JP6181073B2 - ピーナッツアレルギーの処置用医薬製剤およびその使用 - Google Patents
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Description
本発明は、免疫療法で使用しうる医薬製剤または組成物、および特に、ピーナッツアレルギーに罹患する哺乳類、例えばヒトの免疫療法に用いうる製剤または組成物に関する。本発明はさらに、アレルギーに罹患する哺乳類の免疫系を免疫療法により脱感作させるための治療的処置のための本発明の製剤もしくは組成物の使用、および特定のアレルギーを発症する高い素因を有する哺乳類の予防的処置における本発明の製剤もしくは組成物の使用に関する。
アレルゲン免疫療法は、減感作療法、免疫脱感作、減感作(hyposensibilization)、アレルゲン特異的免疫療法ともよばれ、免疫寛容を引き起こすために、アレルゲン、すなわち患者がアレルギー性を示す物質を、次第に用量を増やしながら患者にワクチン接種する、アレルギー障害の免疫療法の一形態である。
アレルゲン特異的免疫療法は、アレルギー障害の根底となる原因を処置する唯一の治療方法である。該免疫療法は、対費用効果の高い治療方法であり、クオリティオブライフの改善をもたらすものである。
免疫療法は、アレルギー性の症候の長期間での寛解をもたらし、関連するアレルギー応答の重症度を低下させ、かつ、アレルゲンに対して新たに感作する可能性を低下させることが示されている。免疫療法は、アレルゲンに対する免疫系の応答を調節することを目的とする。
一般的に、免疫療法は、例えば、舌下または皮下経路を介して特定のアレルゲンに繰り返し暴露させることにより、アレルギー患者の該アレルゲンに対する脱感作をもたらし、それにより、アレルギー性の症候を減少させることならびに、症候に基づく処置の使用を含む。
免疫療法の根底となる機構は、完全にはわかっていないが、免疫療法が、アレルゲンに対する免疫応答の変化を引き起こすということは受け入れられている。かかる変更には、少なくとも、ＩｇＥ合成の変化および特定のアレルゲンに対するアレルギー性の応答を低下させるＩｇＥ遮断抗体の産生が含まれる。また、Ｔｈ２のＴｈ１／Ｔ制御性細胞への変換が増加することも観察されている。分子レベルにおいて、根底となる機構は、アレルゲンを中和する、アレルゲン特異的なＩｇＧの優先的な誘導およびアレルゲン特異的なＩｇＥの低下に依存している。
一般的に、免疫療法は、アレルギー患者の低用量のアレルゲンに対する暴露を含む。該用量は、定期的、例えば１週間毎に、「維持」量に達するまで徐々に上昇させる。これはすなわち、維持量に達するまで１週間毎の注射を約４ヶ月間行うということである。ひとたび維持量に達すると、注射の頻度は低下し、例えば１ヶ月に１回の頻度で２、３年間行うようになる。一般的に、処置が長く、用量が高い程、治療の恩恵は大きくなる。
免疫療法が成功して完了した後では、３〜５年以上の長期間の保護が期待される。症候が見られはじめるもしくは再びみられるようになるか、または該個人が、以前の処置レジメンに含まれていなかった新しいアレルゲンに暴露されるようになった場合、治療を繰り返しうる。
ピーナッツは、食物誘導性のアレルギーの原因となる最も一般的な食物の１つである。ピーナッツアレルギーに対する治療的処置は未だ利用可能ではない。水性のピーナッツ抽出物を用いた特異免疫療法（ＳＩＴ）は、ピーナッツの経口摂取に対する寛容性を上昇さることが示された。しかし、Nelsonらの報告 (非特許文献１: J. Allergy Clin. Immunol. 1997 June;99(6 Pt 1):744-51)により、水性のピーナッツ抽出物は、維持期の注射の間ですら、許容できない全身性応答を引き起こすことが示された。したがって、Nelsonらは:「この処置方法を臨床適用するためには、修飾ピーナッツ抽出物が必要である」と結論づけている。
ピーナッツアレルギーの主要なアレルゲンは、ピーナッツ種子貯蔵蛋白質Ａｒａｈ１（ビシリン）およびＡｒａｈ２（コングルチン）である。近年の研究 (非特許文献２: Moverare et al., Int Arch Allergy Immunol; 2011; pp 282-290)により、ピーナッツアレルギーの疑いのある若年の成人のほとんどが、Ａｒａｈ１およびＡｒａｈ２に対するＩｇＥ抗体を有することが示された。これらの主要なアレルゲンに加えて、他のピーナッツカーネル蛋白質、例えばＡｒａｈ６に対するＩｇＥ反応性が報告されている。
