアミノ酸配列において前記（１）〜（４）から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列からなり、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質である、＜１＞〜＜６＞のいずれか１項に記載の製造方法。
<2> The production method according to <1>, wherein the host is a microorganism.
<3> The production method according to <2>, wherein the microorganism is a microalgae, preferably an algae belonging to the genus Nannochloropsis.
<4> The production method according to <2>, wherein the microorganism is Escherichia coli.
<5> The production method according to any one of <1> to <4>, wherein the lipid includes a C12 fatty acid or an ester thereof.
<6> The production method according to any one of <1> to <5>, wherein the lipid contains 5% by mass or more of a fatty acid having 12 carbon atoms.
<7> The protein of (a) is substituted with at least one amino acid selected from (1) to (4) in the amino acid sequence from any position between positions 1 to 128 of SEQ ID NO: 1 to position 287. <1>-<6> The manufacturing method of any one of <1>-<6> which is a protein which consists of an amino acid sequence which has and has acyl- ACP thioesterase activity.
<8> The protein of (a) is the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, the amino acid sequence of positions 49 to 287 of SEQ ID NO: 1, the amino acid sequence of positions 58 to 287 of SEQ ID NO: 1, Amino acid sequence from positions 78 to 287, amino acid sequence from positions 87 to 287 of SEQ ID NO: 1, amino acid sequence from positions 88 to 287 of SEQ ID NO: 1, amino acids from positions 98 to 287 of SEQ ID NO: 1 In the sequence, amino acid sequence from position 108 to position 287 of SEQ ID NO: 1, amino acid sequence from position 118 to position 287 of SEQ ID NO: 1, or amino acid sequence from position 128 to position 287 of SEQ ID NO: 1 <1> to a protein comprising an amino acid sequence having at least one amino acid substitution selected from (4) and having acyl-ACP thioesterase activity <6> The manufacturing method according to any one of items.
＜９＞ 宿主に前記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子を導入して得られる形質転換体。
＜１０＞ 前記宿主が微生物である、＜９＞項記載の形質転換体。
＜１１＞ 前記微生物が微細藻類、好ましくはナンノクロロプシス属に属する藻類である、＜１０＞項記載の形質転換体。
＜１２＞ 前記微生物が大腸菌である、＜１０＞項記載の形質転換体。
＜１３＞ 前記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子を含有する組換えベクター。
<9> A transformant obtained by introducing a gene encoding the protein (a) or (b) into a host.
<10> The transformant according to <9>, wherein the host is a microorganism.
<11> The transformant according to <10>, wherein the microorganism is a microalgae, preferably an algae belonging to the genus Nannochloropsis.
<12> The transformant according to <10>, wherein the microorganism is Escherichia coli.
<13> A recombinant vector containing a gene encoding the protein of (a) or (b).
＜１４＞ 前記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質。 <14> The protein of (a) or (b).
＜１５＞ 宿主に前記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子を導入して形質転換体を得る工程を含む、脂質の生産性を向上させる方法。
＜１６＞ 宿主に下記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子を導入する工程を含む、脂質中の脂肪酸組成を改変する方法。
<15> A method for improving lipid productivity, comprising a step of introducing a gene encoding the protein of (a) or (b) into a host to obtain a transformant.
<16> A method for modifying a fatty acid composition in a lipid, comprising a step of introducing a gene encoding the protein (a) or (b) below into a host.
＜１７＞ 脂質を製造するための、＜９＞〜＜１２＞のいずれか１項に記載の形質転換体の使用。
＜１８＞ 前記脂質が炭素数１２の脂肪酸又はそのエステルである、＜１７＞項に記載の形質転換体の使用。
<17> Use of the transformant according to any one of <9> to <12> for producing a lipid.
<18> Use of the transformant according to <17>, wherein the lipid is a fatty acid having 12 carbon atoms or an ester thereof.
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although this invention is demonstrated further in detail based on an Example, this invention is not limited to this.
