JP6110610B2 - Breeding yeast breeding method, and alcoholic beverage and sake production method using the brewing yeast - Google Patents
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Description
本発明は、醸造酵母の育種方法、該育種方法で育種された醸造酵母、並びに該醸造酵母を用いたアルコール飲料及び清酒の製造方法に関する。 The present invention relates to a method for breeding brewer's yeast, a brewer's yeast bred by the breeding method, and a method for producing an alcoholic beverage and sake using the brewer's yeast.
酒類における消費者の嗜好は、時に大きく変わるが、その嗜好に合った酒類を製造するには、様々な特徴を備える醸造酵母を育種する必要がある。消費者の嗜好に大きくかかわる酒類の要素として、例えば、香気成分や酸度が挙げられる。酒類の香気成分は、主にエステル類により構成されており、例えば清酒の吟醸香として、酵母の発酵中に生産されるカプロン酸エチルや酢酸イソアミル等が知られている。 Consumer preferences in liquors vary greatly from time to time, but in order to produce liquors that meet those preferences, it is necessary to breed brewer's yeast with various characteristics. As an element of liquor which is greatly related to consumer's preference, for example, aroma components and acidity can be mentioned. The aroma component of alcohol is mainly composed of esters. For example, as ginjo aroma of sake, ethyl caproate and isoamyl acetate produced during yeast fermentation are known.
カプロン酸エチルは、リンゴ様の華やかな香を有し、特に清酒では重要な香気成分（吟醸香）である。しかし清酒によっては、カプロン酸エチルの香りが強すぎると当該清酒全体の香のバランスが崩れたり、食事との相性が悪くなったりする場合がある。その理由として、カプロン酸エチルを高含有している当該清酒は、同じく不快臭（脂肪酸臭）の原因となるカプロン酸をも高含有している事が挙げられる。清酒は発酵後に元々カプロン酸を含有しているが、生成工程、貯蔵、輸送、保管及び販売等において、清酒に含まれているカプロン酸エチルが分解してカプロン酸含有率がより高くなることがある。従って、カプロン酸エチルを高含有する清酒は、カプロン酸の含有率を低く維持するために発酵後の品質管理をしっかり行わなければならないといったコスト的なデメリットがあった。 Ethyl caproate has an apple-like gorgeous incense and is an important aroma component (Ginjo incense) particularly in sake. However, depending on the sake, if the scent of ethyl caproate is too strong, the balance of the incense of the whole sake may be lost or compatibility with the meal may be deteriorated. The reason for this is that the sake containing a high amount of ethyl caproate also contains a high content of caproic acid, which also causes an unpleasant odor (fatty acid odor). Sake originally contains caproic acid after fermentation, but in the production process, storage, transport, storage and sales, etc., ethyl caproate contained in the sake may decompose and the caproic acid content may be higher. is there. Therefore, sake containing a high amount of ethyl caproate has a cost demerit that quality control after fermentation must be performed firmly in order to keep the caproic acid content low.
酢酸イソアミルは、バナナ様のすっきりとした香りであり吟醸香の一つである。清酒に限らず、ビールやワイン等の醸造香を高める香気成分として知られている。この酢酸イソアミルは、イソアミルアルコールとアセチルＣｏＡとからアルコールアセチルトランスフェラーゼの触媒作用により生産される。酢酸イソアミルは、その生産量を高めると、出発物質であるイソアミルアルコールの必要量も増えることになる。イソアミルアルコールは、その含量が増えると、フーゼル油臭（重たいインク様の香り）が強くなるため、酢酸イソアミル／イソアミルアルコールの含有比率（以下、Ｅ／Ａ比と称する。）が高くなる程よい香とされ、Ｅ／Ａ比は酒類の吟醸香の善し悪しを評価する一つの指標とされている。 Isoamyl acetate is a banana-like clean fragrance and one of Ginjo incense. It is known as an aroma component that enhances brewing incense such as beer and wine, not just sake. This isoamyl acetate is produced from isoamyl alcohol and acetyl CoA by the catalytic action of alcohol acetyltransferase. If the production of isoamyl acetate is increased, the required amount of isoamyl alcohol, which is the starting material, will also increase. As the content of isoamyl alcohol increases, the fusel oil odor (heavy ink-like scent) increases, so that the higher the content ratio of isoamyl acetate / isoamyl alcohol (hereinafter referred to as E / A ratio), the better the scent. The E / A ratio is regarded as one index for evaluating the quality of sake ginjo aroma.
カプロン酸エチルと酢酸イソアミルの含有量が共に多い酒類が望ましいが、上述したように、当該酒類は同時にカプロン酸の高含有の問題もあることから、必ずしも好ましい匂いだけの吟醸香の強い酒類にはならない。むしろ、カプロン酸エチルが少なく相対的にカプロン酸が少なく、さらに酢酸イソアミルが多く、Ｅ／Ａ比が高い酒類が、好ましい吟醸香のある酒となりうる。 Liquors with a high content of both ethyl caproate and isoamyl acetate are desirable, but as mentioned above, the liquor also has a problem of high caproic acid content. Don't be. Rather, liquors with a small amount of ethyl caproate and a relatively small amount of caproic acid, a large amount of isoamyl acetate, and a high E / A ratio can be a liquor with a preferred ginjo aroma.
これまで、吟醸香を高めるのに有効な変異株を育種する方法としては、吟醸香を構成する成分であるカプロン酸エチルと酢酸イソアミルの生産量を高める育種法が多く開発されている。 So far, many breeding methods for increasing the production of ethyl caproate and isoamyl acetate, which are constituents of ginjo aroma, have been developed as methods for breeding mutant strains effective for enhancing ginjo aroma.
例えば特許文献１では、セルレニン含有培地及びロイシンアナログの５’−５’−５’−トリフルオロ−Ｄ，Ｌ−ロイシン含有培地で生育可能な変異株を選択してカプロン酸エチル及び酢酸イソアミル高生産株を取得する育種法が開示されている。
For example, in
醸造酵母の変異株の育種は、これまで、特許文献１に見られるように、吟醸香が強く芳醇な酒類を製造するために行われてきた。しかし、消費者の様々な嗜好に合わせるため、吟醸香の強い酒類ばかりではなく、好ましい吟醸香の酒類の製造に適した様々な変異株を育種することが必要である。
Breeding of brewer's yeast mutant strains has so far been carried out in order to produce alcoholic beverages with strong ginjo aroma, as can be seen in
そこで本発明者らは、吟醸香の内、華やかで香の強いカプロン酸エチルの生産量に着目し、カプロン酸エチルの生産を抑えた変異株を育種、取得することを行った。得られた変異株の特徴を調べると、その全ての変異株が酢酸イソアミルを高生産し、さらにＥ／Ａ比が高い変異株であり、好ましい吟醸香の酒を製造することができることを見出して本発明を完成させた。 Accordingly, the inventors focused on the production amount of gorgeous and strong fragrant ethyl caproate among ginjo fragrances, and bred and obtained mutant strains that suppressed the production of ethyl caproate. When the characteristics of the obtained mutants were examined, it was found that all the mutants produced high isoamyl acetate and had a high E / A ratio, and were able to produce a preferred ginjoka sake. The present invention has been completed.
本発明は、上述の酒類を製造するために、カプロン酸エチルの生産を抑制して、さらに酢酸イソアミルを高生産し、Ｅ／Ａ比が高い醸造酵母の育種方法を提供することを目的とする。さらに、当該育種方法で育種された醸造酵母を用いて、好ましい吟醸香を有するアルコール飲料及び清酒の製造方法を提供することを目的とする。 An object of the present invention is to provide a method for breeding brewing yeast that suppresses the production of ethyl caproate, further produces isoamyl acetate, and has a high E / A ratio in order to produce the above-mentioned liquors. . Furthermore, it aims at providing the manufacturing method of the alcoholic beverage which has preferable ginjo incense, and sake using the brewing yeast bred by the said breeding method.
