JP6230681B2 - 糖尿病による脂肪肝を抑制するための組成物及び糖尿病による腎肥大を抑制するための組成物 - Google Patents

Description

本発明は、糖尿病による脂肪肝を抑制するための組成物及び糖尿病による腎肥大を抑制するための組成物に関するものである。

ミミズは、東アジアで古くから解熱鎮痛剤などの生薬として用いられており、また、近年では、ミミズ成分を有効成分とした糖尿病治療剤（特許文献１）、抗高脂血症剤（特許文献２）、血圧調整剤（特許文献３）などが提案されている。

特公平０７−０８０７７８号公報 特公平０７−０８０７７７号公報 特公平０７−０３９３４９号公報

上述したように、ミミズには様々な効能があると考えられており、本願発明者らは、このミミズが有する更なる効能についての研究を行った結果、遂に、ミミズ成分が糖尿病によって引き起こされる脂肪肝及び腎肥大の発症を抑制する新たな効果を有することを見出した。

本発明は、ミミズを有効成分として含有することにより、糖尿病によって引き起こされる可能性が高い脂肪肝及び腎肥大を抑制するための組成物を提供することを目的とする。

添付図面を参照して本発明の要旨を説明する。

青果エキスに酵母を接種して得た発酵液により発酵させた発酵ミミズを有効成分として含有することを特徴とする糖尿病による脂肪肝を抑制するための組成物に係るものである。

また、青果エキスに酵母を接種して得た発酵液により発酵させた発酵ミミズを有効成分として含有し、肝臓への中性脂肪の蓄積を抑制する効果を有することを特徴とする糖尿病による脂肪肝を抑制するための組成物に係るものである。

また、請求項１，２いずれか１項に記載の糖尿病による脂肪肝を抑制するための組成物において、前記発酵ミミズは、シマミミズであることを特徴とする糖尿病による脂肪肝を抑制するための組成物に係るものである。

また、青果エキスに酵母を接種して得た発酵液により発酵させた発酵ミミズを有効成分として含有し、線溶機能を亢進させる効果を有することを特徴とする糖尿病による腎肥大を抑制するための組成物に係るものである。

また、請求項４記載の糖尿病による腎肥大を抑制するための組成物において、前記発酵ミミズはシマミミズであることを特徴とする糖尿病による脂肪肝を抑制するための組成物に係るものである。

本発明は上述のように構成したから、本発明を摂取することにより、糖尿病によって引き起こされる可能性が高い脂肪肝及び腎肥大の発症を抑制することができる。

本実施例の試験１における肝臓、腎臓、心臓の各臓器重量並びに腎周囲脂肪、副睾丸周囲脂肪の重量の測定結果を示すグラフである。 本実施例の試験１における体重１００ｇあたりの肝臓重量を示すグラフである。 図１における腎臓重量の拡大グラフである。 本実施例の試験１における肝臓に含まれる総脂質の割合を示すグラフである。 本実施例の試験１における肝臓に含まれる総コレステロールの重量を示すグラフである。 本実施例の試験１における尿中アルブミンの測定結果を示すグラフである。 本実施例の試験１におけるプラスミノゲンアクチベータインヒビター１（PAI-1）の測定結果を示すグラフである。 本実施例の試験１におけるユーグロブリン分画溶解時間（ECLT）の測定結果を示すグラフである。 本実施例の試験１における血糖値の推移を示すグラフである。 本実施例の試験１におけるグリコヘモグロビン（HbA1c）の測定結果を示すグラフである。 本実施例の試験１におけるインスリンの測定結果を示すグラフである。 本実施例の試験１でのアミラーゼの測定結果を示すグラフである。 本実施例の試験１における尿酸の測定結果を示すグラフである。 本実施例の試験１におけるグルタミン酸オキサロ酢酸転移酵素（GOT）の測定結果を示すグラフである。 本実施例の試験１におけるアルカリホスファターゼ（ALP）の測定結果を示すグラフである。 本実施例の試験１における乳酸脱水素酵素（LD）の測定結果を示すグラフである。 本実施例の試験１における腎臓切片の組織的観察を行った結果を示す組織画像である。 図１７の組織画像から糸球体におけるメサンギウム基質の占有割合を数値化したグラフである。 本実施例の試験１における大動脈弓の組織的観察を行った結果を示す組織画像である。 図１９の組織画像から大動脈弓の血管壁厚を数値化したグラフである。 本実施例の試験２における体重変化を示すグラフである。 本実施例の試験２におけるグリコヘモグロビン（HbA1c）の測定結果を示すグラフである。 本実施例の試験２におけるインスリンの測定結果を示すグラフである。 本実施例の試験２におけるアディポネクチンの測定結果を示すグラフである。 本実施例の試験２におけるグルタミン酸オキサロ酢酸転移酵素（GOT）の測定結果を示すグラフである。 本実施例の試験２におけるアルカリホスファターゼ（ALP）の測定結果を示すグラフである。 本実施例の試験２におけるロイシンアミノペプチターゼ（LAP）の測定結果を示すグラフである。 本実施例の試験２における血中総コレステロールの測定結果を示すグラフである。 本実施例の試験２における血中尿素窒素の測定結果を示すグラフである。 本実施例の試験２におけるクレアチニンクリアランス（Ccr）の測定結果を示すグラフである。 本実施例の試験２における尿中アルブミンの測定結果を示すグラフである。 本実施例の試験２における肝臓重量の測定結果を示すグラフである。 本実施例の試験２における肝臓に含まれる総脂質の割合を示すグラフである。 本実施例の試験２における肝臓に含まれるトリグリセリドの重量を示すグラフである。 本実施例の試験２における肝臓に含まれる総コレステロールの重量を示すグラフである。 本実施例の試験２におけるユーグロブリン分画溶解時間（ECLT）の測定結果を示すグラフである。 本実施例の試験２におけるプラスミノゲンアクチベータインヒビター１（PAI-1）の測定結果を示すグラフである。 本実施例の試験２における糸球体におけるメサンギウム基質の占有割合を示すグラフである。

