JP6224508B2 - Novel diterpene and production method thereof, anticancer agent, propolis extract, and evaluation method of propolis extract using novel diterpene - Google Patents
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Description
本発明は、例えば特定の植物を起源植物として作られたプロポリス原塊から得られる新規ジテルペン及びその製造方法、抗癌剤、プロポリス抽出物、並びに新規ジテルペンを用いたプロポリス抽出物の評価方法に関する発明である。 The present invention relates to a novel diterpene obtained from, for example, a propolis bulk produced from a specific plant as a source plant, a method for producing the same, an anticancer agent, a propolis extract, and a method for evaluating a propolis extract using the novel diterpene. .
プロポリスは、巣の防御及び補強等を目的として、ミツバチが採取した植物の滲出液、新芽、及び樹脂等にミツロウを混ぜて作られる膠状ないしは蝋状の物質である。このプロポリスは、ミツバチが原料として巣箱周辺の種々の植物を採取して生産されるため、多種多様な成分を含有している。 Propolis is a glue-like or wax-like substance made by mixing beeswax into plant exudates, shoots and resins collected by bees for the purpose of defense and reinforcement of the nest. This propolis contains various components because bees are produced by collecting various plants around the nest box as raw materials.
プロポリスは、抗菌効果や抗炎症効果を有していることが古くから知られている。また、プロポリスの主要な生理活性として、抗酸化作用及び免疫賦活作用が知られている。そのため、プロポリスは、医薬品或いは健康食品の素材として古くから用いられてきた。プロポリス中に含まれる有効成分としては、極性の高い有機酸、フラボノイド類、ポリフェノール類、さらには極性の低いテルペノイド類等の非常に多様な種類の有効成分が確認されている。 Propolis has long been known to have antibacterial and anti-inflammatory effects. Antioxidant action and immunostimulatory action are known as main physiological activities of propolis. Therefore, propolis has long been used as a raw material for pharmaceuticals or health foods. As active ingredients contained in propolis, very various kinds of active ingredients such as organic acids with high polarity, flavonoids, polyphenols, and terpenoids with low polarity have been confirmed.
ところで、プロポリスの産地としては、例えば中国、ブラジル、アルゼンチン、ウルグアイ等の南米諸国、ハンガリー、ブルガリア等のヨーロッパ、カナダ等の北米、オーストラリア、ニュージーランド等のオセアニアが産地となっている。近年、非特許文献１に開示されるように多くの研究者により産地別プロポリスの含有成分の相違に関する研究が進められている。これらの産地ごとにおける成分の相違は起源植物の種類によって異なってくるものと考えられている。 By the way, propolis production areas include, for example, South American countries such as China, Brazil, Argentina, and Uruguay, Europe such as Hungary and Bulgaria, North America such as Canada, and Oceania such as Australia and New Zealand. In recent years, as disclosed in Non-Patent Document 1, many researchers have been researching the differences in the content of propolis by production area. It is thought that the difference in the composition in each production area differs depending on the kind of the origin plant.
本発明の目的とするところは、様々な分野に適用することができる新規ジテルペン及びその製造方法、抗癌剤、プロポリス抽出物、並びに新規ジテルペンを用いたプロポリス抽出物の評価方法を提供することにある。 An object of the present invention is to provide a novel diterpene that can be applied to various fields, a method for producing the same, an anticancer agent, a propolis extract, and a method for evaluating a propolis extract using the novel diterpene.
本発明は、ブラジル・パラナ州産のブラウンプロポリス原塊から新規ジテルペンを得たことに基づくものである。
上記目的を達成するために、本発明の一態様では、下記一般式（１）に示される構造を有する新規ジテルペンが提供される。
The present invention is based on obtaining a new diterpene from a brown propolis block from the State of Parana, Brazil.
In order to achieve the above object, in one embodiment of the present invention, a novel diterpene having a structure represented by the following general formula (1) is provided.
また、本発明の別の一様態では、前記新規ジテルペンの製造方法において、原料としてのナンヨウスギ科及びイイギリ科から選ばれる少なくとも一種を起源植物として作られるプロポリス原塊から抽出溶媒を用いて抽出処理する工程を含む新規ジテルペンの製造方法が提供される。前記抽出処理する工程の後に、１又は２以上のクロマトグラフィを用いて分離する工程を含むことが好ましい。 According to another aspect of the present invention, in the method for producing a novel diterpene, at least one kind selected from a cedar family and a lily family as a raw material is extracted from an original propolis mass produced as a source plant using an extraction solvent. A process for producing a novel diterpene comprising the steps is provided. It is preferable to include the process of isolate | separating using 1 or 2 or more chromatography after the process of said extraction process.
また、本発明の別の一様態では、原料としてのナンヨウスギ科及びイイギリ科から選ばれる少なくとも一種を起源植物として作られるプロポリス原塊から抽出溶媒を用いて得られ、下記一般式（１）に示される新規ジテルペンを含有するプロポリス抽出物の評価方法において、下記一般式（１）に示される新規ジテルペンを指標とすることを特徴とするプロポリス抽出物の評価方法が提供される。 Further, in another embodiment of the present invention, at least one kind selected from a cedar family and a phyceae family as a raw material is obtained from a propolis bulk produced as a source plant using an extraction solvent, and is represented by the following general formula (1). In the method for evaluating a propolis extract containing a novel diterpene, a method for evaluating a propolis extract characterized by using the novel diterpene represented by the following general formula (1) as an index is provided.
本発明によれば、新規ジテルペン等を様々な分野に適用することができる。 According to the present invention, novel diterpenes and the like can be applied to various fields.
（第１の実施形態）
以下、本発明の新規ジテルペンを具体化した第１の実施形態を説明する。
本実施形態の新規ジテルペンは、下記一般式（１）で示される構造を有する化合物である。
(First embodiment)
Hereinafter, a first embodiment in which the novel diterpene of the present invention is embodied will be described.
The novel diterpene of this embodiment is a compound having a structure represented by the following general formula (1).
次に、本実施形態の一般式（１）に示される新規ジテルペンの製造方法について説明する。
一般式（１）に示される新規ジテルペンの製造方法は、原料としてのナンヨウスギ科及びイイギリ科から選ばれる少なくとも一種を起源植物として作られるプロポリス原塊から抽出溶媒を用いて抽出処理する工程を備えてなる。
Next, the manufacturing method of the novel diterpene shown by General formula (1) of this embodiment is demonstrated.
The method for producing a novel diterpene represented by the general formula (1) includes a step of extracting, using an extraction solvent, an original propolis mass produced as a source plant with at least one selected from the family Nycephalaceae and Miriaceae as a raw material. Become.
