JP6199579B2

JP6199579B2 - ミトコンドリア機能回復促進剤

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Publication number: JP6199579B2
Application number: JP2013038404A
Authority: JP
Inventors: 三宅　正治; 正治三宅; 美知子金澤; 正則楢原
Original assignee: 三宅　正治; 正治三宅; 美知子金澤; 正則楢原
Priority date: 2013-02-28
Filing date: 2013-02-28
Publication date: 2017-09-20
Anticipated expiration: 2033-02-28
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Description

本発明は，ミトコンドリア機能回復促進剤に関し，詳しくは，アコニターゼの活性回復に基づくミトコンドリア機能回復促進剤に関するものである。

一酸化窒素（ＮＯ）は，生体内でいわゆる「善玉」としての役割と「悪玉」としての役割の２面性を有する。すなわち，ＮＯは，血管系では内皮細胞から遊離される血管弛緩物質としての，また中枢神経系ではシナプス間隙における神経伝達物質としての役割を有する。ＮＯはまた，ストレスや炎症等により大量に誘導され，種々の慢性疾患，癌，老化等の原因物質の一つと考えられている。ＮＯは脂溶性であり，且つ鉄イオンに対する親和性が著しく強く，ＮＯ−鉄複合体を形成することが知られている。

近年，メタボリックシンドロームと強く関連する糖尿病，心筋梗塞や脳梗塞等の心血管系疾患，アルツハイマー病，パーキンソン病やハンチントン病をはじめとする神経変性疾患，更に癌等は，酸化ストレスによるミトコンドリアの機能低下とそれに伴う細胞死が原因ではないかと注目されている。また心筋虚血，脳虚血，移植臓器，長時間圧迫を受けた組織等，虚血による酸素欠乏状態に置かれていた組織に新鮮な血流を再開させた際，酸素の再供給により生じる種々のフリーラジカルによる強度の酸化ストレスを，ミトコンドリアは受ける。これによりミトコンドリア機能，特にクエン酸回路の働きが障害されＮＡＤＨ生成が停止すると，電子伝達系が働かず，過剰の酸素を消費できないまま，ミトコンドリアの主たる機能である酸化的リン酸化によるＡＴＰの高率産生が不能となる。これはオキシダントによる障害作用と相俟って，そのミトコンドリアを含んだ細胞の死に直結し，組織の急速な破壊を引き起こす（虚血再灌流障害）。虚血再灌流障害を予防又は治療する（増悪の抑制を含む）する目的で，血流の再開に際しラジカルスカベンジャーの投与等の処置がなされてはいるものの，これまでのところ効果が十分に確立された方法はない。

ミトコンドリア内のアコニターゼ（aconitase）は，クエン酸回路（ＴＣＡサイクル）の主要酵素の一つであり，ミトコンドリア内の酸化還元状態によって調節される活性型と不活性型との相互変換により，エネルギー代謝におけるサーキットブレーカーとして働いている。

アコニターゼは，クエン酸からイソクエン酸への立体特異的相互変換を，中間体であるcis−アコニット酸を介して触媒する。アコニターゼの触媒活性は，活性中心に存在する無傷の［４Ｆｅ−４Ｓ］^２＋クラスターに依存している（非特許文献１）。この酵素は，独特な［４Ｆｅ−４Ｓ］^２＋キュバン・クラスターを活性部位に含み，このクラスターは，１個の，特別に変化を受けやすいＦｅ原子（所謂，Ｆｅ_ａ）を有している。この［４Ｆｅ−４Ｓ］^２＋キュバン・クラスターの酸化的崩壊に対する感受性が高いために，細胞の酸化障害のバイオマーカーとして，アコニターゼ活性の喪失が広く用いられている（非特許文献２）。酸化により不活性化されたアコニターゼは，in vitro及びin vivoで，クラスターの還元及びＦｅ（II）の再挿入により速やかに再活性化される（非特許文献３）。しかしながら，［３Ｆｅ−４Ｓ］^＋の還元及び，［３Ｆｅ−４Ｓ］^０中心へのＦｅ（II）の再挿入の生理学的メカニズムは，今のところ知られていない（非特許文献２）。細胞内では，アコニターゼは不活性化と再活性化の動的状態にあり，他方Ｆｅ−Ｓ中心は，スーパーオキサイドアニオン，過酸化水素，分子状酸素，一酸化窒素（ＮＯ），そしておそらくは，ペルオキシナイトライト（ＯＮＯＯ⁻）さえも含む，種々の生理学的オキシダントによる攻撃の脅威に絶えず曝されている。そのようなオキシダントに曝された後にアコニターゼの不活性化が起こることが，報告されている（非特許文献２）。

一酸化窒素（ＮＯ）は，種々の細胞タイプにより産生されるフリーラジカルであり，主として，ヘムタンパク質及びＦｅ−Ｓ中心のＦｅ（III）又はＦｅ（II）イオンと，また分子状酸素やスーパーオキサイドアニオンとも，反応する（非特許文献４，５）。更には，ＮＯは，その分子半径の小ささ及び疎水性のため，細胞質や細胞外の発生源からミトコンドリアへと容易に到達する。ＮＯ合成の誘導やＮＯ供与体への種々のタイプの細胞の曝露が，ミトコンドリアのアコニターゼ（ｍ−アコニターゼ。以下，特に断らない限り，本明細書において，「アコニターゼ」は，「ｍ−アコニターゼ」を指す。）活性の早期損失をもたらすことも，報告されている（非特許文献１）。

ＮＯ仲介型のアコニターゼの不活性化が，マクロファージ（非特許文献７），繊維芽細胞（非特許文献８），腫瘍細胞（非特許文献９〜１０），及び大腸菌（非特許文献１１）を含む種々の細胞において，報告されているが，in vitro研究の結果に幾分議論の余地がある。実際，ブタの心臓のアコニターゼを用いたin
vitro研究で，低濃度のＮＯがアコニターゼを不活性化しない一方，高濃度では中等度の阻害をもたらすことが見出されている（非特許文献１２）。精製された大腸菌アコニターゼ及びヒト組換え細胞質アコニターゼ（c−アコニターゼ）の，ＮＯ依存性不活性化に対する抵抗性も，報告されている（非特許文献１３）。反対に，ＮＯ又はＮＯ供与体による不活性化が，基質の存在下及び非存在下において，ｍ−アコニターゼとｃ−アコニターゼの両方について報告された（非特許文献１４）。これらの知見に合致して，ｍ−アコニターゼの活性型である［４Ｆｅ−４Ｓ］^２＋がＯＮＯＯ⁻により急速且つ直接に酸化されて［３Ｆｅ−４Ｓ］^＋となり，その結果触媒活性の喪失を引き起こすことが見出された（非特許文献１２）。別の報告の１つ（非特許文献１１）も，大腸菌アコニターゼが，ＯＮＯＯ⁻生成と一見無関係にＮＯ仲介型の不活性化に対し，非常に感受性が高いことも報告された。最近になって，ＮＯが，組換えブタｍ−アコニターゼ中の［４Ｆｅ−４Ｓ］^２＋クラスターのＦｅ_ａに結合して，クラスターの完全な崩壊をゆっくりと促すことも報告された（非特許文献６）。

他方，ＮＯは，神経系の細胞において，それらの酸化還元状態に依存して顕著に異なる生物学的効果を有することが示されている。ＮＯは，スーパーオキシドアニオンと反応してペルオキシナイトライト（ＯＮＯＯ⁻）を生成することにより神経毒効果を有する。対照的に，ニトロソニウムイオン（ＮＯ^＋）は，Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体表面のチオール基のＳ−ニトロシル化を介して，神経保護効果を有することが知られている（非特許文献１８，１９）。また，ＮＯ及び関連するニトロソ化合物の効果が，混合ニューロン・グリア培養を用いて調べられ，ＮＯの神経の保護効果及び破壊効果に関して酸化還元に基づくメカニズムが報告されている（非特許文献１８）。更に，ＳＮＰが，高濃度において，Ｃ６グリオーマ細胞において化学的低酸素状態誘発による細胞死を防止すること，及びまたｍ−アコニターゼ活性及びその遺伝子発現を，前立腺癌細胞において低濃度でアップレギュレートすることが知られている（非特許文献２０）。最近，Kim等（非特許文献２１）は，肝細胞の非ヘムＦｅの含量が，種々の細胞毒性レベルのＮＯがアポトーシスをもたらすか壊死をもたらすかを決定していることを示唆している。また，ＮＯが，マクロファージ内（非特許文献２１）で，及び腫瘍細胞内（非特許文献２２）で，ジニトロシル鉄複合体を形成することも知られている。

次式１で示されるβ−シトリル−Ｌ−グルタミン酸（以下，「β−ＣＧ」ともいう。）は，最初に新生ラット脳から単離された化合物であり，その後精巣（主に精子）及び眼（水晶体，網膜）にも高濃度に存在することが知られている。しかしながら，この化合物については，化学合成方法は古くから確立されているものの（非特許文献１５），生理学的にどのような機能を果たしているのかは，これまでのところ十分解明されていない。

我々は最近，β−ＣＧが内因性の低分子量Ｆｅ(II)キレート剤であることを見出している（非特許文献１６）。我々は更に，in vitroの実験系において，［Ｆｅ(II)(β−ＣＧ)］複合体が，還元剤の存在下にアコニターゼのためのＦｅ運搬体としての役割を果たしこれを活性化させる（非特許文献１７）。またペルオキソ二硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）により損傷されたミトコンドリアのアコニターゼを再活性化させることを見出したが，β−ＣＧやクエン酸，［Ｆｅ(II)(クエン酸)］にはそのような効果は認められなかった（非特許文献１７）。

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上記背景において，本発明は，虚血等による酸化ストレスが発症又は進行，増悪の原因になっている上記の疾患や障害に対する予防及び治療剤，並びに治療方法の提供を目的とする。