好適と考える本発明の実施形態を、本発明の作用を示して簡単に説明する。

本発明の糖尿病による脂肪肝及び腎肥大を抑制するための組成物を、例えば経口摂取することにより、糖尿病によって低下した脂質代謝機能が改善され、また、糖尿病による脂質代謝機能の低下が抑制される。

更に、糖尿病によって生じた細小血管障害が改善され、また、糖尿病による細小血管障害の発症が抑制される（II型糖尿病モデルラットであるＺＤＦラット（Zucker Diabetic Fatty Rat）を用いた確認試験結果より。）。

これにより、糖尿病による脂肪肝及び腎肥大の発症若しくは進行が抑制される。

本発明の具体的な実施例について図面に基づいて説明する。

本実施例は、ミミズを有効成分とし、II型糖尿病を発症した際に合併症として発症し易い脂肪肝及び腎肥大の発症を抑制するための組成物に係るものであり、具体的には、ミミズ、発酵液、田七人参（別名：三七人参、学名：Panax motoginseng Berk）、蟻、イチョウ葉から成るものである。

より具体的には、本実施例の糖尿病による脂肪肝及び腎肥大を抑制するための組成物（以下、本組成物と称す）は、青果エキスに酵母を接種して得た発酵液に、ミミズを混入して該ミミズを発酵させることで発酵ミミズを得、この発酵ミミズに田七人参を混合し発酵乾燥させて発酵混合物を得、この発酵混合物に蟻とイチョウ葉を混合して成るものである。

以下、本組成物について詳細に説明する。

本実施例に用いたミミズは、シマミミズ（学名：Eisenia fetida）である。

また、発酵液は、野菜及び果物等の青果から抽出した青果エキスに酵母菌（本実施例では、複数種の酵母菌、例えば、日和見菌やカンジダ菌）を接種し発酵させたものであり、具体的には、もやし５ｋｇ、キャベツ１．８ｋｇ、白菜０．５ｋｇ、ほうれん草０．５ｋｇ、小松菜０．５ｋｇ、蓮根０．６ｋｇ、パセリ０．５ｋｇ、馬鈴薯１０ｋｇ、胡瓜２ｋｇ、ごぼう０．６ｋｇ、パパイヤ４５ｋｇ、パイナップル１５ｋｇ、バナナ２ｋｇ、リンゴ５ｋｇ、レモン１ｋｇを適宜な大きさに裁断し、これらに無水ブドウ糖８１ｋｇ、含水ブドウ糖９ｋｇ及び酵母０．２ｌを加え撹拌混合し、室温２１℃で約１週間発酵させ、この発酵させた発酵物をプレス機で搾り、この搾り出した発酵液を濾過（１２０目）したものである。

尚、青果エキスを得るための野菜及び果物は上記に限らず、上記外の野菜、果物も使用可能である。

また、田七人参は、粉末状に加工した田七人参である。

また、蟻は、擬黒多刺蟻（学名：Polyrhachisviva Roger）とクロヤマアリ（学名：Formica japonica）の二種類の蟻であり、具体的には、これらの蟻は、発酵させた発酵蟻である。

より具体的には、この発酵蟻は、パパイヤ粉末、粉末状にした擬黒多刺蟻（以下、擬黒多刺蟻粉末と称す。）、粉末状にしたクロヤマアリ（以下、クロヤマアリ粉末と称す。）、水、を混合し、これに酵母（生イースト）を接種して発酵させ、この発酵させたものを乾燥して粉末状にしたものである。

更に詳細に説明すると、室温を２８℃に設定した作業室内で、パパイヤ粉末３８．２ｋｇ、擬黒多刺蟻粉末１．８２ｋｇ、クロヤマアリ粉末７．２８ｋｇ、水（４０℃）４４ｌを混合し、これに酵母（生イースト）７．７ｇを接種し、２４時間静置して発酵させ、この発酵させたものを２５℃、７２時間、乾燥し、更に、２１℃で水分が１０％以下になるまで乾燥し、この水分１０％以下に乾燥させたものを２ｍｍメッシュで粗粉砕した後、０．２ｍｍメッシュで本粉砕し粉末状にしたものである。

尚、前記パパイヤ粉末の製法は、パパイヤをスライス若しくはミンチにより細分化し、これに糖類を加えてパパイヤエキスを抽出し、このパパイヤ抽出液に酵母菌を加え、この酵母菌及びこのパパイヤに元来付着している野生酵母菌とを発酵増殖させ、これに乳酸菌を加えて前記酵母菌、野生酵母菌及び乳酸菌を共生培養したものから液分を区分し、この液分に更に酵母菌及び乳酸菌を加えて発酵熟成し乾燥させたものである（近藤らの特許第３３７０３０２号参照）。

また、イチョウ葉は、イチョウ葉から抽出したイチョウ葉エキスであり、具体的には、このイチョウ葉エキスを発酵させた発酵イチョウ葉エキスである。

より具体的には、この発酵イチョウ葉エキスは、イチョウ葉を煮てエキスを抽出し、この抽出したエキスを加熱して濃縮し、この濃縮エキスに無水ブドウ糖と発酵カルシウムを混合した後、酵母を接種して発酵させ、この発酵させたものを乾燥して粉末状にしたものである。