一般式（１）に示される新規ジテルペンは、ブラジル・パラナ州産ブラウンプロポリス原塊から見出された。ブラジル・パラナ州産ブラウンプロポリスは、主にブラジル・パラナ州に生息するナンヨウスギ科又はイイギリ科を起源植物として作られていると考えられている。ナンヨウスギ科の植物として、具体的にはナンヨウスギ属（アラウカリア）が挙げられ、より具体的には、Araucaria angustifolia（パラナマツ）及びAraucaria heterophyllaが挙げられる。一般式（１）に示される新規ジテルペンは、キク科植物のバッカリス・ドラクンクリフォリアを主たる起源植物としているブラジルのサンパウロ州やミナスジェライス州原産のグリーンプロポリス原塊中には含有されていない。 A novel diterpene represented by the general formula (1) was found from a brown propolis block from Parana State, Brazil. Brown propolis from Parana State, Brazil, is considered to be made from plants of the genus Cryptaceae or Culex family that live mainly in the State of Parana, Brazil. Specific examples of the plant belonging to the family Araucariaceae include the genus Araucaria (Araucaria), and more specifically, Araucaria angustifolia and Araucaria heterophylla. The novel diterpene represented by the general formula (1) is not contained in the green propolis block from Brazil and Sao Paulo and Minas Gerais, which are mainly derived from the Asteraceae plant Baccharis drakencrifolia.
プロポリス原塊中の起源植物にナンヨウスギ科又はイイギリ科を含有させるためは、例えばプロポリス採集用に工夫されたミツバチの巣箱をナンヨウスギ科又はイイギリ科の植物群に程近い場所等に配置することにより達成することができる。ミツバチの蜜及び花粉やプロポリスの原料を採取する範囲は数キロ（半径約２〜５キロ以内）であるためその範囲内をナンヨウスギ科又はイイギリ科で占めることが好ましい。ナンヨウスギ科又はイイギリ科を起源植物として作られるプロポリス原塊は、目視においてブラウン色を呈することが好ましい。 In order to make the origin plant in the propolis ingot contain the cedar family or the crabs, for example, it is achieved by arranging a bee nest box devised for collecting the propolis in a place close to a plant group of the cedar family or the piaceae family. can do. The range for collecting the honeybee, pollen and propolis raw materials is several kilometers (within a radius of about 2 to 5 kilometers). It is preferable that the propolis bulk that is made from the plant of the cedar family or the genus Elyaceae has a brown color visually.
プロポリス原塊からの一般式（１）に示される新規ジテルペンの抽出方法は、公知の抽出法、例えば親水性有機溶媒又は水／親水性有機溶媒の混合溶媒を用いた抽出法、超臨界抽出法等が用いられる。これらの中で一般式（１）に示される新規ジテルペンを効率よく抽出することができる観点から、水／親水性有機溶媒の混合液を用いた抽出法が好ましく適用される。本実施形態において用いられる親水性有機溶媒としては、水に溶解する性質を有するエタノール、メタノール、イソプロパノール等の低級アルコールのほか、アセトンやエーテル類、クロロホルム等を適宜選択して使用することができる。これらの親水性有機溶媒を単独で使用してもよく、２種以上を組み合わせて使用してもよい。これらの中でも、生体へ適用することを考えればエタノールが最も好ましい。 A novel diterpene extraction method represented by the general formula (1) from the propolis bulk is a known extraction method, for example, an extraction method using a hydrophilic organic solvent or a mixed solvent of water / hydrophilic organic solvent, a supercritical extraction method. Etc. are used. Among these, an extraction method using a mixed solution of water / hydrophilic organic solvent is preferably applied from the viewpoint that the novel diterpene represented by the general formula (1) can be efficiently extracted. As the hydrophilic organic solvent used in the present embodiment, in addition to lower alcohols such as ethanol, methanol and isopropanol having a property of dissolving in water, acetone, ethers, chloroform and the like can be appropriately selected and used. These hydrophilic organic solvents may be used alone or in combination of two or more. Among these, ethanol is most preferable in view of application to a living body.
前記溶媒を用いて抽出する場合、抽出処理前に採取時に混入するゴミ等の夾雑物を除去し、粗粉砕することが好ましい。例えば、水／親水性有機溶媒の混合液又は親水性有機溶媒においてエタノールを用いる場合、その濃度は、好ましくは５０〜１００容量％、より好ましくは７０〜１００容量％、最も好ましくは９５容量％である。エタノール濃度が５０容量％以上の場合には、有効成分の抽出率をより向上させることができる。エタノールの配合割合を高めることにより一般式（１）に示される新規ジテルペンの抽出効率をより高めることができる。エタノール溶媒の使用容量は、プロポリス原塊の質量に対して好ましくは１〜２０倍量、より好ましくは２〜１０倍量である。エタノール溶媒の使用容量が１倍量以上の場合には、目的成分の抽出率をより向上させることができる。一方、エタノール溶媒の使用容量が２０倍量以下の場合には、装置をより大きくする必要がなく、濃縮等の工程の処理時間をより短縮することができ、作業性をより向上させることができる。 When extracting using the said solvent, it is preferable to remove impurities, such as garbage mixed at the time of extraction, and coarsely pulverize before the extraction process. For example, when ethanol is used in a water / hydrophilic organic solvent mixture or a hydrophilic organic solvent, the concentration is preferably 50 to 100% by volume, more preferably 70 to 100% by volume, and most preferably 95% by volume. is there. When the ethanol concentration is 50% by volume or more, the extraction ratio of the active ingredient can be further improved. By increasing the blending ratio of ethanol, the extraction efficiency of the novel diterpene represented by the general formula (1) can be further increased. The use volume of the ethanol solvent is preferably 1 to 20 times, more preferably 2 to 10 times the mass of the propolis bulk. When the use volume of the ethanol solvent is 1 or more times, the extraction rate of the target component can be further improved. On the other hand, when the use volume of the ethanol solvent is 20 times or less, it is not necessary to enlarge the apparatus, the processing time of the process such as concentration can be further shortened, and workability can be further improved. .
