JP6254229B2 - Preventive or therapeutic agent for diabetes or elevation of blood glucose level, and food composition - Google Patents
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Description
本発明は、アントシアニンを含有する、糖尿病または血糖値上昇の予防剤または治療剤、及び食品組成物に関する。 The present invention relates to a preventive or therapeutic agent for diabetes or an increase in blood glucose level, and a food composition containing anthocyanin.
アントシアニンは、アントシアニジン配糖体であり、例えば、葡萄、ブルーベリー、ラズベリー、及びアロニア等の液果類の果実に含有されている生理活性物質である。また、非特許文献１では、アロニア果汁を摂取した糖尿病患者の血糖値が降下したと報告されている。しかし、その血糖降下の作用機構は、不明であった。 Anthocyanins are anthocyanidin glycosides, which are physiologically active substances contained in fruits of berries such as strawberries, blueberries, raspberries, and aronia. Moreover, in nonpatent literature 1, it is reported that the blood glucose level of the diabetic patient who ingested Aronia fruit juice fell. However, the mechanism of action for lowering blood glucose was unknown.
これに対して、非特許文献２では、ｉｎ ｖｉｔｒｏの実験により、アントシアニジンの一種であるシアニジンや、シアニジン−３−グルコシド（以下「Ｃ３Ｇ」という。）等のアントシアニンが、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（以下「ＤＰＰ−ＩＶ」という。）活性を阻害したと報告されている。このため、シアニジンやＣ３Ｇは、糖尿病や血糖値上昇を予防、治療する上で有用な生理活性物質であると考えられる。 On the other hand, in Non-Patent Document 2, anthocyanins such as cyanidin, which is a kind of anthocyanidin, and cyanidin-3-glucoside (hereinafter referred to as “C3G”) are converted into dipeptidyl peptidase IV (hereinafter “ DPP-IV ")) reported to have inhibited activity. For this reason, cyanidin and C3G are considered to be useful physiologically active substances for preventing and treating diabetes and an increase in blood glucose level.
しかし、非特許文献２によれば、シアニジンによるＤＰＰ−ＩＶ阻害活性は強くはなく、Ｃ３ＧによるＤＰＰ−ＩＶ阻害活性の強さは中程度であるとされている。このため、シアニジンやＣ３Ｇを摂取しても、糖尿病や血糖値上昇を予防、治療する効果は現れにくいと考えられる。 However, according to Non-Patent Document 2, it is said that the DPP-IV inhibitory activity by cyanidin is not strong, and the strength of the DPP-IV inhibitory activity by C3G is moderate. For this reason, even if cyanidin or C3G is ingested, it is thought that the effect of preventing and treating diabetes and an increase in blood glucose level is unlikely to appear.
そこで、本発明の課題は、シアニジンやＣ３Ｇよりも糖尿病や血糖値上昇を予防、治療することが可能なアントシアニンを見出し、見出したアントシアニンを含有する治療剤または予防剤、及び食品組成物を提供することにある。 Then, the subject of this invention discovered the anthocyanin which can prevent and treat diabetes and a blood glucose level rise rather than cyanidin and C3G, and provides the therapeutic agent or preventive agent containing the found anthocyanin, and a food composition. There is.
本発明者は、上記した課題を解決しようと鋭意検討を重ねた結果、アントシアニンの一種であるシアニジン−３，５−ジグルコシドがアロニアの果実や果汁に含有されていることを発見した。また、シアニジン−３，５−ジグルコシドがシアニジンやＣ３Ｇよりも強いＤＰＰ−ＩＶ阻害活性を示すことを発見した。さらに、アロニア果汁がα−グルコシダーゼ阻害活性をも発揮することを発見した。これらの発見により、本発明者は、シアニジン−３，５−ジグルコシドを含有する薬剤や食品組成物を摂取することで、糖尿病や血糖値上昇を効果的に予防、治療し得ることを見出した。 As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventor has discovered that cyanidin-3,5-diglucoside, which is a kind of anthocyanin, is contained in aronia fruits and fruit juices. Moreover, it discovered that cyanidin-3,5- diglucoside showed stronger DPP-IV inhibitory activity than cyanidin and C3G. Furthermore, it discovered that aronia juice also exhibited alpha-glucosidase inhibitory activity. Based on these findings, the present inventor has found that diabetes and an increase in blood glucose level can be effectively prevented and treated by ingesting a drug or food composition containing cyanidin-3,5-diglucoside.
すなわち、前述した課題を解決するため、本発明に係る糖尿病または血糖値上昇の予防剤または治療剤は、シアニジン−３，５−ジグルコシド、及びその塩からなる群より選ばれた１種以上の化合物を含有する。 That is, in order to solve the problems described above, the preventive or therapeutic agent for diabetes or blood sugar level elevation according to the present invention is one or more compounds selected from the group consisting of cyanidin-3,5-diglucoside and salts thereof. Containing.
本予防剤または本治療剤は、前記化合物を３０ｍｇ／１００ｇ以上含有し得る。 The prophylactic agent or the therapeutic agent may contain 30 mg / 100 g or more of the compound.
あるいは、本発明に係るジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）阻害剤は、シアニジン−３，５−ジグルコシド、及びその塩からなる群より選ばれた１種以上の化合物を含有する。 Alternatively, the dipeptidyl peptidase IV (DPP-IV) inhibitor according to the present invention contains one or more compounds selected from the group consisting of cyanidin-3,5-diglucoside and salts thereof.
また、本発明に係る糖尿病または血糖値上昇の予防用または治療用の食品組成物は、シアニジン−３，５−ジグルコシド、及びその塩からなる群より選ばれた１種以上の化合物を含有する。 Moreover, the food composition for preventing or treating diabetes or an increase in blood glucose level according to the present invention contains one or more compounds selected from the group consisting of cyanidin-3,5-diglucoside and salts thereof.
あるいは、本発明に係るＤＰＰ−ＩＶ阻害用の食品組成物は、シアニジン−３，５−ジグルコシド、及びその塩からなる群より選ばれた１種以上の化合物を含有する。 Alternatively, the food composition for DPP-IV inhibition according to the present invention contains one or more compounds selected from the group consisting of cyanidin-3,5-diglucoside and salts thereof.
さらに、本発明に係るＤＰＰ−ＩＶ阻害およびα−グルコシダーゼ阻害用のアロニア果汁は、シアニジン−３，５−ジグルコシド、及びその塩からなる群より選ばれた１種以上の化合物を含有する。 Furthermore, the aronia fruit juice for DPP-IV inhibition and α-glucosidase inhibition according to the present invention contains one or more compounds selected from the group consisting of cyanidin-3,5-diglucoside and salts thereof.
本発明に係る予防剤または治療剤を摂取すると、シアニジン−３，５−ジグルコシド及びその塩からなる群より選ばれた１種以上の化合物により、小腸に存在するＤＰＰ−ＩＶの活性が抑えられる。また、この化合物のＤＰＰ−ＩＶ阻害活性は、シアニジンやＣ３ＧのＤＰＰ−ＩＶ阻害活性よりも強い。この強い阻害活性により、本予防剤または本治療剤を摂取した者は、低血糖を引き起こすことを避けつつ、効果的に糖尿病または血糖値上昇を予防または治療することができる。なお、本発明に係るＤＰＰ−ＩＶ阻害剤、食品組成物、及びアロニア果汁も、シアニジン−３，５−ジグルコシドを含有しているため、本予防剤または本治療剤と同様の作用効果を奏する。 When the prophylactic or therapeutic agent according to the present invention is ingested, the activity of DPP-IV present in the small intestine is suppressed by one or more compounds selected from the group consisting of cyanidin-3,5-diglucoside and salts thereof. Moreover, the DPP-IV inhibitory activity of this compound is stronger than the DPP-IV inhibitory activity of cyanidin and C3G. Due to this strong inhibitory activity, those who have taken this prophylactic or therapeutic agent can effectively prevent or treat diabetes or an increase in blood glucose level while avoiding hypoglycemia. In addition, since the DPP-IV inhibitor, food composition, and aronia juice according to the present invention also contain cyanidin-3,5-diglucoside, the same effects as the prophylactic agent or the therapeutic agent are exhibited.
［糖尿病または血糖値上昇の予防剤または治療剤、ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤］
本発明に係る糖尿病または血糖値上昇の予防剤または治療剤は、シアニジン−３，５−ジグルコシド、及びその塩からなる群より選ばれた１種以上の化合物を有効成分として含有する。なお、本明細書において剤とは、内服薬の薬剤を意味している。このため、例えば、採取後に全く加工されていない植物体（果実）、後述する食品組成物、及び果汁１００％のジュースは、本明細書における剤に該当しない。
[Prophylactic or therapeutic agent for diabetes or increased blood glucose level, DPP-IV inhibitor]
The preventive or therapeutic agent for diabetes or elevation of blood glucose level according to the present invention contains, as an active ingredient, one or more compounds selected from the group consisting of cyanidin-3,5-diglucoside and salts thereof. In addition, in this specification, the agent means a drug for internal use. For this reason, for example, a plant body (fruit) that has not been processed at all after collection, a food composition that will be described later, and a juice of 100% fruit juice do not correspond to the agent in the present specification.
シアニジン−３，５−ジグルコシドは、分子内に２つの糖残基を有するアントシアニンの一種であり、その分子構造としては、シアニジンの３位と５位の各々に１分子ずつグルコースがグリコシド結合している構造である。なお、シアニジン−３，５−ジグルコシドは、シアニジン−３，５−Ｏ−ジグルコシド、あるいはシアニンともいわれている。 Cyanidin-3,5-diglucoside is a kind of anthocyanin having two sugar residues in the molecule, and its molecular structure is that glucose is glycosidically bonded to each of the 3rd and 5th positions of cyanidin. It is a structure. Cyanidine-3,5-diglucoside is also referred to as cyanidin-3,5-O-diglucoside or cyanine.
シアニジン−３，５−ジグルコシドの塩としては、薬理学的に許容され得る塩であり、例えば、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩等が挙げられる。この塩は、凝集しにくい観点から、好ましくはナトリウム塩および／またはカリウム塩である。 The salt of cyanidin-3,5-diglucoside is a pharmacologically acceptable salt, and examples thereof include alkali metal salts and alkaline earth metal salts. This salt is preferably a sodium salt and / or a potassium salt from the viewpoint of being difficult to aggregate.
本予防剤または本治療剤は、小腸に存在するＤＰＰ−ＩＶ活性の阻害効果を示すため、好ましくはＤＰＰ−ＩＶ阻害用として使用される。換言すれば、本発明に係るＤＰＰ−ＩＶ阻害剤は、シアニジン−３，５−ジグルコシド及びその塩からなる群より選ばれた１種以上の化合物を有効成分として含有する。 The prophylactic agent or the therapeutic agent is preferably used for DPP-IV inhibition because it exhibits an inhibitory effect on DPP-IV activity present in the small intestine. In other words, the DPP-IV inhibitor according to the present invention contains one or more compounds selected from the group consisting of cyanidin-3,5-diglucoside and a salt thereof as an active ingredient.
本予防剤、本治療剤、及び本阻害剤（以下、この３種類の剤をまとめて「本剤」という。）は、内服薬として公知の剤形をとり得る。つまり、本剤の剤形としては、例えば、錠剤、チュアブル錠、散剤、顆粒剤、丸剤、カプセル剤、液剤、シロップ剤等が挙げられる。 The prophylactic agent, the therapeutic agent, and the inhibitor (hereinafter, these three types of agents are collectively referred to as “this agent”) may take a form known as an internal medicine. That is, examples of the dosage form of this drug include tablets, chewable tablets, powders, granules, pills, capsules, liquids, and syrups.
本剤を摂取すると、小腸に存在するＤＰＰ−ＩＶの活性が阻害されるため、低血糖を引き起こすことを避け、さらに２型糖尿病患者では高血糖にも関わらず夜間にグルカゴンが過剰分泌されることが抑えられる。また、他種の糖尿病治療剤（例えば、スルホニル尿素剤、チアゾリジン誘導体等）とは異なる作用機構により２型糖尿病を予防、治療することができる。このため、本剤は、病状に応じて、他種の糖尿病治療剤の代わりに、あるいは他種の糖尿病治療剤と併用して、経口摂取されることが望ましい。この観点から、本剤は、好ましくは、病状に応じて２型糖尿病患者に摂取させて使用される。 Ingestion of this drug inhibits the activity of DPP-IV present in the small intestine, avoiding hypoglycemia, and in patients with type 2 diabetes, excessive secretion of glucagon at night despite hyperglycemia Is suppressed. In addition, type 2 diabetes can be prevented and treated by an action mechanism different from that of other types of diabetes therapeutic agents (for example, sulfonylurea agents, thiazolidine derivatives, etc.). For this reason, it is desirable that this drug be taken orally instead of or in combination with another type of diabetes therapeutic agent depending on the medical condition. From this point of view, this drug is preferably used after being ingested by patients with type 2 diabetes depending on the medical condition.
本剤は、小腸に存在するＤＰＰ−ＩＶの活性を大幅に抑えることにより糖尿病や血糖値上昇をさらに効果的に予防、治療する観点から、シアニジン−３，５−ジグルコシド及びその塩からなる群より選ばれた１種以上の化合物の含有量が、好ましくは３０ｍｇ／１００ｇ以上、さらに好ましくは２００ｍｇ／１００ｇ以上である。なお、シアニジン−３，５−ジグルコシドは、その分子量が約６１１．５であるため、上記した３０ｍｇ／１００ｇが４９１μｍｏｌ／Ｌに相当し、上記した２００ｍｇ／１００ｇが３．２７ｍｍｏｌ／Ｌに相当する。 From the viewpoint of more effectively preventing and treating diabetes and an increase in blood glucose level by significantly suppressing the activity of DPP-IV present in the small intestine, this drug is from the group consisting of cyanidin-3,5-diglucoside and its salts. The content of one or more selected compounds is preferably 30 mg / 100 g or more, more preferably 200 mg / 100 g or more. Since cyanidin-3,5-diglucoside has a molecular weight of about 611.5, the above 30 mg / 100 g corresponds to 491 μmol / L, and the above 200 mg / 100 g corresponds to 3.27 mmol / L.
