JP6168520B2

JP6168520B2 - インドール化合物、ｄｐプロスタノイド受容体アンタゴニスト、それを用いた薬剤、及びｄｐプロスタノイド受容体アンタゴニストの使用。

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Publication number: JP6168520B2
Application number: JP2013192422A
Authority: JP
Inventors: 孝義荒井; 裕道藤野; 俊彦村山; 聡美大山; 篤子阿波田
Original assignee: Chiba University NUC
Current assignee: Chiba University NUC
Priority date: 2013-09-17
Filing date: 2013-09-17
Publication date: 2017-07-26
Anticipated expiration: 2033-09-17
Also published as: JP2015059091A

Description

本発明は、インドール化合物、ＤＰプロスタノイド受容体アンタゴニスト、それを用いた薬剤、及びＤＰプロスタノイド受容体アンタゴニストの使用に関する。

アラキドン酸は、シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）により中間代謝物であるプロスタグランジン（ＰＧ）Ｈ_２へと変換され、さらにそれぞれのＰＧ及びトロンボキサン（ＴＸ）合成酵素によってＰＧＤ_２、ＰＧＥ_２、ＰＧＦ_２α、ＰＧＩ_２、ＴＸＡ_２に変換される。

ＰＧ、ＴＸはプロスタノイドと総称され、各々に選択的な受容体としてＤＰ、ＥＰ、ＦＰ、ＩＰ、ＴＰが同定されている。これらプロスタノイド受容体はいずれも７回膜貫通型のＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）である。

プロスタノイドの作用は非常に幅広く、組織ごとの発現やそれぞれの受容体からのシグナル伝達経路により制御され、炎症性疾患を始めとした様々な病態に関与している。例えば、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）は、ＣＯＸ活性を抑制することによりプロスタノイドの生成を阻害し抗炎症作用を現す。

ところで、近年の研究により、ＮＳＡＩＤにはＣＯＸ阻害作用に加えて、ＣＯＸ阻害非依存的な作用も報告されている（例えば下記非特許文献１参照）。一般的なＮＳＡＩＤであるインドメタシンもＣＯＸ阻害非依存的な作用の存在が明らかになりつつある。

そのひとつとして、下記非特許文献２、３には、インドメタシンがペルオキシゾーム増殖剤応答性受容体（ＰＰＡＲ）γに直接結合しアゴニストとして活性化させること、ＰＰＡＲγのアンタゴニストとして作用すること、が記載されている。

また、下記非特許文献４、５には、インドメタシンによるＰＰＡＲγをターゲットとした脂肪酸トランスポーターｆａｔｔｙａｃｉｄｔｒａｎｓｌｏｃａｓｅ（ＦＡＴ／ＣＤ３６）のダウンレギュレーション、それに伴うアラキドン酸取り込みの抑制作用が記載されている。

さらに、下記非特許文献６には、ヒト肺癌Ａ５４９細胞株にインドメタシンを処理することにより、ＰＰＡＲγ依存的な上皮−間葉転換（ＥＭＴ）が引き起こされることが記載されている。

また、プロスタノイド受容体に対しては、インドメタシンがＤＰ受容体に対してアンタゴニスト作用を示すことが例えば下記非特許文献７に記載されている。また、インドメタシンがＣＲＴＨ２受容体に対してアゴニスト作用を示すことが例えば下記非特許文献８に記載されている。