抽出温度は抽出溶媒の種類により適宜設定されるが、２〜４０℃であることが好ましい。抽出温度が２℃以上の場合には、有効成分の抽出率をより向上させることができる。一方、抽出温度が４０℃以下の場合には、ロウ成分の抽出をより抑制することができ、抽出後の濾過性をより向上させることができる。また、揮発性の高い抽出溶媒の場合、溶媒の蒸発をより抑制することができる。なお、抽出操作は、前記抽出温度で攪拌しながら所定時間、例えば３時間以上行えばよい。そして、上記の抽出条件で有効成分を十分に抽出した後、濾紙濾過、珪藻土濾過などの濾過処理を行うことにより溶媒抽出物を得ることができる。 Although extraction temperature is suitably set with the kind of extraction solvent, it is preferable that it is 2-40 degreeC. When extraction temperature is 2 degreeC or more, the extraction rate of an active ingredient can be improved more. On the other hand, when the extraction temperature is 40 ° C. or lower, the extraction of the wax component can be further suppressed, and the filterability after extraction can be further improved. In the case of a highly volatile extraction solvent, evaporation of the solvent can be further suppressed. In addition, what is necessary is just to perform extraction operation for predetermined time, for example, 3 hours or more, stirring with the said extraction temperature. And after fully extracting an active ingredient on said extraction conditions, a solvent extract can be obtained by performing filtration processes, such as filter paper filtration and diatomaceous earth filtration.
プロポリス原塊から抽出溶媒を用いて抽出処理する工程を経た場合、例えば該溶媒抽出物を１又は２以上のクロマトグラフィを用いてさらに分離する工程を経ることにより、一般式（１）に示される新規ジテルペンを分離・精製することができる。抽出又は精製工程における分離・精製の程度は、精製された一般式（１）に示される新規ジテルペンを指標とすることにより、又は各種成分分析することにより行うことができる。クロマトグラフィとしては、公知のクロマトグラフィ、例えばガスクロマトグラフィ、液体クロマトグラフィ、超臨界流体クロマトグラフィ、及び薄層クロマトグラフィを用いることができる。液体クロマトグラフィとしては、例えばカラムクロマトグラフィを用いることができ、より具体的には高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）及びオープンカラムクロマトグラフィを挙げることができる。クロマトグラフィ担体としては、例えば、イオン交換クロマトグラフィ、分配クロマトグラフィ（順相・逆相クロマトグラフィ）、吸着クロマトグラフィ、及び分子排斥クロマトグラフィが挙げられる。分配クロマトグラフィとして、具体的にはシリカゲル担体を用いることが抽出成分の分離効率が優れる観点から好ましい。シリカゲル担体として、表面がオクタデシルシリル基（ＯＤＳ）等により表面修飾されたものを使用してもよい。 When a process of extracting from a propolis bulk with an extraction solvent is performed, for example, a novel process represented by the general formula (1) is performed by performing a process of further separating the solvent extract using one or more chromatography. Diterpenes can be separated and purified. The degree of separation / purification in the extraction or purification step can be carried out by using the purified new diterpene represented by the general formula (1) as an index or by analyzing various components. As the chromatography, known chromatography such as gas chromatography, liquid chromatography, supercritical fluid chromatography, and thin layer chromatography can be used. As liquid chromatography, column chromatography can be used, for example, and more specifically, high performance liquid chromatography (HPLC) and open column chromatography can be mentioned. Examples of the chromatography carrier include ion exchange chromatography, partition chromatography (normal phase / reverse phase chromatography), adsorption chromatography, and molecular exclusion chromatography. Specifically, it is preferable to use a silica gel carrier as the distribution chromatography from the viewpoint of excellent separation efficiency of the extracted components. A silica gel carrier whose surface is modified with an octadecylsilyl group (ODS) or the like may be used.
本実施形態の一般式（１）に示される新規ジテルペンによれば、以下のような効果を得ることができる。
（１）本実施形態の一般式（１）に示される新規ジテルペンは、高い抗癌作用を有している。したがって、抗癌作用を目的とした医薬品等の各種用途に好ましく適用することができる。
According to the novel diterpene represented by the general formula (1) of the present embodiment, the following effects can be obtained.
(1) The novel diterpene represented by the general formula (1) of the present embodiment has a high anticancer activity. Therefore, it can be preferably applied to various uses such as pharmaceuticals for anticancer activity.
（２）好ましくは、一般式（１）に示される新規ジテルペンは、ナンヨウスギ科又はイイギリ科を起源植物として作られるプロポリス原塊から抽出することができる。したがって、容易且つ安定的に原料を入手することができる。また、得られた一般式（１）に示される新規ジテルペンは、安全に各種用途に適用することができる。 (2) Preferably, the novel diterpene represented by the general formula (1) can be extracted from a propolis ingot that is made from a cedar family or a phyceae family. Therefore, the raw material can be obtained easily and stably. Moreover, the novel diterpene shown by the obtained general formula (1) can be safely applied to various uses.
（３）好ましくは、一般式（１）に示される新規ジテルペンは、ナンヨウスギ科又はイイギリ科を起源植物として作られるプロポリス原塊を抽出原料として、抽出溶媒を用いて得られた抽出物を、さらに各種クロマトグラフィを用いて分離・精製することにより得ることができる。したがって、安価に精製物を入手することができる。 (3) Preferably, the novel diterpene represented by the general formula (1) is obtained by further using an extract obtained by using a propolis bulk as an extraction raw material, which is made from a plant belonging to the family Nymphalaceae or Cryptaceae, and using an extraction solvent, It can be obtained by separation and purification using various chromatographies. Therefore, a purified product can be obtained at a low cost.
（４）好ましくは、抽出溶媒として親水性有機溶媒又は水／親水性有機溶媒の混合溶媒が用いられる。したがって、より効率的に一般式（１）に示される新規ジテルペンを抽出することができる。 (4) Preferably, a hydrophilic organic solvent or a mixed solvent of water / hydrophilic organic solvent is used as the extraction solvent. Therefore, the novel diterpene represented by the general formula (1) can be extracted more efficiently.
なお、上記実施形態は以下のように変更してもよい。
・上記実施形態において、抽出原料としてナンヨウスギ科又はイイギリ科以外の起源植物が混合されたプロポリス原塊を使用してもよい。プロポリス原塊中に少なくとも起源植物としてナンヨウスギ科又はイイギリ科が含有されていれば、抽出原料として使用することができる。かかる抽出原料を使用した場合に得られる抽出物においても一般式（１）に示される新規ジテルペンが含有されているものと思料される。
In addition, you may change the said embodiment as follows.
-In the said embodiment, you may use the propolis original block | mixed with origin plants other than the cedar family or the genus department as an extraction raw material. If the propolis bulk contains at least the cedar family or the genus department as a source plant, it can be used as an extraction raw material. It is considered that the novel diterpene represented by the general formula (1) is contained in the extract obtained when such an extraction raw material is used.
