JP6099393B2 - Autotaxin isoform-specific antibody and detection method - Google Patents
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Description
本発明はオートタキシンアイソフォームを特異的に認識する抗体および前記抗体を用いたオートタキシンアイソフォームの特異的検出方法に関する。 The present invention relates to an antibody that specifically recognizes an autotaxin isoform and a method for specifically detecting an autotaxin isoform using the antibody.
ヒトオートタキシンは、１９９２年Ｍ．Ｌ．ＳｔｒａｃｋｅらによってＡ２０５８ヒト黒色腫細胞培養培地から細胞運動性を惹起する物質として単離された分子量約１２５ＫＤａの糖蛋白質である（非特許文献１）。オートタキシンはそのリゾホスホリパーゼＤ活性によりリゾホスファチジルコリンを基質としリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）を産生する。生体内ではＬＰＡが癌の増殖、転移に関与していることが多くの研究者により示され（非特許文献２から４）、その産生酵素であるオートタキシンと様々な疾病との因果関係が研究されている。最近になり、ヒトオートタキシンを定量する手法が確立され（特許文献１、非特許文献５）、様々な疾患の診断マーカーとして期待されている。 Human autotaxin was developed in 1992 by M.M. L. It is a glycoprotein having a molecular weight of about 125 KDa isolated by Stracke et al. As a substance that induces cell motility from A2058 human melanoma cell culture medium (Non-patent Document 1). Autotaxin produces lysophosphatidic acid (LPA) using lysophosphatidylcholine as a substrate due to its lysophospholipase D activity. Many researchers have shown that LPA is involved in cancer growth and metastasis in vivo (Non-Patent Documents 2 to 4), and the causal relationship between autotaxin, which is its production enzyme, and various diseases has been studied. Has been. Recently, a method for quantifying human autotaxin has been established (Patent Document 1, Non-Patent Document 5), and is expected as a diagnostic marker for various diseases.
オートタキシンにはいくつかのアイソフォーム（ｉｓｏｆｏｒｍ、構造は異なるが同じ機能をもつタンパク質）があることが知られている。一例として、スプライシングバリアントα、β、γ、δ、εが遺伝子として同定されているオートタキシンアイソフォームα、β、γ、δ、ε（以下ＡＴＸα、β、γ、δ、εと略す）がある（非特許文献６、７）。前記アイソフォームのアミノ酸配列の相同性を確認した結果、ＡＴＸα、β、γはＬ２リンカー領域でＶａｌ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ（配列番号１）を有し、ＡＴＸδ、εはＬ２リンカー領域で配列番号１のアミノ酸配列を欠損していることが明らかとなっている（非特許文献７）。また、ＨＥＫ２９３細胞でこれら５つのアイソフォームの一過性発現が確認されている（非特許文献７）。ＡＴＸδはＡＴＸβに次いで主要なアイソフォームであり、ＡＴＸβに類似した生化学的性質をもつ（非特許文献７）。 Autotaxin is known to have several isoforms (isoforms, proteins with different structures but the same function). As an example, there are autotaxin isoforms α, β, γ, δ, and ε (hereinafter abbreviated as ATXα, β, γ, δ, and ε) in which splicing variants α, β, γ, δ, and ε are identified as genes. (Non-Patent Documents 6 and 7). As a result of confirming the homology of the amino acid sequences of the isoforms, ATXα, β, γ have Val-Glu-Pro-Lys (SEQ ID NO: 1) in the L2 linker region, and ATXδ, ε have SEQ ID NO: in the L2 linker region. It is clear that the amino acid sequence of 1 is missing (Non-patent Document 7). In addition, transient expression of these five isoforms has been confirmed in HEK293 cells (Non-patent Document 7). ATXδ is the major isoform after ATXβ and has biochemical properties similar to ATXβ (Non-patent Document 7).
オートタキシンの測定に関しては、特許文献１にて、ヒト血清等ヒト検体中のオートタキシン濃度を簡便、短時間、かつ信頼性高く定量可能な方法が開示されており、その方法により各種疾患の診断が可能となっている。しかしながら、特許文献１の方法は、ヒトオートタキシン全量を定量する方法であり、オートタキシンアイソフォームを特異的に検出するのは困難である。 Regarding the measurement of autotaxin, Patent Document 1 discloses a method capable of quantifying autotaxin concentration in a human sample such as human serum easily, in a short time, and with high reliability. Is possible. However, the method of Patent Document 1 is a method for quantifying the total amount of human autotaxin, and it is difficult to specifically detect autotaxin isoforms.
そこで本発明は、オートタキシンの測定であって、特定のアイソフォームを検出可能な測定方法を提供することを目的とする。 Therefore, an object of the present invention is to provide a measuring method for measuring autotaxin and capable of detecting a specific isoform.
本発明は、オートタキシンを含む試料中から、配列番号６からなるアミノ酸配列を含むオートタキシン（例えばＡＴＸδ、ε）を特異的に検出する抗体を提供するものである。さらに前記抗体を用いた、簡便かつ短時間で配列番号６からなるアミノ酸配列を含むオートタキシン（例えばＡＴＸδ、ε）を定量可能な測定法および測定試薬も提供する。 The present invention provides an antibody that specifically detects autotaxin (for example, ATXδ, ε) containing an amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 6 from a sample containing autotaxin. Furthermore, a measurement method and a measurement reagent that can quantify autotaxin (for example, ATXδ, ε) containing the amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 6 using the above antibody in a simple and short time are also provided.
より具体的に、上記課題に鑑みてなされた本発明は、以下の態様を包含する：
（１）オートタキシンを認識する抗体であって、
Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ（配列番号６）からなるアミノ酸配列を含むオートタキシンを特異的に認識し、
Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ（配列番号５）からなるアミノ酸配列を含むオートタキシンを認識しない、
ことを特徴とする抗体。
（２）前記抗体がモノクローナル抗体である（１）に記載の抗体。
（３）前記オートタキシンがヒトオートタキシンである、（１）または（２）に記載の抗体。
（４）前記モノクローナル抗体が、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と、配列番号３に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とを有する抗体である、（２）または（３）記載の抗体。
（５）上述の（１）〜（４）のいずれか１項に記載の抗体を用いて、配列番号６からなるアミノ酸配列を含むオートタキシンを特異的に検出する方法。
（６）上述の（１）〜（４）のいずれか１項に記載の抗体と、
オートタキシンのアミノ酸配列のうち、配列番号６からなるアミノ酸配列以外の領域を認識する抗体と、
を用いて、サンドイッチイッムノアッセイにより、配列番号６からなるアミノ酸配列を含むオートタキシンを検出する方法。
（７）上述の（１）〜（４）のいずれか１項に記載の抗体と、
オートタキシンのアミノ酸配列のうち、配列番号６からなるアミノ酸配列以外の領域を認識する抗体と、
を含む、サンドイッチイッムノアッセイによりオートタキシンを検出する試薬。
More specifically, the present invention made in view of the above problems includes the following aspects:
(1) An antibody that recognizes autotaxin,
Autotaxin specifically comprising an amino acid sequence consisting of Cys-Asp-Asp-Lys-Asn-Lys-Leu-Asp-Glu-Leu-Asn-Lys-Arg-Leu (SEQ ID NO: 6);
Recognizes autotaxin containing an amino acid sequence consisting of Cys-Asp-Asp-Lys-Val-Glu-Pro-Lys-Asn-Lys-Leu-Asp-Glu-Leu-Asn-Lys-Arg-Leu (SEQ ID NO: 5) do not do,
An antibody characterized by the above.
(2) The antibody according to (1), wherein the antibody is a monoclonal antibody.
(3) The antibody according to (1) or (2), wherein the autotaxin is human autotaxin.
(4) The monoclonal antibody is an antibody having a heavy chain variable region consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 and a light chain variable region consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3, (2) or ( 3) The antibody described.
(5) A method for specifically detecting autotaxin comprising the amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 6 using the antibody according to any one of (1) to (4) above.