更に詳細に説明すると、イチョウ葉５０ｋｇと水５００ｌをニーダーに入れ、加熱し沸騰させて１時間して、エキスを抽出し、この抽出したエキスを＃３５０及び＃５００の網で濾過し、この濾過した注出エキスを加熱し、６０ｌまで濃縮し、この濃縮エキスの液温が高いうちに無水ブドウ糖１７．５ｋｇを混合し、更に、液温を３０℃にして発酵カルシウム５ｋｇを混合した後、酵母を接種し、室温を２８℃に設定した作業室内で２４時間好気発酵し、発酵後、室温２３〜２４℃に保って乾燥させ、乾燥時は、途中、粉末状にした玄米５ｋｇと澱粉（本実施例では打ち粉澱粉を使用）２２．５ｋｇを２日に分けて半量ずつ混合し、混合作業が終了した翌日から室温を２０℃に下げ、水分量が５％以下になるまで乾燥し、この乾燥させたものを２ｍｍメッシュで粗粉砕した後、０．２ｍｍメッシュで本粉砕し粉末状にしたものである。

尚、前記発酵カルシウムは、前述した発酵液において、発酵期間を２週間とした発酵液を用い、この発酵液１ｌに対して、０．３ｋｇの割合でカルシウム粉末（北陸貝化石７０ｗｔ％、貝カルシウム２８ｗｔ％、魚カルシウム２ｗｔ％から成るもの）を加え、約２週間攪拌し、これに発酵液１ｌに対して５．５ｍｌの割合でコンブエキス、発酵液１ｌに対して０．２ｌの割合で水を加え（本実施例では、コンブエキスと水とを混合したものを発酵液に加えている。）、このコンブエキスと水を加えた翌日、室温を２５℃に上げ、翌日、再度、室温を２１℃に下げて水分８％以下になるまで乾燥させ、この乾燥させたものを２ｍｍメッシュで粗粉砕した後、０．２ｍｍメッシュで本粉砕し粉末状にしたものである。

次に、本組成物の製造方法について具体的に説明する。尚、以下の説明は、シマミミズ１ｋｇ（乾燥後１００ｇ、配合割合１５ｗｔ％）を使用した場合である。

先ず、シマミミズを、泥出し、洗浄し、その後、２ｍｍ以下の粒状に粉砕する。

具体的には、ミキサー内に泥出し、洗浄したシマミミズと水（シマミミズ重量１ｋｇに対して水３．５ｌを加える）を入れ、４０〜８０分間、ミキサーで粉砕処理を施し、所謂泥状のシマミミズを得る。尚、粉砕処理中は、液温が上昇し、この上昇した液温が３０℃を超えてしまうとシマミミズの有効成分が変質したり破壊されたりする虞があるため、粉砕処理中の温度が３０℃を超えないよう、加える水の温度を１５℃以下とすると良い。

次いで、この粉砕し泥状にしたシマミミズに、発酵液を２１５ｍｌ（配合割合２０ｗｔ％）、乳酸菌を１２５ｍｌ混合し、２５℃で１７〜２１時間静置し、発酵させて発酵シマミミズを得る。尚、本実施例では、乳酸菌に制菌効果が良好なＫ−１菌若しくはロイコノストック・メセンテロイデス菌を使用するが、使用する乳酸菌の種類は、大腸菌、大腸菌群の増殖を抑制し、発酵・乾燥過程においてこれらを死滅させ得るものであれば特に限定しない。

次いで、この発酵シマミミズに田七人参粉末１８０ｇ（配合割合２７ｗｔ％）を混合し、この混合した第一混合物を発酵させながら水気が無くなるまで乾燥する。

具体的には、室温を２３℃に保ち、第一混合物に送風しながら、４８〜７２時間、発酵乾燥させ（この発酵乾燥の段階で、発酵ミミズを作成した際に混合した乳酸菌の働きにより、大腸菌・大腸菌群が殺菌される。）、更に、この発酵乾燥終了後、室温を２０〜２８℃、湿度を１８％以下に保ちながら、約２週間、送風乾燥して前記第一混合物の水分量が５％以下になるまで乾燥する。

次いで、この乾燥させた第一混合物に、粉末状にした発酵蟻２０ｇ（配合割合３ｗｔ％）と発酵イチョウ葉エキス２３３ｇ（配合割合３５ｗｔ％）とを混合し第二混合物を得る。

最後に、この第二混合物を、２ｍｍメッシュで粗粉砕した後、０．２ｍｍメッシュで本粉砕し粉末状にし、この粉末をカプセルに収容し完成となる。尚、最終形態は、カプセル形態に限らず、粉末のまま、或いは錠剤にしても良い。

また、本実施例では、各成分（材料）を上記の配合割合で配合しているが、発酵シマミミズ１２〜１８ｗｔ％、田七人参粉末２２〜３２ｗｔ％、発酵蟻２〜４ｗｔ％、発酵イチョウ葉エキス２８〜４２ｗｔ％、発酵液１６〜２４ｗｔ％の範囲であれば適宜変更可能である。

次に、本組成物の効果について説明する。

本実施例では、試験１と試験２との二度の効果確認試験を行なった。試験１では、単純に本組成物の効果の確認を行ない、試験２では、試験１で確認できなかったミミズ（シマミミズ）成分とそれ以外の成分の効果や早期の症状での効果の確認を行なった。先ず、試験１について詳述する。

≪試験１≫
本試験は、II型糖尿病モデルラットであるＺＤＦラット（Zucker Diabetic Fatty Rat）を用いて、上述した本組成物を含有しない通常飼料を与えたＺＤＦラットと、本組成物を含有する飼料を与えたＺＤＦラットとの状態の差を比較し、本組成物の効果を確認した。

具体的には、ＺＤＦラットは、７週齢の雄性を２０匹用意し、これらを体重、血糖値の平均がほぼ同等になるようにして１０匹ずつ２群に分け、一方の群を、本組成物を含有しない通常飼料（コントロール飼料）を与えるControl群（以下、Ｃ群と称す。）とし、もう一方の群を、本組成物を含有する飼料を与えるEisenia fetida群（以下、ＥＦ群と称す。）とした。