・上記プロポリス抽出物を得た後の抽出残渣に、さらに抽出溶媒を添加して複数回抽出処理してもよい。抽出残渣を再利用することにより、回収率を高めることができる。
・上記実施形態の一般式（１）に示される新規ジテルペンは、ヒトに適用される医薬品、飲食品等に対して適用することができるのみならず、家畜等の飼養動物に対する飼料、薬剤等に適用してもよい。
-An extraction solvent may be further added to the extraction residue after obtaining the propolis extract, and extraction may be performed a plurality of times. By reusing the extraction residue, the recovery rate can be increased.
-The new diterpene represented by the general formula (1) of the above embodiment can be applied not only to pharmaceuticals and foods and drinks applied to humans, but also to feeds and drugs for domestic animals such as domestic animals. You may apply.
・上記実施形態において、一般式（１）に示される新規ジテルペンは、ナンヨウスギ科又はイイギリ科を起源植物として作られるプロポリス原塊から入手することができる。しかしながら、公知の化学合成法を用いて化学的に合成してもよい。 In the above-described embodiment, the novel diterpene represented by the general formula (1) can be obtained from a propolis block that is made from a cedar family or a lily family. However, it may be chemically synthesized using a known chemical synthesis method.
・本実施形態の一般式（１）に示される新規ジテルペンは、抗癌剤等として、各種用途に適用することができる。一般式（１）に示される新規ジテルペンは、精製されたものを使用してもよく、プロポリス原塊から抽出溶媒を用いて得られたプロポリス抽出物から、さらに一般式（１）に示される新規ジテルペンをターゲットとして含有比率を高めた精製途中のプロポリス抽出物を使用してもよい。一般式（１）に示される新規ジテルペンの含有比率を高めたプロポリス抽出物とは、新規ジテルペンを固形分中に１．５質量％以上、好ましくは３質量％以上、より好ましくは５質量％以上、さらに好ましくは１０質量％以上、最も好ましくは主成分として一般式（１）に示される新規ジテルペンが含有されている。主成分とは、例えば固形分中の新規ジテルペンが最も含有比率の高い成分である場合、及び固形分中に新規ジテルペンが５０質量％以上含有する場合を示す。 -The novel diterpene shown by General formula (1) of this embodiment is applicable to various uses as an anticancer agent. The new diterpene represented by the general formula (1) may be purified, and from the propolis extract obtained from the propolis bulk using an extraction solvent, the new diterpene represented by the general formula (1) You may use the propolis extract in the middle of the refinement | purification which increased the content rate by making diterpene a target. The propolis extract having an increased content ratio of the new diterpene represented by the general formula (1) is 1.5% by mass or more, preferably 3% by mass or more, more preferably 5% by mass or more of the new diterpene in the solid content. More preferably, it contains 10% by mass or more, and most preferably contains a novel diterpene represented by the general formula (1) as a main component. A main component shows the case where the novel diterpene in solid content is a component with the highest content ratio, and the case where new diterpene contains 50 mass% or more in solid content, for example.
上記一般式（１）に示される新規ジテルペンをターゲットとして含有比率を高めた精製途中のプロポリス抽出物は、プロポリス原塊から単に抽出溶媒を用いて得られるプロポリス抽出物（新規ジテルペンを固形分中に約１質量％含有）よりも、新規ジテルペンの含有比率が増加している。そのため、単に抽出溶媒を用いて得られるプロポリス抽出物とは組成が異なっている。また、上記プロポリス抽出物は、一般式（１）に示される新規ジテルペンの含有比率が増加しているため、一般式（１）に示される新規ジテルペン由来の抗癌作用等の生理作用の増強を期待することができる。 The propolis extract in the middle of purification with the increased content ratio targeting the novel diterpene represented by the above general formula (1) is a propolis extract obtained by simply using an extraction solvent from the propolis bulk (the new diterpene in the solid content). The content ratio of novel diterpenes is higher than that of about 1% by mass. Therefore, the composition is different from the propolis extract obtained simply by using the extraction solvent. In addition, since the propolis extract has an increased content ratio of the new diterpene represented by the general formula (1), it enhances physiological effects such as the anticancer activity derived from the new diterpene represented by the general formula (1). You can expect.
・上記実施形態の一般式（１）に示される新規ジテルペンは、優れた抗癌作用を有する。上記実施形態の一般式（１）に示される新規ジテルペンを含有する抗癌剤を実験用・研究用試薬として適用してもよい。抗癌作用が関係する生理作用のメカニズムの解明等を目的として用いることができる。 -The novel diterpene shown by General formula (1) of the said embodiment has the outstanding anticancer effect | action. You may apply the anticancer agent containing the novel diterpene shown by General formula (1) of the said embodiment as a reagent for experiment and research. It can be used for the purpose of elucidating the mechanism of physiological action related to anticancer action.
・上記実施形態において、一般式（１）に示される新規ジテルペンは、好ましくは抗癌剤として適用される。しかしながら、一般式（１）に示される新規ジテルペンの使用は、抗癌剤に限定されるものではない。 In the above embodiment, the novel diterpene represented by the general formula (1) is preferably applied as an anticancer agent. However, the use of the novel diterpene represented by the general formula (1) is not limited to the anticancer agent.
・上記実施形態において、一般式（１）に示される新規ジテルペン又は一般式（１）に示される新規ジテルペンの含有比率を高めたプロポリス抽出物を、医薬品、医薬部外品、飲食品、化粧品、研究用試薬等の形態で適用する場合、各形態の剤型は特に限定されず、公知のものを適宜採用することができる。また、公知の添加剤を適宜配合して構成してもよい。 -In the said embodiment, the propolis extract which raised the content rate of the novel diterpene shown by General formula (1) or the novel diterpene shown by General formula (1), a pharmaceutical, a quasi-drug, food-drinks, cosmetics, When applied in the form of a research reagent or the like, the dosage form of each form is not particularly limited, and known ones can be appropriately employed. Moreover, you may comprise suitably mix | blending a well-known additive suitably.
（第２の実施形態）
以下、本発明のプロポリス抽出物の評価方法を具体化した第２の実施形態を説明する。
本実施形態のプロポリス抽出物の評価方法は、原料としてのナンヨウスギ科及びイイギリ科から選ばれる少なくとも一種を起源植物として作られるプロポリス原塊から抽出溶媒を用いて得られたプロポリス抽出物の評価方法において、上記一般式（１）に示される新規ジテルペンを指標とすることを特徴とする。一般式（１）に示される新規ジテルペンを指標とするとは、例えばプロポリス抽出物中における新規ジテルペンの存在の有無、含有量、及び特定成分に対する含有比率等を求めることによりプロポリス抽出物の品質を確認することをいう。
(Second Embodiment)
Hereinafter, a second embodiment that embodies the propolis extract evaluation method of the present invention will be described.
