JP6138154B2 - Biomarkers for breast cancer prediction and diagnosis - Google Patents
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Description
本発明は、生物医学的技術に関する。癌の予測および診断のための一連のバイオマーカーのほか、バイオマーカーの検出のための試薬、検査キットおよびチップが本発明に含まれる。 The present invention relates to biomedical technology. In addition to a series of biomarkers for cancer prediction and diagnosis, reagents, test kits and chips for biomarker detection are included in the present invention.
ＷＨＯの報告によれば、年間約１２０万人の女性が乳癌と診断され、乳癌関連の死亡者数は毎年５４万人と報告されている。近年、乳癌の発生率は著しく上昇している。したがって、乳癌を予防および治療するための方法を開発することは急務である。こうした方法には、乳癌の早期発見および早期介入、癌治療の評価、ならびに腫瘍の転移および再発のモニタリングがある。乳癌のスクリーニング効率および治療後の予後のモニタリングを向上させる基準の１つは、乳癌に対して感度および特異性の高い診断試薬を開発することである。 According to the WHO report, about 1.2 million women are diagnosed with breast cancer annually and the number of breast cancer-related deaths is reported to be 540,000 annually. In recent years, the incidence of breast cancer has increased significantly. Therefore, it is urgent to develop a method for preventing and treating breast cancer. Such methods include early detection and intervention of breast cancer, evaluation of cancer treatment, and monitoring of tumor metastasis and recurrence. One of the criteria to improve breast cancer screening efficiency and prognostic monitoring after treatment is to develop diagnostic reagents that are sensitive and specific for breast cancer.
腫瘍出現のメカニズムに関する最近の調査から、シスタチンスーパーファミリーがシステインプロテアーゼ阻害剤として腫瘍の発生、発育、浸潤および転移に重要な役割を果たしていることが明らかにされた。腫瘍では、シスタチンスーパーファミリーのいくつかのメンバーの発現が増加する。たとえば、シスタチンＣは、卵巣腫瘍および頭頸部腫瘍において相対的に過剰発現する。別の例として、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）細胞におけるステフィンＡの高発現がある。腫瘍におけるシスタチンＦの発現増加は、カテプシンの腫瘍の発生および増殖への関与によると考えられ、腫瘍の発生および増殖中にカテプシン発現が上昇し、シスタチンの発現を引き起こしてフィードバックメカニズムによりカテプシンの活性亢進を阻害する。しかしながら、シスタチンの発現は、必ず腫瘍増殖と正の相関関係があるとは限らない点に留意されたい。たとえば、シスタチンＣの低発現は、神経膠腫患者において末期、予後不良および転移の可能性の高さを示す。その考えられる理由は、癌末期のシスタチン発現を制御する何らかの未知のメカニズムにある。 Recent studies on the mechanism of tumor appearance revealed that the cystatin superfamily plays an important role in tumor development, development, invasion and metastasis as cysteine protease inhibitors. In tumors, the expression of several members of the cystatin superfamily is increased. For example, cystatin C is relatively overexpressed in ovarian and head and neck tumors. Another example is high expression of Stefin A in non-small cell lung cancer (NSCLC) cells. The increased expression of cystatin F in the tumor is thought to be due to the involvement of cathepsin in tumor development and growth. Cathepsin expression rises during tumor development and growth, causing cystatin expression and increasing the activity of cathepsin by a feedback mechanism. Inhibits. However, it should be noted that cystatin expression is not necessarily positively correlated with tumor growth. For example, low expression of cystatin C indicates end stage, poor prognosis, and high likelihood of metastasis in glioma patients. The possible reason is due to some unknown mechanism controlling cystatin expression at the end of cancer.
ヒトシスタチンスーパーファミリーのメンバーにシスタチンＳＮがある。シスタチンＳＮは、ＣＳＴ１遺伝子によりコードされ、１４１個のアミノ酸残基を含む。このタンパク質は２つのジスルフィド結合を含み、その分子量は１６．４ｋＤａである。シスタチンＳＮは典型的な分泌型タンパク質であり、体液および分泌液、たとえば涙、唾液、血清および血漿中に分布する。文献には、胃癌細胞内のＣＳＴ１発現が正常な胃細胞より高いことが報告されている。胃癌細胞株内のＣＳＴ１発現の物理的分布は、腫瘍細胞と一致する。ＣＳＴ１発現は、細胞株の分化の程度と正の相関関係を有する。予備臨床データから、ＣＳＴ１発現が腫瘍の浸潤、転移状態およびｐＴＮＭ分類に依存することが示された。生存率分析からは、ＣＳＴ１発現のある患者の５年全生存率はＣＳＴ１発現のない患者より著しく高いことが示される。Ｃｏｘ解析は、ＣＳＴ１が予後予測の独立した指標であることを示す。これらすべての調査から、ＣＳＴ１は、胃癌の発生および発育中に腫瘍阻害剤として働く可能性があることが証明される。しかしながら、ＣＳＴ１と乳癌との間の相関関係は、これまで報告されていない。 Cystatin SN is a member of the human cystatin superfamily. Cystatin SN is encoded by the CST1 gene and contains 141 amino acid residues. This protein contains two disulfide bonds and its molecular weight is 16.4 kDa. Cystatin SN is a typical secreted protein and is distributed in body fluids and secretions such as tears, saliva, serum and plasma. The literature reports that CST1 expression in gastric cancer cells is higher than normal gastric cells. The physical distribution of CST1 expression within gastric cancer cell lines is consistent with tumor cells. CST1 expression has a positive correlation with the degree of differentiation of the cell line. Preliminary clinical data showed that CST1 expression was dependent on tumor invasion, metastatic status and pTNM classification. Survival analysis shows that the 5-year overall survival rate for patients with CST1 expression is significantly higher than for patients without CST1 expression. Cox analysis indicates that CST1 is an independent indicator of prognosis. All these studies demonstrate that CST1 may act as a tumor inhibitor during gastric cancer development and development. However, no correlation between CST1 and breast cancer has been reported so far.
本発明は、乳癌患者のＣＳＴ１の発現を目的とする。ＣＳＴ１発現と臨床病理パラメーターとの間の相関関係の解析により、乳癌の発生、発育および転移におけるＣＳＴ１の役割が明らかにされるはずである。 The present invention is directed to the expression of CST1 in breast cancer patients. Analysis of the correlation between CST1 expression and clinicopathological parameters should reveal the role of CST1 in breast cancer development, development and metastasis.
第１に、本発明ではヒト組織におけるＣＳＴ１発現を比較した。ＣＳＴ１発現は、唾液腺を除く試験対象のすべての組織で低いことが発見された。乳癌腫瘍と腫瘍隣接組織とのＣＳＴ１２４、ＣＳＴ１、ＣＳＴ２、ＣＳＴ４の発現を比較した。腫瘍と隣接組織とではＣＳＴ１発現の差が最も大きいことが発見された。ＣＳＴ１のｍＲＮＡ（配列番号４４）は２つのスプライスバリアントを有し、スプライス１（配列番号４８）はエクソン１（配列番号４５）、エクソン２（配列番号４６）およびエクソン３（配列番号４７）を含み、スプライス２（配列番号４９）はエクソン１（配列番号４５）およびエクソン２（配列番号４６）のみを含む。我々は、本発明において腫瘍および腫瘍隣接組織のこれら２つの変異体に関する発現差を比較した。我々は、スプライス１がスプライス２より大きな差を有することを発見した。ＣＳＴ１のスプライス１の発現を、乳癌腫瘍、腫瘍隣接組織、乳癌性腫瘍、乳腺炎および正常組織の生検サンプル、乳癌転移のあるおよび乳癌転移のないリンパ節組織、乳癌患者、乳腺炎患者および健常女性の無細胞ＲＮＡにおいて比較した。ＣＳＴ１のスプライス１は乳癌腫瘍および乳癌転移のある組織で過剰発現していることが発見された。ＣＳＴ１のスプライス１の発現の定量測定により、乳癌腫瘍と、腫瘍隣接組織と、正常組織と、乳癌転移のあるおよび乳癌転移のない組織とが高い感度および特異性で差異があることが認識された。 First, the present invention compared CST1 expression in human tissues. CST1 expression was found to be low in all tissues tested except salivary glands. The expression of CST124, CST1, CST2, and CST4 was compared between breast cancer tumors and adjacent tissues. It was discovered that the difference in CST1 expression was greatest between tumors and adjacent tissues. CST1 mRNA (SEQ ID NO: 44) has two splice variants, and splice 1 (SEQ ID NO: 48) includes exon 1 (SEQ ID NO: 45), exon 2 (SEQ ID NO: 46) and exon 3 (SEQ ID NO: 47). , Splice 2 (SEQ ID NO: 49) contains only exon 1 (SEQ ID NO: 45) and exon 2 (SEQ ID NO: 46). We compared expression differences for these two variants of tumor and tumor adjacent tissue in the present invention. We have found that splice 1 has a greater difference than splice 2. Splice 1 expression of CST1 was detected in breast cancer tumors, tumor adjacent tissues, breast cancer tumors, mastitis and normal tissue biopsy samples, lymph node tissues with and without breast cancer metastasis, breast cancer patients, mastitis patients and healthy Comparison was made in female cell-free RNA. It has been discovered that splice 1 of CST1 is overexpressed in tissues with breast cancer tumors and breast cancer metastases. Quantitative measurement of CST1 splice 1 expression recognized a high sensitivity and specificity difference between breast cancer tumors, adjacent tumor tissues, normal tissues, and tissues with and without breast cancer metastasis .
第２に、本発明は、乳癌細胞株および正常血清、乳癌患者および健常者の血清においてシスタチンＳＮ（配列番号５２に示した配列、配列番号５３に示した遺伝子コード）の発現を比較した。シスタチンＳＮが乳癌細胞株および乳癌患者血清において過剰発現することが発見された。シスタチンＳＮ発現の定量測定により、乳癌腫瘍および乳癌患者血清は高い感度および特異性を有し、正常血清と差異があることが認識された。 Secondly, the present invention compared the expression of cystatin SN (sequence shown in SEQ ID NO: 52, gene code shown in SEQ ID NO: 53) in breast cancer cell lines and normal sera, and sera of breast cancer patients and healthy individuals. It has been discovered that cystatin SN is overexpressed in breast cancer cell lines and breast cancer patient sera. Quantitative measurement of cystatin SN expression recognized that breast cancer tumor and breast cancer patient sera have high sensitivity and specificity and differ from normal sera.
上記の発見を組み合わせると、ＣＳＴ１のスプライス１およびシスタチンＳＮは乳癌の予測および診断のバイオマーカーとして使用することができると結論される。臨床常識の結論としてシスタチンＳＮのエピトープペプチド（シグナルペプチド配列の除去後のシスタチンＳＮ配列）も、乳癌の予測および診断のバイオマーカーとして利用することができる。シスタチンＳＮのエピトープペプチドの配列を配列番号５４に示す。 In combination with the above findings, it is concluded that CST1 splice 1 and cystatin SN can be used as biomarkers for breast cancer prediction and diagnosis. As a conclusion of clinical common sense, the epitope peptide of cystatin SN (cystatin SN sequence after removal of the signal peptide sequence) can also be used as a biomarker for the prediction and diagnosis of breast cancer. The sequence of the epitope peptide of cystatin SN is shown in SEQ ID NO: 54.
乳癌は、上述のバイオマーカーの発現を測定することにより予測および診断することができる。用途として、原発性および転移性乳癌の識別および診断、乳癌の感受性解析、原発性または転移性乳癌の治療および医療の有効性評価、ならびに乳癌またはその転移のリスク評価等が挙げられる。たとえば、その方法の１つは以下の通り記載することができる。ＣＳＴ１のスプライス１またはシスタチンＳＮの発現を測定し、カットオフ値と比較する。バイオマーカー（単数または複数）の発現がカットオフ値より高ければ、試験結果は陽性である。カットオフ値は、健常者および乳癌患者の体液もしくは乳房組織のＣＳＴ１のスプライス１またはシスタチンＳＮの発現または含有量を計算および比較することにより得られる。 Breast cancer can be predicted and diagnosed by measuring the expression of the biomarkers described above. Applications include identification and diagnosis of primary and metastatic breast cancer, sensitivity analysis of breast cancer, treatment and medical efficacy assessment of primary or metastatic breast cancer, and risk assessment of breast cancer or its metastases. For example, one of the methods can be described as follows. The expression of CST1 splice 1 or cystatin SN is measured and compared to a cutoff value. A test result is positive if the expression of the biomarker (s) is higher than the cutoff value. Cut-off values are obtained by calculating and comparing the expression or content of CST1 splice 1 or cystatin SN in body fluids or breast tissue of healthy and breast cancer patients.