実施例
１．野生型アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子発現プラスミドの構築
配列番号２に示す塩基配列からなる野生型アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（ＮｏＴＥ）遺伝子を鋳型として、下記表１に示す配列番号３及び配列番号４のプライマー対を用いたＰＣＲ反応により、配列番号２の２５９位〜８６４位までの塩基配列からなるＮｏＴＥ遺伝子断片を取得した。なお、配列番号２の塩基配列を有する遺伝子は人工遺伝子の受託合成サービスを利用して取得した。また、プラスミドベクターpBluescriptII SK(-)（Stratagene社製、配列番号１７）を鋳型として、下記表１に示す配列番号５及び６のプライマー対を用いたＰＣＲ反応によりpBluescriptII SK(-)を増幅し、制限酵素DpnI（東洋紡株式会社製）処理により鋳型の消化を行った。これら２つの断片を、High Pure PCR Product Purification Kit（Roche Applied Science社製)を用いて精製した後に、In-Fusion HD Cloning Kit（Clontech社製）を用いて融合し、ＮｏＴＥ遺伝子発現用プラスミドを構築した。なお、本発現プラスミドは、ＮｏＴＥ遺伝子がコードするアミノ酸配列（配列番号１）のＮ末端側１位〜８６位までのアミノ酸配列を除去し、８７位〜２８７位のアミノ酸配列で構築した。
Example 1. Construction of wild-type acyl-ACP thioesterase gene expression plasmid Primers of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 shown in Table 1 below using a wild-type acyl-ACP thioesterase (NoTE) gene consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 as a template A NoTE gene fragment consisting of the nucleotide sequence from position 259 to position 864 of SEQ ID NO: 2 was obtained by PCR reaction using a pair. The gene having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 was obtained using an artificial gene commissioned synthesis service. Further, pBluescriptII SK (-) was amplified by PCR reaction using the plasmid vector pBluescriptII SK (-) (Stratagene, SEQ ID NO: 17) as a template and the primer pairs of SEQ ID NOS: 5 and 6 shown in Table 1 below. The template was digested by restriction enzyme Dpn I (Toyobo Co., Ltd.) treatment. These two fragments were purified using High Pure PCR Product Purification Kit (Roche Applied Science) and then fused using In-Fusion HD Cloning Kit (Clontech) to construct a plasmid for NoTE gene expression. did. This expression plasmid was constructed by removing the amino acid sequence from the 1st to 86th positions on the N-terminal side of the amino acid sequence encoded by the NoTE gene (SEQ ID NO: 1), and was constructed from the 87th to 287th amino acid sequences.
２．アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ改変体発現プラスミドの構築
前記１．で構築したＮｏＴＥ遺伝子発現プラスミドを鋳型として、表１に示す配列番号７及び配列番号８のプライマー対を用いてＰＣＲ反応を行い、配列番号２の４４８位〜４５０位の塩基をＧＡＧからＧＧＧに置換することでコードする１５０位のアミノ酸をグルタミン酸からグリシンに変異させた、ＮｏＴＥ改変体（Ｅ１５０Ｇ）発現プラスミドを取得した。
同様にして、配列番号９及び配列番号１０のプライマー対を用いて、配列番号２の５９８位〜６００位の塩基をＡＡＴからＧＡＴに置換することでコードする２００位のアミノ酸をアスパラギンからアスパラギン酸に変異させた、ＮｏＴＥ改変体（Ｎ２００Ｄ）発現プラスミドを取得した。
配列番号１１及び配列番号１２のプライマー対、配列番号１３及び配列番号１４のプライマー対を用いて、配列番号２の６６４位〜６６６位の塩基をＡＡＣからＧＣＣに置換することでコードする２２２位のアミノ酸をアスパラギンからアラニンに変異させた、ＮｏＴＥ改変体（Ｎ２２２Ａ）発現プラスミド、配列番号２の６６４位〜６６６位の塩基をＡＡＣからＡＧＣに置換することでコードする２２２位のアミノ酸をアスパラギンからセリンに変異させた、ＮｏＴＥ改変体（Ｎ２２２Ｓ）発現プラスミドをそれぞれ取得した。
配列番号１５及び配列番号１６のプライマー対を用いて、配列番号２の７３３位〜７３５位の塩基をＣＧＣからＡＡＧに置換することでコードする２４５位のアミノ酸をアルギニンからリジンに変異させた、ＮｏＴＥ改変体発現（Ｒ２４５Ｋ）プラスミドをそれぞれ取得した。
2. Construction of acyl-ACP thioesterase variant expression plasmid Using the NoTE gene expression plasmid constructed in step 1 as a template, PCR reaction was performed using the primer pairs of SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8 shown in Table 1, and the bases at positions 448 to 450 of SEQ ID NO: 2 were replaced from GAG to GGG As a result, a modified NoTE (E150G) expression plasmid was obtained in which the amino acid at position 150 encoded was mutated from glutamic acid to glycine.