また、インドメタシンがＰＧＥ_２受容体の１つであるＥＰ２受容体に対してアンタゴニスト様に作用することが、例えば下記非特許文献９に記載されている。

ＴｅｇｅｄｅｒＩ，ＰｆｅｉｌｓｃｈｉｆｔｅｒＪ，ＧｅｉｓｓｌｉｎｇｅｒＧ．、（２００１）Ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔａｃｔｉｏｎｓｏｆｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．、ＦＡＳＥＢＪ．、１５（１２）：２０５７−７２．ＬｅｈｍａｎｎＪＭ，ＬｅｎｈａｒｄＪＭ，ＯｌｉｖｅｒＢＢ，ＲｉｎｇｏｌｄＧＭ，ＫｌｉｅｗｅｒＳＡ．、（１９９７）Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄｒｅｃｅｐｔｏｒｓａｌｐｈａａｎｄｇａｍｍａａｒｅａｃｔｉｖａｔｅｄｂｙｉｎｄｏｍｅｔｈａｃｉｎａｎｄｏｔｈｅｒｎｏｎ−ｓｔｅｒｏｉｄａｌａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｄｒｕｇｓ．、ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ．、２７２（６）：３４０６−１０．Ｂｉｓｈｏｐ−ＢａｉｌｅｙＤ，ＷａｒｎｅｒＴＤ．、（２００３）ＰＰＡＲｇａｍｍａｌｉｇａｎｄｓｉｎｄｕｃｅｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｉｎｖａｓｃｕｌａｒｓｍｏｏｔｈｍｕｓｃｌｅｃｅｌｌｓ：ｉｎｄｏｍｅｔｈａｃｉｎａｃｔｓａｓａｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｇａｍｍａａｎｔａｇｏｎｉｓｔ．、ＦＡＳＥＢＪ．、１７（１３）：１９２５−７．ＯｒｉｄｏＴ，ＦｕｊｉｎｏＨ，ＨａｓｅｇａｗａＹ，ＴｏｙｏｍｕｒａＫ，ＫａｗａｓｈｉｍａＴ，ＭｕｒａｙａｍａＴ．、（２００８）ＩｎｄｏｍｅｔｈａｃｉｎｄｅｃｒｅａｓｅｓａｒａｃｈｉｄｏｎｉｃａｃｉｄｕｐｔａｋｅｉｎＨＣＡ−７ｈｕｍａｎｃｏｌｏｎｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓ．、ＪＰｈａｒｍａｃｏｌＳｃｉ．、１０８（３）：３８９−９２．ＯｒｉｄｏＴ，ＦｕｊｉｎｏＨ，ＫａｗａｓｈｉｍａＴ，ＭｕｒａｙａｍａＴ．、（２０１０）ＤｅｃｒｅａｓｅｉｎｕｐｔａｋｅｏｆａｒａｃｈｉｄｏｎｉｃａｃｉｄｂｙｉｎｄｏｍｅｔｈａｃｉｎｉｎＬＳ１７４Ｔｈｕｍａｎｃｏｌｏｎｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓ；ａｎｏｖｅｌｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ−２−ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｅｆｆｅｃｔ．ＡｒｃｈＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙｓ．４９４（１）：７８−８５．ＫａｔｏＴ，ＦｕｊｉｎｏＨ，ＯｙａｍａＳ，ＫａｗａｓｈｉｍａＴ，ＭｕｒａｙａｍａＴ．、（２０１１）Ｉｎｄｏｍｅｔｈａｃｉｎｉｎｄｕｃｅｓｃｅｌｌｕｌａｒｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｎｇｅａｎｄｍｉｇｒａｔｉｏｎｖｉａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ−ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｉｎＡ５４９ｈｕｍａｎｌｕｎｇｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓ：ａｎｏｖｅｌｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ−ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｅｆｆｅｃｔ．、ＢｉｏｃｈｅｍＰｈａｒｍａｃｏｌ．、８２（１１）：１７８１−９１．ＪｏｎｅｓＲＬ，ＧｉｅｍｂｙｃｚＭＡ，ＷｏｏｄｗａｒｄＤＦ．、（２００９）Ｐｒｏｓｔａｎｏｉｄｒｅｃｅｐｔｏｒａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ：ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓｔｒａｔｅｇｉｅｓａｎｄｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．、ＢｒＪＰｈａｒｍａｃｏｌ．、１５８（１）：１０４−４５．ＨｉｒａｉＨ，ＴａｎａｋａＫ，ＴａｋａｎｏＳ，ＩｃｈｉｍａｓａＭ，ＮａｋａｍｕｒａＭ，ＮａｇａｔａＫ．、（２００２）Ｃｕｔｔｉｎｇｅｄｇｅ：ａｇｏｎｉｓｔｉｃｅｆｆｅｃｔｏｆｉｎｄｏｍｅｔｈａｃｉｎｏｎａｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎＤ２ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＣＲＴＨ２．、ＪＩｍｍｕｎｏｌ．、１６８（３）：９８１−５．ＩｋａｗａＹ，ＦｕｊｉｎｏＨ，ＯｔａｋｅＳ，ＭｕｒａｙａｍａＴ．、（２０１２）ＩｎｄｏｍｅｔｈａｃｉｎａｎｔａｇｏｎｉｚｅｓＥＰ（２）ｐｒｏｓｔａｎｏｉｄｒｅｃｅｐｔｏｒａｃｔｉｖａｔｉｏｎｉｎＬＳ１７４Ｔｈｕｍａｎｃｏｌｏｎｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓ．、ＥｕｒＪＰｈａｒｍａｃｏｌ．、６８０（１−３）：１６−２１．

上記のとおり、プロスタノイドの作用は非常に幅広く、組織ごとの発現やそれぞれの受容体からのシグナル伝達経路により制御されており、炎症性疾患を始めとした様々な病態に関与しているが、医薬品として使用されているものの多くはＣＯＸを標的とした薬である。