シアニジン−３，５−ジグルコシドは渋味を呈するため、本剤は、この渋味をなるべく抑えて摂取しやすくする観点から、シアニジン−３，５−ジグルコシド及びその塩からなる群より選ばれた１種以上の化合物の含有量が、好ましくは２０ｇ／１００ｇ以下、さらに好ましくは２．０ｇ／１００ｇ以下である。 Since cyanidin-3,5-diglucoside exhibits astringency, this drug is selected from the group consisting of cyanidin-3,5-diglucoside and salts thereof from the viewpoint of suppressing this astringency as much as possible and making it easy to ingest. The content of the compound of the seed or more is preferably 20 g / 100 g or less, more preferably 2.0 g / 100 g or less.
本剤は、例えば、有効成分（シアニジン−３，５−ジグルコシド、及びその塩からなる群より選ばれた１種以上の化合物）を含有する中間原料を含んで成る。この中間原料は、有効成分を含有する植物体を加工して得られる。このような植物体としては、例えば、ブラックベリー果実、アロニア果実、ハスカップ果実、ヤグルマギク花弁、青色のバラ花弁、クロマメ葉、シソ葉等が挙げられる。 This agent comprises, for example, an intermediate raw material containing an active ingredient (one or more compounds selected from the group consisting of cyanidin-3,5-diglucoside and salts thereof). This intermediate raw material is obtained by processing a plant containing an active ingredient. Examples of such plants include blackberry fruit, aronia fruit, lotus cup fruit, cornflower petal, blue rose petal, black leaf, perilla leaf and the like.
上記した植物体は、シアニジン−３，５−ジグルコシドを高濃度で含有するため本剤を製造しやすい観点から、好ましくは、アロニア果実および／またはブラックベリー果実である。この場合、液果類の果実の風味が付与されて本剤を摂取しやすくなる観点からも好ましい。 The above-mentioned plant body is preferably an aronia fruit and / or a blackberry fruit from the viewpoint of easy production of this agent since it contains cyanidin-3,5-diglucoside at a high concentration. In this case, it is also preferable from the viewpoint of imparting the fruit flavor of berries and facilitating ingestion of the agent.
前述した有効成分を含有する中間原料としては、例えば、前述した植物体の搾汁粕、前述した植物体の破砕物または搾汁（果汁）から抽出された有効成分を含有する粗抽出物、この粗抽出物がカラムクロマトグラフィー等により分画されて得られる有効成分の濃度を高められた植物体抽出物、この植物体抽出物から溶媒を除かれて有効成分の濃度をさらに高められた濃縮物が挙げられる。 Examples of the intermediate raw material containing the above-mentioned active ingredient include, for example, the above-described plant juice extract, the above-described plant crushed material or the crude extract containing the active ingredient extracted from the juice (fruit juice), A plant extract in which the concentration of the active ingredient obtained by fractionating the crude extract by column chromatography is increased, and a concentrate in which the concentration of the active ingredient is further increased by removing the solvent from the plant extract. Is mentioned.
例えば、本剤の原料としてアロニア果実を使用した場合には、アロニア果実から果汁を搾った後に残された搾汁粕や、この搾汁粕および／またはアロニア果汁から抽出されたシアニジン−３，５−ジグルコシドを含むアントシアニンを高濃度で含有する抽出液や、この抽出液をカラムクロマトグラフィーにより分画して得られたシアニジン−３，５−ジグルコシドを高濃度で含有する画分から成る植物抽出物や、この植物抽出物から溶媒を除去して得られる濃縮物は、本剤における有効成分を含有する中間原料として好適に使用することができる。なお、搾汁粕を使用する場合には、産業廃棄物である搾汁粕を有効利用し、搾汁粕の廃棄量を低減できるため、果汁製造のランニングコストを低減させつつ、環境負荷も低減させることができて望ましい。 For example, when aronia fruit is used as a raw material of the present agent, squeezed lees left after squeezing fruit juice from aronia fruit, or cyanidin-3,5 extracted from this squeezed meal and / or aronia fruit juice -An extract containing an anthocyanin containing diglucoside at a high concentration, or a plant extract comprising a fraction containing a high concentration of cyanidin-3,5-diglucoside obtained by fractionating this extract by column chromatography; The concentrate obtained by removing the solvent from the plant extract can be suitably used as an intermediate material containing the active ingredient in the agent. In addition, when using squeezed rice cake, it is possible to effectively use the squeezed rice cake, which is an industrial waste, and to reduce the amount of squeezed rice cake discarded. This is desirable.
本剤は、例えば、前述した中間原料と、公知の医薬品添加物と、が混合されて成り、必要に応じて圧縮成形されたものである。この医薬品添加物は、製剤化を容易にする、品質の安定化を図る、有用性を高める等の目的で、発明の効果を妨げない限りの種類と分量で使用される、薬理作用を示さず薬理学的に許容され得る添加物である。一般的に、この医薬品添加物は、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤等といわれている。医薬品添加物として具体的には、例えば、乳糖、デンプン、ヒドロキシメチルセルロース、ステアリン酸マグネシウム等が挙げられる。 This agent is, for example, a mixture of the above-described intermediate raw material and a known pharmaceutical additive, and is compression-molded as necessary. This pharmaceutical additive is used for the purpose of facilitating formulation, stabilizing quality, enhancing usefulness, etc., and is used in the kind and amount as long as it does not interfere with the effect of the invention, and does not exhibit pharmacological action It is a pharmacologically acceptable additive. Generally, this pharmaceutical additive is said to be, for example, an excipient, a binder, a disintegrant, a lubricant and the like. Specific examples of the pharmaceutical additive include lactose, starch, hydroxymethylcellulose, magnesium stearate and the like.
アロニア果実には、小腸上部に存在するα−グルコシダーゼの活性の阻害物質が含有されている。このα−グルコシダーゼ阻害物質は、アロニア果実に含有されるアントシアニンであると考えられる。このため、本剤は、２型糖尿病患者を効果的に治療する観点から、さらにより好ましくは、アロニア果実由来の前述した中間原料と、公知の医薬品添加物と、が混合されて成る。この場合の中間原料には、シアニジン−３，５−ジグルコシドを含めた複数種のアントシアニンが含有されている。この場合の本剤は、換言すれば、シアニジン−３，５−ジグルコシド及びその塩からなる群より選ばれた１種以上の化合物と、アロニア果実由来のアントシアニン（アロニア果実から抽出されたアントシアニン）と、を含有するＤＰＰ−ＩＶ阻害およびα−グルコシダーゼ阻害剤である。 Aronia fruit contains an inhibitor of the activity of α-glucosidase present in the upper part of the small intestine. This α-glucosidase inhibitor is considered to be anthocyanin contained in aronia fruits. For this reason, from the viewpoint of effectively treating patients with type 2 diabetes, the present agent is more preferably a mixture of the above-mentioned intermediate material derived from aronia fruit and a known pharmaceutical additive. The intermediate raw material in this case contains a plurality of types of anthocyanins including cyanidin-3,5-diglucoside. In other words, the agent in this case is one or more compounds selected from the group consisting of cyanidin-3,5-diglucoside and salts thereof, and anthocyanins derived from aronia fruits (anthocyanins extracted from aronia fruits); A DPP-IV inhibitor and an α-glucosidase inhibitor.
上記したＤＰＰ−ＩＶ阻害およびα−グルコシダーゼ阻害剤を毎日摂取し続けると、小腸上部でグルコース依存性インスリン分泌刺激ポリペプチド（以下「ＧＩＰ」という。）の発現量（分泌量）が減り、小腸下部でグルカゴン様ペプチド−１（以下「ＧＬＰ−１」という。）の発現量（分泌量）が増し、血糖値や白色脂肪組織の重量が小さく抑えられやすい。このため、インスリン抵抗性や高インスリン血症の症状が緩和されると考えられる。また、α−グルコシダーゼ阻害物質（アロニア果実由来のアントシアニン）により小腸下部でＧＬＰ−１の発現量が増し、さらに、ＤＰＰ−ＩＶ阻害物質（シアニジン−３，５−ジグルコシド）によりＧＬＰ−１が分解されにくいため、ＧＬＰ−１の血中濃度が増したまま保たれる相乗効果が発揮されやすいと考えられる。結果として、血糖値が正常に保たれやすいため、効果的に糖尿病や血糖値上昇を予防、治療することができる。 If the above-mentioned DPP-IV inhibition and α-glucosidase inhibitor are continuously ingested, the expression level (secretion amount) of glucose-dependent insulin secretion stimulating polypeptide (hereinafter referred to as “GIP”) decreases in the upper small intestine, and the lower small intestine Therefore, the expression level (secretion amount) of glucagon-like peptide-1 (hereinafter referred to as “GLP-1”) increases, and the blood glucose level and the weight of white adipose tissue are easily suppressed. For this reason, it is considered that symptoms of insulin resistance and hyperinsulinemia are alleviated. In addition, the expression level of GLP-1 is increased in the lower part of the small intestine by an α-glucosidase inhibitor (an anthocyanin derived from aronia fruit), and further, GLP-1 is degraded by a DPP-IV inhibitor (cyanidine-3,5-diglucoside). Therefore, it is considered that a synergistic effect that keeps increasing the blood concentration of GLP-1 is likely to be exhibited. As a result, since the blood glucose level is easily maintained normally, diabetes and an increase in blood glucose level can be effectively prevented and treated.
［食品組成物］
本発明に係る食品組成物は、シアニジン−３，５−ジグルコシド、及びその塩からなる群より選ばれた１種以上の化合物を有効成分として含有し、糖尿病または血糖値上昇の予防用または治療用である。
[Food composition]
The food composition according to the present invention contains, as an active ingredient, one or more compounds selected from the group consisting of cyanidin-3,5-diglucoside and salts thereof, for the prevention or treatment of diabetes or blood sugar level elevation It is.
本明細書において食品組成物とは、加工食品、調味料、食品添加物、及びサプリメントからなる群より選ばれた１種以上の食品組成物を意味している。前述した本剤や、採取後に全く加工されていない植物体（例えば、ブラックベリー果実、アロニア果実）は、本明細書における食品組成物に該当しない。 In the present specification, the food composition means one or more food compositions selected from the group consisting of processed foods, seasonings, food additives, and supplements. The above-mentioned agent and plants that have not been processed at all after collection (for example, blackberry fruit and aronia fruit) do not fall under the food composition in the present specification.
例えば、本剤の説明で前述した中間原料は、食品衛生上の問題を生じなければ、そのまま上記した食品添加物として使用可能である。また、上記した加工食品としては、例えば、漬物、乾物、練り製品、粉類、缶詰、冷凍食品、レトルト食品、インスタント食品、乳製品、菓子類、嗜好品、飲料等が挙げられる。ここでの飲料としては、例えば、果汁１００％のジュース、清涼飲料水、アルコール飲料等が挙げられる。上記した加工食品としては、例えば、上記した食品添加物が公知の加工食品原料と混合されて成る加工食品が挙げられる。上記した飲料としては、例えば、アロニア果汁、ブラックベリー果汁、これらの果汁および／または上記した食品添加物が公知の飲料原料と混合されて成る飲料等が挙げられる。 For example, the intermediate raw material described above in the description of this agent can be used as it is as the food additive as long as it does not cause any food hygiene problems. Examples of the processed food include pickles, dried foods, kneaded products, powders, canned foods, frozen foods, retort foods, instant foods, dairy products, confectionery, luxury products, and beverages. Examples of the beverage here include 100% fruit juice, soft drinks, and alcoholic beverages. Examples of the processed food include processed foods obtained by mixing the above-described food additives with known processed food raw materials. Examples of the beverage include aronia juice, blackberry juice, beverages obtained by mixing these juices and / or the above-described food additives with known beverage ingredients.
本食品組成物は、摂取され続けることで前述した本剤と同様の作用効果を奏する。このため、本食品組成物は、好ましくは糖尿病または血糖値上昇の予防用または治療用の健康食品の組成物として使用される。なお、ここでの健康食品としては、例えば、特定保健用食品、栄養機能食品、病者用食品、高齢者用食品等が挙げられる。 This food composition has the same effects as the above-described agent by continuing to be ingested. For this reason, this food composition is preferably used as a health food composition for preventing or treating diabetes or an increase in blood glucose level. In addition, as health food here, food for specific health, functional nutrition food, food for sick people, food for elderly people, etc. are mentioned, for example.
本食品組成物は、小腸に存在するＤＰＰ−ＩＶの活性の阻害に起因する糖尿病または血糖値上昇の治療効果を発揮しやすい観点から、さらに好ましくは、２型糖尿病患者を対象とした糖尿病治療用の食品組成物である。換言すれば、本発明に係るＤＰＰ−ＩＶ阻害用の食品組成物は、シアニジン−３，５−ジグルコシド、及びその塩からなる群より選ばれた１種以上の化合物を有効成分として含有する。 The food composition is more preferably used for the treatment of diabetes in patients with type 2 diabetes, from the viewpoint of easily exerting a therapeutic effect for diabetes caused by inhibition of the activity of DPP-IV present in the small intestine or an increase in blood glucose level. It is a food composition. In other words, the food composition for DPP-IV inhibition according to the present invention contains, as an active ingredient, one or more compounds selected from the group consisting of cyanidin-3,5-diglucoside and salts thereof.
本食品組成物は、有効成分を抽出したり濃縮する操作をしなくても有効成分をある程度の高濃度で含有している観点や、摂取すると小腸に存在するＤＰＰ−ＩＶの活性の阻害効果が発揮されやすい観点から、好ましくは、アロニア果実の加工食品および／またはブラックベリー果実の加工食品である。この場合の加工食品は、アロニア果実由来および／またはブラックベリー果実由来の風味が付与されているため、摂取しやすい観点からも好ましい。なお、この場合の加工食品としては、例えば、アロニア果実および／またはブラックベリー果実のジャム、果実飲料（果汁１００％のジュース等）、砂糖漬け、乾燥果実、冷凍果実等が挙げられる。 This food composition has an effect of inhibiting the activity of DPP-IV present in the small intestine when it is ingested, in terms of containing the active ingredient at a certain high concentration without the operation of extracting or concentrating the active ingredient. From the viewpoint of being easily exhibited, processed foods of aronia fruits and / or processed foods of blackberry fruits are preferable. The processed food in this case is preferable from the viewpoint of easy consumption because it has a flavor derived from Aronia fruit and / or blackberry fruit. Examples of the processed food in this case include aronia fruit and / or blackberry fruit jam, fruit drinks (fruit juice 100% juice, etc.), candied, dried fruit, frozen fruit, and the like.
