JP6147259B2 - Ecm組成物、腫瘍微小環境プラットフォームおよびその方法 - Google Patents
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Description
本開示は、「臨床反応予測因子」に、ならびに、抗腫瘍効果を有する化学療法、標的化された生物学的製剤および広義の剤についての、種々の癌におけるその応用に関する。本開示はさらに、腫瘍組織を長期培養するための方法であって、前記培養が、生理学的に関連するシグナリング系を模倣するヒトリガンドおよび腫瘍組織の微小環境を提供する、前記方法に関する。本開示はさらに、腫瘍状態の表示のために、細胞生存率を決定する特異的マーカーの存在について腫瘍組織をスクリーニングする方法に関する。本開示はまた、腫瘍対象の反応を予測する方法および、抗癌剤をスクリーニングまたは開発する方法に関する。
当該分野で周知の様々な患者選別ツールは、以下のように大きく分類される:
バイオマーカー:
患者の腫瘍、正常組織、血清、尿、唾液、ならびに身体の他の部分および/または分泌/排泄物質の分析に基づく、種々のバイオマーカーが存在する。例えばHer2は、タンパク質Her2を過剰発現する患者を過少発現する患者から選別する、タンパク質であり遺伝子ベースのマーカーである。続いて詳細な臨床試験が実施されて、より高いレベルのHer2タンパク質を有するものは、モノクローナル抗体ハーセプチンに顕著に良好に反応することが示されている。この文脈において、Her2は、検討中の患者に対するハーセプチン処置の結果を予測する「バイオマーカー」として承認されている。その存在もしくは不在または発現プロファイルが、検討中の標的薬物の有効性を予測するために使用されるところの、EGFR、C−METなどの他のバイオマーカーも存在する。
異なる癌においてシスプラチンなどの化学療法剤の有効性を予測するために用いられる試験がある。これらの試験は、サロゲートマーカーの存在または不在、またはその存在の程度を測定する。化学療法マーカーでは、バイオマーカーと同様の欠陥が問題となる。
患者の現在または以前の疾患状態:
HPV陽性患者で頭頸部扁平上皮癌も有する者は、HPV陰性の頭頸部扁平上皮癌患者よりも良好に化学療法に反応する。この場合、患者のHPVの状態は、患者が頭頚部扁平上皮癌も発症するという事象において、頭頸部扁平上皮癌のための薬物に対する患者の反応を予測するための基準として使用される。この予後カテゴリーのもとで利用可能な情報の量は限られている。この情報は主に相関に基づくものであり、必ずしも因果関係に基づく必要はない。
試験のこのカテゴリーにおいては、患者の腫瘍試料を採取し、腫瘍細胞に均質化し、この系をin vitro系において種々の化学療法剤で処理する。あるいは、患者の腫瘍試料を、均質化することなくin vitro系において様々な化学療法剤で処理する。これらのin vitro試験は、異なる名称で実施される(例えばOncotest GMBHからの単層アッセイまたはクローン形成法、Chemofxからの化学的感受性アッセイ、Oncotechからのエクストリーム薬剤耐性(EDR)試験)。
このモデルの基本的な欠陥は、患者の腫瘍微小環境が、これらの化学的感受性試験では捕捉されないことである。例えばいくつかの文献には、in vitroの細胞または組織ベースの系が臨床転帰の代表ではないことが記載されている。
細胞株ベースのin vitroおよびin vivo異種移植系。
近年、腫瘍増殖の阻害に基づくin vitroおよびin vivoの前臨床試験の腫瘍増殖について、および臨床的有効性を予測するために、多数の文献が公表されている。従来技術の方法すべてには、腫瘍試料の局所微小環境を模倣することができず、したがって臨床転帰との相関が悪く、臨床転帰を予測するための信頼性の高いアッセイとして使用できないという、本質的な限界がある。
本開示は以下に関する:コラーゲン1、コラーゲン3、コラーゲン4、コラーゲン6、フィブロネクチン、ビトロネクチン、カドヘリン、フィラミンA、ビメンチン、ラミニン、デコリン、テネイシンC、オステオポンチン、基底膜タンパク質、細胞骨格タンパク質、および基質タンパク質を有する群から選択される少なくとも3つの成分を含む、細胞外基質[ECM]組成物;上記の細胞外基質[ECM]組成物を得るための方法であって、該方法が、以下の行為:a)腫瘍組織を生化学的アッセイに供して、ECMの成分を同定すること;b)コラーゲン1、コラーゲン3、コラーゲン4、コラーゲン6、フィブロネクチン、ビトロネクチン、カドヘリン、フィラミンA、ビメンチン、ラミニン、デコリン、テネイシンC、オステオポンチン、基底膜タンパク質、細胞骨格タンパク質、および基質タンパク質の群から選択されるECMの成分を組み合わせて、ECM組成物を得ること;を含む、前記方法;および、腫瘍組織を培養するための腫瘍微小環境プラットフォームであって、該微小環境が、上記のECM組成物、培養培地を、任意に血清、血漿または自己PBMCおよび薬物と共に含む、前記腫瘍微小環境プラットフォーム;
本開示はまた、上記細胞外基質[ECM]組成物を得るための方法であって、該方法が、以下の行為:
a.腫瘍組織を生化学的アッセイに供して、ECMの成分を同定すること;
b.コラーゲン1、コラーゲン3、コラーゲン4、コラーゲン6、フィブロネクチン、ビトロネクチン、カドヘリン、フィラミンA、ビメンチン、ラミニン、デコリン、テネイシンC、オステオポンチン、基底膜タンパク質、細胞骨格タンパク質、および基質タンパク質の群から選択されるECMの成分を組み合わせて、ECM組成物を得ること;
を含む、前記方法に関する。
本開示はまた、腫瘍組織を培養するための、腫瘍微小環境プラットフォームを得るための方法であって、該方法が、プラットフォームを前記のECM組成物でコーティングすること、および培養培地を任意に血清、血漿または自己PBMCおよび薬物と共にプラットフォームに加えて、腫瘍微小環境プラットフォームを得ること、の行為を含む、前記方法に関する。
本開示はまた、腫瘍対象の、1または2以上の薬物に対する反応を予測する方法であって、該方法が、以下の行為:
a.対象の腫瘍組織を請求項3に記載の腫瘍微小環境プラットフォーム上で培養して、培養された腫瘍組織を得ること;
b.培養された腫瘍組織を1または2以上の薬物で処理し、アッセイを行うこと;
c.アッセイの読み取りを数値メトリックに変換して感受性指数を取得し、これにより対象の1または2以上の薬物に対する反応を予測すること;および
d.任意に、感受性指数と、対象の1または2以上の薬物に対する臨床反応の相関をとること、
を含む、前記方法に関する。
a.対象の腫瘍組織を請求項3に記載の腫瘍微小環境プラットフォーム上で培養して、培養された腫瘍組織を得ること;
b.培養された腫瘍組織を1または2以上の薬物で処理すること;
c.薬物に対する腫瘍の反応を複数のアッセイにより評価して、複数のアッセイの各々についての評価スコアを得ること;
d.複数のアッセイの各々について重みスコアを割り当てること;
e.複数のアッセイの各々の評価スコアに、複数のアッセイの対応するアッセイの重みスコアを乗じて、複数のアッセイの各々についての独立アッセイスコアを得ること;
e.複数のアッセイの各々の独立アッセイスコアを組み合わせて感受性指数を取得し、これにより対象の1または2以上の薬物に対する反応を予測すること;および
f.任意に、感受性指数と、対象の1または2以上の薬物に対する臨床反応の相関をとること、
を含む、前記方法に関する。
a.対象の腫瘍組織を請求項3に記載の腫瘍微小環境プラットフォーム上で培養して、培養された腫瘍組織を得ること;
b.培養された腫瘍組織を剤で処理し、剤に対する腫瘍の反応をアッセイにより評価して、前記剤の腫瘍細胞に対する効果を決定すること;
を含む、前記方法に関する。
本開示はまた、腫瘍細胞を特定のマーカーについてスクリーニングするための方法であって、該方法が、以下の行為:
a.対象の腫瘍組織を請求項3に記載の腫瘍微小環境プラットフォーム上で培養して、培養された腫瘍組織を得ること;
b.培養された腫瘍組織を1または2以上の薬物で処理し、薬物に対する腫瘍の反応をアッセイにより評価すること;および
c.マイクロアレイおよび核酸解析を行って、バイオマーカーについてスクリーニングすること;
を含む、前記方法に関する。
本開示の一態様において、細胞外基質[ECM]組成物は腫瘍特異的である。
本開示のさらに別の態様において、腫瘍または腫瘍組織は、外科的にもしくは生検により、または異種移植片またはそれらの任意の組合せとして得られ;および腫瘍または腫瘍組織は、約100μmから約3000μmの切片の小さな断片に分割されている。
本開示のさらに別の態様において、腫瘍組織の培養は、約30℃から約40℃の範囲の温度、好ましくは約37℃で;約2〜10日の間、好ましくは約3〜7日;および約5%のCO2で実施される。
本開示のさらに別の態様において、プラットフォームは、腫瘍細胞のシグナリングネットワークを維持するためのものである。
本開示のさらに別の態様において、プラットフォームは、無傷の組織の微小環境、細胞構造、および腫瘍−間質相互作用の完全性を維持するためのものである。
本開示のさらに別の態様において、アッセイは、細胞生存率、細胞死、細胞増殖、腫瘍の形態、腫瘍間質含量、細胞代謝、老化またはこれらの任意の組合せについてのアッセイを含む群から選択される。
本開示のさらに別の態様において、方法は、対象のための処置を、化学療法、標的療法、外科手術、放射線またはそれらの任意の組み合わせを含む群から決定するために使用される。
本開示のさらに別の態様において、生化学的アッセイは、ELISA、ブロッティング技術、LCMS、ビーズベースアッセイ、免疫除去、クロマトグラフィーアッセイまたはそれらの任意の組合せを含む群から選択される定量的アッセイまたは定性的アッセイである。
本開示のさらに別の態様において、感受性指数が60より大、20と60の間、および20より小の場合に、感受性指数はそれぞれ、完全臨床反応、部分的臨床反応、および臨床反応なしと相関する。
本開示のさらに別の態様において、DNA、RNAまたはマイクロRNAのマイクロアレイおよび核酸分析を実施して、薬物処置の前後の経路の調節が検出される。
本開示のさらに別の態様において、マイクロアレイおよび核酸分析は、リアルタイムPCR(RTPCR)、免疫組織化学(IHC)分析、およびホスホプロテオミクスプロファイリングを含む群から選択されるアッセイを用いて確認される。
本開示の一態様において、腫瘍微小環境プラットフォームは、任意に培養培地、血清、血清由来のリガンドおよび薬物と共に請求項1に記載のECM組成物でコーティングされた、プレート、ベース、フラスコ、ディッシュ、ペトリプレート、およびペトリ皿を含む群から選択される。
本開示の一態様において、腫瘍微小環境プラットフォームは、微小環境を作製および/または保持するための、物理的支持体またはベースである。したがって腫瘍微小環境プラットフォームは、腫瘍組織を培養するための物理的支持体を提供する任意のプラットフォームであることができる。本開示の態様において、腫瘍微小環境プラットフォームは、プレート、ベース、フラスコ、ディッシュ、ペトリプレート、およびペトリ皿を含む群から選択される、ex vivo系である。腫瘍微小環境系は、任意に培養培地、血清、血漿、PBMC、血清由来のリガンドおよび薬物と共にECM成分で被覆することにより、プラットフォーム上に作製される。
本開示の別の態様において、血清リガンドまたは血漿リガンドまたは患者由来のリガンドまたは患者の末梢血単核球(PBMC)を、腫瘍/癌患者または対象の血液から得る。
外植片モデルおよびヒト腫瘍異種移植片モデルを含む複数の実験モデルにおいて、制癌(ca)剤(開発されたものおよび開発中のもの両方)に対する患者の臨床反応などの複数の入力パラメータを使用して、包括的な患者選別ツールを開発する。このツールを、「臨床反応予測因子」または本患者選別ツールと呼ぶ。「臨床反応予測因子」は現在、種々の固形癌に対して、化学療法および生物学的製剤両方について適用されている。追加の入力パラメータは、腫瘍のゲノム、プロテオーム、および組成物のエピジェネティックな事柄に由来する。「臨床反応予測因子」の使用は、患者の選別にある。本開示の一態様において、「臨床反応予測因子」は、実験室ベースの試験として提供される。
(i)アッセイは1週間以内で行われる。したがって結果は、医師が処置を決定する時間内に利用可能である。
(ii)少量の組織(〜0.2〜0.5cm3)を必要とする;組織試料は、手術中またはパンチ生検を介して切除される。試料の要件は、針生検試料の使用を、現在多くの場合に十分ではないために防止する。
(iii)モデルは、可能な限り多数の患者に対して経済的に手頃な料金でできるように構築される。
(iv)予後用途の文脈においては、薬物の組み合わせが用いられる。
(a)患者の腫瘍微小環境をプレート上に再現。
(b)腫瘍細胞の生存および細胞シグナリングネットワークを、プレート上に長時間維持する。
(c)患者の無傷(非均質化)腫瘍試料を、複数の抗癌剤で単独または組み合わせのいずれかで処置。
(d)患者の腫瘍試料の、チャレンジされた種々の薬物に対する反応を、複数の直交アッセイにより測定する。
(e)これら複数直交アッセイからの読み取りを組み合わせて、単一の数値メトリックにする。
(f)数値メトリックと、単一薬物または薬物の組み合わせに対する患者の臨床反応の相関をとる。
本開示で使用されるプロトコルの概要を以下に提供する:
最初のステップは、患者のインフォームドコンセントを得た後の、組織試料収集および血液試料採取である。試料は、IRB承認された手順を用いて臨床の連携により得る。それぞれの患者ソースから得られた腫瘍は、外植片および/または異種移植片処理法のいずれかに供される。
外植片処理法において、「臨床反応予測因子」は、原発の患者腫瘍における反応の評価のために行われる。