Similarly, using the primer pair of SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10, the amino acid at position 200 encoded by substituting the base at positions 598 to 600 of SEQ ID NO: 2 from AAT to GAT is changed from asparagine to aspartic acid. A mutated NoTE variant (N200D) expression plasmid was obtained.
Using the primer pair of SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12, and the primer pair of SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14, the 222nd position encoded by substituting the bases at positions 664 to 666 of SEQ ID NO: 2 from AAC to GCC A modified NoTE (N222A) expression plasmid in which the amino acid is mutated from asparagine to alanine, the amino acid at position 222 encoded by replacing the bases at positions 664 to 666 of SEQ ID NO: 2 from AAC to AGC, from asparagine to serine Each mutated NoTE variant (N222S) expression plasmid was obtained.
Using the primer pair of SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16, the amino acid at position 245 encoded by substituting the base at positions 733 to 735 of SEQ ID NO: 2 from CGC to AAG was mutated from arginine to lysine. Each variant expression (R245K) plasmid was obtained.
３．ＮｏＴＥ遺伝子発現プラスミドの大腸菌への導入
前記で構築したＮｏＴＥ遺伝子発現プラスミド、及び各ＮｏＴＥ改変体発現プラスミドを用いて、大腸菌突然変異株であるK27株（fadD88）（Overath et al， Eur．J．Biochem．7，559-574，1969）をコンピテントセル形質転換法により形質転換した。形質転換処理をしたK27株を３７℃で一晩静置し、得られたコロニーをLBAmp液体培地（Bacto Trypton 1%，Yeast Extract 0.5%，NaCl 1%，アンピシリンナトリウム50μg/mL）１ｍＬに接種し、３７℃で一晩培養した。前記培養液２０μＬを、２ｍＬのOvernight Express Instant TB Medium（Novagen社）に接種し、３０℃で振とう培養した。培養２４時間後、培養液に含まれる脂質成分を、下記４．の方法にて解析した。なお、陰性対照として、プラスミドベクターpBluescriptII SK(-)で形質転換した大腸菌K27株についても同様に実験を行った。
3. Introduction of NoTE gene expression plasmid into Escherichia coli K27 strain (fadD88) (Overath et al, Eur. J. Biochem), which is an Escherichia coli mutant, using the NoTE gene expression plasmid constructed above and each NoTE variant expression plasmid. 7, 559-574, 1969) were transformed by the competent cell transformation method. The transformed K27 strain is allowed to stand at 37 ° C. overnight, and the obtained colonies are inoculated into 1 mL of LBAmp liquid medium (Bacto Trypton 1%, Yeast Extract 0.5%, NaCl 1%, ampicillin sodium 50 μg / mL). And overnight at 37 ° C. 20 μL of the culture solution was inoculated into 2 mL of Overnight Express Instant TB Medium (Novagen) and cultured with shaking at 30 ° C. After 24 hours of culturing, the lipid components contained in the culture solution are treated as follows. The method was analyzed. As a negative control, the same experiment was performed for E. coli K27 strain transformed with the plasmid vector pBluescriptII SK (-).
