JP6132589B2 - 粒子、及び、それを有する光イメージング用造影剤 - Google Patents
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Description
本実施形態に係る粒子の一例について、図1を用いて説明する。本実施形態に係る粒子101は、シリコンナフタロシアニンまたはその誘導体102と、PLGA103とを有する。また、粒子表面に界面活性剤104を有する。界面活性剤104を用いることで、粒子101が水中で凝集しにくくなる。
本実施形態に係る粒子の他の例は図2のように、シリコンナフタロシアニンまたはその誘導体202と、PLGA203とを有する粒子201である。また、粒子201の表面に第一の界面活性剤204及び第二の界面活性剤205を有する。第一の界面活性剤204を用いることで、粒子201が水中で凝集しにくくなる。また、第二の界面活性剤205として末端にアミノ基やマレイミド基などの官能基を有する化合物を用いることで、粒子201の表面にアミド結合やマレイミド基とチオール基のカップリング反応による結合を介して抗体などのタンパク質を結合させることができる。
本実施形態に係る粒子の粒径は、10nm以上1000nm未満である。本実施形態に係る粒子の粒径が1000nm未満の場合、EPR(Enhanced Permeability and Retention)効果により、生体内の正常部位に比べて腫瘍部位により多くの粒子を集積させることができる。集積した粒子を、蛍光や光音響といった各種画像形成モダリティを用いて検出することによって、腫瘍部位を特異的にイメージングすることができる。また、粒子の粒径は500nm以下であることがより好ましく、200nm以下であることが好ましい。本実施形態に係る粒子の粒径が200nm以下であると、粒子が血中のマクロファージに取り込まれにくく、血中滞留性が高くなると考えられるからである。
本実施形態にシリコンナフタロシアニンまたはその誘導体とは、例えば化学式3で示される化合物である。
(化学式3)
また、R101、R102はそれぞれ独立に、−OH、−OR11、−OCOR12、−OSi(−R13)(−R14)(−R15)、ハロゲン原子、アセトキシ基、アミノ基、ニトロ基、シアノ基、置換または無置換の炭素数1乃至18のアルキル基、置換または無置換の芳香族基から選択される。前記炭化水素基、及び前記芳香族基の置換基はハロゲン原子、アセトキシ基、アミノ基、ニトロ基、シアノ基、炭素数1〜18のアルキル基のいずれかである。
また、R11乃至R15はそれぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、アセトキシ基、アミノ基、ニトロ基、シアノ基、置換または無置換の炭素数1乃至18のアルキル基、置換または無置換の芳香族基から選択される。前記炭化水素基、及び前記芳香族基の置換基はハロゲン原子、アセトキシ基、アミノ基、ニトロ基、シアノ基、炭素数1〜18のアルキル基のいずれかである。)
本実施形態に係る粒子で用いる乳酸とグリコール酸の共重合体(PLGA)は、粒子形状を形成するコアとなる高分子材料である。PLGAは加水分解を受けやすい性質から、不要となった際に生体内に蓄積しにくく、対外へ排出される効果が期待される。また、本実施形態におけるPLGAの平均分子量は2000以上1000000以下であることが好ましく、10000以上600000以下であることがさらに好ましく、15000以上25000以下であること特に好ましい。最も好ましくは、平均分子量20000のPLGAである。更に、PLGAの乳酸とグリコール酸との共重合比は、25:75から75:25の範囲内であることが好ましい。例えば、乳酸:グリコール酸の共重合比が25:75、50:50、または75:25のPLGAを挙げることができる。最も好ましくは、乳酸:グリコール酸の共重合比が50:50のPLGAである。本実施形態におけるPLGAを構成する乳酸は、D−体、L−体、ラセミ体のいずれのものも使用することができる。
本実施形態における界面活性剤(図1の界面活性剤104、図2の第一の界面活性剤204、第二の界面活性剤205)としては、特に限定されず、後述するように粒子を調製する過程で、エマルジョンを形成することができればいかなるものでもよい。例えば、非イオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、高分子界面活性剤又はリン脂質等を使用することができる。これらの界面活性剤は、1種類のみを用いてもよいし、2種類以上を組み合わせて用いてもよい。
(化学式4)
本実施形態における捕捉分子とは、腫瘍などの標的部位に特異的に結合する物質、標的部位の周辺に存在する物質に特異的に結合する物質などであり、生体分子や医薬品等の化学物質などから任意に選択することができる。具体的には、抗体、抗体フラグメント、酵素、生物活性ペプチド、グリコペプチド、糖鎖、脂質、分子認識化合物などが挙げられる。抗体は一本鎖抗体であることが好ましい。一本鎖抗体の具体例として、下記配列番号2で表わされる配列を有するものが挙げられる。これらの物質は単独で用いることもできるし、あるいは複数を組み合わせて用いることもできる。捕捉分子が化学結合された本実施形態に係る粒子を用いることで、標的部位の特異的な検出、標的物質の動態、局在、薬効、代謝等の追跡を行うことができる。