上記のバイオマーカーの発現の測定には、検査用試薬、キットおよびチップが必要とされる。したがって、本発明では乳癌の予測および診断のためのこれらの試薬、キットおよびチップを検討する。 In order to measure the expression of the above biomarker, a test reagent, a kit and a chip are required. Accordingly, the present invention contemplates these reagents, kits and chips for the prediction and diagnosis of breast cancer.
本発明は、ｍＲＮＡを検出するための複数の方法、以下に限定されるものではないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ：ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、転写介在増幅（ＴＭＡ：ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）および高熱性鎖置換増幅（ｔＳＤＡ：ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を含む。乳癌の予測および診断の検査用試薬を製造するには、ＣＳＴ１のスプライス１（ＣＳＴ１のスプライス１のキャプチャー）またはそのｃＤＮＡを特異的に認識し、かつ検出方法の要求に合致するプライマーまたはプローブを使用してもよい。本発明ではエクソン１、２および３を認識するプライマーおよびプローブを利用し、なかでもエクソン１特異的プライマーおよびプローブが好ましい。たとえば、本発明に使用することができるプライマーの配列は、配列番号１〜２、４〜２１、３４および３９〜４２に示した少なくとも１つの配列と一致すべきである。配列番号１〜２に示した配列は、特に有利である。適用可能なプローブの配列は、配列番号３、３５〜３８および４３に示した配列の少なくとも１つと一致すべきであり、配列番号３に示した配列が好ましい。 The present invention includes multiple methods for detecting mRNA, including but not limited to polymerase chain reaction (PCR), nucleic acid sequence-based amplification (NASBA), transcription-mediated amplification (NAS). Includes TMA: transcription medium amplification, ligase chain reaction (LCR), and thermophilic strand displacement amplification (tSDA). To produce a test reagent for predicting and diagnosing breast cancer, a primer or probe that specifically recognizes CST1 splice 1 (capture of CST1 splice 1) or its cDNA and meets the requirements of the detection method is used. May be. In the present invention, primers and probes that recognize exons 1, 2 and 3 are used, and exon 1-specific primers and probes are particularly preferred. For example, the sequence of the primers that can be used in the present invention should match at least one of the sequences shown in SEQ ID NOs: 1-2, 4-21, 34 and 39-42. The sequences shown in SEQ ID NOs: 1-2 are particularly advantageous. The applicable probe sequence should match at least one of the sequences shown in SEQ ID NOs: 3, 35-38 and 43, with the sequence shown in SEQ ID NO: 3 being preferred.
本発明は、タンパク質検出のための複数の方法、以下に限定されるものではないが、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）およびその派生法、たとえば競合ＥＬＩＳＡ、二重抗体サンドイッチＥＬＩＳＡ、免疫ブロット、ＥＬＩＳＡ免疫ブロット等を含む。シスタチンＳＮを認識する抗体（シスタチンＳＮのキャプチャー）を、乳癌の予測および診断の検査用試薬に使用してもよい。上記の抗体としては、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体が挙げられ、酵素、たとえばアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、ルシフェラーゼ、オキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼおよび様々なフルオロフォアで標識化してもよい。抗体はビオチン標識化してもよく、シグナルはストレプトアビジン−基質複合体により増幅される。定量は、基質と抗体標識化酵素との相互作用時のＵＶ吸光度の変化により実現される。あるいは定量は、フルオロフォア標識抗体のＵＶ励起により実現される。 The present invention relates to multiple methods for protein detection, including but not limited to enzyme immunoassays (ELISAs) and derivatives thereof, such as competitive ELISA, double antibody sandwich ELISA, immunoblot, ELISA immunization. Includes blots and the like. An antibody that recognizes cystatin SN (capture of cystatin SN) may be used as a test reagent for predicting and diagnosing breast cancer. Such antibodies include monoclonal or polyclonal antibodies, and may be labeled with enzymes such as alkaline phosphatase (ALP), luciferase, oxidase, β-galactosidase and various fluorophores. The antibody may be biotinylated and the signal is amplified by a streptavidin-substrate complex. The quantification is realized by a change in UV absorbance upon interaction between the substrate and the antibody-labeled enzyme. Alternatively, quantification is achieved by UV excitation of a fluorophore labeled antibody.
検査用試薬は、簡便かつ迅速な検査に適した乳癌の予測および診断の検査キットを製造するため、相互に組み合わせても、あるいは他の補助検査用試薬と組み合わせてもよい。乳癌の診断および予測には、上述の検査用試薬を含む市販または文献に報告された任意の検査キットを利用してもよい。 The test reagents may be combined with each other or with other auxiliary test reagents in order to produce a test kit for predicting and diagnosing breast cancer suitable for simple and rapid testing. For the diagnosis and prediction of breast cancer, any test kit commercially available or reported in the literature containing the above-described test reagents may be used.
最適化された技術として、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを用いたリアルタイムＰＣＲに基づくＣＳＴ１のスプライス１の検査キットは、アナライトを特異的に認識する少なくとも一対のプライマーおよび１つのプローブを含む。プライマーの配列を配列番号１〜２に示し、５’末端および３’末端にそれぞれフルオロフォア標識および蛍光クエンチャー標識を有するプローブの配列を配列番号３に示す。 As an optimization techniques, TaqMan (registered trademark) CST1 test kit splice 1 based on real-time PCR with probes specifically recognizes the analyte comprises at least one pair of primers and one probe. The sequences of the primers are shown in SEQ ID NOs: 1-2, and the sequences of probes having a fluorophore label and a fluorescent quencher label at the 5 ′ end and 3 ′ end are shown in SEQ ID NO: 3, respectively.
最適化された技術として、フルオロフォアを用いたリアルタイムＰＣＲに基づくＣＳＴ１のスプライス１の検査キットは、少なくとも一対のプライマーを含む。ＣＳＴ１のスプライスのキャプチャーは、ＣＳＴ１のスプライスのｃＤＮＡを特異的に認識するプライマーである。プライマー対の配列を配列番号１〜２、または配列番号４〜５、または配列番号６〜７、または配列番号８〜９、または配列番号１０〜１１、または配列番号１２〜１３、または配列番号１４〜１５、または配列番号１６〜１７、または配列番号１８〜１９、または配列番号２０〜２１に示す。 As an optimized technique, the test kit for splice 1 of CST1 based on real-time PCR using a fluorophore comprises at least a pair of primers. CST1 splice capture is a primer that specifically recognizes CST1 splice cDNA. The sequence of the primer pair is SEQ ID NO: 1-2, or SEQ ID NO: 4-5, or SEQ ID NO: 6-7, or SEQ ID NO: 8-9, or SEQ ID NO: 10-11, or SEQ ID NO: 12-13, or SEQ ID NO: 14. -15, or SEQ ID NOs: 16-17, or SEQ ID NOs: 18-19, or SEQ ID NOs: 20-21.
最適化された技術として、ＮＡＳＢＡまたはＴＭＡに基づくＣＳＴ１のスプライス１の検査キットは、ＣＳＴ１のスプライス１のｃＤＮＡを特異的に認識する少なくとも一対のプライマーおよび１つのプローブを含む。プライマー配列を配列番号３４および配列番号２に示す。５’末端および３’末端にそれぞれフルオロフォア標識および蛍光クエンチャー標識を有するプローブ配列を配列番号３に示す。 As an optimized technique, a NASBA or TMA-based CST1 splice 1 test kit comprises at least a pair of primers and one probe that specifically recognizes CST1 splice 1 cDNA. The primer sequences are shown in SEQ ID NO: 34 and SEQ ID NO: 2. A probe sequence having a fluorophore label and a fluorescent quencher label at the 5 'end and 3' end is shown in SEQ ID NO: 3, respectively.
最適化された技術として、ＬＣＲに基づくＣＳＴ１のスプライス１の検査キットは、検体を特異的に認識する４つのプローブを含む。５’末端にハプテン標識を有するそれらの配列を配列番号３５〜４０に示す。 As an optimized technique, the LCR-based CST1 splice 1 test kit includes four probes that specifically recognize the analyte. Those sequences having a hapten tag at the 5 'end are shown in SEQ ID NOs: 35-40.
最適化された技術として、ｔＳＤＡに基づくＣＳＴ１のスプライス１の検査キットは、ＣＳＴ１のスプライス１のｃＤＮＡを特異的に認識する少なくとも一対のプライマーおよび１つのプローブを含む。プライマーの配列を配列番号３９〜４４に示し、５’末端に放射性標識を有するプローブの配列を配列番号４３に示す。 As an optimized technique, the test kit for splice 1 of CST1 based on tSDA comprises at least a pair of primers and a probe that specifically recognizes the cDNA of splice 1 of CST1. The sequence of the primer is shown in SEQ ID NOs: 39 to 44, and the sequence of the probe having a radioactive label at the 5 'end is shown in SEQ ID NO: 43.
上述のＣＳＴ１のスプライス１のすべての検査キットに、1以上の補助試薬を加えてもよい。こうした補助試薬は、１）プライマーのそれぞれの増幅産物を目視可能または撮像可能にする試薬であり、本方法として、アガロースゲル電気泳動、酵素結合ゲル電気泳動、化学発光、蛍光インシチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）および蛍光顕微鏡検査が挙げられる。２）ＲＮＡ抽出試薬。３）逆転写試薬。４）ｃＤＮＡ増幅試薬、たとえばＰＣＲ、定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、ＮＡＳＢＡ、ＴＭＡ、ＬＣＲおよびｔＳＤＡに利用される試薬。５）校正用標準物質、たとえばＣＳＴ１のスプライス１を含む組換えプラスミド。６）陽性対照、たとえばヒト乳癌細胞株ＨＣＣ１９３７、ＳＫ−ＢＲ−３およびＭＣＦ−７。７）陰性対照、たとえば正常乳房組織細胞株Ｈｓ５７８Ｂｓｔがあるが、これに限定されるものではない。 One or more auxiliary reagents may be added to all the test kits for splice 1 of CST1 described above. These auxiliary reagents are 1) a reagent that makes each amplification product of the primer visible or imageable, and this method includes agarose gel electrophoresis, enzyme-linked gel electrophoresis, chemiluminescence, fluorescence in situ hybridization (FISH). ) And fluorescence microscopy. 2) RNA extraction reagent. 3) Reverse transcription reagent. 4) Reagents used for cDNA amplification reagents such as PCR, quantitative PCR (qPCR), NASBA, TMA, LCR and tSDA. 5) Recombinant plasmid containing splice 1 of calibration standard, eg CST1. 6) Positive controls such as, but not limited to, human breast cancer cell lines HCC1937, SK-BR-3 and MCF-7. 7) Negative controls such as normal breast tissue cell line Hs578Bst.
最適化された技術として、競合ＥＬＩＳＡに基づくシスタチンＳＮの検査キットは、シスタチンアンチゲン、抗シスタチンＳＮモノクローナル抗体、酵素標識二次抗体および酵素の基質を含む。典型的なプロセスでは、ＥＬＩＳＡプレートをシスタチンＳＮアンチゲンでコートする。サンプルおよび抗シスタチンＳＮ抗体をプレート上で連続的にインキュベートする。サンプル中のシスタチンＳＮをレポーティング試薬（酵素標識二次抗体およびそれに対応する基質）のシグナルを測定することにより定量的に判定する。 As an optimized technique, a competitive ELISA-based test kit for cystatin SN comprises cystatin antigen, an anti-cystatin SN monoclonal antibody, an enzyme-labeled secondary antibody and an enzyme substrate. In a typical process, an ELISA plate is coated with cystatin SN antigen. Sample and anti-cystatin SN antibody are incubated sequentially on the plate. Cystatin SN in the sample is quantitatively determined by measuring the signal of a reporting reagent (enzyme-labeled secondary antibody and its corresponding substrate).