上記課題を解決するための本発明に係る醸造酵母の育種方法の特徴構成は、
セルレニン耐性であるヘテロ接合型のＦＡＳ２遺伝子を有する醸造酵母を変異処理する工程と、
変異処理を行った醸造酵母の母集団からホモ接合型のＦＡＳ２遺伝子を有するセルレニン感受性変異株を選択分離する工程と、
を有することにある。
The characteristic configuration of the method for breeding a brewing yeast according to the present invention for solving the above problems is as follows:
Mutating a brewer's yeast having a heterozygous FAS2 gene that is resistant to cerulenin;
Selectively separating a cerulenin-sensitive mutant having a homozygous FAS2 gene from the brewer's yeast population that has undergone the mutation treatment;
It is in having.
上記説明したように、これまで、カプロン酸エチルの生産性を抑制した好ましい吟醸香を有する酒類の製造に適した醸造酵母の育種に関する十分な研究は行われてこなかった。本構成の醸造酵母の育種法では、セルレニン耐性であるヘテロ接合型のＦＡＳ２遺伝子を有する醸造酵母を変異処理し、醸造酵母の母集団からホモ接合型のＦＡＳ２遺伝子を有するセルレニン感受性変異株を選択分離することから、カプロン酸エチルの生産を抑制した醸造酵母を確実に選抜することができ、さらに酢酸イソアミル高生産であり、Ｅ／Ａ比が高い変異株を取得することができる。 As described above, until now, sufficient research has not been conducted on breeding of brewing yeast suitable for the production of liquors having a preferred ginjo aroma that suppresses the productivity of ethyl caproate. In the breeding method of brewing yeast of this configuration, brewing yeast having a heterozygous FAS2 gene which is resistant to cerulenin is mutated, and a cerulenin-sensitive mutant having a homozygous FAS2 gene is selectively separated from the brewing yeast population. Therefore, it is possible to reliably select brewer's yeast that suppresses the production of ethyl caproate, and it is possible to obtain a mutant strain having a high production of isoamyl acetate and a high E / A ratio.
本発明に係る醸造酵母の育種方法において、前記醸造酵母がきょうかい１６０１号又は１８０１号であることが好ましい。 In the method for breeding brewing yeast according to the present invention, the brewing yeast is preferably No. 1601 or 1801.
有機酸の低生産性清酒酵母は、例えば、きょうかい１６０１号（以下、Ｋ−１６０１と称す）及び１８０１号（以下、Ｋ−１８０１と称す）が該当するが、有機酸の低生産性の形質を有した優良な清酒酵母が少ないのが現状である。本構成の育種方法では、育種に用いる親株としてＫ−１６０１又はＫ−１８０１を用いることから、有機酸の低生産性といった親株の形質を維持しながら、カプロン酸エチルの生産を抑制し、酢酸イソアミルが高生産であり、さらにＥ／Ａ比が高く、さらに有機酸の低生産性である優良な酵母の変異株を取得することができる。 Organic acid low-productivity sake yeast includes, for example, Kyoto No. 1601 (hereinafter referred to as “K-1601”) and No. 1801 (hereinafter referred to as “K-1801”). There are few excellent sake yeasts that have In the breeding method of this structure, since K-1601 or K-1801 is used as a parent strain used for breeding, the production of ethyl caproate is suppressed while maintaining the traits of the parent strain such as low productivity of organic acid, and isoamyl acetate is obtained. It is possible to obtain an excellent yeast mutant having a high production, a high E / A ratio, and a low productivity of organic acids.
本発明に係る醸造酵母の育種方法において、前記変異処理がＵＶ処理であることが好ましい。 In the method for breeding brewing yeast according to the present invention, the mutation treatment is preferably UV treatment.
本構成の醸造酵母の育種方法では、変異処理としてＵＶ処理を行うことから、ヘテロ接合性の消失（ＬＯＨ）を効率的に誘発させることができるため、ホモ接合型のＦＡＳ２遺伝子を有するセルレニン感受性変異株を効率的に分離することができる。 In the brewing yeast breeding method of this configuration, since UV treatment is performed as a mutation treatment, loss of heterozygosity (LOH) can be efficiently induced, so that a cerulenin-sensitive mutation having a homozygous FAS2 gene can be induced. Strains can be isolated efficiently.
上記課題を解決するための本発明に係る醸造酵母の特徴構成は、上記何れかの育種方法を用いて育種された醸造酵母である。 The characteristic configuration of the brewer's yeast according to the present invention for solving the above-mentioned problems is a brewer's yeast bred using any one of the breeding methods described above.
本構成の醸造酵母は、上記何れかの育種方法を用いて育種された醸造酵母であることから、カプロン酸エチルの生産を抑制して、さらに酢酸イソアミルを高生産し、Ｅ／Ａ比の値が高くなるように発酵することができるので、好ましい吟醸香の酒を効率的に醸造することができる。 Since the brewer's yeast of this composition is a brewer's yeast bred using any of the breeding methods described above, the production of ethyl caproate is suppressed, and isoamyl acetate is further produced at a high value. Therefore, it is possible to efficiently brew a preferred ginjo aroma sake.
上記課題を解決するための本発明に係るアルコール飲料の製造方法の特徴構成は、
上記醸造酵母を用いてアルコール飲料を製造することである。また、アルコール飲料は清酒であることが好ましい。
The characteristic structure of the method for producing an alcoholic beverage according to the present invention for solving the above problems is
An alcoholic beverage is produced using the brewer's yeast. Moreover, it is preferable that an alcoholic beverage is sake.
本構成のアルコール飲料の製造方法は、上記本構成の醸造酵母を用いることから、好ましい吟醸香を有したアルコール飲料を容易に製造することが可能であり、本構成の醸造酵母は、従来のきょうかい酵母（カプロン酸高生産）とは異なる性質から、従来のきょうかい酵母を用いて醸造した清酒とは異なる新しい清酒（本醸造、吟醸酒、大吟醸酒、純米酒、純米大吟醸など）を効率的に製造することができる。 Since the method for producing an alcoholic beverage of this configuration uses the brewery yeast of the above-mentioned configuration, it is possible to easily produce an alcoholic beverage having a preferred ginjo aroma. New sake that is different from the sake brewed using traditional Kyoto yeast due to its different properties from kai yeast (high caproic acid production) (honjozo, ginjo sake, daiginjo sake, junmai sake, junmai daiginjo, etc.) Can be efficiently manufactured.
本発明者らは、先ず親株のアルコールの生産性やアルコール耐性等の形質に与える影響を低減しながら、カプロン酸エチルの生産を抑えた変異株を育種、取得することを行った。カプロン酸エチルは、前駆体であるカプロン酸のエステル化によって生成され、カプロン酸は、脂肪合成酵素（ＦＡＳ：Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄ Ｓｙｎｔｈａｓｅ）によって生成される。抗生物質であるセルレニンは、ＦＡＳの阻害物質であり、セルレニン耐性の変異株を取得することにより、カプロン酸の量を増加させ、これに伴ってカプロン酸エチル高生産株を取得している。したがって、本発明者らは、ヘテロ接合型のＦＡＳ２遺伝子を有する醸造酵母を穏やかな条件で変異処理し、ヘテロ接合性の消失（Ｌｏｓｓ ｏｆ ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙ，以下、ＬＯＨと称する。）を誘発させ、変異処理を行った醸造酵母の母集団からセルレニン感受性を指標としてホモ接合型のＦＡＳ２遺伝子を有するカプロン酸エチルの生産を抑制させた変異株を取得した。その変異株の形質を調べたところ、予期しないことに、その全ての変異株は、酢酸イソアミル高生産であり、Ｅ／Ａ比の値が高い変異株であるという新しい知見を得た。 The present inventors first bred and obtained mutant strains that suppressed the production of ethyl caproate while reducing the influence of the parent strain on the traits such as alcohol productivity and alcohol resistance. Ethyl caproate is produced by esterification of the precursor caproic acid, and caproic acid is produced by fat synthase (FAS: Fatty Acid Synthase). Cerrenin, which is an antibiotic, is an inhibitor of FAS, and by acquiring a cerulenin-resistant mutant strain, the amount of caproic acid is increased, and accordingly, an ethyl caproate high-producing strain is obtained. Therefore, the present inventors mutated the brewing yeast having the heterozygous FAS2 gene under mild conditions to induce loss of heterozygosity (Loss of heterozygosity, hereinafter referred to as LOH), and the mutation treatment. A mutant strain in which production of ethyl caproate having a homozygous FAS2 gene was suppressed was obtained from the population of the brewing yeast that had undergone the above, using cerulenin sensitivity as an index. When the traits of the mutant strains were examined, it was unexpectedly obtained that all the mutant strains were high in isoamyl acetate production and high in E / A ratio.
