JP6214237B2 - セルロース系バイオマスを糖化するための粗酵素液およびその利用 - Google Patents

Description

本発明は、新規セルラーゼおよびその利用に関するものであり、特に、セルロース系バイオマスを糖化するセルラーゼに関するものである。

植物性バイオマスのエネルギー変換は、再生可能なエネルギーソースとして重要である。そのようなエネルギー変換技術としては、油性植物種子の利用、セルロースの糖化および発酵によるエタノール生産、さらには直接的なガス化などが考えられており、その一部は実用化レベルに至っている。その中でも最も注目されているのが、植物性バイオマス（セルロース系バイオマス）のエタノール化技術である。すなわち、セルロース系バイオマスを糖化することによって得られる還元糖は、アルコール発酵原料として適している。そのため、セルロース系バイオマスを糖化する技術は、バイオエタノール工業に大きく寄与する。

植物性バイオマス（セルロース系バイオマス）の中でも、間伐材、オガクズ等の木質系バイオマスの糖化について、多くの研究が行われている。特許文献１〜４には、木質系バイオマスを好適に糖化する酵素が記載されている。

特開２００３−７０４７５号公報（２００３年３月１１日公開） 特開２０１０−１７８６７７号公報（２０１０年８月１９日公開） 特開２０１１−１４７４４５号公報（２０１１年８月４日公開） 国際公開ＷＯ２００８／１０８１１６パンフレット（２００８年９月１２日公開）

一方、農業における圃場残渣であるイナワラ、サトウキビの搾り粕等の草本系バイオマスについても、有効利用が検討されている。特に、イネ科植物は、農業だけでなく、金属汚染土壌の植物による浄化（ファイトレメディエーション）にも利用され得るため、その有効利用が強く求められている。

しかしながら、セルロース系バイオマスを糖化する酵素であっても、木質系バイオマスを好適に糖化する酵素については、特許文献１〜４に記載のように有望なものが見つかっているが、イナワラや牧草種などのイネ科植物バイオマスを好適に糖化することができる酵素はこれまで知られていない。

本発明は、上記課題に鑑みてなされたものであり、セルロース系バイオマスを糖化する酵素であって、特にイネ科植物バイオマスを好適に糖化することができる酵素を提供することを主たる目的とする。

例えば、市販のセルラーゼは、イナワラなどのイネ科植物に対する酵素活性が低い。イナワラは、セルロース性物質の割合がセルロース３５：ヘミセルロース３５：リグニン６であり、木材などに比べリグニン含有量が少なく、その他の成分（主としてケイ素などの無機成分）が多いことが特徴である。このイナワラに高濃度に含有されるケイ素が、ワラ体の可溶化に伴ってケイ素ポリマーを形成し、酵素反応を阻害していると考えられる。

そこで、本発明者らは、独自の創意に基づき、ケイ素の含有量が高いイネ科植物を主食としている昆虫であれば、イナワラを効率的に糖化し得る酵素を腸内に保有しているのではないかと考え、イネ科植物を食草とする昆虫（イナゴ、ショウリョウバッタおよび二化メイチュウの幼虫）について、それらの腸内に存在する酵素としてのセルラーゼの探索を行った結果、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明に係るセルラーゼは、イナゴ腸由来であって、下記の理化学的性質を有することを特徴としている：（ａ）作用および基質特異性：セルロースを含有する基質を分解し、還元糖を生成する；（ｂ）至適ｐＨ：７．０；（ｃ）至適温度：５０℃；（ｄ）分子量：約５０ｋＤａ、約５３ｋＤａまたは約３０ｋＤａ（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による）。

上記セルラーゼは、さらに下記の理化学的性質を有することが好ましい：（ｅ）作用：イナワラを基質としても酵素活性が低下しない。

上記セルラーゼは、エンド−β−グルカナーゼ又はβ−グルコシダーゼであることが好ましい。

本発明に係る微生物は、イナゴ、ショウリョウバッタまたはメイチュウの腸内に共生する微生物であって、セルロース分解能を有することを特徴としている。

上記微生物は、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｙｌｉｃｕｍ、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｄｉｃｕｍ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｏｓｓｅｌｉｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｏｓｓｅｌｉｉ、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ ｒｈｉｚｏｐｈｉｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｎｅｍａｔｏｄｉｐｈｉｌａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍおよびＢａｃｉｌｌｕｓ ａｒｙａｂｈａｔｔａｉからなる群より選択されるものであることが好ましい。

本発明に係るセルラーゼは、上記微生物由来であるものであってもよい。

本発明に係るケイ素を１質量％以上含有するセルロース系バイオマスを糖化するための糖化用組成物は、上記セルラーゼまたは上記微生物を含有していることを特徴としている。

本発明に係るケイ素を１質量％以上含有するセルロース系バイオマスを糖化するための糖化用キットは、上記セルラーゼまたは上記微生物を備えていることを特徴としている。

本発明に係る糖化用組成物および糖化用キットの糖化の対象となるセルロース系バイオマスは、イネ科植物バイオマスであることがより好ましく、イナワラであることがより好ましく、重金属を含有していてもよい。また、本発明に係る糖化用組成物および糖化用キットは、β−ガラクトシダーゼをさらに有していてもよい。

本発明に係る抗体は、上記セルラーゼに特異的に結合することを特徴としている。

本発明に係るセルロース系バイオマスを糖化する方法は、上記セルラーゼ、上記微生物または上記糖化用組成物と、該セルロース系バイオマスとを接触させる工程を含有することを特徴としている。

上記セルロース系バイオマスを糖化する方法では、上記セルロース系バイオマスが、ケイ素を１質量％以上含有するセルロース系バイオマスであってもよく、イネ科植物バイオマスであってもよく、イナワラであってもよい。

上記セルロース系バイオマスを糖化する方法では、上記セルロース系バイオマスが、例えば、ファイトレメディエーション後の植物のようにカドミウム等の重金属を含有していてもよい。

本発明によれば、セルロース系バイオマスを糖化するセルラーゼであって、特にイネ科植物バイオマスを好適に糖化することができるセルラーゼを提供することができる。

各昆虫の腸内粗酵素液のＣＭＣ分解酵素活性を示すグラフである。 酵素活性測定キットを用いたイナゴ腸内粗酵素液の酵素活性の検定の結果を示す図である。 ろ紙を基質としたときのイナゴ腸内粗酵素液の酵素活性を示すグラフである。 イナワラを基質としたときのイナゴ腸内粗酵素液の酵素活性を示すグラフである。 反応ｐＨを変化させたときのイナゴ腸内粗酵素液の酵素活性を示すグラフである。 反応温度を変化させたときのイナゴ腸内粗酵素液の酵素活性を示すグラフである。 希釈したイナゴ腸内粗酵素液の酵素活性を示すグラフである。 硫安塩析の各分画試料の酵素活性を示すグラフである。 （ａ）は、ゲルろ過クロマトグラフィーの各分画試料のタンパク質量および酵素活性を示すグラフであり、（ｂ）は、酵素活性の高い分画試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。 Ｃｏｎｇｏ Ｒｅｄ Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ培地によって、イナゴの腸内に共生する微生物であって、カルボキシ−メチル−セルロース(ＣＭＣ)分解能を有する微生物を培養した結果を示す図である。 様々な基質に対するイナゴ腸内粗酵素液の酵素活性を示すグラフである。 イナゴ腸内粗酵素液のヘミセルラーゼ活性を示すグラフである。 酵素活性の高い分画試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色した結果を示す図である。

本発明は、新規セルラーゼおよびその利用を提供する。本明細書において「セルラーゼ」とは、セルロースを分解し、還元糖を生成する酵素を指す。また、「セルロース」とは、繊維素とも呼ばれ、植物等に含有されるβ−Ｄ−１，４−グルカンを指し、Ｉ型であってもＩＩ型であってもよく、部分的に置換基によって置換されていてもよく、他の化合物と複合体を形成していてもよい。当該新規セルラーゼは、例えば、各種バイオマスの糖化のために好適に使用することができる。

詳細には、セルラーゼとしては、エンド−１，４−β−グルカナーゼ（ＥＣ３．２．１．４）、エキソセロビオヒドロラーゼ（ＥＣ３．２．１．９１）およびβ−Ｄ−グルコシダーゼ（ＥＣ３．２．１．２１）の２種類の酵素が存在しており、或る局面においては、この３種類の酵素が共同でセルロースを分解すると考えられている。

エンド−１，４−β−グルカナーゼ（ＥＣ３．２．１．４）は、エンド型の作用形式でセルロース鎖を加水分解し、グルコース、セロビオースおよびセロオリゴ糖を生じさせる。エンド−１，４−β−グルカナーゼは、ＣＭＣ（カルボキシメチルセルロース）などの非結晶性の基質をよく加水分解するが、綿繊維などの結晶性セルロースには殆ど作用しない。エキソセロビオヒドロラーゼ（ＥＣ３．２．１．９１）は、セルロースをエキソ形式で加水分解しグルコースまたはセロビオースを特異的に遊離させる酵素である。エキソセロビオヒドロラーゼは、綿繊維やアビセルなどの結晶性セルロースに作用するが、ＣＭＣなどの非結晶性セルロースには殆ど作用しない。β−Ｄ−グルコシダーゼ（ＥＣ３．２．１．２１）は、セロオリゴ糖、セロビオース糖およびβ−グルコシドに作用し、非還元末端からグルコースを遊離する酵素である。

すなわち、上記新規セルラーゼの利用としては、セルロース系バイオマスを糖化するための方法、糖化用組成物、キット等が挙げられる。本発明はまた、セルロース分解能を有する微生物、新規セルラーゼをコードするポリヌクレオチド、新規セルラーゼに特異的に結合する抗体、当該ポリヌクレオチドを含有するベクターおよび当該ポリヌクレオチドが導入された形質転換体を提供する。

〔セルラーゼおよび微生物〕
本発明の一実施形態に係る第一のセルラーゼは、イナゴ腸由来であって、下記の理化学的性質を有する：（ａ）作用および基質特異性：セルロースを含有する基質を分解し、還元糖を生成する；（ｂ）至適ｐＨ：７．０；（ｃ）至適温度：５０℃；（ｄ）分子量：約５０ｋＤａ、約５３ｋＤａまたは約３０ｋＤａ。なお、至適ｐＨは、反応温度５０℃において１刻みで反応ｐＨを変化させたときの至適ｐＨである。また、至適温度は、反応ｐＨ７．０において、１０℃刻みで反応温度を変化させたときの至適温度である。また、分子量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）法により測定された値である。なお、第一のセルラーゼは、至適ｐＨは７．０であるが、ｐＨ４．０〜ｐＨ８．０の範囲で高い活性を呈する。また、第一のセルラーゼは、エンド−β−グルカナーゼ（ＥＣ３．２．１．４）またはβ−グルコシダーゼ（ＥＣ３．２．１．２１）であり得る。

ここで、市販のセルラーゼ等は、イナワラなどのイネ科植物に対する酵素活性が低い。これは、イナワラなどのイネ科植物は、一般の植物に比べてケイ素含量が多いため、このケイ素が可溶化してｐＨに応じてポリマーを形成するため、市販のセルラーゼ等の反応が阻害されると推測される。これに対し、上記第一のセルラーゼは、実施例において示すように、イナワラのようなケイ素を多く含有するセルロース系バイオマスに対しても酵素活性が低下しない。