最適化された技術として、二重抗体サンドイッチＥＬＩＳＡに基づくシスタチンＳＮの検査キットは、シスタチンアンチゲン、抗シスタチンＳＮモノクローナル抗体、ビオチン標識抗シスタチンＳＮポリクローナル抗体、ストレプトアビジン−酵素複合体および基質を含む。典型的なプロセスでは、ＥＬＩＳＡプレートをシスタチンＳＮアンチゲンで被覆する。サンプルおよびビオチン標識抗シスタチンＳＮポリクローナル抗体をプレート上で連続的にインキュベートする。サンプル中のシスタチンＳＮをレポーティング試薬（ストレプトアビジン−酵素複合体およびそれに対応する基質）のシグナルを測定することにより定量的に判定する。 As an optimized technique, a test kit for cystatin SN based on a double antibody sandwich ELISA includes cystatin antigen, anti-cystatin SN monoclonal antibody, biotin-labeled anti-cystatin SN polyclonal antibody, streptavidin-enzyme complex and substrate. In a typical process, an ELISA plate is coated with cystatin SN antigen. Samples and biotin-labeled anti-cystatin SN polyclonal antibody are incubated sequentially on the plate. Cystatin SN in the sample is quantitatively determined by measuring the signal of the reporting reagent (streptavidin-enzyme complex and its corresponding substrate).
上述のシスタチンＳＮのすべての検査キットに、1以上の補助試薬を加えてもよい。こうした補助試薬には、１）ＥＬＩＳＡコーティング溶液、２）抗体希釈用緩衝液、３）洗浄緩衝液、４）反応停止液、５）校正用シスタチンＳＮ標準物質があるが、これに限定されるものではない。 One or more auxiliary reagents may be added to all test kits for cystatin SN described above. These auxiliary reagents include, but are not limited to: 1) ELISA coating solution, 2) antibody dilution buffer, 3) wash buffer, 4) reaction stop solution, 5) cystatin SN standard for calibration. is not.
ＣＳＴ１のスプライス１またはそのｃＤＮＡの検出用のプローブは、簡便かつ迅速な検査を目的とした、乳癌の予測および診断用のセンシングチップを作製するため、固体基質に固定化してもよい。乳癌の予測および診断用のセンシングチップの作製には、上述のプローブを含む、文献に報告されたバイオチップまたは市販されているチップを使用してもよい。 The probe for detecting CST1 splice 1 or its cDNA may be immobilized on a solid substrate in order to produce a sensing chip for breast cancer prediction and diagnosis for the purpose of simple and rapid examination. For the production of a sensing chip for breast cancer prediction and diagnosis, a biochip reported in the literature or a commercially available chip containing the probe described above may be used.
本発明に言及した検査用試薬、キットおよびチップは、乳癌罹患の感受性の検査、乳癌のｐＴＮＭステージの判定、癌の発育および治療の有効性の評価、ならびに乳癌の再発および転移の検出に使用してもよい。サンプルとしては、手術組織または生検組織、リンパ節組織、髄、血清、血漿、全血、血液サンプル画分および尿が挙げられる。被試験者は、乳房の不快感のため医療支援を求める人、乳癌の家族歴を有する人および乳癌を有する人である。 The test reagents, kits and chips mentioned in the present invention are used to test the sensitivity of breast cancer, determine the pTNM stage of breast cancer, evaluate the effectiveness of cancer development and treatment, and detect the recurrence and metastasis of breast cancer. May be. Samples include surgical or biopsy tissue, lymph node tissue, spinal cord, serum, plasma, whole blood, blood sample fractions and urine. Test subjects are those who seek medical assistance because of breast discomfort, those who have a family history of breast cancer, and those who have breast cancer.
本発明の利点は以下の事実にある。乳癌の予測および診断のバイオマーカーとして、それぞれ配列番号４８および５２に示すＣＳＴ１のスプライス１の配列およびそれにコードされたタンパク質シスタチンＳＮが公表される。これらのバイオマーカーの発現を測定することにより、乳癌の発生または転移の区別および診断、乳癌罹患の感受性の検査、原発性および転移性乳癌に対する治療の有効性の評価、癌予後の予測、および人が乳癌に罹患するまたはその転移を起こすリスクの評価を行うことができる。本発明に記載した方法は、感度、特異性および信頼性が高い。本発明では、ＣＳＴ１のスプライスおよびシスタチンＳＮのキャプチャーだけでなく、乳癌の予測および診断用の検査試薬、キットおよびチップの製造におけるその利用も公表される。 The advantages of the present invention lie in the following facts. As a biomarker for the prediction and diagnosis of breast cancer, the sequence of splice 1 of CST1 shown in SEQ ID NOs: 48 and 52 and the protein cystatin SN encoded thereby are published. By measuring the expression of these biomarkers, breast cancer development or metastasis differentiation and diagnosis, breast cancer susceptibility testing, evaluation of the effectiveness of treatment for primary and metastatic breast cancer, cancer prognosis prediction, and human Can be assessed for the risk of suffering from breast cancer or causing its metastasis. The method described in the present invention is highly sensitive, specific and reliable. The present invention discloses not only the capture of CST1 splice and cystatin SN, but also its use in the manufacture of test reagents, kits and chips for breast cancer prediction and diagnosis.
以下の本文で、本発明の応用例に関するいくつかの詳細な説明を行う。必要な場合には、図を利用する。こうした例に言及される通常の分子生物学の方法に関する実験の詳細については記載しない。そうした方法については、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第３版、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋｅら編）のプロトコルに厳密に従った。我々の実験では、このユーザーマニュアルのバイオ試薬に関するプロトコルが遵守される。こうした例に言及されるパーセンテージが明らかにされていない場合は、すべて重量パーセンテージ（ｗ．ｔ．％）である。 In the following text, some detailed explanations of application examples of the present invention are given. Use figures if necessary. The details of the experiments on the usual molecular biology methods mentioned in these examples are not described. For such methods, the protocol of Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd edition, edited by J. Sambrooke et al.) Was strictly followed. In our experiments, the protocol for bioreagents in this user manual is followed. If the percentages mentioned in these examples are not specified, all are weight percentages (wt%).
核酸
実施例のサンプルはすべて、患者の署名した同意書の受領後に取得されている。サンプルを取得した医療研究所の規則を厳格に遵守した。腫瘍組織の生検サンプルを正常組織と比較した。手術由来のリンパ節サンプルの取得後直ちにＲＮＡ抽出を行うか、あるいは、サンプルを液体窒素中またはＲＮＡｌａｔｅｒ（Ａｍｂｉｏｎ）中で保存した。末梢血サンプル、髄サンプルまたは尿サンプルは２０分間（４０００ｒｐｍ、４℃）遠心分離した。上清をさらに１０分間（１３０００ｒｐｍ、４℃）遠心分離した。その後直ちにＲＮＡ抽出を行うか、あるいはサンプルを低温（−２０〜−８０℃）下で保存した。
Nucleic acids All examples of samples are obtained after receipt of the patient's signed consent form. Strict adherence to the rules of the medical laboratory from which the sample was obtained. Biopsy samples of tumor tissue were compared to normal tissue. RNA extraction was performed immediately after obtaining lymph nodes samples from surgery or samples were stored in liquid nitrogen or RNAlater (Ambion). Peripheral blood samples, medulla samples or urine samples were centrifuged for 20 minutes (4000 rpm, 4 ° C.). The supernatant was centrifuged for an additional 10 minutes (13000 rpm, 4 ° C.). RNA extraction was performed immediately thereafter, or the sample was stored at low temperature (-20 to -80 ° C).
実施例１ ヒト組織におけるＣＳＴ１発現
実施例の正常組織はすべて本発明者らと共同した医学研究所から取得した。他のサンプルは市販品を購入し、対応する法規制を遵守した。様々なヒト組織サンプルにおけるＣＳＴ１ ｍＲＮＡの発現をＨＧ−Ｕ９５ＡＶ Ｈｕｍａｎ ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ａｒｒａｙ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）で測定した。ユーザーマニュアルのプロトコルに従う。ＣＳＴ１ ｍＲＮＡの発現の定量は、β−アクチンの蛍光検量線により行った。結果を図２に示す。ＣＳＴ１は、唾液腺を除き正常組織に発現していない。この発見からＣＳＴ１が、正常組織において低バックグラウンドという優れた診断バイオマーカーの要件の１つに適合することが証明される。図２の結果からはさらに、ＣＳＴ１が乳癌腫瘍細胞株ＨＣＣ１９３７、ＳＫ−ＢＲ−３およびＭＣＦ−７において過剰発現し、正常乳房組織細胞株Ｈｓ５７８Ｂｓｔにおいて発現しないことが示される。こうした結果は、ＣＳＴ１が乳癌の有望なバイオマーカーであることを示す。
Example 1 CST1 Expression in Human Tissue All normal tissues in the examples were obtained from a medical laboratory in collaboration with the inventors. Other samples were purchased commercially and complied with the corresponding laws and regulations. The expression of CST1 mRNA in various human tissue samples was measured with HG-U95AV Human GeneChip Array (Affymetrix). Follow the protocol in the user manual. CST1 mRNA expression was quantified using a β-actin fluorescence calibration curve. The results are shown in FIG. CST1 is not expressed in normal tissues except for salivary glands. This finding proves that CST1 meets one of the requirements of a good diagnostic biomarker with low background in normal tissues. The results in FIG. 2 further indicate that CST1 is overexpressed in breast cancer tumor cell lines HCC1937, SK-BR-3 and MCF-7 and not expressed in normal breast tissue cell lines Hs578Bst. These results indicate that CST1 is a promising biomarker for breast cancer.
実施例２ 乳癌腫瘍および腫瘍隣接組織におけるＣＳＴ１２４、ＣＳＴ１、ＣＳＴ２およびＣＳＴ４の発現
蛍光色素をプローブとして用いたリアルタイムｑＰＣＲを使用して、２０個の乳癌腫瘍サンプルおよびそのそれぞれの腫瘍隣接組織におけるＣＳＴ１２４、ＣＳＴ１、ＣＳＴ２およびＣＳＴ４のｍＲＮＡの発現を測定した。ＲＮＡ抽出にはトリゾール試薬を使用した。ｍＲＮＡの逆転写は、市販されているキットを用いてユーザーマニュアルに従い行った。ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅のプライマーは、表１にまとめてある。蛍光色素は、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ、Ｅｖｅ ＧｒｅｅｎおよびＬＣ Ｇｒｅｅｎ等である。図３に示すように、ＣＳＴ１は、腫瘍と腫瘍隣接組織とにおいて検査した全遺伝子の中で発現差が最も大きい。
Example 2 Expression of CST124, CST1, CST2, and CST4 in Breast Cancer Tumors and Tumor Adjacent Tissues Using real-time qPCR with fluorescent dye as a probe, 20 breast cancer tumor samples and CST124, CST1 in their respective tumor adjacent tissues , CST2 and CST4 mRNA expression was measured. Trizol reagent was used for RNA extraction. Reverse transcription of mRNA was performed according to the user manual using a commercially available kit. Primers for PCR amplification of cDNA are summarized in Table 1. Examples of the fluorescent dye include SYBR Green, Eve Green, and LC Green. As shown in FIG. 3, CST1 has the largest expression difference among all the genes examined in the tumor and the tumor adjacent tissue.
実施例３ 乳癌腫瘍および腫瘍隣接組織におけるＣＳＴ１のスプライス１および２の発現
蛍光色素をプローブとして用いたリアルタイムｑＰＣＲを使用して、２０個の乳癌腫瘍サンプルおよびそのそれぞれの腫瘍隣接組織におけるＡＣＴＢ遺伝子のｍＲＮＡの発現を測定した。図４に示すように、ＡＣＴＢ遺伝子のクロスポイント値（ＣＰ：ｃｒｏｓｓ ｐｏｉｎｔ）は近い。次に、蛍光色素をプローブとして用いたリアルタイムｑＰＣＲを使用して、２０個の乳癌腫瘍サンプルおよびそのそれぞれの腫瘍隣接組織におけるＣＳＴ１の２つのスプライスのｍＲＮＡの発現を測定した。ＰＣＲのプロトコルおよびプライマー設計は実施例２のそれと同一である。図５に示すように、腫瘍および腫瘍隣接組織においてスプライス２よりスプライス１の方が発現差が大きいことから、乳癌の診断バイオマーカーとしてスプライス１の方がスプライス２より有利であることが示される。
Example 3 Expression of CST1 Splices 1 and 2 in Breast Cancer Tumors and Tumor Adjacent Tissues Using real-time qPCR with a fluorescent dye as a probe, mRNA of ACTB gene in 20 breast cancer tumor samples and their respective tumor adjoining tissues The expression of was measured. As shown in FIG. 4, the cross point value (CP) of the ACTB gene is close. Next, the expression of two splice mRNAs of CST1 in 20 breast cancer tumor samples and their respective tumor adjacent tissues was measured using real-time qPCR using a fluorescent dye as a probe. The PCR protocol and primer design is identical to that of Example 2. As shown in FIG. 5, since the expression difference of splice 1 is larger than that of splice 2 in tumors and tumor adjacent tissues, it is shown that splice 1 is more advantageous than splice 2 as a diagnostic biomarker for breast cancer.