(6) The antibody according to any one of (1) to (4) above,
An antibody that recognizes a region other than the amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 6 among the amino acid sequences of autotaxin;
A method for detecting autotaxin comprising the amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 6 by sandwich immunoassay using
(7) The antibody according to any one of (1) to (4) above,
An antibody that recognizes a region other than the amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 6 among the amino acid sequences of autotaxin;
A reagent for detecting autotaxin by sandwich immunoassay.
本発明の抗体は、オートタキシンを含む試料中から、配列番号６からなるアミノ酸配列を含むオートタキシン（例えばＡＴＸδ、ε）を特異的に検出することができる。さらに本発明の検出方法及び検出試薬は、前記抗体を用いて、簡便かつ短時間で配列番号６からなるアミノ酸配列を含むオートタキシン（例えばＡＴＸδ、ε）を定量することができる。 The antibody of the present invention can specifically detect autotaxin (for example, ATXδ, ε) containing an amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 6 from a sample containing autotaxin. Furthermore, the detection method and detection reagent of the present invention can quantify autotaxin (for example, ATXδ, ε) containing the amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 6 simply and in a short time using the antibody.
これまで行なわれてきたオートタキシンの測定は、配列番号６や５からなるアミノ酸配列の存在にかかわらず、オートタキシンの全量を定量しており（特許文献１）、その値から臨床的有用性を評価してきたが、本発明の検出方法及び検出試薬を用いて、これまで明らかにされていない各種疾患との関連性を検証することで、オートタキシンアイソフォームによる新たな疾患の診断等も期待できる。 In the autotaxin measurement performed so far, the total amount of autotaxin is quantified regardless of the presence of the amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 6 or 5 (Patent Document 1). Although it has been evaluated, by using the detection method and detection reagent of the present invention to verify the relevance to various diseases that have not been clarified so far, it can be expected to diagnose new diseases by autotaxin isoforms, etc. .
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の抗体は、オートタキシンのアミノ酸配列のうち、ヒトＡＴＸδ、ε上に存在するアミノ酸配列Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ（配列番号６）からなるアミノ酸配列を含むオートタキシンを特異的に認識し、ヒトＡＴＸα、β、γ上に存在するアミノ酸配列Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ（配列番号５）からなるアミノ酸配列を含むオートタキシンを認識しないことを特徴としている。血液中に存在する自然状態のＡＴＸδ、εを検出するためには、自然状態での立体構造を認識する抗体が必要であるが、本発明の抗体は、前記自然状態のＡＴＸδ、εとの結合能を有する。そのため、本発明の抗体は、血清からのＡＴＸδ、εの吸収や酵素免疫測定法などによる血清診断にも用いることができる。
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
The antibody of the present invention comprises the amino acid sequence Cys-Asp-Asp-Lys-Asn-Lys-Leu-Asp-Glu-Leu-Asn-Lys-Arg- present on human ATXδ, ε among the amino acid sequences of autotaxin. An amino acid sequence Cys-Asp-Asp-Lys-Val-Glu-Pro-Lys-Asn that specifically recognizes autotaxin comprising an amino acid sequence consisting of Leu (SEQ ID NO: 6) and exists on human ATX α, β, γ It is characterized by not recognizing autotaxin containing an amino acid sequence consisting of -Lys-Leu-Asp-Glu-Leu-Asn-Lys-Arg-Leu (SEQ ID NO: 5). In order to detect natural state ATXδ, ε present in blood, an antibody that recognizes the three-dimensional structure in the natural state is necessary. The antibody of the present invention binds to the natural state ATXδ, ε. Have the ability. Therefore, the antibody of the present invention can also be used for serum diagnosis by absorption of ATXδ, ε from serum or enzyme immunoassay.
本発明の抗体は、動物を免疫して得た血清から得られたポリクローナル抗体であってもよいし、又はモノクローナル抗体のいずれであってもよく、好ましくはモノクローナル抗体である。モノクローナル抗体としては、ハイブリドーマにより生産される抗体、抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した形質転換体により生産される遺伝子組換え抗体、それらの抗体断片などを挙げることができる。抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体（ｓｃＦＶ）、二量化Ｖ領域断片（ｄｉａｂｏｄｙ）などが挙げられる。 The antibody of the present invention may be a polyclonal antibody obtained from serum obtained by immunizing an animal, or may be a monoclonal antibody, preferably a monoclonal antibody. Examples of monoclonal antibodies include antibodies produced by hybridomas, recombinant antibodies produced by transformants transformed with expression vectors containing antibody genes, and antibody fragments thereof. Examples of antibody fragments include Fab, Fab ', F (ab') 2, single chain antibody (scFV), dimerized V region fragment (diabody), and the like.
本発明の抗体は、Ｃｙｓ-Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ、配列番号６）からなるアミノ酸配列を含むペプチドをマウス、ラット、ウサギ等の動物に免疫することにより取得することができる。ポリクローナル抗体については、このようにして取得した抗体のうち、Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ（配列番号５）に結合しない抗体を、公知の方法で取得すればよい。例えば、配列番号５のペプチドを結合したカラムや担体を用いて、かかるペプチドに結合する抗体を除去することにより、本発明に係る配列番号６であらわされるアミノ酸配列を含むオートタキシンを特異的に認識する抗体を取得することができる。なお、取得した抗体が特異的結合性を有する限りにおいて、配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるオリゴペプチドから、１アミノ酸から数アミノ酸の付加および／または欠損および／または他のアミノ酸への置換が生じてもよい。 The antibody of the present invention comprises a mouse, rat, peptide containing an amino acid sequence consisting of Cys-Asp-Asp-Lys-Asn-Lys-Leu-Asp-Glu-Leu-Asn-Lys-Arg-Leu, SEQ ID NO: 6). It can be obtained by immunizing animals such as rabbits. As for polyclonal antibodies, among the antibodies thus obtained, Cys-Asp-Asp-Lys-Val-Glu-Pro-Lys-Asn-Lys-Leu-Asp-Glu-Leu-Asn-Lys-Arg-Leu-Leu An antibody that does not bind to (SEQ ID NO: 5) may be obtained by a known method. For example, by using a column or carrier bound to the peptide of SEQ ID NO: 5 and removing the antibody that binds to the peptide, autotaxin containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 according to the present invention is specifically recognized. Antibodies can be obtained. In addition, as long as the obtained antibody has specific binding properties, addition and / or deletion of one amino acid to several amino acids and / or substitution with other amino acids from the oligopeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6 May occur.
ここで、配列番号６のアミノ酸配列は、ヒトＡＴＸβ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＢ００８５５．１）の配列番号４の５６９番目〜５８６番目までのアミノ酸からなるオリゴペプチド（Ｃｙｓ-Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ、配列番号５）から、５番目のバリン〜８番目のリジンまでのアミノ酸（すなわち、配列番号１からなるアミノ酸配列）を欠損させたオリゴペプチドに相当する。 Here, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 is an oligopeptide (Cys-Asp-Asp-Lys-Val-Glu-) consisting of amino acids 569 to 586 of SEQ ID NO: 4 of human ATXβ (GenBank: AAB00855.1). Pro-Lys-Asn-Lys-Leu-Asp-Glu-Leu-Asn-Lys-Arg-Leu, SEQ ID NO: 5) to 5th valine to 8th lysine (ie consisting of SEQ ID NO: 1) It corresponds to an oligopeptide deficient in (amino acid sequence).