しかしながら、プロスタノイド受容体を標的とした医薬品はほとんど存在せず、各受容体選択的な薬剤が望まれている。

そこで、本発明は、上記課題を鑑み、新規なインドール化合物、ＤＰプロスタノイド受容体アンタゴニスト、それを用いた薬剤、及びＤＰプロスタノイド受容体アンタゴニストの使用を提供することを目的とする。

上記課題を解決する本発明の一観点に係るインドール化合物は、下記式（１）で示される。

上記式において、Ｒ^１は、Ｈ、Ｍｅ、Ｅｔ、Ｂｎ、Ｔｓ、Ｍｓ、Ａｃ、Ｂｚ、ＭＯＭ、ＭＥＭ、ＳＥＭ、又はＡｌｌｏｃである。また、Ｒ^２は、Ｈ、Ｍｅ、Ｅｔ、Ｂｎ、ハロゲン、アルコキシ、アミノ、アシル基、又はニトロ基である。Ｒ^２は、インドール骨格の炭素上であれば、いずれ位置に複数結合していてもよい。

また、本発明の他の一観点におけるＤＰプロスタノイド受容体アンタゴニストは、下記式（１）で示されるインドール化合物を含む。

また、本発明の他の一観点における薬剤は、下記式（１）で示されるインドール化合物を含む。

また、本発明の他の一観点におけるＤＰプロスタノイド受容体アンタゴニストの使用は、薬剤の製造における下記式（１）で示すインドール化合物を含むＤＰプロスタノイド受容体アンタゴニストの使用である。

以上、本発明によって、新規なインドール化合物、ＤＰプロスタノイド受容体アンタゴニスト、それを用いた薬剤、及びＤＰプロスタノイド受容体アンタゴニストの使用を提供することができる。

ヒト結腸癌細胞株ＬＳ１７４Ｔ細胞にインドール化合物を前処理した後、ＢＷ２４５Ｃで刺激した後のｃＡＭＰ産生量を測定した結果を示す図である。ＤＰ受容体を過剰発現したヒトＨＥＫ２９３モデル細胞を用い、１ｎＭＰＧＤ_２刺激によるｃＡＭＰ産生量を測定した結果を示す図である。細胞にＡＷＴ−４８９を前処理し、１ｎＭＰＧＥ_２刺激によるｃＡＭＰ産生量を測定した結果を示す図である。ＤＰ受容体を過剰発現したＨＥＫ２９３細胞への[^３Ｈ]−ＰＧＤ_２結合量を示す図である。実際のヒト結腸癌ＬＳ１７４Ｔ細胞株を用いてＡＷＴ−４８９によるｃＡＭＰ産生抑制作用について検討を行った結果を示す図である。既存のＤＰ受容体アンタゴニストであるＢＷＡ８６８ＣとＡＷＴ−４８９の作用を比較した結果を示す図である。ＰＧＤ_２またはＢＷ２４５Ｃ刺激による用量作用曲線における１０μＭＡＷＴ−４８９または１０ｎＭＢＷＡ８６８Ｃ前処理による影響を検討した結果を示す図である。ＰＧＤ_２またはＢＷ２４５Ｃ刺激による用量作用曲線における１０μＭＡＷＴ−４８９または１０ｎＭＢＷＡ８６８Ｃ前処理による影響を検討した結果を示す図である。ＤＰ受容体刺激によるＣＤ５５発現への効果を検討した結果を示す図である。ＤＰ受容体刺激によるＣＤ５５発現への効果を検討した結果を示す図である。ＡＷＴ−４８９のＰＧＤ_２刺激、又は、ＢＷ２４５Ｃ刺激によるＣＤ５５発現上昇への効果を検討した結果を示す図である。ＣＤ５５発現量のタンパク質レベルにおけるＡＷＴ−４８９の効果を確認した結果を示す図である。ＡＷＴ−４８９のＤＰ受容体アンタゴニスト作用が可逆的かどうかについて検討を行った結果を示す図である。ＰＧＤ_２がＤＰ受容体だけでなくＧｉタンパク質と共役しているＣＲＴＨ２受容体にも作用することを示す図である。ＬＳ１７４Ｔ細胞におけるＡＷＴ−４８９によるｃＡＭＰ産生量の減少が、ＡＷＴ−４８９がＣＲＴＨ２受容体のアゴニストとして作用していることに起因する可能性について検討した結果を示す図である。ＬＳ１７４Ｔ細胞におけるＡＷＴ−４８９によるｃＡＭＰ産生量の減少が、ＡＷＴ−４８９がＣＲＴＨ２受容体のアゴニストとして作用していることに起因する可能性について検討した結果を示す図である。ＬＳ１７４Ｔ細胞におけるＡＷＴ−４８９によるｃＡＭＰ産生量の減少が、ＡＷＴ−４８９がＣＲＴＨ２受容体のアゴニストとして作用していることに起因する可能性について検討した結果を示す図である。