本食品組成物は、手軽に毎日摂取し続けやすい観点や、２種類の酵素の活性を阻害することにより糖尿病や血糖値上昇の予防効果や治療効果が発揮されやすい観点から、さらに好ましくは、シアニジン−３，５−ジグルコシド、及びその塩からなる群より選ばれた１種以上の化合物を有効成分として含有する、ＤＰＰ−ＩＶ阻害およびα−グルコシダーゼ阻害用のアロニア果汁である。アロニア果汁を毎日摂取し続けると、前述した「ＤＰＰ−ＩＶ阻害およびα−グルコシダーゼ阻害剤」と同様の作用機構により、効果的に糖尿病や血糖値上昇を予防、治療することができる。 The food composition is more preferably cyanidin from the viewpoint that it can be easily taken every day and the effect of preventing or treating diabetes and an increase in blood glucose level by inhibiting the activity of two enzymes. An aronia juice for DPP-IV inhibition and α-glucosidase inhibition containing, as an active ingredient, one or more compounds selected from the group consisting of -3,5-diglucoside and salts thereof. If Aronia fruit juice is ingested every day, diabetes and an increase in blood glucose level can be effectively prevented and treated by the same mechanism of action as the “DPP-IV inhibitor and α-glucosidase inhibitor” described above.
本食品組成物は、有効成分を高濃度で含有することにより小腸に存在するＤＰＰ−ＩＶの活性を大幅に阻害して更に効果的に糖尿病や血糖値上昇を予防、治療する観点から、シアニジン−３，５−ジグルコシド、及びその塩からなる群より選ばれた１種以上の化合物を、好ましくは３０ｍｇ／１００ｇ以上、さらに好ましくは２００ｍｇ／１００ｇ以上含有する。この場合の本食品組成物としては、例えば、サプリメントが挙げられる。この場合のサプリメントは、本剤の説明で前述した中間原料と、公知のサプリメント用の添加物と、が混合されて、必要に応じて圧縮成形されて成る。この場合のサプリメントの形態や公知のサプリメント用の添加物は、本剤の説明で前述した剤形や医薬品添加物と同様である。 From the viewpoint of effectively inhibiting DPP-IV activity in the small intestine by containing an active ingredient at a high concentration and further effectively preventing and treating diabetes and an increase in blood glucose level, It contains preferably 30 mg / 100 g or more, more preferably 200 mg / 100 g or more, of one or more compounds selected from the group consisting of 3,5-diglucoside and salts thereof. Examples of the food composition in this case include supplements. The supplement in this case is formed by mixing the intermediate raw material described above in the description of the present agent and a known additive for supplements, and compression-molding as necessary. The supplement form and known supplements in this case are the same as the dosage forms and pharmaceutical additives described above in the description of the present agent.
本食品組成物は、シアニジン−３，５−ジグルコシドに起因する渋味を抑えて摂取しやすくする観点から、シアニジン−３，５−ジグルコシド及びその塩からなる群より選ばれた１種以上の化合物を、好ましくは２０ｇ／１００ｇ以下、さらに好ましくは２．０ｇ／１００ｇ以下含有する。 The food composition is one or more compounds selected from the group consisting of cyanidin-3,5-diglucoside and salts thereof from the viewpoint of facilitating ingestion by suppressing astringency caused by cyanidin-3,5-diglucoside. Is preferably 20 g / 100 g or less, more preferably 2.0 g / 100 g or less.
［中間原料である植物抽出物の調製方法］
本剤および食品組成物の説明で前述した植物抽出物について、その調製方法の一例として、原料を準備する工程と、原料から抽出液を調製する工程と、抽出液から粗精製物を得る工程と、粗精製物を分離する工程と、を含む調製方法が挙げられる。以下、この調製方法について詳述する。
[Method for preparing plant extract as intermediate raw material]
Regarding the plant extract described above in the description of the present agent and the food composition, as an example of a preparation method thereof, a step of preparing a raw material, a step of preparing an extract from the raw material, and a step of obtaining a crude purified product from the extract, And a step of separating the roughly purified product. Hereinafter, this preparation method will be described in detail.
原料を準備する工程では、有効成分（シアニジン−３，５−ジグルコシド、及びその塩からなる群より選ばれた１種以上の化合物）を含有する原料を準備する。ここでの原料は、例えば、本剤の説明で前述した植物体、その搾汁や搾汁粕等である。 In the step of preparing the raw material, a raw material containing an active ingredient (one or more compounds selected from the group consisting of cyanidin-3,5-diglucoside and a salt thereof) is prepared. The raw material here is, for example, the plant described in the description of the present agent, the juice or the juice of the juice.
原料から抽出液を調製する工程では、準備した原料から、有効成分を含有する抽出液を調製する。このためには、まず、液体窒素により原料を凍結させる。次に、凍結物をミキサーで粉砕する。得られた粉砕物を、室温（１〜３０℃）において、塩酸又はトリフルオロ酢酸を含む水溶液に浸けて、有効成分が抽出された粗抽出液を得る。この粗抽出液をろ過し、凍結乾燥機によりろ液を凍結乾燥する。それから、凍結乾燥により得られたオイル状の有効成分を１．０ｍｏｌ％酢酸エタノール溶液に溶解させ、この溶液にエーテルを加えると、溶液が上清と沈殿物に分離する。ここで沈殿物を除いて採取した上清を、有効成分を含有する抽出液とする。 In the step of preparing the extract from the raw material, an extract containing the active ingredient is prepared from the prepared raw material. For this purpose, first, the raw material is frozen with liquid nitrogen. Next, the frozen material is pulverized with a mixer. The obtained pulverized product is immersed in an aqueous solution containing hydrochloric acid or trifluoroacetic acid at room temperature (1 to 30 ° C.) to obtain a crude extract from which the active ingredient has been extracted. The crude extract is filtered, and the filtrate is freeze-dried by a freeze dryer. Then, the oily active ingredient obtained by lyophilization is dissolved in a 1.0 mol% acetic acid ethanol solution, and ether is added to this solution, so that the solution is separated into a supernatant and a precipitate. The supernatant collected after removing the precipitate is used as an extract containing the active ingredient.
抽出液から粗精製物を得る工程では、上記した抽出液を吸着クロマトグラフィーにかける。吸着クロマトグラフィーのカラムとしては、例えば、吸着剤としてアンバーライトＸＡＤ７ＨＰ（ダウ・ケミカル社製、米国）を充填したカラムや、Ｓｕｐｅｌ Ｓｐｈｅｒｅ Ｃａｒｂｏｎ／ＮＨ２ ＳＰＥ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ（ＳＵＰＥＬＣＯ社製、米国）のカラムが挙げられる。吸着クロマトグラフィーのカラムを例えばｐＨ７．０のリン酸緩衝液で事前に平衡にしておき、このカラムに抽出液を加えて、そのままカラムを通過した溶液は除去する。次いで、カラムをエタノールで広範囲にわたって洗浄し、それから２．０ｍｏｌ／Ｌの食塩を含むｐＨ７．０のリン酸緩衝液の段階的な勾配により溶出させて、得られた溶出液を粗精製物とする。 In the step of obtaining a crude product from the extract, the above extract is subjected to adsorption chromatography. Examples of the column for adsorption chromatography include a column packed with Amberlite XAD7HP (manufactured by Dow Chemical Co., USA) as an adsorbent, and a column of Super Sphere Carbon / NH 2 SPE Cartridge (manufactured by SUPELCO, USA). It is done. The column for adsorption chromatography is pre-equilibrated with, for example, a phosphate buffer having a pH of 7.0, an extract is added to this column, and the solution that has passed through the column is removed. The column is then washed extensively with ethanol and then eluted with a stepwise gradient of pH 7.0 phosphate buffer containing 2.0 mol / L sodium chloride to give a crude purified product. .
粗精製物を分離する工程では、上記した粗精製物を逆相カラムクロマトグラフィーにかける。例えば、高速液体クロマトグラフィー（以下「ＨＰＬＣ」という。）の装置を用いて、アセトニトリル又は０．１ｍｏｌ％ギ酸を溶出液として、ｐＨ０〜３．５に調製したＣ１８カラム等の逆相分配型カラムに粗精製物を加える。さらに、このカラムにトリフルオロ酢酸０．１ｍｏｌ％に対してアセトニトリル０〜１００ｍｏｌ％、又はトリフルオロ酢酸０．１ｍｏｌ％に対してギ酸０〜１０ｍｏｌ％の勾配で溶出させて、粗精製物を分離させる。 In the step of separating the crude product, the crude product is subjected to reverse phase column chromatography. For example, using a high-performance liquid chromatography (hereinafter referred to as “HPLC”) apparatus, a reversed-phase partitioning column such as a C18 column adjusted to pH 0 to 3.5 using acetonitrile or 0.1 mol% formic acid as an eluent. Add crude product. Further, this column is eluted with a gradient of 0 to 100 mol% of acetonitrile relative to 0.1 mol% of trifluoroacetic acid or 0 to 10 mol% of formic acid relative to 0.1 mol% of trifluoroacetic acid to separate the crude product. .
さらに、粗精製物を分離する工程では、ＨＰＬＣに付属の紫外可視分光検出器を用いて、例えば図３に示すようにクロマトグラムにおいて波長２１５ｎｍの紫外線と波長５２５ｎｍの可視光との両方に対してピークを示す溶出時間を確認する。波長２１５ｎｍの紫外線は多くの種類の分子結合を励起させるため、図３に示すように、この紫外線に対してピークを示した溶出時間の溶出液には、構造不明ながら何らかの成分が含まれている。また、波長５２５ｎｍの可視光はシアニジン構造に特有の波長であるため、この可視光に対してピークを示した溶出時間の溶出液には、シアニジン−３，５−ジグルコシドのように分子内にシアニジン構造を有するアントシアニン等の化合物が含有されていると推測できる。ピークと溶出時間を確認の上、当該溶出時間の溶出液を分取する。 Further, in the step of separating the crude product, using an ultraviolet-visible spectroscopic detector attached to the HPLC, for example, as shown in FIG. 3, in the chromatogram, for both ultraviolet light having a wavelength of 215 nm and visible light having a wavelength of 525 nm. Check the elution time showing the peak. Since ultraviolet rays with a wavelength of 215 nm excite many types of molecular bonds, as shown in FIG. 3, the eluate having an elution time that shows a peak with respect to the ultraviolet rays contains some components although the structure is unknown. . In addition, since visible light having a wavelength of 525 nm is a characteristic wavelength of the cyanidin structure, an eluate having an elution time that showed a peak with respect to the visible light has an intracyanidin content in the molecule like cyanidin-3,5-diglucoside. It can be assumed that a compound such as anthocyanin having a structure is contained. After confirming the peak and elution time, the eluate of the elution time is collected.
分取する際、波長２１５ｎｍの紫外線と波長５２５ｎｍの可視光の両方に対してピークを示す溶出時間が複数箇所に分かれる場合には、個々のピークに対応する溶出時間ごとに溶出液を分取する。例えば、図３のクロマトグラムが示された場合には、参考例４の溶出液と実施例１の溶出液をそれぞれ分取する。
When fractionating, when elution times showing peaks for both ultraviolet light with a wavelength of 215 nm and visible light with a wavelength of 525 nm are divided into a plurality of locations, the eluate is fractionated for each elution time corresponding to each peak. . For example, when the chromatogram of FIG. 3 is shown, the eluate of Reference Example 4 and the eluate of Example 1 are separated.
粗精製物を分離する工程で分取した画分のいずれかに、有効成分が高濃度で含有されている。例えば、本製造法において原料がアロニアの果実や果汁である場合には、回収した画分のうちでカラムからの溶出時間が二番目に短い画分（例えば、図３での実施例１の溶出液）に目的の有効成分が高濃度で含まれており、この画分は有効成分を３０ｍｇ／１００ｇ以上含有する植物抽出物とすることができる。
The active ingredient is contained at a high concentration in any of the fractions collected in the step of separating the crude product. For example, when the raw material is aronia fruit or fruit juice in the present production method, the fraction with the second shortest elution time from the column among the collected fractions (for example, the elution of Example 1 in FIG. 3) Liquid) contains the target active ingredient at a high concentration, and this fraction can be a plant extract containing 30 mg / 100 g or more of the active ingredient.
なお、後述する定量法により、植物抽出物におけるシアニジン−３，５−ジグルコシドの濃度を測定することができる。測定の結果、上記した植物抽出物で有効成分の含有量が３０ｍｇ／１００ｇ未満であった場合には、凍結乾燥機を用いて、この植物抽出物を凍結乾燥すると、溶媒が気化するため濃縮されて、有効成分を３０ｍｇ／１００ｇ以上含有する植物抽出物の濃縮物を得ることができる。 In addition, the concentration of cyanidin-3,5-diglucoside in the plant extract can be measured by a quantitative method described later. As a result of the measurement, when the content of the active ingredient is less than 30 mg / 100 g in the above-described plant extract, when the plant extract is freeze-dried using a freeze dryer, the solvent is evaporated and concentrated. Thus, a plant extract concentrate containing 30 mg / 100 g or more of the active ingredient can be obtained.