実施例４ 乳癌腫瘍および腫瘍隣接組織および正常組織におけるＣＳＴ１のスプライス１の発現
乳癌腫瘍、腫瘍隣接組織および正常組織におけるＣＳＴ１のスプライス１の発現をリアルタイムＰＣＲにより定量した。ＰＣＲプライマーの配列を配列番号１および配列番号２に示す。増幅産物の配列を配列番号５０に示す。図６に示すように、ＣＳＴ１のスプライス１は乳癌腫瘍組織において過剰発現する一方、その発現は腫瘍隣接組織および正常組織において比較的に低い。腫瘍におけるスプライス１の発現の中央値は正常組織のそれより１５．６倍高い。癌性腫瘍は、２２３．２０をカットオフ値として使用すれば、正常組織と区別することができ、これを乳癌診断の基準値として提案する。
Example 4 Expression of CST1 Splice 1 in Breast Cancer Tumors and Tumor Adjacent and Normal Tissues Expression of CST1 splice 1 in breast cancer tumors, tumor adjacent and normal tissues was quantified by real time PCR. The sequences of PCR primers are shown in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2. The sequence of the amplification product is shown in SEQ ID NO: 50. As shown in FIG. 6, splice 1 of CST1 is overexpressed in breast cancer tumor tissue, while its expression is relatively low in tumor adjacent tissue and normal tissue. The median expression of splice 1 in tumors is 15.6 times higher than that of normal tissues. Cancerous tumors can be distinguished from normal tissues using 223.20 as a cut-off value, which is proposed as a reference value for breast cancer diagnosis.
実施例５ 乳癌および乳腺炎の患者の生検サンプルにおけるＣＳＴ１のスプライス１の発現
手術由来のサンプルおよび生検由来のサンプルは、生検サンプルにおける癌細胞の割合にばらつきがあるので差が大きい。このため、乳癌または乳腺炎の患者由来の４０の生検サンプルを、リアルタイムＰＣＲを使用して検査した。ＰＣＲプライマーの配列を配列番号１〜２に示す。図７に示すように、乳癌サンプルにおけるＣＳＴ１のスプライス１の発現は乳腺炎サンプルにおけるより高い。乳癌のＣＳＴ１発現の中央値は乳腺炎のそれより１１．０倍高い。癌性腫瘍は、１２０．６６コピーをカットオフ値として使用すれば、乳腺炎の組織と区別することができ、これを乳癌診断の基準値として提案する。
Example 5 Expression of Splice 1 of CST1 in Biopsy Samples of Breast Cancer and Mastitis Patients Surgery-derived samples and biopsy-derived samples vary greatly due to variations in the proportion of cancer cells in the biopsy samples. For this reason, 40 biopsy samples from patients with breast cancer or mastitis were examined using real-time PCR. The sequences of PCR primers are shown in SEQ ID NOs: 1-2. As shown in FIG. 7, CST1 splice 1 expression in breast cancer samples is higher than in mastitis samples. The median CST1 expression in breast cancer is 11.0 times higher than that in mastitis. Cancerous tumors can be distinguished from mastitis tissue using 120.66 copies as a cut-off value, which is proposed as a reference value for breast cancer diagnosis.
実施例６ 乳癌転移のあるおよび乳癌転移のないリンパ節サンプルにおけるＣＳＴ１のスプライス１の発現
我々は、様々な大きさの乳癌転移がある３０のリンパ節サンプルを集めた。乳癌転移を含まない３０のリンパ節サンプルは、検出不能なリンパ節転移を回避するため初期乳癌患者由来である。これらのリンパ節サンプルにおけるＣＳＴ１のスプライス１の発現の定量のため、リアルタイムＰＣＲを利用した。ＰＣＲプライマーの配列を配列番号１および配列番号２に示す。増幅産物の配列を配列番号５０に示す。図８に示すように、乳癌転移を含むリンパ節サンプルにおけるＣＳＴ１のスプライス１の発現は、転移を含まないリンパ節サンプルより高い。転移サンプルにおけるスプライス１の発現の中央値は、転移を含まないサンプルより６．３倍高い。８２．４５コピーをカットオフ値として定義する場合、乳癌転移を含まない２例がスプライス１の発現陽性と検出される。慎重に組織学的研究を行ったところ、これら２つのサンプルに非常に小さな乳癌転移が発見された。本実施例から、ＣＳＴ１のスプライス１の発現検査は８２．４５コピーをカットオフ値として用いて転移例を区別するだけでなく、組織学的解析より感度が高いことも示される。
Example 6 Expression of CST1 splice 1 in lymph node samples with and without breast cancer metastasis We collected 30 lymph node samples with various sizes of breast cancer metastasis. The 30 lymph node samples that do not contain breast cancer metastases are from early breast cancer patients to avoid undetectable lymph node metastases. Real-time PCR was used to quantify the expression of CST1 splice 1 in these lymph node samples. The sequences of PCR primers are shown in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2. The sequence of the amplification product is shown in SEQ ID NO: 50. As shown in FIG. 8, the expression of CST1 splice 1 in lymph node samples containing breast cancer metastasis is higher than in lymph node samples containing no metastasis. The median expression of splice 1 in the metastasis sample is 6.3 times higher than the sample without metastasis. When 82.45 copies are defined as the cut-off value, two cases that do not contain breast cancer metastasis are detected as positive expression of splice 1. Careful histological studies have found very small breast cancer metastases in these two samples. This example shows that the CST1 splice 1 expression test not only distinguishes metastases using 82.45 copies as a cut-off value, but also is more sensitive than histological analysis.
実施例７ 乳癌患者、乳腺炎患者および健常者の血清中の無細胞ＲＮＡにおけるＣＳＴ１のスプライス１の発現
無細胞ＲＮＡを市販されているキットにより抽出した。５０例の乳癌患者、３０例の乳腺炎患者および３０例の健常者の血清中の無細胞ＲＮＡにおけるＣＳＴ１のスプライス１の発現をリアルタイムＰＣＲにより定量した。ＰＣＲプライマーの配列を配列番号１および配列番号２に示す。増幅産物の配列を配列番号５０に示す。図９に示すように、乳癌サンプルにおけるスプライス１の発現の中央値は、乳腺炎サンプルより８．８倍高く、健常者サンプルより３２倍高い。６５．３２コピーをカットオフ値とすると、癌と炎症および健常者とを区別することができる。図１０は、本検査の受信者動作特性（ＲＯＣ：ｒｅｃｅｉｖｅｒ ｏｐｅｒａｔｉｎｇ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）曲線であり、ＣＳＴ１のスプライス１の発現が乳癌診断のマーカーとして感度および特異性が高いことを示す。曲線下面積（ＡＵＣ：ａｒｅａ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｃｕｒｖｅ）は０．９８７であり、非侵襲的乳癌診断の特異的マーカーとしてのＣＳＴ１のスプライス１を実証する値である。
Example 7 Expression of splice 1 of CST1 in cell-free RNA in the serum of breast cancer patients, mastitis patients and normal subjects Cell-free RNA was extracted with a commercially available kit. The expression of CST1 splice 1 in cell-free RNA in the serum of 50 breast cancer patients, 30 mastitis patients and 30 healthy subjects was quantified by real-time PCR. The sequences of PCR primers are shown in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2. The sequence of the amplification product is shown in SEQ ID NO: 50. As shown in FIG. 9, the median expression of splice 1 in breast cancer samples is 8.8 times higher than mastitis samples and 32 times higher than healthy samples. With a cut-off value of 65.32 copies, it is possible to distinguish cancer from inflammation and healthy individuals. FIG. 10 is a receiver operating characteristic (ROC) curve of this test and shows that the expression of splice 1 of CST1 is highly sensitive and specific as a marker for breast cancer diagnosis. The area under the curve (AUC) is 0.987, a value demonstrating splice 1 of CST1 as a specific marker for noninvasive breast cancer diagnosis.
実施例８ ＬＣＲによる、乳癌患者、乳腺炎患者および健常者の血清中の無細胞ＲＮＡにおけるＣＳＴ１のスプライス１の発現
無細胞ＲＮＡを市販されているキットにより抽出した。５０例の乳癌患者、３０例の乳腺炎患者および３０例の健常者の血清中の無細胞ＲＮＡにおけるＣＳＴ１のスプライス１の発現をＬＣＲにより定量した。ＬＣＲプライマーの配列を配列番号１および配列番号２に示す。増幅産物の配列を配列番号５０に示す。図１１に示すように、癌サンプルにおけるＣＳＴ１のスプライス１の蛍光の相対発光量（ＲＬＵ：ｒｅｌａｔｉｖｅ ｌｉｇｈｔ ｕｎｉｔ）は、乳腺炎サンプルおよび正常サンプルより高く、中央値はそれぞれ１２．３８倍および４０．１２倍高い。１８．５１ＲＬＵをカットオフとして設定すれば、癌は区別される。
Example 8 Expression of CST1 splice 1 in cell-free RNA in the sera of breast cancer patients, mastitis patients and healthy individuals by LCR Cell-free RNA was extracted with a commercially available kit. The expression of CST1 splice 1 in cell-free RNA in the serum of 50 breast cancer patients, 30 mastitis patients and 30 healthy subjects was quantified by LCR. The sequences of the LCR primers are shown in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2. The sequence of the amplification product is shown in SEQ ID NO: 50. As shown in FIG. 11, the relative emission amount (RLU) of CST1 splice 1 in cancer samples is higher than that of mastitis samples and normal samples, and the medians are 12.38 times and 40.12, respectively. Twice as expensive. If 18.51 RLU is set as the cut-off, the cancer is distinguished.
実施例９ ｔＳＤＡによる、乳癌患者、乳腺炎患者および健常者の血清中の無細胞ＲＮＡにおけるＣＳＴ１のスプライス１の発現
無細胞ＲＮＡを市販されているキットにより抽出した。５０例の乳癌患者、３０例の乳腺炎患者および３０例の健常者の血清中の無細胞ＲＮＡにおけるＣＳＴ１のスプライス１の発現をｔＳＤＡにより定量した。ｔＳＤＡプライマーの配列を配列番号１および配列番号２に示す。増幅産物の配列を配列番号５０に示す。図１２に示すように、癌サンプルにおけるＣＳＴ１のスプライス１の発現は乳腺炎サンプルおよび正常サンプルより高く、中央値はそれぞれ４１．３８倍および４２．８６倍高い。２４．８１ＲＬＵをカットオフとして設定すれば、癌は区別される。
Example 9 Expression of splice 1 of CST1 in cell-free RNA in the serum of breast cancer patients, mastitis patients and healthy individuals by tSDA Cell-free RNA was extracted with a commercially available kit. The expression of CST1 splice 1 in the cell-free RNA in the serum of 50 breast cancer patients, 30 mastitis patients and 30 healthy subjects was quantified by tSDA. The sequences of tSDA primers are shown in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2. The sequence of the amplification product is shown in SEQ ID NO: 50. As shown in FIG. 12, CST1 splice 1 expression in cancer samples is higher than mastitis and normal samples, with median values 41.38 and 42.86 times higher, respectively. If 24.81 RLU is set as the cut-off, cancer is distinguished.
実施例１０ ＮＡＳＢＡによる、乳癌患者、乳腺炎患者および健常者の血清中の無細胞ＲＮＡにおけるＣＳＴ１のスプライス１の発現
無細胞ＲＮＡを市販されているキットにより抽出した。５０例の乳癌患者、３０例の乳腺炎患者および３０例の健常者の血清中の無細胞ＲＮＡにおけるＣＳＴ１のスプライス１の発現をＮＡＳＢＡにより定量した。プライマーの配列を配列番号１および配列番号２に示す。増幅産物の配列を配列番号５０に示す。図１３に示すように、癌サンプルにおける蛍光のＲＬＵは乳腺炎サンプルおよび正常サンプルより高く、中央値はそれぞれ１８倍および１８．８７倍高い。２２．９３のＲＬＵをカットオフとして設定すれば、癌は区別される。
Example 10 Expression of Splice 1 of CST1 in Cell-free RNA in the Serum of Breast Cancer Patients, Mastitis Patients and Healthy Persons by NASBA Cell-free RNA was extracted with a commercially available kit. The expression of CST1 splice 1 in the cell-free RNA in the serum of 50 breast cancer patients, 30 mastitis patients and 30 healthy subjects was quantified by NASBA. The primer sequences are shown in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2. The sequence of the amplification product is shown in SEQ ID NO: 50. As shown in FIG. 13, the fluorescence RLU in the cancer sample is higher than that in the mastitis sample and the normal sample, and the median is 18 times and 18.87 times higher, respectively. If the RLU of 22.93 is set as the cutoff, the cancer is distinguished.
