JP2022084483A - Methods for producing yeast strains having reduced 4-vinyl guaiacol productivity - Google Patents
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Abstract
Description
新規性喪失の例外適用申請有り There is an application for exception of loss of novelty
本発明は、清酒のオフフレーバーの原因となる４-ビニルグアヤコールの生成量が低下した酵母株の製造方法に関する。 The present invention relates to a method for producing a yeast strain in which the amount of 4-vinylguaiacol produced, which causes off-flavour of sake, is reduced.
清酒の原料である米はフェルラ酸を含む。多くの微生物は、フェルラ酸を脱炭酸して４-ビニルグアヤコール（以下、「４-ＶＧ」と略称する）を生成し、これを酸化してバニリンを生成する。清酒において、４-ＶＧは、煙臭、薬品臭、又は香辛料臭といったオフフレーバーの原因となる。
泡盛を長期熟成すれば、４-ＶＧが酸化されてバニリンを生成するため、４-ＶＧによるオフフレーバーが低減されると共に、バニリンの甘い香りがするものとなることが知られている（非特許文献１）。清酒の長期熟成においては、４－ＶＧからバニリンが香りに寄与するほど著量生成することは報告されていないが、醸造後の加工を行わずに４－ＶＧが低減された清酒を製造することが望まれる。
Rice, which is the raw material of sake, contains ferulic acid. Many microorganisms decarboxylate ferulic acid to produce 4-vinylguaiacol (hereinafter abbreviated as "4-VG"), which is oxidized to produce vanillin. In sake, 4-VG causes off-flavors such as smoke odor, chemical odor, or spice odor.
It is known that if awamori is aged for a long period of time, 4-VG is oxidized to produce vanillin, so that the off-flavour caused by 4-VG is reduced and the vanillin has a sweet scent (non-patented). Document 1). In the long-term aging of sake, it has not been reported that vanillin is produced in a significant amount from 4-VG to contribute to the aroma, but it is necessary to produce sake with reduced 4-VG without post-brewing processing. Is desired.
酵母では、フェルラ酸の脱炭酸により４-ＶＧを生成する反応には、フェルラ酸脱炭酸酵素遺伝子（以下、「ＦＤＣ１遺伝子」ということもある）とフェニルアクリル酸脱炭酸酵素遺伝子（以下、「ＰＡＤ１遺伝子」ということもある）が関わっており、両遺伝子が揃って機能する場合に脱炭酸反応が可能となることが知られている（非特許文献２）。
一般に清酒の醸造に用いられる清酒酵母は、ＦＤＣ１遺伝子が破壊されているためフェルラ酸脱炭酸能を有さない。一方、実験室酵母や天然から単離された酵母株の中にはフェルラ酸脱炭酸能を有するものがあり、これらを用いて製造した清酒は４-ＶＧによるオフフレーバーがある。
清酒酵母は、エタノールや好ましい香味成分を高生産するために多数の遺伝子が関与しており、その遺伝的背景は実験室酵母に比べて複雑である。従って、清酒の醸造方法の改善研究のために遺伝的背景が単純な実験室酵母を用いることが多い。また、近年は天然から単離された酵母株を用いて清酒が醸造されている。従って、実験室酵母や天然から単離された酵母株のように、フェルラ酸脱炭酸能を有する酵母のフェルラ酸脱炭酸能、即ち４-ＶＧの生成能を低減したいという要求がある。他方、ゲノム編集技術を含む遺伝子組換え技術により育種された酵母は望まれていない。
In yeast, the reaction to produce 4-VG by decarboxylation of ferulic acid includes the ferulic acid decarboxylase gene (hereinafter, also referred to as “FDC1 gene”) and the phenylacrylic acid decarboxylase gene (hereinafter, “PAD1”). (Sometimes referred to as a gene) is involved, and it is known that a decarboxylation reaction is possible when both genes function together (Non-Patent Document 2).
Sake yeast generally used for sake brewing does not have ferulic acid decarboxylation ability because the FDC1 gene is disrupted. On the other hand, some laboratory yeasts and yeast strains isolated from nature have ferulic acid decarboxylation ability, and sake produced using these has off-flavour by 4-VG.
Sake yeast involves a large number of genes for high production of ethanol and favorable flavor components, and its genetic background is more complicated than that of laboratory yeast. Therefore, laboratory yeast with a simple genetic background is often used for research to improve the brewing method of sake. In recent years, sake has been brewed using yeast strains isolated from nature. Therefore, there is a demand to reduce the ferulic acid decarboxylation ability of yeast having ferulic acid decarboxylation ability, that is, the ability to produce 4-VG, such as laboratory yeast and yeast strains isolated from nature. On the other hand, yeast bred by gene recombination technology including genome editing technology is not desired.
本発明は、４-ＶＧの生成量が低減した酵母株を、簡単かつ高効率に製造する方法を提供することを課題とする。 An object of the present invention is to provide a method for easily and highly efficiently producing a yeast strain in which the amount of 4-VG produced is reduced.
本発明者は上記課題を解決するために研究を重ね、以下の知見を得た。
(1) フェルラ酸を脱炭酸する酵素をコードする野生型遺伝子と、フェルラ酸脱炭酸能が欠損又は低下した変異型遺伝子とを、ヘテロ接合型に有する酵母の親株から、薬剤耐性を指標として、この変異型遺伝子をホモ接合型に有する株を選択すれば、親株に比べてフェルラ酸脱炭酸能が低下した株、即ち４-ＶＧの生成量が低減した株を、簡単かつ効率よく得ることができる。
(2) プロリンアナログ濃度０．０３～３０μｇ／ｍＬの条件下でプロリンアナログに耐性を示すか、又はケイ皮酸アナログ濃度０．０３～１０ｍＭの条件下でケイ皮酸アナログに耐性を示すことを指標とするのが好適である。
(3) ケイ皮酸アナログに感受性になったことを指標とするのも好適である。
The present inventor has repeated research to solve the above problems and obtained the following findings.
(1) Using a drug resistance as an index from a parent strain of yeast having a heterozygous type of a wild-type gene encoding an enzyme that decarboxylates ferulic acid and a mutant gene in which the decarboxylation ability of ferulic acid is deficient or decreased. By selecting a strain having this mutant gene in a homozygous form, it is possible to easily and efficiently obtain a strain having a lower ferric acid decarboxylation ability than the parent strain, that is, a strain having a reduced amount of 4-VG produced. can.
(2) To be resistant to proline analog under the condition of proline analog concentration of 0.03 to 30 μg / mL, or to be resistant to cinnamic acid analog under the condition of cinnamic acid analog concentration of 0.03 to 10 mM. It is preferable to use it as an index.
(3) It is also preferable to use the susceptibility to cinnamic acid analog as an index.
本発明は、上記知見に基づき完成されたものであり、下記〔１〕～〔６〕を提供する。
〔１〕 フェルラ酸を脱炭酸する酵素をコードする野生型遺伝子と、フェルラ酸脱炭酸能が欠損又は低下した変異型のフェルラ酸を脱炭酸する酵素をコードする変異型遺伝子とを、ヘテロ接合型に有する酵母の親株から、薬剤耐性を指標として、この変異型遺伝子をホモ接合型に有する株を選択する工程を含む、４-ビニルグアイヤコール低生産酵母株の製造方法。
〔２〕 フェルラ酸を脱炭酸する酵素をコードする遺伝子が、フェルラ酸脱炭酸酵素遺伝子、及び／又はフェニルアクリル酸脱炭酸酵素遺伝子である、〔１〕に記載の製造方法。
〔３〕 プロリンアナログの濃度０．０３～３０μｇ／ｍＬの条件下でプロリンアナログに耐性を示すことを指標にする、及び／又はケイ皮酸アナログの濃度０．０３～１０ｍＭの条件下でケイ皮酸アナログに耐性を示すことを指標に、上記変異型遺伝子をホモ接合型に有する株を選択する、〔１〕又は〔２〕に記載の製造方法。
〔４〕 下記（１）～（３）の何れかを指標に、上記変異型遺伝子をホモ接合型に有する株を選択する、〔１〕又は〔２〕に記載の製造方法。
（１） 親株としてケイ皮酸アナログの濃度０．１ｍＭ以上の条件下でケイ皮酸アナログに耐性を示す株を用い、そのケイ皮酸アナログの濃度０．０５ｍＭ以下の条件下で増殖すること
（２） 親株としてケイ皮酸アナログの濃度０．５ｍＭ以上の条件下でケイ皮酸アナログに耐性を示す株を用い、そのケイ皮酸アナログの濃度０．４ｍＭ、０．２ｍＭ、又は０．０５ｍＭ以下の条件下で増殖すること
（３） 親株としてケイ皮酸アナログの濃度０．６ｍＭ又は０．８ｍＭ以上の条件下でケイ皮酸アナログに耐性を示す株を用い、そのケイ皮酸アナログの濃度０．５ｍＭ、０．４ｍＭ、０．２ｍＭ、又は０．０５ｍＭ以下の条件下で増殖すること
〔５〕 〔１〕～〔４〕の何れかの方法で製造された４-ビニルグアイヤコール低生産酵母株を用いて、醸造により清酒を製造する方法。
〔６〕 ４-ビニルグアイヤコール濃度が５００ｐｐｂ以下であり、バニリン濃度が０．７ｐｐｍ以上である容器詰め清酒。
The present invention has been completed based on the above findings, and provides the following [1] to [6].