本発明の抗体の具体例として、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と配列番号３に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とを有する抗体が挙げられる。なお、前記重鎖可変領域および／または前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号６からなるアミノ酸配列を含むオートタキシンへの特異的認識能を有する限り、１アミノ酸から数アミノ酸の付加および／または欠損および／または他のアミノ酸への置換が生じてもよい。配列番号６からなるアミノ酸配列を含むオートタキシンへの特異的認識能を維持する観点から、１または数アミノ酸の付加、欠損および／または置換は、相補性決定領域（ＣＤＲ）ではなく、フレームワーク領域（ＦＲ）に生じることが好ましいが、ＣＤＲに生じる場合もある。 Specific examples of the antibody of the present invention include an antibody having a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 and a light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3. As long as the amino acid sequence of the heavy chain variable region and / or the light chain variable region has a specific recognition ability for autotaxin including the amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 6, addition of one amino acid to several amino acids and / or Alternatively, deletions and / or substitutions with other amino acids may occur. From the viewpoint of maintaining specific recognition ability to autotaxin comprising the amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 6, addition, deletion and / or substitution of one or several amino acids is not a complementarity determining region (CDR) but a framework region (FR) preferably occurs, but sometimes occurs in CDR.
本発明の配列番号６からなるアミノ酸配列を含むオートタキシンを特異的に検出する方法は、本発明の抗体を使用した任意の検出方法であってよく、好ましくは、前処理等を必要とすることなく、配列番号６からなるアミノ酸配列を含むオートタキシン、例えばＡＴＸδ、εを特異的に検出可能な方法である。本発明の検出方法の具体例として、ウエスタンブロッティング、組織染色など一般的な免疫学的手法が挙げられる。また、本発明の抗体と、オートタキシンのアミノ酸配列のうち配列番号６からなるアミノ酸配列以外の領域を認識する抗体とを含むオートタキシン測定試薬を用いることで、配列番号６からなるアミノ酸配列を含むオートタキシン、例えばＡＴＸδ、εをサンドイッチイムノアッセイにより特異的に検出することができる。 The method for specifically detecting autotaxin comprising the amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 6 of the present invention may be any detection method using the antibody of the present invention, and preferably requires pretreatment and the like. And autotaxin containing the amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 6, such as ATXδ, ε, can be specifically detected. Specific examples of the detection method of the present invention include general immunological techniques such as Western blotting and tissue staining. Further, by using an autotaxin measuring reagent containing the antibody of the present invention and an antibody that recognizes a region other than the amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 6 among the amino acid sequences of autotaxin, the amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 6 is included. Autotaxin such as ATXδ, ε can be specifically detected by sandwich immunoassay.
本明細書において「特異的抗体」とは、目的の抗原以外には実質的に結合しないことをいう。すなわち、「Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ（配列番号６）からなるアミノ酸配列を含むオートタキシンを特異的に認識する抗体」とは、配列番号６からなるアミノ酸配列を含むオートタキシンには結合するものの、配列番号６からなるアミノ酸配列を含まないオートタキシンに対しては結合しないか、または、配列番号６からなるアミノ酸配列を含まないオートタキシンに比べて配列番号６からなるアミノ酸配列を含むオートタキシンへの結合性が、１００倍以上、好ましくは１０００倍以上、更に好ましくは１００００倍以上である抗オートタキシン抗体のことをいう。 As used herein, “specific antibody” refers to substantially not binding other than the antigen of interest. That is, an antibody that specifically recognizes autotaxin comprising an amino acid sequence consisting of “Cys-Asp-Asp-Lys-Asn-Lys-Leu-Asp-Glu-Leu-Asn-Lys-Arg-Leu (SEQ ID NO: 6) "Is bound to autotaxin containing the amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 6, but does not bind to autotaxin not containing the amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 6, or is an amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 6". An anti-autotaxin antibody having a binding ability to an autotaxin comprising the amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 6 of 100 times or more, preferably 1000 times or more, and more preferably 10,000 times or more compared to an autotaxin not containing Say.
以下に実施例を示すが、本発明は実施例に記載された例に限られるものではない。なお、以下の実験例で使用したヒト検体は、インフォームドコンセントのもと採血された検体を用い実施した。 Examples are shown below, but the present invention is not limited to the examples described in the Examples. In addition, the human sample used in the following experimental examples was carried out using a sample collected under informed consent.
実施例１：抗原ペプチドの調製
（１）ヒトＡＴＸβ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＢ００８５５．１）の配列番号４の５６９番目から５８６番目までのアミノ酸からなるオリゴペプチド（Ｃｙｓ-Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ、配列番号５）から５番目のバリンから８番目のリジンまでのアミノ酸（すなわち、配列番号１からなるアミノ酸配列）を欠損させたオリゴペプチド（Ｃｙｓ-Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ、配列番号６）を定法に従い合成した。
（２）合成したペプチドをＩｍｊｅｃｔ Ｋｅｙｈｏｌｅ Ｌｉｍｐｅｔ Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ（ＰＩＥＲＣＥ社；品番７７１５３）を用い、プロトコールに従って、スカシ貝ヘモシアニンにコンジュゲーションすることで免疫抗原を作製した。
（３）配列番号５からなるオリゴペプチド、および配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるオリゴペプチドのうち、５番目のバリンから８番目のリジンまでのアミノ酸（すなわち、配列番号１からなるアミノ酸配列）を欠損させたオリゴペプチド（Ｃｙｓ-Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ、配列番号６）を、Ｉｍｊｅｃｔ Ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ（ＰＩＥＲＣＥ社；品番７７１７１）を用い、プロトコールに従って、コンジュゲーションすることでペプチド−ＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）を作製し、これをスクリーニング用抗原とした。
Example 1 Preparation of Antigen Peptide (1) Oligopeptide (Cys-Asp-Asp-Lys-Val-Glu-) consisting of amino acids 569 to 586 of SEQ ID NO: 4 of human ATXβ (GenBank: AAB00855.1) Pro-Lys-Asn-Lys-Leu-Asp-Glu-Leu-Asn-Lys-Arg-Leu, SEQ ID NO: 5) to 5th valine to 8th lysine (ie, amino acid consisting of SEQ ID NO: 1) An oligopeptide (Cys-Asp-Asp-Lys-Asn-Lys-Leu-Asp-Glu-Leu-Asn-Lys-Arg-Leu, SEQ ID NO: 6) lacking the sequence) was synthesized according to a standard method.
(2) An immunoantigen was prepared by conjugating the synthesized peptide to scallop hemocyanin according to the protocol using Image Keyhole Limet Hemocyanin (PIERCE; product number 77153).
(3) Of the oligopeptide consisting of SEQ ID NO: 5 and the oligopeptide consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 5, the amino acids from the fifth valine to the eighth lysine (that is, the amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 1) Oligopeptide (Cys-Asp-Asp-Lys-Asn-Lys-Leu-Asp-Glu-Leu-Asn-Lys-Arg-Leu, SEQ ID NO: 6) was deleted from Image Bovine serum albumin (PIERCE; product number) 77171) and peptide-BSA (Bovine serum albumin) was prepared by conjugation according to the protocol, and this was used as an antigen for screening.
実施例２：組み換えタンパク質の調製
組み換えタンパク質への反応性確認のため、特許文献１に記載の方法に従い、スクリーニング用組み換えタンパク質を調製した。具体的な方法を以下に示す。
（１）Ａｕｔｏｔａｘｉｎ−ｔ（Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｌ４６７２０）のうち、塩基番号６０番目から２６４８番目までのヌクレオチドからなるｃＤＮＡ（配列番号７）をバキュロウイルス用トランスファーベクターｐＦＡＳＴＢａｃ−ＨＴ（インビトロジェン）に導入し、プロトコールに従い、ポリヒスチジンを付加した、配列番号１からなるアミノ酸配列を含むオートタキシン（ＡＴＸβ）発現用バキュロウイルスプラスミドを調製した。
（２）ポリヒスチジンを付加した、配列番号１からなるアミノ酸を含まないオートタキシン（ＡＴＸδ）発現用プラスミドとして、（１）で作製したプラスミドを鋳型として、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（東洋紡績）を用いて、配列番号７からなるポリヌクレオチドのうち１７１７番目から１７２８番目のヌクレオチド（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｌ４６７２９の１７７６番目から１７８７番目までのヌクレオチドに相当）を欠損したポリヌクレオチド（配列番号８）を含むプラスミドを調製した。
（３）（１）および（２）で作製したプラスミドを用い、Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃシステム（インビトロジェン）にて組換えバキュロウイルスを調製した。
（４）（３）で調製したバキュロウイルスを用いて、定法に従い、ｓｆ９昆虫細胞に感染させることにより、ＡＴＸβまたはＡＴＸδを含む培養上清を調製した。
（５）発現タンパク質の精製を特開２０１１−０３７８０２号公報に従い実施した。具体的には以下に示す方法で実施した。
（５−１）抗オートタキシンモノクローナル抗体Ｒ１０．７（特許文献１）をＨｉＴｒａｐ ＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＨＰカラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）に結合させ、ＡＴＸβあるいはＡＴＸδ発現培養上清を前記カラムにロードした。
（５−２）ＴＢＳ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で十分洗浄を行った。
（５−３）１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）により結合したＡＴＸβあるいはＡＴＸδを溶出した。
Example 2: Preparation of recombinant protein In order to confirm the reactivity to the recombinant protein, a recombinant protein for screening was prepared according to the method described in Patent Document 1. A specific method is shown below.