代替的に、腫瘍ソースが異種移植片である場合、マウスから腫瘍を切除し、以下に述べるようにさらに外植片分析に供する。別の態様において、腫瘍を得てマウスに移植し、その後これを増殖させ、次いで切除し、その後に本「臨床反応予測因子」分析に供する。
組織試料を得た後、これを分割して、a)外植片アッセイ、b)IHC(免疫組織化学)/H&Eなどの組織学に基づくアッセイ、およびc)原発腫瘍由来の異種移植片からの有効性分析から、各種入力を得る。
B)組織学的評価のために与えられた組織を、TUNELおよび活性化カスパーゼ3アッセイによりアポトーシスを評価する。また、細胞増殖を、Ki67などの標準的増殖マーカーについてアッセイする。H&Eもまた日常的に実施して、組織の有糸分裂像、壊死および一般の全体的特徴を評価する。
本発明の一態様において、異種移植研究を行って、「臨床反応予測因子」の反応を検証する。異種移植試験用に与えられた試料を用いて約3〜5匹の免疫不全SCIDマウスに移植し、薬効予測にその後供される原発腫瘍異種移植片を生成する。上記のように、異種移植法は日常的な手順ではないが、本「臨床反応予測因子」の反応の検証の一部である。「臨床反応予測因子」反応解析の一部として、外植片および異種移植系で試験した化学療法剤および標的療法剤は、腫瘍組織を得た患者に対して臨床医により規定されたレジメンと同一であることが観察される。
異種移植腫瘍組織の体積が約500mm3に達すると、親の患者組織と同一の外植系における組織を試験し、これらのすべての前臨床の読み取り、すなわち異種移植系、外植系および親の患者組織系の読み取りからの有効性データの相関をとることにより、外植系をさらに検証する。原発腫瘍由来の異種移植片についての臨床データおよび有効性データを生成するために要する時間は3〜8ヶ月である。しかし、外植片分析と組織学的評価のための所要時間は約1週間である。
「臨床反応予測因子」前臨床結果は約1週間で得られ、臨床転帰は治療の約6ヶ月後に収集される。その後、前臨床結果および臨床転帰から得られた結果を相関させる。同じ「臨床反応予測因子」臨床手順を用いて、反応者と無反応者を識別する;これを、複数の固形癌における臨床転帰と比較する。
本開示の一態様において、「臨床反応予測因子」のアッセイと組み合わせて組織試料を評価し、腫瘍の生物学を理解するための、腫瘍組織の遺伝物質を決定することができる。腫瘍組織を核酸単離に供して、RNAおよびmiRNAマイクロアレイ分析、特異的な突然変異のための遺伝子解析、DNAのエクソーム配列決定および遺伝子プロファイリングを評価する。
さらに別の態様において、器官培養物にはまた、ヒト自己血液から、または非相同ヒト血液からのものであるかのようにして、ヒト血液から単離された免疫因子が補足される。器官培養物に、ヒト自己血漿、または非相同ヒト血漿、またはヒト自己血液、または非相同ヒト血液、または非ヒト血清、血漿、もしくは血液から単離された免疫因子を補足する。器官培養物にさらに、ヒト自己血清、非相同ヒト血清などのヒト血清から単離された血管新生因子を補足する。器官培養物に、非ヒト血清、血漿、もしくは血液から単離された血管新生因子、または市販の血管新生因子を補足する。
別の態様において、本腫瘍微小環境の用途は、検討中の患者に対する最適な処置の選択肢の選択である。腫瘍微小環境はまた、検討中の患者に対する抗癌剤の選択、検討中の患者に対して既に選択された薬物と組み合わせる抗癌剤の選択、患者に対する処置の選択肢を、化学療法、標的療法、外科手術、放射線またはそれらの組合せから決定すること、患者が、化学療法、標的療法、外科手術、放射線またはそれらの組合せに反応するかどうかを決定すること、検討中の癌患者の処置のための非癌薬の選択などにおいても、用いられる。
別の態様において、本腫瘍微小環境の用途は、化学療法薬、標的薬物のためのコンパニオン診断試験の開発にある。腫瘍微小環境はまた、生物製剤を含む化学療法薬または標的薬物のためのコンパニオン診断試験の開発において、生物製剤を含む化学療法薬または標的薬物のための「反応者および無反応者」を確立するために、こうして選択された「反応者および無反応者」の分子プロファイリングのために用いられ、これは、生物製剤を含む化学療法薬または標的薬物に反応しやすい患者を事前に選択するためのコンパニオン診断試験を開発するために用いられ、生物製剤を含む化学療法薬または標的薬物に反応しやすい患者を事前に選択する機能的コンパニオン診断試験として用いられる。
一態様において、腫瘍細胞を特異的マーカーの存在についてスクリーニングするための方法が提示され、この方法はIHCおよび他の技術を含み、前記細胞の生存率を決定し、ここで成長および増殖は、腫瘍の状態の指標である。
別の態様において、薬剤を腫瘍に対するそれらの効果についてスクリーニングするための方法が提示され、本方法は、候補薬剤を培養物と接触させること、および該薬剤の、該培養物中の腫瘍細胞に対する効果を決定することを含む。
別の態様において、前記方法/用途は、ヒト起源または動物起源からのものである組織切片を使用する。また、組織は、中枢神経系、骨髄、血液(例えば単球)、脾臓、胸腺、心臓、乳腺、肝臓、膵臓、甲状腺、骨格筋、腎臓、肺、腸、胃、食道、卵巣、膀胱、精巣、子宮または結合組織からのものである。さらに、上記の方法において、細胞は幹細胞であるか、または細胞は複数の器官からであるか、または細胞は健康な1または2以上の臓器からであるか、または細胞は罹患した1または2以上の臓器からであるか、または細胞は遺伝的に改変されたか、または細胞はトランスジェニック動物の器官からである。
以下の実施例は、本開示の側面をさらに詳述して例示する。しかし、これらの例は、本開示の範囲を限定すると解釈されるべきではない
本開示は、以下の例示的な実施例により本発明の様々な側面を提示し、ここで例1は、本「臨床反応予測因子」分析で使用される、細胞プレート上の好適なECM組成物の調製およびコーティングに関する。「臨床反応予測因子」分析システムのセットアップは、例2に詳述される。例1および2はまた、本「臨床反応予測因子」プロセスにおける、本分析用のプレートを癌特異的なECMでコーティングし、血清由来のリガンドを添加することの重要性を示す。例3は、腫瘍組織の供給源が患者からまたはその異種移植片のいずれかであり得る、外植プロトコル(すなわち「臨床反応予測因子」プロトコル)を提供し;異種移植片腫瘍組織を生成する方法論は、例4で提供される。例5は、「臨床反応予測因子」分析によって得られた結果を検証するために、SCID/ヌードマウスの腫瘍異種移植片において薬物の治療効力を決定するために使用されるプロトコルを提示する。「臨床反応予測因子」システムはその後、例6および例14の臨床的検証に示すように、前臨床検証に供される。「臨床反応予測因子」分析で用いるアッセイのプロトコルは例7に提供され、Mスコアの概念は例8に示される。「臨床反応予測因子」システムはさらに、例9、13および14において、複数の固形癌の反応を予測するために試験される。例10は、臨床転帰を用いて得られた結果を比較する「臨床反応予測因子」のプロトコル全体を示し、本分析を検証する。例11および12は実験データを提供して、本「臨床反応予測因子」分析が、それぞれのバイオマーカー細胞株よりも優れた反応予測因子であることを良好に示す。
腫瘍の供給源は、標準的なプロトコルによる患者由来の原発腫瘍組織である。代替的に、原発性ヒト腫瘍組織を免疫不全SCIDマウスに皮下移植して、種々の固体癌についての原発性ヒト腫瘍異種移植片を生成する。およそ1000mm3の腫瘍体積の測定の後に、腫瘍を異種移植片から切除する。ECMを、以下に提供されたプロトコルに従って、患者の腫瘍または異種移植片腫瘍組織のいずれかから単離する。
外科的に摘出した新鮮な腫瘍組織を1〜2mmの切片に切断し、ディスパーゼ溶液(Stem cell Technologies Inc.)に懸濁して、48℃で15分インキュベートした。この組織を、0.05M、pH7.4のトリス、3.4Mの塩化ナトリウム、4mMのEDTA、2mMのN−エチルマレイミドおよびプロテアーゼ(Roche)およびホスファターゼ(phosphatise)阻害剤(Sigma)を含む高塩緩衝液中で均質化する。均質化した混合物を、7000gで15分間遠心分離し、上清を廃棄する。ペレットを2M尿素緩衝液(0.15M塩化ナトリウムおよび0.05M、pH7.4のトリス)中でインキュベートし、48℃で一晩撹拌する。次いで混合物を最終的に14,000gで20分間遠心分離し、2M尿素緩衝液に再懸濁し、アリコートで−80℃で保存する。タンパク質の推定は、DCタンパク質アッセイキット(改変Lowry、Bio-Rad)を用いて行い、定量化用に単離されたECMタンパク質の量を推定する。組織培養皿のコーティングは、タンパク質抽出物を用いて37℃で3時間行う。
異なる適応症のための種々の腫瘍組織からのECMの分離に続いて、これらのECMの組成を質量分析により分析し、その結果を図14に示す。異なる原発腫瘍(HNSCC、胃、膵臓、および大腸の癌)から単離した細胞外基質の異なる成分の分布および存在量を、表1A〜1Gに示す。試料を精製し、LCMS分析に供する。主要な基質タンパク質の存在量を、各腫瘍タイプについて示す。前述の表に示すように、ECMコーティングに必要な成分は各癌のタイプに特異的である。そのため、上記の全データは、特定の腫瘍/癌タイプに向けてウェル上にコーティングされるECMの組成を識別するのに役立つ。ECM混合物中で必要とされる成分の濃度を、次の表1に提供する;この表は表1A〜1Gの要約である。
異なってコーティングされたECM基質上の腫瘍組織の生存率を、37℃、5%CO2で約3〜約7日の期間にわたってモニタリングする。
表1A〜1Gから、異なるソース、すなわちH&N、胃、膵臓、結腸、食道および脳からの腫瘍試料は、特定の腫瘍タイプのために特に処方されたECM混合物でコーティングされたプレート上で、最適な生存率を有することが明らかである。ECM混合物はこのように、外植片に使用される固形癌適応症の各々について得られる。
上記の側面により腫瘍/癌に特定のECM混合物が決定されると、特定の癌タイプに対するECM混合物が、個々のECMタンパク質および他の関連成分を添加し、内容物を混合してカクテル(癌特異的)を形成することにより調製される。約96ウェルプレート上のECMコーティングが、ウェルの側面を均一に被覆するためのアプリケータスティックを使用することによって達成される。他の場合では、約200μlのECM抽出物を各ウェルに添加し、約37℃のインキュベーター中で約2時間乾燥させる。コーティングされたプレートは、滅菌1×PBSで3回洗浄し、長期保存のために約−20℃で保存する。
自己血清リガンドおよび自己血漿リガンドおよび自己PBMCを、患者から標準的なプロトコルに従って得る。
例2.1:自己血清リガンドの添加およびECMコーティングは、天然の腫瘍細胞内シグナリングおよび生存能力を模倣するための腫瘍微小環境を培養物中に再生成する。
別の態様において、図2、3(A)および3(B)は、可能な限り厳密に宿主の腫瘍微小環境を模倣するように設計された、本外植片系の性質を示す。第1の目標は腫瘍組織の構造を維持することであり、細胞プレートのECM成分の重要性が関連する点である。腫瘍ネットワークの生物学を理解し、薬物反応や耐性を解明する場合には、構造的完全性および機能的完全性の両方が重要である。さらに本系は、シグナリングの観点および構造的な観点の両方から、組織の微小環境を無傷で維持することを目的とするように工夫されている。これは、外植片培養において培地に自己血清由来のリガンドを補足することによって行われ、これは天然のシグナリングネットワークの一部である因子を提供するために重要である。これは、小分子阻害剤または標的治療剤または化学療法を試験して、その作用を特定の経路を介して明示することに特に関連する。構造的完全性および機能的シグナリングの完全性の両方を維持した環境を提供することによって、本外植片モデルは、培養における改善された外植片の生存率と、この前臨床モデルが臨床的に意味あることを示す。
cMet[METまたはMNNG HOS形質転換遺伝子]についてIHCを実施する上で、自己血清由来リガンドの存在下で培養した外植片は、cMetの顕著な存在を示し、自己血清由来リガンドを補足した培地が、天然のシグナリングネットワークの模倣に重要なパラクリン因子を含むという事実を証明する。図3Aは、癌タイプ特異的ECM成分でコーティングされたプレートが、天然の組織微小環境を模倣するために重要である無傷の組織構造を維持することを支援する、適切な支持体/足場を提供することを示す。癌タイプ特異的ECM成分でコーティングされたプレート上で培養された外植片は、細胞生存率を改善し、組織構造を維持するための支持体/足場を提供する。ECMコーティングあり(パネルCおよびE)とECMコーティングなし(パネルBおよびD)のプレート上で培養された腫瘍組織のH&E染色。図3Bは、ECMコーティングのプレートで、自己血清由来リガンドを補足した培地で培養された外植片が、改善された細胞生存率を示すことを表す。
HNSCC患者由来の生検腫瘍を切片にし(〜200ミクロン)、96ウェルプレートにて、RPMI培地中、約10%のFBS(対照)または約2%自己血清および約8%のFBS(自己血清)で、約3日間培養する。細胞生存率を、WSTアッセイにより測定する。パーセント細胞生存率を計算し、ボックスおよびウィスカープロット(図4(a))として提示する。ボックス中央部の水平線は平均を示す。下部と上部の境界はそれぞれ25および75パーセンタイルを、下限と上限のウィスカーはそれぞれ5および95パーセンタイルである。対照と比較して**P<0。
自己血清の腫瘍の増殖に対する特異的効果を示すIHCデータを、図4(b)のようにプロットする。腫瘍切片をH&EおよびKi67に対する抗体で染色して、形態学的変化および細胞増殖を評価する。画像の倍率は20倍である。