本発明者らは，ＮＯ供与体が鉄（Ｆｅ）依存性のアコニターゼ活性化を促進することを，同酵素を用いたin vitro実験により見出した。また，無傷のミトコンドリアにおいて，ペルオキソ二硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）により不活性化されたこの酵素のＦｅ依存性の再活性化を，ＮＯ供与体が促進することも見出した。加えて，血清を含む培地を用いたニューロン・グリア混合培養中，ＮＯ供与体がミトコンドリアの活性を高めること，及びＮＯ供与体と［Ｆｅ(II)(β−ＣＧ)］複合体又はβ−ＣＧの同時添加が，酸化ストレスに曝されて障害されたミトコンドリアの活性を有意に高め，ニューロンの生存数を大きく増大させることを見出した。本発明は，これらの発見に基づき，更に検討を重ねて完成させたものである。すなわち，本発明は，以下を提供する。
１．β−シトリル−Ｌ−グルタミン酸又はその薬剤学的に許容し得る塩を含んでなる，ミトコンドリア機能回復促進剤。
２．ＮＯ供与体の投与と併用されるものである，上記１のミトコンドリア機能回復促進剤。
３．酸化ストレス関連疾患の治療用である，上記１又は２のミトコンドリア機能回復促進剤。
４．酸化ストレス関連疾患が，糖尿病合併症，心筋梗塞，脳梗塞，アルツハイマー，パーキンソン，ハンチントン病，癌，又は虚血再灌流障害である，上記３のミトコンドリア機能回復促進剤。
５．虚血再灌流障害が，心筋虚血，脳虚血，又は臓器移植後の虚血再灌流障害である，上記４のミトコンドリア機能回復剤。
６．ミトコンドリア・アコニターゼの再活性化促進剤である，上記１〜５の何れかのミトコンドリア機能回復剤。
７．非経口投与用剤である，上記１〜６の何れかのミトコンドリア機能回復促進剤。
８．酸化ストレス関連疾患の治療又は予防に使用するための，β−シトリル−Ｌ−グルタミン酸又はその薬剤学的許容し得る塩。
９．ＮＯ供与体の投与と併用されるものである，上記８のβ−シトリル−Ｌ−グルタミン酸又はその薬剤学的許容し得る塩。
１０．酸化ストレス関連疾患が，糖尿病合併症，心筋梗塞，脳梗塞，アルツハイマー，パーキンソン，ハンチントン病，癌，又は虚血再灌流障害である，上記８又は９のβ−シトリル−Ｌ−グルタミン酸又はその薬剤学的許容し得る塩。
１１．虚血再灌流障害が，心筋虚血，脳虚血，又は臓器移植後の虚血再灌流障害である，上記１０のβ−シトリル−Ｌ−グルタミン酸又はその薬剤学的許容し得る塩。
１２．酸化ストレス関連疾患の治療又は予防がミトコンドリア・アコニターゼの再活性化促進によるものである，上記８〜１１の何れかのβ−シトリル−Ｌ−グルタミン酸又はその薬剤学的許容し得る塩。
１３．非経口投与されるものである，上記８〜１２の何れかのβ−シトリル−Ｌ−グルタミン酸又はその薬剤学的許容し得る塩。
１４．ミトコンドリアの機能低下を有する患者のミトコンドリアの機能を回復させるための方法であって，有効投与量のβ−シトリル−Ｌ−グルタミン酸又はその薬剤学的に許容し得る塩を該患者に投与することを含んでいる方法。
１５．該患者がＮＯ供与体の投与を受けているものである，上記１４の方法。
１６．酸化ストレス関連疾患の治療又は予防方法である，上記１４の方法。
１７．酸化ストレス関連疾患が，糖尿病合併症，心筋梗塞，脳梗塞，アルツハイマー，パーキンソン，ハンチントン病，癌，又は虚血再灌流障害である，上記１６の方法。
１８．虚血再灌流障害が，心筋虚血，脳虚血，又は臓器移植後の虚血再灌流障害である，上記１７の方法。
１９．ミトコンドリア機能の回復がミトコンドリア・アコニターゼの再活性化の促進によるものである，上記１４〜１８の何れかの方法。
２０．投与が非経口的に行われるものである，上記１〜１９の何れかの方法。

本発明のミトコンドリア機能回復促進剤は，虚血その他種々の原因による酸化ストレスに曝されたミトコンドリアにおいて，活性を喪失したアコニターゼの再活性化を促すことにより，ミトコンドリア機能の回復を促すことができる。アコニターゼはクエン酸回路のサーキットブレーカーであり，この酵素の再活性化はクエン酸回路の作動を可能とし，その結果として，ミトコンドリアにおける酸素の迅速な利用，酸化的リン酸化によるＡＴＰ産生の再開，及び細胞質への迅速なＡＴＰ再供給をもたらす。従って，本発明のミトコンドリア機能回復剤は，酸化ストレスに曝された細胞の生存必須のエネルギー代謝に寄与することから，糖尿病合併症の治療，心筋梗塞，脳梗塞等の心血管系疾患，アルツハイマー病，パーキンソン病やハンチントン病をはじめとする神経変性疾患，癌等を含む，酸化ストレスによるミトコンドリアの機能低下を伴う様々な疾患の治療（進行の抑制を含む）や予防に，また虚血状態の組織への血流の再開に際する虚血再灌流障害の治療（増悪の抑制を含む）や予防に，有用である。

本発明のミトコンドリア機能回復剤は，投与後生体内のＦｅ(II)イオンと複合体［Ｆｅ(II)(β−ＣＧ)］を形成でき，この複合体は，ミトコンドリア内においてアコニターゼの不活性型クラスターにＦｅ(II)を受け渡して活性型クラスターを再生することで，アコニターゼの再活性化を促し，ミトコンドリア機能を回復させることができる。またこの［Ｆｅ(II)(β−ＣＧ)］複合体は，生体内でＮＯと更なる複合体を形成でき，この更なる複合体は，ミトコンドリア内において［Ｆｅ(II)(β−ＣＧ)］複合体からアコニターゼへのＦｅ(II)の受け渡しを助けることで，［Ｆｅ(II)(β−ＣＧ)］複合体のミトコンドリア機能回復を顕著に促進する。［Ｆｅ(II)(β−ＣＧ)］複合体と更なる複合体を形成するＮＯは，内因性に生じているものでもよいが，β−ＣＧの投与と並行してＮＯ供与体を投与してＮＯを補給した場合には，β−ＣＧのミトコンドリア機能回復作用は一層顕著なものとなる。

図１は，Ｆｅ(II)ＡＳの存在下における，種々の阻害剤のアコニターゼ活性に対する効果を示す。縦軸：アコニターゼ活性（μmols/分）。*Ｐ＜0.01：（対照に対する）（一元配置ＡＮＯＶＡ，Tukey―Kramerテスト）図２Ａは，アコニターゼ活性化に対する，ＮＯ供与体であるＳＮＰ，ＳＩＮ，ＮａＮＯ_２，及びＮＯＣ１８の効果を示す。縦軸：アコニターゼ活性（μmols/分）。*Ｐ＜0.01，**Ｐ＜0.05：（対照に対する）（一元配置ＡＮＯＶＡ，Tukey―Kramerテスト）。Ｂ：ブランク（ＤＴＴのみの存在下における活性）。Ｃ：対照（ＤＴＴ及びＦｅ(II)ＡＳの存在下における活性）。図２Ｂは，Ｆｅ(II)ＡＳ及びＤＴＴの存在下における，ＳＮＰ，ＳＩＮ，ＮａＮＯ_２，及びＮＯＣ１８によるアコニターゼの活性化の時間的推移を示す。図２Ｃは，ＤＴＴの存在下における，Ｆｅ(II)ＡＳの存在下又は非存在下でのＳＮＰによる濃度依存性のアコニターゼ活性化を示す。横軸：ＳＮＰ濃度。縦軸：アコニターゼ活性（μmols/分）。図２Ｄは，ＤＴＴの存在下におけるＦｅ(II)ＡＳの存在又は非存在下，ＳＩＮ及びＮＯＣ１８による濃度依存性のアコニターゼ活性化を示す。図３Ａは，ＮＯ供与体により促進されるアコニターゼ活性化に対する，Ｘ／ＸＯの効果を示す。縦軸：アコニターゼ活性（μmols/分）。*Ｐ＜0.01，**Ｐ＜0.05：（対照に対する）（ニ元配置ＡＮＯＶＡ，Tukey―Kramerテスト）図３Ｂは，ＮＯ供与体により促進されるアコニターゼ活性化に対する，ヘム及びＰＴＩＯの効果を示す。Ｂ：ブランク（ＤＴＴのみの存在下での活性）。Ｃ：対照（ＤＴＴ及びＦｅ(II)ＡＳの存在下での活性。Ｎ：ＴＰＩＯ及びヘム不含。*Ｐ＜0.01，**Ｐ＜0.05：（対照に対する）（ニ元配置ＡＮＯＶＡ，Tukey―Kramerテスト）図４Ａは，ＮＯ供与体の存在下における，アコニターゼの活性化に対するＦｅ濃度の影響を示す。縦軸：アコニターゼ活性（μmols/分）。横軸：Ｆｅ(II)濃度図４Ｂは，ＳＩＮの存在下又は非存在下での，アコニターゼ活性化に対するＦｅ(II)ＡＳ及びＳＮＰの効果を示す。縦軸：アコニターゼ活性（μmols/分）。横軸：ＳＮＰ又はＦｅ(II)の濃度。図４Ｃは，ＳＩＮ（1mM）の存在下又は非存在下における，アコニターゼ活性化に対する［Ｆｅ(II)(乳酸)]（0〜0.1mM）及び［Ｆｅ(III)(クエン酸)]（0〜0.1mM）の効果を示す。縦軸：アコニターゼ活性（μmols/分）。横軸：Ｆｅ複合体濃度。図４Ｄは，ＳＩＮ（1mM）の存在下又は非存在下における，アコニターゼ活性化に対する［Ｆｅ(II)(β−ＣＧ)］複合体の効果を示す。縦軸：アコニターゼ活性（μmols/分）。横軸：［Ｆｅ(II)(β−ＣＧ)］濃度。*Ｐ＜0.01（［Ｆｅ(II)(β−ＣＧ)］のみに対する）（ニ元配置ＡＮＯＶＡ）図５Ａは，ＡＰＳにより障害されたミトコンドリアアコニターゼの再活性化に対する，ＮＯ供与体の効果を示す。Blank：Ｆｅ(II)ＡＳ非存在下，対照：Ｆｅ(II)ＡＳ存在下。*Ｐ＜0.01(対照に対する）（一元配置ＡＮＯＶＡ，Tukey―Kramerテスト）。図５Ｂは，ＮＯ供与体により促進されるミトコンドリアアコニターゼ再活性化に対する，ＮＯ消去剤の効果を示す。Blank：Ｆｅ(II)ＡＳ非存在下，対照：Ｆｅ(II)ＡＳ存在下，Ｎ：ＰＴＩＯ非存在下。*Ｐ＜0.01(ＰＴＩＯ不含に対する）（ニ元配置ＡＮＯＶＡ，Tukey―Kramerテスト）。図６Ａは，ニューロン純化培養における，ＭＴＴ還元活性に対するＮＯ供与体の濃度依存性の効果を示す。縦軸：ＭＴＴ活性（対照に対する％），横軸：ＮＯ供与体の濃度。*Ｐ＜0.05（対照に対する）（二元配置ＡＮＯＶＡ，Tukey―Kramerテスト）図６Ｂは，混合ニューロン・グリア培養における，ＭＴＴ還元活性に対するＮＯ供与体の濃度依存性の効果を示す。縦軸：ＭＴＴ活性（対照に対する％），横軸：ＮＯ供与体の濃度。*Ｐ＜0.05（対照に対する）（二元配置ＡＮＯＶＡ，Tukey―Kramerテスト）図６Ｃは，混合ニューロン・グリア培養における，ＤＮＡ含量に対するＮＯ供与体の効果を示す。縦軸：ＤＮＡ含量（対照に対する％）。*Ｐ＜0.01（対照に対する）（ニ元配置ＡＮＯＶＡ，Tukey―Kramerテスト）。図６Ｄは，混合ニューロン・グリア培養における，ＮＯ供与体存在下での，ＭＴＴ還元活性に対するβ−ＣＧ，［Ｆｅ(II)(β−ＣＧ)］及びＦｅ(II)ＡＳの用量依存性の効果を示す。縦軸：ＭＴＴ活性（対照に対する％），横軸：β−ＣＧ，［Ｆｅ(II)(β−ＣＧ)］又はＦｅ(II)ＡＳの濃度。図６Ｅは，［Ｆｅ(II)(β−ＣＧ)］の存在下における，混合ニューロン・グリア培養でのＭＴＴ還元活性に対するＮＯ供与体の効果を示す。縦軸：ＭＴＴ活性（対照に対する％），Ｃｉ：クエン酸，Ｆｅ−Ｃｉ：［Ｆｅ(II)(クエン酸)］，Ｆｅ−ｂ−ＣＧ：［Ｆｅ(II)(β−ＣＧ)］。*Ｐ＜0.01（［Ｆｅ(II)(β−ＣＧ)］のみに対する），**Ｐ＜0.05（ＳＩＮ又はＮＯＣ18単独に対する）（二元配置ＡＮＯＶＡ，Tukey―Kramerテスト）図７は，混合ニューロン・グリア培養におけるＮＯ供与体と［Ｆｅ(II)(β−ＣＧ)］複合体の効果を示す図面代用顕微鏡写真である。Ａ：対照，Ｂ：ＮＯＣ１８（30μM），Ｃ：Ｆｅ(II)ＡＳ（200μM），Ｄ：ＮＯＣ１８（30μM）＋Ｆｅ(II)ＡＳ（200μM），Ｅ：［Ｆｅ(II)(β−ＣＧ)］（200μM），Ｆ：ＮＯＣ１８（30μM）＋［Ｆｅ(II)(β−ＣＧ)］（200μM）。図８は，混合ニューロン・グリア培養におけるＮＯ供与体とβ−ＣＧの効果を示す図面代用顕微鏡写真である。Ｃ：β−ＣＧ（200μM），Ｄ：ＮＯＣ１８（30μM）＋β−ＣＧ（200μM）