(1) cDNA (SEQ ID NO: 7) consisting of nucleotides from the 60th to 2648th nucleotides of Autotaxin-t (Genbank accession number L46720) is introduced into a baculovirus transfer vector pFASTBac-HT (Invitrogen). Then, a baculovirus plasmid for autotaxin (ATXβ) expression containing an amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 1 to which polyhistidine was added was prepared.
(2) A polyhistidine-added autotaxin (ATXδ) expression plasmid containing no amino acid consisting of SEQ ID NO: 1, and using the plasmid prepared in (1) as a template, KOD-Plus-Mutageness Kit (Toyobo) A plasmid containing a polynucleotide (SEQ ID NO: 8) lacking the nucleotides 1717 to 1728 (corresponding to nucleotides 1776 to 1787 of GenBank No. L46729) of the polynucleotide consisting of SEQ ID NO: 7 Prepared.
(3) Using the plasmid prepared in (1) and (2), a recombinant baculovirus was prepared using the Bac-to-Bac system (Invitrogen).
(4) A culture supernatant containing ATXβ or ATXδ was prepared by infecting sf9 insect cells with the baculovirus prepared in (3) according to a conventional method.
(5) Purification of the expressed protein was performed according to Japanese Patent Application Laid-Open No. 2011-037802. Specifically, the following method was used.
(5-1) Anti-autotaxin monoclonal antibody R10.7 (Patent Document 1) was bound to a HiTrap NHS-activated HP column (GE Healthcare Bioscience), and ATXβ or ATXδ expression culture supernatant was loaded onto the column.
(5-2) Thorough washing was performed with TBS (10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7.4).
(5-3) The bound ATXβ or ATXδ was eluted with 100 mM citrate buffer (pH 5.0).
実施例３ モノクローナル抗体作製
（１）ＷＫＹ・ラット７週齢メスに対し、実施例１（２）において調製した免疫抗原２５０μｇをフロイント完全アジュバント（ＤＩＦＣＯ）と共に、エーテル麻酔下で後足に免疫を行なった。
（２）１カ月後、ラットより鼠頚リンパ節および腸骨リンパ節を採取し、Ｂ細胞を回収した。
（３）マウスミエローマ細胞株ＰＡＩとポリエチレングリコール存在下、定法に従い、細胞融合を行い、約１０日間のＨＡＴ培地による選択を行った。
（４）実施例１で作製したスクリーニング用ペプチド−ＢＳＡコンジュゲート抗原を用い配列番号６のオリゴペプチド−ＢＳＡと反応性を示し、かつ配列番号５のオリゴペプチド−ＢＳＡと反応性を示さないクローンを選択した。具体的には、下記に示す方法で実施した。
（４−１）ペプチド−ＢＳＡコンジュゲート抗原（配列番号６のオリゴペプチド−ＢＳＡ、又は配列番号５のオリゴペプチド−ＢＳＡ）５０ｎｇ（１μｇ／ｍＬ溶液５０μL）をＴＢＳにより希釈し９６穴イムノプレート（ＭａｘｉＳｏｒｐ、Ｎａｌｇｅ ＮＵＮＣ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、品番：４３０３４１）に添加し、４℃にて一昼夜保存、コーティングした。
（４−２）続いてＴＢＳにより３回の洗浄後、３％−ＢＳＡを含むＴＢＳ溶液を２５０μＬ／ウェルにて各ウェルに添加し、室温で２時間放置した。
（４−３）ＴＢＳにより３回洗浄を行い、ハイブリドーマ細胞の培養上清を５０μＬ／ウェルにて添加し、室温で２時間放置した。
（４−４）ＴＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＴＢＳ）により６回洗浄を行なった後、ＨＲＰ標識抗ラットイムノグロブリン抗体（５０００倍希釈、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｑｕａｌｅｘ）および１％ ＢＳＡを含むＴＢＳＴを５０μＬ／ウェルにて添加し、室温で２時間放置した。
（４−５）ＴＢＳＴにより６回洗浄を行ない、続いてＴＭＢ基質（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ＆ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、品番：５０−７６−００）を５０μｌ／ウェルで添加し室温１０分放置した。
（４−６）１Ｍリン酸にて反応を停止しＯＤ４５０の吸光度を測定し、目的のクローンを選択した。
（４−７）スクリーニング陽性ウェル中の細胞を限界希釈法によりモノクローナル化を行いハイブリドーマとして樹立した。
（５）得られたハイブリドーマを、ＨＴ培地により約１０日間の培養を行った後、最終的にハイブリドーマ用培地により培養を続けた。ハイブリドーマ細胞培養培地は、ＧＩＴ培地（大日本住友製薬）５００ｍＬに対し、ＮＣＴＣ−１０９培地（インビトロジェン）２７．５ｍＬ、不必須アミノ酸（インビトロジェン）５．５ｍＬ、ペニシリン／ストレプトマイシン／グルタミン酸（インビトロジェン）５．５ｍＬをろ過滅菌し添加したものを用いた。また、前記培地にＨＡＴ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＨＹＢＲＹＭＡＸ、品番：Ｈ０２６２）を添加したものをＨＡＴ培地として、ＨＴ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＨＹＢＲＹＭＡＸ、品番：Ｈ０１３７）を添加したものをＨＴ培地としてそれぞれ用いた。
（６）培養上清を回収し、抗体ＡＴＸＲ４−１２７を回収した。
Example 3 Production of Monoclonal Antibody (1) A WKY rat 7 week old female was immunized with 250 μg of the immunizing antigen prepared in Example 1 (2) together with Freund's complete adjuvant (DIFCO) in ether under anesthesia. It was.
(2) One month later, cervical lymph nodes and iliac lymph nodes were collected from rats, and B cells were collected.
(3) Cell fusion was performed according to a conventional method in the presence of mouse myeloma cell line PAI and polyethylene glycol, and selection was carried out using a HAT medium for about 10 days.
(4) Using the screening peptide-BSA conjugate antigen prepared in Example 1, a clone showing reactivity with the oligopeptide-BSA of SEQ ID NO: 6 and not reactive with the oligopeptide-BSA of SEQ ID NO: 5 Selected. Specifically, the following method was used.
(4-1) Peptide-BSA conjugate antigen (oligopeptide-BSA of SEQ ID NO: 6 or oligopeptide-BSA of SEQ ID NO: 5) 50 ng (1 μg / mL solution 50 μL) was diluted with TBS, and 96-well immunoplate (MaxiSorp , Nalge NUNC International, product number: 430341), and stored at 4 ° C. overnight for coating.
(4-2) Subsequently, after washing three times with TBS, a TBS solution containing 3% -BSA was added to each well at 250 μL / well and left at room temperature for 2 hours.
(4-3) The cells were washed 3 times with TBS, and the culture supernatant of the hybridoma cells was added at 50 μL / well and left at room temperature for 2 hours.