自己血清およびECM組成物の組み合わせは、増殖に対して、単一の相補体よりも大きい効果を示す、図4(f)。腫瘍切片を約72時間、対照、自己血清(約2%)、ECM組成物(約100μg/ml)を単独または両方の組み合わせを用いて培養する。Ki−67スコアは、培養でのECM組成物と自己血清を合わせた存在の利点を示す。T72対照と比較して*P<0.01、ECM組成物単独およびAS単独と比較して**P<0.05(分散分析)。n=5。図4(g)の対応するIHCデータは、ECM組成物と自己血清の添加による、Ki−67陽性細胞の類似した増加を示す。腫瘍組織をパラフィンに包埋し、切片化して(5ミクロン)、抗Ki−67抗体で染色する。
細胞外基質組成物(ECM)を、図5(a)に示すECMの成分のパーセント組成に従って、腫瘍組織を培養する前にプレート上にコーティングする。外植片は、ヒト腫瘍異種源から単離されたECMの異なる用量(1、10および100μg/ml)でコーティングしたプレート中で約72時間培養する。腫瘍細胞の生存率のパーセンテージ(平均±標準誤差)は、WSTにより測定する。ANOVAにより、T0およびT72対照と比較して、それぞれ**P<0.05、**P<0.01。図5(b)に見られるように、ECMは、用量依存的に腫瘍の生存率を増加させる。全体的な腫瘍内の不均一性および完全性の維持は、H&W(図5(c)、上図)によって決定し、外植片の設定において腫瘍細胞の増殖(図5(c)の下の図)は、Ki−67抗体を用いて評価する。データは、トリプリケートで行われた5回の独立した実験の代表である。
培養プレートの内部表面は、ゼラチン、コラーゲン、マトリゲル、または結腸癌から単離した細胞外基質(ECM)でコーティングし、腫瘍切片は3日間培養する。図6(a)に示す外植片腫瘍のIHC(免疫組織化学)プロファイルは、患者由来のECMが、標準の単一基質タンパク質よりも、増殖(Ki67)およびERK1/2のリン酸化に対して大きな効果を発揮することを示す。図6(b)は、対応するKi−67スコアを示す。ANOVAにより、T72対照と比較して**P<0.01(n=5)。図6(c)に示すKi−67スコアの散布図は、患者に由来するECMが、同様の条件下で実行された複数の独立した実験において、外植片に対して積極的な影響を及ぼすことを示す。各点は、1つの実験を表す(n=33)。水平線は、全試料の平均値を表す。対照と比較して***P<0.001。上記の結果は、適切なECMの存在下で腫瘍を培養することは、腫瘍組織の生存率およびシグナリングを改善して宿主の腫瘍微小環境を模倣することを示している。
腫瘍組織を患者または異種移植片源から得て、これを下記のように外植片プロトコル/「臨床反応予測因子」に供する。
外植片プロトコル:
1.およそ3×3×3mmの腫瘍スライスの小片(すべて均一サイズおよび壊死塊なし)を生成する。
2.腫瘍試料をLeicaビブラトームを使用して複数の小片に分割して、約100〜3000μmの切片を生成し、予め適当なECM組成物でコーティングした96ウェル平底プレート内でトリプリケートで培養する。
3.腫瘍組織を、約2%の熱不活性化FBSと共に1%ペニシリン−ストレプトマイシン、100mMのピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸、4mMのL−グルタミンおよび10mMのHEPESを補足した約2mlのDMEMの馴化培地中に維持する。培養培地に、約2%の血清由来のリガンドまたは約2%の血漿由来のリガンドを12時間後に補足し、または、96ウェル当たり100,000PBMCを、約10%の自己血清と共に播種し、約37℃にて多湿条件下5%のCO2で72時間培養する。
5.培地は、サプリメントと共に24時間毎に交換する。
6.5μlの使用済み培地を用いて、腫瘍組織の細胞生存率、細胞代謝、細胞死および細胞生理学を決定する。
7.約48時間から約120時間の範囲の培養期間の終わりに、組織を様々なパラメータについて評価する。この期間の後に、MTT/WST分析を行ってパーセント細胞生存率を評価する。培地培養物からの上清を24時間毎に取り出し、増殖(ATPおよびグルコース利用実験を用いて)および細胞死(乳酸脱水素酵素アッセイの評価およびカスパーゼ−3とカスパーゼ8の測定値によって)について評価して、反応速度応答の傾向を得る。結果は、薬物未処理の対照に対して定量化する。未処理の対照と比較した、細胞生存率/増殖の有意な損失は、薬物/組み合わせに対する反応および細胞死の増加の指標である。処理および未処理両方の組織切片もまた、培養期間の終了時にIHCおよび組織学的評価を受ける。組織学的評価のために与えられた組織を、TUNELおよび活性化カスパーゼ3アッセイによりアポトーシスについて評価する。また、細胞増殖は、Ki67などの標準的な増殖マーカーについてアッセイする。H&Eもまた日常的に行って、有糸分裂像、壊死および組織の一般的全体的特徴を評価する。
ECM組成物が決定されてウェル上にコーティングされると、患者または異種移植源からの腫瘍が外植片の分析に供される。ヒト腫瘍異種移植片を外植片分析用に生成するため、腫瘍を初めにSCIDマウスに移植し、その後切除した腫瘍を、外植片プロトコルおよび「臨床反応予測因子」分析に供する。このためのプロトコルは以下の通りである:
サンプル調製:
1.新鮮に取り出したヒト腫瘍試料を、DPBSを含有する約50mlの管に入れる(約5ML)。
2.試料を取り出し、様々な実験のために試料を切断する。
3.残りの試料を、約2mlのDPBSを含有する滅菌ペトリ皿に移す。
4.腫瘍を、滅菌メスの刃で消しゴム程度(約5×5×5mm)の大きさの片にカットする。できるだけ均一な片を作るよう注意すべきである。
動物の準備:
5.首の回りおよび前脚の上に人差し指と中指を置く従来の持ち方で、動物をつかむ。
6.約5〜6週齢の雌SCIDマウスの表面を、約70%ETOHで洗浄する。
7.両脇腹の皮下空間を固体の移植のために使用する。
8.マウスの体表面をリンスした後、これを、適切なサイズのノーズコーン内または背側を上に向けてマウスケージの蓋の上に(腹側を下に)配置する。
9.約70% (体積/体積)エタノールを飽和させた正方形ガーゼを使用して、背骨中央から尾の付け根までの領域を拭き、トロカールを用いて腫瘍を挿入するための準備をする。
10.移植の直前に、腫瘍片を約100XP/Sに漬ける/すすぐ。
11.トロカールの先端に腫瘍(約5mm3)の固体片を取り、腫瘍試料を乾燥させることなく、滅菌鉗子またはメスを使って内側に押し込む。
12.トロカールの先端を、マウスの皮下空間内の尾の付け根の上に水平に挿入し、脇腹を直接覆って、皮下空間内にポケットを導入し、両方の側腹部背側の中央まで挿入し(一度に1つずつ)、この間プランジャー部と針部を固定位置に保持して、腹膜を損傷しないようにする。
13.腫瘍の個々の片(約50mgまたは約5mm3)を、トロカールを使用して作成されたポケットに押し入れる。
14.トロカールを、挿入された物質を乱すことなく、静かに取り出す。
15.非毒性材料を用いて、マウスに適切な印を付ける(頭部/身体/尾/無印など)。
16.マウスを清潔なケージに戻す。
17.最初に触診可能な腫瘍(約50mm3)が感知され、これが増殖し始める。
18.マウスを毎日モニターし、下記のようにキャリパー測定を用いて、腫瘍増殖を毎週測定する。簡単に説明すると、腫瘍の増殖を、生物発光イメージングまたは外部キャリパー測定(腫瘍サイズ=(長さ×幅×高さ)×0.52)により、約5〜16週の間、毎週モニターする。
19.腫瘍が約700mm3の最大サイズに達すると、動物を安楽死させ、腫瘍を取り出して、同じ手順に従う。
20.取り出した腫瘍は異なる研究のために複数片に分割する。さらに、肺およびリンパ節、腹部および選択の場合は脳などの潜在的転移部位を取り出して、ホルマリン中に移す。
21.動物の腫瘍増殖が遅い場合、増殖を助けるために早期に移植する。全ての動物は16週の終わりに安楽死させる。
異種移植片解析による「臨床反応予測因子」を検証するためのプロトコルは以下の通りである:
Scid/ヌードマウスの腫瘍異種移植片における薬物の治療効果の決定:
動物の調製:
1.P1または後継代(P1またはPN,N>1)からのマウスを、有効性試験のために用いる。
動物のフォローアップ&投薬:
2.マウスを毎日モニターし、下記のようにキャリパー測定を用いて、腫瘍増殖を毎週測定する。
腫瘍体積は以下の式を用いて計算する:
腫瘍体積(mm3)=L×W2/2、ここでL=長さ(mm)、W=幅(mm)。
3.腫瘍が150〜200mm3サイズに達すると、動物に適切な薬物(約1用量/週)を約5週間投与する。マウスを毎日モニターし、上記のようにキャリパー測定を用いて、腫瘍増殖を2週毎に測定する。
4.動物を処置の後約4週間、腫瘍の退縮/成長についてフォローする。
5.研究の最後に、標準的な安楽死の手順に従い、CO2チャンバーを用いてマウスを安楽死させ、腫瘍試料を収集する。
本開示における試験に使用される薬物の詳細なリストを、次の表2に示す。このリストは例示目的のためのみであり、非限定的かつ非網羅的である。
腫瘍から生成された腫瘍異種移植片(HTX)は、患者の腫瘍と類似していることが知られているので、かかる系から得られる有効性の読み取りは、その処置に対する患者の反応の指標である。本外植片系において、薬物の組み合わせで処理したHTXの感受性は、同じ腫瘍についての外植片からの反応結果に非常に類似しており、「臨床反応予測因子」外植片系が、薬物または薬物の組合せに対する患者の反応について高い予測性を有することを示す。同様のことが、以下のサブ実施例により説明される。
ヒト腫瘍異種移植片の初期の継代は、元の腫瘍の分子特性を保持している。図7(A)は、Genespring GXソフトウェアによって生成された3DのPCAプロットを表し、同じ起源および継代の試料の緊密なクラスタリングを示す。プロットは、結腸癌の約4対およびHNSCCの約2対の試料を含む、約6つの明確なクラスターを示す。結腸癌およびHNSCCの教師無し(unsupervised)の2次元階層クラスタリングを、図7のパネルBに示す。
ヒト腫瘍異種移植片の初期の継代および患者腫瘍に由来する腫瘍外植片培養物は、同一の抗腫瘍効果を示す。原発ドナー腫瘍(P0)およびそれから生成されたポスト移植片(P1およびP2)由来の外植片を、TPF(シスプラチン、ドセタキセル、5FU)または対照としてDMSO[ジメチルスルホキシド]で処理する。処理の約72時間後に、生存率をWSTにより測定し、生存率のパーセント阻害を、対応するDMSO対照を100%として算出する(平均±標準誤差)(図8a)。P0およびP1、P2腫瘍に起因する外植片のTPF処理後のKi−67免疫反応性パターン。像倍率は200×(図8b)である。外植片内で増殖している細胞の減少を示す代表的Ki−67スコアは、フィールドごとのKi−67陽性細胞の計算(トリプリケートの平均±s.e.m.)に基づいて測定する。ANOVAにより、対応する対照と比較して*P<0.05、**P<0.01。 n=4(図8c)。データは、親腫瘍とその後の異種移植片が、TPFに対して同じ反応状態を維持することを示し、もともと無反応性の原発腫瘍が、その後の異種移植片と同一のパターンを維持することが見出された。
TPF/セツキシマブで処理した外植片から得られたデータを、生存率の阻害、増殖およびアポトーシスの誘導を評価するために独立してスコア付けする。各アッセイの相対的な寄与を、実施例8に詳述されるようにして決定する。最終的な複合「臨床反応予測因子」反応スコア(阻害)の算出は、腫瘍阻害の全要素を統合し、同一の個別患者の腫瘍および薬物をHTXで用いてin vivoでの有効性試験から得られた腫瘍増殖阻害データと相関させることにより行う。スピアマンの相関係数法を用いて、線形の関連を算出する。R2値は、in vivoでの反応と「臨床反応予測因子」による反応の間の正の相関関係を表す(n=15)(図10)。「臨床反応予測因子」に見られる腫瘍抑制のレベルは、HTXモデルで見られたものに対応する。
患者または異種移植片源から得られた腫瘍試料は、その後、次のアッセイにより「臨床反応予測因子」分析に供して、Mスコアを得る。Mスコアの概念は、例7に詳述されている。
例7.1:細胞生存率を決定するためのアッセイ:
a)固形腫瘍外植片の組織の生存率を測定するためのMTTアッセイ:
定型的MTTアッセイの修正版(Veira V et al Max Loda Lab PNAS 2010)を使用する。簡潔には、組織をビブラトームにより正確に等分に切断し(400ミクロンのスライス)、RPMI1640[RPMI - Roswell Park Memorial Institute]中、約60%〜約100%の、好ましくは約80%の濃度で、最大72時間まで培養する。組織生存率を、MTT 1−(4,5−ジメチルチアゾール−2−イル)−3,5−ジフェニルホルマザンアッセイ(Sigma Aldrich)を用いて、T0およびT72の時点に評価する。組織切片は、5mg/mLのMTTで37℃で4時間インキュベートし、採取し、析出した塩を、0.1MのHCl−イソプロピルアルコールによる室温で25分のインキュベーションにより抽出する。生存率の値は、570nmでのホルマザンの光学密度を、外植片の乾燥重量で割り算することによって決定する。ベースライン試料(T0)はキャリブレータ(1×)として用いて吸光度測定における試料間の変動を正規化し、組織生存率を、T0試料に対する生存率のパーセンテージとして表す。異なる癌のタイプについて、外植片における組織切片は、異なる薬物を含有する培地を用いてピーク血漿濃度で最大72時間までインキュベートする。薬物を含有する培地は24時間毎に交換し、MTTは、通常通りT72とT0の時点で行う。薬物の有効性を評価するために、試験の終わりにおける組織の生存率を、組織がいかなる薬物にも曝露されていない前記T0の時点での組織の生存率と比較して、等級分けする。