４．大腸菌培養液中の脂質の抽出及び構成脂肪酸の分析
培養液１ｍＬに、内部標準として１ｍｇ/ｍＬの７−ペンタデカノンを５０μＬ添加後、０．５ｍＬのクロロホルム、１ｍＬのメタノール及び１０μＬの２Ｎ塩酸を培養液に添加して激しく攪拌後３０分間放置した。その後さらに、０．５ｍＬのクロロホルム及び０．５ｍＬの１．５％ＫＣｌを添加して攪拌後、３，０００ｒｐｍにて１５分間間遠心分離を行い、パスツールピペットにてクロロホルム層（下層）を回収した。得られたクロロホルム層に窒素ガスを吹き付けて乾固し、０．５Ｎ水酸化カリウム／メタノール溶液０．７ｍＬを添加し、８０℃で３０分間恒温した。続いて１ｍＬの１４％三フッ化ホウ素溶液（SIGMA社製）を添加し、８０℃にて１０分間恒温した。その後、ヘキサン、飽和食塩水を各１ｍＬ添加し激しく撹拌し、室温にて３０分間放置後、上層であるヘキサン層を回収して脂肪酸エステルを得た。
4). Extraction of lipids in Escherichia coli culture solution and analysis of constituent fatty acids After adding 50 μL of 1 mg / mL 7-pentadecanone as an internal standard to 1 mL of culture solution, 0.5 mL of chloroform, 1 mL of methanol and 10 μL of 2N hydrochloric acid were added to the culture solution. And stirred vigorously for 30 minutes. Then, 0.5 mL of chloroform and 0.5 mL of 1.5% KCl were added and stirred, and then centrifuged at 3,000 rpm for 15 minutes, and the chloroform layer (lower layer) was recovered with a Pasteur pipette. did. Nitrogen gas was blown into the resulting chloroform layer to dryness, 0.7 mL of 0.5N potassium hydroxide / methanol solution was added, and the temperature was kept constant at 80 ° C. for 30 minutes. Subsequently, 1 mL of 14% boron trifluoride solution (manufactured by SIGMA) was added, and the temperature was kept constant at 80 ° C. for 10 minutes. Thereafter, 1 mL each of hexane and saturated saline was added and stirred vigorously. After standing for 30 minutes at room temperature, the upper hexane layer was recovered to obtain a fatty acid ester.
得られた脂肪酸エステルをガスクロマトグラフィー解析に供した。測定条件を以下に示す。
キャピラリーカラム：ＤＢ−１ ＭＳ ３０ｍ×２００μｍ×０．２５μｍ（J＆W Scientific）、
移動相：高純度ヘリウム、
カラム内流量：１．０ｍＬ／分、
昇温プログラム：１００℃（１分間）→１０℃／分→３００℃（５分間）、
平衡化時間：１分間、
注入口：スプリット注入（スプリット比：１００：１），
圧力１４．４９ｐｓｉ，１０４ｍＬ／分，
注入量１μＬ、
洗浄バイアル：メタノール・クロロホルム、
検出器温度：３００℃
The obtained fatty acid ester was subjected to gas chromatography analysis. The measurement conditions are shown below.
Capillary column: DB-1 MS 30 m × 200 μm × 0.25 μm (J & W Scientific),
Mobile phase: high purity helium,
In-column flow rate: 1.0 mL / min,
Temperature rising program: 100 ° C. (1 minute) → 10 ° C./minute→300° C. (5 minutes)
Equilibration time: 1 minute
Inlet: Split injection (split ratio: 100: 1),
Pressure 14.49 psi, 104 mL / min,
Injection volume 1 μL,
Washing vial: methanol / chloroform,
Detector temperature: 300 ° C
また、脂肪酸エステルの同定は、同サンプルを同条件でガスクロマトグラフ質量分析解析に供することにより行った。
ガスクロマトグラフィー解析により得られた波形データのピーク面積より、各脂肪酸のメチルエステル量を定量した。各ピーク面積を、内部標準である７−ペンタデカノンのピーク面積と比較することで試料間の補正を行い、培養液１リットルあたりの各脂肪酸量を算出した。さらに、各脂肪酸量の総和を総脂肪酸量とし、総脂肪酸量に占める各脂肪酸量の割合を算出した。
ＮｏＴＥ遺伝子導入株、５つのＮｏＴＥ改変体導入株、及び陰性対照であるプラスミドベクターｐＢＳ導入株での総脂肪酸量（脂質量）及び総脂肪酸量に占める各脂肪酸量の割合を、表２及び３に示す。なお、表中の脂肪酸組成において、Ｃｘとあるのは炭素原子数ｘの脂肪酸を、ｘ：ｙとあるのは炭素原子数ｘで二重結合数がｙの脂肪酸を表す。
The fatty acid ester was identified by subjecting the sample to gas chromatograph mass spectrometry analysis under the same conditions.