このＣ群に与える通常飼料とは、ＡＩＮ−９３Ｇに準拠し、カゼインをタンパク質源として調整した飼料であり、また、ＥＦ群に与える飼料とは、Ｃ群に与える通常飼料に含まれるコーンスターチの５％（重量）を本組成物に置き換えた飼料である。

また、給餌方法は、夫々の群に夫々の飼料を１２週間（７週齢から１９週齢）、ペアフィーディングにより摂取させた。尚、水は自由摂取とし、また、週に一度、空腹時血糖値の測定を行なうため、測定前は１８時間の絶食を行った。

上記条件で飼育したＣ群、ＥＦ群の各ＺＤＦラットに対して、血糖値、グリコヘモグロビン（以下、ＨｂＡ１ｃと称す。）、インスリン、臓器重量（腎臓、肝臓、心臓、腎周囲脂肪、副睾丸周囲脂肪）、ユーグロブリン分画溶解時間（以下、ＥＣＬＴと称す。）、血中成分を測定するとともに、腎臓切片及び大動脈弓の組織的観察を行い、Ｃ群とＥＦ群との間で比較し、効果を確認した。

図１〜３は、腎臓、肝臓、心臓の各臓器重量並びに腎周囲脂肪、副睾丸周囲脂肪の各重量の測定結果を示すグラフである。

この臓器等の重量の測定においては、図１に示すように、腎臓と肝臓に関して有意差（ｔ検定、ｐ＜０．０１）があった（心臓、腎周囲脂肪及び副睾丸周囲脂肪に関しては、Ｃ群とＥＦ群との間に有意差無し）。

詳細には、図２に示す肝臓重量の測定結果及び図３に示す腎臓重量の測定結果から明らかなように、夫々、Ｃ群とＥＦ群との間に有意差（ｔ検定、ｐ＜０．０１）があり、Ｃ群よりもＥＦ群のほうが肝臓重量、腎臓重量が共に低い値を示す結果であった。

また、図４は、肝臓に含まれる総脂質の重量を示すグラフであり、図５は、肝臓に含まれる総コレステロール（T-cho）の重量を示すグラフである。

この肝臓に含まれる総脂質及び総コレステロールの重量の測定においては、総脂質、総コレステロール共に、Ｃ群とＥＦ群との間に有意差（ｔ検定、ｐ＜０．０１）があり、Ｃ群よりもＥＦ群のほうが総脂質、総コレステロールの値が共に低い値を示す結果であった。尚、参考として、通常のラット（健康なラット）は、肝臓の総重量に対して、肝臓の総脂質は約４％、総コレステロールは約０．４％である。

この図２に示す肝臓重量の測定結果、図４に示す肝臓の総脂質重量の測定結果及び図５に示す肝臓の総コレステロール重量の測定結果から、Ｃ群とＥＦ群との夫々の肝臓重量に対する総脂質及び総コレステロールの割合を算出すると、Ｃ群は、通常のラットに比べて肝臓重量に対する総脂質及び総コレステロールの割合がいずれも高い値であったが、ＥＦ群は、肝臓重量に対する総脂質及び総コレステロールの割合が通常のラットと同等の値であった。

この結果より、ＥＦ群のＺＤＦラットの肝臓重量がＣ群のＺＤＦラットの肝臓重量よりも有意に低くなった要因は、この肝臓の総脂質及び総コレステロールの差によるものと考える。

即ち、ＥＦ群のＺＤＦラットは、本組成物を摂取したことで糖尿病によって低下した脂質代謝機能が改善されて正常に近い状態の脂質代謝が行われたことで、或いは、本組成物を摂取したことにより糖尿病による脂質代謝機能の低下が抑制されて通常通りの脂質代謝が行われたことで、肝臓への脂肪の蓄積が抑制されて、肝臓の総脂質及び総コレステロールが増加せず、肝臓重量が通常ラットと略ほぼ同等の値を示す結果となったと考える。

また、図６は、尿中アルブミンの測定結果を示すグラフである。

この尿中アルブミンの測定においては、試験開始後（７週齢）から６週目（１３週齢）まではＣ群とＥＦ群との間に有意な差はなかったが、試験開始後８週目（１５週齢）でＣ群とＥＦ群との間に有意差（ｔ検定、ｐ＜０．０５）があり、Ｃ群よりもＥＦ群のほうが尿中アルブミンの値が低い値を示す結果となり、また、試験開始後１０週目（１７週齢）以降は、再び有意な差がなくなった。しかし、試験開始４週目あたりから試験終了まで、Ｃ群よりもＥＦ群のほうが尿中アルブミンの値が低く、アルブミンの排泄を抑制する傾向が見られた。

一般的に、糖尿病が進行すると、合併症として糖尿病腎症を発症することが多く、この糖尿病性腎症を発症すると、本来尿中に殆ど出ることが無いアルブミンが漏出することが知られており、初期の糖尿病性腎症の判定に有効とされており、また、このアルブミンの尿中漏出は、糖尿病による細小血管障害に起因するものと考えられている。

即ち、ＥＦ群のＺＤＦラットは、本組成物を摂取したことで、線溶能が亢進し、細小血管障害の改善効果により、Ｃ群よりも尿中アルブミン量が低くなったと考える。

また、本組成物を摂取したＥＦ群のＺＤＦラットの腎臓重量が、本組成物を摂取しなかったＣ群のＺＤＦラットの腎臓重量よりも有意に低くなった要因は、この線溶能の亢進により糖尿病による細小血管障害の発症が抑制されて腎機能が低下しなかったため、腎肥大の症状が改善若しくは抑制されたことによるものと考える。