本発明において，β−ＣＧは，そのまま又はその薬剤学的に許容し得る塩の形で用いることができる。β−ＣＧの薬剤学的に許容し得る塩は，β−ＣＧの製剤化，特に非経口投与溶剤（液剤，乾燥固形製剤等）としての製剤化に際して支障がなく，実質上無毒である限り限定されない。β−ＣＧの好ましい塩一例として，アルカリ金属塩が挙げられる。β−ＣＧのアルカリ金属塩としては，例えば，ナトリウム塩，カリウム塩，又はナトリウム及びカリウムとの混合塩が挙げられる。β−ＣＧは４個のカルボキシル基を有するが，β−ＣＧのアルカリ金属塩は，それら４個のカルボキシル基のうち１個，２個，３個又は４個が，アルカリ金属イオンと塩を形成したものであってよい。

本明細書において，「酸化ストレス関連疾患」とは，糖尿病，心筋梗塞等の心血管系疾患，アルツハイマー病，パーキンソン病やハンチントン病をはじめとする神経変性疾患及び癌等，その発症又は増悪が種々の背景による酸化ストレスに関連づけられる疾患をいう。本発明のミトコンドリア機能回復剤は，それら酸化ストレス関連疾患における低下したミトコンドリアの機能の回復を促進してこれらの疾患を治療（進行の抑制を含む）又は予防するために，また虚血再灌流障害の予防又は治療（増悪の抑制を含む）のために，患者に非経口的に投与される。

発明のミトコンドリア機能促進剤は，患者の内因性のＮＯの存在を前提としてそれ単独で投与してもよいが，より好ましくはＮＯ供与体の投与と併用する形で投与される。実施例の部に示したように（特に図８），ＮＯの存在下におけるβ−ＧＣの適用は，酸化ストレスに曝されたニューロンのミトコンドリア機能の改善を促して，ニューロンの生存率を有意に高めることができる。

本発明のミトコンドリア機能回復剤は，非経口投与用剤，特に注射剤として，輸液として，又は既存の輸液に添加するための製剤として，提供することができる。また，非経口投与用製剤は，水性液剤等の液剤であってもよく，また使用時に水性溶解液等の溶解液によって溶解される凍結乾燥製剤その他の乾燥固形製剤であってもよい。

本発明のミトコンドリア機能回復剤の投与量は，一般的には，β−ＣＧ換算で1〜500 mg/Kg体重/回の範囲内とすればよいが，この範囲に限定されることなく，個々の具体的治療目的及び患者の状態を考慮して担当医師がその都度適宜増減してよい。

本発明のミトコンドリア機能回復剤は，非経口投与溶剤の製造のための慣用の材料及び方法を用いて製造することができる。すなわち，本発明のミトコンドリア機能回復剤は，主薬であるβ−シトリル−Ｌ−グルタミン酸又はその薬剤学的に許容し得る塩と共に，添加剤として，所望により安定化剤，緩衝剤，キレート剤，等張化剤，pH調整剤，賦形剤等を適宜用いて調製することができる。主薬の添加剤の配合比率や濃度は，１回当たりの意図する投与量及び投与経路（例えば，静脈注射用，点滴静注用等）に応じて，適宜設定すればよく，主薬及び所望により添加剤を，注射用水等非経口投与用の溶媒に溶解させ，必要に応じて常法により溶液のpHを調製し（例えば，pH 7.4その他の中性付近），滅菌処理をすることにより調製すればよい。簡便には，リンゲル液その他の輸液にβ−ＣＧを配合することにより調製してもよい。また，用時溶解される凍結乾燥製剤も，β−ＣＧと，所望により添加剤の１種又は２種以上を適宜注射用水に溶解させ，凍結乾燥することにより，調製することができる。凍結乾燥製剤を溶解するための溶解液としては，例えば，生理食塩水や5％グルコース溶液その他の注射用に滅菌された溶解液を，適宜用いることができる。

安定化剤の例としては，アルブミン，グロブリン，ゼラチン，ソルビトール，エチレングリコール又はプロピレングリコール，亜硫酸水素ナトリウム等が挙げられるが，これらに限定されない。
緩衝剤の例としては，リン酸緩塩，酢酸塩，クエン酸塩，グルタミン酸塩，イプシロンアミノカプロン酸塩等が挙げられるが，これらに限定されない。
キレート剤の例としては，ＥＤＴＡ又はその塩，リン酸又はその塩，クエン酸又はその塩等が挙げられるが，これらに限定されない。
等張化剤の例としては，塩化ナトリウム；Ｄ−マンニトール，ソルビトール，キシリトール等の糖アルコール；フルクトース，グルコース，ガラストース，リボース，キシロース，マンノース，マルトトリオース，マルトテトラオース等の単糖類；ソルビトール，イノシトール，マンニトール等の等アルコール等が挙げられるが，これらに限定されない。
pH調整剤としては，塩酸，リン酸，硫酸等の無機酸；酢酸，酒石酸，乳酸，クエン酸，酒石酸，コハク酸，リンゴ酸等の有機酸；水酸化ナトリウム，炭酸水素ナトリウム，炭酸ナトリウム等の無機塩基；クエン酸ナトリウム，酒石酸ナトリウム等の有機塩基等が挙げられるが，これらに限定されない。

本発明において，「ＮＯ供与体」とは，生体に投与したときこれにＮＯを供給することのできる薬剤をいう。ＮＯ供与体としては，ニトログリセリン，硝酸イソソルビド，一硝酸イソソルビド，ニコランジル等の有機硝酸エステル剤；亜硝酸アミル等の有機亜硝酸エステル剤；３−モルフォリノシドニミン（3-morpholino-sydnonimine：ＳＩＮ），モルシドミン（molsidomine：1-Ethoxy-N-(3-morpholino-5-oxadiazol-3-iumyl)methanimidate）；リンシドミン（linsidomine：5-imino-3-morpholin-4-yl-5H-1,2,3-oxadiazol-3-ium-2-ide）；Ｓ−ニトロソシステイン，Ｓ−ニトロソグルタチオン（ＧＳＮＯ），Ｓ−ニトロソ−Ｎ−アセチルペニシラミン（ＳＮＡＰ）等のＳ−ニトロソチオール類；ジアゾニウムジチオレート類（NONOates)；フロキサン類（Furoxans：1,2,5-Oxadiazole-N-Oxides）；ニトロソアスピリン類等のＮＯ発生有機化合物，及びニトロプルシドナトリウム（Ｎａ_２[Ｆｅ(III)(ＣＮ)_５ＮＯ]）等のＮＯ発生無機化合物が知られている。ＮＯ供与体は，硝酸薬，硝酸供与薬（nitric
acid donor drugs），ニトロ血管拡張剤（nitrovasodilators）等と呼ばれ，ニトログリセリン，硝酸イソソルビド，一硝酸イソソルビド，ニトロプルシドナトリウム（ＳＮＰ）その他，既にＮＯの血管拡張薬作用に基づき狭心症の治療等に用いられている薬剤を含むが，生体に投与したときＮＯを供給するものであればよいから，本発明においてはそれらに限定されない。尤も，ＳＮＰ，又はＳＮＰのようなＣＮ⁻イオンを構成要素とする化合物は，「ＮＯ供与体」から除外してもよい。ＮＯ供与体の投与量は，血管拡張作用を期待して臨床上使用し得る投与量，又はこれに相当する投与量でよく，また患者の状態に応じて，担当医師が適宜増減することができる。

ヒトを含む哺乳類の血中にはＦｅ(II)が十分な量で存在することから，β−ＣＧは，患者に投与されると容易に［Ｆｅ(II)(β−ＣＧ)］複合体を形成することができる。［Ｆｅ(II)(β−ＣＧ)］複合体は，次いで，患者の内因性の，又はＮＯ供与体の投与により供給されたＮＯの存在下に［(ＮＯ)Ｆｅ(II)(β−ＣＧ)］複合体を形成し，ミトコンドリア内に容易に到達して，酸化ストレス下に不活性化したアコニターゼへのＦｅ(II)の受け渡しを助け，アコニターゼの再活性化を促して，ミトコンドリア機能の回復を促進する。

以下，実施例を参照して本発明を更に詳細に説明するが，本発明が実施例に限定されることは意図しない。
〔実施例１〕
１．材料及び方法
１．１．材料
以下の実験において次の材料を使用した。
・アコニターゼ（ブタ心臓由来），イソクエン酸デヒドロゲナーゼ組換え体（イースト由来），キサンチンオキシダーゼ（バターミルク由来），及びβ−ＮＡＤＰ^＋〔オリエンタル酵母（株）（東京，日本）〕
・メシル酸デフェロキサミン（Ｄｅｆ：Fe(III)キレート剤），臭化３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム（ＭＴＴ），及びＤＬ−フルオロクエン酸トリバリウム塩〔Sigma-Aldrich (St. Louis，MO USA)〕
・塩化アミノ−３−モルフォリニル−１，２，３−オキサゾリウム（ＳＩＮ塩化物）〔Tocris Cookson Inc. (MO USA)〕
・Ｆｅ(II)Ｏ（Alfa Aesar），Ｆｅ(III)_２Ｏ_３，クエン酸Ｆｅ(III)アンモニウム，グルコン酸Ｆｅ(II)（Alfa Aesar）及び塩化ヘミン（Alfa Aesar）〔和光純薬工業（株）（大阪，日本）〕
・１−ヒドロキシ−２−オキソ−３，３−ビス（２−アミノエチル）−１−トリアジン（Deta NONOate: NOC18）〔Calbiochem (CA USA)〕
・ヒポキサンチンナトリウム，硫酸アンモニウムＦｅ(II)・６水和物（Ｆｅ(II)ＡＳ），ニトロプルシドナトリウム（ＳＮＰ），乳酸Ｆｅ(II)，及びペルオキソ二硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）〔ナカライテスク（株），（京都，日本）〕
・２−（４−カルボキシフェニル）−４，４，５，５−テトラメチルイミダゾリン−１−オキシル−３−オキシド（Carboxy-ＰＴＩＯ）〔同仁化学研究所，（東京，日本）〕
・ＭＴＴアッセイキット（細胞増殖アッセイキットＩ）〔Roche，マンハイム，ドイツ〕
・β−シトリル−Ｌ−グルタミン酸（β−ＣＧ）〔Miyake M.，Kakimoto Y.，Sorimachi M.，Biochim. Biophys. Acta，544，656-666 (1978)（非特許文献１５）の記載に従って合成〕
・［Ｆｅ(II)クエン酸］複合体〔特許文献１７の記載に従ってＦｅ(II)Ｏとクエン酸三ナトリウムから合成〕
他の試薬は何れも，入手し得る最高グレードの市販品を入手。

１．２．アコニターゼ活性の測定
酵素活性のアッセイは，イソクエン酸からのcis−アコニット酸の形成を定量することにより行った（非特許文献１）。ＵＶアッセイは，室温にて行った。最終液量は1 mlとし，これは25mM Tris-HCl，pH 7.4と2mM ＤＬ−イソクエン酸三ナトリウムとを含んでいる。酵素の添加後，240 nmにおける吸光度変化を0.5分から1.5分迄測定した。１単位は，１μmol のcis−アコニット酸／分（ε_240nm＝3.6mM^-1ｃｍ^−１）を産生するに必要な酵素量と定義した（非特許文献３）。特にことわらない限り，何れの比活性も，ＵＶアッセイのことをいう。Ｆｅ(II)と例えばシステイン又はジチオスレイトール（ＤＴＴ）等の還元剤の存在が，アコニターゼの活性化には必要である（非特許文献３）。幾つかの実験では，アコニターゼ活性を共役法（非特許文献１）を用いて測定し，そこではＮＡＤＰの還元が調べられた。この方法が，この酵素に対する種々のオキシダントの効果を調べるのに頻繁に用いられているからである。