簡潔には、組織をビブラトームにより正確に等分に切断し(400ミクロンのスライス)、RPMI1640[RPMI - Roswell Park Memorial Institute]中、約60%〜約100%の、好ましくは約80%の濃度で、最大72時間まで培養する。組織生存率をWSTアッセイにより評価する。72時間のインキュベーションの終わりに40μlのCCK−8(細胞計数キット−8、Dojindo Laboratories, Japan)を各ウェルに添加し、インキュベーションを37℃/5%CO2でさらに3時間続けた。インキュベーションの間、プレートをマイクロプレートシェーカー上、培養器の中で約90rpmで静かに攪拌した。約3時間のインキュベーションの終わりに、組織切片を注意深く取り出してそれぞれの10%ホルマリン管に入れ、免疫組織化学試験に供する。並列して、吸光度をマイクロプレートリーダー(Bio-Rad, USA)を用いて450nmで測定する。
アデノシン−5’−三リン酸(ATP)は、すべての生物の化学における中心的分子であり、多くの生物学的プロセスをモニターするために使用される。ATPの利用は、StayBriteTMATPアッセイキット(BioVision)を用いて検討する。微小のATPレベルを検出する正確で信頼性の高い方法は、ルシフェラーゼ/ルシフェリンである。アッセイは高スループット用に完全に自動化されており(1秒/試料)、非常に感度が高く、ATP産生の検出に最適である。
計算:BLを試料および標準のそれぞれのLから差し引くことにより、バックグラウンドを補正する。標準曲線をプロットする。試料ウェル中のATP量を、線形回帰を用いて標準曲線から算出する。試料中のATP濃度は、次の式を用いて算出することができる。
C=Sa/Sv(pmol/μlまたはnmol/ml、またはμM)
ここで、Saは標準曲線からの試料の量(pmol)である。
Svは、試料ウェルに加えた試料の体積(μl単位)である。
ATP分子量:507.18g/mol。
約2μlの上清を試験プレートの各ウェルから採取し、96ウェルプレートに添加する。標準として、同様に約2μlのグルコース標準試薬(コンク100mg/dl)もトリプリケートで96ウェルプレートに添加する。これらのウェルに、約200μlのグルコース試薬(Medsource Ozone)添加し、室温で約10分間インキュベートする。吸光度をBioRadプレートリーダーを用いて約490nmで測定する。グラフをプロットし、Graph Pad Prismソフトウェアを用いて分析する。
e)乳酸脱水素酵素アッセイ
乳酸脱水素酵素の評価は、LDH細胞毒性アッセイキット(Cayman)を用いて行う。第1のステップにおいて、LDHは、乳酸からピルビン酸への酸化による、NAD+のNADHとH+への還元を触媒する。反応の第2ステップでは、ジアホラーゼは、新たに形成されたNADHとH+を用いて、テトラゾリウム塩(INT)の、490〜520nmで強く吸収する高発色のホルマザンへの還元を触媒する。生成されるホルマザンの量は、細胞毒性の結果として、培養培地中に放出されるLDHの量に比例する。
プレートセットアップ:各プレートは、標準曲線、細胞を含まないウェル、および実験的処置またはビヒクルを有する細胞を含むウェルを含む。
計算:アッセイ緩衝培地のみを含有するウェル(ブランク)の平均吸光度値を、他のすべてのウェルの吸光度値から差し引く。標準曲線を、LDH濃度の関数として490nmでの吸光度についてプロットし、直線の方程式を決定する。試料中に存在するLDH活性は、以下の式を用いて決定する:
CPP32/カスパーゼ3蛍光定量プロテアーゼアッセイキット(Bio Vision)を用いて、DEVD依存性カスパーゼ活性を分析する。アッセイは、基質DEVD−AFC(AFC:7−アミノ−4−トリフルオロメチルクマリン)の切断の検出に基づく。DEVD−AFCは青色光を発する(λmax=400nm);CPP32または関連カスパーゼによる基質の切断の際に、遊離のAFCは黄緑色の蛍光を発し(λmax=505nm)、これを蛍光光度計または蛍光マイクロタイタープレートリーダーを用いて定量化する。アポトーシス試料と非誘導対照からのAFCの蛍光を比較することにより、カスパーゼ3/CPP32活性の増加倍数の決定が可能となる。
1.所望の方法により、細胞にアポトーシスを誘導する。同時に誘導なしの対照培養物をインキュベートする。
2.細胞をカウントし、約1〜5×約106個の細胞をペレット化するか、または20〜200μgの細胞溶解物を用いる(アポトーシスレベルに応じて)。
組織試料については、組織を溶解緩衝液中で均質化して(1×体積の組織について、約3×体積の溶解緩衝液を加える)組織溶解液を生成し、その後キットの手順に従う。
3.細胞を、約50μlの冷却した細胞溶解緩衝液に再懸濁する。
4.細胞を氷上で約10分間インキュベートする。
5.各試料に、約50μlの2×反応緩衝液(約10mMのDTTを含有)を加える。
6.約5μlの約1mMのDEVD−AFC基質(約50μMの最終濃度)を加え、約37℃で約1〜2時間インキュベートする。
7.400nmの励起フィルターと505nmの発光フィルターを装備した蛍光光度計で、試料を読み取る。プレート読取設定のために、試料を96ウェルプレートに移す。アッセイ全体は、96ウェルプレート内で直接行うこともできる。
CPP32活性の増加倍数は、これらの結果を非誘導対照のレベルと比較することによって決定する。
FLICE/カスパーゼ8蛍光定量アッセイキット(Bio Vision)を用いて、配列IETDを認識するカスパーゼの活性を分析する。アッセイは、基質DEVD−AFC(AFC:7−アミノ−4−トリフルオロメチルクマリン)の切断の検出に基づく。IETD−AFCは青色光を発する(λmax=400nm);FLICEまたは関連カスパーゼによる基質の切断の際に、遊離のAFCは黄緑色の蛍光を発し(λmax=505nm)、これを蛍光光度計または蛍光マイクロタイタープレートリーダーを用いて定量化する。アポトーシス試料と非誘導対照からのAFCの蛍光を比較することにより、FLICE活性の増加倍数の決定が可能となる。
1.所望の方法により、細胞にアポトーシスを誘導する。同時に誘導なしの対照培養物をインキュベートする。
2.細胞をカウントし、約1〜5×約106個の細胞をペレット化するか、または、タンパク質濃度が測定されている場合には50〜200μgの細胞溶解物を用いる。
3.細胞を、約50μlの冷却した細胞溶解緩衝液に再懸濁する。細胞を氷上で約10分間インキュベートする。
4.各試料に、約50μlの2×反応緩衝液(約10mMのDTTを含有)を加える。約5μlの約1mMのIETD−AFC基質(50μMの最終濃度)を加える。約37℃で約1〜2時間インキュベートする。
7.400nmの励起フィルターと505nmの発光フィルターを装備した蛍光光度計で、試料を読み取る。プレート読取設定のために、試料を96ウェルプレートに移す。アッセイ全体は、96ウェルプレート内で直接行うこともできる。FLICE活性の増加倍数は、これらの結果を非誘導対照のレベルと比較することによって決定することができる。
h)老化関連β−gal染色
組織切片の場合には、最適切削温度(OCT)化合物に埋め込まれた液体窒素(LN2)中の凍結組織を、スーパーフロストスライドに載せる。次いで、細胞を約37℃で約20時間、染色溶液(約40mMのクエン酸リン酸ナトリウム、pH6.0、約1mg/mlの5−ブロモ−4−クロロ−3−イソリル−b−D−ガラクトシド[X-gal, Fisher]、約5mMのフェリシアン化カリウム、約5mMのフェロシアン化カリウム、約150mMのNaCl、約2mMのMgCl2)を用いてインキュベートする。インキュベーション後、細胞をPBSで2回洗浄し、青色染色のための明視野顕微鏡下で観察する。
i)免疫組織化学(IHC)分析:
腫瘍を、約10%緩衝ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋する。腫瘍切片を切断し(約5μm)、キシレン中で脱パラフィン化し、続いて減少グレードのエタノール中で再水和する。切片をヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)で染色する。抗原検索を、VectorR抗原アンマスキング溶液(クエン酸ベース、Vector Laboratories)にて約30分間マイクロ波加熱に曝露することにより実施する。スライドを冷却させ、続いてトリス緩衝生理食塩水で洗浄する。内因性ペルオキシダーゼの急冷は、切片を約3%のH2O2中で約15分間インキュベートすることによって行う。タンパク質ブロッキングは、室温で約10%ヤギ血清を用いて約1時間行う。その後のインキュベーションステップに続いて、トリス緩衝生理食塩水(TBS)で洗浄する。切片は、上記の条件で一次抗体と共にインキュベートし、続いて西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)結合二次抗体(SignalStain R Boost IHC検出試薬、Cell Signaling Technology)と共に室温で1時間インキュベートする。シグナルの発色現像は、3,3’−ジアミノベンジジン(DABペルオキシダーゼ基質キット;Vector Laboratories)を使用して行う。組織をヘマトキシリン(パパニコロウ溶液1a;Merck)で対比染色する。
この技術を支える基本原理は、増幅されて可視化される抗原抗体反応である。標的抗原は、固定時に引き起こされるタンパク質の折り畳みにより、抗体に物理的にアクセスできなくなる場合がある。これは、熱を用いてタンパク質の折り畳みを変更することで抗原がよりアクセスしやすくなる、抗原回復と呼ばれる手順によって克服される。内因性ペルオキシダーゼの急冷、タンパク質ブロックおよび内因性ビオチンのブロッキングは、バックグラウンド染色および非特異的結合を回避するための重要なステップである。この標準化されたプロトコルは、標的抗原に特異的に結合する一次抗体(通常ウサギ/マウスmAb);一次抗体に結合するビオチン化二次抗体(通常は、ヤギ抗ウサギIgG);および二次抗体に結合したビオチンを標的とするアビジンビオチン複合体(ABC;アビジンに結合して複合体を形成する、ビオチン化西洋ワサビペルオキシダーゼ)、を含む三層検出システムを使用する。抗体は、抗原およびシグナル増幅の検出を支援する。ABC中に存在するペルオキシダーゼ酵素は、DAB(3,3’−ジアミノベンジジン)が、顕微鏡下で可視化することができる褐色の沈殿物を生成し、最終的に標的抗原を検出する反応を触媒する。
1.脱パラフィン化および再水和を、以下に示すようにして行う:
a.調製:1Lのビーカー内に、約600mLの蒸留水+約5.6mLの抗原アンマスキング溶液(Vector Labs #H-3300)。
b.スライドを溶液に約10分間浸す。
c.ビーカーの内容物およびスライドを以下のように電子レンジにかける:
M−低:約5分
中:約5分
M−高:約5分
高:約5分
d.ビーカーを水道水を満たした槽中に置くことによって、スライドを室温に冷却する。
e.スライドを蒸留水で約5分間ずつ約4回洗浄する(コプリンジャー)。
f.スライドを1×PBSで5分間洗浄する(コプリンジャー)。
a.新鮮な調製:約9mLのH2O2(30% )+約75mLの蒸留水
b.スライドをH2O2溶液中で約15分インキュベートする(コプリンジャー)。
c.スライドを水道水の流水中で約2分間洗浄する。
d.スライドを1×PBSで約7分間洗浄する(コプリンジャー)。
e.疎水性パップペンを使用して組織を旋回する(これは、抗体の体積をできる限り小さくするために行う)。
4.タンパク質のブロッキングを実施。これ以降のステップには、加湿チャンバー(ウェットワットマン濾紙付きのトレイ)が必要である。
a.約10%ヤギ血清を調製する(250μLのヤギ血清+2.5mLの1×PBS)
b.約75μLのヤギ血清を各組織切片に添加し、約1時間インキュベートする。
c.血清を捨てる。洗浄は不要。
5.アビジン/ビオチンブロック(Vector Labs #SP2001より入手)を実施
a.アビジンおよびビオチンの必要量を2本のエッペンドルフ管に分注する。
b.約75μLのアビジンを各組織切片に添加し、約15分間インキュベートする。
c.アビジンを捨て、スライドを1×PBSで短時間すすぐ(コプリンジャー)。
d.約75μLのビオチンを各組織切片に添加し、約15分間インキュベートする。
e.スライドを1×PBSで短時間すすぐ(コプリンジャー)。
a.約1:200のホスホ−Erk/ホスホ−EGFR(Cell Signalling Technology #4370/#2237より入手)と1×PBSを調製する。
b.約75μLを各組織切片に添加し、約1時間インキュベートする。
c.スライドを1×PBSで3回、それぞれ約3分間洗浄する(コプリンジャー)。
7.続いて二次抗体を添加する
a.1:1000のヤギ抗ウサギIgG(Vector Labs #BA-1000)と1×PBSを調製する。
b.約75μLを各組織切片に添加し、約30分間インキュベートする。
c.スライドを1×PBSで3回、徹底的にそれぞれ約5分間洗浄する(コプリンジャー)。
8.ABC試薬(Vector Labsより入手;Vectastain ABC Kit Peroxidase Goat IgG #PK-4005)を添加する
a.試薬を調製する:溶液Aを約1滴+溶液Bを約1滴+約2.5mLの1×PBS。室温で使用する前に試薬を約30分間インキュベートする。余分量は、約4℃で1か月まで保存することができる。
b.約75μLの試薬を各組織切片に添加し、約30分間インキュベートする。
c.スライドを1×PBSで3回、それぞれ約5分間洗浄する(コプリンジャー)。
次のステップは、暗室で実施する。
a.新鮮な調製、DAB基質:緩衝液を約1滴+DABを約2滴+約2.5mLの二重蒸留水中、約1滴のH2O2。
b.約75μLの試薬を各組織切片に添加し、顕微鏡下で観察して、適切な露光時間を決定する。
c.試薬を過マンガン酸カリウム溶液中に捨て、スライドを水道水で洗浄する。
10.スライドをヘマトキシリンにより対比染色する
a.スライドをヘマトキシリンに2〜3回浸す。
b.スライドを水道水の流水で約5分間洗浄する。