本発明に係る醸造酵母の育種方法、該育種方法で育種された醸造酵母、該醸造酵母を用いたアルコール飲料（特に、清酒）の製造方法に関する実施形態について、以下に具体的に説明する。ただし、本発明は、以下に説明する実施形態や図面に記載される構成に限定されることを意図しない。 Embodiments relating to a method for breeding a brewing yeast according to the present invention, a brewing yeast bred by the breeding method, and a method for producing an alcoholic beverage (especially sake) using the brewing yeast will be specifically described below. However, the present invention is not intended to be limited to the configurations described in the embodiments and drawings described below.
ここで、本明細書中に記載される「アルコール飲料」とは、アルコール分一度以上を含む飲料を意味し、具体的には酒類を指し示し、発泡性酒類、醸造酒類、蒸留酒類及び混成酒類を含み、より具体的には、ビール、発泡酒、清酒、果実酒、その他の醸造酒、連続式蒸留焼酎、単式蒸留焼酎ウイスキー、ブランデー、原料用アルコール、スピリッツ、合成清酒、リキュール、粉末酒、雑酒を含む飲料を意味する。また、本明細書中に記載される「カプロン酸エチルの生産を抑制して、さらに酢酸イソアミルを高生産し、Ｅ／Ａ比が高い醸造酵母」とは、本発明で用いられる親株と比較してカプロン酸エチルの生産が抑制されており、さらに酢酸イソアミルを高生産し、Ｅ／Ａ比が高い醸造酵母を意味する。 Here, “alcoholic beverage” described in the present specification means a beverage containing at least one alcohol content, specifically refers to alcoholic beverages, and includes sparkling alcoholic beverages, brewed alcoholic beverages, distilled alcoholic beverages and mixed alcoholic beverages. More specifically, beer, sparkling liquor, refined sake, fruit liquor, other brewed liquor, continuous distilled shochu, single distilled shochu whiskey, brandy, alcohol for raw materials, spirits, synthetic sake, liqueur, powdered liquor, miscellaneous sake Means beverages containing alcohol. Further, “a brewing yeast that suppresses the production of ethyl caproate, further produces isoamyl acetate, and has a high E / A ratio” described in the present specification is compared with the parent strain used in the present invention. This means that the production of ethyl caproate is suppressed, brewer's yeast has a high production of isoamyl acetate and a high E / A ratio.
［醸造酵母の育種方法］
本発明に係る醸造酵母の育種方法は、ＬＯＨを誘導することにより、ヘテロ接合型のＦＡＳ２遺伝子を有するセルレニン耐性株からホモ接合型のＦＡＳ２遺伝子を有するセルレニン感受性変異株を育種する。ここで、ＬＯＨとは、二倍体細胞中の一対の相同染色体の特定の遺伝子座における対立遺伝子が異なる状態（ヘテロ接合型：例えば、正常型と変異型）の場合に、染色体の不分離や重複、体細胞分裂時に起こる遺伝子組換え、変換、欠失等により、その遺伝子座における対立遺伝子が同一の状態（ホモ接合型：正常型と正常型、又は変異型と変異型）へと変化する現象である。例えば、出芽酵母の場合、細胞１００万個乃至１万個に１個の頻度でＬＯＨが生じる。
[Breeding method of brewing yeast]
In the method for breeding brewing yeast according to the present invention, a cerulenin sensitive mutant having a homozygous FAS2 gene is bred from a cerulenin resistant strain having a heterozygous FAS2 gene by inducing LOH. Here, LOH refers to chromosomal non-segregation when alleles at specific loci of a pair of homologous chromosomes in a diploid cell are different (heterozygous type: for example, normal type and mutant type). Due to duplication, genetic recombination, conversion, deletion, etc. that occur during somatic division, alleles at the locus change to the same state (homozygous: normal and normal, or mutant and mutant) It is a phenomenon. For example, in the case of Saccharomyces cerevisiae, LOH is generated at a frequency of 1 per 1 million to 10,000 cells.
（育種に用いる親株）
本発明の醸造酵母の育種方法に用いる親株としては、セルレニン耐性を備えるヘテロ接合型のＦＡＳ２遺伝子を有するサッカロマイセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に属する酵母であればすべての酵母に利用することができる。例えば、実験室酵母や醸造酵母が挙げられるが、より醸造酵母が好ましい。また上述のセルレニン耐性を備えるヘテロ接合型のＦＡＳ２遺伝子を有する醸造酵母は公知の方法（非特許文献：Ｉｃｈｉｋａｗａ, Ｅ. ｅｔ ａｌ.： Ａｇｒｉｃ. Ｂｉｏｌ. Ｃｈｅｍ., ５５, ２１５３（１９９１）.）により、既存の醸造酵母（例えば、公益社団法人日本醸造協会から頒布されている、きょうかい酵母６号、７号、９号、１０号、１１号、１４号、６０１号、７０１号、９０１号、１００１号、１４０１号及び１５０１号、焼酎用きょうかい２号、３号、ブドウ酒用きょうかい１号、３号及び４号。各県工業総合研究センターが開発した、まほろば華酵母、吟醸２号、宮城マイ酵母、愛美酵母、泡なし宮城マイ酵母、秋田流・花酵母、秋田純米酵母、こまち酵母、秋田流・雅酵母。東京農大が開発した花酵母（ＮＤ−４、ＡＢ−２、ＮＩ−２、ＨＮＧ−５、ＣＡＲ−１、ＫＳ−３、ＳＵＮＦ−５、ＢＫ−１、ＳＮ−３、ＭＲ−４、ＧＥ−１、ＫＡＦ−２及びＳＴ−４））から容易に取得できる。また、セルレニン耐性を備えるヘテロ接合型のＦＡＳ２遺伝子を有する醸造酵母は、公益財団法人日本醸造協会より頒布されている、例えば、Ｋ−１６０１、きょうかい１７０１号、Ｋ−１８０１、きょうかい７７号、及び焼酎用きょうかい４号、また、秋田今野商店より販売されている、清酒用Ｎｏ．２４、清酒用Ｎｏ．２５、及び清酒用Ｎｏ．３５等を購入することにより取得することができる。本発明の醸造酵母の育種方法は、これら醸造酵母を親株として用いることにより、親株の形質を維持しながら、カプロン酸エチルの生産を抑制し、さらに酢酸イソアミルが高生産であり、Ｅ／Ａ比が高い優良な酵母の変異株を取得することができ、好ましい吟醸香を有したアルコール飲料を容易に製造することが可能となる。
(Parent strain used for breeding)
The parent strain used in the method for breeding a brewing yeast of the present invention can be used for all yeasts as long as they belong to Saccharomyces cerevisiae having a heterozygous FAS2 gene with cerulenin resistance. For example, laboratory yeast and brewing yeast can be mentioned, and brewing yeast is more preferable. In addition, the above-mentioned brewing yeast having a heterozygous FAS2 gene having cerulenin resistance can be obtained by a known method (Non-patent document: Ichikawa, E. et al .: Agric. Biol. Chem., 55, 2153 (1991)). , Existing brewer's yeast (for example,
また、上述の既存の醸造酵母に対して交配、細胞融合、形質転換、及び変異処理等を行うことによりセルレニン耐性株を分離することができる。醸造酵母を変異処理する方法としては、紫外線、放射線、イオンビーム、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）、又はメタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）等を用いて醸造酵母に対して適宜変異処理を行えばよいが、好ましくはＥＭＳを用いた変異処理である。これにより、醸造酵母のセルレニン耐性株を容易に選択分離することができる。使用する醸造酵母としては、醸造酵母であれば何れの酵母であってもよいが、例えば、上述の既存の醸造酵母等が挙げられる。 In addition, a cerulenin-resistant strain can be isolated by performing mating, cell fusion, transformation, mutation treatment and the like on the above-mentioned existing brewing yeast. As a method of mutation treatment of brewing yeast, ultraviolet light, radiation, ion beam, N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine (NTG), ethyl methanesulfonate (EMS), etc. are used for brewing yeast. Mutation treatment may be performed as appropriate, but mutation treatment using EMS is preferable. Thereby, the cerrenin resistant strain of brewing yeast can be easily selected and separated. The brewer's yeast to be used may be any yeast as long as it is a brewer's yeast, and examples thereof include the aforementioned existing brewer's yeast.