１．３．アコニターゼの活性化
今回の研究で用いたアコニターゼは，不活性型（[３Ｆｅ−４Ｓ]クラスター型）であり，Ｆｅ(II)及び還元剤による活性化（[４Ｆｅ−４Ｓ]クラスター型への）を必要とする（非特許文献３）。アコニターゼは，常法により，硫酸アンモニウム第一鉄（Fe(II)ＡＳ：5〜100μM）溶液を37℃にて10分間，50μM Tris塩酸緩衝液，pH7.4及び2.5mM ジチオスレイトールを全量50〜100μｌ中に含んだ小型試験管への添加することで活性化させた。幾つかの実験では，活性化されたアコニターゼタンパク質溶液を，低分子活性化剤を除去する目的で，0.5mMのジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む50mM Tris-HCl緩衝液（pH 7.4）で平衡化させたBio-Gel p-6カートリッジ（1.6×4 cm）を用いて，急速に脱塩した。これらのアコニターゼ調製物を，実験において「活性化アコニターゼ」として使用した。

１．４．オキシダントによる無傷のミトコンドリアの処理：ミトコンドリア・アコニターゼの再活性化に対するＮＯ供与体の効果
ミトコンドリア画分を，先に記述（Bulteau A.L.,Saito M.，Szweda L.I.，Biochemistry，42，14846-14855(2003)）されているようにして，Wistarラット心臓より調製した。すなわち，ラット心臓を20 mlの緩衝液Ａ（210mMのマンニトール，70mMのショ糖，pH 7.4，これに5mMのＥＤＴＡを添加）中で，Polytron ホモジナイザーを用いてホモジナイズした。ホモジネートを500×gで5分間遠心し，次いで上清を10000×gで10分間遠心，ミトコンドリアのペレットを緩衝液Ａで2回洗浄，ＥＤＴＡ不含の緩衝液Ａで再洗浄，次いで100mMのTris-HCl緩衝液（pH 7.4）中に懸濁させ，実験での使用時まで−80℃で保存した。

ミトコンドリアを約25ｍｇタンパク質／mlになるよう100mM
Tris-HCl緩衝液（pH 7.4）中に希釈し，次いで，先に記述されている（非特許文献３）ようにして，比較的緩和なオキシダントである100μMのペルオキソ二硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）の添加後10分間インキュベートした。ＡＰＳによりダメージを受けたアコニターゼ（［３Ｆｅ−４Ｓ］クラスター型）は，酵素活性を喪失しているが，Ｆｅ(II)イオンにより再活性化することができる。全てのインキュベーションは37℃で行った。インキュベーション後，反応混合物の30μlの各部分量を30μlの1％ Triton X-100に懸濁させ，溶解させてから，50μlの各部分量をアコニターゼ活性の定量に用いた。

１．５．新生マウス脳組織からの初代細胞培養
１日齢ddYマウスの大脳を摘出してCa²⁺/Mg²⁺不含Dulbecco'sリン酸緩衝食塩水〔ＰＢＳ(-)〕中に入れた。ニューロンの分離及び培養を，若干の改変を加え，先に記述（Morrison R.S.，Sharma A.，Vellis J.D.，Bradshaw R.，Proc. Natl. Acad.Sci. USA，83，7537-7541 (1986)）されているようにして行った。すなわち，大脳標本ををＰＢＳ(-)中で濯ぎ，鋏で細切れにし，ピペットを用いて分散させた。細胞を洗浄し，ペニシリン（50IU/ml）及びストレプトマイシン（50μg/ml）を含むＤＭＥＭに分散させた。次いで細胞懸濁液の各部分量（0.1 ml）（通常，細胞2×10⁵個を含む）を0.1％ポリ−ＤＬ−オルニチンで予めコーティングされている96ウェルプレートに入れた。60分間37℃にて5％ＣＯ_２空気下にインキュベートした後，培地を，5 ng/mlのインスリン，5 ng/mlのトランスフェリン，7.3 ng/mlのプロゲステロン，16μg/mlのプトレシン及び5 ng/mlのセレンよりなるＮ_１成分を含有する血清不含ＤＭＥＭに交換し，次いで，ニューロン純化培養物を得るために上記と同じ条件で細胞を連続３日間インキュベートした。培養細胞集団における非ニューロン細胞による割合は，抗β-IIIチューブリン抗体を用いた染色による評価で，播種後７日目までは殆ど観察されなかった。

別の実験において，上に詳述した細胞懸濁液の各部分量（0.1ｍｌ）を，0.1％ポリ−ＤＬ−オルニチンで予めコーティングしておいた96ウェルプレートに入れた。60分間37℃にて5％ＣＯ_２空気下にインキュベートした後，培地を，5％胎仔牛血清（ＦＣＳ）を含んだＤＭＥＭに交換した。翌日，培地を，20μMのシトシンアラビノシドを含んだＤＭＥＭに交換し，細胞を連続３日間インキュベートした（混合ニューロン・グリア培養）。ＦＣＳへの交換の時を０日とした。培養皿中の神経細胞の集団は，インキュベーション後の5日目に約50〜60％にわたっており（全細胞数に対する抗β-IIIチューブリン抗体と反応する細胞の比率により推定），全細胞の約10％は抗グリア繊維状酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）（星状グリア細胞特異的マーカー）抗体で染色された。

培養した細胞を4％のパラホルムアルデヒド中で30分間室温にて固定し，0.1％Triton X-100含有ＰＢＳ(-)中で10分間透過処理して，Blocking One Solution（ナカライテスク（株））で処理した。次に，それらを抗β-IIIチューブリン一次抗体（Sigma，USA; 1:500）又はＧＦＡＰ（Becton Dickinson USA; 1:1000）抗体と4℃で2時間インキュベートし，次いでＴＴＢＳ（50mM Tris-HCl，pH 7.4，150mM NaCl，0.05％ Tween
20）中で洗浄し，蛍光標識二次抗体（Alexa fluoro546，Molecular Probes， USA; 1:1000）と室温で2時間インキュベートした。IX70蛍光顕微鏡（オリンパス（株），日本）を用いて細胞を観察した。

１．６．初代培養細胞のＭＴＴ還元アッセイ
ＭＴＴ還元アッセイは，ミトコンドリア機能の完全性を，Mosmann等の記述（Mosmann T.，J. Immunol. Methods，65，55-63 (1983)）に従って評価する。このアッセイは，ＭＴＴのテトラゾリウム環が活性なミトコンドリア内で電子伝達系により還元される，という原理に基づいている。ＭＴＴを還元するための一次酵素は，複合体II中のコハク酸デヒドロゲナーゼ（コハク酸：ユビキノン酸化還元酵素）及び複合体III中のアンチマイシンＡ感受性チトクロムｃオキシダーゼであることが示されている（Marshall N.J.，Goodwin C.J.，Holt S.J.，Growth Regul，5，69-84（1995））。今回の研究では，アッセイは，メーカーの仕様書（MTT kit I; Roche，Mannheim，Germany）に従って行った。すなわち，細胞を96ウェルプレート中で培養し，次いで，培地100μｌ中に細胞を含んだ各ウェルに10μｌの5 mg/ml ＭＴＴ標識試薬を添加して，加湿したインキュベータ内でプレートを37℃にて4時間インキュベートした。インキュベーション後，溶解液〔0.01 M HCl含有の10％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）溶液〕を各ウェルに17〜18時間の間加えた。630ｎｍを参照波長として，サンプルの吸光度を波長570ｎｍで測定した。特記しない限り，ＮＯ供与体に曝露された細胞におけるＭＴＴ変換の程度は，対照に対する％割合として表わした。

細胞内のＤＮＡ含量は，先に記載した（非特許文献１６）ようにして行った。すなわち，細胞2×10⁶個を24ウェルプレート中で3日間培養し，細胞溶解用緩衝液1 ml中で溶解させてから，プロテインキナーゼＫとＲＮase Ａ溶液で処理した。フェノール／クロロフォルムでＤＮＡを2回抽出し，初めはイソプロピルアルコールで，次いで70％エタノールで，2回沈殿させ，その後，風乾させたペレットを溶解させた。ＤＮＡ濃度を，ＯＤ₂₆₀値を測定することにより算出した。

２．結果
２．１．アコニターゼ活性に対する他の阻害剤の効果とニトロプルシドの効果の比較
アコニターゼは，商業的供給源から不活性状態で入手し，これは，以前の研究（非特許文献３）が示しているように，システインやジチオスレイトール等のような還元剤の存在下にＦｅ(II)による活性化を必要とした。今回の研究では，市販のブタ心臓アコニターゼ（［３Ｆｅ−４Ｓ］型）を，20分間37℃にてＦｅ(II)ＡＳ（0.05mM）及びジチオスレイトール（2.5mM）の存在下に活性化させ，次いで酵素活性を，種々の阻害剤の存在下に測定した。

アコニターゼ活性に対するＦｅキレート剤及びオキシダントを含む種々の阻害剤の効果を，Ｆｅ(II)ＡＳ及びジチオスレイトールの存在下に調べた。すなわち，Ｆｅ(II)ＡＳ（0.1mM）及びジチオスレイトール（2.5mM）存在下にアコニターゼを37℃で20分間活性化させ，各阻害剤の阻害活性をＵＶアッセイを用いて室温で測定した。Ｄ，Ｌ−フルオロクエン酸トリバリウム塩（ＦＣ：競合的阻害剤，Villafranca J.J.，Platus E.，Biochem．Biophys. Res. Commun.，55，1197-1207(1973)），ＥＤＴＡ，メシル酸デフェロキサミン（Ｄｅｆ：Fe(III)キレート剤），及び過酸化水素（Ｈ_２Ｏ_２）は，濃度0.1mMで使用し，ニトロプルシドナトリウム（ＳＮＰ），ペルオキソ二硫酸アンモニウム（ＡＰＳ），フェリシアナイド（[Ｆｅ(III)(ＣＮ)_６]），及びＫＣＮ（非競合的阻害剤，ヘム毒）の濃度は，それぞれ0.05，0.25，2，及び5mMとした。また37℃で20分間ヒポキサンチン（Ｘ）（0.25mM）とキサンチンオキシダーゼ（ＸＯ）（125 m単位／ml）をインキュベートすることにより，スーパーオキシドアニオンを生成させた（Ｘ／ＸＯ）。3〜5回の実験結果の平均値（±SEM）を図１に示す。

図１に示すように，Ｆｅキレート剤であるＥＤＴＡ及びデフェロキサミンが活性を強力に阻害したのに対し，Ｄ，Ｌ−フルオロクエン酸トリバリウム塩），ＫＣＮ（ＣＮ⁻：非競合的阻害剤），フェリシアナイド（［Ｆｅ(III)(ＣＮ)_６］），並びにスーパーオキシド・アニオン（Ｘ／ＸＯ），ＡＰＳ，及び過酸化水素を含む種々のオキシダントは，中等度の阻害を示した。対照的に，ニトロプルシドナトリウム（ＳＮＰ）（Ｆｅ(III)(ＣＮ)₅ＮＯ）のみは，酵素活性を有意に高めた。