The method for evaluating a propolis extract of the present embodiment is a method for evaluating a propolis extract obtained by using an extraction solvent from a propolis bulk that is produced as a source plant of at least one selected from the cedar family and phyceae as raw materials. The novel diterpene represented by the general formula (1) is used as an index. Using the new diterpene shown in the general formula (1) as an indicator, for example, confirms the quality of the propolis extract by determining the presence or absence of the new diterpene in the propolis extract, the content, and the content ratio with respect to the specific component. To do.
より具体的には、まず原料としてのナンヨウスギ科又はイイギリ科を起源植物として作られるプロポリス原塊から抽出溶媒を用いてプロポリス抽出物を得る工程が行われる。次に、好ましくは抽出物中の抽出成分について、１又は２以上のクロマトグラフィを用いて分離する工程が行われ、最後に、一般式（１）に示される新規ジテルペンを検出する工程が行われる。プロポリス原塊から抽出溶媒を用いてプロポリス抽出物を得る工程、及び抽出物中の抽出成分について、クロマトグラフィを用いて分離する工程は、第１の実施形態に記載される方法を適宜採用することができる。 More specifically, first, a step of obtaining a propolis extract using an extraction solvent from a propolis ingot that is produced using a cedar family of cedars or lyceae as a raw material as a source plant is performed. Next, preferably, a step of separating the extracted components in the extract using one or more chromatography is performed, and finally, a step of detecting a novel diterpene represented by the general formula (1) is performed. For the step of obtaining a propolis extract from the original propolis mass using an extraction solvent and the step of separating the extracted components in the extract using chromatography, the method described in the first embodiment may be appropriately adopted. it can.
一般式（１）に示される新規ジテルペンを検出する工程は、各クロマトグラフィにより分離された成分について、公知の方法を用いて定性することにより行われる。例えば、分離された成分は、核磁気共鳴装置等を用いて構造決定を行うことにより定性することができる。また、予め成分が同定された精製品と比較することにより定性・定量することができる。また、抽出成分の分離手段として薄層クロマトグラフィを用いる場合、発色試薬として、例えば硫酸、ドラーゲンドルフ、トリテルペン発色試薬、塩化第二鉄、ブロモクレゾールグリーン等を使用することにより、成分パターンを可視化し、Ｒｆ値から定性することもできる。 The step of detecting the novel diterpene represented by the general formula (1) is performed by qualifying the components separated by each chromatography using a known method. For example, the separated components can be qualitatively determined by determining the structure using a nuclear magnetic resonance apparatus or the like. Further, it can be qualitatively and quantitatively compared with a purified product whose components have been identified in advance. In addition, when thin-layer chromatography is used as a means for separating the extracted components, the component pattern is visualized by using, for example, sulfuric acid, dragendorf, triterpene coloring reagent, ferric chloride, bromocresol green, etc. as the coloring reagent. , Qualitatively from the Rf value.
第２の実施形態のプロポリス抽出物の評価方法によれば、以下のような効果を得ることができる。
（１）本実施形態のプロポリス抽出物の評価方法は、ナンヨウスギ科又はイイギリ科を起源植物として作られるプロポリス原塊を抽出原料として、該抽出原料から抽出溶媒を用いて得られた抽出物の確認作業において、一般式（１）に示される新規ジテルペンを指標とするものである。
According to the propolis extract evaluation method of the second embodiment, the following effects can be obtained.
(1) The method for evaluating a propolis extract according to the present embodiment is a method for confirming an extract obtained from an extraction raw material using a propolis bulk as an extraction raw material, which is produced from a plant belonging to the family Negiaceae or Phyllaceae. In the work, the new diterpene represented by the general formula (1) is used as an index.
ところで、プロポリス原塊は、そのままの状態では摂取しにくいことから、従来より、例えば親水性有機溶媒を用いた抽出方法、水を用いた抽出方法、及び超臨界抽出法により、プロポリス原塊に含まれる有用成分が抽出され、該抽出物が各種用途に適用されている。従来より、例えば親水性有機溶媒を用いて抽出された抽出物の確認作業は、全ての抽出成分を分離し、定性及び定量することは困難であることから、主要抽出成分であるｐ−クマル酸、ケルセチン、又は桂皮酸誘導体等を指標として、その化合物を検出することにより確認が行われていた。また、水を用いて抽出された抽出物は、主要抽出成分であるクロロゲン酸類等を指標として、その化合物を検出することにより確認が行われていた。 By the way, since the propolis bulk is difficult to ingest as it is, it is conventionally included in the propolis bulk by, for example, an extraction method using a hydrophilic organic solvent, an extraction method using water, and a supercritical extraction method. The useful component is extracted, and the extract is applied to various uses. Conventionally, for example, it has been difficult to separate, extract, and qualify p-coumaric acid, which is the main extraction component, in the confirmation of an extract extracted using, for example, a hydrophilic organic solvent. Confirmation has been made by detecting the compound using quercetin, cinnamic acid derivative, or the like as an index. In addition, an extract extracted with water has been confirmed by detecting the compound using chlorogenic acids or the like, which are main extraction components, as an index.
本発明において、ナンヨウスギ科又はイイギリ科を起源植物として作られるプロポリス原塊から、その特徴成分である一般式（１）に示される新規ジテルペンを精製・同定した。したがって、かかる一般式（１）に示される新規ジテルペンを指標成分として、ナンヨウスギ科又はイイギリ科を起源植物として作られるプロポリス原塊から得られた溶媒抽出物の確認作業を行うことができる。 In the present invention, a novel diterpene represented by the general formula (1), which is a characteristic component, was purified and identified from a propolis bulk that is produced from a plant of the genus Cryptaceae or Cryptaceae. Therefore, it is possible to confirm the solvent extract obtained from the propolis bulk that is produced using the new diterpene represented by the general formula (1) as an indicator component, and the origin plant of the cedar family or the primate family.