以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は多くの異なる態様で実施することが可能であり、以下に示す実施形態に限定されるものではない。

（インドール化合物）
まず、本実施形態に係るインドール化合物（以下「本化合物」という。）は、下記式（１）で示される。

ここでＲ^１は、Ｈ、Ｍｅ、Ｅｔ、Ｂｎ、Ｔｓ、Ｍｓ、Ａｃ、Ｂｚ、ＭＯＭ、ＭＥＭ、ＳＥＭ、又はＡｌｌｏｃである。また、Ｒ^２は、Ｈ、Ｍｅ、Ｅｔ、Ｂｎ、ハロゲン、アルコキシ、アミノ、アシル基、又はニトロ基である。Ｒ^２は、インドール骨格の炭素上であれば、いずれ位置に複数結合していてもよい。

（ＤＰプロスタノイド受容体アンタゴニスト）
また、上記化合物は、後述の記載から明らかとなるが、ＤＰプロスタノイド受容体アンタゴニストでもある。

（薬剤）
また、上記化合物は、後述の記載から明らかとなるが、ＤＰプロスタノイド受容体アンタゴニストもあって、薬剤として使用することができると考えられる。この薬剤は、効果を発揮することができる用途において限定されるわけではないが、癌抑制作用を有する薬剤、より具体的には抗がん剤であることが好ましい。この薬剤はＮＳＡＩＤとしての抗炎症作用を有しないため、ＮＳＡＩＤの副作用である胃腸管障害などを引き起こすおそれがないと考えられる。

薬剤として用いる場合、上記化合物のほか、薬学的に許容される通常の担体、結合剤、賦形剤、希釈剤（例えば蒸留水）、ｐＨ緩衝材（例えばリン酸緩衝生理食塩水）、崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤、等張剤等の各種調剤用配合剤成分を含有することができる。

また本実施形態に係る薬剤は、その使用形態に応じて経口的に又は非経口的に投与することができる。経口的な投与としては通常用いられる投与形態、例えば粉末、顆粒、錠剤、カプセル剤、液剤、懸濁液、油剤、乳化剤等の投与形態を採用することができる。非経口的な投与としては、通常用いられる投与形態、例えば上記の液剤、懸濁液等にしたものを点滴や注射により投与する形態、直接損傷部位に投与する形態等を採用することができる。

本実施形態に係る薬剤の投与量は、患者の体重、性別、神経損傷の程度、投与の方法に応じて適宜選択されうる。

（プロスタノイド受容体アンタゴニストの使用）
また、本化合物は、薬剤の製造において、ＤＰプロスタノイド受容体アンタゴニストとして使用することができる。

また、本化合物は、癌抑制作用を有する薬剤、より具体的には抗がん剤の、又は、胃腸管障害などの炎症性疼痛を発症するリスクが高い被検体においてこの作用の軽減をもたらす薬剤の開発のためのリード化合物として、効果の高い癌治療薬の開発につながると期待される。

（製造方法）
また、本実施形態において、本化合物は、合成することができる限りにおいて限定されるわけではないが、例えば特開２０１２−０９２０６６号公報に記載の技術、及び、“Ａｒａｉ，Ｔ．；Ａｗａｔａ，Ａ．；Ｗａｓａｉ，Ｍ．；Ｙｏｋｏｙａｍａ，Ｎ．；Ｍａｓｕ，Ｈ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２０１１，７６，５４５０−５４５６．”を参照して合成することができる。より具体的には、下記式（Ａ）で示すように、三置換ニトロアクリレート１とインドール２を反応させることで合成することができる。

なお、上記式（Ａ）において用いられる触媒を形成する下記式（２）で示される配位子も、合成できる限りにおいて限定されるわけではないが、例えば特許第５１３１８１８号明細書、及び、“Ｙｏｋｏｙａｍａ，Ｎ．；Ａｒａｉ，Ｔ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．２００９，３２８５−３２８７．”に記載の方法によって合成することができる。

以上、本実施形態によって、新規なインドール化合物、ＤＰプロスタノイド受容体アンタゴニスト、それを用いた薬剤、及びＤＰプロスタノイド受容体アンタゴニストの使用を提供することができる。