本実施形態に係る光イメージング用造影剤は、本実施形態に係る粒子と、この粒子が分散された分散媒とを有する。また、本実施形態に係る光イメージング用造影剤は、必要に応じて本実施形態に係る粒子の他に薬理上許容できる添加物を有していても良い。
本実施形態における粒子を得る方法としては、限定されるものではないが、例えばナノエマルジョン法を挙げることができる。ナノエマルション法による粒子の製造方法について、図3を用いて説明する。図3は図1で示す粒子101をナノエマルジョン法により製造する工程の一例示したものである。具体的には、以下の(A)から(C)の工程により粒子101の水分散液を得ることができる。
(A)シリコンナフタロシアニンまたはその誘導体102、及びPLGA103を有機溶媒に溶解させて得られる第一液体105を、界面活性剤104を溶解させた水溶液である第二液体106に加えて混合液を得る工程。
(B)(A)で得た混合液を乳化することにより水中油(以下、O/Wと略すことがある)型のエマルジョン107を得る工程。
(C)(B)で得たエマルジョン107の分散質から第一液体105に含まれる有機溶媒を留去する工程。
(D)シリコンナフタロシアニンまたはその誘導体202、及びPLGA203を有機溶媒に溶解させて得られる第一液体206を、第一の界面活性剤204と第二の界面活性剤205とを溶解させた水溶液である第二液体207に加えて混合液を得る工程。
(E)(D)で得た混合液を乳化することによりO/W型のエマルジョン208を得る工程。
(F)(E)で得たエマルジョン208の分散質から第一液体206に含まれる有機溶媒を留去する工程。
上記ナノエマルジョン法で用いる第一液体の溶媒として使用する有機溶媒としては、水への溶解性がないか又は溶解性が小さく、且つ、シリコンナフタロシアニンまたはその誘導体及びPLGAを溶解することができるものであればいかなる有機溶媒をも使用することが可能である。ただし、揮発性の有機溶媒であることが好ましい。
上記ナノエマルジョン法に用いる第二液体は、界面活性剤104または、第一の界面活性剤204及び第二の界面活性剤205を溶解した水溶液である。第二液体に界面活性剤104または、第一の界面活性剤204及び第二の界面活性剤205をあらかじめ含ませておくと、第一液体と混合した際にエマルジョンを安定化させることができる。但し、本実施形態においては第一液体と第二液体とを混合した分散液に界面活性剤104または、第一の界面活性剤204及び第二の界面活性剤205を含ませることができればよく、界面活性剤104または、第一の界面活性剤204及び第二の界面活性剤205は必ずしも第二液体に予め溶解されている必要はない。
上記ナノエマルジョン法におけるエマルジョンは、本発明の目的を達成可能であればいかなる物性のエマルジョンでもよいが、1ピークの粒径分布を有し、且つ、平均粒径が1000nm以下のエマルジョンであることが好ましい。
上記ナノエマルジョン法における留去とは、エマルジョンの分散質から第一液体に含まれる有機溶媒を除去する操作である。即ち、シリコンナフタロシアニンまたはその誘導体、PLGA、有機溶媒から構成された分散質から有機溶媒を除去することである。
本実施形態における粒子に捕捉分子を固定化する方法としては、用いる捕捉分子の種類にもよるが、いかなる公知の方法をも使用することができる。例えば、第一の界面活性剤204又は第二の界面活性剤205が有する官能基と捕捉分子の官能基とを反応させて化学結合する方法等を使用することができる。
生体内に投与された本実施形態に係る粒子を、光音響イメージング装置を用いて検出する方法について説明する。本実施形態に係る粒子を検出する方法は以下の工程を有する。但し、本実施形態に係る造影方法は、以下に示す工程以外の工程を含んでいても良い。
(a)本実施形態に係る粒子を生体内に投与する工程。
(b)生体に光を照射し、生体内に存在する本実施形態に係る粒子から発せられる音響波を検出する工程。
(c)本実施形態に係る粒子を生体内に投与する工程。
(d)生体に光を照射し、生体内に存在する本実施形態に係る粒子から発せられる蛍光を検出する工程。
以下の実施例において、粒子のモル吸光係数は以下のように測定する。まず、粒子の濃度cを求める。粒子の濃度は、ある体積の粒子溶液を凍結乾燥させることにより、粒子の重量を求め、これと粒子の平均分子量と乾燥前の溶液体積とから算出できる。続いて既知濃度の粒子溶液を幅lの吸光セルに添加する。このセルに600nm乃至1300nmの範囲から選択される少なくとも1つの波長の光を照射して、該波長における吸光度Aを求める。以下の実施例において、吸光度を測定する装置としては、UV/VIS Spectrometer Lambda Bio 40(PERKIN ELMER社製)を用いたが、一般的な紫外可視分光光度計であればいずれのものでも用いることができる。例えば、Gene Quant 1300(PERKIN ELMER社製)、RAMBDA 25(PERKIN ELMER社製)を用いることができる。
本実施形態に係る色素漏出率評価方法は、以下の各実施例で得た粒子と血清とを混合し加温し、粒子と血清の混合物を遠心分離し、遠心分離前後の混合物の上清を回収し吸光度を測定する方法である。