セルレニン耐性を備えるヘテロ接合型のＦＡＳ２遺伝子を有する醸造酵母の選抜方法の例としては、先ずセルレニン含有培地で培養を行い、セルレニン耐性株を分離する。培地は、固体培地、液体培地の何れでもよいが、好ましくは固体培地である寒天培地であり、特にＳＤ寒天培地（２％グルコース、０．６７％イーストナイトロジェンベース（アミノ酸を含まないもの）、２％寒天）が好ましい。セルレニンのＳＤ寒天培地への添加量は、０．５〜７．５μｇ／ｍｌであり、好ましくは２〜３μｇ／ｍｌであり、より好ましくは２μｇ／ｍｌである。培養条件は、例えば、２５〜３７℃、培養時間４８〜１２０時間であるが、使用する醸造酵母に応じて適宜選択される。セルレニン耐性を備える醸造酵母の多くは、ヘテロ接合型のＦＡＳ２遺伝子を有しているが、まれにホモ接合型のＦＡＳ２遺伝子を有しているため、シークエンス解析により、ヘテロ接合型であることを確認することが好ましい。ヘテロ接合型のＦＡＳ２遺伝子を有する醸造酵母からホモ接合型のＦＡＳ２遺伝子を有するセルレニン感受性変異株を取得する方法について以下に説明する。 As an example of a method for selecting a brewing yeast having a heterozygous FAS2 gene having cerulenin resistance, culturing is first carried out in a cerulenin-containing medium to isolate a cerulenin resistant strain. The medium may be either a solid medium or a liquid medium, but is preferably an agar medium that is a solid medium, especially an SD agar medium (2% glucose, 0.67% yeast nitrogen base (without amino acids), 2% agar) is preferred. The amount of cerulenin added to the SD agar medium is 0.5 to 7.5 μg / ml, preferably 2 to 3 μg / ml, more preferably 2 μg / ml. The culture conditions are, for example, 25 to 37 ° C. and a culture time of 48 to 120 hours, and are appropriately selected according to the brewing yeast to be used. Many brewing yeasts with cerulenin resistance have a heterozygous FAS2 gene, but rarely have a homozygous FAS2 gene, so it is confirmed by sequence analysis that it is heterozygous. It is preferable to do. A method for obtaining a cerulenin sensitive mutant having a homozygous FAS2 gene from a brewing yeast having a heterozygous FAS2 gene will be described below.
（セルレニン感受性変異株の取得）
清酒の中でも、本醸造、吟醸酒、大吟醸酒、純米酒、純米大吟醸などの特定名称酒においては、酸度が低いものが求められる場合もあるが、これまで清酒酵母において酸度が低い酵母は少なかった。酸度は、清酒の製造過程で酵母や麹、米から発生した乳酸・コハク酸・クエン酸・リンゴ酸等の有機酸の量を表したものである。酸度が高い場合、味に旨みと爽快感があり、酸度が低いと淡麗辛口のすっきり感がある。淡麗ですっきり感のある酒を嗜好する消費者も多く、カプロン酸エチル、酢酸イソアミルなどの吟醸香のある清酒においては、淡麗辛口の酒を製造するために酸度を低くする酵母を選択することも課題となっていた。
(Acquisition of cerulenin sensitive mutant)
Among sake, certain sakes such as Honjozo, Ginjo sake, Daiginjo sake, Junmai sake, Junmai Daiginjo may require a low acidity, but so far yeast with low acidity in sake yeast. There were few. The acidity represents the amount of organic acids such as lactic acid, succinic acid, citric acid and malic acid generated from yeast, koji, and rice during the production of sake. When the acidity is high, the taste has a taste and refreshing feeling, and when the acidity is low, the taste is refreshing and dry. Many consumers prefer refreshing and refreshing sake, and in sake with ginjo aromas such as ethyl caproate and isoamyl acetate, they select yeasts that have low acidity in order to produce crisp and dry sake. That was also an issue.
そこで、セルレニン感受性変異株の取得に使用する親株として、有機酸の低生産性のＫ−１８０１を使用した。Ｋ−１８０１は、カプロン酸エチル高生産性であるとともに有機酸の低生産性のＫ−１６０１と、常用されているきょうかい９号（以下、Ｋ−９と称す。）とから一倍体株を単離し、両者をマス−メーティング（Ｍａｓｓ−ｍａｔｉｎｇ）法により交雑したものであり、エステルを高生産し、発酵力が強いという形質を有している。 Therefore, K-1801, which is a low productivity organic acid, was used as a parent strain used for obtaining a cerulenin sensitive mutant. K-1801 is a haploid strain from K-1601 having high productivity of ethyl caproate and low productivity of organic acid, and commonly used Kyokai No. 9 (hereinafter referred to as K-9). The two are crossed by the mass-mating method and have a trait that the ester is produced at a high yield and has a strong fermenting power.