(4-4) After washing 6 times with TBST (TBS containing 0.05% Tween 20), 50 μL of TBST containing HRP-labeled anti-rat immunoglobulin antibody (5000-fold diluted, American Qualex) and 1% BSA Per well and left at room temperature for 2 hours.
(4-5) Washing was carried out 6 times with TBST, then TMB substrate (Kirkegaard & Perry Laboratories, product number: 50-76-00) was added at 50 μl / well and allowed to stand at room temperature for 10 minutes.
(4-6) The reaction was stopped with 1M phosphoric acid, the absorbance of OD450 was measured, and the target clone was selected.
(4-7) Cells in the screening positive wells were monoclonalized by the limiting dilution method and established as hybridomas.
(5) The obtained hybridoma was cultured in an HT medium for about 10 days, and finally cultured in a hybridoma medium. Hybridoma cell culture medium is 500 mL of GIT medium (Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.), 27.5 mL of NCTC-109 medium (Invitrogen), 5.5 mL of nonessential amino acid (Invitrogen), 5.5 mL of penicillin / streptomycin / glutamic acid (Invitrogen). Was added after sterilizing by filtration. Moreover, what added HAT (Sigma-Aldrich, HYBRYMAX, product number: H0262) to the said culture medium was used as HAT culture medium, and what added HT (Sigma-Aldrich, HYBRYMAX, product number: H0137) was used as HT culture medium, respectively.
(6) The culture supernatant was recovered, and the antibody ATXR4-127 was recovered.
実施例４ モノクローナル抗体ＡＴＸＲ４−１２７の遺伝子配列
実施例３にて取得したモノクローナル抗体ＡＴＸＲ４−１２７の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の遺伝子配列を決定した。
（１−１）重鎖遺伝子の増幅は、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉキット（ＱＩＡＧＥＮ）にてｔｏｔａｌ ＲＮＡを回収した後、Ｏｎｅ−ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲキット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用しプロトコールに従い実施した。ＰＣＲプライマーは、５’−ｇｃｔｃｔｔｃｃｔｔｔｔａｔｃ−３’（配列番号９、ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｌ２２６５４．１の８６から１００番目を参考に設計）および５’−ｇｔｃａｃｇｇｔｇａｃｔｇｇｃｔｃａ−３’（配列番号１０、ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｌ２２６５２の５８８から６０５番目の塩基の相補鎖に相当）の組み合わせを用いた。
（１−２）（１−１）で得られた２種類のＰＣＲ産物を回収し、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１０（アプライドバイオシステムズ）にてそれぞれシークエンスにより塩基配列を取得後、重鎖可変領域のヌクレオチド配列を決定した（配列番号１３）。配列番号１３の情報を基に翻訳した、重鎖可変領域のアミノ酸配列を配列番号２に示す。
（２−１）軽鎖遺伝子の増幅は、重鎖と同様に回収したｔｏｔａｌ ＲＮＡを用いＯｎｅ−ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲキットを使用しプロトコールに従い実施した。ＰＣＲプライマーは、５’−ｃｔｃｃｔｇｇｋｔｔｔｇｔｔｇｃｔ−３’（配列番号１１、ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＢＣ０８８２５５の３０から４６番目の塩基に相当）および５’−ｔｇｇａｔｇｇｔｇｇｇａａｇａｔ−３’（配列番号１２、ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＢＣ０８８２５５の４２０から４３５番目の塩基の相補鎖に相当）の組み合わせを用いた。
（２−２）（２−１）で得られたＰＣＲ産物を重鎖と同様にシークエンスし塩基配列を決定した（配列番号１４）。配列番号１４の情報を基に翻訳した、軽鎖可変領域のアミノ酸配列を配列番号３に示す。
Example 4 Gene Sequence of Monoclonal Antibody ATXR4-127 The gene sequence of the heavy chain variable region and the light chain variable region of the monoclonal antibody ATXR4-127 obtained in Example 3 was determined.
(1-1) Amplification of the heavy chain gene was carried out according to the protocol using the One-step RT-PCR kit (QIAGEN) after recovering the total RNA with the RNeasy Mini kit (QIAGEN). PCR primers were 5′-gctcttccttttac-3 ′ (SEQ ID NO: 9, GenBank No. L2262654.1, designed with reference to the 86th to 100th positions) and 5′-gtcacgggtggtggctca-3 ′ (SEQ ID NO: 10, GenBank No. L22652). 588 to 605, corresponding to the complementary strand).
(1-2) Collect the two types of PCR products obtained in (1-1), obtain the nucleotide sequence by sequencing with ABI PRISM 310 (Applied Biosystems), and then determine the nucleotide sequence of the heavy chain variable region. Determined (SEQ ID NO: 13). The amino acid sequence of the heavy chain variable region translated based on the information of SEQ ID NO: 13 is shown in SEQ ID NO: 2.
(2-1) Amplification of the light chain gene was performed according to the protocol using the One-step RT-PCR kit using total RNA recovered in the same manner as the heavy chain. PCR primers were 5′-ctcctgggtttgttgtct-3 ′ (SEQ ID NO: 11, corresponding to positions 30 to 46 of GenBank No. BC088255) and 5′-tggagtgtgggaagat-3 ′ (SEQ ID NO: 12, GenBank No. BC088255 to 420). The combination of the 435th base and the complementary strand) was used.
(2-2) The PCR product obtained in (2-1) was sequenced in the same manner as the heavy chain to determine the base sequence (SEQ ID NO: 14). The amino acid sequence of the light chain variable region translated based on the information of SEQ ID NO: 14 is shown in SEQ ID NO: 3.
実施例５ ＡＴＸＲ４−１２７抗体のウエスタンブロッティングによる反応性解析
実施例２に従い調製したバキュロウイルス−昆虫細胞系で発現させ、精製したＡＴＸδおよびＡＴＸβを用い、ウエスタンブロッティングによりＡＴＸＲ４−１２７抗体の反応性を検証した。なお、対照として、抗オートタキシンモノクローナル抗体（Ｒ４＋４、ＡＴＸα、β、γを特異的に認識する抗体）とヒトオートタキシンＮ末端領域の大腸菌発現抗原を用い作製した抗オートタキシンモノクローナル抗体（Ｒ１．１Ａ９、全てのオートタキシンＮ末端を認識する抗体）を用いた。
Example 5 Reactivity Analysis by Western Blotting of ATXR4-127 Antibody The reactivity of ATXR4-127 antibody was verified by Western blotting using ATXδ and ATXβ expressed in the baculovirus-insect cell system prepared according to Example 2. did. As a control, an anti-autotaxin monoclonal antibody (R1.1A9) prepared using an anti-autotaxin monoclonal antibody (an antibody that specifically recognizes R4 + 4, ATXα, β, γ) and an E. coli-expressed antigen in the human autotaxin N-terminal region. , An antibody that recognizes all autotaxin N-termini).
ＡＴＸＲ４＋４抗体の作製方法を以下に示す。
ヒトオートタキシン（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＢ００８５５．１）の配列番号３の５６９番目から５８６番目までのアミノ酸からなるオリゴペプチド（Ｃｙｓ-Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ、配列番号５）を定法に従い合成した。前記ペプチドをＩｍｊｅｃｔ Ｋｅｙｈｏｌｅ Ｌｉｍｐｅｔ Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ（ＰＩＥＲＣＥ社；品番７７１５３）を用い、プロトコールに従って、コンジュゲーションすることで免疫抗原を作製した。免疫抗原を実施例３と同様にラットに免疫し、配列番号５のオリゴペプチド−ＢＳＡと反応性を示し、かつ配列番号６のオリゴペプチド−ＢＳＡと反応性を示さないクローンを選択することで、配列番号５のオリゴペプチド−ＢＳＡを特異的に認識する抗体ＡＴＸＲ４＋４を回収した。
A method for producing ATXR4 + 4 antibody is shown below.