The amount of methyl ester of each fatty acid was quantified from the peak area of the waveform data obtained by gas chromatography analysis. Each peak area was compared with the peak area of 7-pentadecanone, which is an internal standard, to correct between samples, and the amount of each fatty acid per liter of culture solution was calculated. Furthermore, the sum total of each fatty acid amount was made into the total fatty acid amount, and the ratio of each fatty acid amount to the total fatty acid amount was calculated.
Tables 2 and 3 show the total fatty acid amount (lipid amount) and the ratio of each fatty acid amount in the total fatty acid amount in the NoTE gene-introduced strain, the five NoTE variant-introduced strains, and the plasmid vector pBS-introduced strain as a negative control. Show. In the fatty acid composition in the table, Cx represents a fatty acid having x carbon atoms, and x: y represents a fatty acid having x carbon atoms and y double bonds.
表２から明らかなように、５つのＮｏＴＥ改変体導入株では、ＮｏＴＥ遺伝子導入株に比べて、総脂肪酸生産量が増加した。また、５つのＮｏＴＥ改変体導入株では、ＮｏＴＥ遺伝子導入株に比べて、総脂肪酸量に占めるＣ１２脂肪酸及びＣ１４脂肪酸の含有率が高かった。このことから、これらのＮｏＴＥ改変体は、野生型ＮｏＴＥに比べてＣ１２脂肪酸及びＣ１４脂肪酸の選択性が向上していることがわかった。 As is clear from Table 2, the total fatty acid production increased in the five NoTE variant-introduced strains compared to the NoTE gene-introduced strains. In addition, in the five NoTE variant-introduced strains, the content of C12 fatty acid and C14 fatty acid in the total fatty acid amount was higher than that in the NoTE gene-introduced strain. From this, it was found that these NoTE variants have improved selectivity for C12 fatty acids and C14 fatty acids compared to wild-type NoTE.
Claims (12)
（ａ） 配列番号１の１２８位〜２８７位のアミノ酸配列において、下記（１）〜（４）から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を有し、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
（１） 配列番号１の１５０位のアミノ酸がグルタミン酸からグリシンに置換。
（２） 配列番号１の２００位のアミノ酸がアスパラギンからアスパラギン酸に置換。
（３） 配列番号１の２２２位のアミノ酸がアスパラギンからセリン又はアラニンに置換。
（４） 配列番号１の２４５位のアミノ酸がアルギニンからリジンに置換。
（ｂ） （ａ）のタンパク質のアミノ酸配列において、アミノ酸置換されたアミノ酸以外の１〜１５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。 Microorganisms as a host, and a step of collecting and obtaining a transformant, lipids from the resulting transformant by introducing a gene encoding a protein of the following (a) or (b) to the host, A method for producing lipids.
(A) The amino acid sequence at positions 128 to 287 of SEQ ID NO: 1 has an amino acid sequence having at least one amino acid substitution selected from the following (1) to (4), and has acyl-ACP thioesterase activity protein.
(1) The amino acid at position 150 of SEQ ID NO: 1 was replaced with glutamic acid from glycine.
(2) The amino acid at position 200 of SEQ ID NO: 1 was substituted from asparagine to aspartic acid.
(3) The amino acid at position 222 of SEQ ID NO: 1 is substituted from asparagine to serine or alanine.
(4) The amino acid at position 245 of SEQ ID NO: 1 was substituted from arginine to lysine.
(B) an acyl-ACP thioesterase having an amino acid sequence in which 1 to 15 amino acids other than amino acid-substituted amino acids are deleted, substituted, inserted, or added in the amino acid sequence of the protein of (a) Protein with activity.
（ａ） 配列番号１の１２８位〜２８７位のアミノ酸配列において、下記（１）〜（４）から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を有し、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
（１） 配列番号１の１５０位のアミノ酸がグルタミン酸からグリシンに置換。
（２） 配列番号１の２００位のアミノ酸がアスパラギンからアスパラギン酸に置換。
（３） 配列番号１の２２２位のアミノ酸がアスパラギンからセリン又はアラニンに置換。
（４） 配列番号１の２４５位のアミノ酸がアルギニンからリジンに置換。
（ｂ） （ａ）のタンパク質のアミノ酸配列において、アミノ酸置換されたアミノ酸以外の１〜１５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。 Microorganisms as a host, a transformant obtained by introducing a gene encoding a protein of the following (a) or (b) to the host.