実施例１１ 乳癌患者末梢血中のＣＳＴ１のスプライス１の発現、およびその細胞学検査との比較
乳癌患者の血液から赤血球および血小板を除去して末梢血を得、そこからＲＮＡを抽出した。ＣＳＴ１のスプライス１の発現をリアルタイムＰＣＲにより定量した。プライマーの配列を配列番号１および配列番号２に示す。増幅産物の配列を配列番号５０に示す。その結果を乳腺炎患者および健常者の血液サンプル中のスプライス１の発現と比較した。スプライス１の高発現は癌細胞の存在指標となる。そして、細胞学検査をゴールドスタンダードとして使用して癌細胞の存在を確認した。結果は図１４にまとめてある。細胞診断による乳癌はすべてスプライス１の発現検査により特定される。細胞学検査により判定された、乳癌を含まない一部の例は、後で転移を含む例であると確認されている。これは（Ｔｈｅ）、ＣＳＴ１のスプライス１が細胞診より感度の高い乳癌診断法であることを意味する。
Example 11 Expression of CST1 Splice 1 in Peripheral Blood of Breast Cancer Patient and Comparison with Cytology Examination Peripheral blood was obtained by removing erythrocytes and platelets from the blood of a breast cancer patient, and RNA was extracted therefrom. CST1 splice 1 expression was quantified by real-time PCR. The primer sequences are shown in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2. The sequence of the amplification product is shown in SEQ ID NO: 50. The results were compared with the expression of splice 1 in the blood samples of mastitis patients and healthy subjects. High expression of splice 1 is an indicator of the presence of cancer cells. The presence of cancer cells was then confirmed using cytology tests as the gold standard. The results are summarized in FIG. All breast cancers by cytodiagnosis are identified by splice 1 expression test. Some examples that did not include breast cancer, as determined by cytology, were later identified as examples that included metastases. This means (The) that CST1 splice 1 is a more sensitive breast cancer diagnostic method than cytology.
実施例１２ 乳癌患者の髄におけるＣＳＴ１のスプライス１の発現、およびその細胞学検査との比較
リアルタイムＰＣＲを利用して、乳癌患者の髄サンプルにおけるＣＳＴ１のスプライス１の発現を定量した。プライマーの配列を配列番号１および配列番号２に示す。増幅産物の配列を配列番号５０に示す。その結果を健常髄サンプルと比較した。スプライス１の高発現は、癌および癌転移の存在の指標となる。そして、細胞学検査をゴールドスタンダードとして使用して癌細胞の存在を確認した。図１５に示すように、組織学的陽性サンプルの９５％がＣＳＴ１のスプライス１の発現検査により特定された。発現検査は、組織学的検査より高い陽性率を有することから、感度がより高いことが示唆される。
Example 12 Expression of CST1 Splice 1 in the Marrow of Breast Cancer Patients and Its Comparison with Cytology Examination Real-time PCR was used to quantify the expression of CST1 splice 1 in marrow samples from breast cancer patients. The primer sequences are shown in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2. The sequence of the amplification product is shown in SEQ ID NO: 50. The results were compared with healthy medulla samples. High expression of splice 1 is indicative of the presence of cancer and cancer metastasis. The presence of cancer cells was then confirmed using cytology tests as the gold standard. As shown in FIG. 15, 95% of the histologically positive samples were identified by CST1 splice 1 expression test. Expression tests have a higher positive rate than histological tests, suggesting that they are more sensitive.
実施例１３ ＣＳＴ１のスプライス１の発現によるｐＴＮＭ分類
様々なｐＴＮＭステージの８０例の乳癌患者（ＩおよびＩＩが３０例、ＩＩＩおよびＩＶが５０例）の無細胞ＲＮＡを市販されているキットにより抽出した。ＴＭＡを利用して、スプライス１の発現を検査した。プライマーの配列を配列番号１および配列番号２に示す。増幅産物の配列を配列番号５０に示す。図１６に示すように、ステージＩＩＩおよびＩＶのサンプルのＲＬＵはステージＩおよびＩＩのサンプルより高く、中央値は１５倍高い。この結果から、ＣＳＴ１のスプライス１の発現がｐＴＮＭ分類のマーカーであることが証明される。
Example 13 pTNM classification by expression of splice 1 of CST1 Cell-free RNA of 80 breast cancer patients (30 cases of I and II, 50 cases of III and IV) at various pTNM stages was extracted with a commercially available kit . TMA was used to examine the expression of splice 1. The primer sequences are shown in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2. The sequence of the amplification product is shown in SEQ ID NO: 50. As shown in FIG. 16, the RLU of the stage III and IV samples is higher than the stage I and II samples, and the median is 15 times higher. This result demonstrates that the expression of splice 1 of CST1 is a marker for pTNM classification.
実施例１４ 乳癌治療のモニタリングにおけるＣＳＴ１のスプライス１の発現の利用
リアルタイムＰＣＲを利用して、乳癌患者（化学療法を受けている６例および放射線療法を受けている４例）の血液中のＣＳＴ１のスプライス１の発現を定量した。プライマーの配列を配列番号１および配列番号２に示す。増幅産物の配列を配列番号５０に示す。治療の評価のためスプライス１の発現をモニターした。表２に示すように、治療が効果的な患者では、ＣＳＴ１のスプライス１の発現が療法を継続するに従い減少し、腫瘍の大きさが小さくなることがイメージングにより観察された。治療が効果的でない患者の場合、ＣＳＴ１のスプライス１の発現が療法を継続するに従い増加し、腫瘍の大きさが大きくなることがイメージングにより観察された。ＣＳＴ１のスプライス１の発現を、療法の有効性の判断基準として、および癌発育のリアルタイムモニタリングのマーカーとして利用することを提唱する。
Example 14 Utilization of CST1 Splice 1 Expression in Monitoring Breast Cancer Treatment Using real-time PCR, CST1 in the blood of breast cancer patients (6 patients receiving chemotherapy and 4 patients receiving radiation therapy) Splice 1 expression was quantified. The primer sequences are shown in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2. The sequence of the amplification product is shown in SEQ ID NO: 50. Splice 1 expression was monitored for therapeutic evaluation. As shown in Table 2, imaging showed that CST1 splice 1 expression decreased with continued therapy and tumor size decreased in patients with effective treatment. In patients with ineffective treatment, it was observed by imaging that splice 1 expression of CST1 increased with continued therapy and tumor size increased. It is proposed that CST1 splice 1 expression be used as a criterion for therapeutic efficacy and as a marker for real-time monitoring of cancer development.
実施例１５ 乳癌患者のＣＳＴ１のスプライス１の発現による予後
乳癌患者血液中のＣＳＴ１のスプライス１の発現をリアルタイムＰＣＲにより定量した。プライマーの配列を配列番号１および配列番号２に示す。増幅産物の配列を配列番号５０に示す。癌の予後を手術から１ヶ月後、３ヶ月後および１年後に評価した。表３に示すように、癌再発の症例が２例あり、ＣＳＴ１のスプライス１の発現が増加し、ＣＳＴ１のスプライス１の発現が１０００コピーに達したとき、イメージングにより転移が確認された。残りの３例では、イメージングによる再発の証拠、またはＣＳＴ１発現の増加が観察されなかった。こうした一貫性は、乳癌の予後マーカーとしてのＣＳＴ１のスプライス１の発現の有効性を立証する。
Example 15 Prognosis by Expression of Splice 1 of CST1 in Breast Cancer Patients The expression of splice 1 of CST1 in the blood of breast cancer patients was quantified by real-time PCR. The primer sequences are shown in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2. The sequence of the amplification product is shown in SEQ ID NO: 50. Cancer prognosis was assessed 1 month, 3 months and 1 year after surgery. As shown in Table 3, there were two cases of cancer recurrence, and when the expression of splice 1 of CST1 increased and the expression of splice 1 of CST1 reached 1000 copies, metastasis was confirmed by imaging. In the remaining 3 cases, no evidence of recurrence by imaging or increased CST1 expression was observed. This consistency demonstrates the effectiveness of CST1 splice 1 expression as a prognostic marker for breast cancer.
実施例１６ ＣＳＴ１のスプライス１の、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを用いたリアルタイムＰＣＲ測定用の検査キット
本キットは以下を含む。１）ＰＣＲプライマー：５’−ｔｃｔｃａｃｃｃｔｃｃｔｃｔｃｃｔｇ−３’（配列番号１）および５’−ｔｔａｔｃｃｔａｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｔｇｇ−３’（配列番号２）。２）プローブ：５’−ＦＡＭ−ｃｔｃｃａｇｃｔｔｔｇｔｇｃｔｃｔｇｃｃｔｃｔ−ＴＡＭＲＡ−３’（配列番号３）。
Splice 1 of Example 16 CST1, TaqMan (registered trademark) test kits the kit for real-time PCR measurement using the probes include the following. 1) PCR primers: 5′-tctcacccctcctctcctg-3 ′ (SEQ ID NO: 1) and 5′-tattcctatcctcctccttggtgg-3 ′ (SEQ ID NO: 2). 2) Probe: 5'-FAM-ctccagctttgtctctgcctct-TAMRA-3 '(SEQ ID NO: 3).
キットには、以下：ＲＮＡ抽出試薬、逆転写試薬、デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、緩衝液、塩化マグネシウム溶液、ＤＮＡポリメラーゼ、ＣＳＴ１のスプライス１の増幅産物の配列（配列番号５１）を含む組換えプラスミド標準物質（図１に示すようなもの。プライマーは５’−ｇｇｇｃｔｃｃｃｔｇｃｃｔｃｇｇｇｃｔｃｔｃａｃ−３’（配列番号２２）および５’−ａｃｇｇｔｃｔｇｔｔｇｃｃｔｇｇｃｔｃｔｔａｇｔ−３’（配列番号２３）である）、陽性対照（乳癌細胞株ＨＣＣ１９３７）および陰性対照（乳房組織細胞株Ｈｓ５７８Ｂｓｔ）の1以上を含めてもよい。 The kit includes the following: RNA extraction reagent, reverse transcription reagent, deoxynucleotide triphosphate (dNTP), buffer, magnesium chloride solution, DNA polymerase, CST1 splice 1 amplification product sequence (SEQ ID NO: 51) Replacement plasmid standards (as shown in FIG. 1; primers are 5′-ggggctcctgcctcgggctctcac-3 ′ (SEQ ID NO: 22) and 5′-acgggtgtgtgcctggctcttagt-3 ′ (SEQ ID NO: 23)), positive control (breast cancer cell line) One or more of HCC 1937) and a negative control (breast tissue cell line Hs578Bst) may be included.
典型的な手順では、サンプル、対照および標準物質をＰＣＲにより増幅する。標準物質のＣＰ値を標準物質の濃度に対してプロットし、データフィッティングにより校正式を得る。遺伝子の定量はＣＰ値を検量線と比較して行う。 In a typical procedure, samples, controls and standards are amplified by PCR. The CP value of the standard substance is plotted against the standard substance concentration, and a calibration formula is obtained by data fitting. The gene is quantified by comparing the CP value with a calibration curve.