音響波の測定、具体的には光音響信号強度の測定は、パルスレーザー光をPBS中に分散したサンプルに照射し、サンプルから発生した光音響信号の強度を圧電素子を用いて検出し、高速プリアンプで増幅後、デジタルオシロスコープで取得した。具体的な条件は以下の通りである。光源として、チタンサファイアレーザー(LT−2211−PC、Lotis社製)を用いた。波長は700〜1000nmで可変であり、測定時はサンプルの吸収極大値付近の波長を選択した。エネルギー密度はおよそ10から20mJ/cm2、パルス幅は約20ナノ秒、パルス繰返し周波数は10Hzの条件とした。光音響信号を検出する圧電素子には、エレメント径1.27cm、中心帯域1MHzの非収束型超音波トランスデューサー(V303、Panametrics−NDT製)。測定容器としては、ポリスチレン製キュベットで、光路長0.1cm、サンプル容量は約200μLであった。水を満たしたガラス容器に前記の測定容器と圧電素子とを浸け、その間隔を2.5cmとした。光音響信号強度を増幅する高速プリアンプは増幅度+30dBの超音波プリアンプ(Model 5682、オリンパス製)を用いた。増幅された信号をデジタルオシロスコープ(DPO4104、テクトロニクス製)に入力した。前記ガラス容器の外からパルスレーザー光を前記ポリスチレン製キュベットに照射した。この際に生じる散乱光の一部をフォトダイオードで検出し、デジタルオシロスコープにトリガー信号として入力した。デジタルオシロスコープを32回平均表示モードとし、レーザーパルス照射32回平均の光音響信号強度の測定を行った。小動物へ投与したサンプルの生体内からの光音響信号の測定においても基本的に上記システムを用いた。小動物の測定の場合には、上記システムに加えて小動物の位置を保持するための加温式稼働ステージと、撮像位置を撮影するためのCCDカメラを設置した。
(粒子1(PNP1)の調製)
上記の化合物1(0.88mg、シグマアルドリッチジャパン社製)およびPLGA(5mg、乳酸:グリコール酸の組成比50:50、平均分子量20000、和光純薬工業社製)をクロロホルム1.6mLに溶解し、色素クロロホルム溶液1を調製した。
動的光散乱解析装置(大塚電子社製、DLS−8000)で分析したところ、PNP1の平均粒径は125.8nm(キュムラント解析値)であった。また、PNP1のモル吸光係数は8.1×109 M−1cm−1であり、光音響信号強度は2.3×1011 V J−1 M−1だった。
PNP1について前述の色素漏出試験を実施したところ、粒子中の色素残存率は96%であった。
(粒子2(PNP2)の調製)
Tween20の量を180mgから90mgへ変更した他は、前述したPNP1を調製した方法と同様の方法で粒子2(以下、PNP2と呼ぶ)を作製した。
動的光散乱解析装置で分析したところ、PNP2の平均粒径は173.7nm(キュムラント解析値)であった。また、PNP2のモル吸光係数は5.6×1010 M−1cm−1であり、光音響信号強度は1.7×1012 V J−1 M−1だった。PNP2について前述の色素漏出試験を実施したところ、粒子中の色素残存率は98%であった。
(粒子3(PNP3)の調製)
Tween20の量を180mgから360mgへ変更した他は、前述したPNP1を調製した方法と同様の方法で粒子3(以下、PNP3と略す)を作製した。
動的光散乱解析装置で分析したところ、PNP3の平均粒径は143.4nm(キュムラント解析値)であった。また、PNP3のモル吸光係数は2.8×1010 M−1cm−1であり、光音響信号強度は8.8×1011 V J−1 M−1だった。PNP3について前述の色素漏出試験を実施したところ、粒子中の色素残存率は99%以上であった。
(粒子4(PNP4)の調製)
化合物1の量を0.88mgから4.4mgへ変更し、且つTween20の量を180mgから90mgへ変更した他は、前述したPNP1を調製した方法と同様の方法で粒子4(以下、PNP4と略す)を作製した。
動的光散乱解析装置で分析したところ、PNP4の平均粒径は180.4nm(キュムラント解析値)であった。また、PNP4のモル吸光係数は7.7×1010 M−1cm−1であり、光音響信号強度は2.4×1012 V J−1 M−1だった。PNP4について前述の色素漏出試験を実施したところ、粒子中の色素残存率は99%であった。
(粒子5(PNP5)の合成)
化合物1の量を0.88mgから4.4mgへ変更した他は、前述したPNP1を調製した方法と同様の方法で粒子5(以下、PNP5と略す)を調製した。
動的光散乱解析装置で分析したところ、PNP5の平均粒径は162.1nm(キュムラント解析値)であった。また、PNP5のモル吸光係数は9.9×1010 M−1cm−1であり、光音響信号強度は3.0×1012 V J−1 M−1だった。PNP5について前述の色素漏出試験を実施したところ、粒子中の色素残存率は99%以上であった。
(粒子6(PNP6)の合成)
化合物1の量を0.88mgから4.4mgへ変更し、且つTween20の量を180mgから360mgへ変更した他は、前述したPNP1を調製した方法と同様の方法で粒子6(以下、PNP6と略す)を調製した。
動的光散乱解析装置で分析したところ、PNP6の平均粒径は127.5nm(キュムラント解析値)であった。また、PNP6のモル吸光係数は5.2×1010 M−1cm−1であり、光音響信号強度は1.6×1012 V J−1 M−1だった。PNP6について前述の色素漏出試験を実施したところ、粒子中の色素残存率は99%以上であった。
(粒子7(PNP7)の合成)
化合物1の量を0.88mgから17.6mgへ変更し、且つTween20の量を180mgから90mgへ変更した他は、前述したPNP1を調製した方法と同様の方法で粒子7(以下、PNP7と略す)を作製した。