また、上記第一のセルラーゼは、硫安塩析において、３０〜５０％飽和硫安で沈殿してくるものであり、ゲルろ過クロマトグラフィーにおいて、分子量３０〜５３ｋＤａの分子が溶出する分画に溶出するものである。

また、本発明の一実施形態に係る微生物は、イナゴ、ショウリョウバッタまたはメイチュウ等、イネまたはイネ科植物を食草とする昆虫の腸内に共生する微生物であって、セルロース分解能を有する微生物であり、本発明の一実施形態に係る第二のセルラーゼは、当該微生物由来のセルラーゼである。実施例に示すように、イナゴ、ショウリョウバッタまたはメイチュウ等、イネまたはイネ科植物を食草とする昆虫の腸内に共生する微生物には、セルロース分解能を有する微生物が含まれている。イネ科植物を食草とするイナゴ等の腸内に共生する微生物であるため、第一のセルラーゼと同様に、イナワラのようなケイ素を多く含有するセルロース系バイオマスに対しても酵素活性が低下しないと考えられる。

なお、イナゴの腸内に共生する微生物であって、セルロース分解能を有する微生物としては、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｙｌｉｃｕｍ、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｄｉｃｕｍおよびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｏｓｓｅｌｉｉが挙げられる。また、ショウリョウバッタの腸内に共生する微生物であって、セルロース分解能を有する微生物としては、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａおよびＳｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ ｒｈｉｚｏｐｈｉｌａが挙げられる。また、メイチュウの腸内に共生する微生物であって、セルロース分解能を有する微生物としては、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｎｅｍａｔｏｄｉｐｈｉｌａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍおよびＢａｃｉｌｌｕｓ ａｒｙａｂｈａｔｔａｉが挙げられる。

これらの微生物が分泌するセルラーゼ（例えば、エンド−β−グルカナーゼ）は、各昆虫が自ら腸内に分泌するセルラーゼ（例えば、エンド−β−グルカナーゼ）およびヘミセルラーゼ（例えば、β−ガラクトシダーゼ）と共に、イナワラ等のセルロースおよびヘミセルロースを分解するものと考えられる。

なお、上記第一および第二のセルラーゼの酵素活性は、セルロースを含む基質、特に、イナワラ等のケイ素を多く含有するセルロース系バイオマスを基質として、酵素反応を行い、生成される還元糖の量を公知の方法（例えば、ＤＮＳ法等）によって測定することによって、確認することができる。また、上記微生物のセルロース分解能は、微生物の抽出液について酵素活性を測定することによって確認してもよいし、Ｃｏｎｇｏ Ｒｅｄ Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ培地のような、色素で修飾されたセルロースが添加された培地において微生物を培養することによって確認してもよい。

また、上記第一および第二のセルラーゼは、天然の精製産物、化学合成手順の産物、および原核生物宿主または真核生物宿主（例えば、細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を含む）から組換え技術によって産生された産物を含む。組換え産生手順において用いられる宿主に依存して、上記第一および第二のセルラーゼは、グリコシル化され得るか、または非グリコシル化され得る。さらに、上記第一および第二のセルラーゼはまた、いくつかの場合、宿主媒介プロセスの結果として、開始の改変メチオニン残基を含み得る。

上記第一および第二のセルラーゼは、アミノ酸がペプチド結合しているポリペプチドであってもよいし、ポリペプチド以外の構造を含む複合ポリペプチドであってもよい。本明細書中で使用される場合、「ポリペプチド以外の構造」としては、糖鎖およびイソプレノイド基等を挙げることができるが、特に限定されない。

また、上記第一および第二のセルラーゼは、付加的なポリペプチドを含んでいてもよい。付加的なポリペプチドとしては、例えば、Ｈｉｓ、Ｍｙｃ、Ｆｌａｇ等のエピトープ標識ポリペプチドが挙げられる。

なお、タンパク質を構成するアミノ酸配列中のいくつかのアミノ酸が、このタンパク質の構造または機能に有意に影響することなく容易に改変され得ることは、当該分野において周知である。さらに、人為的に改変させるだけではく、天然のタンパク質において、当該タンパク質の構造または機能を有意に変化させない変異体が存在することもまた周知である。

すなわち、上記第一および第二のセルラーゼは、上述したセルラーゼ酵素活性を失わない範囲で１または数個（例えば、１〜３０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個）のアミノ酸が置換、欠失または付加されている変異体を含む。当業者は、周知技術を使用してタンパク質のアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸を容易に変異させることができる。例えば、公知の点変異導入法に従えば、上記第一および第二のセルラーゼをコードするポリヌクレオチドの任意の塩基を変異させることができる。また、上記第一および第二のセルラーゼをコードするポリヌクレオチドの任意の部位に対応するプライマーを設計して欠失変異体または付加変異体を作製することができる。好ましい変異体は、保存性または非保存性アミノ酸置換、欠失、または付加を有する。これらは、本発明に係るセルラーゼ酵素活性を変化させない。また、これらの変異体は、上記第一または第二のセルラーゼに対し、アミノ酸配列において、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、または９９％以上の同一性を有していることが好ましい。

（製造方法）
一実施形態において、上記第一のセルラーゼは、イナゴの腸から上記第一のセルラーゼを精製することによって得ることができる。すなわち、周知の方法（例えば、細胞または組織を破壊した後に遠心分離して可溶性画分を回収する方法）でイナゴの腸から細胞抽出液を調製した後、この細胞抽出液から周知の方法（例えば、硫安沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィー）によって精製する工程が好ましいが、これらに限定されない。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）が精製のために用いられる。また、精製工程は、例えば、各分画試料について、酵素活性を測定しながら精製を行うことにより、確実に目的のセルラーゼを取得することができる。

また、一実施形態において、上記第二のセルラーゼは、イナゴ、ショウリョウバッタまたはメイチュウの腸または糞から採取したセルロース分解能を有する微生物の抽出液から、上記第一のセルラーゼと同様の手法により、上記第二のセルラーゼを精製することによって得ることができる。

また、一実施形態において、上記微生物は、イナゴ、ショウリョウバッタまたはメイチュウの腸または糞から採取した微生物を培養することによって得ることができる。上記微生物の培養は、例えば、磨砕した腸または糞を含む試料液をＣｏｎｇｏ Ｒｅｄ Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ培地等のセルロース分解能を検出し得る培地に播き、所定の間隔で、セルロース分解能を示したコロニーを新しい培地に植え継ぐことによって行うことができる。

また、当業者であれば、上記第一および第二のセルラーゼについて、公知の方法によってアミノ酸配列を解析することにより、上記第一および第二のセルラーゼをコードするポリヌクレオチドの塩基配列を容易に取得することができる。これにより、以下の方法によっても、上記第一および第二のセルラーゼを製造することができる。

すなわち、他の実施形態において、上記第一および第二のセルラーゼは、当該セルラーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを用いる方法により製造してもよい。例えば、１つの局面において、上記第一および第二のセルラーゼの生産方法は、上記ベクターが組換え発現系において用いられることが好ましい。組換え発現系を用いる場合、上記第一および第二のセルラーゼをコードするポリヌクレオチドを組換え発現ベクターに組み込んだ後、公知の方法により発現可能な宿主に導入し、宿主内で翻訳されて得られるポリペプチドを精製するという方法などを採用することができる。組換え発現ベクターは、プラスミドであってもなくてもよく、宿主に目的ポリヌクレオチドを導入することができればよい。好ましくは、上記第一および第二のセルラーゼの生産方法は、上記ベクターを宿主に導入する工程を包含する。

このように宿主に外来ポリヌクレオチドを導入する場合、発現ベクターは、外来ポリヌクレオチドを発現するように宿主内で機能するプロモーターを組み込んであることが好ましい。組換え的に産生されたポリペプチドを精製する方法は、用いた宿主、ポリペプチドの性質によって異なるが、タグの利用等によって比較的容易に目的のポリペプチドを精製することが可能である。

本実施形態の他の局面において、上記第一および第二のセルラーゼの生産方法は、上記ベクターが無細胞タンパク質合成系において用いられることが好ましい。無細胞タンパク質合成系を用いる場合、種々の市販のキットが用いられ得る。好ましくは、上記第一および第二のセルラーゼの生産方法は、上記ベクターと無細胞タンパク質合成液とをインキュベートする工程を包含する。

無細胞タンパク質合成系は細胞内ｍＲＮＡやクローニングされたｃＤＮＡにコードされているさまざまなタンパク質の同定等に広く用いられる手法であり、無細胞タンパク質合成系（無細胞タンパク質合成法、無細胞タンパク質翻訳系とも呼ぶ）に用いられるのが無細胞タンパク質合成液である。

無細胞タンパク質合成系としては、コムギ胚芽抽出液を用いる系、ウサギ網状赤血球抽出液を用いる系、大腸菌Ｓ３０抽出液を用いる系、および植物の脱液胞化プロトプラストから得られる細胞成分抽出液が挙げられる。一般的には、真核生物由来遺伝子の翻訳には真核細胞の系、すなわち、コムギ胚芽抽出液を用いる系またはウサギ網状赤血球抽出液を用いる系のいずれかが選択されるが、翻訳される遺伝子の由来（原核生物／真核生物）や、合成後のタンパク質の使用目的を考慮して、上記合成系から選択されればよい。

なお、種々のウイルス由来遺伝子産物は、その翻訳後に、小胞体、ゴルジ体等の細胞内膜が関与する複雑な生化学反応を経て活性を発現するものが多いので、各種生化学反応を試験管内で再現するためには細胞内膜成分（例えば、ミクロソーム膜）が添加される必要がある。植物の脱液胞化プロトプラストから得られる細胞成分抽出液は、細胞内膜成分を保持した無細胞タンパク質合成液として利用し得るのでミクロソーム膜の添加が必要とされないので、好ましい。

本明細書中で使用される場合、「細胞内膜成分」は、細胞質内に存在する脂質膜よりなる細胞小器官（すなわち、小胞体、ゴルジ体、ミトコンドリア、葉緑体、液胞などの細胞内顆粒全般）が意図される。特に、小胞体およびゴルジ体はタンパク質の翻訳後修飾に重要な役割を果たしており、膜タンパク質および分泌タンパク質の成熟に必須な細胞成分である。

さらに他の実施形態において、上記第一および第二のセルラーゼの生産方法は、本発明に係るポリペプチドを化学合成することを特徴とする。当業者は、上記第一および第二のセルラーゼのアミノ酸配列に基づいて周知の化学合成技術を適用すれば、上記第一および第二のセルラーゼを化学合成できることを、容易に理解する。

以上のように、上記第一および第二のセルラーゼを生産する方法によって取得されるポリペプチドは、天然に存在するポリペプチドであっても、人為的に作製されたポリペプチドであってもよい。また、上述した種々の工程以外の工程を包含する生産方法も本発明の技術的範囲に属する。

〔糖化方法、糖化用組成物および糖化用キット〕
一実施形態において、上記セルラーゼは、セルロース系バイオマスを糖化するために用い得、より好ましくは、草本系バイオマスまたはイネ科植物バイオマスを糖化するために用いる得、特に、イナワラを糖化するために用い得る。糖化の結果得られた還元糖は、特に限定されないが、エタノール等の有用な有機化合物を製造するための原料として好適に用いることができる。すなわち、本発明の一実施形態に係るセルロース系バイオマスを糖化する方法は、上記セルラーゼと、セルロース系バイオマスとを接触させる工程を含有する。また、他の実施形態において、セルロース系バイオマスを糖化する方法は、上記セルロース分解能を有する微生物と、セルロース系バイオマスとを接触させる工程を含有するものであってもよい。