ピーナッツアレルゲンのＡｒａｈ２およびＡｒａｈ６の、還元およびアルキル化による修飾により、これらのアレルゲン性蛋白質の低アレルゲン形態が得られることが報告されている。アレルゲン性の低さは、固相免疫アッセイにおけるＩｇＥ結合の低下または好塩基球のようなエフェクター細胞の活性化により示しうる。しかし、アレルゲンであるＡｒａｈ２およびＡｒａｈ６に、ピーナッツで見つかっている全てのアレルゲンが含まれるわけではなく、そのため、Ａｒａｈ２およびＡｒａｈ６にのみ基づく免疫療法または免疫ワクチン接種では、ピーナッツアレルギーの個体を（予防的に）処置するか、または脱感作させるのに十分ではないと考えられる。
還元およびアルキル化により、蛋白質中のジスルフィド結合は非可逆的に切断される。Ａｒａｈ２は４つのジスルフィド結合、Ａｒａｈ６は６つのジスルフィド結合を有する。還元およびアルキル化により、Ａｒａｈ２およびＡｒａｈ６の２次構造に主な変化が生じ、その結果としてＩｇＥ結合の損失およびエフェクター細胞の活性化が見られることが示されている。しかし、Ａｒａｈ２および、Ａｒａｈ６がそれより低い程度で、ピーナッツアレルギーの原因物質のごく一部しかなしていないことを考えると、Ａｒａｈ２およびＡｒａｈ６のみではピーナッツアレルギーの個体を処置するのに十分とは考えられない。
J. Allergy Clin. Immunol. 1997 June;99(6 Pt 1):744-51
Moverare et al., Int Arch Allergy Immunol; 2011; pp 282-290
本発明の目的は特に、ピーナッツアレルギーの治療または予防的処置用の医薬組成物または製剤を提供することである。すなわち、本発明の目的は、特に、患者を、ピーナッツまたはより具体的にはピーナッツのアレルゲンに対して脱感作させるための医薬組成物または製剤を提供することである。
これらの目的は、特に、添付の特許請求の範囲に記載する医薬組成物により果たされる。
具体的には、第一の局面によって、これらの目的は、特に、修飾ピーナッツ全抽出物と薬学的に許容される希釈剤および／または賦形剤とを含む医薬組成物により果たされ、ここれ、該修飾ピーナッツ全抽出物は、還元、続いてアルキル化されたピーナッツ全抽出物である。
本発明において、アレルゲンとは、免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）応答を通してアトピー性の哺乳類において過感受性応答を刺激しうる抗原として定義する。ほとんどの哺乳類は、顕著な免疫グロブリンＥ応答を、寄生虫感染にたいする防御としてのみ開始する。しかし、哺乳類の中には、多くの一般的な環境的抗原に対して応答するものがある。この遺伝的素因は、アトピーともよばれる。アトピー性の哺乳類では、非寄生性の抗原が望まないＩｇＥ産生を刺激し、その結果、過感受性もしくはアレルギーが引き起こされる。
本発明において、ピーナッツ全抽出物は、ピーナッツ中にみられる種子カーネル蛋白質を実質的に全て含むピーナッツ抽出物をさす。すなわち、本発明のピーナッツ全抽出物は、ピーナッツ中にみられる蛋白質の代理となるものであり、したがって、ピーナッツアレルギーの原因物質（アレルゲン）の代理となるものである。したがって、本発明のピーナッツ全抽出物は、Ａｒａｈ２およびＡｒａｈ６に加えて、他のピーナッツアレルゲンをも含み、その中には、主要ピーナッツアレルゲンであるＡｒａｈ１も含まれる。
本発明によれば、ピーナッツ全抽出物は、還元およびアルキル化により修飾されており、それにより、ピーナッツ全抽出物の蛋白質に存在するジスルフィド結合はアルキル化により崩壊し、その結果、ジスルフィド結合を含む蛋白質の二次構造が変化し、そのため、これらの蛋白質中のアレルギー応答を起こすＩｇＥエピトープが崩壊する。
ジスルフィド結合を還元する適当な薬剤は公知のものであり、例えば、２-メルカプトエタノール (β-ME)、ジチオトレイトール(ＤＴＴ)、ジチオエリトリトール、システイン、ホモシステイン、トリブチルホスフィン、亜硫酸塩、トリス(２-カルボキシエチル) ホスフィン(ＴＣＥＰ)、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、灰汁、グルタチオン、Ｅ−メルカプトエチルアミン、チオグリコール酸、メチルスルフィドまたはエチルスルフィドであってよい。
還元されたシステイン残基をアルキル化する適当な薬剤は公知のものであり、例えば、Ｎ−エチルマルイミド（ethylmalimide）、シスタミン、ヨードアセトアミド、ヨード酢酸、アルキルハロゲン化物、アルキル硫酸、アルケンまたは酵素であってよい。