c.スライドを約1%の炭酸リチウム溶液で約30秒間洗浄する。
d.70%エタノール−1回洗浄−約3分間
e.95%エタノール−1回洗浄−約3分間
f.100%エタノール−2回洗浄−約3分間
g.キシレン−2回洗浄−約3分間
11.スライドの装着はDPX(Merck #61803502501730より入手)を用いて実施
a.スライドを清潔なカバーガラスと共にDPXを使用して装着し、これを乾燥させる。
b.適切にラベルを付ける。
ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼdUTPニック末端標識(TUNEL)は、核酸の末端を標識することにより、DNAの断片化を検出する方法である。TUNELを用いて、アポトーシスのシグナリングカスケードに起因するDNAの断片化を検出する。アッセイはDNAにおけるニックの存在に依存し、これは、マーカーで二次標識されているdUTPの付加を触媒する酵素である、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼまたはTdTによって同定することができる。これはまた、重度のDNA損傷を受けた細胞も標識することができる。
1.第1ステップは、脱パラフィン化および再水和が関与する:
a.約1:1000のプロテイナーゼK(Qiagen # 19131)と1×PBSを調製する。
b.約50μLを各組織切片に添加し、約5分間インキュベートする。
c.スライドをdH2Oで2回、それぞれ約2分間洗浄する(コプリンジャー)。
3.内因性ペルオキシダーゼにより急冷する
a.新鮮な調製:約7.5mLのH2O2(30% )+約67.5mLの蒸留水
b.スライドをH2O2溶液中で約5分インキュベートする(コプリンジャー)。
c.スライドを水道水の流水で約2分間洗浄する。
d.スライドを1×PBSで2回、約5分間洗浄する(コプリンジャー)。
e.疎水性パップペンを使用して組織を旋回する(これは、抗体/試薬の体積をできる限り小さくするために行う)。
a.約13μLの平衡緩衝液を各組織切片に添加し、少なくとも約10秒間(約60分までは可能)インキュベートする。
b.試薬を捨てる。洗浄は不要。
5.TdT酵素を添加する
a.TdT酵素を反応緩衝液中、約3:7の割合で希釈する(例えば:約30μLのTdTを約70μLの反応緩衝液に)
b.約15μLを各組織切片に添加し、加湿チャンバー内で約37℃にて、約1時間インキュベートする。
c.試薬を捨てる。
6.停止/洗浄緩衝液を加える
a.約1mLの原緩衝液を約34mLのdH2Oに加えることにより、停止/洗浄緩衝液を調製する。
b.スライドを緩衝液に入れ、約15秒間攪拌する。室温で約10分間インキュベートする。
d.スライドを1×PBSで3回、それぞれ約1分間洗浄する(コプリンジャー)。
e.アリコートの抗ジゴキシゲニン結合体を取り出し、室温に置く。
a.15μLの抗ジゴキシゲニン結合体を各組織切片に加え、加湿チャンバー内で室温で約30分間インキュベートする。
b.スライドを1×PBSで約4回、それぞれ約2分間洗浄する(コプリンジャー)。
8.スライドをペルオキシダーゼ基質で処理する:DAB
a.DAB基質を調製−DAB希釈緩衝液で約1:50に希釈。
b.約15μLの試薬を各組織切片に加え、約3〜6分間インキュベートする。顕微鏡下で観察して、適正な露光時間を決定する。
c.スライドをdH2Oで3回、それぞれ約1分間洗浄する(コプリンジャー)。
d.スライドをdH2Oで室温で約5分間インキュベートする。
9.メチルグリーンを使用して対比染色する
a.約0.5%のメチルグリーンで室温で約10分間、対比染色する。
b.スライドをコプリンジャー内でdH2Oを3回交換して洗浄し、スライドの浸漬を、1回目および2回目の洗浄中それぞれ約10回、続いて3回目の洗浄中は撹拌なしで約30秒実施する。
c.スライドをコプリンジャー内で100%のN−ブタノールを3回交換して洗浄し、スライドの浸漬を、1回目および2回目の洗浄中それぞれ約10回、続いて3回目の洗浄中は撹拌なしで約30秒実施する。
10.取り付け
a.組織を、約2回交換するキシレン中に入れ、各ジャーで約2分間インキュベートすることにより、脱水する。
b.カバーガラスの下に、DPX(Merck #61803502501730)を用いて取り付ける。
例7.4:細胞増殖のアッセイ。
IHCアッセイは、Ki67およびPCNAなどの標準的な増殖マーカーのためのアッセイにも使用され、細胞増殖を決定する。
例7.6:核酸のアッセイ。
核酸の単離はさらに、RNAおよびmiRNAマイクロアレイ分析、および選択された試料のみについての特定の突然変異の遺伝子解析により評価する。またエクソーム配列決定を、選択された試料のDNAについてのみ実施することができる。遺伝的プロファイリングは、選択例において、「臨床反応予測因子」の一環としてではなく、腫瘍の生物学を理解するために用いられる。
組織からの全RNAの精製は、QiagenRNA抽出キットに従って行われる。
1.RNAlaterで安定化した組織を、試薬から鉗子を使用して取り出す。
2.約30〜50mgの腫瘍を使用する。
3.秤量した組織を約1.2mlの管に入れ、約350μlのRLT緩衝液を組織に加え、直ちに組織マイクロディスメンブレータ(microdismembrator)で約3000rpmで約60秒間、均質化する。
4.溶解物を別の管に収集し、フルスピードで約3分間遠心分離する。上清をピペットで注意深く採取し、これを新しいマイクロ遠心分離管に移す。
5.約1容量(約350μl)の約70%エタノールを清澄化溶解物に添加し、ピペッティングにより直ちに混合する。
6.試料を、約2mlの収集管にセットしたRNeasyスピンカラムに移す。蓋を静かに閉め、約10000rpmで約15秒間遠心分離する。流水を廃棄する。
7.約350μlのRW1緩衝液を、RNeasyスピンカラムに加える。蓋を静かに閉め、約10000rpmで約15秒間遠心分離する。流水を廃棄する。
8.約10μlのDNase 1原液を、約70μlのRDD緩衝液に加える。管をゆっくりと逆転させることにより混合する。
10.約350μlの緩衝液RW1をRNeasyスピンカラムに加える。蓋を静かに閉め、約10000rpmで約15秒間遠心分離する。流水を廃棄する。
11.約500μlのRPE緩衝液をRNeasyスピンカラムに加える。蓋を静かに閉め、約10000rpmで約15秒間遠心分離する。流水を廃棄する。
12.約500μlのRPE緩衝液をRNeasyスピンカラムに加える。蓋を静かに閉め、約10000rpmで約2分間遠心分離する。流水を廃棄する。
13.RNeasyスピンカラムを新しい2mlの収集管に入れ、古い収集管を流水と共に廃棄する。蓋を静かに閉め、フルスピードで約1分間遠心分離する。
14.RNeasyスピンカラムを新しい1.5mlの収集管に入れる。約35μlのRNase非含有水をスピンカラム膜に直接加える。蓋を静かに閉め、約10000rpmで約1分間遠心分離する。
15.RNAを溶出し、約−80℃で保存する。
RNAlaterで安定化されたコア生検および対応するヒト腫瘍異種移植片試料は、標準的な操作手順に従って、マイクロディスメンブレータ(Sartorius)を用いて溶解する。粉砕組織から単離された全RNAは、その後、バイオアナライザおよびナノドロップによって完全性について評価する。
腫瘍RNA(cRNA)マイクロアレイレイを、Agilent Sure Print G3 Human GE 8x60Kマイクロアレイレイシステムプラットフォーム(Agilent Technologies)を用いて実施する。RNAマイクロアレイについては、約7以上のRIN値をカットオフとして使用する。腫瘍試料または適合する対照から抽出された約200ngのRNAを最終的に逆転写して、Cy3/Cy5標識され増幅されたcRNAを生成し、Agilentキットとプラットフォーム(Agilent Technologies)を使用してプロファイリングする。アレイデータは、特徴抽出ソフトウェアおよびAgilentのGene-Springソフトウェアを使用して正規化する。さらなる統計分析は、この研究のための適切なソフトウェアを用いて行う。データは、対応する対照と比較した倍数の違いとして表す(上方制御および下方制御された遺伝子両方について)。約1.5倍以下の差は全て、さらなる検証用に有意でないと考える。ヒートマップを作成し、関係性(遺伝子の類似性)は、異なる原発腫瘍および異種移植片腫瘍の試料間で、それらの反応状態に基づいて明らかにする。教師無しアレイを用いて、薬物反応の文脈における機能的プロファイリングに基づき、CR、PRまたはPDに由来する原発腫瘍と対応する異種移植片との間の関連性を示すツリーを作成する。正規化されたデータのANOVA分析を行って、異なる腫瘍とそれに対応する異種移植片群の間で異なって発現された遺伝子(P<0.05)を識別する。
マイクロアレイから有意に発現された遺伝子は、StratageneリアルタイムPCRプラットフォームを使用して、特定のプローブおよびプライマーセットを用いたRT−qPCRにより確認する。
p)突然変異分析用のエクソーム配列決定
ゲノムDNAを、DNAeasy組織キット(Qiagen)を用いて原発HNSCC腫瘍から単離する。品質チェックの後、DNAのエクソーム配列決定を、以前に記載された手順に従って変異分析用に実施する。簡単に言えば、特定の配列決定プライマーおよび標識ヌクレオチドを用いて反応を生成し、特定の遺伝子配列をイルミナエクソーム配列決定プラットフォームで分析する。臨床的反応者と無反応者の群における突然変異スペクトルの差を決定する。
腫瘍を患者から切除し、例1〜3に記載のように複数の薬物(単独で、または組み合わせて)を用いて外植分析に供する。薬物に対する腫瘍の反応は、例6に記載したように複数のアッセイによって評価する。並行して、臨床転帰を、確立されたプロトコルに従って測定する。異なる重み(weightage)を、外植片の個々のアッセイ結果に付与して、得られた総合スコアが観察された臨床転帰と線形の相関を有するようにする;すなわち、高い総合スコア(例えば>60)は、完全な臨床反応(CR)と相関し、低い総合スコア(例えば<20)は、臨床無反応(NR)と相関する。
かかるスコア付けシステムが考案されれば、これは、将来の患者の臨床反応を外植分析から予測するために使用することができる。
様々な外植片アッセイにより得られた生のスコアを、表4に示す。これは、臨床読み取りも示す(従来のPERCIST基準に従って、完全反応、部分反応、または無反応)。
感受性指数=(5×25%)+(20×25%)+(0×25%)+(120×25%)=36
こうして算出された感受性指数を、次のようにして予測臨床転帰に変換する(表8〜12)。
感受性指数が>60の場合、予測臨床転帰=3(=完全反応)。
20<感受性指数<60の場合、予測臨床転帰=2(=部分反応)。
感受性指数が20<の場合、予測臨床転帰=1(=無反応)。
「臨床反応予測因子」主導の機能的アッセイは、抗癌剤のパネルの迅速なスクリーニングを可能とする。確立されたおよび治験の抗癌剤(細胞傷害性および標的化の両方)のパネルを、初めにそれらの既知の腫瘍増殖阻害特性に基づいて選択する。これらの薬物のex vivoでの有効性を、患者由来の外植片のパネルに対して、72時間の増殖(Ki−67)および生存率アッセイ(WST)で試験する。阻害パーセントは、未処理の対照を参照して決定する。結果を図11に示す。50%を超える阻害は、完全な反応と考えられる。50%未満で20%を超える阻害は、部分的な反応であると考えられる。無反応群において反応を全く示さない薬物(0〜20%阻害)は、無反応と考えられ、安定した疾患と類似する。特定の適応症について細胞増殖の増加を示す薬物は、進行性の疾患であると考えられる。得られた結果は、「臨床反応予測因子」が腫瘍異種移植片試料を模倣することを示す。そこでこれを、臨床転帰を使用してさらに検証する。
腫瘍試料を、標準的なプロトコルに従って血清と共に患者から収集する。患者は「臨床反応予測因子」外植片分析の開始前に、PETCTまたはCTいずれかによる評価を受けていた。収集された試料を、臨床反応予測因子外植片分析のために処理する。
腫瘍スライスの約3×3×3mmの小片を生成する。腫瘍試料を、Leicaビブラトームを使用して複数の小片に分割して、約100〜300μmの切片を生成し、例1に示したように、癌特異的ECMで前もってコーティングした96ウェル平底プレート中トリプリケートで培養する。腫瘍組織を、約2%の熱不活性化FBSと、1%のペニシリン−ストレプトマイシン、100mMのピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸、4mMのLグルタミン酸および10mMのHEPESを補足した、馴化培地である約2mlのDMEM中に維持する。培養培地には、約2%の血清由来のリガンドを12時間後に補足する。薬物は、培養開始時に培地と共にまたは別々に、任意に添加する。培地は、血清添加時に交換する。培地はまた、サプリメントと共に24時間毎に交換する。約5μlの使用済み培地を用いて、細胞生存率、細胞増殖、組織学、および腫瘍組織の細胞死を決定する。約72時間の範囲の培養期間の終わりに、組織をパラメータについて評価する。この期間の後にMTT/WST分析を実施して、パーセント細胞生存率を評価する。培地培養物からの上清を24時間毎に取り出し、増殖(ATPおよびグルコース利用実験を用いて)および細胞死(乳酸脱水素酵素アッセイの評価およびカスパーゼ3およびカスパーゼ8の測定値によって)について評価して、速度論的反応の傾向を得る。結果を薬物未処理の対照に対して定量化する。薬物(単数または複数)による処理および未処理両方の組織切片は、培養期間の終了時にIHCおよび組織学的評価のためにも用いられる。組織学的評価のために与えられた組織を、TUNELおよびカスパーゼ3アッセイによりアポトーシスを評価する。また、細胞増殖は、Ki67およびPCNAなどの標準的な増殖マーカーについて分析する。