また、粗精製物を分離する工程で複数の画分を回収し、回収した画分のいずれに目的の有効成分が含まれるか不明である場合、これらの画分の溶液それぞれについて、例えば、後述する「ＤＰＰ−ＩＶ阻害活性の測定」と同様の方法によりＤＰＰ−ＩＶ活性の阻害の強さを測定する。ここで、他の画分よりも強い阻害活性が示された画分に、有効成分が高濃度で含有されていると推定される。必要であれば、後述する「ＤＰＰ−ＩＶ阻害物質の同定」と同様の方法により、粗精製物を分離する工程で回収した複数の画分のそれぞれについて質量分析（ＭＳ）を行い、シアニジン−３，５−ジグルコシドがいずれの画分に含まれるか確認することが望ましい。 Further, when a plurality of fractions are collected in the step of separating the roughly purified product, and it is unclear which of the collected fractions contains the target active ingredient, for each of these fraction solutions, for example, described later The intensity of inhibition of DPP-IV activity is measured by a method similar to “Measurement of DPP-IV inhibitory activity”. Here, it is presumed that the active ingredient is contained at a high concentration in the fraction showing stronger inhibitory activity than the other fractions. If necessary, mass spectrometry (MS) is performed on each of a plurality of fractions collected in the step of separating the crude product by the same method as “identification of DPP-IV inhibitor” described below, and cyanidin-3 It is desirable to confirm which fraction contains 1,5-diglucoside.
［シアニジン−３，５−ジグルコシドの定量法］
シアニジン−３，５−ジグルコシドの定量法は、前述した「植物抽出物の調製方法」と概ね同じである。ただし、定量の条件を統一するため、この定量法では、前述した原料から抽出液を調製する工程において、原料の粉砕物を１５〜２５℃において、塩酸を含む水溶液に浸けて粗抽出物を得る。
[Quantitative determination of cyanidin-3,5-diglucoside]
The method for quantifying cyanidin-3,5-diglucoside is generally the same as the above-mentioned “Method for preparing plant extract”. However, in order to unify the quantification conditions, in this quantification method, in the step of preparing the extract from the above-mentioned raw material, the raw material pulverized product is immersed in an aqueous solution containing hydrochloric acid at 15 to 25 ° C. to obtain a crude extract .
また、この定量法では、定量の条件を統一するため、前述した抽出液から粗精製物を得る工程で、吸着クロマトグラフィーのカラムとしてＳｕｐｅｌ Ｓｐｈｅｒｅ Ｃａｒｂｏｎ／ＮＨ２ ＳＰＥ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅのカラムを用い、このカラムをｐＨ７．０で５０ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液で事前に平衡にしてベッドボリューム６ｍｌとし、抽出液を流速５ｍｌ／ｈで加え、カラムをエタノールで洗浄後に２．０ｍｏｌ／Ｌの食塩を含むｐＨ７．０で５０ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液の段階的な勾配により溶出させて粗精製物を得る。 Further, in this quantification method, in order to unify the quantification conditions, in the step of obtaining a crude purified product from the above-described extract, a Super Sphere Carbon / NH 2 SPE Cartridge column is used as an adsorption chromatography column. Pre-equilibrated with 50 mmol / L phosphate buffer at pH 7.0 to a bed volume of 6 ml, the extract was added at a flow rate of 5 ml / h, the column was washed with ethanol, pH 2.0 containing 2.0 mol / L sodium chloride. Elute with a step gradient of 50 mmol / L phosphate buffer at 0 to obtain the crude product.
前述した定量法では、定量の条件を統一するため、前述した粗精製物を分離する工程で、アセトニトリルを溶出液として、ｐＨ２．８〜３．２に調製した直径４．６ｍｍ×高さ１５０ｍｍのＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎ Ｃ１８カラム（ジーエルサイエンス社製、米国）に、粗精製物を流速１．０ｍｌ／ｍｉｎで加え、トリフルオロ酢酸０．１ｍｏｌ％に対してアセトニトリル０〜１００ｍｏｌ％の勾配で溶出させて、粗精製物の溶質を分離させる。 In the quantification method described above, in order to unify the quantification conditions, in the step of separating the roughly purified product described above, acetonitrile was used as an eluent and the pH was adjusted to 2.8 to 3.2 mm with a diameter of 4.6 mm and a height of 150 mm. The crude product was added to an Inert Sustain C18 column (manufactured by GL Sciences, USA) at a flow rate of 1.0 ml / min, and eluted with a gradient of 0 to 100 mol% of acetonitrile with respect to 0.1 mol% of trifluoroacetic acid. Separate the solute of the object.
前述した定量法では、分光光度計を用いて、植物抽出物の溶液を波長５２５〜５３０ｎｍの可視光でスキャンして極大波長における吸光度を測定することで、植物抽出物が含有する目的の化合物の濃度を算出する。なお、吸光度を測定する際には、植物抽出物の溶液をそのまま、あるいは色が濃すぎれば当該溶液をアセトニトリルで希釈してから測定する。シアニジン−３，５−ジグルコシド及びその塩からなる群より選ばれた１種以上の化合物の抽出に用いた溶液による希釈率を考慮した上で、シアニジン−３，５−ジグルコシドの標準品の吸光度と比較して、この化合物の含有量を算出する。 In the above-described quantification method, a solution of a plant extract is scanned with visible light having a wavelength of 525 to 530 nm using a spectrophotometer, and the absorbance at the maximum wavelength is measured, whereby the target compound contained in the plant extract is obtained. Calculate the concentration. In measuring the absorbance, the solution of the plant extract is used as it is, or if the color is too dark, the solution is diluted with acetonitrile. Taking into account the dilution rate by the solution used for the extraction of one or more compounds selected from the group consisting of cyanidin-3,5-diglucoside and its salt, the absorbance of the standard product of cyanidin-3,5-diglucoside and In comparison, the content of this compound is calculated.
［ＤＰＰ−ＩＶの精製］
本発明者は、非特許文献３の記載に従って、以下に詳述する方法により、豚の精漿からＤＰＰ−ＩＶを精製することとした。豚の精漿を愛知県畜産総合センターから譲り受け、使用するまで−３０℃で保管した。また、ＤＰＰ−ＩＶに対する蛍光ペプチド基質であるグルシル−Ｌ−プロリン−４−メチルクマリル−７−アミド（以下、「Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＭＣＡ」という。）や、ジペプチジルペプチダーゼＩＩ（以下「ＤＰＰ−ＩＩ」という。）に対する蛍光ペプチド基質であるＬ−リジル−Ｌ−アラニン−４−メチルクマリル−７−アミド（以下「Ｌｙｓ−Ａｌａ−ＭＣＡ」という。）を、株式会社ペプチド研究所から購入した。なお、ＤＰＰ−ＩＶの精製方法は、特に記載のない限り４℃で行った。また、ＤＰＰ−ＩＶの精製方法で用いたその他の試薬は、全て分析グレードである。
[Purification of DPP-IV]
The present inventor decided to purify DPP-IV from pig seminal plasma according to the method described in Non-Patent Document 3 by the method described in detail below. Porcine seminal plasma was collected from Aichi Prefectural Livestock Research Center and stored at -30 ° C until use. Further, glycyl-L-proline-4-methylcoumaryl-7-amide (hereinafter referred to as “Gly-Pro-MCA”), which is a fluorescent peptide substrate for DPP-IV, and dipeptidyl peptidase II (hereinafter referred to as “DPP-II”). L-lysyl-L-alanine-4-methylcoumaryl-7-amide (hereinafter referred to as “Lys-Ala-MCA”), which is a fluorescent peptide substrate, was purchased from Peptide Institute, Inc. The purification method of DPP-IV was performed at 4 ° C. unless otherwise specified. All the other reagents used in the DPP-IV purification method are analytical grade.
精製の程度を確認するために、後述する精製の第２〜５段階で、ＤＰＰ−ＩＶ活性とＤＰＰ−ＩＩ活性を測定することとした。ＤＰＰ−ＩＶ活性は、ｐＨ８．０で５０ｍｍｏｌのトリス塩酸緩衝液中でＧｌｙ−Ｐｒｏ−ＭＣＡを用いて測定し、ＤＰＰ−ＩＩの活性はｐＨ６．０で５０ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液５０ｍｍｏｌ中でＬｙｓ−Ａｌａ−ＭＣＡを用いて測定した。これらの酵素活性の測定するために、１０ｍｍｏｌ／Ｌの蛍光ペプチド基質１０μｌ、ｐＨ８．０で０．５ｍｏｌ／Ｌのトリス塩酸緩衝液１００μｌ、後述する画分のいずれかの溶液１０〜２０μｌ、及び１８ｍΩのミリＱ水を含有する混合液（合計１．０ｍｌ）を調製し、３７℃で３０分間保ち酵素反応をさせた後、混合液に０．２ｍｏｌ／Ｌの酢酸２ｍｌを加えて酵素反応を終了させた。３７℃で遊離した７−アミノ−４−メチルクマリン（以下「ＡＭＣ」という。）が発する蛍光（励起３８０ｎｍ、蛍光４４０ｎｍ）を検出し、蛍光比色定量法によりＤＰＰ−ＩＶ活性とＤＰＰ−ＩＩ活性を算出した。活性の算出にあたり、１分間あたりに基質１μｍｏｌを加水分解する酵素量を、１ユニットの活性として定義した。 In order to confirm the degree of purification, DPP-IV activity and DPP-II activity were measured in the second to fifth stages of purification described below. DPP-IV activity was measured with Gly-Pro-MCA in 50 mmol Tris-HCl buffer at pH 8.0, and DPP-II activity was measured in 50 mmol / L phosphate buffer at 50 mmol at pH 6.0. Measurement was performed using Lys-Ala-MCA. In order to measure these enzyme activities, 10 μl of 10 mmol / L fluorescent peptide substrate, 100 μl of 0.5 mol / L Tris-HCl buffer at pH 8.0, 10-20 μl of any of the fractions described below, and 18 mΩ A liquid mixture containing 1.0 milliliter of water (total 1.0 ml) was prepared and kept at 37 ° C. for 30 minutes for enzyme reaction. Then, 2 ml of 0.2 mol / L acetic acid was added to the liquid mixture to complete the enzyme reaction. I let you. Fluorescence (excitation 380 nm, fluorescence 440 nm) emitted by 7-amino-4-methylcoumarin liberated at 37 ° C. (hereinafter referred to as “AMC”) is detected, and DPP-IV activity and DPP-II activity are detected by fluorescence colorimetry. Was calculated. In calculating activity, the amount of enzyme that hydrolyzes 1 μmol of substrate per minute was defined as 1 unit of activity.
以下、ＤＰＰ−ＩＶを精製するための各段階を詳述する。精製の第１段階として、ｐＨ８．０で２０ｍｍｏｌ／Ｌのトリス塩酸緩衝液を用いて、一晩かけて豚の精漿を透析した。得られた透析物を遠心分離機にかけて、１０，０００×ｇの遠心力を４５分間作用させて、上清と沈殿物に分離させた。 Hereinafter, each step for purifying DPP-IV will be described in detail. As a first step of purification, porcine seminal plasma was dialyzed overnight using 20 mmol / L Tris-HCl buffer at pH 8.0. The obtained dialyzate was subjected to a centrifugal separator, and a centrifugal force of 10,000 × g was applied for 45 minutes to separate the supernatant and the precipitate.
精製の第２段階として、ｐＨ８．０で２０ｍｍｏｌ／Ｌのトリス塩酸緩衝液により、直径２．５ｃｍ×長さ２０ｃｍのＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｅｌカラム（ＧＥヘルスケア社製、米国）を、事前に平衡にしておいた。このカラムに、前述した第１段階で得られた上清を流速５０ｍｌ／ｈで加えた。カラムを前述したトリス塩酸緩衝液により広範囲にわたって洗浄し、それから、同じ緩衝液５００ｍｌと、ｐＨ８．０で０．５ｍｍｏｌ／Ｌの食塩を含んだ２０ｍｍｏｌ／Ｌのトリス塩酸緩衝液５００ｍｌと、で形成された食塩の直線的な濃度勾配により溶出させた複数の画分を得た。これらの画分のうちから、前述した蛍光比色定量法によりＤＰＰ−ＩＶ活性及びＤＰＰ−ＩＩ活性を示す画分を特定した。特定した画分のタンパク質を、固体状の硫酸アンモニウム塩（８５％飽和）により濃縮させた。濃縮させて得られた混合物を、１時間かき混ぜた後に遠心分離機にかけて、１０，０００×ｇの遠心力を４５分間作用させて、上清と沈殿物に分離させた。沈殿物を最少量のｐＨ８．０で２０ｍｍｏｌ／Ｌのトリス塩酸緩衝食塩水中で再懸濁して、この緩衝液により沈殿物を一晩透析した。 As a second stage of purification, a DEAE-Sephacel column (GE Healthcare, USA), 2.5 cm in diameter and 20 cm in length, was equilibrated beforehand with 20 mmol / L Tris-HCl buffer at pH 8.0. Oita. The supernatant obtained in the first step was added to this column at a flow rate of 50 ml / h. The column is washed extensively with the previously described Tris-HCl buffer and then formed with 500 ml of the same buffer and 500 ml of 20 mmol / L Tris-HCl buffer containing 0.5 mmol / L sodium chloride at pH 8.0. Multiple fractions eluted with a linear concentration gradient of salt were obtained. Among these fractions, fractions showing DPP-IV activity and DPP-II activity were identified by the fluorescence colorimetric method described above. The identified fractions of protein were concentrated with solid ammonium sulfate (85% saturation). The mixture obtained by concentration was stirred for 1 hour and then centrifuged, and a centrifugal force of 10,000 × g was applied for 45 minutes to separate the supernatant from the precipitate. The precipitate was resuspended in 20 mmol / L Tris-HCl buffered saline at a minimum volume of pH 8.0 and the precipitate was dialyzed overnight with this buffer.