また、図７は、血中のプラスミノゲンアクチベータインヒビター１（以下、ＰＡＩ−１と称す。）の測定結果を示すグラフである。

このＰＡＩ−１の測定においては、Ｃ群とＥＦ群との間に有意差（ｔ検定、ｐ＜０．０５）があり、Ｃ群よりもＥＦ群のほうがＰＡＩ−１の値が低い値を示す結果であった。

このＰＡＩ−１は、糖尿病により脂質代謝が低下し、この脂質代謝の低下による内臓脂肪の蓄積に伴い脂肪細胞が肥大化し放出量が増加するものであり、このＰＡＩ−１の放出量が増加すると、線溶能が低下し血栓が形成され易くなることが知られている。

即ち、このＰＡＩ−１の測定結果からも本組成物が糖尿病によって低下した脂質代謝を改善し、糖尿病によって引き起こされる線溶能の低下を抑制する効果を有することが裏付けられる。

また、図８は、ＥＣＬＴの測定結果を示すグラフである。尚、このＥＣＬＴ測定においては、Ｃ群とＥＦ群とのＺＤＦラット以外に糖尿病を発症していない健康なラット、具体的にはＳＤラットを用い、このＳＤラットのＥＣＬＴ値をベンチマークとし、このＳＤラットのＥＣＬＴ値とＣ群とＥＦ群との夫々のＥＣＬＴ値を比較した。

このＥＣＬＴは、ユーグロブリン分画に血液の凝固因子であるトロンビンを加え、人工的に血栓を作り、この凝固が溶解するまでの時間を測定することで線溶能を評価するものであり、ＥＣＬＴが長いほど線溶能が低下していることを示すものである。

本試験では、図８に示すように、Ｃ群とＥＦ群との間に有意差（ｔ検定、ｐ＜０．０１）があり、Ｃ群よりも本組成物を与えたＥＦ群のほうがＥＣＬＴが低い値を示す結果であると共に、この本組成物を与えたＥＦ群のＺＤＦラットのＥＣＬＴの値は、健康なＳＤラットのＥＣＬＴの値と同等の値を示すことも確認できた。

このＥＣＬＴの測定結果より、本組成物は、糖尿病によって低下した線溶能を改善する効果、或いは、糖尿病による線溶能の低下を抑制する効果を有する可能性があることも確認できた。

即ち、一般的に、糖尿病を発症すると、合併症として血栓症を発症することが問題となるが、本組成物は、この糖尿病による血栓症の発症を抑制する効果も発揮する可能性があることが確認できた。

また、図９は、空腹時血糖値の推移を示すグラフであり、図１０は、ＨｂＡ１ｃを測定した結果を示すグラフである。

ＨｂＡ１ｃは、一般的に、血糖値が高いほど形成され易くなるため、糖尿病を発症すると血糖値の増加と共に顕著に増加する。

本試験では、血糖値、ＨｂＡ１ｃ共に、Ｃ群とＥＦ群との間で有意差はなく、両群とも血糖値、ＨｂＡ１ｃ共に高い値を示す結果であった。尚、通常のＺＤＦラットのＨｂＡ１ｃの値は、１８週齢では約９．４％（日本チャールス・リバー社のデータを参照）であり、本試験では、これと比べると若干低い値を示す結果となっているが、血糖値の測定結果より高血糖状態が維持されていることが確認されていることより、ＨｂＡ１ｃ値に問題は無いと判断した。

また、図１１は、インスリンを測定した結果を示すグラフである。

ＺＤＦラットは、糖尿病の初期の段階でインスリンの過剰分泌が起こるが、１８週齢頃になると分泌能がなくなり、インスリン濃度が低下することが分かっている。

本試験では、図１１に示すように、本組成物を摂取したＥＦ群のほうが若干インスリンの分泌能が高い傾向を示しているが、Ｃ群とＥＦ群との間に有意差はない結果であった。

この血糖値、ＨｂＡ１ｃ、インスリンの測定結果より、本組成物は、血糖値の改善メカニズムには直接作用していなことが分かる。

即ち、本組成物は、高血糖の症状を改善することで、糖尿病によって発症する脂肪肝や腎肥大の発症を抑えるのではなく、肝臓、腎臓の機能に直接的に作用し、糖尿病によって低下した脂質代謝機能や腎機能を改善する効果、或いは、糖尿病による肝臓の脂質代謝機能の低下や腎機能の低下を抑制する効果を有するものであると考える。

また、本試験では、総タンパク（TP）、アルブミン（Alb）、硫酸亜鉛混濁試験（ZTT）、チモール混濁試験（TTT）、総ビリルビン（T-BIL）、グルタミン酸オキサロ酢酸転移酵素（GOT）、グルタミン酸ピルビン酸転移酵素（GPT）、アルカリホスファターゼ（ALP）、乳酸脱水素酵素（LD）、ガンマ・グルタミン酸（γ−GT）、ロイシンアミノペプチターゼ（LAP）、コリンエステラーゼ（CHE）、クレアチンキナーゼ（CK）、酸性ホスファターゼ（ACP）、アミラーゼ（AMY）、尿酸（UA）、尿素窒素（BUN）、クレアチニン（Cre）、血清鉄（Fe）、総コレステロール（T-cho）、中性脂肪（TG）、HDLコレステロール（HDL）、動脈硬化指数（AI）、LDLコレステロール（LDL）の２４項目について、血液検査により、測定、分析を行った。

この２４項目において、アミラーゼと尿酸との２項目で、Ｃ群とＥＦ群との間に有意差（ｔ検定、ｐ＜０．０１）があった。

アミラーゼは、糖尿病や腎不全の際に高値になる傾向がある項目であるが、本試験では、図１２に示すように、ＥＦ群のほうが有意に低い値を示しており、この結果からも、本組成物が、糖尿病性腎症の発症を抑制する若しくは進行を遅延する効果、或いは、糖尿病性腎症の症状を改善する効果を有することが推考できる。

また、尿酸値は、メタボリックシンドローム等で高値になる項目であるが、本試験では、図１３に示すように、ＥＦ群の方が有意に低い値を示しており、この結果は、本組成物が尿酸の代謝系に何らかの影響を与えている可能性をあることを示す結果と考える。