（２）本実施形態のプロポリス抽出物の評価方法は、ナンヨウスギ科又はイイギリ科を起源植物として作られるプロポリス原塊自体、又はそこから抽出された一般式（１）に示される新規ジテルペンを販売する際に、一般式（１）に示される新規ジテルペンの含有の有無又は含有量を確認する際に適用することができる。また、ナンヨウスギ科又はイイギリ科を起源植物として作られるプロポリス原塊の製品、又はそこから抽出された一般式（１）に示される新規ジテルペンの製品において、一般式（１）に示される新規ジテルペンの含有又は所定含有量を規格・保証する場合、その製品の規格・保証の確認工程において適用することができる。 (2) The method for evaluating a propolis extract according to the present embodiment sells a propolis bulk lump itself produced from a cedar family or a lyceae family, or a novel diterpene represented by the general formula (1) extracted therefrom. In this case, the present invention can be applied when the presence or absence or content of the novel diterpene represented by the general formula (1) is confirmed. In addition, in the product of the propolis bulk that is made from the plant of the family Nymphalaceae or the genus Cryptaceae, or the product of the new diterpene represented by the general formula (1) extracted therefrom, the novel diterpene represented by the general formula (1) When the content or specified content is standardized / guaranteed, it can be applied in the standard / guarantee confirmation process of the product.
（３）本実施形態のプロポリス抽出物の評価方法として、プロポリス抽出物中に一般式（１）に示される新規ジテルペンが含有していることを確認することにより、プロポリスが一般式（１）に示される新規ジテルペンを起源植物として構成されていることを証明することができる。また、プロポリス抽出物中における一般式（１）に示される新規ジテルペンの含有量を測定することにより、プロポリス原料中の上記構成起源植物の純度（比率）を推認することができる。 (3) As a method for evaluating the propolis extract of this embodiment, by confirming that the novel diterpene represented by the general formula (1) is contained in the propolis extract, the propolis is represented by the general formula (1). It can be demonstrated that the novel diterpenes shown are composed as origin plants. Moreover, the purity (ratio) of the said structural origin plant in a propolis raw material can be estimated by measuring content of the novel diterpene shown by General formula (1) in a propolis extract.
なお、上記実施形態は以下のように変更してもよい。
・上記実施形態において、クロマトグラフィにより分離された一般式（１）に示される新規ジテルペンは、抽出物の主要成分として、例えば定量分析、及び抽出効率の確認作業に適用してもよい。
In addition, you may change the said embodiment as follows.
-In the said embodiment, you may apply the novel diterpene shown by General formula (1) isolate | separated by the chromatography as a main component of an extract, for example to the quantitative analysis and the confirmation work of extraction efficiency.
以下に試験例を挙げ、前記実施形態をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
（試験例１：ブラジル・パラナ州産のブラウンプロポリス原塊から新規ジテルペンの分離・精製）
プロポリス原塊として、プロポリス採集用に工夫されたミツバチの巣箱を半径数キロ以内の周辺植物としてナンヨウスギ科又はイイギリ科が含まれる群生地に数日設置することにより得られたブラジル・パラナ州産のブラウンプロポリス原塊を使用した。
Although the test example is given below and the embodiment is described more specifically, the present invention is not limited to these.
(Test Example 1: Separation and purification of a new diterpene from the brown propolis block from Parana State, Brazil)
As a propolis block, a bee hive designed for propolis collection was installed for several days in a colony containing a cedar or scallop as a surrounding plant within a radius of several kilometers. Brown propolis bulk was used.
得られたブラウンプロポリスの原塊１００ｇに９５％エタノール３００ｍＬ加えて、一昼夜、室温（約２５℃）で３回攪拌しながら抽出した。得られたエタノール抽出液をろ紙（アドバンテック東洋製Ｎｏ．２）で吸引ろ過して残渣を除去し、プロポリス抽出物を得た。 300 g of 95% ethanol was added to 100 g of the original brown propolis block, and the mixture was extracted overnight with stirring at room temperature (about 25 ° C.) three times. The obtained ethanol extract was suction filtered with a filter paper (Advantech Toyo No. 2) to remove the residue, and a propolis extract was obtained.
次に、上記プロポリス抽出物（濃縮乾固物:５３．０１ｇ）を、オープンカラムクロマトグラフィ（内径６．５ｍｍ×長さ３２０ｍｍ）に付した。クロマトグラフィ担体としてシリカゲル（シリカゲル６０、メルク社製）を使用した。溶離溶媒として、多段階グラジエントにより、クロロホルム：メタノール＝１００：０（３９００ｍＬ）→４９：１（６００ｍＬ）→９：１（６００ｍＬ）→１：１（６００ｍＬ）→０：１００（８００ｍＬ）として溶出させた。溶出成分は、特定量ずつ分取し、全７画分を得た。 Next, the propolis extract (concentrated dry solid: 53.01 g) was subjected to open column chromatography (inner diameter 6.5 mm × length 320 mm). Silica gel (silica gel 60, manufactured by Merck) was used as a chromatography carrier. As an eluting solvent, eluting with chloroform: methanol = 100: 0 (3900 mL) → 49: 1 (600 mL) → 9: 1 (600 mL) → 1: 1 (600 mL) → 0: 100 (800 mL) by a multistage gradient. It was. The elution component was fractionated by a specific amount to obtain a total of 7 fractions.
目的の成分を確認するために、これらの画分をそれぞれ薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ：ＴＬＣシリカゲル６０Ｆ254、メルク社製）にて展開した。展開溶媒として、クロロホルム：メタノール＝９：１を使用した。発色試薬として、２０％硫酸を使用した。発色試薬を噴霧後、１０５℃のホットプレート上で加熱し呈色させ、成分パターンを可視化し、７画分を得た。それぞれフラクションＡ〜Ｇとする。 To confirm the component of interest, these fractions each thin layer chromatography (TLC: TLC Silica gel 60F 254, Merck) and developed with. As a developing solvent, chloroform: methanol = 9: 1 was used. 20% sulfuric acid was used as a coloring reagent. After spraying the coloring reagent, it was colored on a hot plate at 105 ° C. to visualize the component pattern, and seven fractions were obtained. Let each be fractions A-G.
上記フラクションＤ（乾固後１２．０７ｇ）について、さらにシリカゲルカラムクロマトグラフィ（内径６．５ｍｍ×長さ３２０ｍｍ）に付した。溶離溶媒として、多段階グラジエントにより、ヘキサン：アセトン＝１０：１（２１００ｍＬ）→５：１（７００ｍＬ）→３：１（８００ｍＬ）→１：１（５００ｍＬ）→１００％アセトン（５００ｍＬ）と順次変更し、最後に１００％メタノールで回収した。溶出成分は、特定量ずつ分取し、全８画分を得た。それぞれフラクションＤ−１〜８とする。 The fraction D (12.07 g after drying) was further subjected to silica gel column chromatography (inner diameter 6.5 mm × length 320 mm). As the elution solvent, hexane: acetone = 10: 1 (2100 mL) → 5: 1 (700 mL) → 3: 1 (800 mL) → 1: 1 (500 mL) → 100% acetone (500 mL) was sequentially changed by a multistage gradient. Finally, it was recovered with 100% methanol. Elution components were collected in specific amounts to obtain a total of 8 fractions. It is set as fractions D-1 to 8, respectively.