Oligopeptide (Cys-Asp-Asp-Lys-Val-Glu-Pro-Lys-Asn-Lys-Leu-) consisting of amino acids 569 to 586 of SEQ ID NO: 3 of human autotaxin (GenBank: AAB00855.1) Asp-Glu-Leu-Asn-Lys-Arg-Leu, SEQ ID NO: 5) was synthesized according to a conventional method. The antigen was produced by conjugating the peptide with Image Keyhole Limetic Hemocyanin (PIERCE; product number 77153) according to the protocol. By immunizing a rat with the immunizing antigen in the same manner as in Example 3, and selecting a clone that shows reactivity with the oligopeptide-BSA of SEQ ID NO: 5 and does not show reactivity with the oligopeptide-BSA of SEQ ID NO: 6, The antibody ATXR4 + 4 that specifically recognizes the oligopeptide-BSA of SEQ ID NO: 5 was recovered.
ウエスタンブロッティングによるＡＴＸＲ４−１２７抗体の反応性は、具体的には以下に示す方法で実施した。
（１）実施例２で調製したＡＴＸδまたはβを２００ｎｇ／レーンにて還元条件下ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を行った。
（２）電気泳動後、ポリフッ化ビニリデン膜にＳｅｍｉｄｒｙ Ｔｒａｎｓｂｌｏｔ（ＢＩＯＲＡＤ）を用い定法に従い転写した。
（３）非特異的結合を回避するために、転写後の膜を３％スキムミルクを含むＴＢＳ溶液にて２時間のブロッキングを行い、その後１μｇ／ｍＬのＡＴＸＲ４−１２７抗体またはＡＴＸＲ４＋４抗体またはＡＴＸＲ１．１Ａ９と反応させた。
（４）ＴＢＳＴによる十分な洗浄後、ＣＤＰ−ＳＴＡＲ（Ｒｏｃｈｅ）を製品プロトコルに従って用いることにより抗体の結合を検出した。
The reactivity of the ATXR4-127 antibody by Western blotting was specifically performed by the method shown below.
(1) ATXδ or β prepared in Example 2 was subjected to SDS-PAGE electrophoresis under reducing conditions at 200 ng / lane.
(2) After electrophoresis, it was transferred to a polyvinylidene fluoride film according to a conventional method using Semitrans Transblot (BIORAD).
(3) In order to avoid non-specific binding, the transferred membrane was blocked with a TBS solution containing 3% skim milk for 2 hours, and then 1 μg / mL of ATXR4-127 antibody, ATXR4 + 4 antibody or ATXR1.1A9 And reacted.
(4) After sufficient washing with TBST, antibody binding was detected by using CDP-STAR (Roche) according to the product protocol.
結果、図１に示す通り、ＡＴＸＲ４−１２７抗体はＡＴＸβとは反応性を示さずＡＴＸδとのみ反応性を示す結果が得られた。一方、オートタキシンアイソフォームＡＴＸα、β、γを特異的に認識する抗体ＡＴＸＲ４＋４では、ＡＴＸδとは反応性を示さずＡＴＸβとのみ反応性を示す結果が得られた。オートタキシンＮ末端を認識するモノクローナル抗体ＡＴＸＲ１．１Ａ９ではＡＴＸδおよびＡＴＸβいずれも同程度の感度で検出した。このことより、ＡＴＸＲ４−１２７はＡＴＸδと特異的に反応するモノクローナル抗体であることが確認された。なお、モノクローナル抗体ＡＴＸＲ４−１２７は、配列番号６で表されるオリゴペプチドを抗原として用いて作製されたハイブリドーマから生成されており、ＡＴＸεも、ＡＴＸδと同様に配列番号６からなるオリゴペプチドを含んでいることから、モノクローナル抗体ＡＴＸＲ４−１２７は、ＡＴＸεとＡＴＸδに特異的に反応するものである。 As a result, as shown in FIG. 1, the ATXR4-127 antibody showed no reactivity with ATXβ, and only with ATXδ. On the other hand, with the antibody ATXR4 + 4 that specifically recognizes the autotaxin isoforms ATXα, β, and γ, a result indicating reactivity only with ATXβ without showing reactivity with ATXδ was obtained. With the monoclonal antibody ATXR1.1A9 that recognizes the autotaxin N-terminus, both ATXδ and ATXβ were detected with similar sensitivity. From this, it was confirmed that ATXR4-127 is a monoclonal antibody that specifically reacts with ATXδ. The monoclonal antibody ATXR4-127 is produced from a hybridoma prepared using the oligopeptide represented by SEQ ID NO: 6 as an antigen, and ATXε includes the oligopeptide consisting of SEQ ID NO: 6 as with ATXδ. Therefore, the monoclonal antibody ATXR4-127 reacts specifically with ATXε and ATXδ.
実施例６ 天然状態ＡＴＸδへの反応性検証
（１）天然状態ＡＴＸδへの反応性の検証のため実施例２により作製したＡＴＸδを特開２０１１−０３７８０２号公報に記載の方法でオートタキシンを吸着して除いた牛血清に添加し、他のオートタキシンアイソフォームを含有せず、ＡＴＸδのみを含むサンプルを調製した。
（２）試料中のオートタキシン濃度を、特許文献１に記載のオートタキシン定量法により決定した。
（２−１）プロトコールに従い１ｍＬ容量のＨｉＴｒａｐ ＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＨＰ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）カラムに５ｍｇのＡＴＸＲ４−１２７抗体を結合させたアフィニティーカラムを作製した。本カラムにはＡＴＸδが結合することが期待される。対照として１ｍＬ容量のＨｉＴｒａｐ ＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＨＰ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）カラムにＡＴＸＲ４−１２７抗体を結合させていないカラム（ＡＴＸＲ４−１２７抗体未結合カラム）を作製した。
（２−２）３ｍＬの約０．４ｍｇ／ＬのＡＴＸδを含むサンプルを２本のカラムに別々にロードした。なお、各試料のオートタキシン濃度は特許文献１に記載のオートタキシン定量試薬を用い、全自動エンザイムイムノアッセイ装置 ＡＩＡ−１８００（東ソー、製造販売届出番号：１３Ｂ３Ｘ９０００２０００００２）にて定量している。
（２−３）素通り画分を回収し、オートタキシン濃度を定量した。対照としてＡＴＸＲ４−１２７抗体未結合カラムにロードした同一サンプル中の素通り溶液のオートタキシン濃度を測定しバックグラウンド値とした。
Example 6 Verification of reactivity to natural state ATXδ (1) Autotaxin was adsorbed on ATXδ prepared in Example 2 for verification of reactivity to natural state ATXδ by the method described in JP2011-037802. A sample containing only ATXδ without any other autotaxin isoform was prepared.
(2) The autotaxin concentration in the sample was determined by the autotaxin quantification method described in Patent Document 1.
(2-1) An affinity column in which 5 mg of ATXR4-127 antibody was bound to a 1 mL volume HiTrap NHS-activated HP (GE Healthcare Bioscience) column was prepared according to the protocol. It is expected that ATXδ will bind to this column. As a control, a column (ATXR4-127 antibody non-binding column) in which ATXR4-127 antibody was not bound to a 1 mL capacity HiTrap NHS-activated HP (GE Healthcare Bioscience) column was prepared.
(2-2) A sample containing 3 mL of about 0.4 mg / L of ATXδ was separately loaded onto two columns. In addition, the autotaxin concentration of each sample is quantified with the fully automated enzyme immunoassay apparatus AIA-1800 (Tosoh, manufacturing and sales notification number: 13B3X90002000002) using the autotaxin assay reagent described in Patent Document 1.
(2-3) The flow-through fraction was collected and the autotaxin concentration was quantified. As a control, the autotaxin concentration of the flow-through solution in the same sample loaded on the ATXR4-127 antibody non-binding column was measured and used as a background value.