動的光散乱解析装置で分析したところ、PNP7の平均粒径は137.6nm(キュムラント解析値)であった。また、PNP7のモル吸光係数は3.4×1010 M−1cm−1であり、光音響信号強度は1.2×1012 V J−1 M−1だった。PNP7について前述の色素漏出試験を実施したところ、粒子中の色素残存率は99%以上であった。
(色素含有ポリマーナノ粒子8(PNP8)の合成)
化合物1の量を0.88mgから17.6mgへ変更した他は、前述したPNP1を調製した方法と同様の方法で粒子8(以下、PNP8と略す)を作製した。
動的光散乱解析装置で分析したところ、PNP8の平均粒径は116.7nm(キュムラント解析値)であった。また、PNP8のモル吸光係数は1.0×1011 M−1cm−1であり、光音響信号強度は3.1×1012 V J−1 M−1だった。PNP8について前述の色素漏出試験を実施したところ、粒子中の色素残存率は99%以上であった。
(粒子9(PNP9)の合成)
化合物1の量を0.88mgから17.6mgへ変更し、且つTween20の量を180mgから360mgへ変更した他は、前述したPNP1を調製した方法と同様の方法で粒子9(以下、PNP9と略す)を調製した。
動的光散乱解析装置で分析したところ、PNP9の平均粒径は114.4nm(キュムラント解析値)であった。また、PNP9のモル吸光係数は6.0×1010 M−1cm−1であり、光音響信号強度は1.5×1012 V J−1 M−1だった。PNP9について前述の色素漏出試験を実施したところ、粒子中の色素残存率は99%以上であった。
(粒子10(PNP10)の合成)
上記の化合物1(4.4mg、シグマアルドリッチジャパン社製)およびPLGA(5mg、乳酸:グリコール酸の組成比50:50、平均分子量20000、和光純薬工業社製)をクロロホルム1.6mLに溶解し、色素クロロホルム溶液2を調製した。
動的光散乱解析装置で分析したところ、PNP10の平均粒径は168.5nm(キュムラント解析値)であった。また、PNP10のモル吸光係数は5.7×1010 M−1cm−1であり、光音響信号強度は2.0×1012 V J−−1M−1だった。PNP10について前述の色素漏出試験を実施したところ、粒子中の色素残存率は99%であった。
(粒子11(PNP11)の合成)
DAの量を22mgから11mgへ変更した他は、前述したPNP10と同様の方法で粒子11(以下、PNP11と略す)を調製した。
動的光散乱解析装置で分析したところ、PNP11の平均粒径は169.1nm(キュムラント解析値)であった。また、PNP11のモル吸光係数は7.8×1010 M−1cm−1であり、光音響信号強度は2.5×1012 V J−1 M−1だった。PNP11について前述の色素漏出試験を実施したところ、粒子中の色素残存率は99%以上であった。
(粒子12(PNP12)の合成)
上記の化合物1(4.4mg、シグマアルドリッチジャパン社製)および、PLGA(5mg、乳酸:グリコール酸の組成比50:50、平均分子量20000、和光純薬工業社製)をクロロホルム1.6mLに溶解し、色素クロロホルム溶液2を調製した。
動的光散乱解析装置で分析したところ、PNP12の平均粒径は97.8nm(キュムラント解析値)であった。また、PNP12のモル吸光係数は2.0×1010 M−1cm−1であり、光音響信号強度は6.1×1011 V J−1 M−1だった。PNP12について前述の色素漏出試験を実施したところ、粒子中の色素残存率は80%であった。
(粒子13(PNP13)の合成)
化合物1の量を4.4mgから8.8mgへ変更した他は、前述したPNP12と同様の方法で粒子13(以下、PNP13と略す)を調製した。
動的光散乱解析装置で分析したところ、PNP13の平均粒径は74.2nm(キュムラント解析値)であった。また、PNP13のモル吸光係数は1.2×1010 M−1cm−1であり、光音響信号強度は8.0×1011 V J−−1M−1だった。PNP13について前述の色素漏出試験を実施したところ、粒子中の色素残存率は85%であった。
(粒子14(PNP14)の合成)
化合物1の量を4.4mgから17.6mgへ変更した他は、前述したPNP12と同様の方法で粒子14(以下、PNP14と略す)を作製した。
動的光散乱解析装置で分析したところ、PNP14の平均粒径は87.8nm(キュムラント解析値)であった。また、PNP14のモル吸光係数は2.7×1010 M−1cm−1であり、光音響信号強度は1.1×1012 V J−1 M−1だった。PNP14について前述の色素漏出試験を実施したところ、粒子中の色素残存率は91%であった。
(色素含有ポリマーナノ粒子15(PNP15)の合成)
上記の化合物1(4.4mg、シグマアルドリッチジャパン社製)および、PLGA(5mg、乳酸:グリコール酸の組成比50:50、平均分子量20000、和光純薬工業社製)をクロロホルム1.6mLに溶解し、色素クロロホルム溶液2を調製した。
動的光散乱解析装置で分析したところ、PNP15の平均粒径は80.3nm(キュムラント解析値)であった。また、PNP15のモル吸光係数は1.0×1010 M−1cm−1であり、光音響信号強度は5.8×1011 V J−1 M−1だった。PNP15について前述の色素漏出試験を実施したところ、粒子中の色素残存率は74%であった。
(粒子16(PNP16)の合成)