本外植片分析のために登録された患者は、臨床的処置も受けており、PETCTまたはCTのいずれかにより6〜8ヶ月の終わりに反応が評価された。次に、「臨床反応予測因子」結果(Mスコア)を臨床転帰と比較する。得られた結果を下記の表3に示す。
表3は、それぞれの患者(次の癌タイプの1つを有する:HNSCC、神経膠芽腫、卵巣癌、乳癌、食道癌、CRC、膵臓癌、胃癌)から得た腫瘍試料のタイプ、および「臨床反応予測因子」および臨床処置を介した両方の解析のために患者が処置される薬物または薬物の組み合わせを示す。
頭頸部癌を有する患者1の腫瘍試料を、「臨床反応予測因子」により、シスプラチン+5FU+ドセタキセルの組み合わせで処置する。細胞生存率、組織学的評価、細胞増殖、およびアポトーシスによる細胞死を介した組織分析により得られた前臨床転帰は統合され、感受性指数(またはMスコア)として8を与える。患者1の前臨床処置の感受性指数は<20となるため、患者に同じ薬物の組み合わせが投与された場合には、処置は不良な臨床転帰を有することが予測される。これは、臨床反応について得られたRECISTデータの結果から検証され、ここで患者はスコア1が与えられて、臨床的無反応を示す。
頭頸部癌を有する患者38の腫瘍試料を、「臨床反応予測因子」により、シスプラチン、5FUおよびドセタキセルの組み合わせで処置する。細胞生存率、組織学的評価、細胞増殖、およびアポトーシスによる細胞死を介した組織分析により得られた前臨床転帰は統合され、感受性指数(またはMスコア)として90を与える。患者38の前臨床処置の感受性指数は>60となるため、患者に同じ薬物の組み合わせが投与された場合には、処置は完全臨床転帰を有することが予測される。これは、臨床反応について得られたRECISTデータの結果から検証され、ここで患者はスコア3が与えられて、完全臨床反応を示す。
上述したように、バイオマーカーは従来技術において予測ツールとして使用されているものの、これに関連する多くの制約が存在する。これらの制約は、本開示のツールおよび方法によって克服される。「臨床反応予測因子」は、最初の検証のために用いられた薬物または疾患のみに限定されるものではない。「臨床反応予測因子」は、プラットフォーム技術である。例えば、「臨床反応予測因子」が、例えば5−FUなどの特定の薬物のための結腸直腸癌モデル用に開発されて、このモデルが5−FUの有効性を予測するのに有用であることが示されたならば、モデルは他の薬物に対しても移植可能である。これは、「臨床反応予測因子」のための入力制約が、考慮中の患者(または患者由来の腫瘍)にリンクされており、薬物にリンクされているのではないからである。
バイオマーカー(特定の薬物に対する反応者vs無反応者において、異なって発現される遺伝子/タンパク質)が、ハーセプチン(Her2バイオマーカー)などの少数の薬物のために利用可能ではあるが、それらは他の多種多様な薬物に対しては利用できない。利用可能な場合、それらは臨床転帰に低い相関を有する。例えば、結腸直腸癌におけるエルビタックスのために承認されたバイオマーカーであるKRASは、10〜30%の範囲の予測力を有する。バイオマーカーのこの側面は、表13に示されている。
したがって、「ドライバー」と「パッセンジャー」のバイオマーカーを区別する必要があり、なぜならば、バイオマーカーの存在は多くの場合、特定の患者が薬物に反応するかどうかを決定する際の決定的な要因ではないからである。また、バイオマーカーはしばしば、特定の薬物および癌の特定のタイプにリンクされている。これとは対照的に、本「臨床反応予測因子」モデルは、特定の患者に特異的な機能的読み取りを提供する。
細胞株in vitro試験および細胞株ベースの異種移植片モデルにおける基本的な欠陥は、癌は不均一な疾患であるが、細胞株は定義から均一であることである。これらのモデルは、問題を単純化し過ぎていると考えられる。
臨床反応予測因子の、血清/血漿/PBMC/血清由来リガンドの使用、腫瘍タイプに個別化された細胞外基質および自己腫瘍組織からの障害なしの細胞外基質の使用は、適切なパラクリン結合因子が腫瘍細胞を生存させるために存在することを確実にする;これは次に、腫瘍の開始、維持、進行および抑制に関与するシグナリング経路の研究を可能にし、従来技術で利用可能な、細胞株に基づく患者選別システムに関連する欠陥を克服する。
この側面は、次の表14にさらに詳述されている。
当該分野で周知の他の技術に関する「臨床反応予測因子」の利点:
*従来技術で使用される遺伝子操作されたマウスモデルは良好なモデルであるが、薬物によって媒介される経路が知られている場合にのみ有用であろう。また、種々の癌において、および種々の薬物について、複数の経路が関与する。これは、遺伝子操作マウスモデルの主要な欠陥である。本発明は、患者由来の新鮮な固形組織を使用する。さらに、細胞間コミュニケーションは、組織がアッセイのために処理されている間に本発明によって破壊されない。局所微小環境もまた、外植片アッセイの場合には維持される。
*化学的感受性試験に関しては、本開示は、以下を介して前記試験に関連する欠点を克服することができる:第1に、本発明は、腫瘍組織内で機能的なシグナリングが維持されるためには、特定のパラクリン因子が不可欠であることを示した。第2に、本発明はさらに、異種血清よりも自己血清から誘導されるかかるパラクリン因子の臨床的相関に差があることを発見した。第3に、これに加えて、細胞プレートを、癌の同じサブタイプに由来する細胞外基質でコーティングすることが重要である。第4に、適切な量の組織拡散が生じることを保証するために、組織を特定サイズ(約100μm〜300μm)に維持することが重要である。まとめると、これらの要因の組み合わせにより、臨床転帰の信頼できる反射体である「臨床反応予測因子」がもたらされる。
異なるタイプの腫瘍を有する患者で臨床研究を行って、特定の抗癌剤またはそれらの組み合わせに対する反応を検討する。同じ薬物およびそれらの組み合わせが、本発明の「臨床反応予測因子」分析で使用される。得られた結果(経路阻害に基づくMスコア)は、特定の患者のために個別化された腫瘍環境で行われた調査に基づいて、薬物または薬物組み合わせに対する臨床反応との相関をとる。
例13.1:
本「臨床反応予測因子」分析を、頭頸部癌の67歳の男性患者で試験した;腫瘍部位は右梨状陥凹である。腫瘍試料を、患者の同意と共に手術を介して得た。得られた腫瘍を分析し、腫瘍ステージはT3N0M0と決定され、試料タイプは原発性と分類された。
1)シスプラチン
2)シスプラチン+ドセタキセル+5−フルオロウラシル
3)シスプラチン+5−フルオロウラシル
本「臨床反応予測因子」分析を、頭頸部癌の55歳の男性患者で試験した;腫瘍部位は右梨状陥凹である。腫瘍試料を、患者の同意と共に手術を介して得た。得られた腫瘍を分析し、腫瘍ステージはT3/4N2cM0と決定され、試料タイプは転移性リンパ節と分類された。
腫瘍試料を得て、上記「本方法の概要」に記載の本発明の方法に供した。その後、特定の薬物に対する腫瘍の反応に基づいてデータが得られ、これを以下の表に示す。以下の表は、試験した薬物に対する患者の反応を表し、表Aは反応が観察された薬物を示し、表Bは反応が観察されなかった薬物を示す。
1)カルボプラチン+パクリタキセル
2)シスプラチン+ドセタキセル+5−フルオロウラシル
3)シスプラチン
本「臨床反応予測因子」分析を、結腸癌の40歳の男性患者で試験した;腫瘍部位は直腸S状結腸である。腫瘍試料を、患者の同意と共に手術を介して得た。得られた腫瘍を分析し、腫瘍ステージはステージIVと決定され、試料タイプは転移性と分類された。
腫瘍試料を得て、上記「本方法の概要」に記載の本発明の方法に供した。その後、特定の薬物に対する腫瘍の反応に基づいてデータが得られ、これを以下の表に示す。以下の表は、試験した薬物に対する患者の反応を表し、表Aは反応が観察された薬物を示し、表Bは反応が観察されなかった薬物を示す。
1)オキサリプラチン+5−フルオロウラシル+ロイコボリン
2)エピルビシン+シスプラチン+カペシタビン
3)イリノテカン+5−フルオロウラシル+ロイコボリン
本「臨床反応予測因子」分析を、結腸癌の56歳の男性患者で試験した;腫瘍部位は会陰塊(perineal mass)(直腸)である。腫瘍試料を、患者の同意と共に生検を介して得た。得られた腫瘍を分析し、腫瘍ステージはT3N0M0と決定され、試料タイプは再発性(Recc)と分類された。
腫瘍試料を得て、上記「本方法の概要」に記載の本発明の方法に供した。その後、特定の薬物に対する腫瘍の反応に基づいてデータが得られ、これを以下の表に示す。以下の表は、試験した薬物に対する患者の反応を表し、表Aは反応が観察された薬物を示し、表Bは反応が観察されなかった薬物を示す。
1)イリノテカン+5−フルオロウラシル+ロイコボリン
2)オキサリプラチン+5−フルオロウラシル+ロイコボリン
3)イリノテカン+5−フルオロウラシル+ロイコボリン+ベバシズマブ
本「臨床反応予測因子」分析を、胃癌の49歳の男性患者で試験した;腫瘍部位は胃の幽門部である。腫瘍試料を、患者の同意と共に生検を介して得た。得られた腫瘍を分析し、腫瘍ステージは不明であり、試料タイプは転移性リンパ節再発性(recc)と分類された。
腫瘍試料を得て、上記「本方法の概要」に記載の本発明の方法に供した。その後、特定の薬物に対する腫瘍の反応に基づいてデータが得られ、これを以下の表に示す。以下の表は、試験した薬物に対する患者の反応を表し、表Aは反応が観察された薬物を示し、表Bは反応が観察されなかった薬物を示す。
1)イマチニブ
2)エピルビシン+シスプラチン+カペシタビン
本「臨床反応予測因子」分析を、胃癌の68歳の女性患者で試験した;腫瘍部位は胃である。腫瘍試料を、患者の同意と共に生検を介して得た。得られた腫瘍を分析し、腫瘍ステージは不明であり、試料タイプは再発性(recc)と分類された。
腫瘍試料を得て、上記「本方法の概要」に記載の本発明の方法に供した。その後、特定の薬物に対する腫瘍の反応に基づいてデータが得られ、これを以下の表に示す。以下の表は、試験した薬物に対する患者の反応を表し、表Aは反応が観察された薬物を示し、表Bは反応が観察されなかった薬物を示す。
1)エピルビシン+シスプラチン+カペシタビン
本「臨床反応予測因子」分析を、膵臓癌の45歳の女性患者で試験した;腫瘍部位は肝臓である。腫瘍試料を、患者の同意と共に生検を介して得た。得られた腫瘍を分析し、腫瘍ステージは不明であり、試料タイプは転移性と分類された。
腫瘍試料を得て、上記「本方法の概要」に記載の本発明の方法に供した。その後、特定の薬物に対する腫瘍の反応に基づいてデータが得られ、これを以下の表に示す。以下の表は、試験した薬物に対する患者の反応を表し、表Aは反応が観察された薬物を示し、表Bは反応が観察されなかった薬物を示す。
本「臨床反応予測因子」分析を、膵臓癌の50歳の男性患者で試験した;腫瘍部位は膵臓である。腫瘍試料を、患者の同意と共に手術を介して得た。得られた腫瘍を分析し、腫瘍ステージはT2N0M0と決定され、試料タイプは原発性と分類された。
腫瘍試料を得て、上記「本方法の概要」に記載の本発明の方法に供した。その後、特定の薬物に対する腫瘍の反応に基づいてデータが得られ、これを以下の表に示す。以下の表は、試験した薬物に対する患者の反応を表し、表Aは反応が観察された薬物を示し、表Bは反応が観察されなかった薬物を示す。
本「臨床反応予測因子」分析を、卵巣癌の40歳の女性患者で試験した;腫瘍部位は卵巣である。腫瘍試料を、患者の同意と共に生検を介して得た。得られた腫瘍を分析し、腫瘍ステージは不明あり、試料タイプは転移性と分類された。
腫瘍試料を得て、上記「本方法の概要」に記載の本発明の方法に供した。その後、特定の薬物に対する腫瘍の反応に基づいてデータが得られ、これを以下の表に示す。以下の表は、試験した薬物に対する患者の反応を表し、表Aは反応が観察された薬物を示し、表Bは反応が観察されなかった薬物を示す。
1)ブレオマイシン+エトポシド+シスプラチン
2)カルボプラチン+ゲムシタビン
3)トラベクチジン(trabectidin)+PLDドキソルビシン
本「臨床反応予測因子」分析を、卵巣癌の56歳の女性患者で試験した;腫瘍部位は卵巣である。腫瘍試料を、患者の同意と共に手術を介して得た。得られた腫瘍を分析し、腫瘍ステージは不明あり、試料タイプは原発性と分類された。
腫瘍試料を得て、上記「本方法の概要」に記載の本発明の方法に供した。その後、特定の薬物に対する腫瘍の反応に基づいてデータが得られ、これを以下の表に示す。以下の表は、試験した薬物に対する患者の反応を表し、表Aは反応が観察された薬物を示し、表Bは反応が観察されなかった薬物を示す。
1)トラベクチジン+PLDドキソルビシン
2)ブレオマイシン+エトポシド+シスプラチン
3)カルボプラチン+ゲムシタビン
本「臨床反応予測因子」分析を、乳癌の49歳の女性患者で試験した;腫瘍部位は所属リンパ節(R)乳房である。腫瘍試料を、患者の同意と共に生検を介して得た。得られた腫瘍を分析し、腫瘍ステージはT3N1M0と決定され、試料タイプは転移性および再発性(recc)と分類された。
腫瘍試料を得て、上記「本方法の概要」に記載の本発明の方法に供した。その後、特定の薬物に対する腫瘍の反応に基づいてデータが得られ、これを以下の表に示す。以下の表は、試験した薬物に対する患者の反応を表し、表Aは反応が観察された薬物を示し、表Bは反応が観察されなかった薬物を示す。
1)シクロホスファミド+ドキソルビシン+5−フルオロウラシル
2)ゲムシタビン+パクリタキセル
3)ドセタキセル+カペシタビン
本「臨床反応予測因子」分析を、乳癌の51歳の女性患者で試験した;腫瘍部位は乳房である。腫瘍試料を、患者の同意と共に生検を介して得た。得られた腫瘍を分析し、腫瘍ステージは決定されず、試料タイプは原発性と分類された。
腫瘍試料を得て、上記「本方法の概要」に記載の本発明の方法に供した。その後、特定の薬物に対する腫瘍の反応に基づいてデータが得られ、これを以下の表に示す。以下の表は、試験した薬物に対する患者の反応を表し、表Aは反応が観察された薬物を示し、表Bは反応が観察されなかった薬物を示す。