精製の第３段階として、ｐＨ８．０で２０ｍｍｏｌ／Ｌのトリス塩酸緩衝食塩水を用いて、直径３．５ｃｍ×長さ１００ｃｍのＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−３００カラム（ＧＥヘルスケア社製、米国）を、事前に平衡にしておいた。このカラムに、前述の第２段階で沈殿物を透析した溶液を流速３０ｍｌ／ｈで加えて、複数の画分を得た。これらの画分のうちから、前述した蛍光比色定量法によりＤＰＰ−ＩＶ活性及びＤＰＰ−ＩＩ活性を示す画分を特定した。この第３段階により、ＤＰＰ−ＩＶ活性を示す画分と、ＤＰＰ−ＩＩ活性を示す画分とが、明確に分離されて別の画分になった（詳しくは、非特許文献３を参照）。ＤＰＰ−ＩＶ活性を示す画分を、ｐＨ７．５で２０ｍｍｏｌ／Ｌのトリス塩酸緩衝液により一晩透析した。 As a third stage of purification, a Sephacryl S-300 column (GE Healthcare, USA) having a diameter of 3.5 cm and a length of 100 cm was previously prepared using 20 mmol / L Tris-HCl buffered saline at pH 8.0. Was in equilibrium. A solution obtained by dialyzing the precipitate in the second step was added to this column at a flow rate of 30 ml / h to obtain a plurality of fractions. Among these fractions, fractions showing DPP-IV activity and DPP-II activity were identified by the fluorescence colorimetric method described above. By this third stage, the fraction showing DPP-IV activity and the fraction showing DPP-II activity were clearly separated into different fractions (for details, see Non-patent Document 3). . Fractions showing DPP-IV activity were dialyzed overnight at pH 7.5 against 20 mmol / L Tris-HCl buffer.
精製の第４段階として、ｐＨ７．５で２０ｍｍｏｌ／Ｌのトリス塩酸緩衝液を用いて、直径１．５ｃｍ×長さ２０ｃｍのＭａｔｒｅｘ Ｒｅｄ Ａゲルカラム（Ａｍｉｃｏｎ社製、米国）を、事前に平衡にしておいた。このカラムに、前述の第３段階で透析して得られた透析物を流速２０ｍｌ／ｈで加えて、複数の画分を得た。これらの画分のうちから、前述した蛍光比色定量法により、ＤＰＰ−ＩＶ活性を示す画分を特定した。特定した画分を集めて混合し、混合して得られた溶液が食塩濃度３ｍｍｏｌ／Ｌとなるように食塩を加えた。 As a fourth step of purification, a Matrex Red A gel column (Amicon, USA) 1.5 cm in diameter and 20 cm in length was pre-equilibrated with 20 mmol / L Tris-HCl buffer at pH 7.5. Oita. The dialysate obtained by dialysis in the third stage was added to this column at a flow rate of 20 ml / h to obtain a plurality of fractions. Among these fractions, the fraction showing DPP-IV activity was identified by the fluorescence colorimetric method described above. The specified fractions were collected and mixed, and sodium chloride was added so that the solution obtained by mixing had a sodium chloride concentration of 3 mmol / L.
精製の第５段階として、ｐＨ８．０で２０ｍｍｏｌ／Ｌのトリス塩酸緩衝液を用いて、直径１．５ｃｍ×８ｃｍのフェニル−セルロファイン（ＪＮＣ株式会社製）のカラムを、事前に平衡にしておいた。このカラムに、前述した第４段階でＤＰＰ−ＩＶ活性を示す画分を混合して得られた溶液を、流速１５ｍｌ／ｈで加えた。カラムに吸着されなかったタンパク質を、ｐＨ８．０で２０ｍｍｏｌ／Ｌのトリス塩酸緩衝液で洗い流し、それから、この緩衝液７５ｍｌと、ｐＨ８．０で２０ｍｍｏｌ／Ｌのトリス塩酸緩衝液とで、減少する塩勾配により溶出して複数の画分を得た。これらの画分のうちから、前述した蛍光比色定量法により、ＤＰＰ−ＩＶ活性を示す画分を特定した。特定した画分を集めて混合した溶液を、ｐＨ８．０で２０ｍｍｏｌ／Ｌのトリス塩酸緩衝液により一晩透析した。これにより、精製されたＤＰＰ−ＩＶ溶液が得られた。 As a fifth stage of purification, a column of phenyl-cellulofine (manufactured by JNC Corporation) with a diameter of 1.5 cm × 8 cm was equilibrated in advance using a 20 mmol / L Tris-HCl buffer at pH 8.0. It was. A solution obtained by mixing the fraction showing DPP-IV activity in the above-mentioned fourth step was added to this column at a flow rate of 15 ml / h. The protein not adsorbed on the column is washed away with 20 mmol / L Tris-HCl buffer at pH 8.0, and then the salt is reduced with 75 ml of this buffer and 20 mmol / L Tris-HCl buffer at pH 8.0. Multiple fractions were obtained by elution with a gradient. Among these fractions, the fraction showing DPP-IV activity was identified by the fluorescence colorimetric method described above. The identified fractions collected and mixed were dialyzed overnight at pH 8.0 against 20 mmol / L Tris-HCl buffer. As a result, a purified DPP-IV solution was obtained.
前述した第５段階で得られたＤＰＰ−ＩＶ溶液は、前述した第１段階で透析された精漿と比べて、１５％の収率であり約５，７００倍の濃度に精製されていた。また、得られたＤＰＰ−ＩＶ溶液は基質Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＭＣＡを急速に加水分解し、Ｌｙｓ−Ａｌａ−ＭＣＡを弱く加水分解した。なお、得られたＤＰＰ−ＩＶの最初の１８残基のアミノ酸配列は、Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−であり、ヒトやラットの肝臓に存在するＤＰＰ−ＩＶやマウスの胸腺に存在するＤＰＰ−ＩＶにおける膜貫通部位の後部の配列に高度に一致する（詳細は、非特許文献３を参照）。 The DPP-IV solution obtained in the above-mentioned fifth stage had a yield of 15% and was purified to a concentration of about 5,700 times compared to the seminal plasma dialyzed in the above-mentioned first stage. Further, the obtained DPP-IV solution rapidly hydrolyzed the substrate Gly-Pro-MCA and weakly hydrolyzed Lys-Ala-MCA. The amino acid sequence of the first 18 residues of DPP-IV obtained was Asn-Lys-Gly-Thr-Asp-Asp-Ala-Ala-Ala-Asp-Ser-Arg-Arg-Thr-Thr-Thr. -Leu-Thr-, which highly matches the sequence at the rear of the transmembrane site in DPP-IV present in human and rat liver and DPP-IV present in mouse thymus (for details, see Non-Patent Document 3) See).
［植物抽出物の試作、ＤＰＰ−ＩＶ阻害活性の評価方法］
以下に詳述する方法により植物抽出物（中間原料）を試作し、そのＤＰＰ−ＩＶ阻害活性を評価することとした。なお、試作は、特に記載のない限り１５〜２５℃で行った。また、試作、及びＤＰＰ−ＩＶ阻害活性の測定では、特に記載のない限り、和光純薬工業株式会社から購入した分析グレードの試薬を用いた。
[Trial production of plant extract, evaluation method of DPP-IV inhibitory activity]
A plant extract (intermediate raw material) was prototyped by the method described in detail below, and its DPP-IV inhibitory activity was evaluated. The trial production was performed at 15 to 25 ° C. unless otherwise specified. In the trial production and the measurement of DPP-IV inhibitory activity, analytical grade reagents purchased from Wako Pure Chemical Industries, Ltd. were used unless otherwise specified.
試作においてはブルガリア産のアロニア果実を原料とし、この原料を搾って得られたアロニア果汁（商品名：ｆｒｕｉｔ−ｊｕｉｃｅ Ａｒｏｎｉａ、有限会社中垣技術士事務所）を準備した。このアロニア果汁そのものを参考例１とした。
In the trial production, an Aronia fruit juice (trade name: fruit-juice Aronia, limited company Nakagaki Technician Office) obtained by squeezing this raw material was prepared using Bulgarian Aronia fruit. This Aronia juice itself was used as Reference Example 1.
参考例１（アロニア果汁）の組成等を表１に示す。
また、参考例１（アロニア果汁）に含有されている糖質の組成を表２に示す。
原料から抽出液を調製する工程として、液体窒素を用いて参考例１（アロニア果汁）を凍結させ、凍結物をミキサーで粉砕し、この粉砕物を塩酸水溶液に浸けて、粗抽出液を得た。この粗抽出液をろ過し、凍結乾燥機によりろ液を凍結乾燥し、凍結乾燥により得られたオイル状のアントシアニンを１．０ｍｏｌ％酢酸エタノール溶液を溶解させ、この溶液にエーテルを加えて、沈殿物から分離した上清を採取して抽出液とした。
As a process for preparing an extract from the raw material, Reference Example 1 (Aronia juice) was frozen using liquid nitrogen, the frozen product was pulverized with a mixer, and the pulverized product was immersed in an aqueous hydrochloric acid solution to obtain a crude extract. . This crude extract is filtered, the filtrate is lyophilized with a freeze dryer, oily anthocyanin obtained by lyophilization is dissolved in 1.0 mol% acetic acid ethanol solution, ether is added to this solution, and the precipitate is precipitated. The supernatant separated from the product was collected and used as an extract.
試作において抽出液から粗精製物を得る工程では、ｐＨ７．０で５０ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液を用いて、Ｓｕｐｅｌ Ｓｐｈｅｒｅ Ｃａｒｂｏｎ／ＮＨ２ ＳＰＥ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅのカラムを、ベッドボリューム６ｍｌとして、事前に平衡にしておいた。このカラムに抽出液を流速５ｍｌ／ｈで加え、そのままカラムを通過した溶液を回収して参考例２に係る溶液とした。参考例２を回収後のカラムをエタノールで広範囲にわたって洗浄し、それから２．０ｍｏｌ／Ｌの食塩を含むｐＨ７．０で５０ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液の段階的な勾配により溶出させた粗精製物を得て、この粗精製物の溶液を参考例３とした。
In the process of obtaining a crude product from the extract in the trial production, the column of the Super Sphere Carbon / NH 2 SPE Cartridge was equilibrated in advance using a phosphate buffer of 50 mmol / L at pH 7.0. I left it. The extract was added to this column at a flow rate of 5 ml / h, and the solution that passed through the column as it was was collected to obtain a solution according to Reference Example 2 . The column after recovering Reference Example 2 was washed extensively with ethanol, and then the crude product was eluted with a step gradient of 50 mmol / L phosphate buffer at pH 7.0 containing 2.0 mol / L sodium chloride. A solution of the crude product was obtained as Reference Example 3 .
試作において粗精製物を分離する工程として、ＨＰＬＣにより、参考例３に係る溶液を逆相カラムクロマトグラフィーにかけることとした。直径４．６ｍｍ×高さ１５０ｍｍのＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎ Ｃ１８カラムに、参考例３に係る溶液を流速１．０ｍｌ／ｍｉｎで加え、トリフルオロ酢酸０．１重量％に対してアセトニトリル０〜１００重量％の勾配で溶出させて、参考例３に含まれる溶質を分離させた。
As a step of separating the crude product in the trial production, the solution according to Reference Example 3 was subjected to reverse phase column chromatography by HPLC. The solution according to Reference Example 3 was added to an Inert Sustain C18 column having a diameter of 4.6 mm and a height of 150 mm at a flow rate of 1.0 ml / min, and a gradient of 0 to 100% by weight of acetonitrile with respect to 0.1% by weight of trifluoroacetic acid. The solute contained in Reference Example 3 was separated by elution.
また、ＨＰＬＣの装置に付属の紫外可視分光検出器により、溶出時間ごとに溶出液で波長２１５ｎｍの紫外線や波長５２５ｎｍの可視光の吸収の度合いを検出した。図３に示されたピークに基づいて、逆相カラムクロマトグラフィーにかけられた後の溶出液から、次の４つの画分を分取した。まず、最も短い溶出時間において、波長２１５ｎｍの紫外線と波長５２５ｎｍの可視光との両方に対してピークを示した溶出液を、参考例４とした。また、二番目に短い溶出時間において、波長２１５ｎｍの紫外線と波長５２５ｎｍの可視光との両方に対してピークを示した溶出液を、実施例１とした。三番目に短い溶出時間において波長２１５ｎｍの紫外線に対してのみピークを示した溶出液を、参考例５とした。四番目に短い溶出時間において波長２１５ｎｍの紫外線に対してのみピークを示した溶出液を、参考例６とした。
Further, the degree of absorption of ultraviolet light having a wavelength of 215 nm or visible light having a wavelength of 525 nm was detected in the eluate at every elution time by an ultraviolet-visible spectroscopic detector attached to the HPLC apparatus. Based on the peaks shown in FIG. 3, the following four fractions were fractionated from the eluate after being subjected to reverse phase column chromatography. First, Reference Example 4 was an eluate that showed peaks for both ultraviolet light having a wavelength of 215 nm and visible light having a wavelength of 525 nm in the shortest elution time. In addition, an eluate that showed peaks for both ultraviolet light having a wavelength of 215 nm and visible light having a wavelength of 525 nm in the second shortest elution time was defined as Example 1 . The eluate that showed a peak only with respect to ultraviolet rays having a wavelength of 215 nm in the third shortest elution time was defined as Reference Example 5 . The eluate that showed a peak only with respect to ultraviolet rays having a wavelength of 215 nm in the fourth shortest elution time was defined as Reference Example 6 .
次いで、実施例１、及び参考例１〜６について各々のＤＰＰ−ＩＶ阻害活性を評価することとした。対照群（水）としては、１０ｍｍｏｌ／Ｌの蛍光ペプチド基質Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＭＣＡ１０μｌ、ｐＨ９．０で０．５ｍｏｌ／Ｌのトリス塩酸緩衝液１００μｌ、前述した精製方法により得られたＤＰＰ−ＩＶ溶液５μｌ、及び１８ｍΩのミリＱ水、を含む混合液（合計１．０ｍｌ）を調製した。また、実施例１、及び参考例１〜６については、対照群（水）と同じく蛍光ペプチド基質、トリス塩酸緩衝液、及びＤＰＰ−ＩＶ溶液を含有し、さらに実施例１、及び参考例１〜６に係る溶液のうちのいずれか１０μｌ、並びに１８ｍΩのミリＱ水、を含有する混合液（合計１．０ｍｌ）を調製した。
Then, it was decided to Example 1, and reference example 1-6 to evaluate each of the DPP-IV inhibitory activity. As a control group (water), 10 μl of 10 mmol / L fluorescent peptide substrate Gly-Pro-MCA, 100 μl of 0.5 mol / L Tris-HCl buffer at pH 9.0, 5 μl of DPP-IV solution obtained by the purification method described above and milli-Q water 18 M [Omega, mixture containing a (total 1.0 ml) was prepared. In Examples 1, and for Reference Example 1 to 6 likewise fluorescent peptide substrate with the control group (water), Tris-HCl buffer, and containing DPP-IV solution, further Example 1,及 Beauty Reference Example 1 any 10μl of a solution according to 1-6, and milli-Q water 18 M [Omega, mixed solution containing the (total 1.0 ml) was prepared.