[1] A heterozygous gene comprising a wild-type gene encoding an enzyme that decarboxylates ferulic acid and a mutant gene encoding an enzyme that decarboxylates a mutant ferulic acid having a deficient or decreased ferulic acid decarboxylation ability. A method for producing a 4-vinylguaiyacol low-producing yeast strain, which comprises a step of selecting a strain having this mutant gene homozygously from the parent strain of the yeast possessed in the above, using drug resistance as an index.
[2] The production method according to [1], wherein the gene encoding the enzyme that decarboxylates ferulic acid is a ferulic acid decarboxylase gene and / or a phenylacrylic acid decarboxylase gene.
[3] Using the resistance to proline analog as an index under the condition of proline analog concentration of 0.03 to 30 μg / mL, and / or the caustic skin under the condition of silicate analog concentration of 0.03 to 10 mM. The production method according to [1] or [2], wherein a strain having the above-mentioned mutant gene in a homozygous form is selected using the resistance to an acid analog as an index.
[4] The production method according to [1] or [2], wherein a strain having the above mutant gene homozygously is selected using any of the following (1) to (3) as an index.
(1) As a parent strain, a strain exhibiting resistance to cinnamic acid analog under the condition of cinnamic acid analog concentration of 0.1 mM or more is used, and the strain is grown under the condition of the cinnamic acid analog concentration of 0.05 mM or less (1). 2) As the parent strain, a strain exhibiting resistance to cinnamic acid analog under the condition of cinnamic acid analog concentration of 0.5 mM or more is used, and the cinnamic acid analog concentration is 0.4 mM, 0.2 mM, or 0.05 mM or less. (3) As a parent strain, a strain exhibiting resistance to cinnamic acid analog under the conditions of 0.6 mM or 0.8 mM or more of cinnamic acid analog is used, and the concentration of cinnamic acid analog is 0. Proliferate under conditions of .5 mM, 0.4 mM, 0.2 mM, or 0.05 mM or less [5] Low production of 4-vinylguaiyacol produced by any of the methods [1] to [4]. A method of producing sake by brewing using a yeast strain.
[6] 4-Packaged sake having a vinyl guayancol concentration of 500 ppb or less and a vanillin concentration of 0.7 ppm or more.
前述した通り、フェルラ酸の脱炭酸により４-ＶＧを生成する反応は、ＦＤＣ１遺伝子とＰＡＤ１遺伝子が機能する場合に可能となる。ＦＤＣ１遺伝子及びＰＡＤ１遺伝子は野生型遺伝子が優性であるため、野生型遺伝子と変異型遺伝子をヘテロ接合型に有する酵母株は４－ＶＧを生成する。従って、オフフレーバーの原因となる４－ＶＧの生成が少ない酵母株を得るためには、変異型ＰＡＤ１遺伝子及び／又は変異型ＦＤＣ１遺伝子をホモ接合型に有する酵母株を選択する必要がある。
本発明方法によれば、薬剤耐性を指標とすることで、手間のかかる網羅的な選抜等を行うことなく、簡単かつ効率よく、４-ＶＧの生成が低減した酵母株を得ることができる。これにより、実験室酵母や自然界から単離した酵母株であって４-ＶＧの生成が低減した株を簡単かつ効率よく得ることができ、新たな清酒などの開発に寄与することができる。また、本発明方法により得られる酵母株は、遺伝子組換え技術により得たものではないため、遺伝子組み換え食品を避ける消費者の指向に合致している。
As mentioned above, the reaction to produce 4-VG by decarboxylation of ferulic acid is possible when the FDC1 gene and the PAD1 gene function. Since the FDC1 gene and the PAD1 gene are dominant in the wild-type gene, a yeast strain having a wild-type gene and a mutant gene in a heterozygous manner produces 4-VG. Therefore, in order to obtain a yeast strain that produces less 4-VG that causes off-flavour, it is necessary to select a yeast strain that has the mutant PAD1 gene and / or the mutant FDC1 gene in a homozygous manner.
According to the method of the present invention, by using drug resistance as an index, it is possible to easily and efficiently obtain a yeast strain in which the production of 4-VG is reduced without performing time-consuming and comprehensive selection. As a result, it is possible to easily and efficiently obtain a strain of yeast isolated from laboratory yeast or yeast with reduced 4-VG production, which can contribute to the development of new sake and the like. Moreover, since the yeast strain obtained by the method of the present invention is not obtained by the genetically modified technique, it is in line with the consumer's tendency to avoid genetically modified foods.
以下、本発明を詳細に説明する。
（１）４-ＶＧ低生産酵母株の製造方法
本発明の４-ＶＧ低生産酵母株の製造方法は、フェルラ酸を脱炭酸する酵素をコードする野生型遺伝子と、フェルラ酸脱炭酸能が欠損又は低下した変異型のフェルラ酸を脱炭酸する酵素をコードする変異型遺伝子とを、ヘテロ接合型に有する酵母の親株から、薬剤耐性を指標として、この変異型遺伝子をホモ接合型に有する株を選択する工程を含む方法である。
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
(1) Method for producing 4-VG low-producing yeast strain
The method for producing a 4-VG low-producing yeast strain of the present invention comprises a wild-type gene encoding an enzyme that decarboxylates ferulic acid and an enzyme that decarboxylates a mutant ferulic acid lacking or reduced in ferulic acid decarboxylation ability. It is a method including a step of selecting a strain having this mutant gene in a homozygous form from a parent strain of yeast having the mutant gene encoding the above in a heterozygous form, using drug resistance as an index.
酵母の親株
フェルラ酸を脱炭酸する酵素をコードする遺伝子としては、フェルラ酸脱炭酸酵素遺伝子（ＦＤＣ１遺伝子）、フェニルアクリル酸脱炭酸酵素遺伝子（ＰＡＤ１遺伝子）が挙げられる。フェルラ酸の脱炭酸には両遺伝子が機能する必要があるため、本発明方法では、ＦＤＣ１遺伝子、ＰＡＤ１遺伝子の何れか一方又は両方が変異型遺伝子のホモ接合型になった株を選択すればよい。従って、親株としては、ＦＤＣ１遺伝子、ＰＡＤ１遺伝子の何れか一方又は両方が、野生型遺伝子と変異型遺伝子のヘテロ接合型に有する株を用いればよい。
このような株は、主に醸造用の酵母として日本醸造協会、各都道府県の試験場から頒布されている酵母、あるいは様々な酵母をリソースとして提供するＡＴＣＣ（American Type Culture Collection）、ＮＢＲＣ（NITE Biological Resource. Center）、理化学研究所バイオリソースセンターなど、各国あるいは各運営団体が提供されているものを使用できる。またこれらの機関が提供している、ＦＤＣ１遺伝子及び／またはＰＡＤ１遺伝子を欠損したことが知られている酵母株と、これらが欠損していない酵母株とを交配して、野生型遺伝子と変異型遺伝子のヘテロ接合型の酵母株を育種して親株として用いてよい。例えば、日本醸造協会から頒布されるきょうかい酵母（好ましくはきょうかい酵母1001号）と、Saccharomyces cerevisiae S288C（NBRC1136）のような実験室酵母株（好ましくは実験室株D458-5A（ATCC90753））とをかけ合わせればよい。
Examples of the gene encoding the enzyme that decarbonates the parent strain ferulic acid of yeast include ferulic acid decarboxylase gene (FDC1 gene) and phenylacrylic acid decarboxylase gene (PAD1 gene). Since both genes need to function for decarboxylation of ferulic acid, in the method of the present invention, a strain in which either one or both of the FDC1 gene and the PAD1 gene are homozygous for the mutant gene may be selected. .. Therefore, as the parent strain, a strain having either one or both of the FDC1 gene and the PAD1 gene in a heterozygous form of a wild-type gene and a mutant gene may be used.
Such strains are mainly yeasts for brewing, yeasts distributed from the Brewing Society of Japan, test sites in each prefecture, or ATCC (American Type Culture Collection), NBRC (NITE Biological), which provides various yeasts as resources. Resource. Center), Bioresource Center of the Institute of Physical and Chemical Research, etc., which are provided by each country or each operating organization can be used. In addition, a yeast strain known to be deficient in the FDC1 gene and / or the PAD1 gene provided by these institutions is crossed with a yeast strain in which these are not deficient, and a wild-type gene and a mutant type are crossed. Heterozygous yeast strains of genes may be bred and used as parent strains. For example, yeast distributed by the Brewing Society of Japan (preferably Saccharomyces cerevisiae 1001) and laboratory yeast strains such as Saccharomyces cerevisiae S288C (NBRC1136) (preferably laboratory strain D458-5A (ATCC90753)). You just have to multiply.
親株の酵母については、限定はないが、Saccharomyces属であればよく、醸造で主に用いられる酵母であるSaccharomyces pastorianus、Saccharomyces bayanus、Saccharomyces cerevisiaeが好ましく、Saccharomyces cerevisiaeが最も好ましい。
また、本発明方法は、ＤＮＡシーケンシングにより、親株の酵母のＦＤＣ１遺伝子及び／又はＰＡＤ１遺伝子が野生型と変異型でヘテロ接合していることを確認する工程を含むことが好ましい。
The parent strain yeast is not limited, but may be Saccharomyces genus, and Saccharomyces pastorianus, Saccharomyces bayanus, Saccharomyces cerevisiae, which are yeasts mainly used in brewing, are preferable, and Saccharomyces cerevisiae is the most preferable.