化合物1の量を4.4mgから8.8mgへ変更した他は、前述したPNP15と同様の方法で粒子16(以下、PNP16と略す)を調製した。
動的光散乱解析装置で分析したところ、PNP16の平均粒径は94.6nm(キュムラント解析値)であった。また、PNP16のモル吸光係数は2.1×1010 M−1cm−1であり、光音響信号強度は7.5×1011 V J−1 M−1だった。PNP16について前述の色素漏出試験を実施したところ、粒子中の色素残存率は89%であった。
(粒子17(PNP17)の合成)
化合物1の量を4.4mgから17.6mgへ変更した他は、前述したPNP15と同様の方法で粒子17(以下、PNP17と略す)を作製した。
動的光散乱解析装置で分析したところ、PNP17の平均粒径は92.9nm(キュムラント解析値)であった。また、PNP17のモル吸光係数は2.7×1010 M−1cm−1であり、光音響信号強度は9.7×1011 V J−−1M−1だった。PNP17について前述の色素漏出試験を実施したところ、粒子中の色素残存率は93%であった。
(色素含有ポリマーナノ粒子18(PNP18)の合成)
上記の化合物1(4.4mg、シグマアルドリッチジャパン社製)および、PLGA(5mg、乳酸:グリコール酸の組成比50:50、平均分子量20000、和光純薬工業社製)をクロロホルム1.6mLに溶解し、色素クロロホルム溶液2を調製した。
動的光散乱解析装置で分析したところ、PNP18の平均粒径は97.1nm(キュムラント解析値)であった。また、PNP18のモル吸光係数は1.5×1010 M−1cm−1であり、光音響信号強度は5.1×1011 V J−1 M−1だった。PNP18について前述の色素漏出試験を実施したところ、粒子中の色素残存率は86%であった。
(粒子19(PNP19)の合成)
化合物1の量を4.4mgから8.8mgへ変更した他は、前述したPNP18と同様の方法で粒子19(以下、PNP19と略す)を作製した。
動的光散乱解析装置で分析したところ、PNP19の平均粒径は98.3nm(キュムラント解析値)であった。また、PNP19のモル吸光係数は2.2×1010 M−1cm−1であり、光音響信号強度は9.6×1011 V J−1 M−1だった。PNP19について前述の色素漏出試験を実施したところ、粒子中の色素残存率は89%であった。
(粒子20(PNP20)の合成)
化合物1の量を4.4mgから17.6mgへ変更した他は、前述したPNP18と同様の方法で粒子20(以下、PNP20と略す)を作製した。
動的光散乱解析装置で分析したところ、PNP20の平均粒径は105nm(キュムラント解析値)であった。また、PNP20のモル吸光係数は3.8×1010 M−1cm−1であり、光音響信号強度は1.1×1011 V J−1 M−1だった。PNP20について前述の色素漏出試験を実施したところ、粒子中の色素残存率は93%であった。
(粒子21(PNP21)の調製)
化合物2(4.4mg、シグマアルドリッチジャパン社製)および、PLGA(20mg、乳酸:グリコール酸の組成比50:50、平均分子量20000、和光純薬工業社製)をクロロホルム1.6mLに溶解し、色素クロロホルム溶液3を調製した。
動的光散乱解析装置で分析したところ、PNP21の平均粒径は161.4nm(キュムラント解析値)であった。また、PNP21のモル吸光係数は6.7×108 M−1cm−1であり、光音響信号強度は2.2×1010 V J−1 M−1だった。PNP21について前述の色素漏出試験を実施したところ、粒子中の色素残存率は97%であった。
(粒子22(PNP22)の調製)
前述の化合物1(4.4mg、シグマアルドリッチジャパン社製)および、PLGA(5mg、乳酸:グリコール酸の組成比50:50、平均分子量20000、和光純薬工業社製)をクロロホルム1.6mLに溶解し、色素クロロホルム溶液2を調製した。
動的光散乱解析装置で分析したところ、PNP22の平均粒径は106.9nm(キュムラント解析値)であった。また、PNP22のモル吸光係数は1.98×109 M−1cm−1であった。PNP22について前述の色素漏出試験を実施したところ、粒子中の色素残存率は69%であった。実施例5にて記載のPNP5と仕込み条件は同じだが、平均粒径や粒子中の色素残存率が異なる結果となった。これは、PNP5は遠心精製(20000×g)であるのに対してPNP22は限外ろ過精製であり、過剰の界面活性剤の除去が不十分であったためであると考えられる。
PNP22のPLGAのかわりに、以下の表1に示すポリマーを用いてPNPを調製した。ここで、PLAは、ポリ乳酸を、PSは、ポリスチレンをそれぞれ表す。ポリマーを変更した他は、前述したPNP22を調製した方法と同様の方法でおこなった。それぞれ粒子23〜29あるいはPNP23〜29と示す。
動的光散乱解析装置で分析したところ、PNP23〜29の平均粒径は100nm程度(キュムラント解析値)であった。また、PNP23〜29のモル吸光係数は8×108〜2×109 M−1cm−1程度であった。PNP23〜29について前述の色素漏出試験を実施したところ、粒子中の色素残存率は40〜60%程度であった。
(粒子(ICG−PNP)の調製)
インドシアニングリーン(以下、ICGと略す。4.4mg、(財)日本公定書協会製)をメタノール1mLに溶解し、PLGA(20mg、乳酸:グリコール酸の組成比50:50、平均分子量20000、和光純薬工業社製)を溶解したクロロホルム1mLと混和し、ICGメタノールクロロホルム溶液を調製した。