さらに、フラクションＤ−４について、分取用逆相ＨＰＬＣを用いて下記の条件で分離処理を行い、全３画分を得た。それぞれフラクションＤ−４−１〜３とする。
さらに、フラクションＤ−４−２（乾固後１１５．２１ｍｇ）について、再度同条件にてＨＰＬＣで再精製処理を行った。得られた全３画分のうち（フラクションＤ−４−２−１〜３）、フラクションＤ−４−２−３より、新規クレロダン系ジテルペン５１．８４ｍｇを得た。
Furthermore, the fraction D-4 was subjected to separation treatment using preparative reverse phase HPLC under the following conditions to obtain all three fractions. It is set as fractions D-4-1 to 3, respectively.
Furthermore, the fraction D-4-2 (115.21 mg after drying) was re-purified by HPLC again under the same conditions. Of all 3 fractions obtained (fraction D-4-2-1-3), 51.84 mg of novel clerodane diterpene was obtained from fraction D-4-2-3.
ＨＰＬＣ機器：PU980，UV970（日本分光社製）
カラム：Develosil HG-5（内径１０ｍｍ×長さ２５０ｍｍ、野村化学社製）
移動相：Ａ液（水）、Ｂ液（アセトニトリル）
６０％Ｂ液（０分）→１００％Ｂ液（６０分）→１００％Ｂ液保持（１０分）グラジエント
流速：４ｍＬ／分
検出波長：２０５ｎｍ
（試験例２：新規ジテルペンの構造解析）
（ａ）核磁気共鳴装置（NMR）を用いた構造決定
単離精製した成分について、核磁気共鳴装置（300MHz、VARIAN社製）を用いた構造決定を行った。溶媒として重クロロホルム（CDCl3）を使用した。1H-NMRスペクトルの測定結果を示すデータを図１と表１にそれぞれ示す。13C-NMRスペクトルの測定結果を示すデータを図２と表１にそれぞれ示す。HMBC及びH-H COSYの測定結果を示すデータを表１にそれぞれ示す。
HPLC instrument: PU980, UV970 (manufactured by JASCO)
Column: Develosil HG-5 (inner diameter 10 mm x length 250 mm, manufactured by Nomura Chemical Co., Ltd.)
Mobile phase: Liquid A (water), Liquid B (acetonitrile)
60% solution B (0 minutes) → 100% solution B (60 minutes) → 100% solution B retained (10 minutes) Gradient Flow rate: 4 mL / min Detection wavelength: 205 nm
(Test Example 2: Structural analysis of a novel diterpene)
(A) Structure Determination Using Nuclear Magnetic Resonance Apparatus (NMR) The isolated components were subjected to structure determination using a nuclear magnetic resonance apparatus (300 MHz, manufactured by VARIAN). Deuterated chloroform (CDCl 3 ) was used as the solvent. Data showing the measurement results of 1 H-NMR spectrum are shown in FIG. 1 and Table 1, respectively. Data showing the measurement results of the 13 C-NMR spectrum are shown in FIG. 2 and Table 1, respectively. Data showing the measurement results of HMBC and HH COZY are shown in Table 1, respectively.
単離精製した成分について分子量を測定した。分子量はエレクトロスプレーイオン化質量分析法（ESI-MS）を採用し、LC-MS/MS（ウォータズ社製、G2-QTOFシステム）を用いて行った。その結果を図３に示す。
その結果、Positiveモードでm/z 554.27（M＋NH4）＋に、ピーク示したことにより分子量５３６であることを確認した。
（ｃ）赤外線吸収スペクトル
単離精製した成分について赤外線吸収スペクトル（IR）を測定した。赤外線吸収スペクトルは赤外分光光度計（600-IR、Agilent社製）を用いた。結果を図４に示す。縦軸が透過率、横軸が波数（wavenumber [cm-1]）を示す。その結果、IR（KBr）νmax, 2970, 1761, 1722cm-1に吸収を確認した。
As a result, it was confirmed that the molecular weight was 536 by showing a peak at m / z 554.27 (M + NH 4 ) + in the positive mode.
(C) Infrared absorption spectrum An infrared absorption spectrum (IR) of the isolated and purified component was measured. For the infrared absorption spectrum, an infrared spectrophotometer (600-IR, manufactured by Agilent) was used. The results are shown in FIG. The vertical axis represents the transmittance, and the horizontal axis represents the wave number (wavenumber [cm −1 ]). As a result, absorption was confirmed at IR (KBr) ν max , 2970, 1761, 1722 cm −1 .
（ｄ）その他の測定
単離精製した成分について旋光度（optical rotation）と融点を測定した。旋光度は旋光計（HORIBA SEPA-500、堀場製作所社製）、融点は融点測定器を用いた。その結果、[α]20 D=+46°（c 0.01, MeOH）、融点（mp）115-115.5℃であった。
(D) Other measurements The optical rotation and melting point of the isolated and purified components were measured. An optical rotation meter (HORIBA SEPA-500, manufactured by Horiba Seisakusho) was used for the optical rotation, and a melting point measuring device was used for the melting point. As a result, [α] 20 D = + 46 ° (c 0.01, MeOH) and melting point (mp) 115-115.5 ° C.
以上の結果より、単離精製した成分は、下記一般式（２）で表されるカセアリン系のクレロダン骨格を有するジテルペンであり、１８，１９−エポキシ−２−オキソクレロダ−３，１２，１４−トリエン−６，１８，１９−トリオール１８，１９−ジアセタート６−ベンゾエート（18,19-Epoxy-2-Oxocleroda-3,12,14-triene-6,18,19-triol 18,19-diacetate 6-benzoate）（Ｃ31Ｈ36Ｏ8、分子量５３６）と決定した。尚、下記一般式（２）中においてＡｃはアセチル基を示す。炭素のナンバリングを併せて示す。 From the above results, the isolated and purified component is a diterpene having a catherine-based clerodane skeleton represented by the following general formula (2), and 18,19-epoxy-2-oxocreroda-3,12,14-triene. 6,18,19-triol 18,19-diacetate 6-benzoate (18,19-Epoxy-2-Oxocleroda-3,12,14-triene-6,18,19-triol 18,19-diacetate 6-benzoate ) (C 31 H 36 O 8 , molecular weight 536). In the following general formula (2), Ac represents an acetyl group. The carbon numbering is also shown.