In addition, the method of the present invention preferably includes a step of confirming that the FDC1 gene and / or the PAD1 gene of the parent strain yeast is heterozygous between the wild type and the mutant type by DNA sequencing.
ＦＤＣ１遺伝子としては、配列番号１に示す塩基配列（Saccharomyces genome data base SGD ID：S000002947）からなる遺伝子が挙げられる。配列番号１は、実験室酵母S288C株のＦＤＣ１遺伝子の塩基配列である。
また、配列番号１と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなる遺伝子であり、かつフェルラ酸を脱炭酸する酵素をコードする遺伝子も使用できる。より好ましい遺伝子は、配列番号１と異なる塩基の数が１０個以下、中でも５個以下の塩基配列からなるものである。
本発明において、塩基配列の同一性は、遺伝情報処理ソフトウェアＧＥＮＥＴＹＸ（株式会社ゼネティックス）により算出した値である。
また、配列番号１と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつフェルラ酸を脱炭酸する酵素をコードする遺伝子も使用できる。
本発明において、「ストリンジェントな条件」は６×ＳＳＣの塩濃度のハイブリダイゼーション溶液中、５０～６０℃の温度条件下、１６時間ハイブリダイゼーションを行い、０．１×ＳＳＣの塩濃度の溶液中で洗浄を行う条件をいう。
Examples of the FDC1 gene include a gene consisting of the base sequence (Saccharomyces genome data base SGD ID: S000002947) shown in SEQ ID NO: 1. SEQ ID NO: 1 is the base sequence of the FDC1 gene of the laboratory yeast S288C strain.
Further, it is a gene consisting of a base sequence having 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 98% or more, particularly preferably 99% or more identity with SEQ ID NO: 1, and is an enzyme that decarboxylates ferulic acid. You can also use the gene that encodes. A more preferable gene consists of a base sequence in which the number of bases different from SEQ ID NO: 1 is 10 or less, particularly 5 or less.
In the present invention, the identity of the base sequence is a value calculated by the genetic information processing software GENETYX (Genetics Co., Ltd.).
Further, a gene encoding an enzyme that hybridizes with DNA having a base sequence complementary to SEQ ID NO: 1 under stringent conditions and decarboxylates ferulic acid can also be used.
In the present invention, "stringent conditions" are hybridized in a hybridization solution having a salt concentration of 6 × SSC for 16 hours under a temperature condition of 50 to 60 ° C. in a solution having a salt concentration of 0.1 × SSC. Refers to the conditions for cleaning with.
配列番号１に示す塩基配列からなる遺伝子のこれらのホモログの中で好ましいものとしては、配列番号１の、塩基番号９のＧがＡに、塩基番号２１９のＧがＡ又はＣに、塩基番号３３５のＴがＣに、塩基番号７４６のＣがＴに、塩基番号１３８９のＴがＣに、及び／又は塩基番号１４８５のＡがＴに置換された塩基配列からなる遺伝子が挙げられる。
配列番号１に示す塩基配列からなる遺伝子のホモログの中で特に好ましいものとして、配列番号２に示す塩基配列からなる遺伝子が挙げられる。配列番号２は、きょうかい７号 変異型ＦＤＣ１遺伝子の塩基配列である。配列番号２は、配列番号１の塩基番号９のＧがＡに置換され、塩基番号２１９のＧがＡに置換され、塩基番号１３８９のＴがＣに置換され、塩基番号１４８５のＡがＴに置換されたものである。
Among these homologues of the gene consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, G of base number 9 of SEQ ID NO: 1 is assigned to A, G of base number 219 is assigned to A or C, and base number 335 is preferable. A gene consisting of a base sequence in which T of base number 746 is replaced with T, C of base number 746 is replaced with T, T of base number 1389 is replaced with C, and / or A of base number 1485 is replaced with T can be mentioned.
Among the homologues of the gene consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, a gene consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 is particularly preferable. SEQ ID NO: 2 is the base sequence of Kyokai No. 7 mutant FDC1 gene. In SEQ ID NO: 2, G of base number 9 of SEQ ID NO: 1 is replaced with A, G of base number 219 is replaced with A, T of base number 1389 is replaced with C, and A of base number 1485 is replaced with T. It has been replaced.
変異型ＦＤＣ１遺伝子は、フェルラ酸脱炭酸能が欠損又は低下したフェルラ酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子である。変異型ＦＤＣ１遺伝子は、野生型ＦＤＣ１遺伝子に、塩基欠損や挿入などによりフレームシフトを起こしたり、塩基置換によりストップコドンを導入することにより得ることができる。例えば、配列番号１の塩基番号１６０のＡをＴに置換すれば、その位置にストップコドンが生じる。また、野生型ＦＤＣ１遺伝子のプロモーター領域を欠損させたり、塩基欠損、挿入、置換により破壊することによっても得ることができる。 The mutant FDC1 gene is a gene encoding a ferulic acid decarboxylase having a deficient or decreased ferulic acid decarboxylation ability. The mutant FDC1 gene can be obtained by causing a frame shift in the wild-type FDC1 gene due to a base defect or insertion, or by introducing a stop codon by base substitution. For example, if A of base number 160 of SEQ ID NO: 1 is replaced with T, a stop codon is generated at that position. It can also be obtained by deleting the promoter region of the wild-type FDC1 gene, or by destroying it by base deletion, insertion, or substitution.
ＰＡＤ１遺伝子としては、配列番号３に示す塩基配列（Saccharomyces genome data base SGD ID：（S000002946））からなる遺伝子が挙げられる。
また、配列番号３と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなる遺伝子であり、かつフェルラ酸を脱炭酸する酵素をコードする遺伝子も使用できる。より好ましい遺伝子は、配列番号３と異なる塩基の数が１０個以下、中でも５個以下の塩基配列からなるものである。
また、配列番号３と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつフェルラ酸を脱炭酸する酵素をコードする遺伝子も使用できる。
Examples of the PAD1 gene include a gene consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 (Saccharomyces genome data base SGD ID: (S000002946)).
Further, it is a gene consisting of a base sequence having 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 98% or more, particularly preferably 99% or more identity with SEQ ID NO: 3, and is an enzyme that decarboxylates ferulic acid. You can also use the gene that encodes. A more preferable gene consists of a base sequence in which the number of bases different from SEQ ID NO: 3 is 10 or less, particularly 5 or less.
Further, a gene encoding an enzyme that hybridizes with DNA having a base sequence complementary to SEQ ID NO: 3 under stringent conditions and decarboxylates ferulic acid can also be used.
配列番号３に示す塩基配列からなる遺伝子のこれらのホモログの中でも好ましいものとしては、配列番号３の、塩基番号１１２のＣがＴに、塩基番号１４０のＣがＴに、塩基番号１７２のＧがＡに、塩基番号１７７のＣがＴに、及び／又は塩基番号３５４のＴがＣに置換された塩基配列からなる遺伝子が挙げられる。 Among these homologues of the gene consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3, C of base number 112 of SEQ ID NO: 3 is T, C of base number 140 is T, and G of base number 172 is preferable. Examples of A include a gene consisting of a base sequence in which C of base number 177 is replaced with T and / or T of base number 354 is replaced with C.
変異型ＰＡＤ１遺伝子は、フェルラ酸脱炭酸能が欠損又は低下したフェニルアクリル酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子である。変異型ＰＡＤ１遺伝子は、変異型ＦＤＣ１遺伝子について説明したのと同様にして、塩基欠損や挿入などによるフレームシフト、塩基置換によるストップコドンの導入、プロモーター領域の欠損や破壊により得ることができる。例えば、配列番号３の塩基番号３０５のＧをＡに置換するとストップコドンが導入される。 The mutant PAD1 gene is a gene encoding phenylacrylic acid decarboxylase having a deficient or decreased ferulic acid decarboxylation ability. The mutant PAD1 gene can be obtained by frameshifting due to base deletion or insertion, introduction of a stop codon by base substitution, or deletion or destruction of a promoter region in the same manner as described for the mutant FDC1 gene. For example, replacing G in base number 305 of SEQ ID NO: 3 with A introduces a stop codon.
親株は、フェルラ酸を脱炭酸する酵素をコードする遺伝子の野生型と変異型をヘテロ接合型に有する株に変異処理を施して得た株であってもよい。変異処理により、フェルラ酸を脱炭酸する酵素をコードする変異型遺伝子をホモ接合型に有する株を効率よく得ることができる。
変異処理方法は良く知られており、例えば、エチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）、Ｎ－メチル－Ｎ－ニトロ－ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）、亜硝酸、アクリジン系色素などを用いた化学処理、紫外線照射、放射線照射、イオンビーム照射などが挙げられる。
The parent strain may be a strain obtained by subjecting a strain having a wild type and a mutant type of a gene encoding an enzyme decarboxylating ferulic acid to a heterozygous type and subjecting the mutation treatment. By the mutation treatment, a strain having a homozygous mutant gene encoding an enzyme that decarboxylates ferulic acid can be efficiently obtained.
Mutation treatment methods are well known, for example, chemical treatment with ethylmethanesulfonic acid (EMS), N-methyl-N-nitro-nitrosoguanidine (NTG), nitrite, acridine dye, etc., ultraviolet irradiation, Irradiation, ion beam irradiation and the like can be mentioned.