動的光散乱解析装置で分析したところ、ICG−PNPの平均粒径は83.4nm(キュムラント解析値)であった。また、ICG−PNPのモル吸光係数は2.8×109 M−1cm−1であり、光音響信号強度は6.8×1010 V J−1 M−1だった。ICG−PNPについて前述の色素漏出試験を実施したところ、粒子中の色素残存率は12%であった。
(粒子(PNP−PMMA1)の調製)
前述の化合物1(0.88mg、シグマアルドリッチジャパン社製)および、Poly(methyl methacrylate−co−methacrylic acid)(以下、PMMA1と略す。5mg、methyl methacrylate:methacrylic acid=1:0.016、平均分子量15000、シグマアルドリッチ社製)をクロロホルム1.6mLに溶解し、色素クロロホルム溶液4を調製した。
PNP−PMMA1と同じ方法で、以下の表2に示すポリマーを使用してPNPを作製した。ここで、表2中ではPoly(methyl methacrylate−co−butyl methacrylate)(methyl methacrylate:butyl methacrylate=85:15、平均分子量75000、シグマアルドリッチ社製)をPMMA2、Poly(methyl methacrylate), isotactic(>80%isotactic、シグマアルドリッチ社製)を、PMMA3と略して表記した。PMMA2を使用したPNPをPNP−PMMA2、PMMA3を使用したPNPをPNP−PMMA3とそれぞれ呼ぶ。
PNP−PMMA1から3と同様の方法で、Tween20水溶液にDA(11mg、日油社製)を溶解した水溶液(20mL)を用いてPNP−PMMA4から6を作製した。
動的光散乱解析装置で分析したところ、PNP−PMMA1〜6の平均粒径は120〜130nm(キュムラント解析値)であった。前述の色素漏出試験を実施したところ、粒子中の色素残存率はPNP−PMMA1が最も高く96%であったが、ポリマーとしてPLGAを使用して作製したPNP1よりも4%程度低い値となった。更に、リン脂質としてDAを添加したPNP−PMMA4〜6では、ポリマーとしてPLGAを使用して作製したPNPよりも50%程度色素残存率が低いことがわかった。以上より、PLGAをポリマーとして使用することで色素残存率がもっとも高いPNPを作製できることがわかった。
2,3−Naphthalocyanine(4.4mg、シグマアルドリッチジャパン社製)および、PLGA(20mg、乳酸:グリコール酸の組成比50:50、平均分子量20000、和光純薬工業社製)をクロロホルム1.6mLに溶解し、2,3−Naphthalocyanineクロロホルム溶液を調製した。
動的光散乱解析装置で分析したところ、PNP21の平均粒径は162.6nm(キュムラント解析値)であった。また、Nc−PNPのモル吸光係数は6.7×108 M−1cm−1であった。Nc−PNPについて前述の色素漏出試験を実施したところ、粒子中の色素残存率は93%であった。一方で、2,3−Naphthalocyanineの代わりに化合物1を用いて、Nc−PNPと同じ方法で作製した粒子では、平均粒径が166.3nm(キュムラント解析値)、モル吸光係数は1.6×1011 M−1cm−1であり、粒子中の色素残存率は92%であった。両粒子間において、色素残存率に大きな差はないものの、モル吸光係数には150倍の差があった。これは粒子中に内包された色素量の差であり、実際に化合物1を用いた粒子では系に投入したうち84%が粒子に存在するのに対し、
Nc−PNPでは、11%存在するのみであった。このことから、粒子中の色素残存率を高め、且つ高いモル吸光係数を持つ粒子を作製するためには、中心金属としてSiを有し、好ましくは中心金属のSiにアルキル鎖のような嵩高い分子が結合しているナフタロシアニン色素を使用することが有効であると考えられる。
腫瘍イメージングにおいては、雌の非近交系BALB/c Slc−nu/nuマウス(購入時6週齢)(日本エスエルシー株式会社)を用いた。マウスに担癌させる前の1週間、標準的な食餌、寝床を用い、自由に食餌および飲料水を摂取できる環境下でマウスを順応させた。イメージング実験の約2週間前に2×106個のN87ヒト胃癌細胞(ATCC#CRL−5822)を、マウスの左肩に皮下注射した。実験時までに、腫瘍は全て定着しており、マウスの体重は17〜22gであった。担癌させたマウスにPNP10のPBS溶液を、200μL(粒子として13nmol)を静脈注射した。
実施例5にて記載の方法にてPNP5を調製した。精製方法は、遠心精製(20000×g、45分間)で実施した。遠心精製の上清を回収し、72100×g、15分間の条件でさらに遠心し、沈殿した画分を回収し、PBSへ再分散させた。以降、この再分散溶液中に含まれる粒子をPNP5’と略す。