先ず、このＫ−１８０１を、ＹＰＤ培地（２％グルコース、２％ポリペプトン、１％酵母エキス）で１日間培養後、菌体を遠心分離にて集菌し、洗浄した。生存率が０．０１〜９０％、好ましくは１０〜８０％、より好ましくは５０〜６０％となるように、ＵＶ照射処理を行い、ＬＯＨを誘発させた。ＵＶ照射条件は、１×１０5〜１×１０9細胞／ｍｌ、好ましくは１×１０７細胞／ｍｌに調整した洗浄菌体の懸濁液１〜２０ｍｌ、好ましくは１２ｍｌを直径２０−２００ｍｍ、好ましくは直径８５ｍｍのシャーレに入れ、シャーレを紫外線ランプ（波長１４〜２８０ｎｍ，１５Ｗ）から１０〜６０ｃｍ、好ましくは３５ｃｍの距離に配置し、ＵＶを５〜５００秒、好ましくは１０〜２００秒、より好ましくは４５秒間照射して処理した。処理後、回収した菌体を滅菌水で洗浄後、ＹＰＤ寒天培地（ＹＰＤ培地に２％の寒天を添加）に塗布して、３０℃で培養した。ＹＰＤ寒天培地上で増殖したコロニーを、セルレニン０．５〜７．５μｇ／ｍｌ、好ましくは２〜３μｇ／ｍｌであり、より好ましくは２μｇ／ｍｌを含むＳＤ寒天培地にレプリカして、３０℃で培養した。ＹＰＤ寒天培地で増殖し、セルレニン含有ＳＤ寒天培地で増殖しなかったコロニーをセルレニン感受性変異株として釣菌して、セルレニン感受性変異株１０株（ＦＭＮ−１８Ｎｏ．１５株、ＦＭＮ−１８Ｎｏ．２５株、ＦＭＮ−１８Ｎｏ．２８株、ＦＭＮ−１８Ｎｏ．５０株、ＦＭＮ−１８Ｎｏ．６４株、ＦＭＮ−１８Ｎｏ．８０株、ＦＭＮ−１８Ｎｏ．８８株、ＦＭＮ−１８Ｎｏ．９１株、ＦＭＮ−１８Ｎｏ．９８株、ＦＭＮ−１８Ｎｏ．１１３株）を取得した。シークエンス解析を行った結果、全ての変異株がホモ接合型のＦＡＳ２遺伝子を有していることが確認された。Ｋ−１８０１からホモ接合型のＦＡＳ２遺伝子を有するセルレニン感受性変異株の取得頻度は、２．５×１０−３であった。比較対象として、ＵＶ照射を行なかった場合の取得頻度は、１０−7以下であった。このうちＦＭＮ−１８Ｎｏ．２８株（識別の表示は、ＦＭＮ−１８−２８）及びＦＭＮ−１８Ｎｏ．９８株（識別の表示は、ＦＭＮ−１８−９８）は、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１３８２及び受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１３８３として、独立行政法人製品評価技術基盤機構・特許生物寄託センター（〒２９２−０８１８日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に寄託している。ＵＶ処理によるＬＯＨ誘発は、生存率８０％以上ではＬＯＨ誘発率の向上が見られず、生存率５０−６０％ではＬＯＨ誘発率が非照射と比較して約１０4倍上昇し、生存率１％以下では最も重要な形質であるアルコールの生産性に悪影響を及ぼす変異が導入された（データ示さず）。
First, the K-1801 was cultured in a YPD medium (2% glucose, 2% polypeptone, 1% yeast extract) for 1 day, and then the cells were collected by centrifugation and washed. UV irradiation treatment was performed to induce LOH so that the survival rate was 0.01 to 90%, preferably 10 to 80%, more preferably 50 to 60%. The UV irradiation condition is 1 to 10 ml of a washed bacterial cell suspension adjusted to 1 × 10 5 to 1 × 10 9 cells / ml, preferably 1 × 10 7 cells / ml, preferably 12 ml of 20 to 200 mm in diameter, Preferably, the petri dish is placed in a petri dish having a diameter of 85 mm, and the petri dish is placed at a distance of 10 to 60 cm, preferably 35 cm from the ultraviolet lamp (
上記のように、高い生存率の穏やかな条件下で親株をＵＶ処理するだけで、ＬＯＨの頻度を上げることが可能であり、セルレニン感受性変異株を高頻度で取得することができた。ＵＶ照射による生存率は、０．０１〜９０％、好ましくは１〜８０％、より好ましくは５０〜６０％である。これにより、親株のアルコール耐性や、他の香気成分の生産等の有用な形質の変化を低減しながら、ホモ接合型のＦＡＳ２遺伝子を有するセルレニン感受性変異株を効率的に取得することができる。 As described above, the frequency of LOH can be increased only by UV treatment of the parent strain under mild conditions with a high survival rate, and a cerulenin-sensitive mutant strain could be obtained at a high frequency. The survival rate by UV irradiation is 0.01 to 90%, preferably 1 to 80%, more preferably 50 to 60%. Thus, a cerulenin-sensitive mutant having a homozygous FAS2 gene can be efficiently obtained while reducing changes in useful characters such as alcohol resistance of the parent strain and production of other aroma components.
本発明の育種方法では、ＬＯＨを誘発させる変異処理としてＵＶ処理を用いたが、使用する醸造酵母により、変異処理の方法を適宜選択可能である。変異処理としては、生存率の高い穏やかな条件下で変異処理を行えるものであればよく、ＵＶ、放射線、イオンビーム、ＮＴＧ、又はＥＭＳ等を用いた処理が挙げられるが、好ましくは、ＵＶ、放射線、又はイオンビームであり、さらに好ましくは、ＵＶである。また、ＬＯＨの出現頻度は低くなるが、自然突然変異によるＬＯＨの誘発により、ホモ接合型のＦＡＳ２遺伝子を有するセルレニン感受性変異株の取得を行ってもよい。これにより、親株の有用な形質の変化をさらに低減しながら、ホモ接合型のＦＡＳ２遺伝子を有するセルレニン感受性変異株を取得することができる。 In the breeding method of the present invention, UV treatment was used as the mutation treatment for inducing LOH. However, the mutation treatment method can be appropriately selected depending on the brewing yeast used. The mutation treatment is not particularly limited as long as mutation treatment can be performed under mild conditions with a high survival rate, and includes treatment using UV, radiation, ion beam, NTG, EMS, or the like. Radiation or an ion beam, and more preferably UV. Moreover, although the appearance frequency of LOH is reduced, a cerulenin sensitive mutant having a homozygous FAS2 gene may be obtained by induction of LOH by natural mutation. Thereby, the cerulenin sensitive mutant which has a homozygous FAS2 gene can be acquired, further reducing the change of the useful character of a parent strain.
図１は、１０株のセルレニン感受性変異株とＫ−１８０１との増殖能を比較したグラフである。各酵母の増殖能は、５ｍｌのＹＰＤ培地に各酵母の菌体濃度をＯＤ６００（吸光度６００ｎｍにおける濁度）＝０．０１となるように植菌し、バイオフォトレコーダ（アドバンテック社製、型番：ＴＶＳ０６２ＣＡ）でＯＤ６００を経時的に測定して評価した。図１に示されるように、Ｋ−１８０１を親株とするセルレニン感受性変異株の１０株の増殖能は、Ｋ−１８０１と比較して、略同等の増殖能を示した。以下、これら変異株を小仕込み試験に供し、各変異株の形質を比較した。 FIG. 1 is a graph comparing the growth ability of 10 cerulenin sensitive mutants and K-1801. The growth ability of each yeast was inoculated in 5 ml of YPD medium so that the yeast cell concentration was OD 600 (turbidity at 600 nm absorbance) = 0.01, and biophoto recorder (manufactured by Advantech, model number: OD 600 was measured over time with TVS062CA) and evaluated. As shown in FIG. 1, the growth ability of 10 strains of cerulenin sensitive mutants having K-1801 as a parent strain showed substantially the same growth ability as that of K1801. Hereinafter, these mutant strains were subjected to a small preparation test, and the characteristics of each mutant strain were compared.