ニトロプルシドナトリウム以外のこれらの阻害剤のアコニターゼ阻害活性値は，以前の報告（非特許文献３）に述べられているのと同等であった。尤も，それらのオキシダントの阻害率は，アコニターゼに対するＦｅ(II)の保護作用のため，やや低い値となった。ＳＮＰは，分子にフェリシアン化ナトリウムと同様アコニターゼの強力な阻害剤であるフェリシアン部分を有してはいるが，ＮＯも発生することが知られている。ＮＯは低濃度ではアコニターゼを阻害しないが，高濃度ではアコニターゼを不活性化することが，以前報告されている（非特許文献１２）。更には，ＮＯ基に加え，ＳＮＰ分子はＦｅ部分を有し，これは分解時にイオンの形で遊離されることから，アコニターゼに対しＳＮＰにより加えられる活性促進効果はＦｅイオンによるものである可能性がある。このため我々は，この分子に対するＮＯ基の役割及びそのアコニターゼ活性に対する効果を調べた。

２．２．アコニターゼ活性に対するＳＮＰ及び他のＮＯ供与体の効果
上記ＳＮＰの促進効果が分子中に存在するＮＯとＦｅの何れによるものかを決定するために，アコニターゼの活性化に対するＳＮＰ及び他のＮＯ供与体の効果を検討した。更に，ＮＯには，異なった酸化還元条件下で，少なくとも３つのグループがあることが知られている。すなわち，ニトロソニウムイオン（ＮＯ^＋），一酸化窒素（ＮＯ^＊），及びペルオキシナイトライト（ＯＮＯＯ⁻）であり，これらは顕著に異なった生物学的効果を有している（非特許文献１８，２０）。特に，アスコルビン酸等の還元剤の存在は，ＳＮＰを化学種ＮＯ^＋から化学種ＮＯ^＊に変換することが知られている。また，ＮＯ供与体である３−モルフォリノシドニミン（ＳＩＮ）が，ＮＯ及びスーパーオキシドアニオンを産生することも示されており（Hogg N.，Darley-Usmar
V.M.，Wilson M.T.，Monocada S.，Biochem. J.，281，419-424(1992)），このことは結果的にアコニターゼに対する強力な阻害剤であるペルオキシナイトライト（Feelisch M.，Noack E.A.，Eup. J. Pharmacol.，139，19-30 (1987)）の形成をもたらすことも予想される。そこで，ＳＮＰ（ＮＯ急速遊離型化合物）に加え，ＳＩＮ，Deta ＮＯＮＯate（ＮＯＣ１８）（非特許文献６，１０）（非常に遅延遊離型のＮＯ供与体），及びＮａＮＯ_２（古典的ＮＯ遊離化合物）を，今回の研究においてＮＯ供与体として選択した。

（Ａ）アコニターゼ活性化に対する，ＳＮＰ，ＳＩＮ，ＮａＮＯ_２，及びＮＯＣ１８の効果
アコニターゼ活性化に対するＳＮＰ（0.1mM），ＳＩＮ（2mM），ＮａＮＯ_２（2mM），及びＮＯＣ１８（1mM）の効果を，Ｆｅ(II)ＡＳの存在下（0.05mM）又は非存在下の，2.5mMのＤＴＴで測定した。実験結果の平均値（±SEM）を図２Ａに示す。

図２Ａは，ＳＮＰを含む全てのＮＯ供与体がＦｅ(II)ＡＳの存在下にアコニターゼの活性化を促進するのに，対してＳＮＰのみは，Ｆｅ(II)ＡＳの非存在下でさえ僅かにこれを促進することを示している。ＳＮＰから遊離されたＦｅが，アコニターゼ活性化効果の一因かも知れない。

（Ｂ）Ｆｅ(II)ＡＳ及びＤＴＴの存在下における，ＮＯ供与体によるアコニターゼの活性化の時間的推移
次に，Ｆｅ(II)ＡＳ（0.05mM）及びＤＴＴ（2.5mM）の存在下における，ＳＮＰ（0.1mM），ＳＩＮ（0.1mM），ＮａＮＯ_２（2mM），及びＮＯＣ１８（1mM）によるアコニターゼの活性化の時間的推移を，反応開始後20分間にわたって測定した。結果を図２Ｂに示す。

図２Ｂは，アコニターゼと何れのＮＯ供与体とのインキュベーションも，Ｆｅ(II)ＡＳの存在下，アコニターゼ活性化を時間依存的に促進することを示している。この活性化は，Ｆｅ(II)ＡＳ単独の場合と比較して，ＮＯ供与体により有意に促進された。

（Ｃ）ＤＴＴの存在下，Ｆｅ(II)ＡＳの存在又は非存在下でのＳＮＰによる濃度依存性のアコニターゼ活性化
次いで，ＤＴＴ（2.5mM）及びＦｅ(II)ＡＳ（0.02mM）の存在下，ＳＮＰの濃度を0〜2mMの範囲内で変化させて，アコニターゼ活性化に対するＳＮＰの濃度依存性を検討した。また，比較のため，Ｆｅ(II)ＡＳの非存在下においても併せて検討を行った。結果を図２Ｃに示す。

図２Ｃに示したように，ＳＮＰは，Ｆｅ(II)ＡＳの存在下に用量依存性にアコニターゼ活性化を強く促進したが，これに対しＦｅ(II)ＡＳの非存在下では，促進効果は，用量依存的ではあるが，中等度であった。ＳＮＰ単独でも活性化が見られるのは，ＳＮＰ分子から遊離されたＦｅイオンに仲介されているものかも知れない。実際，ＳＮＰ（0.025mM）とＤＴＴ（2.5mM）を37℃で予備的にインキュベーションすると，インキュベーションを省いた場合と比較して，時間依存的にアコニターゼの活性化をもたらした（データ示さず）。

（Ｄ）Ｆｅ(II)ＡＳ及びＤＴＴの存在下における，ＳＩＮ及びＮＯＣ１８による濃度依存性のアコニターゼ活性化
更に，Ｆｅ(II)ＡＳ（0.02mM）及びＤＴＴ（2.5mM）の存在下，ＳＩＮ及びＮＯＣ１８の濃度を変化させて，アコニターゼ活性化に対する濃度依存性を検討した。結果を，3回の実験の平均（±SEM）として図２Ｄに示す。

図２Ｄは，ＳＩＮとＮＯＣ１８の双方がＦｅ(II)ＡＳの存在下に用量依存的にアコニターゼ活性化を強く促進することを示している。これに対しＦｅ(II)ＡＳの非存在下では効果がなかった。またＮａＮＯ_２も用量依存的にＦｅ依存性の活性化を強く促進したが，その効果を得るには，より高い濃度（約10mM）を必要とした（データ示さず）。ＮＯ供与体によるアコニターゼ活性化の促進はまた，アコニターゼ活性測定法のうちの共役法を用いても確認された（データ示さず）。

（Ｅ）上記の知見は，試験した何れのＮＯ供与体から遊離されたＮＯも，Fe(II)の存在下にアコニターゼの活性化を促進することを示している。

２．３．ＮＯにより促進されるアコニターゼ活性化に対するＮＯ消去剤の効果
（Ａ）ＮＯ供与体に促進されるアコニターゼ活性化に対する，Ｘ／ＸＯの効果
ＮＯがスーパーオキシドアニオンと反応してペルオキシナイトライトを生成することから，スーパーオキシドアニオンを生成する条件下でのＮＯの効果を検討するは興味がもたれる。予備的に，ヒポキサンチン（Ｘ）とキサンチンオキシダーゼ（ＸＯ）とを，37℃で20分間インキュベーションすることにより，スーパーオキシドを産生させ（Gardner P.R.，Fridovich
I.，J. Biol. Chem.，266，19328-19333 (1991); Flint D.H.，Tuminello
J.F.，Emptage M.H.，J. Biol. Chem.，268，22369-22376 (1993)），アコニターゼ活性化に対するＮＯ供与体の効果を調べた。すなわち，ヒポキサンチン（0.25mM）をキサンチンオキシダーゼ（125 m単位/ml）と共に20分間37℃で予備インキュベートし，次いで，Ｆｅ(II)ＡＳ（0.02mM）及びＳＮＰ（0.1mM），ＳＩＮ（2mM），ＮａＮＯ_２（2mM），又はＮＯＣ１８（0.2mM）の存在下，反応混合物の添加後直ちにアコニターゼと共に10分間37℃でインキュベートした後，アコニターゼ活性を測定した。結果を，3〜6回の実験の平均（±SEM）として図３Ａに示す。

図３Ａに示されるように，Ｘ／ＸＯは，ＳＩＮ及びＮＯＣ１８による促進された活性化に対し強く拮抗的に作用し，ＮａＮＯ_２による促進を中等度に減弱させたが，これに対し，ＳＮＰによる促進は僅かしか阻害しなかった。Ｆｅイオンは種々のオキシダントにより障害されたアコニターゼ内に再挿入できることから（非特許文献３），ＳＮＰ分子から遊離されたＦｅイオンが，ＯＮＯＯ⁻による障害を受けたアコニターゼ内に再挿入されていると推定された。しかしながら，そのメカニズムは明らかでない。

（Ｂ）ＮＯ供与体により促進されたアコニターゼ活性化に対するヘム及びＰＴＩＯの効果
ＮＯはまた，ヘム（Dawson V.L.，Dawson T.M.，London E. D.，Bred D.S.，Snyder S.H.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，88，6368-6371(1991)）やイミダゾリンオキシルＮオキシド誘導体（ＰＴＩＯ）（Akaike T.，Yoshida M.，Miyamoto Y.，Sato K.，Kohno M.，Sasamoto K.，Miyazaki K.，Ueda S.，Maeda H.，Biochemistry，32，827-832 (1993)）を含む種々のＮＯ捕捉剤によっても，拮抗されることが知られている。そこで，ＮＯが仲介するアコニターゼ活性化促進に対するヘム及びＰＴＩＯの効果を調べた。すなわち，ＮＯ供与体仲介性のアコニターゼ活性化の促進に対するヘム（0.05mM）及びＰＴＩＯ（1mM）の効果を，Ｆｅ(II)ＡＳ（0.02mM）及びＳＮＰ（0.025mM），ＳＩＮ（1mM），ＮａＮＯ_２（10mM），又はＮＯＣ１８（0.2mM）の存在下に調べた。結果を，3〜4回の実験の平均（±SEM）として図３Ｂに示す。

図３Ｂに示すように，活性化に対する全てのＮＯ供与体の促進効果は，ＰＴＩＯにより完全に阻害されたが，ヘムによる阻害は中等度であった。総合すると，これらの知見は，ＮＯ供与体から遊離されたＮＯがアコニターゼ活性化を促進することを示唆している。

２．４．ＮＯ供与体によるアコニターゼ活性化促進におけるＦｅ依存性
（Ａ）ＮＯ供与体の存在下，アコニターゼの活性化に対するＦｅ濃度の影響
我々の発見は，ＮＯがＦｅ依存性のアコニターゼ活性化を時間及び濃度依存的に強く促進することを，明確に示している。しかしながら，アコニターゼ活性化の促進におけるＮＯとＦｅイオンの関係は，まだ詳細には明らかでなかった。そこで我々は，ＮＯ供与体であるＳＮＰ，ＳＩＮ，ＮａＮＯ_２及びＮＯＣ１８の存在及び非存在下に，種々の濃度のＦｅ(II)ＡＳを用いた。すなわち，ＳＮＰ（0.025mM），ＳＩＮ（0.5mM），ＮａＮＯ_２（5mM），及びＮＯＣ１８（0.1mM）の存在又は非存在下，アコニターゼの活性化に際し種々の濃度（0〜0.2mM）のＦｅ(II)ＡＳを添加した。結果を，3〜6回の実験の平均（±SEM）として図４Ａに示す。

図４Ａに示されるように，Ｆｅ(II)ＡＳ単独の場合と比較して，試験した何れのＮＯ供与体の存在下でも，Ｆｅ(II)ＡＳは低濃度においてアコニターゼ活性化を用量依存的に促進した。しかしながら，各供与体の存在下におけるアコニターゼ活性化の最大レベルは，Ｆｅ(II)ＡＳ単独の場合とほぼ同じであった。