また、有意差はないものの、図１４〜１６に示すように、グルタミン酸オキサロ酢酸転移酵素（GOT）、アルカリホスファターゼ（ALP）、乳酸脱水素酵素（LD）の３項目でＥＦ群のほうが良好な値を示す結果であった。これは、本組成物が肝機能の低下を抑制した可能性がる、或いは、低下した肝機能を改善させた可能性があることを示唆する結果と考える。

また、図１７は、腎臓切片の組織的観察を行った結果を示す組織画像であり、図１８は、この組織画像を数値化したグラフである。

この腎臓切片の組織的観察においては、図１７に示すように、本組成物を摂取したＥＦ群において、メサンギウム基質増加の抑制が観察された。

また、この観察した組織画像を数値化したものを比較した結果、Ｃ群とＥＦ群との間に有意差（ｔ検定、ｐ＜０．０５）があり、Ｃ群よりもＥＦ群のほうが糸球体面積に占めるメサンギウム基質の割合が少ない、即ち、メサンギウム基質の増加が抑制されていることを示す結果であった。

このメサンギウム基質は、通常腎臓で糸球体を支える役割を担っているが、糖尿病時には高血糖などが原因でメサンギウム基質が肥大し、周囲にある糸球体の毛細血管を圧迫してしまうことが知られており、本組成物を摂取しなかったＣ群では、まさにその傾向がみられたが、本組成物を摂取したＥＦ群では、このメサンギウム基質の増加が抑制されていて、糸球体の毛細血管の圧迫症状が見られなかった。

また、メサンギウム基質によって圧迫された毛細血管は、内腔（血液の通り道）が狭くなって血流が悪くなるが、糸球体では流れ込む血液を濾過しているので血流の悪化によって濾過機能が低下し、さらに、毛細血管の壁には血液を濾過する孔がありフィルターの役目を担っているが、壁が厚くなって目が粗くなり、タンパク質が大量に漏れてしまい、その結果、タンパク尿が出るようになる。

本試験において、ＥＦ群のアルブミン尿が抑制されていたのは、このメサンギウム基質の肥大が抑制されていたためであると考える。

また、図１９は、大動脈弓の組織的観察を行った結果を示す組織画像であり、図２０は、この組織画像より動脈弓血管壁厚を数値化したグラフである。

この大動脈弓の組織的観察においては、図１９に示すように、本組成物を摂取したＥＦ群において、大動脈弓の血管壁の肥大の抑制が有意な傾向にあることが観察できた。

また、この観察した組織画像を数値化したものを比較した結果、Ｃ群よりもＥＦ群のほうの血管壁厚が薄く、有意差はないものの、数値的に有意な傾向で肥大が抑制されていることを確認できた。

次に、試験２について詳述する。

≪試験２≫
本試験は、本組成物におけるミミズ（シマミミズ）成分の効果とミミズ（シマミミズ）以外の成分の効果を明確にすること、更に、試験期間を短期間に設定して、早期の症状に対する効果を確認することを目的としている。

具体的には、試験１同様、ＺＤＦラットを用い、本組成物を含有しない通常飼料を与えたＺＤＦラットと、本組成物を含有する飼料を与えたＺＤＦラットと、本組成物においてミミズ（シマミミズ）成分が入っていないミミズ非含有組成物を含有する飼料を与えたＺＤＦラットの状態の差を比較し、本組成物におけるミミズ成分とミミズ成分以外の成分の効果を明確にした。尚、前記ミミズ非含有組成物とは、単純に本組成物においてミミズ（シマミミズ）成分を除いたもので、他の成分の配合割合は本組成物と同じである。

具体的には、ＺＤＦラットは、試験１と同様、７週齢の雄性を用意し、これらを体重、血糖値の平均がほぼ同等になるようにして、試験１と同様の本組成物を含有しない通常飼料（コントロール飼料）を与えるＣ群と、本組成物を含有する飼料を与えるＥＦ群と、ミミズ非含有組成物を含有する飼料を与えるNon-Eisenia fetida群（以下、ＮＥ群と称す。）とに群分けした。

このＣ群及びＥＦ群に与える飼料は、試験１と同じであり、また、ＮＥ群に与える飼料とは、Ｃ群に与える通常飼料に含まれるコーンスターチの４．２５％（重量）をミミズ非含有組成物に置き換えた飼料である。

また、給餌方法は、試験期間を１０週間（７週齢から１７週齢）とする以外は全て試験１と同条件で行った。

上記条件で飼育したＣ群、ＥＦ群、ＮＥ群の各ＺＤＦラットに対して、体重変化、ＨｂＡ１ｃ、インスリン、アディポネクチン、肝機能マーカー（血中）、血中総コレステロール、肝臓脂質、ＥＣＬＴ、ＰＡＩ−１、メサンギウム基質比率を測定し、Ｃ群とＥＦ群とＮＥ群との間で比較して、本組成物におけるミミズ（シマミミズ）成分の効果とミミズ以外の成分の効果を明確にすると共に、早期の症状に対する効果を確認した。

図２１は、体重の推移を示すグラフである。この図２１に示すように、Ｃ群は５週目（１２週齢）あたりから体重の増加がほとんどなく、６週目（１３週齢）以降、ＥＦ群、ＮＥ群と体重に有意差（LSD検定、ｐ＜０．０１）があり、成長の低下に有意な差が出る結果となった（ＥＦ群とＮＥ群とは有意差無し）。

また、図２２は、ＨｂＡ１ｃを測定した結果を示すグラフである。試験１では、Ｃ群とＥＦ群との間に有意差はなかったが、本試験では、Ｃ群とＥＦ群、Ｃ群とＮＥ群との間に有意差（LSD検定、ｐ＜０．０５）があり、ＥＦ群とＮＥ群とで有意にＨｂＡ１ｃの値が抑制される結果であった（ＥＦ群とＮＥ群とは有意差無し）。これは、本試験が糖尿病の早い段階のＨｂＡ１ｃ値を見ていることによるものと考える。

