JP6201099B2 - 南極産酵母による低温下でのエタノール製造方法 - Google Patents
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Description
(1)ムラキア属菌に属する菌類を用いて、低温下で、高濃度エタノールを製造する方法。
(2)ムラキア属菌に属する菌類を用いて、低温下で、バイオマス酵素糖化液からバイオエタノールを生成する方法。
(3)ムラキア属菌に属する菌類を用いて、低温下で、バイオマスから同時糖化発酵によりバイオエタノールを生成する方法。
(4)非イオン性界面活性剤を添加し、低温下で、バイオマスからの糖化同時発酵による バイオエタノールを生成する方法。
(5)バイオマスがユーカリ由来である上記(2)から(4)いずれかに記載のバイオエタノールの生成方法。
本願発明は、低温で高濃度のアルコール生産をできる低温高濃度アルコール製造法を提供する。より具体的には、本願発明は、ムラキア属菌類を用いることによる、低温で糖液から高濃度のアルコールを製造する方法を提供する。
低温エタノール発酵中は、糖溶液を10 rpmから200 rpm程度の攪拌をすることもできる。
また、本願発明は、バイオマスから、低温でアルコールを生産する方法を提供する。
より具体的には、本願発明は、ムラキア属菌類を用いることによる、リグノセルロース系バイオマスから低温アルコール生産法を提供する。
本願発明の対象となるバイオマスは、当該バイオマスから糖液が調製できるものであれば、いずれのバイオマスでも良いが、例えば、セルロース含有バイオマス、例えば、リグノセルロース系バイオマスを挙げることができる。
本願発明のバイオマス糖化液発酵法には、(1)まず、バイオマスを糖化しバイオマス糖化液を製造し、次にこのバイオマス糖化液を上記ムラキア属菌類を用いて低温でエタノール発酵する2工程に分ける方法、及び(2)バイオマスを糖化すると同時にする上記ムラキア属菌類を用いて低温エタノール発酵する、同時糖化発酵法が包含される。
エタノール生産のためのバイオマスは、例えば、リグノセルロース系バイオマスであれば、廃材等の形体で入手されるが、これを効率よく糖化するために、通常粉砕し、更に酵素法により投下する場合はリグノセルロースが酵素により分解される前処理がなされる。
バイオマス中のセルロース及びヘミセルロースは、糖化処理により、まず、オリゴ糖又はグルコース等の単糖に分解される。糖化処理工程としては、硫酸などによる加水分解処理や、酵素処理があるが、好適には酵素処理によることができる。
本願発明では、バイオマス糖化液は、低温で、アルコール発酵される。低温とは、上記1.低温高濃度エタノール発酵法に記載の条件と同様に、室温20℃以下の低温を意味しているが、好適には、-1℃から20℃の範囲、更に好適には、4℃から15℃の範囲を採用することができる。本発明に用いるムラキア属菌類についても、1.低温高濃度エタノール発酵法に記載の菌株と同じである。具体的には担子菌門ハラタケ亜門シロキクラゲ菌網シストフィロバシディウム目シストフィロバシディウム科ムラキア属の菌類、例えばムラキア・ブロロピス SK-4株 (Mrakia blollopis)(FERM P−22126株)が最も好ましい菌株として上げられる。
前述のように、セルラーゼによる糖化反応が生産物であるセルロース由来のグルコース及びセロビオースが反応液中に蓄積することによりセルラーゼの活性が阻害されることが知られている。この阻害を防ぐために、糖化すると同時にエタノール発酵する、つまり、セルラーゼによる生産物を直ちにエタノール発酵することで、反応液中のセルラーゼによる生産物の濃度を低下して、生産物によりセルラーゼの活性阻害を防ぐことができる。このように糖化処理とエタノール発酵を同時に行う方法は、同時糖化発酵法と呼ばれている。
高濃度グルコースからのエタノール発酵は20 mM クエン酸緩衝液中に120 g/lのグルコースに5 g/l yeast extract, 5 g/l Bacto peptone, 2 g/l NH4Cl, 1 g/l KH2PO4, 0.3 g/l MgSO4・7H2Oを含んだ発酵用培地にYPD 液体培地(10 g/l yeast extract, 20 g/l peptone, 20 g/l glucose)で96時間10℃、 120 rpmの条件で前培養していたムラキア・ブロロピス(FERM P−22126株)8 mlを3000 × g 4℃ 10分間遠心分離し、菌体を回収した。滅菌蒸留水で2回洗浄し再び遠心分離して回収した菌体を滅菌蒸留水1 mlに懸濁したものを接種源として植菌し10℃、 120 rpmの条件で19日間発酵試験を行った。