変異型遺伝子をホモ接合型に有する株の選択
フェルラ酸を脱炭酸する酵素をコードする変異型遺伝子をホモ接合型に有する株は、薬剤耐性を指標にして選択する。
薬剤としては、プロリンアナログ、ケイ皮酸アナログが挙げられる。
プロリンアナログは酵母に毒性を示しその生育を阻害するアナログであればよく、例えばアゼチジン－２－カルボン酸（ＡＺＣ）、３，４－ジヒドロ－ＤＬ－プロリンが挙げられるが、好ましくはアゼチジン－２－カルボン酸（ＡＺＣ）である。
プロリンアナログの濃度は、好ましくは０．０３μｇ／ｍＬ以上、より好ましくは０．１μｇ／ｍＬ以上、さらに好ましくは０．８μｇ／ｍＬ以上であり、また好ましくは３０μｇ／ｍＬ以下、より好ましくは１０μｇ／ｍＬ以下、さらに好ましくは３μｇ／ｍＬ以下である。この条件下で、プロリンアナログに耐性を示すことを指標に株を選択することができる。
また、ケイ皮酸アナログは酵母に毒性を示しその生育を阻害するアナログ（本明細書中ではケイ皮酸をも含むものとする）であればよく、例えば、ケイ皮酸、フェルラ酸、トランス－ケイ皮酸、α－シアノ－４－ヒドロキシケイ皮酸が挙げられる。
ケイ皮酸アナログの濃度は、好ましくは０．０３ｍＭ以上、より好ましくは０．１ｍＭ以上、さらに好ましくは０．３ｍＭ以上であり、また好ましくは１０ｍＭ以下、より好ましくは３ｍＭ以下、さらに好ましくは１ｍＭ以下である。この条件下で、ケイ皮酸アナログに耐性を示すことを指標に株を選択することができる。
Selection of strains homozygous for the mutant gene Strains homozygously possessing the mutant gene encoding the enzyme that decarboxylates ferulic acid are selected using drug resistance as an index.
Examples of the drug include proline analog and cinnamic acid analog.
The proline analog may be any analog that is toxic to yeast and inhibits its growth, and examples thereof include azetidine-2-carboxylic acid (AZC) and 3,4-dihydro-DL-proline, but azetidine-2- It is a carboxylic acid (AZC).
The concentration of the proline analog is preferably 0.03 μg / mL or more, more preferably 0.1 μg / mL or more, still more preferably 0.8 μg / mL or more, and preferably 30 μg / mL or less, more preferably 10 μg / mL. It is mL or less, more preferably 3 μg / mL or less. Under this condition, the strain can be selected based on the resistance to the proline analog.
The cinnamic acid analog may be any analog that is toxic to yeast and inhibits its growth (including cinnamic acid in the present specification), for example, cinnamic acid, ferulic acid, and trans-cinnamic acid. Acids and α-cyano-4-hydroxycinnamic acid can be mentioned.
The concentration of the cinnamic acid analog is preferably 0.03 mM or more, more preferably 0.1 mM or more, still more preferably 0.3 mM or more, and preferably 10 mM or less, more preferably 3 mM or less, still more preferably 1 mM or less. Is. Under these conditions, strains can be selected based on their resistance to cinnamic acid analogs.
また、フェルラ酸を脱炭酸する酵素をコードする遺伝子の変異型をホモ接合型に有する株は、ケイ皮酸アナログへの耐性が消失又は低下したことを指標に選択することもできる。この場合、ＦＤＣ１遺伝子を野生型と変異型のヘテロ接合型で有する親株を用い、変異型のＦＤＣ１遺伝子をホモ接合型で有する株を選択することができる。
好ましくは、（１）親株としてケイ皮酸アナログの濃度０．１ｍＭ以上の条件下でケイ皮酸アナログに耐性を示す株を用い、そのケイ皮酸アナログの濃度０．０５ｍＭ以下の条件下で増殖すること、（２）親株としてケイ皮酸アナログの濃度０．５ｍＭ以上の条件下でケイ皮酸アナログに耐性を示す株を用い、そのケイ皮酸アナログの濃度０．４ｍＭ、０．２ｍＭ、又は０．０５ｍＭ以下の条件下で増殖すること、或いは（３）親株としてケイ皮酸アナログの濃度０．６ｍＭ又は０．８ｍＭ以上の条件下でケイ皮酸アナログに耐性を示す株を用い、そのケイ皮酸アナログの濃度０．５ｍＭ、０．４ｍＭ、０．２ｍＭ、又は０．０５ｍＭ以下の条件下で増殖することを指標に、ケイ皮酸感受性になった株を選択することができる。増殖できる株の選択に用いるケイ皮酸アナログ濃度の下限値は０μｇ／ｍＬとすることができる。
In addition, a strain having a mutant form of a gene encoding an enzyme decarboxylating ferulic acid in a homozygous form can be selected based on the disappearance or decrease of resistance to cinnamic acid analog. In this case, a parent strain having the FDC1 gene in the wild type and the mutant type heterozygous type can be used, and a strain having the mutant FDC1 gene in the homozygous type can be selected.
Preferably, (1) a strain exhibiting resistance to cinnamic acid analog under the condition of 0.1 mM or more of cinnamic acid analog is used as the parent strain, and the strain is grown under the condition of 0.05 mM or less of the cinnamic acid analog. (2) Use a strain that is resistant to cinnamic acid analog under the condition of cinnamic acid analog concentration of 0.5 mM or more as the parent strain, and use the cinnamic acid analog concentration of 0.4 mM, 0.2 mM, or Proliferate under conditions of 0.05 mM or less, or (3) use a strain that is resistant to cinnamic acid analog under conditions of cinnamic acid analog concentration of 0.6 mM or 0.8 mM or more as the parent strain, and use the cinnamic acid analog. A cinnamic acid-sensitive strain can be selected based on the growth under conditions of a cinnamic acid analog concentration of 0.5 mM, 0.4 mM, 0.2 mM, or 0.05 mM or less. The lower limit of the cinnamic acid analog concentration used for selecting a growable strain can be 0 μg / mL.
薬剤耐性を示す株は、薬剤を含む培地に親株を接種し、２５～３７℃、中でも２８～３０℃で、４８～１２０時間、中でも７２～９６時間培養した場合に増殖が認められる株を選択すればよい。培地は、固体培地又は液体培地の何れでも良いが、固体培地に親株を接種し、菌体の増殖を目視で確認するのが簡便である。また、ケイ皮酸アナログ感受性になった株の増殖も同様の条件で確認することができる。 For drug-resistant strains, select strains that grow when the parent strain is inoculated into a medium containing the drug and cultured at 25 to 37 ° C, especially 28 to 30 ° C, for 48 to 120 hours, especially 72 to 96 hours. do it. The medium may be either a solid medium or a liquid medium, but it is convenient to inoculate the solid medium with the parent strain and visually confirm the growth of the cells. In addition, the growth of the cinnamic acid analog-sensitive strain can be confirmed under the same conditions.
上記説明した、フェルラ酸を脱炭酸する酵素をコードする遺伝子の変異型をホモ接合型に有する株の選択操作は２回以上繰り返すこともでき、それにより、このようなホモ接合型の株の出現率が高くなる。
本発明方法は、さらに、選択した株が、フェルラ酸を脱炭酸する酵素をコードする変異型遺伝子をホモ接合型に有するか否かを、シークエンシングにより確認する工程を含むことができる。
The above-described strain selection operation for homozygous strains having a variant of the gene encoding the enzyme that decarboxylates ferulic acid can be repeated two or more times, whereby the emergence of such homozygous strains. The rate will be high.
The method of the present invention can further include a step of sequencing to confirm whether the selected strain has a homozygous mutant gene encoding an enzyme that decarboxylates ferulic acid.
本発明方法により、ＦＤＣ１遺伝子の野生型と変異型をヘテロ接合型に有する親株を用いれば、ＦＤＣ１遺伝子の変異型をホモ接合型に有する株を選択することができ、また、ＰＡＤ１遺伝子の野生型と変異型をヘテロ接合型に有する親株を用いれば、ＰＡＤ１遺伝子の変異型をホモ接合型に有する株を選択することができる。また、ＦＤＣ１遺伝子及びＰＡＤ１遺伝子の野生型と変異型をヘテロ接合型に有する親株を用いれば、ＦＤＣ１遺伝子及びＰＡＤ１遺伝子の変異型をホモ接合型に有する株を選択することができる。 By the method of the present invention, if a parent strain having a wild type and a mutant of the FDC1 gene in a heterozygous type is used, a strain having a mutant type of the FDC1 gene in a homozygous type can be selected, and a wild type of the PAD1 gene can be selected. By using a parent strain having a heterozygous type of PAD1 gene, a strain having a mutant type of PAD1 gene in a homozygous type can be selected. Further, if a parent strain having a wild type and a mutant of the FDC1 gene and the PAD1 gene in a heterozygous type is used, a strain having a mutant type of the FDC1 gene and the PAD1 gene in a homozygous type can be selected.
（２）清酒の製造方法
本発明は、上記説明した本発明方法により得られた４-ＶＧ低生産酵母株を用いて、清酒などのアルコール飲料（清酒、焼酎、ワイン、ウィスキー、ビールなど）を醸造により製造する方法を提供する。
清酒の製造方法は特に限定されない、酒母に、米麹、掛米、及び水を添加して仕込み、これを糖化、発酵させてもろみを得た後、上槽（もろみの液体画分と酒粕を分離して液体画分を採取する工程であり、酒税法でいう「こす（濾す）」工程であればよい）により製造することができる。さらに、熱処理、オリの除去、濾過などを行ってもよい。焼酎、ワイン、ウィスキー、ビールなどであれば、ブドウ・穀類などを用いればよい。
(2) Method for producing sake The present invention uses the 4-VG low-producing yeast strain obtained by the method of the present invention described above to make alcoholic beverages such as sake (sake, shochu, wine, whiskey, beer, etc.). Provides a method of manufacturing by brewing.