結果、図２に示すとおり対照であるバックグラウンド中のオートタキシン濃度が０．３５ｍｇ／Ｌであったのに対し、ＡＴＸＲ４−１２７抗体を結合させたアフィニティーカラムにより処理したサンプル中のオートタキシン濃度は０．０３ｍｇ／Ｌと約９３％低減し、ＡＴＸＲ４−１２７抗体は溶液中にあるＡＴＸδとの反応性を有していることが示された。 As a result, the autotaxin concentration in the background as a control was 0.35 mg / L as shown in FIG. 2, whereas the autotaxin concentration in the sample treated with the affinity column to which the ATXR4-127 antibody was bound was The ATXR4-127 antibody was shown to be reactive with ATXδ in solution, decreasing by about 93% to 0.03 mg / L.
実施例７ ヒト血清中のＡＴＸδ、εの検出
ヒト血清中のＡＴＸδ、εの存在検出を以下の手順にて行った。
（１）実施例６と同様にＡＴＸＲ４−１２７モノクローナル抗体を結合させたアフィニティーカラムを作製した。
（２）１．１７ｍｇ／Ｌのオートタキシンを含む健常者ヒト血清１５ｍＬをＡＴＸＲ４−１２７抗体結合アフィニティーカラムにロードした。
（３）カラムは十分量のＴＢＳにて洗浄後、１００ｍＭグリシン（ｐＨ２．５）溶液でカラムに結合した物質を溶出し、溶出画分はアミコンウルトラ−４、３０ｋＤａ、アミコンウルトラ−０．５、５０ｋＤａ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）にて５０μｌまで濃縮し、解析用サンプルとした。
（４）ＡＴＸＲ４−１２７抗体結合カラムに結合後に溶出した画分（以下、溶出画分とする）を、実施例５同様、電気泳動、膜への転写を実施し、ＡＴＸＲ４−１２７抗体およびＡＴＸＲ４＋４抗体およびＡＴＸＲ１．１Ａ９抗体にてオートタキシンを検出した。
（５）同様の実験を、異なるヒト健常人血清についても実施した。
Example 7 Detection of ATXδ, ε in human serum The presence of ATXδ, ε in human serum was detected by the following procedure.
(1) In the same manner as in Example 6, an affinity column to which the ATXR4-127 monoclonal antibody was bound was prepared.
(2) 15 mL of healthy human serum containing 1.17 mg / L autotaxin was loaded onto an ATXR4-127 antibody-binding affinity column.
(3) After washing the column with a sufficient amount of TBS, the substance bound to the column was eluted with a 100 mM glycine (pH 2.5) solution, and the eluted fractions were Amicon Ultra-4, 30 kDa, Amicon Ultra-0.5, The sample was concentrated to 50 μl with 50 kDa (Millipore) to obtain a sample for analysis.
(4) The fraction eluted after binding to the ATXR4-127 antibody binding column (hereinafter referred to as the eluted fraction) was subjected to electrophoresis and transfer to a membrane in the same manner as in Example 5, and the ATXR4-127 antibody and ATXR4 + 4 antibody Autotaxin was detected with the ATXR1.1A9 antibody.
(5) A similar experiment was performed on different healthy human serums.
結果、図３（ａ）および図３（ｂ）（（ａ）、（ｂ）は異なる健常者血清を用いた結果それぞれを示す。）に示す通り、溶出画分には、Ｒ１．１Ａ９抗体でのウエスタンブロッティングの結果によりオートタキシンが存在することが確認された。
一方、同一試料をＡＴＸＲ４−１２７抗体でウエスタンブロッティングした場合は、反応性を示し、ＡＴＸＲ４＋４抗体でウエスタンブロッティングした場合は、反応性を示さなかった。以上のことから、ＡＴＸＲ４−１２７抗体結合カラムにはＡＴＸδ、εのみが結合し、血清中のＡＴＸα、β、γは結合しないことが明らかとなった。
As a result, as shown in FIG. 3 (a) and FIG. 3 (b) ((a) and (b) show the results of using different healthy human sera, respectively), the elution fraction contains R1.1A9 antibody. The Western blotting results confirmed that autotaxin was present.
On the other hand, when the same sample was Western blotted with the ATXR4-127 antibody, the reactivity was shown, and when Western blotting was done with the ATXR4 + 4 antibody, the reactivity was not shown. From the above, it has been clarified that only ATXδ, ε binds to the ATXR4-127 antibody binding column, and ATX α, β, γ in the serum does not bind.
実施例８ ＡＴＸδ、ε特異的測定試薬の調製
特許文献１と同様の方法でＡＴＸδ、ε特異的測定試薬の調製を行った。具体的には以下に示す方法で実施した。
（１）水不溶性担体（内部にフェライトを練り込んだ粒子径約１．５ｍｍのエチレンビニルアルコール製担体）に抗ヒトオートタキシンモノクローナル抗体（ＡＴＸＲ４−１２７）を１００ｎｇ／担体になるように３０℃にて一昼夜物理的に吸着させ、その後１％ＢＳＡを含む１００ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）にて４０℃、４時間ブロッキングを行なうことで抗体固定化担体を調製した。
（２）抗ヒトオートタキシンモノクローナル抗体（ＡＴＸＲ１０．２３）をアルカリフォスファターゼ標識用キット−ＮＨ２（同仁化学研究所、品番：ＬＫ１２）を用いてアルカリ性フォスファターゼと結合させることで標識抗体を調製した。
（３）磁力透過性の容器（容量１．２ｍＬ）に１２個の抗体固定化担体を入れた後、０．７μｇ／ｍＬの標識抗体を含む緩衝液（３％ＢＳＡを含むトリス緩衝液、ｐＨ８．０）５０μＬを容器に添加し凍結乾燥を施しオートタキシン測定試薬とした。オートタキシン測定試薬は窒素充填下密閉封印シールを施し測定まで４℃にて保管した。
（４）既知濃度ヒトオートタキシン標準品を特許文献１記載の方法で調製した。具体的には、下記に示す方法で実施した。
（４−１）オートタキシンモノクローナル抗体（ＡＴＸＲ１０．２３）結合カラムを用い、牛血清中のオートタキシンを吸着させることで、オートタキシン非含有血清を調製した。
（４−２）実施例２に記載の方法で精製した組み換えＡＴＸδを用い、オートタキシン非含有血清に適当な濃度添加することで、濃度の異なる５濃度（オートタキシン非含有血清を加えると６濃度）の標準品を作製した。標準品の濃度決定は特許文献１に記載のオートタキシン定量試薬にて決定した。
本実施例で調製した、ＡＴＸδ、ε特異的測定試薬について、全自動エンザイムイムノアッセイ装置 ＡＩＡ−１８００（東ソー、製造販売届出番号：１３Ｂ３Ｘ９０００２０００００２）において、標準品を用いて作成した検量線を図４に示す。図４の検量線は、縦軸に測定値のｌｏｇ値を、横軸に各標準品のオートタキシン濃度の対数値をとり、オートタキシン非含有血清試料における測定値を０.０１ｍｇ／Ｌでの値として代用し作成したものである。
Example 8 Preparation of ATXδ, ε-specific measurement reagent ATXδ, ε-specific measurement reagent was prepared in the same manner as in Patent Document 1. Specifically, the following method was used.
(1) An anti-human autotaxin monoclonal antibody (ATXR4-127) is 100 ng / carrier at 30 ° C. in a water-insoluble carrier (an ethylene vinyl alcohol carrier having a particle diameter of about 1.5 mm with ferrite kneaded inside). The antibody-immobilized carrier was prepared by physically adsorbing all day and night, followed by blocking with 100 mM Tris buffer (pH 8.0) containing 1% BSA at 40 ° C. for 4 hours.
(2) A labeled antibody was prepared by binding an anti-human autotaxin monoclonal antibody (ATXR10.23) to alkaline phosphatase using an alkaline phosphatase labeling kit-NH2 (Dojindo Laboratories, product number: LK12).
(3) After 12 antibody-immobilized carriers are placed in a magnetically permeable container (capacity 1.2 mL), a buffer solution containing 0.7 μg / mL labeled antibody (Tris buffer solution containing 3% BSA, pH 8) 0.0) 50 μL was added to the container and freeze-dried to obtain an autotaxin measuring reagent. The autotaxin measurement reagent was hermetically sealed under nitrogen filling and stored at 4 ° C. until measurement.