なお、本明細書において「セルロース系バイオマス」とは、セルロースを含有するバイオマスを指し、廃棄物系バイオマスであってもよいし、資源作物系バイオマスであってもよく、また、木質系バイオマスであってもよいし、草本系バイオマスであってもよい。また、本明細書において「木質系バイオマス」とは。木本植物の木質部またはその処理物を指し、「草本系バイオマス」とは、草本植物またはその処理物を指す。また、「イネ科植物バイオマス」とは、イネ科植物またはその処理物を指す。木質系バイオマスの例としては、スギ、ユーカリ、ヒノキ、マツ、ヤナギ、それらのオガクズ等が挙げられる。また、草本系バイオマスの例としては、イネ、イナワラ、モミガラ、ムギ（コムギ、オオムギ）、ムギワラ、サトウキビ、サトウキビの搾り粕、トウモロコシ、トウモロコシの葉茎、ソルガム、アシ、ススキ、芝および牧草等のグラス類などが挙げられ、そのうち、イネ科植物バイオマスの例としては、イネ、イナワラ、ムギ（コムギ、オオムギ）、ムギワラ、サトウキビ、サトウキビの搾り粕、トウモロコシ、ソルガム、アシ、ススキ、芝および牧草等のグラス類などが挙げられる。

また、本発明の一実施形態に係るセルラーゼは、実施例に示すように、イナワラのようなケイ素を多く含有するセルロース系バイオマスに対して優れた酵素活性を有している。それゆえ、一実施形態において、セルロース系バイオマスを糖化する方法は、ケイ素を１質量％以上含有するセルロース系バイオマスを糖化する方法であり得る。ケイ素を１質量％以上含有するセルロース系バイオマスとしては、特に限定されないが、例えば、イネ科植物バイオマスが挙げられる。特にイネは、ケイ素が必須栄養であり、ケイ素が欠乏すると軟弱になり倒伏したり、病中害に抵抗性がなくなるため、ケイ酸カルシウム肥料を施肥して生育される。そのため、イナワラには数％から多い場合は１２〜１３％のケイ素が含まれることになる。

また、上記セルラーゼまたは上記微生物と、セルロース系バイオマスとを接触させる方法は、特に限定されないが、例えば、混合攪拌した後に加温するといった方法を用いることができる。

また、本発明の一実施形態に係るセルロース系バイオマスを糖化する方法は、上記セルラーゼまたは上記微生物と、セルロース系バイオマスとを接触させる工程の他にも、セルロース系バイオマスを磨砕する工程、セルロース系バイオマスを脱リグニンする工程、ならびに、バイオマスの種類に応じた、リグニン分解、亜臨界処理、および微生物処理といった工程をさらに包含していてもよい。

また、本発明の一実施形態に係るセルロース系バイオマスを糖化する方法は、例えば、ファイトレメディエーション後の植物のようにカドミウム等の重金属を含有しているセルロース系バイオマスを糖化するものであり得る。本実施形態によれば、金属汚染土壌の植物による浄化（ファイトレメディエーション）にも利用した植物を有効利用することができる。

例えば、Ｃｄ高吸収性のイネ「長香穀」は、吸収したＣｄを地上部へ移行しやすいこと、Ｃｄの高移行がｑＣｄＴ７遺伝子によって行われていること、Ｃｄの高移行はＯｓＨＭＡ３遺伝子がＣｄを膜輸送する機能を喪失したことが原因であることが明らかとなっている。本実施形態に係るバイオマスを糖化する方法によれば、このようなバイオマスを糖化することができるため好ましい。

一実施形態において、セルロース系バイオマスを糖化するための糖化用組成物および糖化用キットが提供される。本発明の一実施形態に係る糖化用組成物は、上記セルラーゼおよび／または上記微生物を含んでいることを特徴としており、本発明に係る糖化用キットは、上記セルラーゼおよび／または上記微生物を備えていることを特徴としている。なお、上記セルラーゼの酵素活性を利用するための組成物およびキットを、本明細書中において「糖化用組成物」および「糖化用キット」と称する。

なお、本明細書中で使用される場合、「組成物」は各種成分が一物質中に含有されている形態であり、「キット」は各種成分の少なくとも１つが別物質中に含有されている形態であることが意図される。本発明に係る糖化用キットは、本発明に係るポリペプチド（またはポリヌクレオチド）、並びに他の酵素、補酵素などが同一容器内に備えられていても、別々に備えられていてもよい。

一実施形態において、セルロース系バイオマスを糖化するための糖化用組成物および糖化用キットは、本発明に係るセルラーゼまたは微生物を複数種類含んでいてもよく、より好ましくは、本発明に係る第一のセルラーゼを複数種類含んでおり、特に好ましくは、本発明に係るエンド−β−グルカナーゼおよびβ−グルコシダーゼ（ＥＣ３．２．１．２１）の両方を含み得る。

また、一実施形態において、本発明に係る糖化用組成物は、イナゴ腸由来のヘミセルラーゼ、特に、β−ガラクトシダーゼをさらに含有していてもよい。これにより、セルロース系バイオマスに含まれるガラクトンなどのヘミセルロースを糖化して、より効率的に還元糖を生成することができる。

なお、ヘミセルロースは、植物の細胞壁を構成するセルロースおよびペクチン以外の多糖と定義されている。このヘミセルロースを分解する酵素は、ヘミセルラーゼと総称され、キシラン分解酵素のエンド−１，４−β−Ｄ−キシラナーゼ（ＥＣ３．２．１．８）およびエキソ−１，４−β−キシロシダーゼ（ＥＣ３．２．１．２７）、マンナン分解酵素のβ−Ｄ−マンノシダーゼ（ＥＣ３．２．１．２５）およびエンド−１，４−β−Ｄ−マンナナ−ゼ（ＥＣ３．２．１．７８）、ガラクタン分解酵素のβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ（ＥＣ３．２．１．２３）、エンド−１，４−β−Ｄ−ガラクタナーゼ（ＥＣ３．２．１．８９）およびエンド−１，３−β−Ｄ−ガラクタナ−ゼ（ＥＣ３．２．１．９０）、ならびに、アラビナン分解酵素のα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ（ＥＣ３．２．１．５５）があり、これらは多糖を単糖に分解する。

また、本発明の一実施形態に係るセルラーゼは、実施例に示すように、イナワラのようなケイ素を多く含有するセルロース系バイオマスに対して優れた酵素活性を有している。それゆえ、一実施形態において、糖化用組成物および糖化用キットは、ケイ素を１質量％以上含有するセルロース系バイオマスを糖化するための糖化用組成物および糖化用キットであることが好ましく、ケイ素を２質量％以上、３質量％以上、または５質量％以上含有するセルロース系バイオマスを糖化するための糖化用組成物および糖化用キットであることがより好ましい。

なお、糖化用組成物および糖化用キットが糖化する対象であるセルロース系バイオマスは、本発明に係るセルロース系バイオマスを糖化する方法において糖化する対象であるセルロース系バイオマスと同じであり、一実施形態において、イネ科植物バイオマスであることがより好ましく、イナワラであることがさらに好ましく、重金属を含有しているものであり得る。

また、本実施形態に係る糖化用組成物は、さらに、緩衝液等を含有していてもよい。また、本実施形態に係る糖化用キットは、さらに、緩衝液、キットの取扱説明書（紙または情報記録媒体）等を含有していてもよい。

〔ポリヌクレオチド、ベクター、形質転換体、抗体〕
（ポリヌクレオチド）
一実施形態において、上記セルラーゼをコードするポリヌクレオチドが提供される。当業者であれば、精製されたセルラーゼから、公知の方法に従って、そのアミノ酸配列を容易に取得することができる。そして、上記セルラーゼのアミノ酸配列が得られた場合、当該セルラーゼをコードするポリヌクレオチドの塩基配列を容易に設計することができる。なお、本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は、「遺伝子」、「核酸」または「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。本明細書中で使用される場合、用語「塩基配列」は、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」と交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、ＣおよびＴと省略される）の配列として示される。

また、本発明の一実施形態に係るポリヌクレオチドは、上記セルラーゼのアミノ酸配列に対応する塩基配列の変異体を含む。本明細書中においてポリヌクレオチドに関して用いられる場合、用語「変異体」は、特定のポリペプチドの活性と同じ活性を保持しているポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが意図される。すなわち、当該変異体は、上記セルラーゼのアミノ酸配列に対応する塩基配列に対して、１または数個の塩基が置換、欠失または付加されている塩基配列からなるポリヌクレオチド；あるいは、上記セルラーゼのアミノ酸配列に対応する塩基配列の相補配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るポリヌクレオチドであり得る。

本発明に係るポリヌクレオチドは、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態、またはＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）で存在し得る。ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であり得る。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、コード鎖（センス鎖としても知られる）であり得るか、または、非コード鎖（アンチセンス鎖としても知られる）であり得る。

本明細書中で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド」は、ヌクレオチドが数個ないし数十個結合したものが意図され、「ポリヌクレオチド」と交換可能に使用される。オリゴヌクレオチドは、短いものはジヌクレオチド（二量体）、トリヌクレオチド（三量体）といわれ、長いものは３０マーまたは１００マーというように重合しているヌクレオチドの数で表される。オリゴヌクレオチドは、より長いポリヌクレオチドのフラグメントとして生成されても、化学合成されてもよい。

本発明に係るポリヌクレオチドはまた、その５’側または３’側で上述のタグ標識（タグ配列またはマーカー配列）をコードするポリヌクレオチドに融合され得る。

ハイブリダイゼーションは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）に記載されている方法のような周知の方法で行うことができる。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなり（ハイブリダイズし難くなる）、より相同なポリヌクレオチドを取得することができる。適切なハイブリダイゼーション温度は、塩基配列やその塩基配列の長さによって異なり、例えば、アミノ酸６個をコードする１８塩基からなるＤＮＡフラグメントをプローブとして用いる場合、５０℃以下の温度が好ましい。

本明細書中で使用される場合、用語「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、ハイブリダイゼーション溶液（５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む）中にて４２℃で一晩インキュベーションした後、約６５℃にて０．１×ＳＳＣ中でフィルターを洗浄することが意図される。ポリヌクレオチドの「一部」にハイブリダイズするポリヌクレオチドによって、参照のポリヌクレオチドの少なくとも約１５ヌクレオチド（ｎｔ）、そしてより好ましくは少なくとも約２０ｎｔ、さらにより好ましくは少なくとも約３０ｎｔ、そしてさらにより好ましくは約３０ｎｔより長いポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）が意図される。このようなポリヌクレオチドの「一部」にハイブリダイズするポリヌクレオチド（オリゴヌクレオチド）は、本明細書中においてより詳細に考察されるような検出用プローブとしても有用である。

（ベクターおよび形質転換体）
本発明に係るポリヌクレオチドは、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列またはベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの配列を含むものであってもよい。言い換えれば、本発明にかかるベクターは、上記本発明にかかるポリヌクレオチドを含むものである。上記本発明にかかるポリヌクレオチドを含むものであれば、その他の構成は特に限定されるものではない。

本発明にかかるベクターを構成するベースとなるベクターとしては、宿主に対して好適なベクターが適宜選択され得る。例えば、ベースとなるベクターとしては、プラスミド、ファージ、コスミド、アデノウイルス、またはレトロウイルスなどを使用することが可能であるが、これらに限定されない。