(A) The amino acid sequence at positions 128 to 287 of SEQ ID NO: 1 has an amino acid sequence having at least one amino acid substitution selected from the following (1) to (4), and has acyl-ACP thioesterase activity protein.
(1) The amino acid at position 150 of SEQ ID NO: 1 was replaced with glutamic acid from glycine.
(2) The amino acid at position 200 of SEQ ID NO: 1 was substituted from asparagine to aspartic acid.
(3) The amino acid at position 222 of SEQ ID NO: 1 is substituted from asparagine to serine or alanine.
(4) The amino acid at position 245 of SEQ ID NO: 1 was substituted from arginine to lysine.
(B) an acyl-ACP thioesterase having an amino acid sequence in which 1 to 15 amino acids other than amino acid-substituted amino acids are deleted, substituted, inserted, or added in the amino acid sequence of the protein of (a) Protein with activity.
（ａ） 配列番号１の１２８位〜２８７位のアミノ酸配列において、下記（１）〜（４）から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を有し、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
（１） 配列番号１の１５０位のアミノ酸がグルタミン酸からグリシンに置換。
（２） 配列番号１の２００位のアミノ酸がアスパラギンからアスパラギン酸に置換。
（３） 配列番号１の２２２位のアミノ酸がアスパラギンからセリン又はアラニンに置換。
（４） 配列番号１の２４５位のアミノ酸がアルギニンからリジンに置換。
（ｂ） （ａ）のタンパク質のアミノ酸配列において、アミノ酸置換されたアミノ酸以外の１〜１５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。 The following protein (a) or (b).
(A) The amino acid sequence at positions 128 to 287 of SEQ ID NO: 1 has an amino acid sequence having at least one amino acid substitution selected from the following (1) to (4), and has acyl-ACP thioesterase activity protein.
(1) The amino acid at position 150 of SEQ ID NO: 1 was replaced with glutamic acid from glycine.
(2) The amino acid at position 200 of SEQ ID NO: 1 was substituted from asparagine to aspartic acid.
(3) The amino acid at position 222 of SEQ ID NO: 1 is substituted from asparagine to serine or alanine.
(4) The amino acid at position 245 of SEQ ID NO: 1 was substituted from arginine to lysine.
(B) an acyl-ACP thioesterase having an amino acid sequence in which 1 to 15 amino acids other than amino acid-substituted amino acids are deleted, substituted, inserted, or added in the amino acid sequence of the protein of (a) Protein with activity.
（ａ） 配列番号１の１２８位〜２８７位のアミノ酸配列において、下記（１）〜（４）から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を有し、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
（１） 配列番号１の１５０位のアミノ酸がグルタミン酸からグリシンに置換。
（２） 配列番号１の２００位のアミノ酸がアスパラギンからアスパラギン酸に置換。
（３） 配列番号１の２２２位のアミノ酸がアスパラギンからセリン又はアラニンに置換。
（４） 配列番号１の２４５位のアミノ酸がアルギニンからリジンに置換。
（ｂ） （ａ）のタンパク質のアミノ酸配列において、アミノ酸置換されたアミノ酸以外の１〜１５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。 How microorganisms as a host, by introducing a gene encoding a protein of the following (a) or (b) to the host comprising the step of obtaining a transformant, improve the productivity of lipids.
(A) The amino acid sequence at positions 128 to 287 of SEQ ID NO: 1 has an amino acid sequence having at least one amino acid substitution selected from the following (1) to (4), and has acyl-ACP thioesterase activity protein.
(1) The amino acid at position 150 of SEQ ID NO: 1 was replaced with glutamic acid from glycine.
(2) The amino acid at position 200 of SEQ ID NO: 1 was substituted from asparagine to aspartic acid.
(3) The amino acid at position 222 of SEQ ID NO: 1 is substituted from asparagine to serine or alanine.
(4) The amino acid at position 245 of SEQ ID NO: 1 was substituted from arginine to lysine.
(B) an acyl-ACP thioesterase having an amino acid sequence in which 1 to 15 amino acids other than amino acid-substituted amino acids are deleted, substituted, inserted, or added in the amino acid sequence of the protein of (a) Protein with activity.
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