Ａｒａｈ２およびＡｒａｈ６と対照的に、Ａｒａｈ１が、単一のＣｙｓ残基以外にジスルフィド結合を含まないことを考えると、主要アレルゲン蛋白質Ａｒａｈ１を含むピーナッツ全抽出物を還元およびメチル化させることにより、アレルゲン性を低下させることは驚くべきことである。したがって、Ａｒａｈ１の還元およびアルキル化は、二次構造の変化およびそれに伴うピーナッツ全抽出物のＩｇＥ結合の損失およびエフェクター細胞の活性化を引き起こすとは予期されない。これにもかかわらず、Ａｒａｈ１が主要なピーナッツアレルゲンであることを特に考えると、驚くべきことに、本発明の発明者らは、還元およびアルキル化がＡｒａｈ１に影響を与え、それにより、修飾ピーナッツ抽出物のアレルゲン性に影響を与えることを見出した。
本発明の第一の局面の好ましい態様によれば、本発明のピーナッツ全抽出物は、該ピーナッツ抽出物が還元およびアルキル化を受ける前に脱脂されている。脂質および他の脂肪性の物質を除くことにより、抽出物中の蛋白質の含有量が増加し、そのため、免疫性ＩｇＥエピトープの相対数が増加し、該抽出物のアレルゲン性が増加する。
本発明の第一の局面のさらに他の好ましい態様によれば、本発明のピーナッツ全抽出物は、可溶性のピーナッツカーネル蛋白質、より好ましくは少なくともＡｒａｈ１、Ａｒａｈ２およびＡｒａｈ６を含む。可溶性のピーナッツカーネル蛋白質は、全てではないにしても、ピーナッツ蛋白質Ａｒａｈ１、Ａｒａｈ２およびＡｒａｈ６のアレルゲンとなるエピトープの大部分を示すものである。
本発明の第一の局面の特に好ましい態様によれば、本発明のピーナッツ全抽出物は:
a) ピーナッツを粉砕してピーナッツ粉末を得;
b) 該ピーナッツを、アセトン５０mlあたりピーナッツ粉末５gを用いてアセトン中で３０分間インキュベートして脱脂ピーナッツ粉末を得；
c) 該脱脂ピーナッツ粉末を乾燥させ;
d) 該乾燥ピーナッツ粉末をｐＨ７〜９の緩衝液に懸濁し;
e) 生じた工程（ｄ）の上清を単離し、それにより、ピーナッツ全抽出物を得る；
ことにより得られる。
a) ピーナッツを粉砕してピーナッツ粉末を得;
b) 該ピーナッツを、アセトン５０mlあたりピーナッツ粉末５gを用いてアセトン中で３０分間インキュベートして脱脂ピーナッツ粉末を得；
c) 該脱脂ピーナッツ粉末を乾燥させ;
d) 該乾燥ピーナッツ粉末をｐＨ７〜９の緩衝液に懸濁し;
e) 生じた工程（ｄ）の上清を単離し、それにより、ピーナッツ全抽出物を得る；
ことにより得られる。
上述の方法は、可溶性ピーナッツアレルゲン性蛋白質の精製抽出物、すなわち、可溶性ピーナッツカーネル蛋白質に富む抽出物を提供し、該抽出物は還元およびアルキル化を容易に受けうる。
本発明の第一の局面の、他の特に好ましい態様によれば、本発明の医薬組成物はさらにアルミニウムを含む。驚くべきことに、本発明の組成物にアルミニウムを添加することにより、本発明の修飾ピーナッツ全抽出物のアレルゲン性がさらに低下することが明らかになった。
ＩｇＥ結合またはＩｇＥエピトープが有意に減少するため、本発明の医薬組成物は特に、患者におけるピーナッツアレルギーの脱感作、好ましくは免疫療法または免疫ワクチン接種による脱感作のための治療的処置において用いるのに適当である。
本発明によれば、免疫療法は、アレルギーに罹患している哺乳類、好ましくはヒトに、本発明の組成物を、該哺乳類の該アレルゲンに対するアレルギー性応答を低下させるかまたは除去するのに十分な量で、十分な期間投与することを含む。
典型的な十分量は、本発明の組成物を投与する個体の体重に対して約０.１ng/kg〜１０mg/kg、１０ng/kg〜約１００μg/kgまたは０.１μ/kg〜１μg/kgの本発明の組成物である。処置が、この範囲の中の低い用量の投与ではじまり、処置が進行するにつれて用量を増加させることを含むことはしばしばである。
脱感作処置には、患者は頻繁な投与、例えば最初は１日、２日または３日毎の投与を受け、徐々に頻度を低下させて、２週間または３週間に一度に低下させることが典型的に必要とされる。他の適当な脱感作プログラムは、注射の用量が徐々に増加する２〜４週間に１回の頻度の皮下注射を３〜６ヶ月の間行った後、最長約５年間の間、２〜４週間に１度の注射を続ける。舌下投与については特に、毎日投与を行うことも可能である。
脱感作手法はまた、急速脱感作、急速アレルゲン免疫療法、急速アレルゲンワクチン接種および急速（rapid or rush）免疫療法として、種々の相当する代替形態で慣用的に知られる、処置形態を含みうる。広義には、この手法は、アレルギー患者に、頻度の高い間隔で（例えば時間毎）、用量を増加させながらアレルゲンを、一連の注射による（または他の適当な担体を介した）投与によって、抽出物（すなわちアレルゲン）の免疫量または維持量に至るように進めることを目的とするものである。成功した場合、該患者はアレルゲンに対する抵抗性の改善を示し、アレルゲンに暴露しても完全な非応答を示すこともあり得る。