(4) A human autotaxin standard with a known concentration was prepared by the method described in Patent Document 1. Specifically, the following method was used.
(4-1) Autotaxin-free serum was prepared by adsorbing autotaxin in bovine serum using an autotaxin monoclonal antibody (ATXR10.23) binding column.
(4-2) Using recombinant ATXδ purified by the method described in Example 2 and adding appropriate concentrations to autotaxin-free serum, 5 concentrations with different concentrations (6 concentrations when autotaxin-free serum is added) ) Was produced. The concentration of the standard product was determined using the autotaxin assay reagent described in Patent Document 1.
FIG. 4 shows a calibration curve prepared by using a standard product for the ATXδ, ε-specific measurement reagent prepared in this example in a fully automatic enzyme immunoassay apparatus AIA-1800 (Tosoh, manufacturing and sales notification number: 13B3X90002000002). . The calibration curve of FIG. 4 shows the log value of the measured value on the vertical axis, the logarithmic value of the autotaxin concentration of each standard product on the horizontal axis, and the measured value in the autotaxin-free serum sample at 0.01 mg / L. It is created by substituting as a value.
実施例９ ＡＴＸδ、ε特異的測定試薬による測定
実施例８で作製した測定試薬を、全自動エンザイムイムノアッセイ装置 ＡＩＡ−１８００（東ソー、製造販売届出番号：１３Ｂ３Ｘ９０００２０００００２）において用いて、健常者血清２種（オートタキシン濃度が低濃度の血清と中濃度の血清）、および健常者血清に、実施例２に記載の方法で精製した組み換えＡＴＸδを添加した高濃度試料の計３種類の検体を１０回測定した際のばらつき（ＣＶ（％））を検証した。表１に示す通り、いずれもＣＶは５％以下であり測定精度は良好であった。
実施例１０ ＡＴＸδ、ε特異的測定試薬のヒト血清中ＡＴＸδ、εへの反応性検証
ＡＴＸδ、ε特異的測定試薬のヒト血清中ＡＴＸδ、εへの反応性検証を以下の手順にて行った。
（１）オートタキシン非含有健常者ヒト血清を特開２０１１−０３７８０２号公報に記載の方法で調製した。具体的には、オートタキシンモノクローナル抗体（ＡＴＸＲ１０．２３）結合カラムを用い、健常者ヒト血清中のオートタキシンを吸着させることで、オートタキシン非含有血清を調製した。
（２）（１）で作製したオートタキシン非含有健常者ヒト血清に、実施例２により作製したＡＴＸδおよび、ＡＴＸβを約０．４ｍｇ／Ｌとなるように添加することにより、他のオートタキシンアイソフォームを含有せずＡＴＸδのみを含むサンプル（以下、ＡＴＸδ添加サンプルとする）および他のオートタキシンアイソフォームを含有せずＡＴＸβのみを含むサンプル（以下、ＡＴＸβ添加サンプルとする）を調製した。
（３）上記２つのサンプルのオートタキシン濃度を、特許文献１に記載のオートタキシン定量試薬（以下、ＡＴＸｔｏｔａｌ測定試薬とする）および実施例８で調製したＡＴＸδ、ε特異的測定試薬（以下、ＡＴＸδ、ε測定試薬とする）を用い、全自動エンザイムイムノアッセイ装置 ＡＩＡ−１８００（東ソー、製造販売届出番号：１３Ｂ３Ｘ９０００２０００００２）にて定量した。
Example 10 Verification of reactivity of ATXδ, ε-specific measurement reagent to ATXδ, ε in human serum Reactivity of ATXδ, ε-specific measurement reagent to ATXδ, ε in human serum was verified by the following procedure.
(1) Normal human serum containing no autotaxin was prepared by the method described in JP2011-037802. Specifically, autotaxin-free serum was prepared by adsorbing autotaxin in normal human serum using an autotaxin monoclonal antibody (ATXR10.23) binding column.
(2) By adding the ATXδ and ATXβ prepared in Example 2 to about 0.4 mg / L to the normal human serum containing no autotaxin prepared in (1), other autotaxin isoforms are added. Samples containing only ATXδ without foam (hereinafter referred to as ATXδ-added samples) and samples containing only ATXβ without other autotaxin isoforms (hereinafter referred to as ATXβ-added samples) were prepared.
(3) The autotaxin concentration of the above two samples was determined based on the autotaxin quantification reagent described in Patent Document 1 (hereinafter referred to as ATXtotal measurement reagent) and the ATXδ, ε-specific measurement reagent prepared in Example 8 (hereinafter referred to as ATXδ). , Ε measurement reagent), and quantified with a fully automatic enzyme immunoassay apparatus AIA-1800 (Tosoh, manufacturing and sales notification number: 13B3X90002000002).
結果、図５に示す通り、ＡＴＸｔｏｔａｌ測定試薬では、ＡＴＸδ添加サンプルは０．４３ｍｇ／Ｌ、ＡＴＸβ添加サンプルは０．３９ｍｇ／Ｌの測定値を示した。
一方、ＡＴＸδ、ε測定試薬では、ＡＴＸδ添加サンプルは０．４４ｍｇ／Ｌ、ＡＴＸβ添加サンプルは０．００ｍｇ／Ｌの測定値を示した。このことから、ＡＴＸδ、ε測定試薬は、ヒト血清中において、ＡＴＸα、β、γは検出せず、ＡＴＸδ、εのみを検出することが明らかとなった。
As a result, as shown in FIG. 5, with the ATXtotal measurement reagent, the ATXδ added sample showed a measured value of 0.43 mg / L, and the ATXβ added sample showed a measured value of 0.39 mg / L.
On the other hand, with the ATXδ and ε measurement reagents, the ATXδ added sample showed a measured value of 0.44 mg / L, and the ATXβ added sample showed a measured value of 0.00 mg / L. From this, it was clarified that the ATXδ, ε measuring reagent detects only ATXδ, ε, but not ATXα, β, γ in human serum.
Claims (4)
配列番号２に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と、配列番号３に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とを有し、前記抗体が、
Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ（配列番号６）からなるアミノ酸配列を含むヒトオートタキシンを特異的に認識し、
Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ（配列番号５）からなるアミノ酸配列を含むヒトオートタキシンを認識しない、
ことを特徴とする、前記抗体。 A monoclonal antibody that recognizes human autotaxin,
A heavy chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 and a light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3, wherein the antibody comprises:
Specifically recognizing human autotaxin comprising an amino acid sequence consisting of Cys-Asp-Asp-Lys-Asn-Lys-Leu-Asp-Glu-Leu-Asn-Lys-Arg-Leu (SEQ ID NO: 6);
A human autotaxin comprising an amino acid sequence consisting of Cys-Asp-Asp-Lys-Val-Glu-Pro-Lys-Asn-Lys-Leu-Asp-Glu-Leu-Asn-Lys-Arg-Leu (SEQ ID NO: 5) not recognize,
The antibody as described above .
ヒトオートタキシンのアミノ酸配列のうち、配列番号６からなるアミノ酸配列以外の領域を認識する抗体と、
を用いて、サンドイッチイムノアッセイにより、配列番号６からなるアミノ酸配列を含むヒトオートタキシンを検出する方法。 The antibody of claim 1,
An antibody that recognizes a region other than the amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 6 in the amino acid sequence of human autotaxin;
Using, by the sandwich Lee beam Noassei, a method for detecting human autotaxin comprising an amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 6.
ヒトオートタキシンのアミノ酸配列のうち、配列番号６からなるアミノ酸配列以外の領域を認識する抗体と、
を含む、サンドイッチイムノアッセイによりヒトオートタキシンを検出する試薬。 The antibody of claim 1,
An antibody that recognizes a region other than the amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 6 in the amino acid sequence of human autotaxin;
Reagent comprising, detecting human autotaxin by sandwich Lee beam Noassei a.
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