JP5864918B2 - Autotaxin isoform-specific antibody and detection method - Google Patents
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Description
本発明はオートタキシンのアイソフォームを特異的に検出する抗体および前記抗体を用いたオートタキシンのアイソフォームの検出方法に関する。 The present invention relates to an antibody that specifically detects an autotaxin isoform and a method for detecting an autotaxin isoform using the antibody.
ヒトオートタキシンは、１９９２年Ｍ．Ｌ．ＳｔｒａｃｋｅらによってＡ２０５８ヒト黒色腫細胞培養培地から細胞運動性を惹起する物質として単離された分子量約１２５ＫＤａの糖タンパク質である（非特許文献１）。オートタキシンはそのリゾホスホリパーゼＤ活性によりリゾホスファチジルコリンを基質とし、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）を産生する。生体内ではＬＰＡが癌の増殖、転移に関与していることが多くの研究者により示され（非特許文献２から４）、その産生酵素であるオートタキシンと様々な疾病との因果関係が研究されている。最近になり、ヒトオートタキシンを定量する手法が確立されていることから（特許文献１および非特許文献５）、様々な疾患の診断マーカーとして期待されている。 Human autotaxin was developed in 1992 by M.M. L. It is a glycoprotein having a molecular weight of about 125 KDa isolated by Stracke et al. As a substance that induces cell motility from A2058 human melanoma cell culture medium (Non-patent Document 1). Autotaxin produces lysophosphatidic acid (LPA) using lysophosphatidylcholine as a substrate due to its lysophospholipase D activity. Many researchers have shown that LPA is involved in cancer growth and metastasis in vivo (Non-Patent Documents 2 to 4), and the causal relationship between autotaxin, which is its production enzyme, and various diseases has been studied. Has been. Recently, since a method for quantifying human autotaxin has been established (Patent Document 1 and Non-Patent Document 5), it is expected as a diagnostic marker for various diseases.
オートタキシンはそのＬＰＡ産生能から癌あるいは癌転移との関連が注目されており、これまでも多くの研究がなされている。１９９２年に癌との関連を示した特許が開示（特許文献２および３）された後、ヒトテラトカルシノーマ（非特許文献６）、肺の非小細胞癌（非特許文献７）、甲状腺癌（非特許文献８）、乳癌（非特許文献９）、多型膠芽腫（非特許文献１０および１１）、前立腺癌（非特許文献１２）、ホジキンリンパ腫（非特許文献１３）等多種多様な癌においてオートタキシンの関与が報告されている。しかしながら、前述した報告はいずれも臓器における発現報告である。 Autotaxin has attracted attention because of its ability to produce LPA, and is related to cancer or cancer metastasis, and many studies have been conducted so far. After 1992 patents showing a relationship with cancer were disclosed (patent documents 2 and 3), human teratocarcinoma (non-patent document 6), non-small cell lung cancer (non-patent document 7), thyroid cancer (Non-patent document 8), Breast cancer (Non-patent document 9), Glioblastoma multiforme (Non-patent documents 10 and 11), Prostate cancer (Non-patent document 12), Hodgkin lymphoma (Non-patent document 13), etc. Autotaxin has been reported to be involved in cancer. However, all the reports described above are expression reports in organs.
一方、体液中のオートタキシン濃度の上昇に関する報告は、卵巣癌患者血清で差が認められない報告（非特許文献１４）や、前立腺癌患者血清で差が認められない報告（非特許文献１５）等、否定的な報告が多い。これらの結果から、健常者における血清オートタキシン濃度は比較的高く、癌細胞がオートタキシンを産生しても血清濃度を上昇変動させるに至るほどではないことを示唆している。肯定的な報告として、卵巣癌患者腹水中でオートタキシン濃度の上昇が示された報告や、悪性腫瘍のうち血液中に癌細胞が存在する悪性リンパ腫において血清オートタキシン濃度が高値を示す報告（特許文献４、非特許文献１６）があるが、体液中のオートタキシン濃度の上昇は極めて限定された癌のみといえる。 On the other hand, reports on the increase in autotaxin concentration in body fluids are reports in which no difference is observed in serum of ovarian cancer patients (Non-Patent Document 14) and reports in which no difference is observed in serum of prostate cancer patients (Non-Patent Document 15). There are many negative reports. These results suggest that the serum autotaxin concentration in healthy individuals is relatively high, and even if cancer cells produce autotaxin, the serum concentration does not rise or fluctuate. As positive reports, reports of increased autotaxin levels in ascites of ovarian cancer patients and reports of high serum autotaxin levels in malignant lymphomas with malignant tumors in the blood (patents) Although there are literature 4 and non-patent literature 16), it can be said that the increase in autotaxin concentration in body fluids is only limited to cancer.