当該分野では、種々の脱感作手法が公知であり、例えば、アレルゲンに対する即時型の過感受性を有する患者を、促進免疫療法の前にプレドニゾンおよびヒスタミン拮抗薬で予め処置する方法と組み合わせて、促進急速免疫療法スケジュールと組み合わせて処置する方法を含みうる。
本発明を、本発明の好ましい態様である以下の実施例によりさらに詳細に記載する。実施例において、言及する図は以下の通りである：
図１は、個々のピーナッツアレルゲンおよびスペイン品種の抽出物のｒｐ−ＨＰＬＣパターンを示す。パネルＡ (個々のピーナッツアレルゲン): ピーク ７.３ml: Ａｒａｈ２; ピーク ９〜９.５ml: Ａｒａｈ６; ピーク １１ml: Ａｒａｈ１。パネルＢ (スペイン品種の抽出物): ブランク (MQ水); ピーク ７.３ml: Ａｒａｈ２; ピーク９〜９.５ml: Ａｒａｈ６; ピーク１１ml: Ａｒａｈ１;
図２は、修飾前後の個々のピーナッツアレルゲンのｒｐ−ＨＰＬＣパターンを示す。一番上のパネル: Ａｒａｈ１、矢印は修飾前（天然)および修飾後(ＲＡ)を示す。真ん中のパネル: Ａｒａｈ２、矢印は修飾前（天然)および修飾後(ＲＡ)を示す。一番下のパネル: Ａｒａｈ６、矢印は修飾前（天然)および修飾後(ＲＡ)を示す。;
図３は、修飾前後の個々のピーナッツアレルゲンの遠紫外線ＣＤスペクトルを示す。一番上のパネル: Ａｒａｈ１、矢印は修飾前（天然)および修飾後(ＲＡ)を示す。真ん中のパネル:Ａｒａｈ２、矢印は修飾前（天然)および修飾後(ＲＡ)を示す。一番下のパネル: Ａｒａｈ６、矢印は修飾前（天然)および修飾後(ＲＡ)を示す;
図４は、負荷後のピーナッツアレルギーマウスの体温を示す。上のパネル: 天然ピーナッツ抽出物を用いた負荷(０.１、０.６および３ mg/マウス)。下のパネル: 修飾ピーナッツ抽出物を用いた負荷(０.１、０.６および３ mg/マウス);
図５は、実施例６（Ａ）で用いた感作、脱感作および負荷手法のタイムラインおよび実施例７（Ｂ）で用いた感作、脱感作および負荷手法のタイムラインを示す;
図６は、９１日目に負荷試験を行ったマウスの体温（Ａ）および８５日目の肥満細胞の活性(Ｂ; ｍＭＣＰ−１)を示す;
図７は、１１２日目に負荷試験を行ったマウスの体温を示す;
図８は、全ての試験群の９９日目の血清中のｍＭＣＰ−１レベルを示す;
図９は、全ての試験群の９９日目の血清中のＩｇＥ (Ａ)、ＩｇＧ１ (Ｂ)およびＩｇＧ２ａ (Ｃ)のレベルを示す。
図１は、個々のピーナッツアレルゲンおよびスペイン品種の抽出物のｒｐ−ＨＰＬＣパターンを示す。パネルＡ (個々のピーナッツアレルゲン): ピーク ７.３ml: Ａｒａｈ２; ピーク ９〜９.５ml: Ａｒａｈ６; ピーク １１ml: Ａｒａｈ１。パネルＢ (スペイン品種の抽出物): ブランク (MQ水); ピーク ７.３ml: Ａｒａｈ２; ピーク９〜９.５ml: Ａｒａｈ６; ピーク１１ml: Ａｒａｈ１;
図２は、修飾前後の個々のピーナッツアレルゲンのｒｐ−ＨＰＬＣパターンを示す。一番上のパネル: Ａｒａｈ１、矢印は修飾前（天然)および修飾後(ＲＡ)を示す。真ん中のパネル: Ａｒａｈ２、矢印は修飾前（天然)および修飾後(ＲＡ)を示す。一番下のパネル: Ａｒａｈ６、矢印は修飾前（天然)および修飾後(ＲＡ)を示す。;
図３は、修飾前後の個々のピーナッツアレルゲンの遠紫外線ＣＤスペクトルを示す。一番上のパネル: Ａｒａｈ１、矢印は修飾前（天然)および修飾後(ＲＡ)を示す。真ん中のパネル:Ａｒａｈ２、矢印は修飾前（天然)および修飾後(ＲＡ)を示す。一番下のパネル: Ａｒａｈ６、矢印は修飾前（天然)および修飾後(ＲＡ)を示す;
図４は、負荷後のピーナッツアレルギーマウスの体温を示す。上のパネル: 天然ピーナッツ抽出物を用いた負荷(０.１、０.６および３ mg/マウス)。下のパネル: 修飾ピーナッツ抽出物を用いた負荷(０.１、０.６および３ mg/マウス);
図５は、実施例６（Ａ）で用いた感作、脱感作および負荷手法のタイムラインおよび実施例７（Ｂ）で用いた感作、脱感作および負荷手法のタイムラインを示す;
図６は、９１日目に負荷試験を行ったマウスの体温（Ａ）および８５日目の肥満細胞の活性(Ｂ; ｍＭＣＰ−１)を示す;
図７は、１１２日目に負荷試験を行ったマウスの体温を示す;
図８は、全ての試験群の９９日目の血清中のｍＭＣＰ−１レベルを示す;
図９は、全ての試験群の９９日目の血清中のＩｇＥ (Ａ)、ＩｇＧ１ (Ｂ)およびＩｇＧ２ａ (Ｃ)のレベルを示す。
実施例１ 試料回収および抽出物の製造