The method for producing sake is not particularly limited. After adding rice jiuqu, kake rice, and water to the sake mother and saccharifying and fermenting it to obtain mash, the upper tank (liquid fraction of mash and lees) is added. It is a step of separating and collecting a liquid fraction, and can be produced by the "straining" step referred to in the Liquor Tax Law). Further, heat treatment, removal of sediment, filtration and the like may be performed. For shochu, wine, whiskey, beer, etc., grapes and grains may be used.
仕込みに使用する掛米は、蒸米を用いてもよく、或いは液化した融米を用いてもよい。融米を使用する仕込みは、液化仕込みといわれる。融米は、米や粉砕米に、仕込み水と耐熱性酵素であるα－アミラーゼを添加し、６０～９０℃で液化することにより得られる。液化だけでなく糖化まで行う場合は、液化終了後６０℃程度まで冷却した時点で、グルコアミラーゼを添加して約５０～５５℃で糖化させればよい。 As the hanging rice used for the preparation, steamed rice may be used, or liquefied molten rice may be used. The preparation using melted rice is called liquefaction preparation. Melted rice is obtained by adding water to be charged and α-amylase, which is a heat-resistant enzyme, to rice or crushed rice, and liquefying the rice at 60 to 90 ° C. In the case of performing not only liquefaction but also saccharification, glucoamylase may be added and saccharified at about 50 to 55 ° C. after cooling to about 60 ° C. after the completion of liquefaction.
原料米（掛米、麹米）は、米粉であっても、精米したものであってもよいが、精米したものが好ましい。米の品種には特に限定はなく、酒造好適米（例えば、山田錦、五百万石など）、あるいは一般食用米であっても良く、うるち米、もち米であってもよく、清酒醸造に用いることができる米であればよい。また、国内産米と海外産米のどちらでもよいが、地理的表示（基準）上、国内産米が好ましい。 The raw material rice (kake rice, jiuqu rice) may be rice flour or polished rice, but polished rice is preferable. The varieties of rice are not particularly limited, and may be rice suitable for sake brewing (for example, Yamada Nishiki, Gohyakumangoku, etc.), general edible rice, glutinous rice, glutinous rice, etc., and used for sake brewing. Any rice that can be used will do. In addition, either domestic rice or overseas rice may be used, but domestic rice is preferable in terms of geographical indication (standard).
米麹は、蒸した米に麹菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）を増殖させたものである。清酒の製造に使用する米麹は、平成元年１１月２２日 国税庁告示第８号「清酒の製法品質表示基準を定める件［１］」において、「米こうじとは、白米にこうじ菌を繁殖させたもので、白米のでんぷんを糖化させることができるものをいい、特定名称の清酒は、こうじ米の使用割合（白米の重量に対するこうじ米の重量の割合をいう。以下同じ）が、１５％以上のものに限るものとする。」と定められている。
使用する麹菌は、清酒の製造に使用できるものであればよく、例えば、ビオック社製の大吟醸、酒母用、醪用、機械製麹用、純米吟醸用、純米酒用、本醸造用、経済酒用、良い香り、液化仕込み用や、樋口松之助商店社製のひかみ吟醸用、ハイ・Ｇ、ダイヤモンド印、もと立用、醪用、ひかみ醪用２０号、ひかみ醪用３０号、ひかみ特選粉状Ａ、エースヒグチ、ヒグチ粉状菌、白峯、かおり、強力糖化菌、液化仕込み用などが挙げられる。
Jiuqu is made by growing Aspergillus oryzae on steamed rice. The rice jiuqu used in the production of sake is described in the National Tax Agency Notification No. 8 "Matters to Establish Quality Labeling Standards for Sake Manufacturing [1]" on November 22, 1989. Sake that can saccharify the starch of white rice is made, and the ratio of koji rice used (the ratio of the weight of koji rice to the weight of white rice; the same applies hereinafter) is 15% for sake with a specific name. It shall be limited to the above. "
The aspergillus used may be any as long as it can be used for the production of sake. For economic sake, good fragrance, for liquefaction preparation, for Higuchi Ginjo made by Higuchi Matsunosuke Shoten, high G, diamond mark, for original mash, for mash, for moromi mash No. 20, for mash mash 30 No., Hikami Special Powder A, Ace Higuchi, Higuchi Powder Bacteria, Shiramine, Kaori, Strong Saccharifying Bacteria, For Liquefiing Preparation, etc.
酒母は、酵母に蒸米、米麹、水を加えて酵母を大量に増殖させたものである。
酵母は、本発明の４-ＶＧ低生産酵母株を用いる。
Sake mother is made by adding steamed rice, rice jiuqu, and water to yeast to grow a large amount of yeast.
As the yeast, the 4-VG low-producing yeast strain of the present invention is used.
仕込みは、上記のように調製した酒母、掛米、米麹、及び水を発酵タンクに投入して行う。仕込みでは、一段で全て添加してもよいが、多段に分けてもよいし、上槽前に四段として仕込んでもよい。酵母濃度が薄まらないように、三段仕込みが好ましい。三段仕込みは、もろみ造りにおいて、酒母に米麹及び掛米を三段階に分けて添加する方法であり、酵母に与える環境の変化を最小限にして、酵母の活性を損なわないようにする方法である。 The preparation is carried out by putting the liquor mother, kake rice, rice jiuqu, and water prepared as described above into the fermentation tank. In the preparation, all of them may be added in one stage, or they may be divided into multiple stages, or they may be charged in four stages in front of the upper tank. Three-stage preparation is preferable so that the yeast concentration does not diminish. The three-stage preparation is a method of adding rice jiuqu and kake rice to the mash mother in three stages in moromi brewing, and is a method of minimizing the change in the environment given to the yeast and not impairing the activity of the yeast. Is.
もろみの発酵期間は、１０～４０日間とすればよく、好ましくは１５～４０日間、より好ましくは２０～３０日である。この期間は、三段仕込みの場合は、留添（留後）から上槽までの期間としてもよい。もろみの発酵温度は、５～２５℃とすればよく、好ましくは１０～２０℃である。
発酵が終了した後、酒粕を除去し、清酒画分（上槽酒）を回収する。例えば、圧搾、ろ過などにより、酒粕と清酒画分を分離すればよい。上槽酒は、さらに必要に応じて、ろ過、オリの除去、加熱処理、活性炭処理などに供すればよい。焼酎、ウィスキーであれば更に、蒸留すればよい。
The fermentation period of the mash may be 10 to 40 days, preferably 15 to 40 days, and more preferably 20 to 30 days. In the case of three-stage preparation, this period may be the period from the attachment (after the attachment) to the upper tank. The fermentation temperature of the mash may be 5 to 25 ° C, preferably 10 to 20 ° C.
After the fermentation is completed, the lees are removed and the sake fraction (upper tank liquor) is collected. For example, the lees and the sake fraction may be separated by squeezing, filtering, or the like. The upper tank liquor may be further subjected to filtration, removal of sediment, heat treatment, activated carbon treatment and the like, if necessary. If it is shochu or whiskey, it may be further distilled.
（３）低４－ＶＧ含有清酒
本発明は、４-ＶＧ濃度が５００ｐｐｂ以下であり、バニリン濃度が０．７ｐｐｍ以上である容器詰め清酒を提供する。
実施例の項目に示す通り、本発明では、清酒中の４-ＶＧ濃度が５００ｐｐｂ以下である場合は、バニリン濃度が０．７ｐｐｍ以上、好ましくは、０．８ｐｐｍ以上、０．９ｐｐｍ以上、１ｐｐｍ以上、１．１ｐｐｍ以上、１．２ｐｐｍ以上、又は２ｐｐｍ以上であれば、４-ＶＧに由来する煙臭、薬品臭、又は香辛料臭がマスキングされることを見出した。
(3) Low 4-VG-containing sake The present invention provides a packaged sake having a 4-VG concentration of 500 ppb or less and a vanillin concentration of 0.7 ppm or more.
As shown in the items of Examples, in the present invention, when the 4-VG concentration in sake is 500 ppb or less, the vanillin concentration is 0.7 ppm or more, preferably 0.8 ppm or more, 0.9 ppm or more, and 1 ppm or more. , 1.1 ppm or more, 1.2 ppm or more, or 2 ppm or more, it was found that the smoke odor, the chemical odor, or the spice odor derived from 4-VG is masked.
４-ＶＧ濃度は、３００ｐｐｂ以下が好ましく、２００ｐｐｂ以下がより好ましく、１００ｐｐｂ以下がさらに好ましい。４-ＶＧ濃度の下限値は０ｐｐｂとすることができるが、５ｐｐｂ以上、２０ｐｐｂ以上、又は５０ｐｐｂ以上であっても良い。
また、バニリン濃度は、０．８ｐｐｍ以上が好ましく、中でも０．９ｐｐｍ以上が好ましく、中でも１ｐｐｍ以上が好ましく、中でも１．５ｐｐｍ以上、特に２ｐｐｍ以上が好ましい。この範囲であれば、４-ＶＧに由来する煙臭、薬品臭、又は香辛料臭がマスキングされ、またバニリンの甘い香りが感じられる清酒となる。また、バニリン濃度は、３００ｐｐｍ以下が好ましく、１００ｐｐｍ以下がより好ましく、３０ｐｐｍ以下がさらに好ましい。この範囲であれば、バニリンに由来する香りが突出することがなく、清酒らしい香気を有するものとなる。
The 4-VG concentration is preferably 300 ppb or less, more preferably 200 ppb or less, and even more preferably 100 ppb or less. The lower limit of the 4-VG concentration can be 0 ppb, but it may be 5 ppb or more, 20 ppb or more, or 50 ppb or more.