発酵試験開始直後から発酵試験溶液の一部を採取し、12100 × g 4℃、 5分間遠心分離し、上清を回収した。回収した上清はその後、高速クロマトグラフィーにてグルコース濃度とエタノール濃度を測定した。グルコースの定量条件は検出器:日本分光RI-2031、 カラム:Aminex HPX87P、 移動相:イオン交換水、 流速: 0.6 mL / min、 カラム温度:80℃で行った。 エタノールの定量条件は検出器:日本分光RI-2031、 カラム:Aminex HPX87H、 移動相:5mM H2SO4、 流速: 0.6 mL / min、 カラム温度:65℃で行った。 結果を図1に示す。発酵開始からエタノール濃度は徐々に生産されることが確認され、グルコース濃度は徐々に減少した。発酵開始19日後にグルコースは完全に消費された。この条件では発酵終了後、エタノール濃度約48 g/lのエタノールを得た。
リグノセルロース系バイオマスの酵素糖化反応は20 mM クエン酸緩衝液(pH 4.5)にメカノケミカル処理したスギ木粉を200 g/lとなるように加え十分に懸濁した後、株式会社 明治社製Acremozyme セルラーゼを6 FPU/g、 Genencor社製 Optimash BGを20 μl/ g添加し、37℃,120rpmで96時間撹拌しながら加水分解反応をおこなった。反応終了後、0.22μmのフィルターユニットにより糖化液を回収し、実施例1の条件でグルコース濃度を測定した。測定の結果グルコース濃度約40.9 g/lの糖化液を得ることができた。リグノセルロース系バイオマス酵素糖化液からのエタノール発酵はスギ糖化液に5 g/l yeast extract, 5 g/l Bacto peptone, 2 g/l NH4Cl, 1 g/l KH2PO4, 0.3 g/l MgSO4・7H2Oを加え、実施例1の条件で培養を行った接種源を植菌し、10℃ 120 rpm 120時間、発酵試験を行った。発酵試験開始直後から発酵試験溶液の一部を採取し、12100 × g 4℃, 5分間遠心分離し、上清を回収した。回収した上清はその後、高速クロマトグラフィーにて実施例1の条件でグルコース濃度とエタノール濃度の測定を行った。結果を図2に示す。発酵試験開始96時間後にグルコースは完全に消費し、最終的に17.0 g/lのエタノールを得ることができた。
リグノセルロース系バイオマスの酵素糖化反応は20 mM クエン酸緩衝液(pH 4.5)にメカノケミカル処理したユーカリ木粉を200 g/lとなるように加え十分に懸濁した後、株式会社 明治社製Acremozyme セルラーゼを6 FPU/g、 Genencor社製 Optimash BGを20 μl/ g添加し、37℃,120rpmで96時間撹拌しながら加水分解反応をおこなった。反応終了後、0.22μmのフィルターユニットにより糖化液を回収し、実施例1の条件でグルコース濃度を測定した。測定の結果グルコース濃度約40.9 g/lの糖化液を得ることができた。リグノセルロース系バイオマス酵素糖化液からのエタノール発酵はユーカリ糖化液に5 g/l yeast extract, 5 g/l Bacto peptone, 2 g/l NH4Cl, 1 g/l KH2PO4, 0.3 g/l MgSO4・7H2Oを加え、実施例1の条件で培養を行った接種源を植菌し、10℃ 120 rpm 120時間、発酵試験を行った。発酵試験開始直後から発酵試験溶液の一部を採取し、12100 × g 4℃, 5分間遠心分離し、上清を回収した。回収した上清はその後、高速クロマトグラフィーにて実施例1の条件でグルコース濃度とエタノール濃度の測定を行った。結果を図3に示す。発酵試験開始120時間までもグルコースは消費されず、エタノールの生産も認められなかった。
20 mM クエン酸緩衝液(pH 4.5)にメカノケミカル処理したスギ木粉を200 g/l, 5 g/l yeast extract, 5 g/l Bacto peptone, 2 g/l NH4Cl, 1 g/l KH2PO4, 0.3 g/l MgSO4・7H2Oを加え、実施例1の条件で培養を行った接種源を植菌した後、株式会社明治社製Acremozyme セルラーゼを50 FPU/g, Genencor社製 Optimash BGを20 μl/ g添加し、10℃,180rpmで120時間撹拌しながら同時糖化反応をおこなった。同時糖化発酵試験開始直後から同時糖化発酵試験溶液の一部を採取し、12100 × g 4℃、 5分間遠心分離し、上清を回収した。回収した上清はその後、高速クロマトグラフィーにて実施例1の条件でグルコース濃度とエタノール濃度の測定を行った。結果を図4に示す。同時糖化発酵試験開始24時間後に約7.2 g/lのグルコースが生産されその後、同時糖化発酵時間の経過と共にグルコース濃度は減少した。最終的に12.5 g/lのエタノールを得ることができた。