４つの異なる品種(ランナー、スペイン、バレンシアおよびバージニア種)を含む１２のピーナッツ試料を、Maleki博士(US Department of Agriculture, New Orleans, USA)よりご供与いただいた。これらの品種は、西欧および米国において通常消費されているものである。ピーナッツの一部を焙煎した(予め加熱した熱風循環炉内で、１４０℃にて１５分間)。
４つの異なる品種(ランナー、スペイン、バレンシアおよびバージニア種)を含む１２のピーナッツ試料を、Maleki博士(US Department of Agriculture, New Orleans, USA)よりご供与いただいた。これらの品種は、西欧および米国において通常消費されているものである。ピーナッツの一部を焙煎した(予め加熱した熱風循環炉内で、１４０℃にて１５分間)。
該ピーナッツを、手動により粉砕し、アセトンを用いて脱脂し(アセトン ５０mLでピーナッツ５gを３０分間脱脂した)、室温（ＲＴ）に置いて一晩乾燥させた。脱脂ピーナッツ粉末１gを５０mM Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ８.０） (１０% w/v) １０mLに懸濁し、１時間室温にて撹拌した。その後、試料を遠心分離し、上清を０.２μm セルロース膜フィルター(Whatman FP30/0,2 CA-S, Whatman GmbH, Dassel, Germany)に通して濾過し、さらなる試験に用いた。
該抽出物を単回使用量で−２０℃にて保存した。蛋白質濃度を、Bradford解析を用いて決定した。ウシ血清アルブミン (BSA ２mg/mL、Pierce, IL, USA) を用いて標準曲線を描き、５０〜５００μg/mLの範囲に希釈した。粗製ピーナッツ抽出物 (ＣＰＥ)を、５０mM Ｔｒｉｓ ＨＣｌ （ｐＨ８.０）を用いて４０倍希釈した。protein assay試薬（Bio-Rad, USA）を水で５倍に希釈した。標準および試料２０μLを、５倍希釈した試薬１mLと混合し、各試料および標準２５０μLを、フラット付き平底プレート（Ｆタイプ）のウェルに入れた。５０ mM Ｔｒｉｓ ＨＣｌ （ｐＨ８.０）をブランクとして用いた。結果を表１にまとめる。
実施例２ ピーナッツカーネル中のＡｒａｈ１、Ａｒａｈ２およびＡｒａｈ６の存在量
X-Bridge BEH Phenyl 3.5 μm column (2.1 x 150 mm, Waters, Ireland)を備えたAgilent 1200 series HPLCを用いたｒｐ−ＨＰＬＣ法によって、Ａｒａｈ１、Ａｒａｈ２およびＡｒａｈ６を定量化した。勾配溶出は、以下の移動相を用いて行った: (Ａ) ０.１ % Milli Q (MQ) 水中ＴＦＡおよび(Ｂ) ０.０８５% メタノール中ＴＦＡ。用いた勾配は、３% 溶出液Ｂ/分であり、溶出液Ｂ５０%から始めて１００%になるまで１５分間続けた。クロマトグラムは、２８０nmおよび２１５nmにて記録した。２１５nmにおける記録を、ピーク面積の比較に用いた。
X-Bridge BEH Phenyl 3.5 μm column (2.1 x 150 mm, Waters, Ireland)を備えたAgilent 1200 series HPLCを用いたｒｐ−ＨＰＬＣ法によって、Ａｒａｈ１、Ａｒａｈ２およびＡｒａｈ６を定量化した。勾配溶出は、以下の移動相を用いて行った: (Ａ) ０.１ % Milli Q (MQ) 水中ＴＦＡおよび(Ｂ) ０.０８５% メタノール中ＴＦＡ。用いた勾配は、３% 溶出液Ｂ/分であり、溶出液Ｂ５０%から始めて１００%になるまで１５分間続けた。クロマトグラムは、２８０nmおよび２１５nmにて記録した。２１５nmにおける記録を、ピーク面積の比較に用いた。
試料をMQ水を用いて蛋白質濃度を１ mg/mL に希釈し、ブランクにMQ水を用いた。ピーナッツアレルゲン Ａｒａｈ１、Ａｒａｈ２およびＡｒａｈ６の精製物を、ピークの指定に用いた。主要ピーナッツアレルゲン(Ａｒａｈ１、Ａｒａｈ２およびＡｒａｈ６) の分離したピークを定量し、全蛋白質面積あたりの％として表した。
図１aは、個々のＡｒａｈ１、Ａｒａｈ２およびＡｒａｈ６の精製形態を用いたこの解析の実施例を示す。これらのアレルゲンは、ベースラインが分離されており、該方法は抽出物中の定量化を考慮したものである。
図１ｂは、ピーナッツ抽出物の例を示し、矢印はＡｒａｈ１、Ａｒａｈ２およびＡｒａｈ６に相当するピークを示す。この抽出物において、Ａｒａｈ１が最も豊富なアレルゲンであることが示されている。
図１ｂは、ピーナッツ抽出物の例を示し、矢印はＡｒａｈ１、Ａｒａｈ２およびＡｒａｈ６に相当するピークを示す。この抽出物において、Ａｒａｈ１が最も豊富なアレルゲンであることが示されている。