上記した混合液を３７℃で３０分間保って酵素反応をさせた後、混合液に０．２ｍｏｌ／Ｌの酢酸２ｍｌを加えて酵素反応を終了させた。３７℃で遊離したＡＭＣが発する蛍光（励起３８０ｎｍ，蛍光４４０ｎｍ）を検出して、蛍光比色定量法によりＤＰＰ−ＩＶ活性を算出した。ＤＰＰ−ＩＶ活性のデータは、ｎ＝４で、平均値±標準誤差で表わした。データの統計分析は、対応のないスチューデントｔ−検定に従って分散分析（一元配置分析）を用いて行った。多数の試料との比較のために、テューキー・クレーマー検定を用いた。 The above mixed solution was kept at 37 ° C. for 30 minutes to cause an enzyme reaction, and then 2 ml of 0.2 mol / L acetic acid was added to the mixed solution to terminate the enzyme reaction. Fluorescence (excitation 380 nm, fluorescence 440 nm) emitted from AMC released at 37 ° C. was detected, and DPP-IV activity was calculated by fluorescence colorimetry. The data of DPP-IV activity was expressed as mean ± standard error with n = 4. Statistical analysis of the data was performed using analysis of variance (one-way analysis) according to an unpaired Student t-test. Tukey-Kramer assay was used for comparison with multiple samples.
［実施例１、及び参考例１〜６のＤＰＰ−ＩＶ阻害活性の評価結果］
図１に示すように、ＤＰＰ−ＩＶ阻害物質を含有していない対照群（水）に比べて、参考例１（アロニア果汁）では、ＤＰＰ−ＩＶ活性が約２７％低かった。アロニア果汁がＤＰＰ−ＩＶ阻害物質を含有していることが示唆された。
[Example 1, and Reference Examples 1 to evaluate the results of the DPP-IV inhibitory activity of 6]
As shown in FIG. 1, DPP-IV activity was about 27% lower in Reference Example 1 (Aronia juice) than in the control group (water) containing no DPP-IV inhibitor. It was suggested that Aronia juice contains a DPP-IV inhibitor.
図２に示すように、試作における抽出液から粗精製物を得る工程で、Ｓｕｐｅｌ Ｓｐｈｅｒｅ Ｃａｒｂｏｎ／ＮＨ２ ＳＰＥ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅのカラムをそのまま通過した参考例２では、ＤＰＰ−ＩＶ活性が阻害されなかった。一方、このカラムをエタノールで洗浄して２．０ｍｏｌ／Ｌの食塩を含む５０ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液の段階的な勾配により溶出された参考例３では、対照群（水）に比べてＤＰＰ−ＩＶ活性が約２８％低かった。参考例３がアロニア果汁由来のＤＰＰ−ＩＶ阻害物質を含有していることが示唆された。
As shown in FIG. 2, DPP-IV activity was not inhibited in Reference Example 2 that passed through the Super Sphere Carbon / NH 2 SPE Cartridge column in the process of obtaining a crude product from the extract in the trial production. On the other hand, in Reference Example 3 in which this column was washed with ethanol and eluted with a stepwise gradient of 50 mmol / L phosphate buffer containing 2.0 mol / L sodium chloride, DPP compared to the control group (water). -IV activity was about 28% lower. It was suggested that Reference Example 3 contains a DPP-IV inhibitor derived from Aronia juice.
図４に示すように、試作における粗精製物を分離する工程で、参考例３を逆相カラムクロマトグラフィーにより分離して得られた画分のうちで、参考例４〜６ではＤＰＰ−ＩＶ活性が阻害されなかった。一方、実施例１では、対照群（水）と比べてＤＰＰ−ＩＶ活性が約８１％低かった。実施例１が、アロニア果汁由来のＤＰＰ−ＩＶ阻害物質を含有していることが示唆された。また、実施例１は、参考例１（アロニア果汁）よりもＤＰＰ−ＩＶ阻害物質を高濃度で含有していると考えられる。
As shown in FIG. 4, among the fractions obtained by separating Reference Example 3 by reverse phase column chromatography in the step of separating the crudely purified product in the trial production, DPP-IV activity was found in Reference Examples 4 to 6 Was not inhibited. On the other hand, in Example 1 , the DPP-IV activity was about 81% lower than that of the control group (water). It was suggested that Example 1 contains a DPP-IV inhibitor derived from Aronia juice. Further, Example 1 is considered to contain a higher concentration of DPP-IV inhibitor than Reference Example 1 (Aronia juice).
［アロニア果汁に含有されているＤＰＰ−ＩＶ阻害物質の同定］
液体クロマトグラフ−タンデム質量分析計（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）により、実施例１に係る溶液を分離して成分の質量分析をすることとした。ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ Ｍ−ｃｌａｓｓシステム（ウォーターズ社製、米国）を用いて、直径７５μｍ×長さ１５０ｍｍのＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ Ｍ−ｃｌａｓｓ ＨＳＳ Ｔ３カラム（ウォーターズ社製）に、実施例１に係る溶液を流速５μｌ／ｍｉｎで加えて、ＨＰＬＣにより実施例１に含まれる成分を分離した。その結果、図５に示すように、溶出時間７分１８秒前後における溶出液で最大のピークが示された。次いで、このピークを示した溶出液に含まれる成分について、エレクトロスプレーイオン化源を備えるＸｅｖｏ Ｇ２ ＱＴｏｆ（ウォーターズ社製）を用いて、タンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）を行った。解析用ソフトウェアとしてＭａｓｓＬｙｎｘ ｖ４．１（ウォーターズ社製）を用いて、測定器を制御してデータを収集した。なお、ＭＳ／ＭＳにあたり、毛細管の温度は１２０℃であり、毛細管の電圧は３ｋＶであった。陽イオンモードで、分子量１００〜１，０００で質量スペクトルを記録した。
[Identification of DPP-IV inhibitor contained in Aronia juice]
The solution according to Example 1 was separated using a liquid chromatograph-tandem mass spectrometer (LC-MS / MS), and the components were subjected to mass spectrometry. Using the ACQUITY UPLC M-class system (manufactured by Waters, USA), the solution according to Example 1 was applied to an ACQUITY UPLC M-class HSS T3 column (manufactured by Waters) having a diameter of 75 μm and a length of 150 mm at a flow rate of 5 μl / min. In addition, the components contained in Example 1 were separated by HPLC. As a result, as shown in FIG. 5, the maximum peak was shown in the eluate at an elution time of around 7 minutes 18 seconds. Next, tandem mass spectrometry (MS / MS) was performed on the components contained in the eluate that showed this peak, using Xevo G2 QTof (manufactured by Waters) equipped with an electrospray ionization source. Data was collected by controlling the measuring instrument using MassLynx v4.1 (manufactured by Waters) as analysis software. In the MS / MS, the capillary temperature was 120 ° C., and the capillary voltage was 3 kV. Mass spectra were recorded at a molecular weight of 100-1,000 in positive ion mode.
実施例１についてＬＣ−ＭＳ／ＭＳを行った結果、図６に示すように、６３５．７４ｍ／ｚで主なピークが示され、２８９．３８ｍ／ｚ及び４５１．５６ｍ／ｚで断片のピークが示された。ここで、非特許文献４に記載のデータに基づき、２８９．３８ｍ／ｚでのピークはシアニジン、４５１．５６ｍ／ｚでのピークはＣ３Ｇ、６３５．７４ｍ／ｚでのピークはシアニジン−３，５−ジグルコシドを示すことが明らかとなった（詳しくは、非特許文献４を参照）。
As a result of performing LC-MS / MS for Example 1 , as shown in FIG. 6, a main peak was shown at 635.74 m / z, and fragment peaks were shown at 289.38 m / z and 451.56 m / z. Indicated. Here, based on the data described in Non-Patent Document 4, the peak at 289.38 m / z is cyanidin, the peak at 451.56 m / z is C3G, and the peak at 635.74 m / z is cyanidin-3,5. -It became clear that diglucoside was shown (for details, refer nonpatent literature 4).
次いで、ＤＰＰ−ＩＶ阻害物質としてシアニジン（株式会社常盤植物化学研究所製）、シアニジン−３−グルコシド（ＥＸＴＲＡＳＹＮＴＨＥＳＥ社製、フランス）、及びシアニジン−３，５−ジグルコシド（シグマ アルドリッチ社製、米国）の試薬を準備した。これら試薬の各々について、前述した実施例１や参考例１〜６と同様の条件でＤＰＰ−ＩＶ活性を測定して、阻害活性を評価することとした。図７に示すように、０．５μｍｏｌ／Ｌのシアニジン又はシアニジン−３−グルコシドを含有する混合液では、ＤＰＰ−ＩＶ活性が阻害されなかった。これに対して、０．５μｍｏｌ／Ｌのシアニジン−３，５−ジグルコシドを含有する混合液では、対照群（水）に比べてＤＰＰ−ＩＶ活性が約２５％低かった。
Subsequently, cyanidin (manufactured by Tokiwa Phytochemical Laboratories Co., Ltd.), cyanidin-3-glucoside (manufactured by EXTRASYNTHESE, France), and cyanidin-3,5-diglucoside (manufactured by Sigma Aldrich, USA) as DPP-IV inhibitors Reagents were prepared. For each of these reagents, the DPP-IV activity was measured under the same conditions as in Example 1 and Reference Examples 1 to 6 described above to evaluate the inhibitory activity. As shown in FIG. 7, the DPP-IV activity was not inhibited in the mixed solution containing 0.5 μmol / L cyanidin or cyanidin-3-glucoside. In contrast, in the mixed solution containing 0.5 μmol / L cyanidin-3,5-diglucoside, the DPP-IV activity was about 25% lower than that of the control group (water).
また、上記したＤＰＰ−ＩＶ阻害活性の評価と同様にして、本発明者が他の実験系において、ＤＰＰ−ＩＶ阻害物質（シアニジン、シアニジン−３−グルコシド、又はシアニジン−３，５−ジグルコシド）の濃度と、豚の精漿由来のＤＰＰ−ＩＶの活性と、の関係を算出したところ、図８に示す結果となった。図８においても、シアニジン−３，５−ジグルコシドは、シアニジンやＣ３Ｇよりも強いＤＰＰ−ＩＶ阻害活性を示している。 Further, in the same manner as the evaluation of the DPP-IV inhibitory activity described above, the inventor of the present invention used other DPP-IV inhibitors (cyanidine, cyanidin-3-glucoside, or cyanidin-3,5-diglucoside) in other experimental systems. When the relationship between the concentration and the activity of DPP-IV derived from porcine seminal plasma was calculated, the results shown in FIG. 8 were obtained. Also in FIG. 8, cyanidin-3,5-diglucoside shows stronger DPP-IV inhibitory activity than cyanidin and C3G.
上記した一連の実験結果に基づき、本発明者は、シアニジン−３，５−ジグルコシドが、シアニジンやＣ３Ｇよりも強いＤＰＰ−ＩＶ阻害活性を示すことを発見した。また、非特許文献１で報告されたアロニア果汁を摂取したことによる血糖降下の作用や、図１に示す参考例１（アロニア果汁）が示したＤＰＰ−ＩＶ活性の阻害は、その大半がアロニア果汁に含有されているシアニジン−３，５−ジグルコシドに起因していると推定される。
Based on the above-described series of experimental results, the present inventor has discovered that cyanidin-3,5-diglucoside exhibits stronger DPP-IV inhibitory activity than cyanidin and C3G. In addition, the action of hypoglycemia caused by ingestion of aronia juice reported in Non-Patent Document 1 and the inhibition of DPP-IV activity shown in Reference Example 1 (aronia juice) shown in FIG. 1 are mostly aronia juice. It is presumed to be due to cyanidin-3,5-diglucoside contained in
［アロニア果汁の効果を評価するための動物実験方法］
動物実験により、アロニア果汁の効果を評価することとした。このためには、前述した参考例１（アロニア果汁）と、前述した豚の精漿由来の精製されたＤＰＰ−ＩＶ溶液を準備した。また、この動物実験は、アメリカ国立衛生研究所の「動物実験の管理と使用に関する指針」に従って実施した。特に記載のない限り、和光純薬工業株式会社から購入した分析グレードの試薬を用いた。
[Animal testing method for evaluating the effects of Aronia juice]
It was decided to evaluate the effect of Aronia juice by animal experiments. For this purpose, the aforementioned Reference Example 1 (Aronia juice) and the aforementioned purified DPP-IV solution derived from porcine seminal plasma were prepared. This animal experiment was conducted in accordance with the “Guidelines for the Management and Use of Animal Experiments” of the National Institutes of Health. Unless otherwise specified, analytical grade reagents purchased from Wako Pure Chemical Industries, Ltd. were used.
さらに、Ｃ５７ＢＬ／６ＪＪｍｓＳｌｃ雄性マウス（以下「Ｃ５７ＢＬマウス」という。）と、ＫＫ−Ａｙ雄性マウス（以下「ＫＫ−Ａｙマウス」という。）を、各々４週齢で日本エスエルシー株式会社から入手した。なお、Ｃ５７ＢＬマウスは、多くの動物実験で対照群として使用されているモデル生物である。ＫＫ−Ａｙマウスは、２型糖尿病発症のモデル生物であり、早期（７〜８週齢）かつ重度の肥満や高血糖を発現する。 Furthermore, C57BL / 6JJmsSlc male mice (hereinafter referred to as “C57BL mice”) and KK-Ay male mice (hereinafter referred to as “KK-Ay mice”) were obtained from Nippon SLC Co., Ltd. at 4 weeks of age. The C57BL mouse is a model organism used as a control group in many animal experiments. The KK-Ay mouse is a model organism for onset of type 2 diabetes, and develops early (7-8 weeks old) and severe obesity and hyperglycemia.