［小仕込み試験］
得られたセルレニン感受性変異株の１０菌株と、親株であるＫ−１８０１とを用いて総米約２００ｇの小仕込み試験を行い、製成酒の成分について検討した。小仕込み試験の配合量としては、掛米にはα化米（精米歩合７０％）１６０ｇ、麹米には乾燥麹（精米歩合７０％）４０ｇ、汲水３６５ｍｌ、１／１０乳酸５００μｌ、及び酵母添加量５×１０９細胞で実施した。発酵温度は、１５℃の一定で行い、１７日後に上槽した。上槽液の成分の分析結果を以下の表１に示す。
[Small preparation test]
A small preparation test of about 200 g of total rice was conducted using 10 strains of the obtained cerulenin sensitive mutants and the parent strain K-1801 to examine ingredients of the sake. As for the compounding amount of the small preparation test, it is 160 g for kake rice (70% polished rice ratio), 40 g for dried rice (70% polished rice ratio), 365 ml pumped water, 500
表１の結果をみると、セルレニン感受性変異株１０株のアルコール生産量は、親株であるＫ−１８０１と略同じ値を示した。吟醸香のひとつであるカプロン酸エチルの生産量は、全ての変異株において親株より減少し、親株の生産量に対して０．２１〜０．５９倍の生産量を維持していた。また、全ての変異株は従来法であるロイシンアナログの５’−５’−５’−トリフルオロ−Ｄ，Ｌ−ロイシンの薬剤耐性を用いて選抜しなかったにもかかわらず、酢酸イソアミルの生産量は、親株より７．４〜１４．１倍と非常に高い値を示した。さらに、吟醸香の善し悪しを評価する１つの指標であるＥ／Ａ比に関しても、親株と比較して７．７倍〜１３．２倍と非常に高い値を示した。 When the result of Table 1 was seen, the alcohol production amount of 10 cerulenin sensitive mutants showed the substantially same value as K-1801 which is a parent strain. The production amount of ethyl caproate, which is one of ginjo aroma, decreased from the parent strain in all the mutant strains, and maintained the production amount 0.21 to 0.59 times the production amount of the parent strain. In addition, although all mutants were not selected using the drug resistance of 5′-5′-5′-trifluoro-D, L-leucine, a conventional leucine analog, production of isoamyl acetate The amount was 7.4 to 14.1 times higher than that of the parent strain. Furthermore, the E / A ratio, which is one index for evaluating the quality of Ginjoka, also showed a very high value of 7.7 to 13.2 times compared to the parent strain.
図２は、セルレニン感受性変異株とＫ−１８０１との発酵経過に伴う炭酸ガス減量を比較したグラフである。図２から明らかなように、Ｋ−１８０１を親株とするセルレニン感受性変異株１０株の炭酸ガス減量の経過は、親株と比較して差異は認められなかった。従って、セルレニン感受性変異株の１０株は、親株と同等の発酵力を有しており、清酒の製造に十分利用できる酵母であることが認められた。また、得られたセルレニン感受性変異株１０株のうち９株は、親株と同等の有機酸の低生産性の形質を有していた。 FIG. 2 is a graph comparing the carbon dioxide loss associated with the fermentation process between the cerulenin sensitive mutant and K-1801. As is clear from FIG. 2, no difference was observed in the course of carbon dioxide gas reduction in 10 cerulenin sensitive mutants having K-1801 as the parent strain compared to the parent strain. Therefore, it was recognized that 10 strains of cerulenin sensitive mutants have the same fermentative ability as the parent strain, and are yeasts that can be sufficiently used for the production of sake. Moreover, 9 strains among the 10 cerulenin sensitive mutants obtained had the same low productivity traits of organic acids as the parent strain.
公知の酢酸イソアミル高生産変異酵母の育種方法としては、ＥＭＳ等の変異剤で親株を変異処理後、ロイシンアナログの５’−５’−５’−トリフルオロ−Ｄ，Ｌ−ロイシン耐性株を取得する方法がこれまで知られているが、強い変異処理を行うことから親株の有用な形質を維持できない場合がある。これに対して、本発明の育種方法では、上述したように、温和な条件でＵＶ処理を行ってＬＯＨを誘発させ、Ｋ−１８０１をホモ接合型のＦＡＳ２遺伝子を有するセルレニン感受性変異株に育種していることから、Ｋ−１８０１のアルコールの生産性やアルコール耐性等の有用な形質を維持しながら、カプロン酸エチルの生産を抑制し、さらに酢酸イソアミルを高生産し、Ｅ／Ａ比の高い変異株を取得することができた。また、Ｋ−１８０１及びＫ−１６０１は、有機酸の低酸性の特徴を有していることから、ＦＭＮ−１８Ｎｏ．９８株等の有機酸の低酸性の特徴を維持した多くの変異株を取得した。つまり、本発明の育種方法を用いてＫ−１８０１やＫ−１６０１等の低酸性の醸造酵母を育種すると、酸度が低いという醸造酵母の有用な形質を維持した低酸性変異株を取得することが可能である。以下に、Ｋ−１８０１及びＫ−１６０１由来の変異株について実施した試験醸造結果を示す。 As a known breeding method for isoamyl acetate high-producing mutant yeast, a leucine analog 5′-5′-5′-trifluoro-D, L-leucine resistant strain is obtained after mutating the parent strain with a mutation agent such as EMS. Although the method of doing so is known until now, since a strong mutation process is performed, the useful character of a parent strain may not be maintained. On the other hand, in the breeding method of the present invention, as described above, UV treatment is performed under mild conditions to induce LOH, and K-1801 is bred into a cerulenin-sensitive mutant strain having a homozygous FAS2 gene. Therefore, while maintaining useful traits such as alcohol productivity and alcohol resistance of K-1801, it suppresses the production of ethyl caproate, further produces isoamyl acetate, and has a high E / A ratio. The stock was able to be acquired. Moreover, since K-1801 and K-1601 have the low acidity characteristic of organic acids, FMN-18No. Many mutant strains were maintained that maintained the low acidity characteristics of organic acids such as 98 strains. In other words, when a low-acid brewing yeast such as K1801 or K-1601 is bred using the breeding method of the present invention, a low-acid mutant strain that maintains a useful character of the brewing yeast having a low acidity can be obtained. Is possible. Below, the test brewing result implemented about the mutant strain derived from K1801 and K-1601 is shown.
［試験醸造１］
Ｋ−１８０１から得られたセルレニン感受性変異株のうち、特徴的な形質を有しているＦＭＮ−１８Ｎｏ．２８株と、カプロン酸エチル及び酢酸イソアミル以外のＫ−１８０１の形質と良く似た形質を有しているＦＭＮ−１８Ｎｏ．９８株を用いて清酒の試験醸造を行い、製成酒を成分分析に供した。試験醸造には、セルレニン感受性酵母であるＦＭＮ−１８Ｎｏ．２８株及びＦＭＮ−１８Ｎｏ．９８株と比較するために、当該菌株の親株であるＫ−１８０１と、Ｋ−１８０１の親株であるＫ−１６０１と、Ｋ−１８０１の親株であるＫ−９と同じ形質を備えているきょうかい９０１号（以下、Ｋ−９０１と称す。）と、Ｋ−１６０１の親株であるきょうかい１００１号（以下、Ｋ−１００１と称す。）及びきょうかい７０１号（以下、Ｋ−７０１と称す。）と、を用いて行った。試験醸造の配合量は、以下の表２に示すとおりである。
[Test brewing 1]
Among the cerulenin sensitive mutants obtained from K-1801, FMN-18No. 28 strains and FMN-18 No. having traits similar to those of K-1801 other than ethyl caproate and isoamyl acetate. The sake was brewed using 98 strains, and the sake was subjected to component analysis. For test brewing, FMN-18No. 28 strains and FMN-18 No. For comparison with 98 strains, K-1801, the parent strain of the strain, K-1601, the parent strain of K-1801, and K-9, the parent strain of K-1801, have the same traits. No. 901 (hereinafter referred to as K-901), Kyokai No. 1001 (hereinafter referred to as K-1001) and Kyokai No. 701 (hereinafter referred to as K-701), which are the parent strains of K-1601. And performed using. The amount of test brewing is as shown in Table 2 below.
この試験醸造では、掛米には精米歩合７０％の米を使用し、麹米には乾燥麹（精米歩合７０％）を用いた。酒母には乳酸０．１ｍｌを添加し、酵母の添加量としては、酵母密度が約１×１０７細胞／ｍｌとなるように添加した。発酵温度経過は、初添を１１℃で、中添を１０℃で、留添を９℃で行い、以降０．５℃／日ずつ昇温して、最高温度を１５℃とした。留添後、２０日目で上槽した。 In this test brewing, 70% polished rice was used for the kake rice, and dried koji (70% polished rice) was used for the polished rice. To the liquor, 0.1 ml of lactic acid was added, and the yeast was added so that the yeast density was about 1 × 10 7 cells / ml. As for the fermentation temperature, the initial addition was 11 ° C., the intermediate addition was 10 ° C., and the distillation was carried out at 9 ° C. Thereafter, the temperature was raised by 0.5 ° C./day to the maximum temperature of 15 ° C. After the distillation, the upper tank was placed on the 20th day.