実施例23と同じ方法で担癌マウスを作製し、PNP5、またはPNP5’のPBS溶液を、200μl(粒子として13nmol)を静脈注射した。上記のPNP5、PNP5’を投与した担癌マウスは、投与後いかなる視覚的問題も無いことから、全注射が良好に耐容されたと判断した。投与24時間後にマウスを炭酸ガスで安楽死させた後、癌組織を摘出した。癌組織をプラスチックチューブに移し、癌組織の重量に対し1.25倍量の1%Triton−X100水溶液を添加し、ホモジネートした。次いで、癌組織重量の20.25倍量のテトラヒドロフラン(THF)を加えた。IVIS(登録商標)Imaging System 200 Series(XENOGEN社)を用いて、プラスチックチューブの状態で、ホモジネート溶液の蛍光強度を測定することで癌組織中の色素量を定量した。その結果を図8にまとめた。PNP5および、PNP5’の投与量に対する癌組織への移行率は、それぞれ0.11%(癌組織1gあたり)、0.29%であった。したがって、平均粒径49.3nm(キュムラント解析値)のPNP5’は、平均粒径162.1nm(キュムラント解析値)のPNP5に比べて腫瘍集積量が多いことがわかった。
実施例10で作製したPNP10をマウスの足底皮下に投与し、投与後24時間後に摘出し、ホモジネート後有機溶媒で抽出して膝下リンパ節への集積率を測定した。投与量は色素量で13nmolとした。比較例としてICG水溶液も同様に投与測定した。表3に結果を示した。ICGに比較してPNP10ではリンパ節への集積率が約80倍増加した。この結果より、本発明の粒子はリンパ節の造影用として機能できることが分かった。
PNP10をマウスの足底皮下に投与し、投与後24時間後に膝下リンパ節の光音響イメージングを行った。その結果を図9に示す。図9の(b)で確認されるリンパ節付近から強い光音響信号がかんさつされた(図9(a))。比較例として未投与のリンパ節からは、蛍光信号は確認されなかった。この結果より、本発明の粒子はリンパ節造影用の光音響用造影剤として機能できることが分かった。
(一本鎖抗体hu4D5−8scFvの調製)
HER2へ結合するIgGの可変領域の遺伝子配列(hu4D5−8)を基に、一本鎖抗体(scFv)をコードする遺伝子hu4D5−8scFvを作製した。まずhu4D5−8のVL、VH遺伝子をペプチド(GGGGS)3をコードするcDNAで連結したcDNAを作製した。5’末端には制限酵素NcoI を、3’末端には制限酵素NotIの認識サイトを導入した。以下に塩基配列を示す。
配列番号1:
5’-CCATGGATATCCAGATGACCCAGTCCCCGAGCTCCCTGTCCGCCTCTGTGGGCGATAGGGTCACCATCACCTGCCGTGCCAGTCAGGATGTGAATACTGCTGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGAAAAGCTCCGAAACTACTGATTTACTCGGCATCCTTCCTCTACTCTGGAGTCCCTTCTCGCTTCTCTGGATCCAGATCTGGGACGGATTTCACTCTGACCATCAGCAGTCTGCAGCCGGAAGACTTCGCAACTTATTACTGTCAGCAACATTATACTACTCCTCCCACGTTCGGACAGGGTACCAAGGTGGAGATCAAAGGCGGTGGTGGCAGCGGTGGCGGTGGCAGCGGCGGTGGCGGTAGCGAGGTTCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGTGGCCTGGTGCAGCCAGGGGGCTCACTCCGTTTGTCCTGTGCAGCTTCTGGCTTCAACATTAAAGACACCTATATACACTGGGTGCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCAAGGATTTATCCTACGAATGGTTATACTAGATATGCCGATAGCGTCAAGGGCCGTTTCACTATAAGCGCAGACACATCCAAAAACACAGCCTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGTGCTGAGGACACTGCCGTCTATTATTGTTCTAGATGGGGAGGGGACGGCTTCTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCGGCGGCCGC-3’
(制限酵素の認識サイトを下線で示す。)
配列番号2:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSAAALEHHHHHHGGC
前述の通り調製したscFvを5mM EDTAを含むリン酸バッファー(2.68mM KCl/137mM NaCl/1.47mM KH2PO4/1mM Na2HPO4/5mM EDTA、pH7.4)にバッファー置換後、10倍モル量のトリ(2−カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩(TCEP)によって、25℃で約2時間、還元処理した。
BCA(bicinchoninic acid、ビシンコニン酸)法を用いて、PNP10へのscFvの修飾量を算出した結果、粒子あたりに280個のscFvが修飾されていることがわかった。動的光散乱解析装置で分析したところ、scFv−PNP10の平均粒径は約400nm(キュムラント解析値)であった。