本発明にかかるベクターとしてプラスミドベクターを用いる場合、例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）、ｐＵＣ１８などが使用できる。この場合、ベクターが導入される宿主としては、例えば、酵母、大腸菌（エシェリヒア・コリーＷ３１１０（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、エシェリヒア・コリーＣ６００、エシェリヒア・コリーＪＭ１０９、エシェリヒア・コリーＤＨ５α）、昆虫細胞、哺乳類細胞などが利用可能である。

更に、具体的には、上記宿主として、大腸菌（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉなど）等の細菌、酵母（例えば、出芽酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、分裂酵母Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅなど）、昆虫細胞、線虫（例えば、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓなど）、アフリカツメガエル（例えば、Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓなど）の卵母細胞、哺乳類細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、およびＢｏｗｅｓ黒色腫細胞）や各種ヒト培養細胞などを用いることが可能であるが、これらに限定されない。また、本明細書中で使用される場合、用語「形質転換体」には、細胞、組織または器官だけでなく、生物個体をも含まれる。

本発明にかかるベクターは、導入されるべき宿主に依存して、発現制御領域（例えば、プロモーター、ターミネーター、および／または複製起点等）を含有することが可能である。プロモーターとしては、ウイルス性プロモーター（例えば、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター等）などが挙げられるが、これに限定されない。

上記ベクターは、少なくとも１つの選択マーカーを含むことが好ましい。このようなマーカーとしては、アンピシリン、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、ネオマイシン耐性遺伝子などが挙げられる。上記選択マーカーを用いれば、本発明にかかるポリヌクレオチドが宿主に導入されたか否か、さらには宿主中で確実に発現しているか否かを確認することができる。

上記宿主に本発明にかかるベクターを導入する方法としては特に限定されるものではないが、例えば、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。更に具体的には、エシェリヒア属に属する宿主微生物にベクターを導入する場合は、カルシウムイオンの存在下で組換えＤＮＡを導入する方法や、エレクトロポレーション法を用いる方法が適用され得る。その他、市販のコンピテントセル（例えば、コンピテントハイＪＭ１０９、コンピテントハイＤＨ５α；東洋紡績製）を用いて遺伝子導入が行われても良い。

本発明にかかるベクターを構築するには、本発明にかかるポリヌクレオチド（遺伝子）を分離および精製した後、制限酵素処理などを用いて切断した該ポリヌクレオチドの断片と、ベースとなるベクターを制限酵素で切断して得た直鎖ポリヌクレオチドとを結合閉鎖させて構築することができる。結合閉鎖する際には、ベクターおよび該ポリヌクレオチドの性質に応じてＤＮＡリガーゼなどが使用され得る。本発明のベクターを複製可能な宿主に導入した後、ベクターのマーカーおよび酵素活性の発現を指標としてスクリーニングして、本発明のポリヌクレオチド（遺伝子）を含有する形質転換体を得ることができる。よって、本発明にかかるベクターには薬剤耐性遺伝子などのマーカー遺伝子が含まれていることが好ましい。

なお本発明は、上記本発明にかかるベクターで形質転換された形質転換体を包含する。本発明にかかるベクターによって形質転換される宿主は、特に限定されないが、上述したように酵母、大腸菌、昆虫細胞、および哺乳類細胞などが挙げられる。

（抗体）
また、一実施形態において、上記セルラーゼに結合する抗体、特に、上記セルラーゼと特異的に結合する抗体が提供される。本発明の一実施形態に係る抗体は、上記セルラーゼに結合し得るものであれば限定されず、上記セルラーゼに対するポリクローナル抗体等でもよいが、上記セルラーゼに対するモノクローナル抗体であることが好ましい。モノクローナル抗体は、性質が均一で供給しやすい、ハイブリドーマとして半永久的に保存ができるなどの利点を有する。

本明細書中で使用される場合、用語「抗体」は、免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭおよびこれらのＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント、Ｆｃフラグメント）を意味し、例としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単鎖抗体および抗イディオタイプ抗体が挙げられるがこれらに限定されない。

なお、「抗体」は、種々の公知の方法に従えば作製され得る。例えば、モノクローナル抗体は、当該分野において公知の技術（例えば、ハイブリドーマ法（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．およびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｎａｔｕｒｅ ２５６，４９５−４９７（１９７５））、トリオーマ法、ヒトＢ−細胞ハイブリドーマ法（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４，７２（１９８３））およびＥＢＶ−ハイブリドーマ法（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，７７−９６（１９８５））などを参照のこと）を用いれば容易に作製され得る。

また、ペプチド抗体は、当該分野に公知の方法（例えば、Ｃｈｏｗ，Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：９１０−９１４；およびＢｉｔｔｌｅ，Ｆ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２３４７−２３５４（１９８５）（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。）に従えば容易に作製され得る。

ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）_２ならびに本発明に係る抗体の他のフラグメントが、本明細書中で開示される方法に従って使用され得ることは、当業者には明白である。このようなフラグメントは、代表的には、パパイン（Ｆａｂフラグメントを生じる）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）_２フラグメントを生じる）のような酵素を使用するタンパク質分解による切断によって産生され得る。あるいは、上記セルラーゼに結合するフラグメントは、組換えＤＮＡ技術の適用または化学合成によって産生され得る。

このように、本実施形態に係る抗体は、上記セルラーゼと特異的に結合するフラグメント（例えば、ＦａｂフラグメントおよびＦ（ａｂ’）_２フラグメント）を備えていればよく、異なる抗体分子のＦｃフラグメントとからなる免疫グロブリンも本発明に含まれることに留意すべきである。

つまり、本発明の目的は、上記セルラーゼと特異的に結合する抗体およびその利用を提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載した個々の免疫グロブリンの種類（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧまたはＩｇＭ）、抗体作製方法等に存するのではない。したがって、上記各方法以外によって取得される抗体も本発明の範囲に属することに留意しなければならない。

（１．昆虫の採取）
イネ科植物を食草とする昆虫であるイナゴ、ショウリョウバッタ、およびメイチュウを、日本大学生物資源科学部生物環境科学研究センター敷地内の水稲棚田において採取し、−８０℃に凍結して保管した。

イナゴは直翅目バッタ科のグループに属し、雄の体長は３０ｍｍ前後、雌の体長は４０ｍｍ前後である。前胸下に突起を有し、後足脛節が端に広がり、全体的に緑色であるが、背面は褐色である。水田または湿地に棲み、特にイネ科植物を食草とする。

ショウリョウバッタは直翅目バッタ科の一種であり、雄の体長は５０ｍｍ前後、雌の体長は８０ｍｍ前後である。根元が太く先が細まっている剣状で平たい触覚を有し、前翅の先端が尖っており、後足腿節の膝部に小刺を有し、全体は緑色、褐色または両者の班である。日本全土に広く分布し、主に草原に棲むが、海岸にも棲息する。

メイチュウはメイガ（鱗翅目メイガ科）の幼虫であり、イネの青枯れ、褐色枯れ、枯死を引き起こす害虫として知られている。幼虫の体長は１０ｍｍ前後であり、イネの根ぎわ、下茎部内等に食い込んで生活し、数本の茎を移り食い、３〜７週間でさなぎとなり、さらに５〜１０日間で蛾となる。

（２．腸内ｐＨの測定）
凍結保存しておいた昆虫を氷上にて解凍し、ハサミおよびピンセットを用いて腸を摘出した。摘出した腸をハサミにより細かくきざみ、腸内ｐＨをｐＨ計（ｔｗｉｎ ｐＨメータ、ＨＯＲＩＢＡ）を用いて測定した。結果、イナゴの腸内ｐＨは６．５であり、ショウリョウバッタの腸内ｐＨは６．５であり、メイチュウの腸内ｐＨは８．０であった。

（３．腸内粗酵素液の調製）
凍結保存しておいた昆虫を氷上にて解凍し、腸を摘出した。各昆虫１匹の腸１個に対し、０．１Ｍリン酸またはクエン酸緩衝液（２．で測定した各昆虫の腸内ｐＨに合わせてｐＨを調整したもの）を０．５ｍＬ加え、氷上においてガラスホモジナイザーを用いて磨砕した。さらに、高速冷却遠心機（ＭＸ−３０１、ＴＯＭＹ）を用いて１２０００ｒｐｍ、４℃、５分間の条件で遠心し上清を回収する操作を２回行い、腸内粗酵素液を得た。

（４．腸内粗酵素液のＣＭＣ分解酵素活性の測定）
３．で得た各昆虫の腸内粗酵素液について、基質としてＣＭＣ（Ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）を用いて、セルロースを分解する酵素活性を測定した。ＣＭＣは、セルロースにカルボキシルメチル基が導入されてなる水溶性の高分子である。酵素活性の測定は、酵素がＣＭＣを加水分解することによって生じる還元糖をＤＮＳ（Ｄｉｎｉｔｒｏ ｓａｌｉｃｔｌｉｃ ａｃｉｄ）法により定量することにより行った。

具体的には、３．で得た各昆虫の腸内粗酵素液に対し、２％（ｗ／ｖ）ＣＭＣ含有５０ｍＭクエン酸緩衝液（２．で測定した各昆虫の腸内ｐＨに合わせてｐＨを調整したもの）を基質として加え、３０℃において３０分間インキュベートし、ＣＭＣからの還元糖生成量をＤＮＳ法により測定した。

結果、図１に示すように、ＣＭＣから最も多くの還元糖を生成した腸内粗酵素液はイナゴのものであり、次いでショウリョウバッタのものであり、メイチュウの腸内粗酵素液は還元糖を殆ど生成しなかった。このことから、イナゴおよびショウリョウバッタ、特にイナゴは、ＣＭＣ分解酵素を有しており、イネ科植物を食べたとき、腸内酵素により効率よくセルロースを糖化して吸収していると考えられる。

（５．イナゴ腸内酵素の検定）
４．においてイナゴ腸内粗酵素液がＣＭＣ分解能を有することが明らかとなった。そこで、精製されていない試料からも各種の酵素活性を検出することができる市販の酵素活性測定キットを用いて、セルロースの分解に関与する酵素であるβ−グルコシダーゼの存否を確認した。

まず、凍結保存しておいたイナゴを氷上にて解凍し、腸を摘出した。腸１個に対し滅菌生理食塩水２．０ｍＬを加え、氷上においてペレットミキサーを用いて磨砕した。さらに、高速冷却遠心機（ＭＸ−３０１、ＴＯＭＹ）を用いて１２０００ｒｐｍ、４℃、５分間の条件で遠心し上清を回収する操作を２回行い、酵素活性測定キット（アピザイムキット、ＢＩＯＭＥＲＩＥＵＸ）を用いてイナゴ腸内酵素の種類を確認した。

結果、図２に示すように、β−グルコシダーゼに対応するウェル（１７）が発色し、β−グルコシダーゼの存在を確認した。なお、β−グルコシダーゼは、セロオリゴ糖、セロビオース、およびβ−グルコシドに作用し、非還元末端からグルコースを遊離する酵素である。

また、図２に示すように、アルカリフォスファターゼに対応するウェル（２）、ナフトール−ＡＳ−ＢＩ−フォスフォヒドロラーゼに対応するウェル（１２）、β−ガラクトシダーゼに対応するウェル（１４）、およびβ−グルクロニダーゼに対応するウェル（１５）の発色が特に強いことを確認した。