The vanillin concentration is preferably 0.8 ppm or more, particularly preferably 0.9 ppm or more, particularly preferably 1 ppm or more, and particularly preferably 1.5 ppm or more, particularly 2 ppm or more. Within this range, the smoke odor, chemical odor, or spice odor derived from 4-VG is masked, and the sweet scent of vanillin can be felt in the sake. The vanillin concentration is preferably 300 ppm or less, more preferably 100 ppm or less, and even more preferably 30 ppm or less. Within this range, the scent derived from vanillin does not protrude, and the scent is typical of sake.
本発明の清酒は、米、米麹、及び水を主な原料として酵母により発酵したものであればよいが、中でも、酒税法（特に、日本国の酒税法）で定める清酒であることが好ましい。清酒は、酒税法や酒税法に関わる各種法令（例えば、酒税法施行令など）や通達などにおいて、使用できる原料が、米、米麹、水の他、酒粕、醸造アルコール、特定の有機酸などに限定されており、一般に食品添加物として認められている香料などを添加することは認められていない。また、酵素剤の使用量や使用用途についても限定されている。 The sake of the present invention may be one fermented with yeast using rice, rice jiuqu, and water as the main raw materials, but among them, the sake specified by the Liquor Tax Law (particularly the Liquor Tax Law of Japan) is preferable. .. For sake, the raw materials that can be used in various laws and regulations related to the Liquor Tax Law and the Liquor Tax Law (for example, the Liquor Tax Law Enforcement Ordinance) and notifications are rice, rice koji, water, lees, brewed alcohol, specific organic acids, etc. It is not permitted to add fragrances and the like that are generally accepted as food additives. In addition, the amount of enzyme preparation used and the intended use are also limited.
また、本発明の清酒は、国税庁告示で定められた「清酒の製法品質表示基準」（「酒税の保全及び酒類業組合等に関する法律」などで定められる酒類の表示の基準）を満たす清酒であってよく、吟醸酒、大吟醸酒、純米酒、純米吟醸酒、純米大吟醸酒、特別純米酒、本醸造酒、及び特別本醸造酒といった特定名称の清酒が挙げられる。これらの特定名称にあたらない清酒を、本明細書では「普通酒」とする。
また、本発明の容器詰め清酒は、その容器に「清酒」、または国税庁長官が指定した酒類の地理的表示（基準）である「日本酒」など、清酒を意味する文言が表示されていることが好ましい。
Further, the sake of the present invention is a sake that satisfies the "quality labeling standard for sake manufacturing method" (the standard for labeling of liquor stipulated in the "Law Concerning Conservation of Liquor Tax and Liquor Industry Association" etc.) stipulated by the Notification of the National Tax Agency. Sake with specific names such as Ginjo Sake, Daiginjo Sake, Junmai Sake, Junmai Ginjo Sake, Junmai Daiginjo Sake, Special Junmai Sake, Honjo Sake, and Special Honjo Sake can be mentioned. Sake that does not fall under these specific names is referred to as "ordinary sake" in the present specification.
In addition, the container-packed sake of the present invention may have a word meaning sake such as "sake" or "sake" which is a geographical indication (standard) of sake designated by the Commissioner of the National Tax Agency. preferable.
アルコール度数
本発明の清酒において、アルコール度数、即ち、アルコール分（ｖ／ｖ％）は、酒税法で定める１％以上２２％未満の範囲であれば特に限定はないが、３ｖ／ｖ％以上が好ましく、５ｖ／ｖ％以上がより好ましく、７ｖ／ｖ％以上がさら好ましい。また、２０ｖ／ｖ％以下が好ましく、１８ｖ／ｖ％以下がより好ましく、１５ｖ／ｖ％以下がさらに好ましい。この範囲であれば、４－ＶＧに由来するオフフレーバーを感じず、かつバニリンに由来する甘い香りを感じ、全体として消費者に好まれる風味を有する清酒となる。
アルコール分（アルコール度数）は、アルコール飲料の全量に対するアルコール（エタノール）の体積濃度を百分率で表示した割合である。アルコール分は、酒税法で認められる国税庁所定分析法、あるいは独立行政法人酒類総合研究所が定める「酒類総合研究所標準分析法」（平成２２年１１月４日、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｒｉｂ．ｇｏ．ｊｐ／ｄａｔａ／ｎｒｉｂａｎａｌｙｓｉｓ．ｈｔｍ）で測定できるが、本発明におけるアルコール分は、独立行政法人酒類総合研究所が定める「酒類総合研究所標準分析法」の「３．清酒」の規定（以下、「清酒分析法」という）に基づいて分析した値である。
Alcohol content In the sake of the present invention, the alcohol content, that is, the alcohol content (v / v%) is not particularly limited as long as it is in the range of 1% or more and less than 22% specified by the Liquor Tax Law, but 3v / v% or more is used. Preferably, 5v / v% or more is more preferable, and 7v / v% or more is even more preferable. Further, 20 v / v% or less is preferable, 18 v / v% or less is more preferable, and 15 v / v% or less is further preferable. Within this range, the sake has a flavor that is preferred by consumers as a whole, without feeling the off-flavour derived from 4-VG and feeling the sweet aroma derived from vanillin.
The alcohol content (alcohol content) is the ratio of the volume concentration of alcohol (ethanol) to the total amount of alcoholic beverages expressed as a percentage. Alcohol content is determined by the National Tax Agency's prescribed analysis method permitted by the Liquor Tax Law, or the "Liquor Research Institute Standard Analysis Method" established by the Liquor Research Institute (November 4, 2010, http: //www.nrib. Although it can be measured by go.jp/data/nribanarysis.hm), the alcohol content in the present invention is the provision of "3. Sake" of "Standard Analytical Method of Liquor Research Institute" established by Incorporated Administrative Agency Liquor Research Institute. , "Sake analysis method").
日本酒度
本発明の清酒において、日本酒度は特に制限はないが、－９０以上が好ましく、－６０以上がより好ましく、－３０以上がさらに好ましい。また、＋３０以下が好ましく、＋２０以下がより好ましく、＋１０以下がさらに好ましい。この範囲であれば、４－ＶＧに由来するオフフレーバーを感じず、かつバニリンに由来する甘い香りを感じ、全体として消費者に好まれる風味を有する清酒となる。
日本酒度は、上述の清酒分析法で測定した値である。
Sake degree In the sake of the present invention, the sake degree is not particularly limited, but is preferably −90 or higher, more preferably −60 or higher, and even more preferably −30 or higher. Further, +30 or less is preferable, +20 or less is more preferable, and +10 or less is further preferable. Within this range, the sake has a flavor that is preferred by consumers as a whole, without feeling the off-flavour derived from 4-VG and feeling the sweet aroma derived from vanillin.
The degree of sake is a value measured by the above-mentioned sake analysis method.
酸度
本発明の清酒において、酸度は特に制限はないが、０．１以上が好ましく、０．２以上がより好ましく、０．４以上がさらに好ましい。また、１０以下が好ましく、６以下がより好ましく３以下がさらに好ましい。この範囲であれば、４－ＶＧに由来するオフフレーバーを感じず、かつバニリンに由来する甘い香りを感じ、全体として消費者に好まれる風味を有する清酒となる。
酸度は、清酒に含まれる、遊離酸（主に乳酸、リンゴ酸、コハク酸など）の総量を示した値である。具体的には、酸度は、１０ｍＬの清酒を中和するのに要する、０．１Ｎ水酸化ナトリウム溶液のｍＬを指す。
酸度は、上述の清酒分析法で測定した値である。
Acidity In the sake of the present invention, the acidity is not particularly limited, but is preferably 0.1 or more, more preferably 0.2 or more, still more preferably 0.4 or more. Further, 10 or less is preferable, 6 or less is more preferable, and 3 or less is further preferable. Within this range, the sake has a flavor that is preferred by consumers as a whole, without feeling the off-flavour derived from 4-VG and feeling the sweet aroma derived from vanillin.
The acidity is a value indicating the total amount of free acids (mainly lactic acid, malic acid, succinic acid, etc.) contained in sake. Specifically, acidity refers to the mL of 0.1N sodium hydroxide solution required to neutralize 10 mL of sake.
The acidity is a value measured by the above-mentioned sake analysis method.
容器の素材としては、ガラス、プラスチック、紙類、陶器、木材、及びこれらを組み合わせたものが挙げられる。容器の種類としては、カップ（コップ）、紙パック、パウチ、ビン、ポリタンク、及び樽が挙げられる。本発明の容器詰め清酒は、これらの容器に格納又は充填されていることが好ましい。樽であれば、樽でアルコール飲料を保存したものを含めても良いし、含めなくても良い。 Examples of the material of the container include glass, plastic, paper, pottery, wood, and a combination thereof. Types of containers include cups, paper packs, pouches, bottles, plastic tanks, and barrels. The bottled sake of the present invention is preferably stored or filled in these containers. If it is a barrel, it may or may not include the one in which the alcoholic beverage is stored in the barrel.