1)フィルグラスチム+シクロホスファミド+ドキソルビシン+5−フルオロウラシル
2)ゲムシタビン+ドセタキセル
3)シクロホスファミド+ドキソルビシン+ドセタキセル
4)フィルグラスチム+シクロホスファミド+エピルビシン+5−フルオロウラシル
本「臨床反応予測因子」分析を、肝臓癌の50歳の男性患者で試験した;腫瘍部位は肝臓である。腫瘍試料を、患者の同意と共に手術を介して得た。得られた腫瘍を分析し、腫瘍ステージはT3NxM1と決定され、試料タイプは転移性と分類された。
腫瘍試料を得て、上記「本方法の概要」に記載の本発明の方法に供した。その後、特定の薬物に対する腫瘍の反応に基づいてデータが得られ、これを以下の表に示す。以下の表は、試験した薬物に対する患者の反応を表し、表Aは反応が観察されなかった薬物を示す。
本「臨床反応予測因子」分析を、肝臓癌の56歳の男性患者で試験した;腫瘍部位は肝臓である。腫瘍試料を、患者の同意と共に手術を介して得た。得られた腫瘍を分析し、腫瘍ステージはT4N0M0と決定され、試料タイプは原発性と分類された。
腫瘍試料を得て、上記「本方法の概要」に記載の本発明の方法に供した。その後、特定の薬物に対する腫瘍の反応に基づいてデータが得られ、これを以下の表に示す。表Aは、反応が観察された薬物を示す。
本「臨床反応予測因子」分析を、大腸癌の56歳の男性患者で試験した;腫瘍部位は会陰塊である。腫瘍試料を、患者の同意と共に生検を介して得た。得られた腫瘍を分析し、腫瘍ステージはT3N0M0と決定され、試料タイプは再発性と分類された。
腫瘍試料を得て、上記「本方法の概要」に記載の本発明の方法に供した。その後、特定の薬物に対する腫瘍の反応に基づいてデータが得られ、これを以下の表に示す。以下の表は、試験した薬物に対する患者の反応を表し、表Aは反応が観察された薬物を示し、表Bは反応が観察されなかった薬物を示す。
1)Rx1:オキサリプラチン+5−FU+ロイコボリン
2)Rx2:イリノテカン+5−FU+ロイコボリン
3)Rx3:オキサリプラチン+5−FU
4)Rx4:カペシタビン+エルビタックス
5)Rx5:アバスチン
本「臨床反応予測因子」分析を、大腸癌の肺転移を有する59歳の男性患者で試験した;腫瘍部位は直腸S状結腸である。腫瘍試料を、患者の同意と共に生検を介して得た。得られた腫瘍を分析し、腫瘍ステージはT4N2Mxと決定され、試料タイプは転移性と分類された。
腫瘍試料を得て、上記「本方法の概要」に記載の本発明の方法に供した。その後、特定の薬物に対する腫瘍の反応に基づいてデータが得られ、これを以下の表に示す。以下の表は、試験した薬物に対する患者の反応を表し、表Aは反応が観察された薬物を示し、表Bは反応が観察されなかった薬物を示す。
1)Rx1:オキサリプラチン+イリノテカン
2)Rx2:エルビタックス+カペシタビン
3)Rx3:5−FU+ロイコボリン
4)Rx4:イリノテカン+エルビタックス
本「臨床反応予測因子」分析を、膵臓癌の肝臓転移を有する45歳の女性患者で試験した;腫瘍部位は膵臓である。腫瘍試料を、患者の同意と共に生検を介して得た。得られた腫瘍を分析し、腫瘍ステージはT3N2M1と決定され、試料タイプは転移性と分類された。
腫瘍試料を得て、上記「本方法の概要」に記載の本発明の方法に供した。その後、特定の薬物に対する腫瘍の反応に基づいてデータが得られ、これを以下の表に示す。以下の表は、試験した薬物に対する患者の反応を表し、表Aは反応が観察された薬物を示し、表Bは反応が観察されなかった薬物を示す。
1)Rx1:シスプラチン+ゲムシタビン
2)Rx2:オキサリプラチン+5−FU
3)Rx3:アブラキサン
4)Rx4:エルロチニブ+ゲムシタビン
5)Rx5:5−FU+ロイコボリン
本「臨床反応予測因子」分析を、乳癌の転移を有する49歳の女性患者で試験した;腫瘍部位は所属リンパ節(RtBr)である。腫瘍試料を、患者の同意と共に生検を介して得た。得られた腫瘍を分析し、腫瘍ステージはT3N1M1と決定され、試料タイプは再発性と分類された。
腫瘍試料を得て、上記「本方法の概要」に記載の本発明の方法に供した。その後、特定の薬物に対する腫瘍の反応に基づいてデータが得られ、これを以下の表に示す。以下の表は、試験した薬物に対する患者の反応を表し、表Aは反応が観察された薬物を示し、表Bは反応が観察されなかった薬物を示す。
1)Rx1:シクロホスファミド+メトトレキサート+5−FU
2)Rx2:アブラキサン
3)Rx3:ドキソルビシン+シクロホスファミド+5−FU
4)Rx4:ドキソルビシン+シクロホスファミド+パクリタキセル
5)Rx5:アバスチン
6)Rx6:カペシタビン+ラパチニブ
7)Rx7:ドキソルビシン+シクロホスファミド
8)Rx8:ドセタキセル+カペシタビン
本「臨床反応予測因子」分析を、乳癌の鎖骨下リンパ節転移(SCLN転移)を有する40歳の女性患者で試験した;腫瘍部位は鎖骨上リンパ節である。腫瘍試料を、患者の同意と共に生検を介して得た。得られた腫瘍を分析し、腫瘍ステージはTxNxM2と決定され、試料タイプは転移性と分類された。
腫瘍試料を得て、上記「本方法の概要」に記載の本発明の方法に供した。その後、特定の薬物に対する腫瘍の反応に基づいてデータが得られ、これを以下の表に示す。以下の表は、試験した薬物に対する患者の反応を表し、表Aは反応が観察された薬物を示し、表Bは反応が観察されなかった薬物を示す。
1)Rx1:カペシタビン+ラパチニブ
2)Rx2:ゲムシタビン+エルロチニブ
3)Rx3:ハーセプチン
4)Rx4:メトトレキサート+シクロホスファミド
5)Rx5:アバスチン
6)Rx6:5−FU+カルボプラチン
シスプラチン、パクリタキセルおよび5−FUを受領予定の臨床試験に登録した患者からの初代H&N腫瘍試料を、「臨床反応予測因子」分析に供する。腫瘍試料はパンチ生検によって収集する。収集した試料の腫瘍ステージは、臨床ステージII/IIIである。例5で説明したように、「臨床反応予測因子」外植片評価を実施して、臨床転帰を予測する。Mスコアに到達するために行われるアッセイは、WST、KI、およびTUNELである。独立して、PERCIST基準に従って臨床転帰を評価するための処置の前後にPET−CTイメージングを実施し、患者を臨床試験に供する。「臨床反応予測因子」の予測を臨床結果と比較して、「臨床反応予測因子」の予測力を評価する(図12)。
表15に示すように、およそ112人のH&N腫瘍の患者がこの研究に登録され、ここで「臨床反応予測因子」を用いて感受性指標を決定し、これを臨床転帰と相関させる。
同様に、中央左のパネルは、Mスコアが45と判定された部分的な反応者を表す。25と60未満の間のMスコアについて予測されるように、患者は部分的な反応を示す。この分類に入るMスコアを有する53の患者腫瘍のうち、79%より多くは部分的な反応者であり、8%が完全反応を有し、13%が無反応者である。
下のパネルは無反応者を表し、ここで左側の投与後のCTは、患者が処置後に進行性疾患を有し、腫瘍には無反応を表すMスコア18を与えられたことを示す。「臨床反応予測因子」により無反応と予測された29人の患者は、その100%が実際に無反応であり、この技術の、臨床転帰を確実に予測する力を示す。
薬物開発用途:
患者と薬物のマッチング:薬物開発の文脈においては、どの患者が開発中の薬物に反応する可能性が最も高いかを、薬物が患者に投与される前に知ることが重要である。さらに、これは癌の文脈において特に重要であり、その理由は、どの既存の薬物を、癌治療に使用される「組み合わせ」戦略の下で開発中の薬剤と組み合わせることが必要かを、決定しなければならないからである。また、どのタイプの癌を標的とするか(例えば、結腸癌対膵臓癌)を決定するのにも有用である。全体として、これは開発期間の短縮、低コストおよび成功の可能性の増加をもたらす、より良い臨床試験戦略の開発にも有用である。
処置の選択:これは、医師が、現在承認されている選択肢の中から、検討中の患者に対して最適な処置の選択肢を決めることを支援する診断モデルとして有用である。これは、現在の処置の成功率が20%未満あり、患者間での変化が大きい、二次(再発性)および転移性癌の患者に特に有用である。また、現在の成功率が〜50%である第一選択処置を決定する際にも役立つ。「臨床反応予測因子」の診断的適用は、頭頸部癌、乳癌、胃癌、膵臓癌、大腸癌、肝臓癌、卵巣癌、食道癌、AMLおよびCMLの文脈において実証されている。予測力は、無反応者の場合は〜100%、部分的な反応者の場合は〜75%、および反応者の場合は〜90%である。
抗癌剤の開発において、開発中の薬物についての最適な癌の同定、開発中の薬物に対する共同開発戦略としての標準ケア薬物の選択、試験中の薬物または薬物の組み合わせに最も反応する可能性のある患者プロファイルの選択、および試験中の薬物または薬物の組み合わせについての予後バイオマーカーの同定。さらに、本発明はまた、化学療法剤、標的薬物、および生物製剤を含む抗癌剤のためのコンパニオン診断ツールの開発において、患者選別ツールを利用する。
Claims (26)
- 成分:コラーゲン1、コラーゲン3、コラーゲン4、コラーゲン6、フィブロネクチン、ビトロネクチン、カドヘリン、フィラミンA、ビメンチン、オステオポンチン、ラミニン、デコリン、テネイシンCを含み、任意に基底膜タンパク質、細胞骨格タンパク質、および基質タンパク質を共に含む、細胞外基質[ECM]組成物。
- 請求項1に記載の細胞外基質[ECM]組成物を得るための方法であって、該方法が、以下の行為:
a.腫瘍組織を生化学的アッセイに供して、ECMの成分を同定すること;および
b.ECMの成分:コラーゲン1、コラーゲン3、コラーゲン4、コラーゲン6、フィブロネクチン、ビトロネクチン、カドヘリン、フィラミンA、ビメンチン、オステオポンチン、ラミニン、デコリン、テネイシンC、任意に基底膜タンパク質、細胞骨格タンパク質、および基質タンパク質を共に組み合わせて、ECM組成物を得ること;
を含む、前記方法。 - 腫瘍組織を培養するための腫瘍微小環境プラットフォームであって、該微小環境が、請求項1に記載のECM組成物、培養培地を、任意に血清、血漿またはPBMCおよび薬物と共に含む、前記腫瘍微小環境プラットフォーム。
- 腫瘍組織を培養するための、腫瘍微小環境プラットフォームを得るための方法であって、該方法が、プラットフォームを請求項1に記載のECM組成物でコーティングすること、および培養培地を任意に血清、血漿またはPBMCおよび薬物と共にプラットフォームに加えて、腫瘍微小環境プラットフォームを得ること、の行為を含む、前記方法。
- 腫瘍組織を器官培養する方法であって、腫瘍組織を請求項3に記載の腫瘍微小環境プラットフォーム上で培養して器官培養物を得る行為を含む、前記方法。
- 腫瘍対象の、1または2以上の薬物に対する反応を予測する方法であって、該方法が、以下の行為:
a.対象の腫瘍組織を請求項3に記載の腫瘍微小環境プラットフォーム上で培養して、培養された腫瘍組織を得ること;
b.培養された腫瘍組織を1または2以上の薬物で処理し、アッセイを行うこと;
c.アッセイの読み取りを数値メトリックに変換して感受性指数を取得し、これにより、対象の1または2以上の薬物に対する反応を予測すること;および
d.任意に、感受性指数と、前記1または2以上の薬物に対する対象の臨床反応との相関をとること、
を含む、前記方法。 - 腫瘍対象の、1または2以上の薬物に対する反応を予測する方法であって、該方法が、以下の行為:
a.対象の腫瘍組織を請求項3に記載の腫瘍微小環境プラットフォーム上で培養して、培養された腫瘍組織を得ること;
b.培養された腫瘍組織を1または2以上の薬物で処理すること;
c.薬物に対する腫瘍の反応を複数のアッセイにより評価して、複数のアッセイの各々についての評価スコアを得ること;
d.複数のアッセイの各々に対して重みスコアを割り当てること;
e.複数のアッセイの各々の評価スコアに、複数のアッセイの対応するアッセイの重みスコアを乗じて、複数のアッセイの各々についての独立アッセイスコアを得ること;
f.複数のアッセイの各々の独立アッセイスコアを組み合わせて感受性指数を取得し、これにより、対象の1または2以上の薬物に対する反応を予測すること;および
g.任意に、感受性指数と、対象の1または2以上の薬物に対する臨床反応との相関をとること、
を含む、前記方法。 - 抗癌剤をスクリーニングまたは開発する方法であって、該方法が、以下の行為:
a.対象の腫瘍組織を請求項3に記載の腫瘍微小環境プラットフォーム上で培養して、培養された腫瘍組織を得ること;および
b.培養された腫瘍組織を剤で処理し、剤に対する腫瘍の反応をアッセイにより評価して、前記剤の腫瘍細胞に対する効果を決定すること;
を含む、前記方法。 - 腫瘍細胞を特定のマーカーについてスクリーニングするための方法であって、該方法が、以下の行為:
a.対象の腫瘍組織を請求項3に記載の腫瘍微小環境プラットフォーム上で培養して、培養された腫瘍組織を得ること;
b.培養された腫瘍組織を1または2以上の薬物で処理し、薬物に対する腫瘍の反応をアッセイにより評価すること;および
c.マイクロアレイおよび核酸解析を行って、バイオマーカーについてスクリーニングすること;
を含む、前記方法。 - 請求項1に記載の細胞外基質[ECM]組成物であって、細胞外基質[ECM]組成物が腫瘍特異的であり、コラーゲン1が、約0.01μg/mlから約100μg/mlの範囲の濃度、好ましくは約5μg/mlまたは約20μg/mlまたは約50μg/mlであり;
コラーゲン3が、約0.01μg/mlから約100μg/mlの範囲の濃度、好ましくは約0.1μg/mlまたは約1μg/mlまたは約100μg/mlであり;
コラーゲン4が、約0.01μg/mlから約500μg/mlの範囲の濃度、好ましくは約5μg/mlまたは約20μg/mlまたは約250μg/mlであり;
コラーゲン6が、約0.01μg/mlから約500μg/mlの範囲の濃度、好ましくは約0.1μg/mlまたは約1μg/mlまたは約10μg/mlであり;