実施例１７ ＣＳＴ１のスプライス１の、蛍光色素を用いたリアルタイムＰＣＲ測定用の検査キット
以下のプライマーの少なくとも一対を含むべきである。［１］５’−ｔｃｔｃａｃｃｃｔ−ｃｃｔｃｔｃｃｔｇ−３’（配列番号１）；５’−ｔｔａｔｃｃｔａｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｔｇｇ−３’（配列番号２）。［２］５’−ｃｃｃｔｇｇｇａｇａａｃａｇａａｇｇｔｃｃ−３’（配列番号４）；５’−ｇｇｔｇｇｔｇｇｃｔｇｇｔｇｃｇａａｔ−３’（配列番号５）。［３］５’−ｃａｔｔｃｇｃａｃｃａｇｃｃａｃｃａｃ−３’（配列番号６）；５’−ａｇａａｇｃａａ−ｇａａｇｇａａｇｇａｇｇｇａｇ−３’（配列番号７）。［４］５’−ｃａｇｃｇｔｇｃｃｃｔｔｃａｃｔｔｃｇ−３’（配列番号８）；５’−ｃｇｇｔｃｔｇｔｔｇｃｃｔｇｇｃｔｃｔｔａ−３’（配列番号９）。［５］５’−ｃａｔｔｃｇｃａｃｃａｇｃｃａ−ｃｃａｃ−３’（配列番号１０）；５’−ｃａｇｇｇｃｔａｔａｇａａｇｃａａｇａａｇｇａａ−３’（配列番号１１）。［６］５’−ｇｇｔａｃａｇｃｇｔｇｃｃｃｔｔｃａｃｔｔｃ−３’（配列番号１２）；５’−ｃｇｇｔｃｔｇｔｔｇｃｃｔｇｇｃｔｃｔｔａ−３’（配列番号１３）。［７］５’−ｇａｇａａｃａｇａａｇｇｔｃｃｃｔｇｇｔｇａａ−３’（配列番号１４）；５’−ｇｇｔｇｇｔｇｇｃｔｇｇｔｇｃｇａａｔ−３’（配列番号１５）。［８］５’−ｔｇｇｇｔａｃａｇｃｇｔｇｃｃｃｔｔｃａ−３’（配列番号１６）；５’−ｃｇｇｔｃｔｇｔｔｇｃｃｔｇｇｃｔｃｔｔａ−３’（配列番号１７）。［９］５’−ｃｃｃｔｇｇｇａｇａａｃａｇａａｇｇｔｃｃ−３’（配列番号１８）；５’−ｔｇｇｔｇｇｃｔｇｇｔｇｃｇａａｔｇｇ−３’（配列番号１９）。［１０］５’−ｔｔｃｃｃｔｇｇｇａｇ−ａａｃａｇａａｇｇｔｃｃ−３’（配列番号２０）；５’−ｔｇｇｔｇｇ−ｃｔｇｇｔｇｃｇａａｔｇｇ−３’（配列番号２１）。
Example 17 Test Kit for Real-Time PCR Measurement of Splice 1 of CST1 Using Fluorescent Dye At least one pair of the following primers should be included. [1] 5′-tctccacct-cctctcctg-3 ′ (SEQ ID NO: 1); 5′-tattcctatcctcctccttgg-3 ′ (SEQ ID NO: 2). [2] 5′-ccctgggagaacaagaggtcc-3 ′ (SEQ ID NO: 4); 5′-ggtgggtggctggtgcgaat-3 ′ (SEQ ID NO: 5). [3] 5′-catcgcaccaccccaccac-3 ′ (SEQ ID NO: 6); 5′-agagacaa-gaaggaaggagggag-3 ′ (SEQ ID NO: 7). [4] 5′-cagcgtgcccttcactttg-3 ′ (SEQ ID NO: 8); 5′-cggctgtttgcctggctctta-3 ′ (SEQ ID NO: 9). [5] 5'-catcgcaccaccca-ccac-3 '(SEQ ID NO: 10); 5'-caggggtatagaagagaagagaga-3' (SEQ ID NO: 11). [6] 5′-ggtacagcgtgcccttcacttt-3 ′ (SEQ ID NO: 12); 5′-cgtctgtgtgcctggctctta-3 ′ (SEQ ID NO: 13). [7] 5′-gagaacagaaggtccccgtggtgaa-3 ′ (SEQ ID NO: 14); 5′-ggtgggtggctgggtgcgaat-3 ′ (SEQ ID NO: 15). [8] 5′-tgggtacagcgtgcccttca-3 ′ (SEQ ID NO: 16); 5′-cggctgtgtgcctggctctta-3 ′ (SEQ ID NO: 17). [9] 5′-ccctgggagaacaagaggtcc-3 ′ (SEQ ID NO: 18); 5′-tgggtggctgggtgcgaatgg-3 ′ (SEQ ID NO: 19). [10] 5'-ttccctgggag-aaacagaaggtcc-3 '(SEQ ID NO: 20); 5'-tgggtgg-ctgggtgcgaatgg-3' (SEQ ID NO: 21).
キットには、以下：内部マーカーβ−アクチンのプライマー５’−ａａｇａｔｃａｔｔｇｃｔｃｃｔｃｃｔｇ−３’（配列番号３２）、５’−ｃｇｔｃａｔａｃｔｃｃｔｇｃｔｔｇｃ−３’（配列番号３３）、ＲＮＡ抽出試薬、逆転写試薬、デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、緩衝液、塩化マグネシウム溶液、ＤＮＡポリメラーゼおよび蛍光色素（ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎなど）の1以上を含めてもよい。 The kit includes the following: internal marker β-actin primer 5′-aagatacatgctcctccctg-3 ′ (SEQ ID NO: 32), 5′-cgtcatactcctgctttgc-3 ′ (SEQ ID NO: 33), RNA extraction reagent, reverse transcription reagent, deoxynucleotide three One or more of phosphoric acid (dNTP), buffer, magnesium chloride solution, DNA polymerase and fluorescent dye (such as SYBR Green) may be included.
実施例１８ ＮＡＳＢＡに基づくＣＳＴ１のスプライス１の発現の検査キット
本キットは以下を含む。１）プライマー：５’−ａａｔｔｃｔａａｔａｃｇａｃｔｃａ−ｃｔａｔａｇｇｇｔｃｔｃａｃｃｃｔｃｃｔｃｔｃｃｔｇ−３’（配列番号３４）および５’−ｔｔａｔｃｃｔａｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｔｇｇ−３’（配列番号２）。２）プローブ：５’−ＦＡＭ−ｃｔｃｃａｇｃｔｔｔｇｔｇｃｔｃｔｇｃｃｔｃｔ−ダブシル−３’（配列番号３）。
Example 18 Test Kit for Expression of Splice 1 of CST1 Based on NASBA The kit comprises: 1) Primers: 5'-aattctataacgactca-ctataggggtccacccctcctctcctg-3 '(SEQ ID NO: 34) and 5'-ttattcctatcctcctcctttgg-3' (SEQ ID NO: 2). 2) Probe: 5'-FAM-ctccagctttgtctctgcctct-Dabcil-3 '(SEQ ID NO: 3).
キットには以下：ＲＮＡ抽出試薬、逆転写試薬、ＲＮＡの蛍光色素（Ｒｉｂｏ−Ｇｒｅｅｎなど）、Ｔ４ ＲＮＡポリメラーゼ、リボヌクレアーゼH、トリ骨髄性白血病ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素、リボヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）およびｄＮＴＰの1以上を含めてもよい。 The kit includes the following: RNA extraction reagent, reverse transcription reagent, RNA fluorescent dye (such as Ribo-Green), T4 RNA polymerase, ribonuclease H, avian myeloid leukemia virus (AMV) reverse transcriptase, ribonucleotide triphosphate (NTP) ) And one or more of dNTPs may be included.
実施例１９ ＴＭＡに基づくＣＳＴ１のスプライス１の発現の検査キット
本キットは以下を含む。１）プライマー：５’−ａａｔｔｃｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇｇｔｃｔｃａｃｃｃｔｃｃｔｃｔｃｃｔｇ−３’（配列番号３４）および５’−ｔｔａｔｃｃｔａｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｔｇｇ−３’（配列番号２）。２）プローブ：５’−ＦＡＭ−ｃｔｃｃａｇｃｔｔｔｇｔｇｃｔｃｔｇｃｃｔｃｔ−ダブシル−３’（配列番号３）。
Example 19 Test Kit for Splice 1 Expression of CST1 Based on TMA The kit includes: 1) Primers: 5'-aattctataacgactcactatagggtctcaccctcctctcctg-3 '(SEQ ID NO: 34) and 5'-ttattcctatcctcctccttgg-3' (SEQ ID NO: 2). 2) Probe: 5'-FAM-ctccagctttgtctctgcctct-Dabcil-3 '(SEQ ID NO: 3).
キットには、以下：ＲＮＡ抽出試薬、逆転写試薬、ＲＮＡの蛍光色素（Ｒｉｂｏ−Ｇｒｅｅｎなど）、Ｔ４ ＲＮＡポリメラーゼ、リボヌクレアーゼH、トリ骨髄性白血病ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素、ＮＴＰおよびｄＮＴＰの1以上を含めてもよい。 The kit includes the following: RNA extraction reagent, reverse transcription reagent, RNA fluorescent dye (such as Ribo-Green), T4 RNA polymerase, ribonuclease H, avian myeloid leukemia virus (AMV) reverse transcriptase, one or more of NTP and dNTP May be included.
実施例２０ ＬＣＲに基づくＣＳＴ１のスプライス１の発現の検査キット
キットは、４つのプライマー：５’−ａｇｔａｔｃｔｇａｇｔａｃｃｃｔｇｃｔｇｃｔｃｃｔｇｃ−３’（配列番号３５）、５’−ａｃｃｃｔａｇｃｔｇｔｇｇｃｃｃｔｇｇｃｃｔｇｇａｇ−３’（配列番号３６）、５’−ｃａｔａｇａｃｔｃａｔｇｇｇａｃｇａｃｇ−３’（配列番号３７）、５’−ａｃａｃｃｇｇｇａｃｃｇｇａｃｃｔｃ−３’（配列番号３８）を含む。プライマーはすべて、５’末端にヘプタン標識を有する。
Example 20 Test Kit for Expression of Splice 1 of CST1 Based on LCR The kit contains four primers: 5′-agtatctgagtaccctgctgctcctgc-3 ′ (SEQ ID NO: 35), 5′-accctaggtgtgggccccggggctggag-3 ′ (SEQ ID NO: 36), 5 ′ -Catagactcatgggacgac-3 '(SEQ ID NO: 37), 5'-acaccgggaccggacctc-3' (SEQ ID NO: 38). All primers have a heptane label at the 5 'end.
キットには、以下：ＲＮＡ抽出試薬、逆転写試薬、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼおよびｄＮＴＰの1以上を含めてもよい。 The kit may include one or more of the following: RNA extraction reagent, reverse transcription reagent, T4 DNA ligase and dNTP.
実施例２１ ｔＳＤＡに基づくＣＳＴ１のスプライス１の発現の検査キット
キットは以下を含む。１）ＣＳＴ１ Ｂ１のプライマー：５’−ｔｇｇｇｔａｃａｇｃ−ｇｔｇｃｃｃｔｔｃａｃｔｔ−３’（配列番号３９）、ＣＳＴ１ Ｓ１のプライマー：５’−ｃｃｇｃｔｃｇａｇｔａｃａｇｃｇｔｇｃｃｃｔｔｃａｃｔｔｃｇｃ−３’（配列番号４０）、ＣＳＴ１ Ｂ２のプライマー：５’−ｃａａｃｇｇｔｃｔｇｔｔｇｃｃｔｇｇｃｔｃｔｔａ−３’（配列番号４１）およびＣＳＴ１ Ｓ２のプライマー：５’−ｇａｃｃｔｃｇａｇｇｔｔｇｃｃｔｇｇｃｔｃｔｔａｇｔａｃｃｃｇ−３’（配列番号４２）。２）プローブ：５’末端に３２Ｐ標識を有する５’−ｇｔｇｃｔｃｇａｇｔｃａｇｃｇａｇｔａｔａａｃａａｇｇ−ｃｃａｃｃａａａｇａｔｇａｃｔａｃ−３’（配列番号３）。
Example 21 Test Kit for Expression of Splice 1 of CST1 Based on tSDA The kit comprises: 1) CST1 B1 primer: 5'-tgggtacagc-gtgcccttcactt-3 '(SEQ ID NO: 39), CST1 S1 primer: 5'-ccgctcgagtacagcgtgccctctactcgc-3' (SEQ ID NO: 40), CST1g2tctgt 3 ′ (SEQ ID NO: 41) and CST1 S2 primer: 5′-gacctcgaggttgcctggctcttagacccg-3 ′ (SEQ ID NO: 42). 2) Probe: 5′-gtgctcgagtcagcgagtataacaagg-ccaccaaagatgactac-3 ′ (SEQ ID NO: 3) having a 32 P label at the 5 ′ end.