全てのピーナッツ試料を、そのＡｒａｈ１、Ａｒａｈ２およびＡｒａｈ６の含有量について解析し、その結果を表２にまとめる。試験した全てのピーナッツ試料について、Ａｒａｈ１の含有量はＡｒａｈ２およびＡｒａｈ６よりも高い。
試験した全ての試料において、Ａｒａｈ１はＡｒａｈ２もしくはＡｒａｈ６より量が多い。
実施例３ 修飾はＡｒａｈ２およびＡｒａｈ６には影響を与えるが、Ａｒａｈ１には与えない。
精製したアレルゲンＡｒａｈ１、Ａｒａｈ２およびＡｒａｈ６を上に記載したように処理した。端的には、該アレルゲンをＤＴＴとともに１時間６０℃にてインキュベートし、ＩＡＡを添加し、該混合物を室温にて１．５時間インキュベートした。
精製したアレルゲンＡｒａｈ１、Ａｒａｈ２およびＡｒａｈ６を上に記載したように処理した。端的には、該アレルゲンをＤＴＴとともに１時間６０℃にてインキュベートし、ＩＡＡを添加し、該混合物を室温にて１．５時間インキュベートした。
処理したアレルゲンを、ｒｐ−ＨＰＬＣにより、移動度に影響があるかどうかについて試験した。図２より、Ａｒａｈ２およびＡｒａｈ６が影響を受けているのに対し、Ａｒａｈ１がこの修飾による影響を受けていないことが明らかにわかる。この点をさらに調べるため、さらなる試験：精製蛋白質の二次構造要素の含量を評価しうる遠紫外線ＣＤ分光法を行った。スペクトルを蛋白質濃度について標準化した。図３により、修飾はＡｒａｈ２およびＡｒａｈ６に影響を与えるが、Ａｒａｈ１には影響を与えないことを示す。
実施例４ 還元し、アルキル化したピーナッツ抽出物は低ＩｇＥ結合力価を示す。
ピーナッツアレルギーの患者２０人から回収した血清を得、ＩｇＥ ＥＬＩＳＡを行った。ＥＬＩＳＡプレートは、ピーナッツ抽出物でコートし、天然のピーナッツ抽出物のＩｇＥ結合力価を１とし、修飾ピーナッツ抽出物のＩｇＥ結合力価をその相対値とした。表３は、患者ごとの天然ピーナッツ抽出物に対して相対的な、修飾ピーナッツ抽出物の残存力価を示す。修飾ピーナッツ抽出物の残存力価の平均は、天然ピーナッツ抽出物の力価の７％である。
ピーナッツアレルギーの患者２０人から回収した血清を得、ＩｇＥ ＥＬＩＳＡを行った。ＥＬＩＳＡプレートは、ピーナッツ抽出物でコートし、天然のピーナッツ抽出物のＩｇＥ結合力価を１とし、修飾ピーナッツ抽出物のＩｇＥ結合力価をその相対値とした。表３は、患者ごとの天然ピーナッツ抽出物に対して相対的な、修飾ピーナッツ抽出物の残存力価を示す。修飾ピーナッツ抽出物の残存力価の平均は、天然ピーナッツ抽出物の力価の７％である。
実施例５ 修飾ピーナッツ抽出物の生体内安全性
以前に記載されている方法により、マウスをピーナッツ抽出物に対してアレルギー性にした。これらのマウス（群ごとに６個体）を、天然もしくは修飾ピーナッツ抽出物のいずれ化を用いて負荷試験を行った。その後、９０分間体温を測定した。該体温をプロットしたものを図４に示す。
以前に記載されている方法により、マウスをピーナッツ抽出物に対してアレルギー性にした。これらのマウス（群ごとに６個体）を、天然もしくは修飾ピーナッツ抽出物のいずれ化を用いて負荷試験を行った。その後、９０分間体温を測定した。該体温をプロットしたものを図４に示す。
天然ピーナッツ抽出物での負荷が、体温の急速かつ深い低下を伴う重症なアレルギー応答を引き起こすことは明らかである。これは０．１mg/mlの用量ですでに見られる。対照的に、修飾ピーナッツ抽出物での負荷は、３０倍高い用量（３mg/マウス）においてさえ該応答をひきおこさなかった。
実施例６および７
導入
ピーナッツアレルギー免疫療法の生体内マウスモデルにおいて、試験製剤を、その有効性について解析した。これらの実験は、化学的に修飾したピーナッツ抽出物（水酸化アルミニウムに吸着させていても吸着させていなくてもよい）が、ピーナッツに感作させたマウスを処置するのに有効に使用できる可能性があることを示す。
導入
ピーナッツアレルギー免疫療法の生体内マウスモデルにおいて、試験製剤を、その有効性について解析した。これらの実験は、化学的に修飾したピーナッツ抽出物（水酸化アルミニウムに吸着させていても吸着させていなくてもよい）が、ピーナッツに感作させたマウスを処置するのに有効に使用できる可能性があることを示す。
材料および方法
マウス
５週齢の、特定病原体不在のメスC３H/HeOuJマウスを、Charles River, Franceより購入した。全てのマウスを特定病原体不在条件下で動物飼育施設（ユトレヒト大学、オランダ）に収容した。実験は、ユトレヒト大学の動物実験委員会の承認を受けている。用いた食事には、植物蛋白質（ダイズを含む）が含まれていたが、ピーナッツ蛋白質は含まれていなかった。
マウス