（Ｂ）ＳＩＮの存在又は非存在下でのアコニターゼ活性化に対するＦｅ(II)ＡＳ及びＳＮＰの効果
次に我々は，種々のＦｅ複合体中のＦｅをＮＯがアコニターゼ活性化の際に利用できるか否かを調べた。ＮＯは主として，ヘム，種々の酵素タンパク質中のＦｅ−Ｓ中心，及びフェリチン中のＦｅ(III)又はＦｅ(II)イオンと反応することが報告されている（非特許文献４，５）。他方，細胞内には遊離のＦｅは実質上存在しないことも報告されている（Kruszewski M.，Mutat.
Res.，531，81-92(2003)。そこで，Ｆｅ複合体として先ずＳＮＰを選んだ。ＳＮＰ濃度は変化させ，一方ＳＩＮをＮＯ供与体として用いるときは，その濃度は一定（1mM）とした。すなわち，ＳＩＮ（1mM）の存在又は非存在下にＦｅ(II)ＡＳ（0〜0.1mM）と共にアコニターゼをインキュベートし，またＳＩＮ（1mM）の存在又は非存在下にＳＮＰ（0〜0.1mM）と共にアコニダーゼをインキュベートした。結果を，3〜4回の実験の平均（±SEM）として，図４Ｂに示す。

図４Ｂに示されるように，Ｆｅ（II）ＡＳ（0〜0.1mM）は，ＳＩＮ（1mM）の存在下，用量依存的にアコニターゼ活性化の促進をもたらした。またＳＮＰ（0〜0.1mM）は，ＳＩＮ（1mM）の存在下でも，ＳＮＰ単独の場合とほぼ同等の効果しかなかった。ＳＮＰは，ＳＩＮの存在下及び非存在下の何れでもアコニターゼ活性化を僅かしか増加させなかったが，これに対しＦｅ(II)ＡＳは，ＳＩＮの存在下に活性化を用量依存的に促進した。これらの知見は，ＮＯは，アコニターゼ活性化にＳＮＰ分子中のＦｅを利用できないことを示唆している。

（Ｃ）ＳＩＮの存在又は非存在下における，アコニターゼ活性化に対する［Ｆｅ(II)(乳酸)]及び［Ｆｅ(III)(クエン酸)]の効果
我々はまた，ＳＩＮの存在下及び非存在下において，アコニターゼ活性化に対するＦｅ複合体［Ｆｅ(II)(乳酸)］及び［Ｆｅ(III)(クエン酸)］の効果も調べた。すなわち，ＳＩＮ（1mM）の存在又は非存在下に，アコニターゼを[Ｆｅ(II)(乳酸)]（0〜0.1mM）又は[Ｆｅ(III)（クエン酸）]（0〜0.1mM）と共にインキュベートして，アコニターゼ活性を測定した。結果を，3回の実験の平均（±SEM）として，図４Ｃに示す。

図４Ｃに示されるように，ＳＩＮの存在下において，アコニターゼと[Ｆｅ(II)(乳酸)]とのインキュベーションは用量依存的にアコニターゼ活性化を促進したが，これに対し［Ｆｅ(III)(クエン酸)］は効果がなかった。この複合体［Ｆｅ(III)(クエン酸)］は，複合体中のＦｅ(III)を還元するために還元性化合物ＤＴＴの高濃度（20mM）を使用した場合ですら，活性化を促進できなかった（データ示さず）。更に，我々の以前の研究が示すように（非特許文献１７），Ｆｅ(II)Ｏ粉末とクエン酸塩及びグルタミン酸塩との長時間インキュベーションにより調製した［Ｆｅ(II)(クエン酸)］及び［Ｆｅ(II)(グルタミン酸)］複合体は，［３Ｆｅ−４Ｓ］型アコニターゼを活性化できなかった。加えて，市販されている［Ｆｅ(II)(グルコン酸)］は，ＳＩＮの存在下に，［Ｆｅ(II)(乳酸)］とほぼ同じ活性を示した（データ示さず）。これらの知見は，ＮＯが，［Ｆｅ(II)(クエン酸)］におけるような強く結合したＦｅを利用できないことを示唆している。

（Ｄ）ＳＩＮの存在下又は非存在下における，アコニターゼ活性化に対する［Ｆｅ(II)(β−ＣＧ)］複合体の効果
我々は最近，新生ラット脳から単離したβ−シトリル−Ｌ−グルタミン酸（β−ＣＧ）が内因性の低分子Ｆｅキレート剤であり（非特許文献１６），［Ｆｅ(II)(β−ＣＧ)］複合体が，ミトコンドリア・アコニターゼのためのＦｅ運搬体としての役割を果たし，次いでこれを活性化していることを見出した（非特許文献１７）。そこで，我々は，中等度に強く結合したＦｅを含む［Ｆｅ(II)(β−ＣＧ)］複合体を用いて実験を行った。すなわち，ＳＩＮ（1mM）の存在又は非存在下に，アコニターゼを［Ｆｅ(II)(β−ＣＧ)］複合体（0〜1mM）と共にインキュベートして，アコニターゼ活性を測定した。結果を，3回の実験の平均（±SEM）として，図４Ｄに示す。

図４Ｄに示すように，［Ｆｅ(II)(β−ＣＧ)］はＳＩＮ（1mM）の存在下に用量依存的にアコニターゼ活性化を促進したが，ＳＩＮの非存在下では，以前に記述した（非特許文献１７）ように中等度にしか活性化しなかった。

以上の知見は，ＮＯは，アコニターゼ活性化のため，自身に結合できるＦｅ(II)イオンを必須としていることを示唆している。

ＮＯがアコニターゼを不活性化するか否かについて何故これまで相互に矛盾する結果が報告されているのか，という問題には未だ答えが出ていなかった。この問題に取り組むため，我々は，Ｆｅ不含（アコニターゼ中のＦｅ以外には，溶液中にＦｅを実質上含まない）の活性化アコニターゼ調製物を準備した。すなわち，市販のアコニターゼ（ブタ心臓より精製）をＦｅ(II)ＡＳ（100μM）及びジチオスレイトールにより37℃で10分間活性化させた。Ｆｅイオン等のような過剰の低分子活性化剤を除去するため，0.5mM
ジチオスレイトール含有の50mM Tris-HCl緩衝液，pH
7.4で緩衝化したBio-Gel p-6を用いてこのアコニターゼタンパク質調製物を急速に脱塩し，次いで，このＦｅ不含アコニターゼ調製物を用いて種々のＮＯ供与体の効果を直ちに調べた。すなわち，Ｆｅ不含の活性化したアコニターゼを，ＮＯ供与体の存在下に20分間37℃で予備インキュベートした後，酵素活性を測定した。別の実験において，活性化したアコニターゼをＮＯ供与体及びＦｅ(II)ＡＳ（0.05mM）の存在下にインキュベートした。使用したＮＯ供与体の濃度は，ＳＮＰが0.1mM，ＳＩＮが2mM，ＮａＮＯ_２が2mM，そしてＮＯＣ１８が1mMであった。結果を平均（±SEM）として表１に示す。アスタリスクは対照（100％）に対する有意差を示す（*Ｐ＜0.01，ニ元配置ANOVA,Tukey―Kramerテスト，n＝3）。

表１に示されているように，ＳＩＮ及びＮＯＣ１８は，4mMでアコニターゼを不活性化したが，これに対しＳＮＰは低濃度（0.1mM）でこれを活性化し，高濃度（0.4mM）では不活性化した。ＮａＮＯ_２は，低濃度でも高濃度でも効果がなく，非常に高濃度（10mM超）では酵素を阻害した（データ示さず）。低濃度のＳＮＰによるアコニターゼの活性化は，ＤＴＴの存在下でのインキュベーション中にＳＮＰからＦｅイオンが遊離したことによるものかも知れない。この研究において見られたＮＯ供与体によるアコニターゼの不活性化は，以前に報告されているin vitroの研究結果と整合する（非特許文献６）。興味深いことに，これらのＦｅ不含アコニターゼの活性は，その促進程度は供与体のタイプにより様々であったものの，ＮＯ供与体の存在下でのＦｅ(II)ＡＳの添加により，強く促進された。我々の知見は，ＮＯはＦｅ(II)の非存在下においてアコニターゼ活性を阻害するが，Ｆｅ(II)の存在下では，効果がないかあるいはＦｅ依存性活性化を著しく促進するかのいずれかであることを示唆している。

２．５．ＡＰＳ処理ミトコンドリア内のアコニターゼ再活性化に対するＮＯ供与体の効果
（Ａ）ＡＰＳにより障害されたアコニターゼの再活性化に対するＮＯ供与体の効果
ミトコンドリア内のアコニターゼは，細胞内の反応性の酸素及び窒素種に対する高感度の酸化還元センサーとなることが報告されている（非特許文献１８）。アコニターゼは，種々のオキシダント，例えばＨ_２Ｏ_２等により，［４Ｆｅ−４Ｓ］クラスター中のＦｅ_ａの欠損によって阻害されることが示されている（非特許文献２）。また，ＡＰＳは，Ｈ_２Ｏ_２に比べて緩和なオキシダントとして，アコニターゼを不活性化することが知られている（非特許文献３）。

そこで我々は，ラット心臓から調製した無傷のミトコンドリアを用いて，ＡＰＳの効果を調べた。アコニターゼ活性は，ＡＰＳをミトコンドリア内に添加すると低下した。そこで我々は，ＮＯ供与体がＡＰＳにより損傷を受けたアコにターゼを再活性化させる否かを検討した。すなわち，無傷のミトコンドリア懸濁液をＡＰＳ（0.1mM）と共に10分間37℃で予備インキュベートし，続いて，Ｆｅ(II)ＡＳ（0.04mM）の存在又は非存在下に，種々のＮＯ供与体と共に10分間37℃でインキュベートした。ＮＯ供与体としてはＳＮＰ,ＳＩＮ，ＮａＮＯ_２，及びＮＯＣ１８を，それぞれ，0.02〜0.1mM，0.4〜2mM，4〜20mM，及び0.08〜0.4mMで用いた。次いでミトコンドリアを0.5％ Triton X-100で溶解させ，溶解液中のアコニターゼ活性を30秒以内に測定した。結果を，3〜6回の実験の平均（±SEM）として，図５Ａに示す。

図５Ａに示すように，試験した全てのＮＯ供与体が，Ｆｅ(II)ＡＳ（0.04mM）の存在下には用量依存的にアコニターゼの再活性化を促進したが，非存在下には活性化しなかった（データ示さず）。但し，ＳＩＮ及びＮａＮＯ_２によるアコニターゼの再活性化の度合いは，ＳＮＰ及びＮＯＣ１８のそれに比べて低かった。

（Ｂ）ＮＯ供与体により促進されるアコニターゼ再活性化に対するＮＯ消去剤の効果
ＮＯの種々の効果がＰＴＩＯ等のようなＮＯ捕捉剤によって拮抗されることが知られている。そこで，ＮＯ供与体仲介型のミトコンドリア内アコニターゼ再活性化の促進に対する，ＰＴＩＯの効果を調べた。すなわち，無傷のミトコンドリア懸濁液をＡＰＳ（0.1mM）と共に10分間37℃で予備インキュベートし，続いて，Ｆｅ(II)ＡＳ（0.02mM）の存在下又は非存在下に，ＮＯ供与体及びＰＴＩＯ（1mM）と共に10分間37℃でインキュベートした。ＮＯ供与体としては，ＳＮＰ（0.025mM），ＳＩＮ（2mM），ＮａＮＯ_２（10mM），及びＮＯＣ１８（0.4mM）を用いた。次いでミトコンドリアを0.5％ Triton X-100で溶解させ，溶解液中のアコニターゼ活性を30秒以内に測定した。ＰＩＴＯでの結果を，3〜6回の実験の平均（±SEM）として，図５Ｂに示す。

図５Ｂに示されているように，再活性化に対する何れのＮＯ供与体の効果も，ＰＴＩＯにより阻害された。これらの知見は，ＮＯ供与体から遊離されたＮＯがミトコンドリア・マトリクス内のアコニターゼの再活性化を促進していることを示唆している。