以上から、イナゴ腸内粗酵素液には、β−グルコシダーゼが存在するとともに、他にもヘミセルラーゼ類等の様々な酵素が含まれていることを確認した。

（６．イナゴ腸内粗酵素液と市販セルラーゼとの比較）
また、イナゴ腸内粗酵素液によるＣＭＣの分解が確認されたため、イナゴ腸内粗酵素液が、ＣＭＣより糖化し難い基質であるろ紙およびイナワラを分解し得るか否かを確認した。

（６−１．ろ紙分解能の測定）
１５ｍＬチューブに、基質として幅１．０ｃｍ、長さ６．０ｃｍのろ紙（約５０ｍｇ、ワットマン製、ＦＩＬＴＥＲ ＰＡＰＥＲＳ １、Ｑｕａｎｉｔａｔｉｖｅ Ｃｉｒｃｌｅｓ、直径１５０ｍｍ、Ｃａｔ Ｎｏ．１００１−１５０）を入れ、３．で得たイナゴ腸内粗酵素液を０．５ｍＬ加えた。なお、当該ろ紙は、α-セルロース含有量が最低９８％となるように処理された高品質コットンリターからなる。また、同様に、１５ｍＬチューブに同一のろ紙を入れ、市販のセルラーゼ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ由来セルラーゼ、ＣＥＬＬＵＬＹＳＩＮ Ｃｅｌｌｕｌａｓｅ、ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ、至適作用条件ｐＨ４．０および４０℃）の酵素液０．５ｍＬ（約２Ｕ）を加えた。各々にｐＨ６．６に調整した５０ｍＭクエン酸緩衝液１．０ｍＬを混合して、５０℃において１時間インキュベートし、ＤＮＳ法により還元糖量を測定した。結果を図３に示す。

（６−２．イナワラ分解能の測定）
イナワラについては、元から含まれる還元糖を除くため、イナワラ（Ｃｄ高吸収性イネ「長香穀」）をミキサーにより粉砕し、目開き５ｍｍの篩に掛け、その篩下を１０倍量の蒸留水と混合し、沸騰水中で５分間加熱した後、ろ紙でろ過し、その残渣を乾燥させたものを用いた。なお、乾燥処理後のイナワラにおけるケイ素の含有量は、Ｓｉとして６．３７質量％であった。

１５ｍＬチューブに、基質として還元糖を除いたイナワラ約５０ｍｇを入れ、基質としてろ紙を用いた場合と同様に還元糖量を測定した。結果を図４に示す。

図３に示すように、ろ紙を基質とした場合には、イナゴ腸内粗酵素液による還元糖の生成量は、市販のセルラーゼと同程度の少ない量であった。一方、図４に示すように、イナワラを基質とした場合には、イナゴ腸内粗酵素液による還元糖の生成量は著しく大きい値であり、市販のセルラーゼによる還元糖の生成量を遙かに超えていた（約４０倍）。このことから、イナゴ腸内粗酵素液は、イナワラを基質としても酵素活性が低下しない、優れたイナワラ糖化酵素を含んでいると考えられる。

（７．イナゴ腸内粗酵素液の至適ｐＨの測定）
凍結保存しておいたイナゴ１０匹から摘出した腸１０個に、ｐＨ５．０に調整した０．１Ｍクエン酸緩衝液５．０ｍＬを加え、３．と同様にイナゴ腸内粗酵素液を調製した後、ｐＨ５．０に調整した０．１Ｍクエン酸緩衝液によって、１０倍に希釈した。次いで、１５ｍＬチューブへ、基質として６．と同様のろ紙またはイナワラを入れ、得られたイナゴ腸内粗酵素液０．５ｍＬを加えた。さらに、ｐＨ４．０、５．０、６．０、７．０および８．０に夫々調整した０．１Ｍ緩衝液（ｐＨ４．０〜５．０はクエン酸緩衝液、ｐＨ６．０〜８．０はリン酸緩衝液）１．０ｍＬを加えて混合した。その後、５０℃で１時間インキュベートし、ＤＮＳ法で生成した還元糖量を測定した。結果を図５に示す。なお、図５では、還元糖量はイナゴ腸内粗酵素液のタンパク質含量当たりの値で示している。イナゴ腸内粗酵素液のタンパク質含量は、Ｂｒａｆｏｒｄ法を用いたプロテインアッセイ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）により測定した。

図５に示すように、ろ紙およびイナワラの何れを基質としたときでも、ｐＨ７．０において最も酵素活性が高くなっていた。そして、イナワラを基質としたときには、ｐＨ５．０〜８．０の範囲において一定の活性を示していた。これは、イナゴ腸内粗酵素液中に、複数の酵素が存在していることに起因するものと考えられる。また、イナワラを基質としたときに、ｐＨ４．０において急激に活性が低くなったが、これは、酸性条件によってイナワラ糖化酵素のタンパク質の変性が生じたものと考えられる。

（８．イナゴ腸内粗酵素液の至適温度の測定）
凍結保存しておいたイナゴ１０匹から摘出した腸１０個に、ｐＨ５．０に調整した０．１Ｍクエン酸緩衝液５．０ｍＬを加え、３．と同様にイナゴ腸内粗酵素液を調製した後、ｐＨ５．０に調整した０．１Ｍクエン酸緩衝液によって、１０倍に希釈した。次いで、１５ｍＬチューブへ、基質として６．と同様のろ紙またはイナワラを入れ、得られたイナゴ腸内粗酵素液０．５ｍＬを加えた。さらに、ｐＨ７．０に調整した０．１Ｍリン酸緩衝液１．０ｍＬを加えて混合した。なお、ｐＨ７．０は、７．で得た至適ｐＨである。その後、反応温度を３０℃、４０℃、５０℃、６０℃に夫々設定して１時間インキュベートし、ＤＮＳ法で生成した還元糖量を測定した。結果を図６に示す。なお、図６では、還元糖量はイナゴ腸内粗酵素液のタンパク質含量当たりの値で示している。タンパク質含量はプロテインアッセイ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）により測定した。

図６に示すように、反応温度が５０℃のときに酵素活性が最も高くなり、６０℃で減少した。これは、反応温度の上昇に伴う酵素反応の反応速度の上昇と、熱による変性とのバランスによるものであり、最も効率よく作用する温度は５０℃と考えられる。

（９．イナゴ腸内粗酵素液の濃度変化に伴うイナワラ糖化能の変化）
凍結保存しておいたイナゴ１０匹から摘出した腸１０個に、ｐＨ５．０に調整した０．１Ｍクエン酸緩衝液５．０ｍＬを加え、３．と同様にイナゴ腸内粗酵素液を調製した後、ｐＨ５．０に調整した０．１Ｍクエン酸緩衝液によって、２倍、５倍および１０倍に夫々希釈した。次いで、１５ｍＬチューブへ、基質として６．と同様のイナワラを入れ、各倍率に希釈されたイナゴ腸内粗酵素液０．５ｍＬを加えた。さらに、ｐＨ７．０に調整した０．１Ｍリン酸緩衝液１．０ｍＬを加えて混合した。なお、ｐＨ７．０は、７．で得た至適ｐＨである。その後、反応温度を５０℃に設定して１時間インキュベートし、ＤＮＳ法で生成した還元糖量を測定した。なお、５０℃は、８．で得た至適温度である。結果を図７に示す。なお、図７では、還元糖量はイナゴ腸内粗酵素液のタンパク質含量当たりの値で示している。タンパク質含量はプロテインアッセイ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）により測定した。

図７に示すように、イナゴ腸内粗酵素液を２倍、５倍、１０倍と希釈していく程、タンパク質１ｍｇ当たりの還元糖量が多くなった。これは、イナゴ腸内粗酵素液を希釈する程にイナワラ糖化酵素の活性が高まることを示している。この要因としては、イナゴ腸内粗酵素液中には様々な物質が存在しており、イナゴ腸内粗酵素液を希釈することによって、これらの物質の濃度が薄められて、イナワラ糖化酵素の活性が高まるものと考えられる。このことから、イナゴ腸内粗酵素液を精製することにより、イナワラ糖化酵素の活性がさらに高まると考えられる。

（１０．イナゴ腸内粗酵素液の粗分画）
上述したように、イナゴ腸内粗酵素液のタンパク質当たりの還元糖生成量が希釈により向上したことから、精製により高い活性を呈することが示唆された。そのため、まず、硫安塩析により、イナゴ腸内粗酵素液の粗分画を行った。

（１０−１．イナゴ腸内粗酵素液の調製）
氷上において、イナゴから摘出した腸４０個に、プロテアーゼ阻害剤（Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｍｉｘ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）２００μＬを加えたｐＨ７．０に調整した５０ｍＭリン酸緩衝液２０ｍＬを加えて、ガラスホモジナイザーを用いて磨砕し、高速冷却遠心機（ＣＲ２２ＧＩＩ、日立）を用いて１２０００ｒｐｍ、４℃、５分間の遠心操作を２回行い、イナゴ腸内粗酵素液を得た。

（１０−２．硫安分画）
続いて、得られたイナゴ腸内粗酵素液を硫安塩析した。硫安塩析はタンパク質を安定的に処理し得る方法であり、一般に、タンパク質を硫安塩析により分画する際には、３０〜６０％飽和の範囲で、１０％飽和間隔で順番に塩析を行い、目的タンパク質が何れの濃度で沈殿するのかを予め調べておく必要がある。なお、硫安濃度を増加させたときの塩析のされ方はタンパク質の種類によって異なり、３０％飽和硫安の状態で分子量の非常に大きいタンパク質、タンパク質複合体、タンパク質脂質複合体（リポタンパク質）等が沈殿し、６０％飽和まで増加させると酵素を含む多くのタンパク質が沈殿し、約８０％飽和まで増加させると殆ど全てのタンパク質が沈殿する。

まず、５０ｍＬチューブに、得られたイナゴ腸内粗酵素液と、当該イナゴ腸内粗酵素液の１／１０程度のｐＨ７．０に調整した２００ｍＭリン酸緩衝液とを加えてよく混合した。そこへ、予め乳鉢で砕いておいた硫酸アンモニウム（硫安）を少量ずつ溶解させ、３０％飽和状態にしてから１時間放置した。その後、高速冷却遠心機（ＣＲ２２ＧＩＩ、日立）を用いて１５０００ｒｐｍ、４℃、３０分間の遠心操作を行い、上清を新しい５０ｍＬチューブに移して、沈殿を回収した。得られた上清に対して、１０％飽和間隔で飽和度を増加させながら同様の操作を行い、最終的に、３０〜７０％飽和の各沈殿を夫々回収した。各沈殿は、ｐＨ７．０に調整した２０ｍＭリン酸緩衝液１２００μＬに溶かし、３０〜７０％飽和の各分画試料とした。

（１０−３．透析）
続いて、アイスバケツ中に、ｐＨ７．０に調整した２０ｍＭリン酸緩衝液５００ｍＬが入ったビーカーを設置し、３０〜７０％飽和の各分画試料を入れたセルロースチューブ（２４／３２、エーディア、分画分子量１２〜１６ＫＤａ）を入れ、スターラー上で静かに攪拌した。２時間毎にビーカー内の緩衝液を交換し、計６時間攪拌することによって透析を行った。透析後、平衡化した分画試料を回収し、−８０℃で保管した。