［試験醸造１の製成酒の成分分析］
製成酒は、一般分析、成分分析、及び官能試験に使用した。其々の菌株を用いた製成酒の一般分析及び生産性の結果を表３に、其々の菌株の香気成分の結果を表４に、有機酸組成の結果を表５に示した。香気成分はヘッドスペース法によりガスクロマトグラフィー（島津製作所製、型番ＧＣ-２０１０）で分析し、有機酸は高速液体クロマトグラフィー（島津製作所製、型番ＬＣ-２０）で分析した。
[Ingredient analysis of
Seisei was used for general analysis, component analysis, and sensory testing. Table 3 shows the results of general analysis and productivity of the sake made using each strain, Table 4 shows the results of the aroma components of each strain, and Table 5 shows the results of the organic acid composition. The aromatic component was analyzed by gas chromatography (manufactured by Shimadzu Corp., model number GC-2010) by the headspace method, and the organic acid was analyzed by high performance liquid chromatography (manufactured by Shimadzu Corp., model number LC-20).
表３に示されるように、ＦＭＮ−１８Ｎｏ．２８株及びＦＭＮ−１８Ｎｏ．９８株の何れで仕込んだ清酒においても、アルコール濃度及び使用した白米に対する製成清酒の割合である酒化率に関しては、他のきょうかい酵母と略同等の値を示し、両菌株とも一般の醸造に用いても十分に実用性のある酵母であることが示された。酸度及び日本酒度に関しては、ＦＭＮ−１８Ｎｏ．９８株は親株であるＫ−１８０１と比較して、略同じ値を示したが、ＦＭＮ−１８Ｎｏ．２８株は、酸度に関しては何れのきょうかい酵母よりも高く、日本酒度に関しては低いという特徴を有していた。 As shown in Table 3, FMN-18 No. 28 strains and FMN-18 No. Sake prepared with any of the 98 strains showed almost the same value as other cultivated yeasts in terms of alcohol concentration and the rate of brewing sake, which is the ratio of manufactured sake to the white rice used. It was shown that the yeast was sufficiently practical even when used in the above. Regarding acidity and sake, FMN-18No. The 98 strain showed almost the same value as the parent strain K-1801. The 28 strains were characterized by higher acidity than any other yeast and low sake content.
表４に示されるように、ＦＭＮ−１８Ｎｏ．２８株及びＦＭＮ−１８Ｎｏ．９８株の何れも、カプロン酸エチルの生産量に関して、カプロン酸エチル高生産株であるＫ−１６０１及びＫ−１８０１より生産量は低くなったが、ＦＭＮ−１８Ｎｏ．２８株は他のきょうかい酵母と同等の値を示し、ＦＭＮ−１８Ｎｏ．９８株は他のきょうかい酵母よりも高い値を示した。また、酢酸イソアミルに関しては、ＦＭＮ−１８Ｎｏ．２８株及びＦＭＮ−１８Ｎｏ．９８株の何れの菌株も他のきょうかい酵母よりも高い生産量を示し、Ｅ／Ａ比に関しても高い値を示した。このように、ＦＭＮ−１８Ｎｏ．２８株及びＦＭＮ−１８Ｎｏ．９８株は、カプロン酸エチルの生産量を抑え、酢酸イソアミルの生産量を増強しており、香において、バランスの良い、変異株となっている。このことから、本発明の育種方法を用いて変異株を取得すると、カプロン酸エチルと酢酸イソアミルの生産量を変化させることができるため、様々な吟醸香を有する変異株を取得することができる。 As shown in Table 4, FMN-18 No. 28 strains and FMN-18 No. In all of 98 strains, the production amount of ethyl caproate was lower than that of K-1601 and K-1801, which are high production strains of ethyl caproate. No. 28 strain showed the same value as other yeasts, and FMN-18No. 98 strains showed higher values than other yeasts. In addition, regarding isoamyl acetate, FMN-18No. 28 strains and FMN-18 No. All strains of 98 strains showed a higher production amount than other yeasts, and also showed a high value for the E / A ratio. Thus, FMN-18No. 28 strains and FMN-18 No. The 98 strains have suppressed the production of ethyl caproate and have increased the production of isoamyl acetate, and are well-balanced mutants in the incense. From this, when a mutant strain is obtained using the breeding method of the present invention, the production amounts of ethyl caproate and isoamyl acetate can be changed, so that mutant strains having various ginjo aromas can be obtained.
表５に示されるように、ＦＭＮ−１８Ｎｏ．９８株の有機酸濃度の特徴は、有機酸の低生産性であり、親株であるＫ−１８０１とＫ−９０１の中間の値を示しており、非常にバランスのとれた清酒酵母となっている。これに対して、ＦＭＮ-１８Ｎｏ．２８株は、リンゴ酸、乳酸、酢酸等の有機酸が他のきょうかい酵母よりも高い値を示し、非常に特徴のある清酒酵母となっている。 As shown in Table 5, FMN-18 No. The characteristics of the organic acid concentration of 98 strains are low productivity of organic acids, showing intermediate values between the parent strains K-1801 and K-901, and it is a very balanced sake yeast. . On the other hand, FMN-18No. The 28 strains are highly characteristic sake yeasts, with organic acids such as malic acid, lactic acid, and acetic acid showing higher values than other yeasts.
官能試験は、４人のパネラーの評価で行った。当該パネラーの評価として、ＦＭＮ−１８Ｎｏ．９８株の清酒は、吟醸香は抑えられているが、香がよく、爽やかであるとの評価が得られ、ＦＭＮ−１８Ｎｏ．２８株の清酒は、吟醸香は抑えられているが、口中華やかであるとの評価が得られた。この結果から、ＦＭＮ−１８Ｎｏ．９８株及びＦＭＮ−１８Ｎｏ．２８株で醸造した清酒は、好ましい香（すっきりとした香）を有する清酒としての商品価値は十分あると考えられる。 The sensory test was conducted by evaluating four panelists. As an evaluation of the panel, FMN-18No. The 98 strains of sake had a reduced ginjo aroma, but were evaluated as having a good aroma and refreshing. The 28 sakes were rated as gorgeous in the mouth, although Ginjo incense was suppressed. From this result, FMN-18No. 98 strain and FMN-18 No. The sake brewed with 28 strains is considered to have a sufficient commercial value as a sake having a preferable incense (clean incense).
［試験醸造２］
本醸造酵母の育種方法を用いて取得したＫ−１６０１由来の変異株であるＦＭＮ−１６株による清酒の試験醸造を行い、製成酒を成分分析に供した。ＦＭＮ−１６株（識別の表示は、ＦＭＮ−１６−０１）は、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１３８４として 独立行政法人製品評価技術基盤機構・特許生物寄託センター（〒２９２−０８１８日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に寄託している。試験醸造には、セルレニン感受性酵母であるＦＭＮ−１６株と比較するために、当該菌株の親株であるＫ−１６０１と、Ｋ−１６０１の親株であるＫ−１００１と、を用いて行った。試験醸造の配合量は、以下の表６に示すとおりである。
[Test brewing 2]
The sake was brewed by FMN-16 strain, which is a mutant strain derived from K-1601 obtained using the breeding method of the present brewing yeast, and the produced sake was subjected to component analysis. FMN-16 strain (identification is FMN-16-01) is NITE P-1384 as an independent administrative agency, National Institute of Technology and Evaluation, Patent Biological Deposit Center (Kazusa, Kisarazu, Chiba, Japan 292-0818) It is deposited in 2-5-8). The test brewing was carried out using K-1601 which is the parent strain of the strain and K-1001 which is the parent strain of K-1601 for comparison with the FMN-16 strain which is a cerulenin sensitive yeast. The amount of test brewing is as shown in Table 6 below.