５週齢の、特定病原体不在のメスC３H/HeOuJマウスを、Charles River, Franceより購入した。全てのマウスを特定病原体不在条件下で動物飼育施設（ユトレヒト大学、オランダ）に収容した。実験は、ユトレヒト大学の動物実験委員会の承認を受けている。用いた食事には、植物蛋白質（ダイズを含む）が含まれていたが、ピーナッツ蛋白質は含まれていなかった。
感作および負荷
マウス (群ごとのn=６) を、マウス一匹につき、ＰＢＳ ４００μl中のピーナッツ抽出物（ＰＥ） ６mgおよびコレラトキシン(ＣＴ、List Biological Laboratories, Inc.) １５μgを、０、１、２、７、１４、２１、２８日目に胃内(i.g.)投与することにより感作させた。対照マウスには、マウス一匹につき、ＰＢＳ４００μl中にＣＴ１５μgを含むＰＢＳを投与した。４２日目より、様々な群のマウスに様々な試験製剤(修飾PE +/- 水酸化アルミニウム)またはそのそれぞれの対照２００μlを用いて、首への皮下(s.c.)投与による脱感作を、１週間に３回を３週間（実施例５）または１週間に２回を６週間（実施例６）行った（図５）。以降、非アレルギー性ＰＢＳ感作マウスおよびアレルギー性ＰＥ感作マウス（免疫療法なし）を、それぞれ、ＰＢＳ対照およびＰＥ対照として示す。
マウス (群ごとのn=６) を、マウス一匹につき、ＰＢＳ ４００μl中のピーナッツ抽出物（ＰＥ） ６mgおよびコレラトキシン(ＣＴ、List Biological Laboratories, Inc.) １５μgを、０、１、２、７、１４、２１、２８日目に胃内(i.g.)投与することにより感作させた。対照マウスには、マウス一匹につき、ＰＢＳ４００μl中にＣＴ１５μgを含むＰＢＳを投与した。４２日目より、様々な群のマウスに様々な試験製剤(修飾PE +/- 水酸化アルミニウム)またはそのそれぞれの対照２００μlを用いて、首への皮下(s.c.)投与による脱感作を、１週間に３回を３週間（実施例５）または１週間に２回を６週間（実施例６）行った（図５）。以降、非アレルギー性ＰＢＳ感作マウスおよびアレルギー性ＰＥ感作マウス（免疫療法なし）を、それぞれ、ＰＢＳ対照およびＰＥ対照として示す。
アナフィラキシーの評価
アナフィラキシーショックの客観的パラメーターとして、体温を、腹腔内（i.p.）負荷の後、１０〜２０分ごとに９０分間直腸検温により測定した。該モデルの過程におけるいくつかのタイムポイントにおいて、血液を、抗体およびｍＭＣＰ−１(mast cell protease １)を測定するために採取した。９１日目 (実施例５)または１１２日目 (実施例６)に、マウスにi.p.負荷を行った直後、体温を９０分間経過観察した。
アナフィラキシーショックの客観的パラメーターとして、体温を、腹腔内（i.p.）負荷の後、１０〜２０分ごとに９０分間直腸検温により測定した。該モデルの過程におけるいくつかのタイムポイントにおいて、血液を、抗体およびｍＭＣＰ−１(mast cell protease １)を測定するために採取した。９１日目 (実施例５)または１１２日目 (実施例６)に、マウスにi.p.負荷を行った直後、体温を９０分間経過観察した。
実施例６
結果
９１日目のi.p.負荷の後、修飾ＰＥ製剤は、負荷後の体温低下により測定されるアナフィラキー応答を効果的に低下させた (図６Ａ)。様々な濃度の修飾ＰＥによる脱感作により、体温により測定されるアナフィラキーショック応答の改善について、０.０３mgおよび０.１ mgを比較して、濃度依存的な効果が小さいことが示された(図６Ａ)。
最も濃度の高い２つである、０.１および１mg ｍＰＥを比較しても、体温に違いは観察されない (図６Ａ)。ｍＰＥによる免疫療法後における、体温低下の減少によって示されるアナフィラキーショック応答の改善は、同様に、８５日目における肥満細胞の活性化レベルによっても示される (ｍＭＣＰ−１; 図６Ｂ)。試験した中で高い２つのＩＴ用量(それぞれ、０.１および１mg/マウス)では、肥満細胞の活性が低下していたのに対し、最も低い用量 (０.０３mg/マウス) では改善は見られなかった。
結果
９１日目のi.p.負荷の後、修飾ＰＥ製剤は、負荷後の体温低下により測定されるアナフィラキー応答を効果的に低下させた (図６Ａ)。様々な濃度の修飾ＰＥによる脱感作により、体温により測定されるアナフィラキーショック応答の改善について、０.０３mgおよび０.１ mgを比較して、濃度依存的な効果が小さいことが示された(図６Ａ)。