20 mM クエン酸緩衝液(pH 4.5)にメカノケミカル処理したユーカリ木粉を200 g/l, 5 g/l yeast extract, 5 g/l Bacto peptone, 2 g/l NH4Cl, 1 g/l KH2PO4, 0.3 g/l MgSO4・7H2Oを加え、実施例1の条件で培養を行った接種源を植菌した後、株式会社明治社製Acremozyme セルラーゼを50 FPU/g, Genencor社製 Optimash BGを20μl/ g添加し、10℃,180rpmで120時間撹拌しながら同時糖化反応をおこなった。同時糖化発酵試験開始直後から同時糖化発酵試験溶液の一部を採取し、12100 × g 4℃、 5分間遠心分離し、上清を回収した。回収した上清はその後、高速クロマトグラフィーにて実施例1の条件でグルコース濃度とエタノール濃度の測定を行った。結果を図5に示す。同時糖化発酵試験開始24時間後に約11.9 g/lのグルコースが生産されその後、グルコース濃度はほぼ一定に推移した。最終的に14.2 g/lのグルコースが残存し、最大で7.1 g/lのエタノールを得ることができた。
20 mM クエン酸緩衝液(pH4.5)にメカノケミカル処理したスギ木粉を200 g/l, 5 g/l yeast extract, 5 g/l Bacto peptone, 2 g/l NH4Cl, 1 g/l KH2PO4, 0.3 g/l MgSO4・7H2O, 非イオン性界面活性剤として1% (v/v) Tween 80を加え、実施例1の条件で培養を行った接種源を植菌した後、株式会社明治社製Acremozyme セルラーゼを50 FPU/g, Genencor社製 Optimash BGを20 μl/g添加し、10℃,180rpmで120時間撹拌しながら同時糖化反応をおこなった。同時糖化発酵試験開始直後から同時糖化発酵試験溶液の一部を採取し、12100 × g 4℃、 5分間遠心分離し、上清を回収した。回収した上清はその後、高速クロマトグラフィーにて実施例1の条件でグルコース濃度とエタノール濃度の測定を行った。結果を図6に示す。同時糖化発酵試験開始24時間後に約1.5 g/lのグルコースが生産されその後、グルコース濃度は発酵120時間目までにほぼ消化された。最大で13.2 g/lのエタノールを得ることができた。
20 mM クエン酸緩衝液(pH 4.5)にメカノケミカル処理したユーカリ木粉を200 g/l, 5 g/l yeast extract, 5 g/l Bacto peptone, 2 g/l NH4Cl, 1 g/l KH2PO4, 0.3 g/l MgSO4・7H2O、 非イオン性界面活性剤として1% (v/v) Tween 80を加え、実施例1の条件で培養を行った接種源を植菌した後、株式会社明治社製Acremozyme セルラーゼを50 FPU/g, Genencor社製 Optimash BGを20 μl/ g添加し、10℃,180rpmで120時間撹拌しながら同時糖化反応をおこなった。同時糖化発酵試験開始直後から同時糖化発酵試験溶液の一部を採取し、12100 × g 4℃、 5分間遠心分離し、上清を回収した。回収した上清はその後、高速クロマトグラフィーにて実施例1の条件でグルコース濃度とエタノール濃度の測定を行った。結果を図7に示す。同時糖化発酵試験開始24時間後に約7.3 g/lのグルコースが蓄積され、反応終了の時点で約4.7 g/lのグルコースが残存していた。最終的に最大で11.6 g/lのエタノールを得ることができた。
Claims (5)
- ムラキア属に属するムラキア・ブロロピス(FERM P−22126株)を用いて、バイオマス糖化液から、4-15℃の低温下で、17.0g/l以上のエタノールを製造する方法。
- ムラキア属に属するムラキア・ブロロピス(FERM P−22126株)を用いて、低温下で、4-15℃のバイオマスから同時糖化発酵により、7.1g/l以上のエタノールを製造する方法。
- 界面活性剤を添加することを特徴とする、請求項2記載のエタノールを製造する方法。
- バイオマスがユーカリ由来のバイオマスである請求項2又は3に記載のエタノールを製造する方法。
- ムラキア属に属するムラキア・ブロロピス(FERM P−22126株)を用いて、4-15℃の低温下で、糖液から45g/l以上の高濃度のエタノールを製造する方法。
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