ここで、上記実施形態に係る化合物について実際に作成を行い、その効果を確認した。以下具体的に説明する。

（インドール化合物の合成）
まず、上記実施形態に記載の方法を用いて、以下に示す５種類の光学活性非対称インドール化合物を用意した。

次に、上記化合物それぞれに対し、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で処理することによりｔＢｕ基を除去し、カルボン酸とした下記５種類の化合物（ＡＷＴ−４８９，ＡＷＴ−７４６，ＡＷＴ−７４７，ＡＷＴ−７４８，ＡＷＴ−７４９）を得た。具体的には、０．５ｍｌのジクロロメタン中に０．１５０ｍｍｏｌの上記いずれかの化合物を溶解させた溶液に、室温下、０．５ｍｌトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を加え、一時間攪拌後、減圧下にて溶媒を除去し、トルエン１ｍｌを加えトリフルオロ酢酸を共沸させることによって、カルボン酸とした５種類の化合物（ＡＷＴ−４８９，ＡＷＴ−７４６，ＡＷＴ−７４７，ＡＷＴ−７４８，ＡＷＴ−７４９）を定量的に得た。

（スクリーニング）
ＤＰ受容体の発現が確認されているヒト結腸癌細胞株ＬＳ１７４Ｔ細胞に１０μＭのインドール化合物を１５分間前処理後、１ｎＭＢＷ２４５Ｃ（ＤＰｒｅｃｅｐｔｏｒａｇｏｎｉｓｔ）で刺激し、１時間後のｃＡＭＰ産生量を測定した。この結果を図１に示しておく。本図で示すように、５種類のインドール化合物の中で、ＡＷＴ−４８９が最も強くｃＡＭＰ産生量を抑制していることを確認した。

（ＤＰ受容体発現ＨＥＫ２９３細胞株におけるＡＷＴ−４８９のｃＡＭＰ産生への影響）
次に、上記ＬＳ１７４Ｔ細胞で確認されたＡＷＴ−４８９によるｃＡＭＰ産生抑制作用の詳細を検討するため、ＤＰ受容体を過剰発現したヒトＨＥＫ２９３モデル細胞を用い、１ｎＭＰＧＤ_２刺激によるｃＡＭＰ産生量を測定した。この結果を図２に示す。

この測定において、ＡＷＴ−４８９単独処理ではｃＡＭＰ産生は引き起こされなかった（●）。しかしながらＰＧＤ_２刺激により亢進したｃＡＭＰ産生量に対して、ＡＷＴ−４８９は濃度依存的に抑制した（○）（図２Ａ）。

次に、ＡＷＴ−４８９のＰＧＤ_２の用量作用曲線への影響を検討した。その結果１０μＭＡＷＴ−４８９を前処理することで（○）ＰＧＤ_２の用量作用曲線は右へとシフトした（図２Ｂ）。

（ＥＰ２受容体発現ＨＥＫ２９３細胞株におけるＡＷＴ−４８９のｃＡＭＰ産生への影響）
また、ＥＰ２受容体を発現したＨＥＫ２９３細胞においても同様にＡＷＴ−４８９の効果について検討を行った。この検討では、細胞にＡＷＴ−４８９を前処理し、１ｎＭＰＧＥ_２刺激によるｃＡＭＰ産生量を測定した。その結果、どの濃度のＡＷＴ−４８９処理においてもＰＧＥ_２によるｃＡＭＰ産生量を抑制することはなかった（○）。すなわち、ＤＰ受容体発現細胞において見られたＡＷＴ−４８９によるｃＡＭＰ産生量の抑制作用はＥＰ２受容体発現細胞株においては見られなかった。

（ＡＷＴ−４８９のＤＰ受容体、又は、ＥＰ２受容体結合への影響）
ＤＰ受容体への[^３Ｈ]−ＰＧＤ_２の結合に対するＡＷＴ−４８９の影響をｗｈｏｌｅｃｅｌｌｂｉｎｄｉｎｇａｓｓａｙにて検討した。ＤＰ受容体を過剰発現したＨＥＫ２９３細胞への[^３Ｈ]−ＰＧＤ_２結合量はＡＷＴ−４８９により濃度依存的に減少した（図４Ａ）。しかしながらＥＰ２受容体発現ＨＥＫ２９３細胞への[^３Ｈ]−ＰＧＥ_２結合量は１００μＭＡＷＴ−４８９においても抑制されることはなかった（図４Ｂ）。

（ＬＳ１７４Ｔ細胞株におけるＡＷＴ−４８９のｃＡＭＰ産生に対する影響）
次に、実際のヒト結腸癌ＬＳ１７４Ｔ細胞株を用いてＡＷＴ−４８９によるｃＡＭＰ産生抑制作用について検討を行った。１０ｎＭＰＧＤ_２（Ａ）及び１ｎＭＢＷ２４５Ｃ（Ｂ）刺激により亢進したｃＡＭＰ産生量に対して、ＡＷＴ−４８９は濃度依存的にｃＡＭＰ産生量を抑制した（図５）。