上記した全てのマウスには、飼育期間中に普通食（Ｍｏｕｓｅ Ｄｉｅｔ Ａｕｔｏ／ＹＳ、ＬａｂＤｉｅｔ社製、米国）を自由摂取させた。入手から２週経過時（６週齢の時点）に、Ｃ５７ＢＬマウスとＫＫ−Ａｙマウスのそれぞれを、各々５匹から成る２群（対照群とアロニア群）に分けた。この分けた時点を開始日として２８日間、つまり６〜１０週齢にかけて、対照群（Ｃ５７ＢＬマウス）と対照群（ＫＫ−Ａｙマウス）には水を自由摂取させ、アロニア群（Ｃ５７ＢＬマウス）とアロニア群（ＫＫ−Ａｙマウス）にはアロニア果汁を自由摂取させた。 All the mice described above were allowed to freely take a normal diet (Mouse Diet Auto / YS, manufactured by LabDiet, USA) during the breeding period. When two weeks passed from the time of acquisition (at the age of 6 weeks), each of C57BL mice and KK-Ay mice was divided into two groups (control group and aronia group) each consisting of five mice. The control group (C57BL mouse) and the control group (KK-Ay mouse) were allowed to drink water ad libitum for 28 days, that is, 6 to 10 weeks of age, starting from this divided time point, and the aronia group (C57BL mouse) and aronia The group (KK-Ay mice) received Aronia juice freely.
開始日から２８日経過するまで、３日または４日ごとに全てのマウスの体重と血糖値を測定した。なお、血糖値の測定には、グルコースＮｅｏアルファと、グルテストＮｅｏセンサー（共に、パナソニックヘルスケア株式会社製）を使用した。 The body weight and blood glucose level of all mice were measured every 3 or 4 days until 28 days passed from the start date. In addition, glucose Neo alpha and a Glutest Neo sensor (both manufactured by Panasonic Healthcare Co., Ltd.) were used for blood glucose level measurement.
開始日から２８日目に、全てのマウスの静脈から採血し、得られた血液を遠心分離して血清を得た。さらに、全てのマウスをイソフルランで麻酔した上で解剖して、精巣上体の白色脂肪組織、腸間膜の白色脂肪組織、腹膜後方の白色脂肪組織、皮下の白色脂肪組織、肝臓、及び小腸を摘出した。摘出した各々の白色脂肪組織の重量を量った。摘出した小腸を切断して、主に十二指腸と空腸を含んで成る小腸上部と、主に回腸を含んで成る小腸下部に分離した。小腸上部と小腸下部の各々について、内容物を除去し、生理食塩水中で振り洗いした。肝臓、小腸上部、及び小腸下部の各々について、組織片にＲＮＡｌａｔｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ社製、オランダ）を浸透させてからホモジナイズして、各々の破砕物を得た。 On the 28th day from the start date, blood was collected from the veins of all mice, and the obtained blood was centrifuged to obtain serum. In addition, all mice were anesthetized with isoflurane and dissected to reveal epididymal white adipose tissue, mesenteric white adipose tissue, retroperitoneal white adipose tissue, subcutaneous white adipose tissue, liver, and small intestine. Extracted. Each extracted white adipose tissue was weighed. The excised small intestine was cut and separated into an upper small intestine mainly composed of the duodenum and jejunum and a lower small intestine mainly composed of the ileum. The contents of each of the upper small intestine and the lower small intestine were removed and shaken in physiological saline. For each of the liver, upper small intestine, and lower small intestine, RNAlater (manufactured by Qiagen, The Netherlands) was infiltrated into the tissue piece and then homogenized to obtain each crushed material.
血清、肝臓、小腸上部、小腸下部の各々について、ＤＰＰ−ＩＶ活性の阻害効果を評価することとした。このためには、１０ｍｍｏｌ／ＬのＧｌｙ−Ｐｒｏ−ＭＣＡを１０μｌ、０．５ｍｏｌ／ＬでｐＨ９．０のトリス塩酸１００μｌ、ＤＰＰ−ＩＶ溶液５μｌ、血清または前述した破砕物のいずれか１０〜２０μｌ、及び１８ｍΩのミリＱ水を含有する混合液（合計１．０ｍｌ）を調製した。この混合液を３７℃で３０分間保ち酵素反応させた後、さらに０．２ｍｏｌ／Ｌの酢酸２ｍｌを加えて酵素反応を終了させた。酵素反応により遊離したＡＭＣを、蛍光分析（励起３８０ｎｍ、蛍光４４０ｎｍ）により測定した。 For each of serum, liver, upper small intestine and lower small intestine, the inhibitory effect of DPP-IV activity was evaluated. For this purpose, 10 μl of 10 mmol / L Gly-Pro-MCA, 100 μl of Tris-HCl at 0.5 mol / L and pH 9.0, 5 μl of DPP-IV solution, 10-20 μl of serum or any of the aforementioned crushed materials, And a mixed solution (total 1.0 ml) containing 18 mΩ milli-Q water. The mixture was kept at 37 ° C. for 30 minutes for an enzyme reaction, and further 0.2 ml of acetic acid at 0.2 mol / L was added to terminate the enzyme reaction. AMC released by the enzyme reaction was measured by fluorescence analysis (excitation 380 nm, fluorescence 440 nm).
また、参考例１（アロニア果汁）等について、α−グルコシダーゼ阻害活性を評価することとした。このためには、まず、α−グルコシダーゼの基質として、ｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−グルコピラノシド（シグマアルドリッチ社製、以下「ＰＮＰ−グルコシド」という。）とジメチルスルホキシドとの混合溶液を調製した。
In addition, α-glucosidase inhibitory activity was evaluated for Reference Example 1 (Aronia fruit juice) and the like. For this purpose, first, a mixed solution of p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside (manufactured by Sigma-Aldrich, hereinafter referred to as “PNP-glucoside”) and dimethyl sulfoxide was prepared as a substrate of α-glucosidase.
その上で、対照群（水）として、２０ｍｍｏｌ／Ｌの基質１０μｌ、１５０ｍｍｏｌ／ＬでｐＨ７．０のリン酸ナトリウム１００μｌ、α−グルコシダーゼ（パナソニックヘルスケア株式会社製）１０μｌ、及び１８ｍΩのミリＱ水、を含有する混合液（合計３００μｌ）を調製した。また、参考例１（アロニア果汁）のα−グルコシダーゼ阻害活性を評価するため、対照群（水）と同じく基質、リン酸ナトリウム、及びα−グルコシダーゼを含有し、さらに参考例１（アロニア果汁）１０μｌ、及び１８ｍΩのミリＱ水、を含有する混合液（合計３００μｌ）を調製した。これらの混合液を３７℃で３０分間保ち酵素反応させ、３０分経過時に直ちに、残存しているＰＮＰ−グルコシドの量を９６穴マイクロプレートの分光光度計により波長４０５ｎｍで測った。
In addition, as a control group (water), 10 μl of 20 mmol / L substrate, 100 μl of sodium phosphate pH 150 at 150 mmol / L, 10 μl of α-glucosidase (manufactured by Panasonic Healthcare Co., Ltd.), and 18 mΩ milli-Q water , Containing a total of 300 μl. Also, Reference Example 1 to evaluate the (Aronia juice) of α- glucosidase inhibitory activity, as well substrate and the control group (water), sodium phosphate, and containing α- glucosidase, further Reference Example 1 (aronia juice) 10 [mu] l and milli-Q water 18 M [Omega, mixed solution containing the (total 300 [mu] l) was prepared. These mixed solutions were kept at 37 ° C. for 30 minutes for enzyme reaction, and immediately after 30 minutes, the amount of remaining PNP-glucoside was measured with a 96-well microplate spectrophotometer at a wavelength of 405 nm.
さらに、血清、肝臓、小腸上部、小腸下部の各々について、α−グルコシダーゼ活性の阻害効果を評価することとした。このためには、上記した対照群（水）と同じく基質、リン酸ナトリウム、及びα−グルコシダーゼを含有し、さらに、血清または前述した破砕液のいずれか１０μｌ、及び１８ｍΩのミリＱ水、を含有する混合液（合計３００μｌ）を調製した。その後、上記した対照群（水）と同様に酵素反応させて３０分経過時に残存しているＰＮＰ−グルコシドの量を測った。
Furthermore, the inhibitory effect of α-glucosidase activity was evaluated for each of serum, liver, upper small intestine, and lower small intestine. To this end, contains the above-mentioned control group (water) Like the substrate, sodium phosphate, and α- glucosidase, further containing either 10μl of serum or aforementioned lysate, and 18mΩ of Milli-Q water, the A mixture (total 300 μl) was prepared. Thereafter, the enzyme reaction was carried out in the same manner as in the control group (water) described above, and the amount of PNP-glucoside remaining after 30 minutes was measured.
血清と、マウスインスリン測定キット（株式会社森永生科学研究所製）を用いて、開始日から２８日目のマウスにおける血清インスリン濃度を測定した。 Serum insulin concentration in mice on the 28th day from the start date was measured using serum and a mouse insulin measurement kit (manufactured by Morinaga Institute of Science).
小腸上部でのＧＩＰのｍＲＮＡ量と、小腸下部でのＧＬＰ−１のｍＲＮＡ量を測定することとした。このためには、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製、オランダ）を用いて、小腸上部の破砕液と小腸下部の破砕液の各々からトータルＲＮＡを抽出した。さらに、このトータルＲＮＡを５００ｎｇ、表３に示す遺伝子のプライマー、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（タカラバイオ株式会社製）、及びＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ ＩＩ（タカラバイオ株式会社製）を用いて、ＭｉｎｉＯｐｔｉｃｏｎリアルタイムＰＣＲシステム（バイオ・ラッド社製、米国）により、定量ＲＴ−ＰＣＲを行なった。 The amount of GIP mRNA in the upper small intestine and the amount of GLP-1 mRNA in the lower small intestine were measured. To this end, RNeasy Mini Kit (Qiagen, Netherlands) was used to extract total RNA from each of the upper small intestinal disruption solution and the lower small intestinal disruption solution. Furthermore, using 500 ng of this total RNA, the primers of the genes shown in Table 3, PrimeScript RT Master Mix (manufactured by Takara Bio Inc.), and SYBR Premix Ex Taq II (manufactured by Takara Bio Inc.), the MiniOpticon real-time PCR system ( Quantitative RT-PCR was performed by Bio-Rad Co., USA).
定量ＲＴ−ＰＣＲにおいて、９５℃で３分、９５℃で１０秒、及び６０℃で３０秒のサイクルを５０回繰り返して、トータルＲＮＡにおける各々の遺伝子（ＧＩＰ、又はプログルカゴン）のｍＲＮＡ量を定量した。なお、ＧＬＰ−１はプログルカゴンが切断されて生成されるため、プログルカゴンのｍＲＮＡ量をＧＬＰ−１のｍＲＮＡ量として考えることとした。また、インターナルコントロールとしたβ−アクチンのｍＲＮＡが増幅されたため、定量ＲＴ−ＰＣＲでの連鎖反応は阻害されなかったと判断した。 In quantitative RT-PCR, a cycle of 95 ° C. for 3 minutes, 95 ° C. for 10 seconds, and 60 ° C. for 30 seconds is repeated 50 times to quantify the amount of mRNA of each gene (GIP or proglucagon) in total RNA. did. Since GLP-1 was produced by cleaving proglucagon, the amount of proglucagon mRNA was considered as the amount of GLP-1 mRNA. Moreover, since β-actin mRNA was amplified as an internal control, it was determined that the chain reaction in quantitative RT-PCR was not inhibited.
この動物実験で得られたデータについて、対応がないスチューデントｔ−検定にしたがい、一元配置分散分析により統計分析を行なった。多数の試料を比較するため、テューキー・クレーマー検定を行なった。 The data obtained in this animal experiment was subjected to statistical analysis by one-way analysis of variance according to the unpaired Student t-test. Tukey-Kramer test was performed to compare multiple samples.
［アロニア果汁の効果を評価するための動物実験について結果と考察］
図９（ａ）及び（ｂ）に示すように、アロニア群（ＫＫ−Ａｙマウス）では、対照群（ＫＫ−Ａｙマウス）と比べて、加齢に伴う体重と血糖値の増加が著しく抑えられていた。開始日から２８日目に、アロニア群（ＫＫ−Ａｙマウス）は、対照群（ＫＫ−Ａｙマウス）と比べて、体重で約１２％軽く、血糖値で約４５％低かった。このＫＫ−Ａｙマウスでの実験結果により、２型糖尿病患者がアロニア果汁を摂取し続けると、過体重や高血糖が緩和されることにより糖尿病が治療され得ると考えられる。
[Results and discussion on animal experiments to evaluate the effects of Aronia juice]
As shown in FIGS. 9A and 9B, in the aronia group (KK-Ay mouse), the increase in body weight and blood glucose level with aging is remarkably suppressed as compared to the control group (KK-Ay mouse). It was. On the 28th day from the start date, the Aronia group (KK-Ay mouse) was about 12% lighter in weight and about 45% lower in blood glucose level than the control group (KK-Ay mouse). Based on the results of experiments with this KK-Ay mouse, it is considered that diabetes can be treated by relieving overweight and hyperglycemia when type 2 diabetic patients continue to take Aronia juice.
また、図９（ａ）及び（ｂ）において、アロニア群（Ｃ５７ＢＬマウス）では、対照群（Ｃ５７ＢＬマウス）と比べて、体重や血糖値に有意差こそ認められなかったものの、低い値が示されやすかった。このため、糖尿病を患っていない者であっても、アロニア果汁を摂取し続けると、過体重や高血糖が緩和されることにより糖尿病や血糖値上昇が予防され得ると考えられる。 9 (a) and 9 (b), the Aronia group (C57BL mouse) showed lower values than the control group (C57BL mouse), although there was no significant difference in body weight or blood glucose level. It was easy. For this reason, even if it is a person who does not have diabetes, if it continues ingesting Aronia fruit juice, it is thought that diabetes and a raise in a blood glucose level can be prevented by overweight and hyperglycemia being relieved.