製造方法
４-ＶＧ濃度が５００ｐｐｂ以下であり、バニリン濃度が０．７ｐｐｍ以上である清酒は、酵母として、上記説明した本発明の４-ＶＧ低生産酵母株を用いて清酒を醸造により製造し、例えば、得られた清酒を４-ＶＧ酸化酵素（例えば、Caulobacter segnis由来CSO2など）で処理することにより４-ＶＧをバニリンに変換することで製造することができる。清酒の醸造方法は、本発明の４-ＶＧ低生産酵母株を用いること以外は、一般的な方法とすることができる。本発明の容器詰め清酒は、長期（例えば、６カ月以上、中でも１年以上、中でも３年以上）保存したものを排除しないが、長期（例えば、６カ月以上、中でも１年以上、中でも３年以上）保存しないものとすることができる。
Production method For sake having a 4-VG concentration of 500 ppb or less and a vanillin concentration of 0.7 ppm or more, sake is produced by brewing using the 4-VG low-producing yeast strain of the present invention described above as yeast. For example, it can be produced by converting 4-VG to vanillin by treating the obtained sake with a 4-VG oxidase (for example, CSO2 derived from Caulobacter segnis). The method for brewing sake can be a general method except that the 4-VG low-producing yeast strain of the present invention is used. The packaged sake of the present invention does not exclude those that have been stored for a long period of time (for example, 6 months or more, especially 1 year or more, especially 3 years or more), but long-term (for example, 6 months or more, especially 1 year or more, especially 3 years or more). Above) It can be decided not to save.
以下、本発明を、実施例を挙げてより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples, but the present invention is not limited thereto.
実施例１
＜親株の選定＞
月桂冠株式会社保存酵母（Saccharomyces cerevisiae）である、Ｕ－０１株の遺伝子配列をシーケンスしたところ、ＦＤＣ１遺伝子については、Saccharomyces genome databaseにSGD：S000002947として登録されている配列番号１の塩基配列からなるＦＤＣ１遺伝子と比較して、塩基番号１６０の塩基がＡのままの野生型ＦＤＣ１遺伝子と、塩基番号１６０の塩基がＡからＴに置換された変異型ＦＤＣ１遺伝子の２つを有するヘテロ接合型であることが明らかとなった。また、野生型ＦＤＣ１遺伝子及び変異型ＦＤＣ１遺伝子とも、その塩基配列は、配列番号１において、塩基番号９のＧがＡに、塩基番号２１９のＧがＡに、塩基番号１４８５のＡがＴに置換された配列であった。
Example 1
<Selection of parent stock>
When the gene sequence of the U-01 strain, which is a preserved yeast (Saccharomyces cerevisiae) of Laurel Crown Co., Ltd., was sequenced, the FDC1 gene was FDC1 consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 1 registered as SGD: S000002947 in the Saccharomyces genome database. Compared to the gene, it is a heterozygous type having two genes, a wild type FDC1 gene in which the base of base number 160 remains A and a mutant FDC1 gene in which the base of base number 160 is substituted from A to T. Became clear. Further, in the base sequence of both the wild-type FDC1 gene and the mutant FDC1 gene, in SEQ ID NO: 1, G of base number 9 is replaced with A, G of base number 219 is replaced with A, and A of base number 1485 is replaced with T. It was a sequence that was made.
＜ホモ接合化工程＞
Ｕ－０１株を親株としてＹＰＤ培地（２％グルコース、２％ポリペプトン、１％酵母エキス）で３０℃、1日間培養した。ＡＺＣを最終濃度０．１ｇ／Ｌになるように加えた寒天培地（２％グルコース、０．６７％イーストナイトロジェンベース（アミノ酸を含まないもの）、２％寒天）に、Ｕ－０１株の培養液を塗布し、３０℃で４日間培養した。寒天培地上からＡＺＣ耐性株を単離し、変異株を合計72株得た。
ＦＤＣ１遺伝子の１６０番目の塩基を確認したところ、得られた７２株のうち、２株が変異型ＦＤＣ１遺伝子をホモ接合型で持つもの（Ｎｏ．５２株とＮｏ．５７株）、２株が野生型ＦＤＣ１遺伝子をホモ接合型で持つものとなっていた（Ｎｏ．４４株とＮｏ．５１株）。
<Homozygous process>
The U-01 strain was used as a parent strain and cultured in YPD medium (2% glucose, 2% polypeptone, 1% yeast extract) at 30 ° C. for 1 day. Culture of U-01 strain on agar medium (2% glucose, 0.67% yeast nitrogen base (without amino acids), 2% agar) to which AZC was added to a final concentration of 0.1 g / L. The solution was applied and cultured at 30 ° C. for 4 days. AZC-resistant strains were isolated on agar medium, and a total of 72 mutant strains were obtained.
When the 160th base of the FDC1 gene was confirmed, of the 72 strains obtained, 2 strains had the mutant FDC1 gene homozygously (No. 52 strain and No. 57 strain), and 2 strains were wild. It had a homozygous type FDC1 gene (No. 44 strain and No. 51 strain).
＜試験醸造＞
親株および上記変異株４株をそれぞれ、清酒の小仕込み試験を行った。発酵条件は、１５℃、２週間、原料は精米歩合約７０％の米麹と蒸米、装置はファーモグラフ（アトー社製））を用いた。上槽後の日本酒度、アルコール度、酸度、アミノ酸度、及び４－ＶＧを測定した。
各清酒の４－ＶＧ濃度、アルコール度数、及び酸度を表１に示す。
A small preparation test of sake was carried out for each of the parent strain and the above-mentioned four mutant strains. Fermentation conditions were 15 ° C. for 2 weeks, the raw materials were rice jiuqu and steamed rice with a rice polishing ratio of about 70%, and the equipment was Pharmagraph (manufactured by Atto). The sake degree, alcohol content, acidity, amino acid content, and 4-VG after the upper tank were measured.
Table 1 shows the 4-VG concentration, alcohol content, and acidity of each sake.
変異型ホモ接合のＮｏ．５２株とＮｏ．５７株は、Ｕ－０１株（親株）と比較して、アルコール度数、酸度、アミノ酸度、グルコース濃度、エキス分濃度はほぼ同じであったが、４－ＶＧ濃度は大きく減少した。
これに対して、野生型ホモ接合のＮｏ．４４株及びＮｏ．５１株は、Ｕ－０１株（親株）と比較して、アルコール度数、酸度、アミノ酸度、グルコース濃度、エキス分濃度はほぼ同じであったが、４－ＶＧ濃度が増大していた。
本発明方法により、醸造特性を維持しながら４－ＶＧ生産性のみ低減させることができた。
Mutant homozygous No. 52 strains and No. Compared with the U-01 strain (parent strain), the 57 strains had almost the same alcohol content, acidity, amino acid content, glucose concentration, and extract content concentration, but the 4-VG concentration was significantly reduced.
On the other hand, wild-type homozygous No. 44 strains and No. Compared with the U-01 strain (parent strain), the 51 strains had almost the same alcohol content, acidity, amino acid content, glucose concentration, and extract content concentration, but the 4-VG concentration was increased.
According to the method of the present invention, only 4-VG productivity could be reduced while maintaining the brewing characteristics.
＜PAD1遺伝子配列のホモ接合化＞
親株のＰＡＤ１遺伝子は、野生型のホモ接合型であり、ＦＤＣ１遺伝子が変異型ホモであるＮｏ．５２株も、当然にＰＡＤ１遺伝子は野生型のホモ接合型であった。親株のＰＡＤ１遺伝子は、一塩基多型として１７２番目の塩基がＡとＧである野生型のヘテロ接合型であった。Ｎｏ．５２株では、１７２番目の塩基がＧのみの野生型のホモ接合型になっていた。
<Homozygosity of PAD1 gene sequence>
The PAD1 gene of the parent strain is a wild-type homozygous type, and the FDC1 gene is a mutant homozygous type No. Of course, in the 52 strains, the PAD1 gene was a wild-type homozygous type. The PAD1 gene of the parent strain was a wild-type heterozygous type in which the 172nd base is A and G as a single nucleotide polymorphism. No. In the 52 strain, the 172nd base was a wild-type homozygous type containing only G.
実施例２
清酒酵母であるきょうかい酵母は、一部が欠損している変異型のＦＤＣ１遺伝子しか有さない（ＦＤＣ１伝子が変異型のホモ接合型である）ことが知られている。そこで、きょうかい酵母７号とＵ－０１株（ＦＤＣ１遺伝子が野生型と変異型のヘテロ接合型である）を、ケイ皮酸を含有するＹＰＤ寒天培地にスポットし、３０℃で６日間培養した。ケイ皮酸の最終濃度は、０．１ｍＭ、０．２ｍＭ、０．５ｍＭ、又は1ｍＭとした。
酵母の生育の程度を目視で確認した結果を、表２に示す。
It is known that Kyokai yeast, which is a sake yeast, has only a mutant FDC1 gene in which a part is deleted (the FDC1 gene is a mutant homozygous type). Therefore, Kyokai Yeast No. 7 and U-01 strain (FDC1 gene is a wild-type and mutant heterozygous type) were spotted on a YPD agar medium containing cinnamic acid and cultured at 30 ° C. for 6 days. .. The final concentration of cinnamic acid was 0.1 mM, 0.2 mM, 0.5 mM, or 1 mM.