また、既存のＤＰ受容体アンタゴニストであるＢＷＡ８６８ＣとＡＷＴ−４８９の作用を比較した。ＢＷＡ８６８ＣはＤＰ受容体のアンタゴニストであるが、パーシャルアゴニスト活性も有することが報告されている（例えば“Ｌｉｕｅｔａｌ．，１９９６”参照）。ＢＷＡ８６８Ｃを単独処理したところ、ｃＡＭＰ産生量を微増させるアゴニスト活性を有することが確認された（図６Ａ）。しかしながらＡＷＴ−４８９単独処理ではｃＡＭＰ産生量を増加させることはなく、ＡＷＴ−４８９のアゴニスト活性は認められなかった（図６Ｂ）。

次に、ＰＧＤ_２またはＢＷ２４５Ｃ刺激による用量作用曲線における１０μＭＡＷＴ−４８９または１０ｎＭＢＷＡ８６８Ｃ前処理による影響を検討した（図７、図８）。その結果、ＰＧＤ_２（図７Ａ，●）、又は、ＢＷ２４５Ｃ（図８Ａ，●）の用量作用曲線はＡＷＴ−４８９（○）、又は、ＢＷＡ８６８Ｃ（△）前処理により右にシフトした。ＢＷＡ８６８Ｃ前処理によりＡＷＴ−４８９前処理よりも大きく右へのシフトが見られた。

次に図７Ａ、図８Ａから１０ｎＭＰＧＤ_２、１ｎＭＢＷ２４５Ｃにおけるデータを抽出し、棒グラフへとｒｅ−ｐｌｏｔした（図７Ｂ，８Ｂ）。その結果、ＡＷＴ−４８９、ＢＷＡ８６８Ｃともに１０ｎＭＰＧＤ_２、又は、１ｎＭＢＷ２４５Ｃ刺激によるｃＡＭＰ産生量を有意に抑制した。しかしながら、ＢＷＡ８６８Ｃのアゴニスト活性により、ｂａｓａｌレベルのｃＡＭＰ産生量が増加したため、ＰＧＤ_２、又は、ＢＷ２４５Ｃ刺激によるｃＡＭＰ産生への抑制効果はＡＷＴ−４８９の方がＢＷＡ８６８Ｃよりも高いことが明らかとなった。

（ＬＳ１７４Ｔ細胞におけるＤＰ受容体を介したＣＤ５５の発現とＡＷＴ−４８９の影響）
ところで、癌細胞において補体系を抑制することで癌を悪化させるＣＤ５５は、ＰＧＤ_２刺激により発現量が増加することが報告されている（Ｈｏｌｌａｅｔａｌ．，２００５）。そこで、ＤＰ受容体情報伝達系へのＡＷＴ−４８９の効果を検証するためＤＰ受容体刺激によるＣＤ５５発現への効果を検討した。ＬＳ１７４Ｔ細胞に１０ｎＭＰＧＤ_２、又は、１ｎＭＢＷ２４５Ｃを処理し、ＣＤ５５ｍＲＮＡ産生量の変化をＲＴ−ＰＣＲ法により検討した。その結果、ＰＧＤ_２、ＢＷ２４５Ｃ両処理共に刺激後４時間をピークとした時間依存的なＣＤ５５ｍＲＮＡの発現量の増大が確認された（図９）。

またＰＧＤ_２、又は、ＢＷ２４５Ｃを４時間処理したところ、ＣＤ５５ｍＲＮＡはＰＧＤ_２およびＢＷ２４５Ｃの濃度依存的に上昇した（図１０）。

次に、ＡＷＴ−４８９のＰＧＤ_２刺激、又は、ＢＷ２４５Ｃ刺激によるＣＤ５５発現上昇への効果を検討した。１０μＭＡＷＴ−４８９、又は、１０ｎＭＢＷＡ８６８Ｃを１５分間前処理し、１０ｎＭＰＧＤ_２または１ｎＭＢＷ２４５Ｃを４時間刺激した時のＣＤ５５ｍＲＮＡ発現量を測定した（図１１）。

ＰＧＤ_２またはＢＷ２４５Ｃにより亢進したＣＤ５５ｍＲＮＡはＡＷＴ−４８９前処理で有意に抑制された。ＢＷＡ８６８Ｃ前処理では、ＤＰ受容体に対するアゴニスト活性により、単独処理においてもＣＤ５５発現の亢進が見られ、ＰＧＤ_２、又は、ＢＷ２４５ＣによるＣＤ５５ｍＲＮＡ産生に対する有意な抑制は見られなかった。さらにＣＤ５５発現量のタンパク質レベルにおけるＡＷＴ−４８９の効果を確認するためＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法を用いて検討を行った。１０μＭＡＷＴ−４８９、又は、１０ｎＭＢＷＡ８６８Ｃを１５分間前処理し、１０ｎＭＰＧＤ_２、又は、１ｎＭＢＷ２４５Ｃで８時間刺激した時のＣＤ５５タンパク質発現量を検討した（図１２）。