試験例１において得られたブラジル・パラナ産ブラウンプロポリスのエタノール抽出液中の、下記表２に記載される主な成分について、下記の条件にて定量分析を行った。
The main components described in Table 2 below in the ethanol extract of Brazilian Parana brown propolis obtained in Test Example 1 were quantitatively analyzed under the following conditions.
同様に、キク科植物のバッカリス・ドラクンクリフォリアを主たる起源植物としているブラジル・ミナスジェライス州原産のグリーンプロポリスについても、試験例１と同様の方法にてエタノール抽出液を得て、下記表２に記載される主な成分について、下記の条件にて定量分析を行った。 Similarly, an ethanol extract was obtained in the same manner as in Test Example 1 for green propolis native to Minas Gerais, Brazil, whose main plant was the asteraceae Baccaris dracuncrifolia. The main components described in 1 were quantitatively analyzed under the following conditions.
ＨＰＬＣ機器：UPLC（ACQUITY UPLC H-Class, Waters社製）、PDA（ACQUITY UPLC PDA）
カラム：ACQUITY BEH C18（内径２．１ｍｍ×長さ５０ｍｍ、Waters社製）
移動相：Ａ液（水＋０．１％リン酸）、Ｂ液（アセトニトリル＋０．１％リン酸）
３０％Ｂ液（０分）→８０％Ｂ液（１０分）→８０％Ｂ液（１４分）のグラジエント
カラム温度：４０℃
流速：０．４ｍＬ／分
検出波長：PDA１９５〜４００ｎｍ（１９５，２３０，２４０ｎｍにて定量）
定量結果を、表２に示す。
HPLC equipment: UPLC (ACQUITY UPLC H-Class, Waters), PDA (ACQUITY UPLC PDA)
Column: ACQUITY BEH C 18 (inner diameter 2.1 mm × length 50 mm, manufactured by Waters)
Mobile phase: Liquid A (water + 0.1% phosphoric acid), liquid B (acetonitrile + 0.1% phosphoric acid)
Gradient of 30% B solution (0 minutes) → 80% B solution (10 minutes) → 80% B solution (14 minutes) Column temperature: 40 ° C
Flow rate: 0.4 mL / min Detection wavelength: PDA 195-400 nm (quantitative determination at 195, 230, 240 nm)
The quantitative results are shown in Table 2.
（試験例４：一般式（１）に示される新規ジテルペンの癌細胞増殖抑制活性の評価）
癌細胞株として４種類の株、LNCaP（ヒト前立腺癌由来）、MCF-7（ヒト乳癌由来）、DLD-1（ヒト大腸癌由来）及びA549（ヒト肺癌由来）を用いた。LNCaP、MCF-7及びDLD-1は１０％の非働化FBSを含むRPMI-1640を、A549は１０％の非働化FBSを含むDMEMをそれぞれ培地として用い、３７℃、５％CO2雰囲気下で培養した。細胞数の測定は、テトラゾリウム塩（WST-8）の還元による発色を利用したCell Counting kit-8（CCK-8）を用いて行った。
(Test Example 4: Evaluation of cancer cell growth inhibitory activity of a novel diterpene represented by the general formula (1))
Four types of cancer cell lines, LNCaP (derived from human prostate cancer), MCF-7 (derived from human breast cancer), DLD-1 (derived from human colon cancer) and A549 (derived from human lung cancer) were used. LNCaP, MCF-7, and DLD-1 used RPMI-1640 containing 10% inactivated FBS, and A549 used DMEM containing 10% inactivated FBS, respectively, at 37 ° C. and 5% CO 2 atmosphere. Cultured. The number of cells was measured using Cell Counting kit-8 (CCK-8) utilizing color development by reduction of tetrazolium salt (WST-8).
各癌細胞を１．０×１０４cells/well（A549は０．５×１０４cells/well）で９６ウエルプレートに播種した。２４時間の培養後、下記表３に示される化合物又はプロポリスを培地に添加した。７２時間の培養後、培地を除去し、１０％CCK-8溶液を含む各細胞の培地を加え、３７℃、５％CO2雰囲気下で１時間の発色反応を行った。反応液の吸光度（４５０ｎｍと６３０ｎｍ）を測定し、細胞生存率を算出した。細胞生存率からソフトGraphPad Prism 5.02Jを用いて、癌細胞増殖を５０％阻害する濃度（IC50）及びその幾何平均値を算出した。各被験物質に対する３回の繰り返し試験におけるIC50の幾何平均値の結果を表３に示す。 Each cancer cell was seeded in a 96-well plate at 1.0 × 10 4 cells / well (A549 is 0.5 × 10 4 cells / well). After culturing for 24 hours, the compounds or propolis shown in Table 3 below were added to the medium. After culturing for 72 hours, the medium was removed, a medium for each cell containing 10% CCK-8 solution was added, and a color reaction was performed for 1 hour at 37 ° C. in a 5% CO 2 atmosphere. The absorbance (450 nm and 630 nm) of the reaction solution was measured, and the cell viability was calculated. From the cell viability, a concentration (IC 50 ) that inhibits cancer cell proliferation by 50% and its geometric mean value were calculated using soft GraphPad Prism 5.02J. Table 3 shows the results of geometric mean values of IC 50 in three repeated tests for each test substance.
次に、上記実施形態及び別例から把握できる技術的思想について、以下に追記する。
（ａ）原料としてのナンヨウスギ科及びイイギリ科から選ばれる少なくとも一種を起源植物として作られるプロポリス原塊からエタノールを含有する溶媒を用いて得られるプロポリス抽出物に対し、下記一般式（１）に示される新規ジテルペンの含有量を増加させた新規ジテルペン高含有プロポリス抽出物。
Next, the technical idea that can be grasped from the above embodiment and other examples will be described below.
(A) For a propolis extract obtained by using a solvent containing ethanol from a propolis ingot produced using at least one species selected from the cedar family and phyceae as a raw material, the following general formula (1) A novel diterpene-rich propolis extract with an increased content of the new diterpene.
Claims (7)
原料としてのナンヨウスギ科及びイイギリ科から選ばれる少なくとも一種を起源植物として作られるプロポリス原塊から抽出溶媒を用いて抽出処理する工程を含む新規ジテルペンの製造方法。 In the manufacturing method of the novel diterpene of Claim 1,
A method for producing a novel diterpene, comprising a step of extracting at least one kind selected from a cedar family and a lilyceae as a raw material from a propolis bulk produced as a source plant using an extraction solvent.
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