Table 2 shows the results of visually confirming the degree of yeast growth.
ケイ皮酸濃度が０．１～０．５ｍＭの濃度範囲で、両株の生育に差異があったことから、この濃度範囲できょうかい酵母７号と同等の生育をする株を選択すれば、実施例１のＮｏ．５２株のように変異型ＦＤＣ１遺伝子をホモ接合型で有する株が取得できる可能性がある。
また、０．６～０．９ｍＭのケイ皮酸を含む培地では、きょうかい酵母７号は生育せずに、Ｕ－０１株のみが生育できる可能性がある。従って、０．６ｍＭ以上のケイ皮酸を含む培地で生育せず、０．５ｍＭ以下あるいは含有しない培地で生育するコロニーを選抜すれば（いわゆるネガティブセレクション）、変異型ＦＤＣ１遺伝子をホモ接合型で有する株が得られる可能性が示唆された。
Since there was a difference in the growth of both strains in the concentration range of cinnamic acid concentration of 0.1 to 0.5 mM, if a strain that grows equivalent to yeast No. 7 in this concentration range is selected, Example 1 No. There is a possibility that a strain having a mutant FDC1 gene homozygous, such as 52 strains, can be obtained.
In addition, in a medium containing 0.6 to 0.9 mM cinnamic acid, there is a possibility that only the U-01 strain can grow without growing Kyokai Yeast No. 7. Therefore, if colonies that do not grow in a medium containing 0.6 mM or more of cinnamic acid and grow in a medium containing 0.5 mM or less or not (so-called negative selection) are selected, they have the mutant FDC1 gene in a homozygous manner. It was suggested that a strain could be obtained.
実施例３
実験室酵母株Ｄ４５８－５Ａ（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、ATCC90753）系統株と、きょうかい酵母１００１号系統１倍体株を掛け合わせた、Ｘ株を親株とした。このX株のＦＤＣ１遺伝子の配列をシーケンスしたところ、１６０番目の塩基がＡのままの野生型ＦＤＣ１遺伝子と、同塩基がＴに変わった変異型ＦＤＣ１遺伝子のヘテロ接合型となっていた。
X株を、実施例１と同様にして、ＹＰＤ培地で培養し、培養液をＡＺＣ含有寒天培地に塗布し、培養してＡＺＣ耐性株を単離し、変異株を合計１５株得た。変異株のＦＤＣ１遺伝子をシーケンスして１６０番目の塩基を確認したところ、得られた１５株のうち、1株が変異型ＦＤＣ１遺伝子をホモ接合型に持つもの（Ｎｏ．１株）、３株が野生型ＦＤＣ１遺伝子をホモ接合型に持つものとなっていた。
Example 3
The parent strain was X strain, which was obtained by multiplying the laboratory yeast strain D458-5A (American Type Culture Collection, ATCC90753) strain and the Kyokai yeast 1001 strain haploid strain. When the sequence of the FDC1 gene of this X strain was sequenced, it was found to be a heterozygous type of the wild-type FDC1 gene in which the 160th base remained A and the mutant FDC1 gene in which the same base was changed to T.
The X strain was cultured in YPD medium in the same manner as in Example 1, the culture solution was applied to an AZC-containing agar medium, and the culture was performed to isolate an AZC-resistant strain to obtain a total of 15 mutant strains. When the FDC1 gene of the mutant strain was sequenced and the 160th base was confirmed, one of the 15 strains obtained had the mutant FDC1 gene homozygous (No. 1 strain), and 3 strains were found. It had a wild-type FDC1 gene homozygous.
親株とＮｏ．１株を用いて、実施例１と同様にして、清酒の試験醸造を行った。発酵期間は１９日間とし、上槽後の日本酒度、アルコール度、酸度、アミノ酸度、及び４－ＶＧ濃度を測定した。Ｎｏ．１株は、親株と比較して、アルコール度数（親株１７．３ｖ／ｖ％、Ｎｏ．１株１６．１ｖ／ｖ％）と酸度（親株３．０、Ｎｏ．１株２．６）はほぼ同じであったが、４－ＶＧ濃度は大きく減少した（親株６７８４μｇ／Ｌ、Ｎｏ．１株５５μｇ／Ｌ）。 Parent strain and No. Using one strain, test brewing of sake was carried out in the same manner as in Example 1. The fermentation period was 19 days, and the sake content, alcohol content, acidity, amino acid content, and 4-VG concentration after the upper tank were measured. No. Compared with the parent strain, one strain has almost the same alcohol content (parent strain 17.3 v / v%, No. 1 strain 16.1 v / v%) and acidity (parent strain 3.0, No. 1 strain 2.6). Although it was the same, the 4-VG concentration was significantly reduced (parent strain 6784 μg / L, No. 1 strain 55 μg / L).
実施例４
市販清酒に４－ＶＧを５００ｐｐｂになるよう添加した対照酒と、市販清酒に４－ＶＧを５００ｐｐｂ、バニリンを０．６ｐｐｍ、１．２ｐｐｍ、又は２．０ｐｐｍになるよう添加した試験酒について、熟練した専門パネル７名が香りの官能評価を行った。この市販清酒は地理的表示で言う日本酒の普通酒であり、アルコール度１３．５度、日本酒度１．０、酸度１．２である。標品の４－ＶＧとバニリンは、それぞれ試薬特級グレード相当を使用した。
Example 4
Skilled about the control liquor in which 4-VG was added to 500 ppb to commercial sake and the test liquor to which 4-VG was added to 500 ppb and vanillin was added to 0.6 ppm, 1.2 ppm, or 2.0 ppm in commercial sake. Seven specialized panels performed a sensory evaluation of the scent. This commercial sake is an ordinary sake of sake, which is geographically indicated, and has an alcohol content of 13.5 degrees, a sake content of 1.0, and an acidity of 1.2. The standard 4-VG and vanillin used were equivalent to the reagent special grade, respectively.
評価点は、対照酒と比べてどの程度差があるかを、下記基準で評価して定めた。即ち、４－ＶＧの香りについて対照酒（組成は試験１と同じ）と差がない場合を０点、４－ＶＧの香りがほぼマスキングされた場合を３点とし、その間を３分割して、１点、２点と評価した。さらに、７名の評価点の平均値、標準偏差および分散を求めた。
０点：（バニリンを添加していないものと）４－ＶＧの香りに差はない。
１点：４－ＶＧの香りが少しマスキングされたと感じる
２点：４－ＶＧの香りがややマスキングされたと感じる
３点：４－ＶＧの香りがほぼマスキングされたと感じる
The evaluation points were determined by evaluating the difference from the control liquor according to the following criteria. That is, 0 points were given when the aroma of 4-VG was not different from that of the control liquor (the composition was the same as in Test 1), and 3 points were given when the aroma of 4-VG was almost masked. It was evaluated as 1 point and 2 points. Furthermore, the mean value, standard deviation and variance of the evaluation points of the seven subjects were obtained.
0 points: There is no difference in the scent of 4-VG (from the one without vanillin added).
1 point: I feel that the scent of 4-VG is slightly masked 2 points: I feel that the scent of 4-VG is slightly masked 3 points: I feel that the scent of 4-VG is almost masked
結果を表３に示す。
本発明の４-ＶＧ低生産酵母株の製造方法によれば、実験室酵母や自然界からの分離株などを４-ＶＧ低生産株にすることができるため、酵母株の育種の研究に寄与することができる。 According to the method for producing a 4-VG low-producing yeast strain of the present invention, laboratory yeast and isolates from the natural world can be made into 4-VG low-producing yeast strains, which contributes to research on breeding yeast strains. be able to.
Claims (6)
（１） 親株としてケイ皮酸アナログの濃度０．１ｍＭ以上の条件下でケイ皮酸アナログに耐性を示す株を用い、そのケイ皮酸アナログの濃度０．０５ｍＭ以下の条件下で増殖すること
（２） 親株としてケイ皮酸アナログの濃度０．５ｍＭ以上の条件下でケイ皮酸アナログに耐性を示す株を用い、そのケイ皮酸アナログの濃度０．４ｍＭ、０．２ｍＭ、又は０．０５ｍＭ以下の条件下で増殖すること
（３） 親株としてケイ皮酸アナログの濃度０．６ｍＭ又は０．８ｍＭ以上の条件下でケイ皮酸アナログに耐性を示す株を用い、そのケイ皮酸アナログの濃度０．５ｍＭ、０．４ｍＭ、０．２ｍＭ、又は０．０５ｍＭ以下の条件下で増殖すること The production method according to claim 1 or 2, wherein a strain having the above-mentioned mutant gene in a homozygous form is selected using any of the following (1) to (3) as an index.
(1) As a parent strain, a strain exhibiting resistance to cinnamic acid analog under the condition of cinnamic acid analog concentration of 0.1 mM or more is used, and the strain is grown under the condition of the cinnamic acid analog concentration of 0.05 mM or less (1). 2) As the parent strain, a strain exhibiting resistance to cinnamic acid analog under the condition of cinnamic acid analog concentration of 0.5 mM or more is used, and the cinnamic acid analog concentration is 0.4 mM, 0.2 mM, or 0.05 mM or less. (3) As a parent strain, a strain exhibiting resistance to cinnamic acid analog under the conditions of 0.6 mM or 0.8 mM or more of cinnamic acid analog is used, and the concentration of cinnamic acid analog is 0. Proliferate under conditions of .5 mM, 0.4 mM, 0.2 mM, or 0.05 mM or less
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