培養細胞に対するscFv−PNP10の結合能評価を行った。前日にHER2陽性細胞(N87細胞)またはHER2陰性細胞(SUIT2細胞)を48ウェルプレートに播種した(4×105 cells/well)。翌日、培地を除去し、増殖培地200μlを入れた後、scFv−PNP10を種々の濃度で100μl添加した(PNP濃度として、0.57、1.1、2.3、4.6、9.1pM)。4℃で3時間、静置した。その後、scFv−PNP10を含む培地を除去し、PBS 1mlで2回、洗浄した。PBSを除去した後、細胞を溶解させるため、Triton X−100(polyoxyethylene−p−isooctylphenol)の1%水溶液を1ウェルにつき300μl加えた。37℃で1時間以上インキュベートした。このTriton溶液をマイクロチューブに移したのち、これにTHF 200ulを添加して溶液中の色素量を蛍光測定により求めた。蛍光測定は、励起波長は730nm、蛍光波長は820nmとした。蛍光強度値とインキュベートしたscFv−PNP10濃度より、スキャッチャードプロットを作成し、N87細胞に対するscFv−PNP10の見かけの平衡解離定数(KD)を求めた結果、0.35nMであった。一方、SUIT−2細胞への結合は弱く、その結果、蛍光強度値が小さかったため、スキャッチャードプロットからKDは求められなかった。以上の結果より、scFv−PNP10は、HER2を認識してHER2陽性細胞に対して選択的に結合することが確認された。
Claims (14)
- 乳酸とグリコール酸の共重合体と、シリコンナフタロシアニンとを有する粒子であって、粒径が10nm以上1000nm未満であることを特徴とする粒子。
- 前記シリコンナフタロシアニンが、下記化学式3で表されることを特徴とする請求項1に記載の粒子。
(化学式3)
(化学式3において、R201乃至R224はそれぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、アセトキシ基、アミノ基、ニトロ基、シアノ基、置換または無置換の炭素数1乃至18のアルキル基、置換または無置換の芳香族基から選択される。前記アルキル基、及び前記芳香族基の置換基はハロゲン原子、アセトキシ基、アミノ基、ニトロ基、シアノ基、炭素数1〜18のアルキル基のいずれかである。
また、R101、R102はそれぞれ独立に、−OH、−OR11、−OCOR12、−OSi(−R13)(−R14)(−R15)、ハロゲン原子、アセトキシ基、アミノ基、ニトロ基、シアノ基、置換または無置換の炭素数1乃至18のアルキル基、置換または無置換の芳香族基から選択される。前記アルキル基、及び前記芳香族基の置換基はハロゲン原子、アセトキシ基、アミノ基、ニトロ基、シアノ基、炭素数1〜18のアルキル基のいずれかである。
また、R11乃至R15はそれぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、アセトキシ基、アミノ基、ニトロ基、シアノ基、置換または無置換の炭素数1乃至18のアルキル基、置換または無置換の芳香族基から選択される。前記アルキル基、及び前記芳香族基の置換基はハロゲン原子、アセトキシ基、アミノ基、ニトロ基、シアノ基、炭素数1〜18のアルキル基のいずれかである。) - 前記シリコンナフタロシアニンが化学式1で示される化合物、化学式2で示される化合物、シリコン2,3−ナフタロシアニンジオクチルオキシド(Silicon 2,3−naphthalocyanine dioctyloxide)、シリコン2,3−ナフタロシアニンジクロライド(Silicon 2,3−naphthalocyanine dichloride)、ビス(ジイソブチルオクタデシルシロキシ)シリコン2,3−ナフタロシアニン(Bis(di−isobutyl octadecylsiloxy)silicon 2,3−naphthalocyanine(isoBOSINC))のいずれかであることを特徴とする請求項1または2に記載の粒子。
- 前記共重合体の平均分子量が15000以上25000以下であることを特徴とする請求項1乃至3のいずれか一項に記載の粒子。
- 前記共重合体における乳酸とグリコール酸との共重合比が25:75から75:25の範囲内であることを特徴とする請求項1乃至4のいずれか一項に記載の粒子。
- 前記共重合体における乳酸とグリコール酸との共重合比が50:50であることを特徴とする請求項5に記載の粒子。
- 前記粒子の表面に1種類または2種類以上の界面活性剤を有することを特徴とする請求項1乃至6のいずれか一項に記載の粒子。
- 前記界面活性剤がポリオキシエチレンソルビタン系脂肪酸エステルとリン脂質のうち少なくともいずれか一方から選択された界面活性剤であることを特徴とする請求項7に記載の粒子。
- 前記ポリオキシエチレンソルビタン系脂肪酸エステルが下記化学式4で表されることを特徴とする請求項8に記載の粒子。
(化学式4)
化学式4において、R21乃至R24はそれぞれ独立に、−H、−OCR’から選択される。前記R’は炭素数1乃至18の、飽和または不飽和アルキル基である。wとxとyとzの総和が10乃至30の整数である。 - 前記粒子は、標的部位に特異的に結合する捕捉分子を有することを特徴とする請求項1乃至9のいずれか一項に記載の粒子。
- 前記捕捉分子が一本鎖抗体であることを特徴とする請求項10に記載の粒子。
- 前記一本鎖抗体が配列番号2で表される配列を有することを特徴とする請求項11に記載の粒子。
- 請求項1乃至12のいずれか一項に記載の粒子と、前記粒子が分散された分散媒とを有することを特徴とする光イメージング用造影剤。
- 請求項1乃至11のいずれか一項に記載の粒子と、前記粒子が分散された分散媒とを有することを特徴とする光音響イメージング用造影剤。
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