２．６．１日齢マウス脳組織からの初代培養ニューロンに対するＮＯ供与体の効果
（Ａ）ニューロン純化培養におけるＭＴＴ還元活性に対するＮＯ供与体の濃度依存性的効果
細胞内のミトコンドリアの個数はその細胞の代謝要求に依存する。ニューロンの生存にとって，ミトコンドリアによる十分なエネルギー供給が必要不可欠であり，細胞内のいわば発電所としての役割に基づき，ミトコンドリアは，細胞生存に関わる要の因子として注目されている。更には，皮質ニューロンに対して，ミトコンドリアにおける酸化的リン酸化は，主たるＡＴＰ源を提供している。ＭＴＴ還元活性のアッセイでミトコンドリア機能を総合的に評価できることが，知られている。その反応は，主としてミトコンドリアの諸酵素と電子運搬体に帰せられ，細胞の生存を検出するのにも用いることができる。加えて，ＮＯは，神経系の細胞においてその酸化還元状態に依存して顕著に異なる生物学的効果を有することが示されている。ＮＯは，スーパーオキシドアニオンと反応してペルオキシナイトライト（ＯＮＯＯ⁻）を生成することにより神経毒効果を有する。対照的に，ニトロソニウムイオン（ＮＯ^＋）は，Ｎ−メチル−アスパラギン酸受容体のチオール基のＳ−ニトロシル化を介して，神経保護的効果を有する（非特許文献１８，１９）。そこで，ミトコンドリア機能を，ＮＯ供与体としてＳＮＰ，ＳＩＮ及びＮＯＣ１８の0.1〜1000μMに曝露後のニューロン純化培養で，播種後3日間，ＭＴＴ還元アッセイを用いて調べた。すなわち，１日齢マウス大脳組織からの初代培養ニューロンを播種後3日間，0.1〜1000mMのＮＯ供与体（ＳＮＰ，ＳＩＮ，又はＮＯＣ１８）に曝露させた後，ＭＴＴ還元アッセイを用いてミトコンドリア機能を調べた。3〜6回の実験のデータの統計学的有意性を，二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）により検討した。Turkey-Kramer多重比較テストを用いて，群間での有意差を判定し，危険率ｐ＜0.05を有意水準とした。結果を図６Ａに示す。

図６Ａに示されているように，初代培養ニューロンにおいて，ＳＮＰ以外の全てのＮＯ供与体が，低濃度でＭＴＴ還元活性を高めたが，ＮＯ供与体の全てが，高濃度ではＭＴＴ還元活性を用量依存的に低下させた。

（Ｂ）混合ニューロン・グリア培養におけるＭＴＴ還元活性に対するＮＯ供与体の濃度依存的効果
以前に，ＮＯ及び関連するニトロソ化合物の効果が，混合ニューロン・グリア培養を用いて調べられ，ＮＯの神経保護及び破壊的効果に関して，その酸化還元に基づくメカニズムが報告されている（非特許文献１８）。今回の研究では，混合ニューロン・グリア培養におけるＳＮＰ，ＰＩＮ，及びＮＯＣ１８の効果を，0.1〜1000μMの範囲の濃度で調べた。得られた結果は，ニューロン純化培養でのものとほぼ同じであった（データ示さず）。実際，ＳＩＮ及びＮＯＣ１８は低濃度でＭＴＴ還元活性を高め，これに対しＳＮＰは低濃度でも活性を僅かに低下させた。しかしながら，ＳＮＰはまた，高濃度においてではあるが，Ｃ６グリオーマ細胞において化学的低酸素誘導による細胞死を防止すること，また前立腺癌細胞のｍ−アコニターゼ活性及びその遺伝子発現を，低濃度でアップレギュレートすることが報告されている（非特許文献２０）。そこで，混合培養でのＭＴＴの還元活性に対する今回のＮＯ供与体の効果を，0.1〜10μMの範囲の低濃度で検討した。結果を図６Ｂに示す。

図６Ｂに示した結果を得た。ＳＩＮとＮＯＣ１８は共に，用量依存的にＭＴＴ還元活性を有意に高めたが，これに対しＳＮＰはこれを僅かに低下させた。

（Ｃ）混合ニューロン・グリア培養におけるＤＮＡ含量に対するＮＯ供与体の効果
別の実験において，ＮＯ供与体で処理された培養細胞内のＤＮＡ含量を測定し，図６Ｃに示す結果を得た。共に10及び30μMのＳＩＮ及びＮＯＣ１８で処理された細胞内のＤＮＡ含量は僅かに上昇したが，これに対しＳＮＰで処理した細胞内のそれは，有意に低下した。但し，ＳＩＮ及びＮＯＣ１８処理した細胞内のＤＮＡ含量の変化は，統計学的に有意ではなかった。この培養系において，培養皿中のＤＮＡ含量に基づいて測定したところ神経系細胞の細胞数は，3日間の培養後には約70％まで減少していた。これは，ＮＯ供与体処理による細胞数の増加が，生存細胞の個数の増加を反映していることを示唆している。

（Ｄ）混合ニューロン・グリア培養におけるＮＯ供与体存在下でのＭＴＴ還元に対する，β−ＣＧ及び［Ｆｅ(II)(β−ＣＧ)］の用量依存性の効果
先の我々のin vitro実験において（図４Ｄ），ＳＩＮは，ＳＩＮ単独の場合と比較して，［Ｆｅ(II)(β−ＣＧ)］複合体（約200μM）の添加を伴うと，アコニターゼの活性化を約2〜3倍に高めた。そこで，ＭＴＴ還元活性に対するβ−ＣＧ，［Ｆｅ(II)(β−ＣＧ)］及びＦｅ(II)ＡＳの濃度依存性の効果を，ＳＩＮの存在下に，混合ニューロン・グリア培養を用いて調べた。すなわち，ＳＩＮ（1mM ）の存在下，β−ＣＧ（0〜200μM），［Ｆｅ(II)(β−ＣＧ)］（0〜200μM）又はＦｅ(II)ＡＳ（0〜200μM）を用いて混合ニューロン・グリア培養を行った。結果を図６Ｄに示す。

図６Ｄに示されているように，は，ＳＩＮの存在下に，より高いＭＴＴ還元活性を50μMでさえ示し，これに対しβ−ＣＧは50μMではより低い活性しか有しなかったが，その後200μMまで，徐々に活性が高まった。対照的に，Ｆｅ(II)ＡＳは，ＳＩＮの存在下にＭＴＴ還元活性を低下させた。ＮＯＣ１８も，ＳＩＮの場合とほぼ同じ結果を与えた（データ示さず）。加えて，先に図４Ｄに示したように，ＳＩＮ及びＮＯＣ１８は，［Ｆｅ(II)(β−ＣＧ)］複合体の存在下に，ＭＴＴ還元活性をかなり効果的に促進した。また，我々が以前に明らかにしたように（非特許文献１６），β−ＣＧは中性のpH でＦｅイオンと比較的強い複合体を形成できる。このことから，β−ＣＧは，胎仔牛血清含有培地中のＦｅイオン（全体で約2μM）と[Ｆｅ(II)(β−ＣＧ)]複合体を形成すると考えられる。従って，β−ＣＧは，[Ｆｅ(II)(β−ＣＧ)]複合体と同等の効果を示したのであろうと推定された。

（Ｅ）混合ニューロン・グリア培養でクエン酸，［Ｆｅ(II)(クエン酸)］の存在下におけるＭＴＴ還元活性に対するＮＯ供与体の効果
次に，混合ニューロン・グリア培養を用いて，Ｆｅ(II)ＡＳ，クエン酸，[Ｆｅ(II)(クエン酸)]又は[Ｆｅ(II)(β−ＣＧ)]複合体の存在下（何れも200μM）に，ＳＩＮ及びＮＯＣ１８（共に30μM）の効果を調べた。結果を図６Ｅに示す。

図６Ｅに示されているように，ＳＩＮ及びＮＯＣ１８は，［Ｆｅ(II)(β−ＣＧ)］複合体（200μM）の存在下に，ＭＴＴ還元活性を有意に高めたが，これに対しこれらのＮＯ供与体の何れも，Ｆｅ(II)ＡＳ，クエン酸及び［Ｆｅ(II)(クエン酸)］の存在下では効果を有しなかった。

（Ｆ）混合ニューロン・グリア培養におけるＮＯ供与体と［Ｆｅ(II)(β−ＣＧ)］複合体の効果
別の実験において，培養細胞を播種後，［Ｆｅ(II)(β−ＣＧ)］の存在下に30μMのＮＯＣ１８に最初の3日間曝露させ，次いで5日目に生存神経細胞をβ−チューブリン−III抗体（神経細胞マーカー）で染色した。［Ｆｅ(II)(β−ＣＧ)］の存在下にＮＯＣ１８処理されたウェル内の染色されたニューロン（図７Ｆ）は，［Ｆｅ(II)(β−ＣＧ)］のみで処理されたウェル内のもの（図７Ｅ）より，著しく多くのニューロンが染色された。ＮＯＣ１８のみで処理されたウェルでは，染色されたニューロンはごく僅かであった（図７Ｂ）。加えて，染色されたニューロンは，Ｆｅ(II)ＡＳのみ又はＦｅ(II)ＡＳ含有のＮＯＣ１８で処理されたウェル内には，殆ど存在しなかった（図７Ｃ，Ｄ）。また別の実験で，ＳＩＮもＮＯＣ１８と同じ結果を示したが，ＳＮＰは神経破壊的な結果をもたらした（データ示さず）。
上記の知見は，ＮＯが，［Ｆｅ(II)(β−ＣＧ)］複合体の細胞による利用を促進してミトコンドリア機能を高めることにより，生存ニューロンの細胞数を増加させることを示唆している。

（Ｇ）混合ニューロン・グリア培養におけるＮＯ供与体とβ−ＣＧの効果
更に，［Ｆｅ(II)(β−ＣＧ)］に代えてβ−ＣＧ（200μM）についても，上記と同じ方法で混合ニューロン・グリア培養に対する効果を調べた。結果を図８に示す。図８に見られるように，β−ＣＧは，ＮＯ供与体（ＮＯＣ１８）の共存下において，顕著に多くのニューロンの生存をもたらした。これは，β−ＣＧが培養液中に含有されている胎仔牛血清由来のＦｅ(II)イオンと［Ｆｅ(II)(β−ＣＧ)］複合体を形成する一方，ミトコンドリア内のアコニターゼによるこの複合体の利用を，ＮＯ供与体が促進した結果であると考えられる。

３．考察
ＮＯが仲介するｍ−アコニターゼの不活性化は，種々の哺乳類細胞内において起こっていることが報告されているが（特許文献７，１１）。in vitro研究から得られた従来の結果は，幾分相矛盾している。実際，ブタ心臓ｍ−アコニターゼを用いた諸々の実験の結果は，低濃度のＮＯはアコニターゼを不活性化しないが，高濃度では，中等度の阻害がもたらされた（非特許文献１２）。今回の研究で，我々は，ＳＮＰ（[Ｆｅ(III)(ＣＮ)_５ＮＯ]）はフェリシアン酸部分を有するため，この酵素を阻害するであろうと予想していた。何故なら，青酸イオン及びフェリシアン化イオン（[Ｆｅ(III)(ＣＮ)_６）にそのような阻害活性があることが知られていたからである。しかしながら，ＳＮＰはアコニターゼ活性を有意に増強した。従って，ＳＮＰから遊離されたＮＯ分子が，Ｆｅ依存性のアコニターゼ活性化を促進する，とみなすのが合理的であると考えた。ＳＮＰ以外のＮＯ供与体（ＳＩＮ，ＮａＮＯ_２及びＮＯＣ１８）は，Ｆｅ(II)ＡＳの存在下に，時間及び用量に依存的にｍ−アコニターゼの活性化を促進した。また，アコニターゼ活性化に対するＮＯ供与体の促進効果は，ヘム及びＰＴＩＯを含むＮＯ捕捉剤により阻害された。これらの知見は，ＮＯ供与体から遊離されたＮＯが，Ｆｅ依存性のアコニターゼ活性化を促進することを示唆している。