（１０−４．分画試料のイナワラ分解能測定）
１５ｍＬチューブへ、基質として６．と同様のイナワラを入れ、透析した分画試料０．５ｍＬを加え、さらにｐＨ７．０に調整した２０ｍＭリン酸緩衝液１．０ｍＬを加えて混合し、反応温度を５０℃として１時間インキュベートし、ＤＮＳ法により還元糖を測定した。結果を図８に示す。なお、図８では、還元糖量は分画試料のタンパク質含量当たりの値で示している。タンパク質含量はプロテインアッセイ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）により測定した。

図８に示すように、３０〜５０％飽和の分画試料において酵素活性が高く、特に５０％飽和の分画試料が最も高い活性を示した。これにより、３０〜５０％飽和硫安で沈殿してくるタンパク質に、イナワラ糖化酵素が多く存在することが示された。

（１１．イナゴ腸内粗酵素液中のイナワラ糖化酵素の精製）
さらなる精製のため、イナゴ腸由来の３０〜５０％飽和硫安分画試料について、カラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５ １０／３００ＧＬ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いたゲルろ過クロマトグラフィーを行った。カラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５ １０／３００ＧＬ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）は、分画範囲３〜７０ｋＤａ、カラムサイズ直径１．０ｃｍ×高さ３０．０ｃｍ、ベット体積２４ｍＬである。

（１１−１．ランニングバッファーの調製）
ｐＨ７．０に調整した５０ｍＭリン酸緩衝液（０．１５Ｍ ＮａＣｌ）を、０．２２μｍメンブレンフィルター（ＩＷＡＫＩ）に掛け、バキュームポンプにより脱気を行い、４℃に冷却することにより、ゲルろ過クロマトグラフィーに用いるランニングバッファーを調製した。

（１１−２．試料の調製）
１０．において得られたイナゴ腸由来の３０〜５０％飽和硫安分画試料を、注射器（１ｍＬテルモシリンジ、ＴＥＲＵＭＯ）を用いて０．２２μｍフィルター（Ｓｙｒｉｎｇｅ Ｄｒｉｖｅｎ Ｆｉｌｔｅｒ Ｕｎｉｔ、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）に掛け、ゲルろ過クロマトグラフィーに供する試料を調製した。

（１１−３．試料の溶出）
ゲルろ過クロマトグラフィーでは、４℃条件下で、試料２５０μＬを流速約０．０７ｍＬ／ｍｉｎでカラムに流した。分画された試料は、フラクションコレクター（ＳＦ−２１２０、ＡＤＶＡＮＴＥＣ）により、１チューブ当たり０．５ｍＬずつ、計８０本（４０ｍＬ）採取した。

（１１−４．吸光度測定）
得られた分画試料の２８０ｎｍにおける吸光度を分光光度計（ＵＶ−１７００、島津製作所）を用いて測定した。結果、図９（ａ）に示すように、主に６つのタンパク質のピークが示された。

（１１−５．イナワラ分解能測定）
この６つのピークに対応する各分画試料について、イナワラ分解能を測定した。測定は、用いる緩衝液をｐＨ７．０に調整した５０ｍＭリン酸緩衝液に変更したこと以外は１０−４．と同様に行った。結果、図９（ａ）に示すように、溶出液量（Ｖｅ）における二つ目のピークに対応する分画試料の酵素活性は高かったが、他のピークでは活性は示されなかった。

そして、活性の高い二つ目のピーク付近に対応するＦ１〜Ｆ４の分画試料（溶出液量１１．５ｍＬ（Ｆ１）、１２．０ｍＬ（Ｆ２）、１２．５ｍＬ（Ｆ３）および１３．０ｍＬ（Ｆ４））についても夫々イナワラ分解能を測定したところ、図９（ａ）に示すように、Ｆ２の酵素活性が最も高く、Ｆ１、Ｆ３およびＦ４についてもＦ２程ではないが活性が示された。

（１１−６．タンパク質の純度検定）
Ｆ１〜Ｆ４の分画試料について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。具体的には、まず、Ｆ２試料２０μＬを等量の２×サンプルバッファーと混合した後、９５℃において３分間加熱した。そのうち７μＬを、ミニゲル用電気泳動装置（ＡＴＴＯ）にセットしたゲル（１２．５％均一濃度ＰＡＧＥＬ、ＡＴＴＯ）のウェルにアプライし、２０ｍＡの電流で約８０分間電気泳動を行った。電気泳動後、ゲルをＣＢＢ染色した。図９（ｂ）に、染色後のゲルの写真を示す。図９（ｂ）に示すように、酵素活性が最も高かったＦ２において、３つのバンドが検出された。この３つのバンドに対応するタンパク質の分子量は、それぞれ約５３ｋＤａ（ｆ１）、約５０ｋＤａ（ｆ２）、約３０ｋＤａ（ｆ３）と推定され、これら三つのタンパク質がイナワラ糖化酵素であると考えられる。なお、これら三つのタンパク質のうち、特にｆ２が、イナワラを効率よく分解して還元糖を精製することができるセルラーゼであると推定される。

（１２．昆虫の腸内に共生するセルロース分解微生物の探索）
自然界において、セルロースは主に微生物の働きによって分解されている。これまでに数多くのセルロース分解微生物が知られている。セルロース分解微生物は、土壌および草食動物の消化管等に生息しており、これらの微生物は菌体外に複数のセルロース分解酵素を分泌して植物体の細胞壁等のセルロースを分解している。そこで、Ｃｏｎｇｏ Ｒｅｄ Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ培地を用いて、イネ科植物を食草とする昆虫の腸内に共生する微生物の中からの、ＣＭＣを分解する能力を有する微生物の分離を試みた。

（１２−１．昆虫の腸および糞からの試料液の調製）
イネ科植物を食草とする昆虫であるイナゴ、ショウリョウバッタ、およびメイチュウを、日本大学生物資源科学部生物環境科学研究センター敷地内の水稲棚田において採取した。イネを入れたそれぞれの飼育容器で各昆虫を一晩飼育し、飼育容器から糞を採取した。昆虫を飼育容器から取り出し、酢酸エチルを染み込ませたガーゼを入れた密閉容器に移し、酢酸エチルによって昆虫が動かなくなってからクリーンベンチに移した。７０％エタノールに漬け、昆虫の表体を滅菌し、滅菌水で洗い流した。その後、ハサミおよびピンセットにより、腸を摘出した。

腸１個または糞５個を１．５ｍＬチューブに入れ、滅菌生理食塩水１．０ｍＬを加え、ペレットミキサーにより磨砕し、試料液とした。

（１２−２．Ｃｏｎｇｏ Ｒｅｄ Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ培地によるセルロース分解微生物の単離）
蒸留水１Ｌに、ＣＭ−Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ（セロゲンＢＳ、第一工業製薬）を１．８８ｇ、ＫＨ_２ＰＯ_４を０．２０ｇ、ＭｇＳＯ_４を０．２５ｇ、Ｇｅｌａｔｉｎを２．００ｇ、Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔを１．００ｇ、Ｃｏｎｇｏ Ｒｅｄを０．２０ｇ、Ａｇａｒを１５．００ｇ混合し、１２１℃で１５分間オートクレーブすることによりＣｏｎｇｏ Ｒｅｄ Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ培地を作製した。

この培地に、１２−１．で調整した試料液を塗沫して、３０℃において２４時間培養した。ここで、Ｃｏｎｇｏ Ｒｅｄ Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ培地では、ＣＭＣ分解能を有する微生物は、コロニー周囲の色素結合セルロースを酵素で分解してハローを生じるため、容易にＣＭＣ分解微生物を選抜することができる。結果、図１０に一例を示すように、イナゴ腸由来の８株、イナゴ糞由来の３株、ショウリョウバッタ糞由来の４株、メイチュウ腸由来の５株、メイチュウ糞由来の４株の計２４株が、コロニー周囲にハローを形成した。

そのため、イナゴ、ショウリョウバッタおよびメイチュウの何れにも、ＣＭＣ分解微生物が存在しており、菌体外にＣＭＣ分解酵素を分泌していることが示された。

また、得られた上記微生物を、以下のように継代培養した。継代培養は、３週間程度で行った。すなわち、約３週間毎に、ＣＭＣの分解を示すハローが生じているコロニーを白金耳でとり、ＬＢ培地（Ｔｒｙｐｔｏｎ １０ｇ／Ｌ、Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ ５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ ５ｇ／Ｌ）に接種した。このＬＢ培地を、３０℃で２４時間、１２１ｒｐｍにて振とう培養し、前述したものと同様の新しいＣｏｎｇｏ Ｒｅｄ Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ培地にストークした。このＣｏｎｇｏ Ｒｅｄ Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ培地を、室温にて２４時間培養し、コロニーの周辺にハローが生じたことを確認した後、４℃で保存した。以上により、上記微生物を首尾よく継代培養することができた。

（１３．異なる基質に対するイナゴ腸由来糖化酵素の糖化能の比較）
６．に示すように、イナゴ腸由来糖化酵素（セルラーゼ）は、ろ紙に対しては、市販のセルラーゼ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ由来セルラーゼ、ＣＥＬＬＵＬＹＳＩＮ Ｃｅｌｌｕｌａｓｅ、ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ、至適作用条件ｐＨ４．０および４０℃）２Ｕとほぼ同程度の糖化能であったが、イナワラに対しては特異的に高い糖化能を有していた。そこで、異なる基質に対するイナゴ腸由来のセルラーゼの糖化能をより詳細に調べるために、各種イネ科植物のセルロースを基質とした場合のイナゴ腸由来のセルラーゼと市販のセルラーゼの糖化能とを比較検討した。基質としては、イナワラに加えて、ソルガムおよびケンタッキー芝を用いた。

（１３−１．糖化前処理（基質中に存在する還元糖の除去））
基質として用いるイナワラ、ソルガムおよびケンタッキー芝の乾燥物を、ミキサーで粉砕し、５ｍｍの篩いを通過させ、篩下を１０倍量の蒸留水と混合し、沸騰湯中で５分間加熱し、ろ紙（ＦＴＬＴＥＲ ＰＡＰＥＲＳ １、Ｗｈａｔｍａｎ）によりろ過した。得られたろ物を、乾燥機（ＣＯＮＶＥＣＴＩＯＮ ＯＶＥＮ ＬＣ−７２２、ＥＳＰＥＣ）内において１０５℃で一晩乾燥させることにより、前処理済みの基質を得た。なお、この前処理は、基質中に元々含まれる還元糖を除いて、測定値のバックグランドを低くするための処理である。

（１３−２．灰分の測定）
前処理済みの基質の一部を、乾燥機内に入れ、１０５℃で４時間程度加熱した。続いて、基質をデシケーター内に移し、冷却して重量を測定した後に、再び乾燥器内で１時間加熱することを、重量の変化が±０．３ｍｇ未満になるまで繰り返して、絶乾した基質を得た。

次いで、絶乾した基質を、０．１ｍｇの精度で０．１ｇ秤取り、るつぼ（マッフル炉、Ｍｕｆｆｌｅ Ｆｕｒｎａｃｅ、ＩＳＵＺＵ）内に入れ、５７５℃で４時間程度加熱した。続いて、基質をデシケーター内に移し、冷却して重量を測定した後に、再び乾燥器内で１時間加熱することを、重量の変化が±０．３ｍｇ未満になるまで繰り返して、灰化した基質を得た。