また、ミミズ（シマミミズ）成分を含有していないＮＥ群でもＨｂＡ１ｃ値が抑制されていることから、ミミズ（シマミミズ）成分以外の成分にＨｂＡ１ｃ値を抑制する効果があることが確認できた。

また、図２３は、インスリンを測定した結果を示すグラフである。試験１同様、Ｃ群とＥＦ群との間に有意差はなく、また、Ｃ群とＮＥ群との間、ＥＦ群とＮＥ群との間においても同様に有意差はない結果であった。

また、図２４は、アディポネクチン（試験１では測定していない新規項目）を測定した結果を示すグラフである。この図２４に示すように、Ｃ群とＥＦ群，ＮＥ群との間に有意差（LSD検定、ｐ＜０．０５）があり、ＥＦ群とＮＥ群とで有意にアディポネクチンの値が高い結果であった（ＥＦ群とＮＥ群とは有意差無し）。

このアディポネクチンは、糖尿病時に減少することが知られている善玉アディポカインであり、インスリン抵抗性等に関わり、血糖値の低下作用を有する。また、アディポネクチンの低下は動脈硬化を引き起こすとも言われている。

また、ミミズ（シマミミズ）成分を含有していないＮＥ群でもアディポネクチンの値が高いことから、ミミズ（シマミミズ）成分以外の成分にアディポネクチンの減少を抑制する効果があることが確認できた。尚、上述したＨｂＡ１ｃ値を抑制する効果は、このアディポネクチンの減少が抑制されることにより、インスリン抵抗性が改善されることで生じた結果であると考える。

また、図２５〜２７は、肝機能マーカー（血中）の測定結果を示すグラフであり、具体的には、図２５は、グルタミン酸オキサロ酢酸転移酵素（GOT）、図２６は、アルカリホスファターゼ（ALP）、図２７は、ロイシンアミノペプチターゼ（LAP）の測定結果を示すグラフである。また、図２８は、血中総コレステロールの測定結果を示すグラフである。

この肝機能マーカーのひとつであるロイシンアミノペプチターゼは、肝臓疾患で値が上昇することが知られており、また、脂肪肝の際にも値が上昇することが知られている項目であり、また、血中総コレステロールは、糖尿病の進行によっても上昇することが知られている項目である。

試験１では、各項目とも有意差は無い（グルタミン酸オキサロ酢酸転移酵素，アルカリホスファターゼは有意な傾向は見られた）結果であったが、本試験では、図２５〜２８に示すように、各項目とも、Ｃ群とＥＦ群，ＮＥ群との間に有意差（LSD検定、ｐ＜０．０５）があった。

即ち、本試験では、ＥＦ群とＮＥ群とにおいて、肝機能マーカーのグルタミン酸オキサロ酢酸転移酵素、アルカリホスファターゼ、ロイシンアミノペプチターゼの上昇が有意に抑制されると共に、血中総コレステロールの上昇が有意に抑制され、ＥＦ群とＮＥ群とで有意に肝機能の低下抑制、脂質代謝改善が示唆される結果であった（ＥＦ群とＮＥ群とは有意差無し）。

また、ミミズ（シマミミズ）成分を含有していないＮＥ群でも各項目でＣ群と比べて有意差があったことから、ミミズ（シマミミズ）成分以外の成分に肝機能の低下抑制効果及び脂質代謝改善効果があることが確認できた。

また、図２９，３０は、腎機能マーカーの測定結果を示すグラフであり、具体的には、図２９は、血中尿素窒素（BUN）、図３０は、クレアチニンクリアランス（Ccr）の測定結果を示すグラフである。

この腎機能マーカーである血中尿素窒素、クレアチニンクリアランスは、共に糖尿病時に腎機能の指標として用いられている項目であり、血中尿素窒素は、腎臓の濾過機能が低下すると、値が増加することが知られており、また、クレアチニンクリアランスは、腎臓の濾過能力を表すもので、糖尿病性腎症の進行により低下することが知られている項目である。

試験１では、血中尿素窒素の測定結果に有意差はなかったが、本試験では、Ｃ群とＥＦ群，ＮＥ群との間に有意差（LSD検定、ｐ＜０．０５）があった。また、クレアチニンクリアランスに関しては、有意差はなかったものの、Ｃ群とＥＦ群，ＮＥ群との間に有意な傾向があった。

即ち、本試験では、ＥＦ群とＮＥ群とにおいて、腎機能マーカーの血中尿素窒素の上昇が有意に抑制されると共に、クレアチニンクリアランスの低下が抑制される傾向があり、ＥＦ群とＮＥ群とで腎機能の低下抑制効果を示唆する結果となった（ＥＦ群とＮＥ群とは有意差無し）。

また、図３１は、尿中アルブミンを測定した結果を示すグラフである。

試験１では、試験開始８週後に有意な差が見られたが、本試験では、試験開始後６週目（１３週齢）からＣ群とＥＦ群、ＮＥ群との間に有意差（LSD検定、ｐ＜０．０５）が生じ、最終的（試験開始１０週後）には、各郡間で夫々、有意差（LSD検定、ｐ＜０．０５）がある結果となった。

具体的には、Ｃ群よりもＥＦ群のほうが尿中アルブミンの漏出量が有意に抑制され、更にＥＦ群よりもＮＥ群のほうが尿中アルブミンの漏出量が有意に抑制される結果となった。このことから、ミミズ（シマミミズ）成分以外の成分に尿中アルブミンの漏出を抑制する効果があることが確認できた。