ＰＧＤ_２、又は、ＢＷ２４５Ｃ刺激により上昇したＣＤ５５はＡＷＴ−４８９前処理により有意に抑制された。しかしながら、ＣＤ５５ｍＲＮＡ発現への効果と同様にＢＷＡ８６８Ｃ前処理ではアゴニスト活性によりＡＷＴ−４８９ほど抑制効果は見られなかった。

（ＡＷＴ−４８９作用の可逆性の検討）
ＡＷＴ−４８９のＤＰ受容体アンタゴニスト作用が可逆的かどうかについて検討を行った。ＤＰ受容体を発現させたＨＥＫ２９３細胞に１０μＭＡＷＴ−４８９を３０分間前処理後、ＦＢＳの入っていないＯｐｔｉ−ＭＥＭで３回ｗａｓｈを行った。次にその細胞を用いて、ＡＷＴ−４８９を再び前処理し１ｎＭＰＧＤ_２刺激した時のｃＡＭＰ産生量を測定した（図１３）。その結果、ｗａｓｈを行うことでＡＷＴ−４８９のｃＡＭＰ産生抑制作用は減少し、２度目のＡＷＴ−４８９前処理により再び１ｎＭＰＧＤ_２刺激によるｃＡＭＰ産生量の抑制が見られた。

（ＬＳ１７４Ｔ細胞における[^３Ｈ]−ＰＧＤ_２結合へのＡＷＴ−４８９の影響）
ＬＳ１７４Ｔ細胞においてもＤＰ受容体を発現させたＨＥＫ２９３細胞と同様にＡＷＴ−４８９の作用点が受容体であるかどうかをｗｈｏｌｅｃｅｌｌｂｉｎｄｉｎｇａｓｓａｙにて検討した（図１４）。この結果、ＬＳ１７４Ｔ細胞への[^３Ｈ]−ＰＧＤ_２の結合量は１０ μＭＡＷＴ−４８９により８割程度抑制された。

（ＬＳ１７４Ｔ細胞におけるＣＲＴＨ２受容体）
ＰＧＤ_２はＤＰ受容体だけでなくＧｉタンパク質と共役しているＣＲＴＨ２受容体にも作用する。ＲＴ−ＰＣＲ法によりＬＳ１７４Ｔ細胞においてＤＰ受容体だけでなくＣＲＴＨ２受容体ｍＲＮＡの発現が確認された（図１５）。

そこでＬＳ１７４Ｔ細胞におけるＡＷＴ−４８９によるｃＡＭＰ産生量の減少が、ＡＷＴ−４８９がＣＲＴＨ２受容体のアゴニストとして作用していることに起因する可能性について検討した。ＣＲＴＨ２受容体アゴニストである１００ｎＭＤＫ−ＰＧＤ_２、又は、ＣＲＴＨ２受容体アンタゴニストである１０ｎＭＣＡＹ１０４７１を１５分間前処理し、ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ刺激によりアデニル酸シクラーゼを活性化させたときのｃＡＭＰ産生量を測定した（図１６）。

その結果、ｆｏｒｓｋｏｌｉｎにより亢進したｃＡＭＰ産生量はＤＫ−ＰＧＤ_２、ＣＡＹ１０４７１前処理により変化することはなかった。また、ＣＲＴＨ２受容体アゴニストである１００ｎＭＤＫ−ＰＧＤ_２と１０μＭＡＷＴ−４８９を１５分間前処理後、１０ｎＭＰＧＤ_２、又は、１ｎＭＢＷ２４５Ｃを１時間処置した時のｃＡＭＰ産生量を測定した（図１７）。ＤＫ−ＰＧＤ_２を前処理することにより、Ｇｉタンパク質に共役しているＣＲＴＨ２受容体が活性化し、ＰＧＤ_２、又は、ＢＷ２４５Ｃ刺激によるｃＡＭＰ産生が抑制されることが考えられる。しかしながら、ＰＧＤ_２、又は、ＢＷ２４５Ｃ単独処理よりもｃＡＭＰ産生が減少することはなかった。また１０μＭＡＷＴ−４８９によるｃＡＭＰ産生抑制効果にＤＫ−ＰＧＤ_２は影響を与えなかった。