最も濃度の高い２つである、０.１および１mg ｍＰＥを比較しても、体温に違いは観察されない (図６Ａ)。ｍＰＥによる免疫療法後における、体温低下の減少によって示されるアナフィラキーショック応答の改善は、同様に、８５日目における肥満細胞の活性化レベルによっても示される (ｍＭＣＰ−１; 図６Ｂ)。試験した中で高い２つのＩＴ用量(それぞれ、０.１および１mg/マウス)では、肥満細胞の活性が低下していたのに対し、最も低い用量 (０.０３mg/マウス) では改善は見られなかった。
実施例７
結果
１１２日目のi.p.負荷試験の後、免疫療法製剤(修飾ＰＥ単独およびアルミニウムに吸着させたもの)は、ともに、負荷後の体温低下により測定されるアナフィラキシー応答を効果的に低下させた(図７)。
結果
１１２日目のi.p.負荷試験の後、免疫療法製剤(修飾ＰＥ単独およびアルミニウムに吸着させたもの)は、ともに、負荷後の体温低下により測定されるアナフィラキシー応答を効果的に低下させた(図７)。
アルミニウムに吸着させた抽出物は、吸着させない抽出物と比較して、有効性プロファイルがわずかに改善した(図７Ａ)。アルミニウムに吸着させた、様々な濃度の修飾ＰＥによる脱感作は、温度により測定されるアナフィラキシーショック応答の改善に対する濃度依存的な効果を示した（図７）。
ｍＭＣＰ−１および抗体 (ＩｇＥ、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ)のレベルを、モデルの過程において、全ての群の血清において測定した。これらの免疫学的パラメーターに対する免疫療法の９９日目における効果が示されている（図８および９）。
ｍＭＣＰ−１レベルは、陰性ＰＢＳ対照と比較して、全ての群で上昇していた。修飾ＰＥで脱感作した群は、免疫療法を受けていないマウス（ＰＥ対照）およびアルミニウムに吸着させた修飾ＰＥで脱感作したマウスと比較して、ｍＭＣＰ−１が増加していた（図８）。
ＩｇＥレベルは、陰性ＰＢＳ対照と比較して全ての群で、高くなっていた。臨床において一般的に見られるように、免疫療法は、ＩｇＥのレベルを上昇させる（図９Ａ）。これは、免疫療法により免疫系がブーストされていることを示す。該上昇は、注射の過程の間においてより高く、時間とともにわずかに低下する（データは示さない）。
免疫療法を受けたマウスは、アルミニウムに吸着させた抽出物および吸着させていない抽出物を用いた場合に匹敵するレベルで、血清中のＩｇＧ１レベルの上昇を示した（図９Ｂ）。ＩｇＧ２ａレベルの上昇（ヒトにおけるＩｇＧ４に匹敵する）は、アルミニウムに吸着させたピーナッツ製剤で処理した群が優位を占めた（図９ｃ）。
結論
還元およびアルキル化により修飾したピーナッツ抽出物は、i.p.負荷後のマウスにおけるアナフィラキシー応答を改善することができる。様々な免疫療法モデル(皮下注射、１週間に３回を３週間または１週間に２回を６週間)により、匹敵する有効な結果が得られることが示された。有効性は、ピーナッツ抽出物を水酸化アルミニウムに吸着させた後ではわずかに上昇する。これは、これらのマウスにおいて、ＩｇＧ２ａ（ヒトＩｇＧ４に匹敵）のレベルが上昇することによるものであり得る。
還元およびアルキル化により修飾したピーナッツ抽出物は、i.p.負荷後のマウスにおけるアナフィラキシー応答を改善することができる。様々な免疫療法モデル(皮下注射、１週間に３回を３週間または１週間に２回を６週間)により、匹敵する有効な結果が得られることが示された。有効性は、ピーナッツ抽出物を水酸化アルミニウムに吸着させた後ではわずかに上昇する。これは、これらのマウスにおいて、ＩｇＧ２ａ（ヒトＩｇＧ４に匹敵）のレベルが上昇することによるものであり得る。
Claims (8)
- 修飾ピーナッツ全抽出物およびアルミニウムと、薬学的に許容される希釈剤および／または賦形剤とを含む医薬組成物であって、該修飾ピーナッツ全抽出物が、還元され、続いてアルキル化されたピーナッツ全抽出物であり、Ａｒａｈ１、Ａｒａｈ２およびＡｒａｈ６を含み、かつ水酸化アルミニウムに吸着されている、医薬組成物。
- 該ピーナッツ全抽出物が脱脂されている、請求項１に記載の医薬組成物。
- 該ピーナッツ全抽出物が可溶性ピーナッツカーネル蛋白質を含む、請求項１または２記載の医薬組成物。
- アレルギーに罹患する哺乳類の免疫療法による処置において用いるための、請求項１〜３のいずれかに記載の組成物。
- 該哺乳類がヒトである、請求項４に記載の組成物。
- アレルゲンについて哺乳類の免疫系を脱感作するために治療的処置に用いるか、または該アレルゲンへの接触時にアレルギーを発症する素因が高い哺乳類の予防的処置に用いるための、請求項１〜３のいずれかに記載の組成物。
- 該哺乳類がヒトである、請求項６に記載の組成物。
- 医薬に用いるための、請求項１〜３のいずれかに記載の組成物。
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