灰化後の基質の重量を、絶乾重量で割ることにより、絶乾重量に対する灰分の割合として灰分を算出した。なお、灰分には、ケイ素の他、カリウム、マグネシウム、鉄などのミネラルも僅かに含まれるが、主成分はケイ素である。各基質の前処理後の段階での還元糖量および灰分を表１に示す。表１に示すように、基質中に残存する残存還元糖量は、ソルガムおよびケンタッキー芝の方が、イナワラよりも若干高いが、何れも殆ど存在していない。また、灰分は、何れの基質においても同程度であり、かつ、ケイ素の含有量が１％を超えていることを示している。

（１３−３．還元糖量の測定）
測定において用いる基質として、１３−１．において前処理したイナワラ、ソルガムおよびケンタッキー芝の各々５０±１ｍｇと、幅１．０ｃｍ、長さ６．０ｃｍのろ紙（ＦＩＬＴＥＲ ＰＡＰＥＲＳ １、Ｗｈａｔｍａｎ）とをそれぞれ１５ｍｌチューブに入れた。

また、測定において用いる酵素として、３．において得られたイナゴの腸内粗酵素液を１０倍希釈したものと、市販のセルラーゼ（ＣＥＬＬＵＬＹＳＩＮ Ｃｅｌｌｕｌａｓｅ，Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ、ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ、至適作用条件ｐＨ４．０、４０℃）の酔素液約２Ｕとの２種類を用いた。

この両酵素液各々を０．５ｍｌずつ各基質に加え、さらにｐＨ７．０の２０ｍＭリン酸緩衝液１．０ｍｌと混合して５０℃で１時間インキュベートし、ＤＮＳ法により還元糖を測定した。結果を図１１に示す。

図１１に示すように、イナゴ腸由来の糖化酵素液による還元糖精製量は市販のセルラーゼと比較して、イナワラについて約４０倍、ソルガムについて約８倍、ケンタッキー芝について約４倍であり、イナゴ腸由来のセルラーゼはイネ科植物を特異的に糖化する酵素であることが明らかとなった。そして、活性（糖化量）は、基質としてイナワラを用いた場合が、最も高くなった。

（１４．イナゴ腸由来糖化酵素のヘミセルラーゼ活性の検討）
３．において得られたイナゴの腸内粗酵素液について、ヘミセルラーゼの有無を確認した。

（１４−１．キシラン分解関連酵素エンド−１，４−β−Ｄ−キシラナ−ゼ活性の測定）
Ｄ−ＸＹＬＯＳＥ ＡＳＳＡＹ ＫＩＴ（Ｍｅｇａｚｙｍｅ）を用いて、イナゴの腸内粗酵素液のエンド−１，４−β−Ｄ−キシラナ−ゼ活性を測定した。滅菌水２．００ｍｌに腸内粗酵素液試料０．１０ｍｌを加え、さらにｓｏｌｕｔｉｏｎ １を０．４０ｍｌ、ｓｏｌｕｔｉｏｎ ２を０．４０ｍｌ、ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ３を０．０２ｍｌそれぞれ加えた。５分後に分光光度計を用いて３４０ｎｍの吸光度を測定し、続いて、ｓｏｌｕｔｉｏｎ４を０．０５ｍｌ加え、６分以内に３４０ｎｍの吸光度を測定した。そして、ｓｏｌｕｔｉｏｎ４を加えた前後でキシロースの濃度を検討した。結果、図１２に示すように、キシラーゼ活性は検出されなかった。

（１４−２．マンナン分解関連酵素エンド−１，４−β−Ｄ−マンナナ−ゼ活性の測定）
腸内粗酵素液試料０．５ｍｌに、色素標識したアゾ−カロブガラクトマンナン（Ｍｅｇａｚｙｍｅ）であるカロブ（ローカスト）ガラクトマンナンを基質とした溶液０．５ｍｌを加え、攪拌し、４０℃で、１０分間インキュベートした。その後、エタノール２．５ｍｌを加えて高分子の基質を沈殿させ、室温で１０分間放置し、１０００ｇで、１０分間遠心分離を行った。その後、５９０ｎｍの吸光度を測定し、β−マンナナ−ゼ活性を測定した。結果、図１２に示すように、マンナナーゼ活性は検出されなかった。

（１４−３．ガラクタン分解関連酵素β−ガラクトシダーゼ活性の測定）
ｐ−Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ Ｅｎｚｙｍｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ ｗｉｔｈ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、イナゴの腸内粗酵素液のβ−ガラクトシダーゼ活性を測定した。９６ウェルのマイクロプレートリーダーＢｅｎｃｈｍａｒｋ Ｐｌｕｓ（Ｂｌ０−ＲＡＤ）に、ｌｘＲＬＢ２０μｌおよび腸内粗酵素液試料３０μｌを入れ、さらに、基質ＯＮＰＧ（Ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）を含むＡｓｓａｙ Ｂｕｆｆｅｒ（２ｘ）を加え、３７℃で、３０分間反応させた。その後、１Ｍ炭酸ナトリウムを１５０μｌ加え、反応を停止させて分光光度計で４２０ｎｍの吸光度を測定した。結果、図１２に示すように、約１７ｍＵのβ−ガラクトシダーゼ活性が検出された。この結果は、５．におけるアピザイムキットを用いた検定結果と一致する。

（１４−４．アラビナン分解関連酵素α−Ｌ−アラビノフラノシーダーゼ活性の測定）
ＡＲＡＢＬＮＡＮ ＡＳＳＡＹ ＫＩＴ（Ｍｅｇａｚｙｍｅ）を用いて、イナゴの腸内粗酵素液のアラビノース活性を測定した。腸内粗酵素液試料０．１０ｍｌに滅菌水を２．１２ｍｌ、ｓｏｌｕｔｉｏｎ １を２００μｌ、ｓｏｌｕｔｉｏｎ ２を１００μｌそれぞれ加えて、３分後、分光光度計で３４０ｎｍの吸光度を測定した。さらに、ｓｏｌｕｔｉｏｎ ３を２０μｌ加えて混合し、４０℃で１０分間インキュベートした後、分光光度計で３４０ｎｍの吸光度を測定した。結果、図１２に示すように、アラビノシダーゼ活性は検出されなかった。

（１５．イナワラ糖化能を有するタンパク質の質量分析による同定）
１１．において得られたイナワラ糖化酵素の活性が最も高かった分画試料について、質量分析によりタンパク質の同定を行った。

（１５−１．ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるタンパク質の分離）
１１．において得られた分画試料（ｆ２）２５μｌを等量の２×サンプルバッファーと混合し、９５℃で３分間加熱し、ミニゲル用電気泳動装置（ＡＴＴＯ）にセットしたゲル（１２．５％均一濃度ＰＡＧＥＬ、ＡＴＴＯ）のウェルに１５μｌアプライし、２０ｍＡの電流で約８０分間電気泳動を行った。なお、タンパク質の量を確保するため、試料は３レーン流した。

（１５−２．質量分析用の銀染色）
ゲルを取り出し、固定液（５０％メタノール、５％酢酸）の入った容器に入れ、室温で２０分間振とう後、固定液を捨てた。さらに、洗浄液（５０％メタノール）を入れ、室温で１Ｏ分間振とう後、洗浄液を捨てた。次に、増感液（０．０２％Ｎａ_２Ｓ_２０_３）を入れ、室温で１分間振とうした。次に、ＭｉｌｌｉＱ水を入れ、１分間振とうさせた後、水を捨てる操作を３回繰り返した。次に、硝酸銀液（０．１％ＡｇＮＯ_３）を入れ、４℃で２０分間振とうさせた。次に、ＭｉｌｌｉＱ水を入れ、室温で１分間振とうさせた後、水を捨てる操作を３回繰り返した。そして、現像液（０．０４％ＨＣＨＯ、２％Ｎａ_２ＣＯ_３）を入れ、ゲルの染色の様子を見ながら室温で２〜５分間振とうさせた後に、停止液（５％酢酸）を入れ、室温で１０分間振とうした。最後に、ＭｉｌｌｉＱ水を入れ、室温で５分間振とうさせた後、水を捨てる操作を３回繰り返した。

（１５−３．プロテアーゼによるゲル内消化）
以下の作業は全てクリーンルーム内で行った。まず、ＯＨＰシートを敷いたライトボックスにゲルを載せ、メスを用いてゲルの切り出しを行った。図１３に示すように、泳動後のゲルについて、１レーンずつ、ゲルの上端から泳動の終端（上端から６５ｍｍ）まで６ｍｍサイズ毎に１１断片を切り出した。

次いで、ゲルの脱色操作を行った。まず、ゲル片に対して、脱色液（１５ｍＭ フェリシアン化カリウム ５０ｍＭ チオ硫酸ナトリウム）１００μｌを加え、Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒｃｏｍｆｏｒｔ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）を用いて、室温にて、１３，０００ｒｐｍで１０分間振とうし、液を取り除いた。その後、ＭｉｌｌｉＱ水５００μｌを加え、室温にて１３，０００ｒｐｍで１５分間振とうした後、水を取り除く操作を３回繰り返した。さらに、アセトニトリル１００μｌを加え、室温にて１３，０００ｒｐｍで５分間振とうした後、液を取り除いた。以上により、ゲルの脱色を行った。その後、遠心エバポレーターＣＶＥ−２００Ｄを用い、１５分間ゲルを乾燥した。

次いで、還元およびアルキル化操作を行った。まず、タンバク質のＳ−Ｓ結合を切断するための処理として、ゲルに還元液（１０ｍＭＤＴＴ、２５ｍＭ重炭酸アンモニウム）１００μｌを加え、５６℃にて、１３，０００ｒｐｍで１時間振とうした後、液を取り除いた。そして、洗浄用バッファー（２５ｍＭ重炭酸アンモニウム）を加え、室温にて１３．０００ｒｐｍで１０分間振とうした。その後、アルキル化液（５５ｍＭ ヨードアセトアミド、２５ｍＭ重炭酸アンモニウム）１００μｌを加え、遮光して室温にて１３，０００ｒｐｍで４５分間、振とうした後、液を取り除いた。さらに、洗浄用バッファー１００μｌを加え、室温にて１３，０００ｒｐｍで１０分間振とうした。

最後に、ゲル内消化操作を行った。まず、ゲルに脱水液（５０％アセトニトリル、２５ｍＭ重炭酸アンモニウム）を加え、室温にて１３，０００ｒｐｍで１０分間振とう後、液を取り除く操作を２回繰り返した。その後、遠心エバポレーターで１５分間真空にしてゲルを乾燥させた。その後、トリプシン溶液（１０μｇ／ｍｌ、２５ｍＭ重炭酸アンモニウム）３０μｌを加え、氷上で３０分間放置後、余分なトリプシン溶液を取り除き、３７℃で一晩反応させた。その後、抽出液（５０％アセトニトリル、５％トリフルオロ酢酸）５０μｌを加え、室温にて１３．０００ｒｐｍで３０分間振とうした後、液を回収した。さらに抽出液２５μｌを加え、室温にて１３，０００ｒｐｍで３０分振とうした後、液を回収した。この２回分の抽出液を合わせたものを、遠心エバポレーターＣＶＥ−２００Ｄ（ＥＹＥＬＡ）を用いて、乾固するまで乾燥させた。そして、０．１％ギ酸を１３μｌ添加して混合し、Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ５４１５Ｒ（ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）を用いて、４℃にて１２，０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心した。ここから沈殿を吸わないように１２μｌ採取して４℃で保管し、これをゲル内消化された試料として質量分析に用いた。