これらの実験結果を要約すると、以下のようになる。

１．ＬＳ１７４Ｔ細胞においてＡＷＴ−４８９がＢＷ２４５Ｃ刺激によるｃＡＭＰ産生抑制作用を示した。

２．ＤＰ受容体を過剰発現したヒトＨＥＫ２９３モデル細胞を用い、ＰＧＤ_２刺激によるｃＡＭＰ産生量に対するＡＷＴ−４８９の効果を検討し、ＡＷＴ−４８９の濃度依存的な減少が見られ、ＬＳ１７４Ｔ細胞特異的な作用ではないことが確認した。ＤＰ受容体を過剰発現させたＨＥＫ２９３細胞への[^３Ｈ]−ＰＧＤ_２の結合量は、ＡＷＴ−４８９の濃度依存的に減少した。

３．ＡＷＴ−４８９のＤＰ受容体親和性はインドメタシンより強い。

４．ＡＷＴ−４８９はＤＰ受容体の競合的アンタゴニストとして作用することによりｃＡＭＰ産生を可逆的に抑制している。

５．ＡＷＴ−４８９は、ＤＰ受容体に選択的に作用していることが示唆された。（ＥＰ２受容体選択性は低い。）

６．タンパク質発現への影響について、ＡＷＴ−４８９はＣＤ５５の産生抑制作用を示した。

７．補体系の抑制を解除することによる免疫作用の活性化により癌抑制作用を有する可能性が示唆される。

尚、ＬＳ１７４Ｔ細胞においてＡＷＴ−４８９のＣＲＴＨ２受容体への影響は極めて低いことも確認している。

以上の通り、本実施例により、ＤＰ受容体に対するアンタゴニスト様作用物質として新規インドール化合物ＡＷＴ−４８９を創出し、新規なインドール化合物、ＤＰプロスタノイド受容体アンタゴニスト、それを用いた薬剤、及びＤＰプロスタノイド受容体アンタゴニストの使用を提供することができることを確認した。

ＰＧＤ_２刺激によるｃＡＭＰ産生抑制作用を示すＡＷＴ−４８９をリード化合物とすることで、効果の高い癌治療薬の開発につながると期待される。例えば、ＣＤ５５発現を抑制することでｒｉｔｕｘｉｍａｂの補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）活性抵抗性が解消され抗癌作用が亢進することが報告されていることからも、モノクロ―ナル抗体と組み合わせる癌治療が考えられる。

Claims

下記式（１）で示されるインドール化合物。
（ここでＲ^１は、Ｈ、Ｍｅ、Ｅｔ、Ｂｎ、Ｔｓ、Ｍｓ、Ａｃ、Ｂｚ、ＭＯＭ、ＭＥＭ、ＳＥＭ、又はＡｌｌｏｃである。また、Ｒ^２は、Ｈ、Ｍｅ、Ｅｔ、Ｂｎ、ハロゲン、アルコキシ、アミノ、アシル基、又はニトロ基である。Ｒ^２は、インドール骨格の炭素上であれば、いずれ位置に複数結合していてもよい。）
下記式（１）で示されるインドール化合物であるＤＰプロスタノイド受容体アンタゴニスト。

（ここでＲ^１は、Ｈ、Ｍｅ、Ｅｔ、Ｂｎ、Ｔｓ、Ｍｓ、Ａｃ、Ｂｚ、ＭＯＭ、ＭＥＭ、ＳＥＭ、又はＡｌｌｏｃである。また、Ｒ^２は、Ｈ、Ｍｅ、Ｅｔ、Ｂｎ、ハロゲン、アルコキシ、アミノ、アシル基、又はニトロ基である。Ｒ^２は、インドール骨格の炭素上であれば、いずれ位置に複数結合していてもよい。）
下記式（１）で示されるインドール化合物を含む薬剤。

（ここでＲ^１は、Ｈ、Ｍｅ、Ｅｔ、Ｂｎ、Ｔｓ、Ｍｓ、Ａｃ、Ｂｚ、ＭＯＭ、ＭＥＭ、ＳＥＭ、又はＡｌｌｏｃである。また、Ｒ^２は、Ｈ、Ｍｅ、Ｅｔ、Ｂｎ、ハロゲン、アルコキシ、アミノ、アシル基、又はニトロ基である。Ｒ^２は、インドール骨格の炭素上であれば、いずれ位置に複数結合していてもよい。）
薬剤の製造における、下記式（１）で示されるインドール化合物であるＤＰプロスタノイド受容体アンタゴニストの使用。
（ここでＲ^１は、Ｈ、Ｍｅ、Ｅｔ、Ｂｎ、Ｔｓ、Ｍｓ、Ａｃ、Ｂｚ、ＭＯＭ、ＭＥＭ、ＳＥＭ、又はＡｌｌｏｃである。また、Ｒ^２は、Ｈ、Ｍｅ、Ｅｔ、Ｂｎ、ハロゲン、アルコキシ、アミノ、アシル基、又はニトロ基である。Ｒ^２は、インドール骨格の炭素上であれば、いずれ位置に複数結合していてもよい。）