ＮＯがアコニターゼを阻害する，或いは何も影響を及ぼさない，との報告がこれまでなされているのは何故なのか，ということを問うのは重要である。今回の研究では，我々は，Ｆｅ不含（アコニターゼ中のもの以外には，溶液中にＦｅを実質上含まない）の活性化アコニターゼを調製し，ＮＯ供与体の効果を調べた。表１に示すように，ＳＩＮ及びＮＯＣ１８はアコニターゼ活性を阻害し，これは，以前に報告されていたin vitroの研究結果（特許文献６，１２）と合致するものであった。加えて，Ｆｅ不含アコニターゼの活性は，各ＮＯ供与体へのＦｅ(II)ＡＳの添加により著しく促進された。これらの知見は，ＮＯにより誘導されるアコニターゼ活性の阻害又は促進は，細胞内にＮＯが利用可能なＦｅ(II)イオンの存在するか否に依存していることを示している。

無傷のミトコンドリアにおいては，今回試験した全てのＮＯ供与体が，Ｆｅ(II)ＡＳの存在下に，アコニターゼの再活性化を用量依存的に促進したが，Ｆｅ(II)ＡＳの非存在下では促進しなかった。またアコニターゼの再活性化に対するＮＯ供与体の促進効果は，ＮＯ捕捉剤であるＰＴＩＯにより阻害された。

加えて，我々の予備的実験は，細胞質アコニターゼ（ｃ−アコニターゼ），すなわち鉄調節タンパク質１（IRP1）が，ＥＤＴＡ／Ｆｅ(ＣＮ)_６試薬による損傷を受けた後，やはり［Ｆｅ(II)(β−ＣＧ)］複合体とＮＯ供与体との同時添加により再活性化されることを明らかにした。しかしながら，ラット肝の細胞質から調製したｃ−アコニターゼは，比較的安定な[４Ｆｅ−４Ｓ]クラスター型をしている。そこでＥＤＴＡ／Ｆｅ(ＣＮ)_６を用いて[３Ｆｅ−４Ｓ]クラスター型にしようとしたが，このクラスターは不安定でさらに崩壊してしまうことがわかった。従って，ｃ−アコニターゼでの活性化条件は，より詳細に研究するのが困難であった。

混合ニューロン・グリア培養では，ＳＮＰ以外の全てのＮＯ供与体が，低濃度でＭＴＴ還元活性を増強して，細胞生存率を有意に高めたが，逆に高濃度ではＭＴＴの還元活性を減弱させた。細胞内において，何故ＳＮＰのみがＭＴＴ還元活性を高めなかったのかは，不明である。ＳＮＰ分子はＮＯ基に加えてＦｅを含んでいる。Ｆｅイオンは強力な神経毒であることが知られている。このことが，ＭＴＴ還元活性に対しＳＮＰに作用がないことを説明しているのかも知れない。別の説明の１つは，ＳＮＰからのシアンイオンの遊離によるのかも知れない，ということである。最近，ＳＮＰからのＮＯの遊離は，ＳＮＰ分子からのシアンイオンの発生によって進行するのではないかと報告された(Roncaroli F.，Olabe J.A.，van Eldik R.，Inorg. Chem.，42，4179-4189(2003)。シアンイオンの毒作用に関しては，呼吸鎖の終末酵素であるシトクロムｃを抑制することが古くから知られている。従って，ＳＮＰにＭＴＴ還元反応の促進効果がないのは，Ｆｅイオンおよび（または）シアンイオンに起因するのかも知れない。総合すると，これらの知見は，ＮＯが，アコニターゼからＦｅを除去できるものの，また一方Ｆｅを運ぶこともできる，いわばこの酵素にとって低分子量Ｆｅシャペロンとしての役割を演じていることを示唆している。

今や，ＮＯが壊死やアポトーシスを誘導できることも，また細胞を死から保護することさえできることが明らかである。しかしながら，これらの逆説的な作用を決定づけるファクターは，これまで殆ど知られていない。ＮＯの傷害作用と保護作用という相矛盾する結果の多くは，神経系（非特許文献１８），前立腺癌（非特許文献２０），及び赤白血病細胞（非特許文献１９）中のＮＯの酸化還元状態の違いや，マクロファージ，神経細胞，又は肝細胞等の細胞タイプの違いや，ＮＯへの曝露のレベル（非特許文献２１）の違いのためであると考えられてきた。しかしながら，最近細胞内のＦｅ含量が，細胞の生存に対する効果を決定するための，要をなす別の１ファクターであると考えられている。Kim等（非特許文献２１）は，肝細胞の非ヘムＦｅの含量が，種々の細胞毒性のレベルのＮＯがアポトーシスをもたらすか壊死をもたらすかを決定していることを示唆している。実際，ＮＯ供与体は，低含量の非ヘムＦｅを含むハツカネズミのマクロファージにアポトーシスを誘導し，これに対し，高い含量の非ヘムＦｅを含む肝細胞ではアポトーシスを誘導しなかった。しかしながら，ＦｅＳＯ_４でマクロファージを前処理すると，細胞内Ｆｅを肝細胞内と近似のレベルにまで高め，且つＮＯ誘導性の細胞死を遅らせた。更に，ＮＯ仲介型のＤＮＡ損傷が，腫瘍細胞にアポトーシスによる細胞死を誘導することが知られている（非特許文献１０）が，実際ＳＮＰやＦｅＣＮ等のようなＦｅ含有化合物の同時添加は，腫瘍細胞のＮＯ仲介型の増殖阻害及びアポトーシスから保護した。総合すると，これらの知見は，細胞内の鉄含量の上昇は，マクロファージ及び腫瘍細胞を，ＮＯ仲介型の増殖阻害及びアポトーシスから救出し得ることを示唆している。

今回の研究においては，ＳＩＮ及びＮＯＣ１８は，混合ニューロン・グリア培養に対して，［Ｆｅ(II)(β−ＣＧ)］複合体の添加によってＭＴＴ還元活性を高めたが，他方何れのＮＯ供与体もＦｅ(II)ＡＳ及び［Ｆｅ(III)(クエン酸)］の存在下では効果がなかった（図６Ｅ）。興味深いことに，［Ｆｅ(II)(β−ＣＧ)］存在下のＮＯＣ１８処理ウェルにおける生存ニューロンの数は，ＮＯＣ１８単独で処理したウェルのものよりも多く（図７Ｅ，Ｆ），これに対し，Ｆｅ(II)ＡＳのみ又はＮＯＣ１８とＦｅ(II)ＡＳで処理した殆ど全てのウェルで，生存ニューロンはほとんど見出されなかった（図７Ｃ，Ｄ）。以前にＮＯ供与体であるＳＩＮ又はＳ−ニトロソシステインから生じたＮＯが，今回の培養系に類似した混合ニューロン・グリア培養において神経毒性をもたらすことが報告されているが，その研究において用いられたＮＯ供与体の濃度は比較的高かった（非特許文献１８）。加えて，我々は以前，ミトコンドリアを含むin
vitro実験及び培養細胞において，ＡＰＳにより障害された後のアコニターゼ（[３Ｆｅ−４Ｓ]クラスター型）に，［Ｆｅ(II)(β−ＣＧ)］複合体を加えたところＦｅを受け渡すことができることを示している（非特許文献１７）。従って，これらの知見は，［Ｆｅ(II)(β−ＣＧ)］複合体の同時添加が，ＮＯの神経保護的効果を決定する上での鍵であることを示している。総合すると，ＮＯ供与体は，細胞内における［Ｆｅ(II)(β−ＣＧ)］複合体の利用を促進して，ミトコンドリア機能を増強することによりニューロンの生存数を著しく高めるものと考える。

最後に，ＮＯは，Ｆｅイオンに対しより高い親和性を有するが，その高い疎水性の故に細胞質又は細胞外の供給源から容易にミトコンドリアに到達すること（特許文献６），及びin vitroで（特許文献１４），マクロファージ内（非特許文献２１）で，及び腫瘍細胞内（非特許文献２２）で，ジニトロシル鉄複合体（NO―鉄複合体）を形成することが知られている。従って，［Ｆｅ(II)(β−ＣＧ)］複合体はミトコンドリア内のアコニターゼに対する高い親和性を有し，そのＦｅイオンをアコニターゼの［３Ｆｅ−４Ｓ］クラスターに挿入してこれを活性型に変えることができる（非特許文献１６，１７）このことから，ＮＯは，［Ｆｅ(II)(β−ＣＧ)］複合体のＦｅ部分と反応し，さらに［(ＮＯ)Ｆｅ(II)(β−ＣＧ)］複合体を形成してミトコンドリアに到達し，アコニターゼの活性化をもたらすものと考えられる。完全な証明のためには更なる検討を要するものの，β−ＣＧは，ミトコンドリア内のアコニターゼに向けられた荷札として機能すると考えられる。

ヒトを含む哺乳類の血中にはＦｅ(II)が十分な量で存在することから，β−ＣＧは，生体に投与されると容易に［Ｆｅ(II)(β−ＣＧ)］複合体を形成することができる。従って，生体へのβ−ＣＧの投与は，［Ｆｅ(II)(β−ＣＧ)］複合体の投与と実質上等価である。そして，β−ＣＧの投与により生体内で形成された［Ｆｅ(II)(β−ＣＧ)］複合体は，ＮＯの存在下に更に［(ＮＯ)Ｆｅ(II)(β−ＣＧ)］複合体を形成できる。この新たな複合体は，ミトコンドリア内に容易に到達し，酸化ストレスを受けて不活性化したアコニターゼへのＦｅ(II)の受け渡しを助け，アコニターゼの再活性化を促して，ミトコンドリア機能の回復を促進する。ここにおいて，ＮＯ源は内因性であってもよいが，ＮＯ供与体の投与を併せて行い生体側のＮＯ血中濃度を高めておくことが，β−ＣＧ単独投与の場合に較べ，顕著な効果を発揮させることができる。またβ−ＣＧをリポソーム等で内包した製剤あるいはβ−ＣＧを脂溶性の誘導体に変えた製剤も細胞内でその効果を発揮させることができると考えられる。

本発明は，酸化ストレスに曝されたミトコンドリア機能の回復を促進する薬剤として，糖尿病合併症の治療，心筋梗塞，脳梗塞等の心血管系疾患，アルツハイマー病，パーキンソン病やハンチントン病をはじめとする神経変性疾患，癌等を含む，酸化ストレスによるミトコンドリアの機能低下を伴う様々な疾患の治療（進行の抑制を含む）や予防に，また虚血状態の組織への血流の再開に際する虚血再灌流障害の治療（増悪の抑制を含む）や予防に有用である。

Claims

β−シトリル−Ｌ−グルタミン酸又はその薬剤学的に許容し得る塩を含んでおり，ＮＯ供与体の投与と併用されるものである，ミトコンドリア機能回復促進剤。
酸化ストレス関連疾患の治療用である，請求項１のミトコンドリア機能回復促進剤。
酸化ストレス関連疾患が，糖尿病合併症，心筋梗塞，脳梗塞，アルツハイマー，パーキンソン，ハンチントン病，癌，又は虚血再灌流障害である，請求項２のミトコンドリア機能回復促進剤。
虚血再灌流障害が，心筋虚血，脳虚血，又は臓器移植後の虚血再灌流障害である，請求項３のミトコンドリア機能回復剤。
ミトコンドリア・アコニターゼの再活性化促進剤である，請求項１〜４の何れかのミトコンドリア機能回復剤。
非経口投与用剤である，請求項１〜５の何れかのミトコンドリア機能回復促進剤。