この試験醸造では、掛米には精米歩合７０％の米を使用し、麹米には乾燥麹（精米歩合７０％）を用いた。酒母には乳酸０．１ｍｌを添加し、酵母の添加量としては、酵母密度が約１×１０７細胞／ｍｌとなるように添加した。発酵温度経過は、初添を１１℃で、中添を１０℃で、留添を９℃で行い、以降１．０℃／日ずつ昇温して、最高温度を１５℃とした。留添後、２２日目で上槽した。 In this test brewing, 70% polished rice was used for the kake rice, and dried koji (70% polished rice) was used for the polished rice. To the liquor, 0.1 ml of lactic acid was added, and the yeast was added so that the yeast density was about 1 × 10 7 cells / ml. As for the fermentation temperature, the initial addition was 11 ° C., the intermediate addition was 10 ° C., the distillation was performed at 9 ° C., and thereafter the temperature was raised by 1.0 ° C./day to the maximum temperature of 15 ° C. After the distillation, the tank was placed on the 22nd day.
［試験醸造２の製成酒の成分分析］
製成酒は、一般分析、及び成分分析に使用した。其々の菌株を用いた製成酒の一般分析及び生産性の結果を表７に、其々の菌株の香気成分の結果を表８に、有機酸組成の結果を表９に示した。
[Ingredient analysis of sake brewed by Test Brewing 2]
The sake was used for general analysis and component analysis. Table 7 shows the results of general analysis and productivity of the sake brewed using each strain, Table 8 shows the results of the aroma components of each strain, and Table 9 shows the results of the organic acid composition.
表７に示されるように、ＦＭＮ−１６株で仕込んだ清酒は、酒化率に関して、他のきょうかい酵母と略同等の値を示し、ＦＭＮ−１６株は一般の醸造に用いても十分に実用性のある酵母であることが示された。ＦＭＮ−１６株は、酸度に関しても低い値に維持されていた。 As shown in Table 7, sake prepared with the FMN-16 strain showed almost the same value as the other yeast in terms of the rate of liquefaction, and the FMN-16 strain was sufficient even when used for general brewing. It was shown to be a practical yeast. The FMN-16 strain was maintained at a low value in terms of acidity.
表９に示されるように、ＦＭＮ−１６株は、カプロン酸エチルの生産量に関して、カプロン酸エチル高生産株であるＫ−１６０１より生産量は低くなり、Ｋ−１００１と略同等の値を示した。酢酸イソアミルに関しては、Ｋ−１６０１と比較して略同等の値であったが、Ｅ／Ａ比に関しては高い値を示した。このように、ＦＭＮ−１６株は、カプロン酸エチルの生産量を抑えて、Ｅ／Ａ比の値が高くなっており、香において、バランスの良い、変異株となっている。 As shown in Table 9, the FMN-16 strain had a lower production amount than K-1601, which is an ethyl caproate high-producing strain, with respect to the production amount of ethyl caproate, and showed a value almost equivalent to K-1001. It was. As for isoamyl acetate, the value was substantially the same as that of K-1601, but the E / A ratio was high. As described above, the FMN-16 strain has a high E / A ratio value by suppressing the production amount of ethyl caproate, and has a well-balanced mutant in the incense.
表９に示されるように、ＦＭＮ−１６株の有機酸濃度の特徴は、有機酸の低生産性であり、親株であるＫ−１６０１と、Ｋ−１００１との中間の値を示しており、バランスのとれた清酒酵母となっている。 As shown in Table 9, the characteristics of the organic acid concentration of the FMN-16 strain are low productivity of the organic acid, indicating an intermediate value between the parent strains K-1601 and K-1001. It is a well-balanced sake yeast.
上記結果から、本発明に係る醸造酵母の育種方法では、セルレニン耐性であるヘテロ接合型のＦＡＳ２遺伝子を有する醸造酵母から、既存の醸造酵母と同等のアルコールの生産性を維持しながら、カプロン酸エチルの生産を抑制して、さらに酢酸イソアミルを高生産し、Ｅ／Ａ比が高い変異株を育種することができるため、カプロン酸エチルと酢酸イソアミルの生産量を変化させた様々な吟醸香を有する実用的な醸造酵母を取得することが可能であることが確認された。 From the above results, in the method for breeding brewer's yeast according to the present invention, ethyl caproate is maintained from the brewer's yeast having the heterozygous FAS2 gene that is resistant to cerulenin while maintaining the same alcohol productivity as that of the existing brewer's yeast. It has a variety of ginjo aromas that vary the production amount of ethyl caproate and isoamyl acetate, because it can cultivate mutants with higher E / A ratio and higher E / A ratio. It was confirmed that it was possible to obtain a practical brewing yeast.
本発明に係る醸造酵母の育種方法、該育種方法で育種された醸造酵母、並びに該醸造酵母を用いたアルコール飲料及び清酒の製造方法は、カプロン酸エチルの生産を抑制し、さらに酢酸イソアミルの生産を高生産させ。Ｅ／Ａが高い醸造酵母の育種方法に利用でき、また、親株として有機酸低生産性酵母を用いることにより、有機酸低生産性を保持しつつカプロン酸エチルの生産を抑制し、さらに酢酸イソアミルの生産を高生産させ、Ｅ／Ａが高い醸造酵母の育種方法にも利用できる。当該育種方法により育種された醸造酵母は、アルコール飲料、清酒、焼酎、ビール、ワイン等の製造に利用することができ、特に清酒醸造において利用可能であり、本醸造、純米酒の製造に好適に利用できる。 Brewing yeast breeding method according to the present invention, brewing yeast bred by the breeding method, and alcoholic beverage and sake production method using the brewing yeast suppress production of ethyl caproate and further produce isoamyl acetate High production. It can be used in breeding methods for brewing yeast with a high E / A, and by using yeast with low productivity of organic acid as a parent strain, it suppresses the production of ethyl caproate while maintaining low productivity of organic acid, and further, isoamyl acetate Can be used in breeding methods for brewing yeast with a high E / A. The brewer's yeast bred by the breeding method can be used for the production of alcoholic beverages, sake, shochu, beer, wine, etc., and can be used particularly for sake brewing and is suitable for the production of main brewing and pure rice sake. Available.
Claims (4)
変異処理を行った醸造酵母の母集団からセルレニンで阻害される脂肪酸合成酵素（ＦＡＳ：Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄ Ｓｙｎｔｈａｓｅ）のホモ接合型のＦＡＳ２遺伝子を有するセルレニン感受性変異株を選択分離する工程と、
を有する醸造酵母の育種方法であって、
前記セルレニン感受性変異株を選択分離する工程は、セルレニン濃度を２〜３μｇ／ｍｌに調製した培地を用いて行われ、
前記醸造酵母がきょうかい１８０１号である醸造酵母の育種方法。 Mutating a brewing yeast having a heterozygous FAS2 gene that is resistant to cerulenin to eliminate the heterozygosity of the FAS2 gene while maintaining the alcohol productivity or alcohol resistance of the parent strain;
A step of selectively separating a cerulenin sensitive mutant strain having a homozygous FAS2 gene of fatty acid synthase (FAS) that is inhibited by cerulenin from a population of brewed yeast that has been subjected to the mutation treatment;
A method for breeding brewing yeast having
The step of selectively separating the cerulenin sensitive mutant is carried out using a medium prepared with a cerulenin concentration of 2-3 μg / ml,
A method for breeding brewing yeast, wherein the brewing yeast is Kyokai No. 1801 .
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