フィブロネクチンが、約0.01μg/mlから約750μg/mlの範囲の濃度、好ましくは約5μg/mlまたは約20μg/mlまたは約500μg/mlであり;
ビトロネクチンが、約0.01μg/mlから約95μg/mlの範囲の濃度、好ましくは約5μg/mlまたは約10μg/mlであり;
カドヘリンが、約0.01μg/mlから約500μg/mlの範囲の濃度、好ましくは約1μg/mlおよび約5μg/mlであり;
フィラミンAが、約0.01μg/mlから約500μg/mlの範囲の濃度、好ましくは約5μg/mlまたは約10μg/mlであり;
ビメンチンが、約0.01μg/mlから約100μg/mlの範囲の濃度、好ましくは約1μg/mlまたは約10μg/mlであり;
ラミニンが、約0.01μg/mlから約100μg/mlの範囲の濃度、好ましくは約5μg/mlまたは約10μg/mlまたは約20μg/mlであり;
デコリンが、約0.01μg/mlから約100μg/mlの範囲の濃度、好ましくは約10μg/mlまたは約20μg/mlであり;
テネイシンCが、約0.01μg/mlから約500μg/mlの範囲の濃度、好ましくは約10μg/mlまたは約25μg/mlであり;
オステオポンチンが、約0.01μg/mlから約150μg/mlの範囲の濃度、好ましくは約1μg/mlまたは約5μg/mlであり;
基底膜タンパク質、細胞骨格タンパク質、および基質タンパク質が、約0.01μg/mlから約150μg/mlの範囲の濃度である;
前記細胞外基質[ECM]組成物。 - 請求項3に記載の腫瘍微小環境プラットフォームであって、細胞外基質[ECM]組成物が腫瘍特異的であり、コラーゲン1が、約0.01μg/mlから約100μg/mlの範囲の濃度、好ましくは約5μg/mlまたは約20μg/mlまたは約50μg/mlであり;
コラーゲン3が、約0.01μg/mlから約100μg/mlの範囲の濃度、好ましくは約0.1μg/mlまたは約1μg/mlまたは約100μg/mlであり;
コラーゲン4が、約0.01μg/mlから約500μg/mlの範囲の濃度、好ましくは約5μg/mlまたは約20μg/mlまたは約250μg/mlであり;
コラーゲン6が、約0.01μg/mlから約500μg/mlの範囲の濃度、好ましくは約0.1μg/mlまたは約1μg/mlまたは約10μg/mlであり;
フィブロネクチンが、約0.01μg/mlから約750μg/mlの範囲の濃度、好ましくは約5μg/mlまたは約20μg/mlまたは約500μg/mlであり;
ビトロネクチンが、約0.01μg/mlから約95μg/mlの範囲の濃度、好ましくは約5μg/mlまたは約10μg/mlであり;
カドヘリンが、約0.01μg/mlから約500μg/mlの範囲の濃度、好ましくは約1μg/mlおよび約5μg/mlであり;
フィラミンAが、約0.01μg/mlから約500μg/mlの範囲の濃度、好ましくは約5μg/mlまたは約10μg/mlであり;
ビメンチンが、約0.01μg/mlから約100μg/mlの範囲の濃度、好ましくは約1μg/mlまたは約10μg/mlであり;
ラミニンが、約0.01μg/mlから約100μg/mlの範囲の濃度、好ましくは約5μg/mlまたは約10μg/mlまたは約20μg/mlであり;
デコリンが、約0.01μg/mlから約100μg/mlの範囲の濃度、好ましくは約10μg/mlまたは約20μg/mlであり;
テネイシンCが、約0.01μg/mlから約500μg/mlの範囲の濃度、好ましくは約10μg/mlまたは約25μg/mlであり;
オステオポンチンが、約0.01μg/mlから約150μg/mlの範囲の濃度、好ましくは約1μg/mlまたは約5μg/mlであり;
基底膜タンパク質、細胞骨格タンパク質、および基質タンパク質が、約0.01μg/mlから約150μg/mlの範囲の濃度である;
前記腫瘍微小環境プラットフォーム。 - 請求項2、4〜9のいずれか一項に記載の方法であって、細胞外基質[ECM]組成物が腫瘍特異的であり、コラーゲン1が、約0.01μg/mlから約100μg/mlの範囲の濃度、好ましくは約5μg/mlまたは約20μg/mlまたは約50μg/mlであり;
コラーゲン3が、約0.01μg/mlから約100μg/mlの範囲の濃度、好ましくは約0.1μg/mlまたは約1μg/mlまたは約100μg/mlであり;
コラーゲン4が、約0.01μg/mlから約500μg/mlの範囲の濃度、好ましくは約5μg/mlまたは約20μg/mlまたは約250μg/mlであり;
コラーゲン6が、約0.01μg/mlから約500μg/mlの範囲の濃度、好ましくは約0.1μg/mlまたは約1μg/mlまたは約10μg/mlであり;
フィブロネクチンが、約0.01μg/mlから約750μg/mlの範囲の濃度、好ましくは約5μg/mlまたは約20μg/mlまたは約500μg/mlであり;
ビトロネクチンが、約0.01μg/mlから約95μg/mlの範囲の濃度、好ましくは約5μg/mlまたは約10μg/mlであり;
カドヘリンが、約0.01μg/mlから約500μg/mlの範囲の濃度、好ましくは約1μg/mlおよび約5μg/mlであり;
フィラミンAが、約0.01μg/mlから約500μg/mlの範囲の濃度、好ましくは約5μg/mlまたは約10μg/mlであり;
ビメンチンが、約0.01μg/mlから約100μg/mlの範囲の濃度、好ましくは約1μg/mlまたは約10μg/mlであり;
ラミニンが、約0.01μg/mlから約100μg/mlの範囲の濃度、好ましくは約5μg/mlまたは約10μg/mlまたは約20μg/mlであり;
デコリンが、約0.01μg/mlから約100μg/mlの範囲の濃度、好ましくは約10μg/mlまたは約20μg/mlであり;
テネイシンCが、約0.01μg/mlから約500μg/mlの範囲の濃度、好ましくは約10μg/mlまたは約25μg/mlであり;
オステオポンチンが、約0.01μg/mlから約150μg/mlの範囲の濃度、好ましくは約1μg/mlまたは約5μg/mlであり;
基底膜タンパク質、細胞骨格タンパク質、および基質タンパク質が、約0.01μg/mlから約150μg/mlの範囲の濃度である;
前記方法。 - 腫瘍組織が、中枢神経系、骨髄、血液、脾臓、胸腺、心臓、乳腺、肝臓、膵臓、甲状腺、骨格筋、腎臓、肺、腸、胃、食道、卵巣、膀胱、精巣、子宮、間質組織および結合組織、またはそれらの任意の組み合わせを含む群から選択されるソースから得られ、腫瘍または腫瘍組織が、外科的にもしくは生検により、または異種移植片としてまたはそれらの任意の組合せで得られ;および前記腫瘍または腫瘍組織が、約100μmから約3000μmの切片の小さな断片に分割されている、請求項3に記載の腫瘍微小環境プラットフォーム。
- 腫瘍組織が、中枢神経系、骨髄、血液、脾臓、胸腺、心臓、乳腺、肝臓、膵臓、甲状腺、骨格筋、腎臓、肺、腸、胃、食道、卵巣、膀胱、精巣、子宮、間質組織および結合組織、またはそれらの任意の組み合わせを含む群から選択されるソースから得られ、腫瘍または腫瘍組織が、外科的にもしくは生検により、または異種移植片としてまたはそれらの任意の組合せで得られ;および前記腫瘍または腫瘍組織が、約100μmから約3000μmの切片の小さな断片に分割されている、請求項2、4〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 腫瘍組織の培養が、約30℃から約40℃の範囲の温度、好ましくは約37℃で;約2〜10日の間、好ましくは約3〜7日;および約5%のCO2で実施され、コーティングプラットフォームが、プレート、ベース、フラスコ、ディッシュ、ペトリプレートおよびペトリ皿を含む群から選択される、請求項3に記載の腫瘍微小環境プラットフォーム。
- 腫瘍組織の培養が、約30℃から約40℃の範囲の温度、好ましくは約37℃で;約2〜10日の間、好ましくは約3〜7日;および約5%のCO 2 で実施され、コーティングプラットフォームが、プレート、ベース、フラスコ、ディッシュ、ペトリプレートおよびペトリ皿を含む群から選択される、請求項4〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 微小環境プラットフォームが、腫瘍細胞のシグナリングネットワーク、無傷の組織の微小環境、細胞構造、および腫瘍−間質相互作用の完全性を維持するためのものである、請求項3に記載の腫瘍微小環境プラットフォーム。
- 微小環境プラットフォームが、腫瘍細胞のシグナリングネットワーク、無傷の組織の微小環境、細胞構造、および腫瘍−間質相互作用の完全性を維持するためのものである、請求項4に記載の方法。
- 培養培地が、約60%〜約100%の範囲の濃度、好ましくは約80%で2mlのダルベッコ改変イーグル培地[DMEM]またはRPMI1640[Roswell Park Memorial Institute Medium];約0.1%〜約40%の範囲の濃度、好ましくは約2%(重量/重量)の熱不活性化ウシ胎児血清(FBS);約1%〜約2%の範囲の濃度、好ましくは約1%(重量/重量)のペニシリン−ストレプトマイシン;約10mM〜約500mMの範囲の濃度、好ましくは約100mMのピルビン酸ナトリウム;約1mM〜約10mMの範囲の濃度、好ましくは約5mMのL−グルタミンである非必須アミノ酸;および約1mM〜約20mMの範囲の濃度、好ましくは約10mMのHEPES(4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジンエタンスルホン酸)またはそれらの任意の組合せを含む群から選択され;および、培養培地中の血清が、約0.1%〜約10%の範囲の濃度、好ましくは約2%である、請求項3に記載の腫瘍微小環境プラットフォーム。
- 培養培地が、約60%〜約100%の範囲の濃度、好ましくは約80%で2mlのダルベッコ改変イーグル培地[DMEM]またはRPMI1640[Roswell Park Memorial Institute Medium];約0.1%〜約40%の範囲の濃度、好ましくは約2%(重量/重量)の熱不活性化ウシ胎児血清(FBS);約1%〜約2%の範囲の濃度、好ましくは約1%(重量/重量)のペニシリン−ストレプトマイシン;約10mM〜約500mMの範囲の濃度、好ましくは約100mMのピルビン酸ナトリウム;約1mM〜約10mMの範囲の濃度、好ましくは約5mMのL−グルタミンである非必須アミノ酸;および約1mM〜約20mMの範囲の濃度、好ましくは約10mMのHEPES(4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジンエタンスルホン酸)またはそれらの任意の組合せを含む群から選択され;および、培養培地中の血清が、約0.1%〜約10%の範囲の濃度、好ましくは約2%である、請求項4〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 腫瘍が、胃癌、結腸癌、頭頸部癌、脳の癌、口腔癌、乳癌、胃癌、胃腸の癌、食道癌、大腸癌、膵臓癌、肺癌、肝臓癌、腎臓癌、卵巣癌、子宮癌、骨の癌、前立腺癌、精巣癌、神経膠芽腫、星状細胞腫、黒色腫、甲状腺癌、膀胱癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、ならびにAML[急性骨髄性白血病]、CML[慢性骨髄性白血病]、ALL[急性リンパ性白血病]、TALL[T細胞急性リンパ芽球性白血病]、NHL[非ホジキンリンパ腫]、DBCL[びまん性B細胞性リンパ腫]、CLL[慢性リンパ性白血病]、および多発性骨髄腫を含む血液の癌、またはこれらの任意の組み合わせを含む群から選択される、請求項2、4〜9のいずれか一項に記載の方法。
- アッセイが、細胞生存率、細胞死、細胞増殖、腫瘍の形態、腫瘍間質含量、細胞代謝、老化またはこれらの任意の組合せについてのアッセイを含む群から選択され、細胞生存率および細胞代謝についてのアッセイが、WSTアッセイ、ATP取り込みアッセイ、およびグルコース取り込みアッセイを含む群から選択され;細胞死についてのアッセイが、LDHアッセイ、活性化カスパーゼ3アッセイ、活性化カスパーゼ8アッセイ、および酸化窒素合成酵素アッセイ、TUNELを含む群から選択され;細胞増殖についてのアッセイが、Ki67アッセイ、ATP/ADP比アッセイおよびグルコース取り込みアッセイを含む群から選択され;ならびに腫瘍の形態および腫瘍間質についてのアッセイが、H&E[ヘマトキシリン&エオシン染色]であるか;またはそれらの任意の組み合わせである、請求項6〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 方法が、対象のための処置を、化学療法、標的療法、外科手術、放射線またはそれらの任意の組み合わせを含む群から決定するために使用され、感受性指数が60より大、20と60の間、および20より小の場合に、感受性指数がそれぞれ、完全臨床反応、部分的臨床反応、および臨床反応なしと相関する、請求項6または7に記載の方法。
- 生化学的アッセイが、ELISA、ブロッティング技術、LCMS、ビーズベースアッセイ、免疫除去、クロマトグラフィーアッセイまたはそれらの任意の組合せを含む群から選択される定量的アッセイまたは定性的アッセイである、請求項2に記載の方法。
- 複数アッセイの各々に対する重みスコアの割り当てが、用いる薬物の性質に基づく、請求項7に記載の方法。
- DNA、RNAまたはマイクロRNAのマイクロアレイおよび核酸分析を実施して、薬物処置の前後の経路の調節を検出し、マイクロアレイおよび核酸分析が、リアルタイムPCR(RTPCR)、免疫組織化学(IHC)分析、およびホスホプロテオミクスプロファイリングを含む群から選択されるアッセイを用いて確認される、請求項9に記載の方法。
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