キットには、以下：ＲＮＡ抽出試薬、逆転写試薬、ｄＣＴＰαＳ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ＢｓｏｂＩ酵素、ｅｘｏ−Ｂｃａ酵素の1以上を含めてもよい。 The kit may include one or more of the following: RNA extraction reagent, reverse transcription reagent, dCTPαS, dATP, dGTP, dTTP, BsobI enzyme, exo-Bca enzyme.
（２）タンパク質
組換えシスタチンＳＮ、ウサギ抗シスタチンＳＮ抗体はＮＯＶＵＳ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓから購入した。マウス抗ヒトシスタチンＳＮモノクローナル抗体（配列番号５４に示した配列に対して特異的認識を行う）はＲ＆Ｄから購入した。ＴＭＢ溶液Ａおよびペルオキシダーゼ溶液Ｂを含むＴＭＢオキシダーゼ基質は、Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ＆ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．から購入した。
(2) Protein Recombinant cystatin SN and rabbit anti-cystatin SN antibody were purchased from NOVUS Biologicals. Mouse anti-human cystatin SN monoclonal antibody (which specifically recognizes the sequence shown in SEQ ID NO: 54) was purchased from R & D. TMB oxidase substrates, including TMB solution A and peroxidase solution B, are available from Kirkegaard & Perry Laboratories Inc. Purchased from.
血清調製の典型的な手順を以下の通り記載する。全血サンプルを周囲温度下２時間または４℃下一晩保存し、その後サンプルを２０分間（１０００ｇ）遠心分離する。上清を集めて検査を行うか、または−２０℃もしくは−８０℃下保存する。凍結および解凍の繰り返しは避けるべきである。血漿サンプルは以下のプロトコルにより調製する。ＥＤＴＡまたはヘパリンなどの抗凝固剤を添加した血液サンプルを１５分間（２〜８℃、１０００ｇ）遠心分離し、上清を集めて検査を行うか、または−２０℃もしくは−８０℃下保存する。凍結および解凍の繰り返しは避けるべきである。血清サンプルおよび血漿サンプルは、検査前にＰＢＳ緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．０〜７．２）を用いて１０倍希釈する。 A typical procedure for serum preparation is described as follows. Whole blood samples are stored at ambient temperature for 2 hours or overnight at 4 ° C., after which the samples are centrifuged for 20 minutes (1000 g). The supernatant is collected for testing or stored at -20 ° C or -80 ° C. Repeated freezing and thawing should be avoided. Plasma samples are prepared according to the following protocol. Blood samples supplemented with an anticoagulant such as EDTA or heparin are centrifuged for 15 minutes (2-8 ° C., 1000 g) and the supernatant is collected for testing or stored at −20 ° C. or −80 ° C. Repeated freezing and thawing should be avoided. Serum and plasma samples are diluted 10-fold with PBS buffer (0.1 M, pH 7.0-7.2) prior to testing.
実施例２２ 乳癌細胞株および健常ヒト血清におけるシスタチン発現
高発現のＣＳＴ１のｍＲＮＡを含む乳癌細胞株ＨＣＣ１９３７（レーン１〜２）およびＭＣＦ−７（レーン３〜４）と健常ヒト血清Ｓ１（レーン５〜６）およびＳ２（レーン７〜８）とをＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１５％）により解析した。タンパク質をニトロセルロース膜に転写し、コーティング溶液（５％スキムミルク粉末および０．１％ＴＷＥＥＮ−２０）とインキュベートし、その後膜をポリクローナル抗シスタチンＳＮ抗体と一晩インキュベートした。次いで膜を、０．１％ＴＷＥＥＮ−２０を含むＰＢＳで３回洗浄し、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ヤギ−抗ウサギＩｇＧ溶液と３７℃下１時間インキュベートし、０．１％ＴＷＥＥＮ−２０を含むＰＢＳで４回洗浄し、ＰＢＳで１回洗浄し、比色検出用のＴＭＢペルオキシダーゼ指示薬で処理した。β−アクチンを内部標準として使用した。図１７に示すように、１６ｋＤａのタンパク質がレーン１〜４で観察された一方、レーン５〜８ではあまり観察されなかった。シスタチンＳＮ発現は乳癌細胞において異常に高いと結論される。
Example 22 Cystatin Expression in Breast Cancer Cell Lines and Healthy Human Serum Breast cancer cell lines HCC1937 (lanes 1-2) and MCF-7 (lanes 3-4) containing highly expressed CST1 mRNA and healthy human serum S1 (lanes 5-5) 6) and S2 (lanes 7-8) were analyzed by SDS-PAGE (15%). The protein was transferred to a nitrocellulose membrane and incubated with a coating solution (5% skim milk powder and 0.1% TWEEN-20), after which the membrane was incubated overnight with a polyclonal anti-cystatin SN antibody. The membrane was then washed three times with PBS containing 0.1% TWEEN-20 and incubated with horseradish peroxidase (HRP) labeled goat-anti-rabbit IgG solution for 1 hour at 37 ° C. to give 0.1% TWEEN-20. Washed 4 times with PBS containing, washed once with PBS, and treated with TMB peroxidase indicator for colorimetric detection. β-actin was used as an internal standard. As shown in FIG. 17, a 16 kDa protein was observed in lanes 1 to 4, whereas it was not observed much in lanes 5 to 8. It is concluded that cystatin SN expression is abnormally high in breast cancer cells.
実施例２３ 乳癌患者および健常者の血清中のシスタチンＳＮ発現
健常者（レーン１〜２）および乳癌患者（レーン３〜６）の血清を、実施例２２に記載されているようにＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび免疫ブロットにより解析した。図１８に示すように、レーン３〜６に検出されたシスタチンＳＮはレーン１〜２より非常に高かったことから、シスタチンＳＮ発現は乳癌患者血清中で異常に高いことが示された。
Example 23 Cystatin SN Expression in Serum of Breast Cancer Patients and Healthy Subjects Serum from healthy subjects (lanes 1-2) and breast cancer patients (lanes 3-6) were analyzed by SDS-PAGE and as described in Example 22. Analyzed by immunoblotting. As shown in FIG. 18, cystatin SN detected in lanes 3-6 was much higher than lanes 1-2, indicating that cystatin SN expression was abnormally high in breast cancer patient serum.
実施例２４ 競合ＥＬＩＳＡにより測定された、乳癌患者および健常者の血清中のシスタチンＳＮ発現。
ＥＬＩＳＡプレートを５μｇ／ｍＬのシスタチンＳＮ溶液でコートし、３％ＢＳＡで再充填した。血清サンプルをシスタチンＳＮモノクローナル抗体と混合し（１：２０００）、混合物をプレートで１時間（３７℃）インキュベートした。ＥＬＩＳＡプレートをＴＢＳ緩衝液（１５４ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）で洗浄し、ＨＲＰ標識ヤギ−抗ウサギＩｇＧ（０．０８μｇ／ｍＬ）により３７℃下１時間インキュベートした。プレートを再びＴＢＳにより洗浄した。最後にマイクロプレートリーダーにより定量的検出のため、プレートをｏ−フェニレンジアミンで処理した。健常者由来の２０の血清サンプルおよび乳癌患者由来の３０の血清サンプルを処理した。図１９に示すように、健常血清のシスタチンＳＮ濃度の中央値は１．７ｎｇ／ｍＬである一方、乳癌患者のそれは４．１ｎｇ／ｍＬに達する。乳癌サンプルは、３．２５ｎｇ／ｍＬがカットオフ値であれば、区別可能である。
Example 24 Cystatin SN expression in the sera of breast cancer patients and healthy individuals as measured by competitive ELISA.
ELISA plates were coated with 5 μg / mL cystatin SN solution and refilled with 3% BSA. Serum samples were mixed with cystatin SN monoclonal antibody (1: 2000) and the mixture was incubated on the plate for 1 hour (37 ° C.). The ELISA plate was washed with TBS buffer (154 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 7.5) and incubated with HRP-labeled goat-anti-rabbit IgG (0.08 μg / mL) at 37 ° C. for 1 hour. The plate was washed again with TBS. Finally, the plate was treated with o-phenylenediamine for quantitative detection with a microplate reader. Twenty serum samples from healthy individuals and 30 serum samples from breast cancer patients were processed. As shown in FIG. 19, the median cystatin SN concentration of healthy serum is 1.7 ng / mL, while that of breast cancer patients reaches 4.1 ng / mL. Breast cancer samples are distinguishable if 3.25 ng / mL is the cut-off value.
実施例２５ 二重抗体サンドイッチＥＬＩＳＡにより測定された、乳癌患者および健常者の血清中のシスタチンＳＮ発現
ＥＬＩＳＡプレートを５μｇ／ｍＬのマウス−抗ヒトシスタチンＳＮモノクローナル抗体でコートし、３％ＢＳＡ溶液で再充填した。血清サンプルをプレートで１時間（３７℃）インキュベートし、ＴＢＳ緩衝液で洗浄した。このプレートでビオチン標識ウサギ−抗シスタチンＳＮポリクローナル抗体（１：１０００）をインキュベートした。プレートをＴＢＳ洗浄し、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ基質複合体を添加し、これをさらに１時間インキュベートし、ＴＢＳ緩衝液で洗浄した。プレートにＴＭＢを加え、比色シグナルをマイクロプレートリーダーにより測定した。健常者由来の２０の血清サンプルおよび乳癌患者由来の３０の血清サンプルを検査した。図２０に示すように、健常血清のシスタチンＳＮ濃度の中央値は０．５２５ｎｇ／ｍＬである一方、乳癌患者のそれは２．９９ｎｇ／ｍＬに達する。乳癌サンプルは、１．４８ｎｇ／ｍＬがカットオフ値であれば、区別可能である。
Example 25 Cystatin SN Expression in Serum of Breast Cancer Patients and Healthy Persons as Determined by Double Antibody Sandwich ELISA ELISA plates were coated with 5 μg / mL mouse-anti-human cystatin SN monoclonal antibody and re-applied with 3% BSA solution Filled. Serum samples were incubated on the plate for 1 hour (37 ° C.) and washed with TBS buffer. Biotin-labeled rabbit-anticystatin SN polyclonal antibody (1: 1000) was incubated on this plate. The plate was TBS washed and streptavidin-peroxidase substrate complex was added, which was further incubated for 1 hour and washed with TBS buffer. TMB was added to the plate and the colorimetric signal was measured with a microplate reader. Twenty serum samples from healthy individuals and 30 serum samples from breast cancer patients were examined. As shown in FIG. 20, the median cystatin SN concentration in healthy serum is 0.525 ng / mL, while that for breast cancer patients reaches 2.99 ng / mL. Breast cancer samples are distinguishable if 1.48 ng / mL is the cut-off value.
実施例２６ 乳癌マーカーとしての血清中のシスタチンＳＮとＣＥＡとの感度および特異性の比較
シスタチンＳＮ発現を実施例２５で測定したプロトコル準じて測定した。ＣＥＡは、市販されている検査キットを使用して測定した。３０の健常血清サンプルおよび乳癌患者由来の３０の血清サンプルを検査し、結果を図２１にまとめてある。シスタチンＳＮおよびＣＥＡのＡＵＣ値はそれぞれ０．９９４および０．８３３であるから、感度および特異性に関する場合、シスタチンＳＮは乳癌マーカーとしてＣＥＡより有利であることが示される。
Example 26 Comparison of Sensitivity and Specificity between Cystatin SN and CEA in Serum as a Breast Cancer Marker Cystatin SN expression was measured according to the protocol measured in Example 25. CEA was measured using a commercially available test kit. Thirty healthy serum samples and 30 serum samples from breast cancer patients were examined and the results are summarized in FIG. The AUC values for cystatin SN and CEA are 0.994 and 0.833, respectively, indicating that cystatin SN is advantageous over CEA as a breast cancer marker when it comes to sensitivity and specificity.
実施例２７ シスタチンＳＮの定量用の検査キット（競合ＥＬＩＳＡ）
１．キットの組成
以下：シスタチンＳＮ、マウス−抗ヒトシスタチンＳＮモノクローナル抗体、ＨＲＰ標識ヤギ−抗ウサギＩｇＧ、酵素基質（ｏ−フェニレンジアミン）を含めるべきである。
Example 27 Test Kit for Quantification of Cystatin SN (Competitive ELISA)
1. Kit composition The following should include: cystatin SN, mouse-anti-human cystatin SN monoclonal antibody, HRP-labeled goat-anti-rabbit IgG, enzyme substrate (o-phenylenediamine).