図１０（ａ）〜（ｄ）に示すように、開始日から２８日目に、アロニア群（ＫＫ−Ａｙマウス）では、対照群（ＫＫ−Ａｙマウス）と比べて、各々の白色脂肪組織の重量が有意に低かった。各々の白色脂肪組織の重量を比べると、アロニア群（ＫＫ−Ａｙマウス）では、対照群（ＫＫ−Ａｙマウス）と比べて、精巣上体で２７％軽く、腸間膜で２６％軽く、腹膜後方で３８％軽く、皮下で４８％軽かった。なお、アロニア群（Ｃ５７ＢＬマウス）では、対照群（Ｃ５７ＢＬマウス）と比べて、各々の白色脂肪組織の重量に有意差は認められなかったが、精巣上体、腹膜後方、及び皮下については低い値が示されやすかった。図１０（ａ）〜（ｄ）での実験結果より、アロニア果汁を摂取し続けることによる過体重の抑制効果は、白色脂肪組織の重量増加を抑えることによるものと考えられる。 As shown in FIGS. 10 (a) to 10 (d), on the 28th day from the start date, in the allonia group (KK-Ay mouse), each white adipose tissue was compared with the control group (KK-Ay mouse). The weight was significantly lower. Comparing the weight of each white adipose tissue, in the Aronia group (KK-Ay mouse), it was 27% lighter in the epididymis and 26% lighter in the mesentery than in the control group (KK-Ay mouse). It was 38% lighter and 48% lighter subcutaneously. In the aronia group (C57BL mouse), there was no significant difference in the weight of each white adipose tissue compared to the control group (C57BL mouse), but the values were lower for the epididymis, posterior peritoneum, and subcutaneous. It was easy to be shown. From the experimental results shown in FIGS. 10 (a) to 10 (d), it is considered that the effect of suppressing overweight by continuing to ingest aronia juice is due to suppressing the weight increase of white adipose tissue.
図１１（ａ）に示すように、ＫＫ−Ａｙマウスでは、Ｃ５７ＢＬマウスと比べて、血清でのＤＰＰ−ＩＶ活性が有意に低く抑えられていた。また、図１１（ａ）及び（ｂ）に示すように、アロニア群（ＫＫ−Ａｙマウス）と対照群（ＫＫ−Ａｙマウス）とでは血清や肝臓でのＤＰＰ−ＩＶ活性に有意差が認められなかったことに対して、アロニア群（Ｃ５７ＢＬマウス）は対照群（Ｃ５７ＢＬマウス）と比べて血清や肝臓でのＤＰＰ−ＩＶ活性が有意に増していた。アロニア果汁に含有されているシアニジン−３，５−ジグルコシドによるＤＰＰ−ＩＶ活性の阻害効果は、血清や肝臓に存在するＤＰＰ−ＩＶに対しては発揮されにくいものと考えられる。 As shown in FIG. 11 (a), in the KK-Ay mouse, the DPP-IV activity in the serum was significantly reduced as compared with the C57BL mouse. In addition, as shown in FIGS. 11 (a) and 11 (b), there is a significant difference in serum and liver DPP-IV activity between the Aronia group (KK-Ay mouse) and the control group (KK-Ay mouse). On the other hand, the DPP-IV activity in serum and liver was significantly increased in the aronia group (C57BL mouse) compared to the control group (C57BL mouse). It is considered that the inhibitory effect of DPP-IV activity by cyanidin-3,5-diglucoside contained in aronia juice is hardly exerted against DPP-IV present in serum or liver.
これに対して、図１１（ｃ）に示すように、アロニア群（ＫＫ−Ａｙマウス）では、対照群（ＫＫ−Ａｙマウス）と比べて、ＤＰＰ−ＩＶ活性が小腸上部で約３５％小さく、小腸下部で約４６％小さく抑えられていた。アロニア果汁に含有されているシアニジン−３，５−ジグルコシドは、小腸上部や小腸下部に存在するＤＰＰ−ＩＶに対して、その活性の阻害効果を顕著に発揮したものと考えられる。 On the other hand, as shown in FIG. 11 (c), in the aronia group (KK-Ay mouse), the DPP-IV activity is about 35% smaller in the upper small intestine than in the control group (KK-Ay mouse). It was about 46% smaller in the lower part of the small intestine. It is considered that cyanidin-3,5-diglucoside contained in Aronia fruit juice exerted a remarkable inhibitory effect on its activity against DPP-IV present in the upper and lower small intestines.
図１２（ａ）に示すように、参考例１（アロニア果汁）を含有する混合液では、アロニア果汁の代わりに水を含有する対照群（水）の混合液と比べて、α−グルコシダーゼ活性が４９％小さく抑えられていた。このため、アロニア果汁には、α−グルコシダーゼ活性の阻害物質が含有されていると考えられる。
As shown to Fig.12 (a), in the liquid mixture containing the reference example 1 (aronia fruit juice), compared with the liquid mixture of the control group (water) containing water instead of aronia fruit juice, (alpha) -glucosidase activity is. 49% smaller. For this reason, it is considered that the aronia fruit juice contains an inhibitor of α-glucosidase activity.
図１２（ｂ）に示すように、アロニア群（ＫＫ−Ａｙマウス）では、対照群（ＫＫ−Ａｙマウス）と比べて、小腸上部でα−グルコシダーゼ活性が４２％小さく抑えられていた。なお、アロニア群（ＫＫ−Ａｙマウス）の小腸下部では、対照群（ＫＫ−Ａｙマウス）と比べて、α−グルコシダーゼ活性に有意差は認められなかったが、低い値が示された。このため、アロニア果汁を摂取し続けることによるα−グルコシダーゼ活性の阻害効果は、アロニア果汁に含有されているα−グルコシダーゼ阻害物質が、小腸上部に存在するα−グルコシダーゼの活性を阻害することによるものと考えられる。 As shown in FIG. 12 (b), in the Aronia group (KK-Ay mouse), the α-glucosidase activity was suppressed by 42% smaller in the upper small intestine than in the control group (KK-Ay mouse). In addition, in the lower small intestine of the aronia group (KK-Ay mouse), compared with the control group (KK-Ay mouse), there was no significant difference in α-glucosidase activity, but a low value was shown. For this reason, the inhibitory effect of α-glucosidase activity by continuing to ingest aronia juice is due to the fact that the α-glucosidase inhibitor contained in aronia juice inhibits the activity of α-glucosidase present in the upper small intestine. it is conceivable that.
図１２（ｃ）に示すように、アロニア群（ＫＫ−Ａｙマウス）では、対照群（ＫＫ−Ａｙマウス）と比べて、小腸上部におけるＧＩＰのｍＲＮＡ量が有意に少なかった。なお、ＧＩＰは小腸上部に存在するＫ細胞で発現し、その発現量は糖濃度により調節されている。このことから、アロニア群（ＫＫ−Ａｙマウス）の小腸上部において、α−グルコシダーゼ活性の阻害により糖の吸収が抑えられ、Ｋ細胞で糖濃度の上昇が抑えられたため、ＧＩＰのｍＲＮＡ量が減少したと考えられる。また、ＧＩＰのｍＲＮＡ量が減少すると、ＧＩＰの分泌量や血中濃度の減少により脂肪細胞の表面に存在するＧＩＰ受容体に結合するＧＩＰの量が減少するため、脂肪細胞での脂肪の蓄積が抑えられて、図１０（ａ）〜（ｄ）で示したように白色脂肪組織の重量増加が抑えられたと考えられる。 As shown in FIG. 12 (c), the amount of GIP mRNA in the upper small intestine was significantly smaller in the aronia group (KK-Ay mouse) than in the control group (KK-Ay mouse). GIP is expressed in K cells existing in the upper small intestine, and the expression level is regulated by the sugar concentration. From this, in the upper small intestine of the aronia group (KK-Ay mice), the absorption of sugar was suppressed by inhibiting α-glucosidase activity, and the increase in the sugar concentration was suppressed in K cells, so the amount of GIP mRNA decreased. it is conceivable that. In addition, when the amount of GIP mRNA decreases, the amount of GIP binding to the GIP receptor present on the surface of the adipocytes decreases due to a decrease in the amount of GIP secretion and blood concentration. It is considered that the increase in the weight of the white adipose tissue was suppressed as shown in FIGS. 10 (a) to 10 (d).
さらに、図１２（ｃ）に示すように、アロニア群（ＫＫ−Ａｙマウス）では、対照群（ＫＫ−Ａｙマウス）と比べて、小腸下部におけるＧＬＰ−１（プログルカゴン）のｍＲＮＡ量が有意に多かった。小腸上部でα−グルコシダーゼ活性が阻害されてグルコースの吸収量が減ったため、小腸下部でグルコースの吸収量が増したことに起因して、小腸下部に存在するＬ細胞でＧＬＰ−１の発現量が顕著に増加したものと考えられる。また、アロニア果汁を摂取し続けると、α−グルコシダーゼ活性の阻害によりＧＬＰ−１の分泌量が増し、さらにＤＰＰ−ＩＶ活性の阻害によりＧＬＰ−１の血中濃度が減少しにくいため、糖尿病または血糖値上昇を予防、治療する効果が発揮されやすいと考えられる。 Furthermore, as shown in FIG. 12 (c), in the Aronia group (KK-Ay mouse), the amount of GLP-1 (proglucagon) mRNA in the lower small intestine was significantly higher than that in the control group (KK-Ay mouse). There were many. Since the α-glucosidase activity was inhibited in the upper small intestine and the glucose absorption decreased, the glucose absorption increased in the lower small intestine, so that the expression level of GLP-1 in L cells existing in the lower small intestine was increased. This is thought to be a significant increase. Further, if the ingestion of aronia juice is continued, the secretion amount of GLP-1 increases due to inhibition of α-glucosidase activity, and the blood concentration of GLP-1 does not easily decrease due to inhibition of DPP-IV activity. It is thought that the effect of preventing and treating the increase in value is likely to be exerted.
図１３に示すように、アロニア群（ＫＫ−Ａｙマウス）では、対照群（ＫＫ−Ａｙマウス）と比べて、血清インスリン量が有意に少なく抑えられていた。なお、アロニア群（Ｃ５７ＢＬマウス）では、対照群（Ｃ５７ＢＬマウス）と比べて、血清インスリン量について有意差は認められなかったが少なく抑えられていた。 As shown in FIG. 13, the serum insulin level was significantly reduced in the aronia group (KK-Ay mouse) as compared to the control group (KK-Ay mouse). In the aronia group (C57BL mouse), there was no significant difference in serum insulin level compared to the control group (C57BL mouse), but it was suppressed to a small extent.
アロニア群（ＫＫ−Ａｙマウス）では、図９（ｂ）に示すように血糖値の増加が抑えられ、図１０（ａ）〜（ｄ）に示すように白色脂肪組織の重量増加が抑えられ、かつ、図１３に示すように血清インスリン濃度が少なく抑えられていたため、対照群（ＫＫ−Ａｙマウス）と比べて、インスリン抵抗性や高インスリン血症の症状が緩和されていると考えられる。また、ＫＫ−Ａｙマウスでは、Ｃ５７ＢＬマウスよりも顕著な効果が発揮されたため、アロニア果汁を摂取し続けることにより糖尿病や血糖値上昇を予防、治療する効果は、２型糖尿病患者で顕著に発揮されやすいものと考えられる。 In the aronia group (KK-Ay mice), an increase in blood glucose level is suppressed as shown in FIG. 9 (b), and an increase in the weight of white adipose tissue is suppressed as shown in FIGS. 10 (a) to (d). And as shown in FIG. 13, since the serum insulin concentration was suppressed low, it is considered that the symptoms of insulin resistance and hyperinsulinemia are alleviated as compared with the control group (KK-Ay mice). In addition, since the KK-Ay mouse exhibited a remarkable effect as compared with the C57BL mouse, the effect of preventing and treating diabetes and an increase in blood glucose level by continuing to ingest aronia juice is significantly exhibited in patients with type 2 diabetes. It is considered easy.
シアニジン−３，５−ジグルコシドに限らず、分子内に２分子の糖残基を有するアントシアニンを含有する薬剤または食品組成物を摂取し続ける場合には、シアニジンやＣ３Ｇを含有する薬剤または食品組成物を摂取する場合よりも、ＤＰＰ−ＩＶ活性が著しく阻害されることにより糖尿病または血糖値上昇を予防、治療しやすい場合があるものと期待される。 Not only cyanidin-3,5-diglucoside but also a medicine or food composition containing cyanidin or C3G when ingesting a medicine or food composition containing anthocyanin having two sugar residues in the molecule It is expected that it may be easier to prevent and treat diabetes or an increase in blood glucose level by significantly inhibiting the DPP-IV activity than ingesting.
Claims (6)
糖尿病または血糖値上昇の予防剤または治療剤。 Containing at least 30 mg / 100 g of one or more compounds selected from the group consisting of cyanidin-3,5-diglucoside and salts thereof,
Preventive or therapeutic agent for diabetes or increased blood glucose level.
ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）阻害剤。 Containing at least 30 mg / 100 g of one or more compounds selected from the group consisting of cyanidin-3,5-diglucoside and salts thereof,
Dipeptidyl peptidase IV (DPP-IV) inhibitor.
糖尿病または血糖値上昇の予防用または治療用の食品組成物。 Containing at least 30 mg / 100 g of one or more compounds selected from the group consisting of cyanidin-3,5-diglucoside and salts thereof,
A food composition for preventing or treating diabetes or an increase in blood glucose level.
ＤＰＰ−ＩＶ阻害用の食品組成物。 Containing at least 30 mg / 100 g of one or more compounds selected from the group consisting of cyanidin-3,5-diglucoside and salts thereof,
A food composition for DPP-IV inhibition.
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