（１５−４．ＬＣＱ ＤＥＣＡ ＸＰを用いたペプチドの質量分析）
１５−３．において得られた試料について、日本大学生物資源科学部生物環境科学研究センターに設置されたＬＣＱ ＤＥＣＡ ＸＰ（ＴｈｅｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によりＬＣ−ＭＳ／ＭＳ解析を行った。試料は１０μｌを分析に用いた。測定条件は、カラム：Ｌ−Ｃｏｌｕｍｎ Ｍｉｃｒｏ ７１１２９０ Ｆ１１０７５３３−Ｐ ０．２×５０ｍｍ，Ｌ２−Ｃ１８，３μｍ、流速：１．５μＬ／ｍｉｎ、移動相Ａ：９８％水、２％アセトニトリル、０．１％ギ酸、移動相Ｂ：９０％アセトニトリル、１０％水、０．１％ギ酸、グラジェント：Ａ：Ｂ−９５：５（０ｍｉｎ）−５：９５（２０ｍｉｎ）、モニターイオン：ｍ／ｚ４５０〜２０００で行った。

（１５−５．ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ解析結果についてのデータベース検索）
ＮＣＢＩより、セルロース分解関連酵素としてＥＣ３．２．１．４、ＥＣ３．２．１．２１、ＥＣ３．２．１．７４およびＥＣ３．２．１．９１の４種類、ヘミセルロ−ス分解関連酵素としてキシラン分解酵素ＥＣ３．２．１．８およびＥＣ３．２．１．２７、マンナン分解酵素ＥＣ３．２．１．２５およびＥＣ３．２．１．７８、ガラクタン分解酵素ＥＣ３．２．１．２３、ＥＣ３．２．１．８９およびＥＣ３．２．１．９０ならびにアラビナン分解酵素ＥＣ３．２．１．５５の８種類で合計１２種類の１３９３４件のタンパク質のデータベースを取り込んだ。そして、ＢｉｏｗｏｒｋｓＶｅｒ３．３（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、１５−４．における各ゲル断片の質量分析結果から得られた部分アミノ酸配列と、データベース上のセルロース分解関連酵素およびヘミセルロース分解関連酵素の配列とを比較した。

その結果、ゲル断片Ｎ０．５から得られた部分アミノ酸配列（配列番号１）が、既知のエンド−β−グルカナーゼ（ＥＣ３．２．１．４、Ｈｏｄｏｔｅｒｍｏｐｓｉｓ Ｓｊｏｅｓｔｅｄｔｉ、Ｍ．Ｗ．４２７３８、グリコシルヒドロラーゼファミリー９（ＧＨＦ９）、ｇｉ：４４８８５８３０、配列番号２）の第１２位〜第３８位と一致した。

また、ゲル断片ＮＯ．３から得られた部分アミノ酸配列（配列番号３、４）が、既知のβ−グルコシダーゼ（ＥＣ３．２．１．２１、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ Ｍｕｌｔｉｓａｃｃｈａｒｉｖｏｒａｘ、Ｍ．Ｗ．９５０７７、ｇｉ：３３６３９９３７０、配列番号５）の第７４６位〜第７５９位、第８０１位〜第８１３位とそれぞれ一致した。なお、これらの部分アミノ酸配列には、ＰＲＫ１５０９８（β−Ｄ−グルコシダーゼグルコヒドロラーゼ）の領域が存在していた。

また、β−ガラクトシダーゼ（ＥＣ３．２．１．２３）も検出された。この結果は、５．の結果と一致し、イナゴ腸内粗酵素液には、β−ガラクトシダーゼが含まれると考えられる。

以上のことから、イナゴ腸内粗酵素液には、エンド−β−グルカナーゼ（ＥＣ３．２．１．４）およびβ−グルコシダーゼ（ＥＣ３．２．１．２１）が含まれており、イナゴの腸内では、例えば、イナワラのセルロースにエンド−β−グルカナーゼが作用することで、セルロースが加水分解されてセロビオースおよびセロオリゴ糖が生成する。そして、生成したセロビオースおよびセロオリゴ糖にβ−グルコシダーゼが作用することでグルコースを生成していると考えられる。なお、同じくセルラーゼに包摂されるエキソセロビオヒドロラーゼは検出されなかったが、非結晶性セルロースに殆ど作用しないエキソセロビオヒドロラーゼが、イナワラを常食とするイナゴ腸内から検出されなかったことは矛盾しない。

また、イナワラには、セルロースと同程度のヘミセルロースが含まれており、イナゴの腸内ではヘミセルロースのガラクタンが、β−ガラクトシダーゼ（ＥＣ３．２．１．２３）によって分解されガラクトースを生成している可能性が考えられる。

なお、エンド−β−グルカナーゼ（ＥＣ３．２．１．４）は、Ｈｏｄｏｔｅｒｍｏｐｓｉｓ Ｓｊｏｅｓｔｅｄｔｉという昆虫が分泌することが知られており、イナゴの消化酵素であることが示唆される。一方、β−グルコシダーゼ（ＥＣ３．２．１．２１）はＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ Ｍｕｌｔｉｓａｃｃｈａｒｉｖｏｒａｘという微生物が分泌することが知られており、イナゴの腸内に共生する微生物に由来する可能性が考えられる。すなわち、イナゴ腸内では、イナワラをイナゴ自身の消化酵素による糖化とともに、腸内に共生する微生物由来の酵素の両方で糖化していることが考えられる。

（１６．単離したＣＭＣ分解微生物の１６Ｓ ｒＤＮＡ−５００Ｒａｐｉｄ解析）
「株式会社テクノスルガ・ラボ」に委託して、単離したＣＭＣ分解微生物の１６Ｓ ｒＤＮＡ−５００Ｒａｐｉｄ解析を以下のように実施した。

まず、１２−２．において単離したＣＭＣ分解微生物（試料菌株）の各々（イナゴ腸由来菌株Ｉ−１〜８、イナゴ糞由来菌株Ｉ−１〜２、ショウリョウバッタ糞由来菌株Ｄ−１〜２、メイチュウ腸由来菌株Ｄ−１〜２、メイチュウ糞由来菌株Ｈ−１〜２）について、アクロモペプチダーゼ（和光純薬）を用いてＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡに対し、１６Ｓ ｒＤＮＡの部分配列を増幅するためのプライマー（配列番号６、７）およびＰｒｉｍｅ ＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ）を用いて、ＰＣＲ法を実施した。得られた各ＤＮＡ断片について、サイクルシーケンスＢｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏ）およびＣｈｒｏｍａｓ Ｐｒｏ １．５（Ｔｅｃｈｎｅｌｙｓｉｕｍ Ｐｔｙ Ｌｔｄ．）を用いて、塩基配列を決定した。決定した各塩基配列について、国際塩基配列データベースおよび微生物同定用ＤＮＡデータベース＆系統解析システムアポロン２．０（テクノスルガ・ラボ）に対してＢＬＡＳＴ法による相同性検索を行った。表２に、各ＣＭＣ分解生成物について、同定結果および相同率（％）を示す。

表２に示すように、イナゴ腸由来でＣＭＣ分解能を有する菌は、細菌のＥｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｙｌｉｃｕｍおよびＥｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｄｉｃｕｍと同定された。また、イナゴ糞由来でＣＭＣ分解能を有する菌は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｏｓｓｅｌｉｉと同定された。また、ショウリョウバッタ糞由来でＣＭＣ分解能を有する菌は、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａおよびＳｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ ｒｈｉｚｏｐｈｉｌａと同定された。また、メイチュウ腸由来でＣＭＣ分解能を有する菌は、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｎｅｍａｔｏｄｉｐｈｉｌａと同定された。また、メイチュウ糞由来でＣＭＣ分解能を有する菌は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍおよびＢａｃｉｌｌｕｓ ａｒｙａｂｈａｔｔａｉと同定された。

Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｙｌｉｃｕｍ、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｄｉｃｕｍ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｏｓｓｅｌｉｉ、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ ｒｈｉｚｏｐｈｉｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｎｅｍａｔｏｄｉｐｈｉｌａおよびＢａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍおよびＢａｃｉｌｌｕｓ ａｒｙａｂｈａｔｔａｉは、何れも昆虫腸内に共生する細菌であり、エンド−β−グルカナーゼを分泌し、昆虫が自ら腸内に分泌するエンド−β−グルカナーゼと共に、イナワラ等のセルロースを分解するものと考えられる。

なお、イナゴ腸由来菌株Ｉ−４、イナゴ腸由来菌株Ｉ−５、イナゴ腸由来菌株Ｉ−６およびイナゴ腸由来菌株Ｉ−８から得られたＤＮＡ断片の塩基配列は同一であり、同一の菌株と考えられる。また、イナゴ糞由来菌株Ｆ−１およびイナゴ糞由来菌株Ｆ−２から得られたＤＮＡ断片の塩基配列は同一であり、同一の菌株と考えられる。また、メイチュウ腸由来菌株Ｄ−１およびメイチュウ腸由来菌株Ｄ−２から得られたＤＮＡ断片の塩基配列は同一であり、同一の菌株と考えられる。

本発明は、セルロース系バイオマスを原料とする有機化合物の製造分野において利用可能である。

Claims (14)

1. イナゴ腸由来であって、セルラーゼを含み、下記の理化学的性質を有することを特徴とする、ケイ素を１質量％以上含有するセルロース系バイオマスを糖化するための粗酵素液：
   （ａ）作用および基質特異性：セルロースを含有する基質を分解し、還元糖を生成する；
   （ｂ）至適ｐＨ：７．０；
   （ｃ）至適温度：５０℃；
   （ｄ）分子量：約５０ｋＤａ、約５３ｋＤａまたは約３０ｋＤａ（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による）。
2. 上記セルラーゼが、エンド−β−グルカナーゼ又はβ−グルコシダーゼであることを特徴とする請求項１に記載の粗酵素液。
3. 請求項１または２に記載の粗酵素液を含有していることを特徴とするケイ素を１質量％以上含有するセルロース系バイオマスを糖化するための糖化用組成物。
4. 上記セルロース系バイオマスが、イネ科植物バイオマスであることを特徴とする請求項３に記載の糖化用組成物。
5. 上記セルロース系バイオマスが、ケイ素を５質量%以上含有することを特徴とする請求項３に記載の糖化用組成物。
6. 上記セルロース系バイオマスが、イナワラであることを特徴とする請求項３〜５の何れか一項に記載の糖化用組成物。
7. 上記セルロース系バイオマスが、重金属を含有していることを特徴とする請求項３〜６の何れか一項に記載の糖化用組成物。
8. β−ガラクトシダーゼをさらに含有していることを特徴とする請求項３〜７の何れか一項に記載の糖化用組成物。
9. 請求項１または２に記載の粗酵素液を備えていることを特徴とするケイ素を１質量％以上含有するセルロース系バイオマスを糖化するための糖化用キット。
10. セルロース系バイオマスを糖化する方法であって、
    請求項１または２に記載の粗酵素液、または請求項３〜８の何れか一項に記載の糖化用組成物と、該セルロース系バイオマスとを接触させる工程を含有することを特徴とする方法。
11. 上記セルロース系バイオマスが、ケイ素を５質量％以上含有するセルロース系バイオマスであることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
12. 上記セルロース系バイオマスが、イネ科植物バイオマスであることを特徴とする請求項１０または１１に記載の方法。
13. 上記セルロース系バイオマスが、イナワラであることを特徴とする請求項１０〜１２の何れか一項に記載の方法。
14. 上記セルロース系バイオマスが、重金属を含有していることを特徴とする請求項１０〜１３の何れか一項に記載の方法。