キットは、以下：再充填溶液（３％ＢＳＡ）、ＴＢＳ緩衝液（１５４ｍＭのＮａＣｌおよび１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）を含んでもよい。 The kit may include the following: refill solution (3% BSA), TBS buffer (154 mM NaCl and 10 mM Tris-HCl, pH 7.5).
２．ガイドライン
ＥＬＩＳＡプレートを５ｍｇ／ｍＬのシスタチンＳＮでコートする。次いでプレートを３％ＢＳＡ溶液で再充填する。血清サンプルおよび抗シスタチンＳＮモノクローナル抗体を混合し（１：２０００）、プレートで１時間（３７℃）インキュベートする。プレートをＰＢＳで洗浄し、ＨＲＰ標識ヤギ−抗ウサギＩｇＧ（０．０８μｇ／ｍＬ）を添加し、１時間インキュベート（３７℃）する。プレートに０．４ｍｇ／ｍＬのｏ−フェニレンジアミンを加えた。測定にはマイクロプレートリーダーを使用する。
2. Guidelines Coat ELISA plates with 5 mg / mL cystatin SN. The plate is then refilled with 3% BSA solution. Serum sample and anti-cystatin SN monoclonal antibody are mixed (1: 2000) and incubated on the plate for 1 hour (37 ° C.). The plate is washed with PBS, HRP-labeled goat-anti-rabbit IgG (0.08 μg / mL) is added and incubated for 1 hour (37 ° C.). 0.4 mg / mL o-phenylenediamine was added to the plate. A microplate reader is used for the measurement.
実施例２８ シスタチンＳＮの定量用の検査キット（二重抗体サンドイッチＥＬＩＳＡ）
１．キットの組成
以下：シスタチンＳＮ標準物質（１％ＢＳＡを含むＰＢＳＴを用いて一連の溶液を作製する。濃度は、たとえば１０、５、２．５、１、０．５および０．２５ｎｇ／ｍＬとする）、マウス−抗ヒトシスタチンＳＮモノクローナル抗体、ビオチン標識ウサギ−抗シスタチンＳＮポリクローナル抗体、ストレプトアビジン基質複合体、ＴＭＢペルオキシダーゼ基質を含めるべきである。
Example 28 Test Kit for Quantification of Cystatin SN (Double Antibody Sandwich ELISA)
1. Kit composition Below: Cystatin SN standard (1% BSA in PBST is used to make a series of solutions. Concentrations are eg 10, 5, 2.5, 1, 0.5 and 0.25 ng / mL Mouse-anti-human cystatin SN monoclonal antibody, biotin-labeled rabbit-anti-cystatin SN polyclonal antibody, streptavidin substrate complex, TMB peroxidase substrate.
キットは以下：コーティング溶液（０．０５ＭのＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．０）、再充填溶液（３％ＢＳＡ）、１％ＢＳＡを含むＰＢＳＴ緩衝液、ＰＢＳＴ緩衝液（０．０５％ＴＷＥＥＮ−２０を含むＰＢＳ）および停止液（２Ｎ Ｈ２ＳＯ４）を含んでもよい。 The kit includes: coating solution (0.05M NaHCO 3 , pH 9.0), refill solution (3% BSA), PBST buffer containing 1% BSA, PBST buffer (containing 0.05% TWEEN-20) PBS) and stop solution (2N H 2 SO 4 ).
２．ガイドライン
マウス−抗ヒトシスタチンＳＮモノクローナル抗体を５μｇ／ｍＬの濃度で希釈用緩衝液に溶解し、これをＥＬＩＳＡプレートに加える。プレートを４℃下一晩インキュベートする。残留液体を捨て、ＰＢＳＴ緩衝液を使用してプレートを３回、合計９分間洗浄する。プレートの穴に２００μＬの再充填溶液を加え、プレートを４℃下または３７℃下１時間インキュベートする。残留液体を捨て、ＰＢＳＴ緩衝液を使用してプレートを３回、合計９分間洗浄する。ブランク、標準物質、サンプルのサンプル穴を指定する。ブランクの穴、標準物質の穴およびサンプルの穴にそれぞれ１００μＬのＰＢＳ、シスタチンＳＮ標準物質溶液および血清／血漿サンプルを加える。プレートを２時間（３７℃）インキュベートする。残留液体を捨てる。１００μＬのビオチン標識ウサギ−抗シスタチンＳＮポリクローナル抗体溶液（ＰＢＳＴ−ＢＳＡ緩衝液で１：２００の比率に希釈）を加える。プレートを１時間（３７℃）インキュベートし、各穴の残留液体を捨てる。プレートをＰＢＳＴ緩衝液で３回（合計９分）洗浄する。各穴にストレプトアビジン基質複合体を加え、プレートを１時間（３７℃）インキュベートする。プレートを各サイクル１〜２分で５サイクル洗浄する。各穴に５０μＬのペルオキシダーゼ基質溶液を加え、プレートを暗所に入れておく。約１５分して標準物質の穴が青色のグラデーションを示したら、５０μＬの停止液を加えて反応を停止する（色が青から黄に変化する）。マイクロプレートリーダー（４０５ｎｍ）を使用してＯＤ値を検査する。標準物質のＯＤを濃度に対してプロットして検量線およびＲ２値を得る（Ｒ２が０．９５より高い場合、検量線の妥当性が確認される）。シスタチンＳＮ濃度をサンプルの穴のＯＤ値および校正式により算出する。
2. Guidelines Dissolve mouse-anti-human cystatin SN monoclonal antibody in dilution buffer at a concentration of 5 μg / mL and add it to the ELISA plate. Incubate plates overnight at 4 ° C. Discard the remaining liquid and wash the plate 3 times with PBST buffer for a total of 9 minutes. 200 μL of refill solution is added to the plate holes and the plate is incubated at 4 ° C. or 37 ° C. for 1 hour. Discard the remaining liquid and wash the plate 3 times with PBST buffer for a total of 9 minutes. Specify blanks, standards, and sample holes for samples. Add 100 μL of PBS, cystatin SN standard solution and serum / plasma sample to blank, standard and sample holes, respectively. Incubate the plate for 2 hours (37 ° C.). Discard the remaining liquid. Add 100 μL of biotinylated rabbit-anticystatin SN polyclonal antibody solution (diluted 1: 200 with PBST-BSA buffer). Incubate the plate for 1 hour (37 ° C.) and discard the remaining liquid in each well. The plate is washed 3 times with PBST buffer (9 minutes total). Streptavidin substrate complex is added to each well and the plate is incubated for 1 hour (37 ° C.). The plate is washed 5 cycles with 1-2 minutes each cycle. Add 50 μL of peroxidase substrate solution to each well and keep the plate in the dark. After about 15 minutes, when the hole of the standard substance shows a blue gradation, stop the reaction by adding 50 μL of stop solution (the color changes from blue to yellow). Examine the OD value using a microplate reader (405 nm). Plot the OD of the standard against the concentration to obtain a calibration curve and R 2 value (if R 2 is greater than 0.95, the validity of the calibration curve is confirmed). Cystatin SN concentration is calculated by OD value of sample hole and calibration formula.
実施例２９ 乳癌のｐＴＮＭ分類のためのシスタチンＳＮの利用
８０例の乳癌患者（ステージＴが２０例、ステージＮが３０例およびステージＭが３０）の血清サンプルを、実施例２８に記載したプロトコル／キットを使用して検査した。表４にまとめたように、癌発育が継続するに従いシスタチンＳＮ発現が増加する。この結果から、シスタチンＳＮのｐＴＭＮ分類への利用が示される。
Example 29 Use of Cystatin SN for pTNM Classification of Breast Cancer Serum samples from 80 breast cancer patients (20 in stage T, 30 in stage N and 30 in stage M) were treated with the protocol described in Example 28. Inspected using kit. As summarized in Table 4, cystatin SN expression increases as cancer growth continues. This result indicates the use of cystatin SN for pTMN classification.
実施例３０ シスタチンＳＮレベルによる転移の検出
乳癌患者（転移なし）由来の２０の血清サンプルおよび転移のある乳癌由来の３０の血清サンプルを実施例２８に言及したプロトコルにより検査した。表５に示すように、転移性乳癌患者由来のシスタチンＳＮレベルは、転移のない患者のそれより高いことから、シスタチンＳＮが乳癌転移のマーカーであることが証明される。
Example 30 Detection of Metastasis by Cystatin SN Levels 20 serum samples from breast cancer patients (no metastasis) and 30 serum samples from breast cancer with metastases were examined according to the protocol referred to in Example 28. As shown in Table 5, cystatin SN levels from patients with metastatic breast cancer are higher than those of patients without metastasis, demonstrating that cystatin SN is a marker for breast cancer metastasis.
実施例３１ 化学療法（ＣＴ）−内分泌療法の併用療法の効果を評価するためのシスタチンＳＮ
２８８５例の乳癌患者（Ｎ０またはＮ１）をＡＣ（ドキソルビシン＋シクロホスファミド）またはＡＴ（ドキソルビシン＋パクリタキセル）で治療した。内分泌療法は、ホルモン受容体（ＨＲ）レベルに基づき選択した。シスタチンＳＮは、実施例２８のプロトコルを用いて測定した。データ解析について７７６例の有効性が確認され、そのシスタチンＳＮ濃度の中央値は４．０６ｎｇ／ｍＬである。それから７６ヶ月にわたり無増悪生存率（ＰＦＳ：ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ−ｆｒｅｅ ｓｕｒｖｉｖａｌ）を記録した。図２２に示すように、シスタチンＳＮ発現が中央値より高い患者は２０％のＰＦＳを有する一方、残りの患者は約６０％のＰＦＳを有する。この結果から、シスタチンＳＮが本療法の有効性評価の指標となることが証明される。
Example 31 Cystatin SN for Evaluating the Effect of Chemotherapy (CT) -Endocrine Therapy Combination Therapy
2885 breast cancer patients (N0 or N1) were treated with AC (doxorubicin + cyclophosphamide) or AT (doxorubicin + paclitaxel). Endocrine therapy was selected based on hormone receptor (HR) levels. Cystatin SN was measured using the protocol of Example 28. The effectiveness of 776 cases was confirmed for data analysis, with a median cystatin SN concentration of 4.06 ng / mL. Then progression-free survival (PFS) was recorded over 76 months. As shown in FIG. 22, patients with cystatin SN expression higher than the median have 20% PFS, while the remaining patients have about 60% PFS. This result proves that cystatin SN is an index for evaluating the effectiveness of this therapy.
上記の例により極めて詳細に本発明が考察された。これらの例は、実際の実施要件に適合するように組み合わせてもよい点に留意されたい。当該分野の研究者にとって交換、改変および変更は必要かつ容易であり、したがって本発明の一部をなすものとする。 The present invention has been discussed in great detail by the above examples. Note that these examples may be combined to suit actual implementation requirements. Exchanges, modifications, and changes are necessary and easy for researchers in the field and therefore form part of the present invention.
Claims (12)
前記診断キットが、ＣＳＴ１遺伝子と、そのスプライスバリアントとに対するキャプチャーを含み、ＣＳＴ１遺伝子およびそのスプライスバリアントのキャプチャーがＣＳＴ１遺伝子またはそのｃＤＮＡを特異的に認識するプライマーまたはプローブを含み、前記ＣＳＴ１遺伝子およびそのスプライスバリアントの配列が配列番号４８に示され、ＣＳＴ１遺伝子およびそのスプライスバリアントのプライマーが、配列番号１〜２、４〜２１、３４および３９〜４２に示された配列から選択され、ＣＳＴ１遺伝子およびそのスプライスバリアントのプローブが配列番号３、３５〜３８および４３に示された配列の１つから選択される、利用方法。 The TaqMan (R) Real-Time PCR using a probe or fluorophore, or nucleic acid-based amplification (NASBA), transcription mediated amplification (TMA), the prediction of breast cancer based on the ligase chain reaction (LCR) or thermophilic strand displacement amplification (tSDA) And a method of using a diagnostic kit for diagnosis , comprising:
Said diagnostic kit, see contains the capture for the CST1 gene, and its splice variants, includes primers specifically recognizing or probes CST1 gene and capture of its splice variants CST1 gene or cDNA, the CST1 gene and its The sequence of the splice variant is shown in SEQ ID NO: 48, and the CST1 gene and its splice variant primers are selected from the sequences shown in SEQ ID NOs: 1-2, 4-21, 34 and 39-42, and the CST1 gene and its 45. A method of use wherein the splice variant probe is selected from one of the sequences set forth in SEQ ID NOs: 3, 35-38 and 43.
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