また、図３２〜３５は、肝臓脂質に関する測定結果を示すグラフであり、図３２は、肝臓重量の測定結果を示し、図３３は、肝臓総脂質の測定結果を示し、また、図３４は、肝臓中のトリグリセリドの重量の測定結果を示し、図３５は、肝臓中の総コレステロールの重量の測定結果を示すグラフである。

肝臓重量の測定では、Ｃ群とＥＦ群，ＮＥ群との間に有意差（LSD検定、ｐ＜０．０５）があり（ＥＦ群とＮＥ群とは有意差無し）、肝臓総脂質の測定では、Ｃ群，ＮＥ群とＥＦ群との間に有意差（LSD検定、ｐ＜０．０５）があった（Ｃ群とＮＥ群とは有意差無し）。

また、肝臓中のトリグリセリド重量の測定では、Ｃ群，ＮＥ群とＥＦ群との間に有意差（LSD検定、ｐ＜０．０５）があり（Ｃ群とＮＥ群とは有意差無し）、総コレステロール重量の測定では、各郡間で有意差（LSD検定、ｐ＜０．０５）がある結果となった。

具体的には、Ｃ群よりもＮＥ群のほうが総コレステロールが有意な低値を示し、更にＮＥ群よりもＥＦ群のほうが総コレステロールが有意な低値を示す結果となった。

このことから、ミミズ（シマミミズ）成分に肝臓への脂質の蓄積を抑制する効果があることが確認できた。

また、図３６は、ＥＣＬＴの測定結果を示すグラフであり、図３７は、ＰＡＩ−１の測定結果を示すグラフである。

試験１同様、本試験においても、ＥＣＬＴの測定結果は、Ｃ群とＥＦ群との間に有意差（LSD検定、ｐ＜０．０５）があり、Ｃ群よりもＥＦ群のほうがＥＣＬＴが低い値を示す結果であった。尚、ＮＥ群は、Ｃ群、ＥＦ群のいずれに対しても有意差無しの結果であった。

また、ＰＡＩ−１に関しても、試験１同様、Ｃ群とＥＦ群との間に有意差（LSD検定、ｐ＜０．０１）があり、Ｃ群よりもＥＦ群のほうがＰＡＩ−１が低い値を示し、また、ＮＥ群に関しても、ＥＦ群と同様に、Ｃ群との間に有意差（LSD検定、ｐ＜０．０１）があり、Ｃ群よりもＰＡＩ−１が低い値を示す結果であった（ＥＦ群とＮＥ群とは有意差無し）。

このＥＣＬＴとＰＡＩ−１の測定結果から、ミミズ（シマミミズ）成分に糖尿病時の線溶機能低下を有意に抑制する効果があることが確認でき、また、ミミズ（シマミミズ）成分以外の成分に線溶阻害因子（ＰＡＩ−１）を抑制する効果があることが確認できた。

また、図３８は、糸球体におけるメサンギウム基質の占有割合を示すグラフである。

試験１同様、Ｃ群とＥＦ群との間に有意差（LSD検定、ｐ＜０．０５）があり、Ｃ群よりもＥＦ群のほうが糸球体面積に占めるメサンギウム基質の割合が少ない、即ち、メサンギウム基質の増加が抑制されていることを示す結果であった。

また、本試験では、Ｃ群とＮＥ群との間に有意差（LSD検定、ｐ＜０．０５）があり、更に、このＮＥ群とＥＦ群との間に有意差（LSD検定、ｐ＜０．０５）があった。即ち、ＥＦ群が最もメサンギウム基質の増加が抑制されており、次いで、ＮＥ群がメサンギウム基質の増加が抑制されている結果であった。このことから、腎臓の組織構造変化抑制では、ミミズ成分の寄与が大きいことが確認できた。

以上、上述した試験１及び試験２の結果から、本組成物は、糖尿病の合併症を抑制する作用（脂質代謝改善、糖尿病性腎症の進行抑制）を有することが確認できた。

また、肝臓の脂質代謝改善効果、線溶機能の亢進効果、腎臓の組織構造変化の抑制効果は、本組成物中のミミズ（シマミミズ）成分による作用が大きいことが確認でき、腎機能改善効果は、ミミズ（シマミミズ）成分以外の成分（田七人参、発酵蟻、発酵イチョウ葉エキス、発酵液）による作用が大きいことが確認できた。

このように、本組成物は、ミミズ（シマミミズ）、田七人参、発酵蟻、発酵イチョウ葉エキス、発酵液の各成分の作用により、II型糖尿病による脂肪肝及び腎肥大を抑制することができる従来にない画期的なものとなる。

しかも、本組成物は、上述した効果以外に、発酵蟻の作用により抗炎症効果や鎮痛作用も発揮し、糖尿病から生じる種々の疾病を緩和する効果も期待できるものとなる。

尚、本発明は、本実施例に限られるものではなく、各構成要件の具体的構成は適宜設計し得るものである。

Claims (5)

1. 青果エキスに酵母を接種して得た発酵液により発酵させた発酵ミミズを有効成分として含有することを特徴とする糖尿病による脂肪肝を抑制するための組成物。
2. 青果エキスに酵母を接種して得た発酵液により発酵させた発酵ミミズを有効成分として含有し、肝臓への中性脂肪の蓄積を抑制する効果を有することを特徴とする糖尿病による脂肪肝を抑制するための組成物。
3. 請求項１，２いずれか１項に記載の糖尿病による脂肪肝を抑制するための組成物において、前記発酵ミミズは、シマミミズであることを特徴とする糖尿病による脂肪肝を抑制するための組成物。
4. 青果エキスに酵母を接種して得た発酵液により発酵させた発酵ミミズを有効成分として含有し、線溶機能を亢進させる効果を有することを特徴とする糖尿病による腎肥大を抑制するための組成物。
5. 請求項４記載の糖尿病による腎肥大を抑制するための組成物において、前記発酵ミミズはシマミミズであることを特徴とする糖尿病による脂肪肝を抑制するための組成物。