オートタキシンにはいくつかのアイソフォーム（ｉｓｏｆｏｒｍ、構造は異なるが同じ機能をもつタンパク質）があることが知られており、一例としてスプライシングバリアント（α、β、γ）が遺伝子として同定されている（非特許文献１７）。一方、鶏のオートタキシンには、ｃＡＴＸ−ＳおよびｃＡＴＸ−Ｌのアイソフォームが同定されており、このうちｃＡＴＸ−ＬはリゾホスホリパーゼＤ活性も哺乳動物と同等に有しているため、哺乳動物のオートタキシンと同等の作用、機能を有していると考えられる（非特許文献１８）。ｃＡＴＸ−Ｌとヒトオートタキシンとのアミノ酸配列の相同性を確認した結果、ｃＡＴＸ−ＬはＶａｌ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ（配列番号１）が欠損していることが明らかとなっている。ｃＡＴＸ−Ｌと同様の欠損アイソフォームは、ヒトオートタキシンにおいても存在することが示唆されている。しかしながら、これまで前記欠損アイソフォームは、タンパク質としての存在が証明されていなかった。 Autotaxin is known to have several isoforms (isoforms, proteins with different structures but the same function), and as an example, splicing variants (α, β, γ) have been identified as genes ( Non-patent document 17). On the other hand, isoforms of cATX-S and cATX-L have been identified in chicken autotaxin. Among them, cATX-L has lysophospholipase D activity equivalent to that of mammals. It is considered to have the same action and function as autotaxin (Non-patent Document 18). As a result of confirming the amino acid sequence homology between cATX-L and human autotaxin, it is clear that cATX-L lacks Val-Glu-Pro-Lys (SEQ ID NO: 1). It has been suggested that a defective isoform similar to cATX-L also exists in human autotaxin. However, until now, the existence of the defective isoform as a protein has not been proved.
オートタキシン測定に関しては、特許文献１にて、ヒト血清等ヒト検体中のオートタキシン濃度を簡便、短時間、かつ信頼性高く定量可能な方法が開示されており、その方法により各種疾患の診断が可能となっている。しかしながら、特許文献１の方法は、ヒトオートタキシン全量を定量する方法であり、オートタキシンのアイソフォームを特異的に検出するのは困難である。 Regarding autotaxin measurement, Patent Document 1 discloses a method that can easily, quickly, and reliably quantify the concentration of autotaxin in a human sample such as human serum. By this method, various diseases can be diagnosed. It is possible. However, the method of Patent Document 1 is a method for quantifying the total amount of human autotaxin, and it is difficult to specifically detect an autotaxin isoform.
そこで本発明は、オートタキシンの測定方法であって、特定のアイソフォームの有無を検出可能な測定方法を提供することを目的とする。 Accordingly, an object of the present invention is to provide a method for measuring autotaxin, which can detect the presence or absence of a specific isoform.
上記課題を鑑みてなされた本発明は、以下の態様を包含する：
（１）オートタキシンを認識する抗体であって、Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ（配列番号１）からなるアミノ酸配列を含むオートタキシンを認識し、配列番号１からなるアミノ酸配列を含まないオートタキシンを認識しない抗体。
（２）前記抗体がモノクローナル抗体である（１）に記載の抗体。
（３）前記オートタキシンがヒトオートタキシンである、（１）または（２）に記載の抗体。
（４）前記モノクローナル抗体が、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と、配列番号３に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とを有した抗体である、（２）または（３）に記載の抗体。
（５）（１）から（４）のいずれかに記載の抗体を用いて、配列番号１からなるアミノ酸配列を含むオートタキシンを測定する方法。
（６）（１）から（４）のいずれかに記載の抗体と、オートタキシンのアミノ酸配列のうち配列番号１からなるアミノ酸配列以外の領域のアミノ酸配列を認識する抗体と、を用いて、サンドイッチイムノアッセイにより、配列番号１からなるアミノ酸配列を含むオートタキシンを測定する方法。
（７）（１）から（４）のいずれかに記載の抗体と、オートタキシンのアミノ酸配列のうち配列番号１からなるアミノ酸配列以外の領域のアミノ酸配列を認識する抗体と、を含む、サンドイッチイムノアッセイによりオートタキシンを測定する試薬。
The present invention made in view of the above problems includes the following aspects:
(1) An antibody that recognizes autotaxin, which recognizes autotaxin including an amino acid sequence consisting of Val-Glu-Pro-Lys (SEQ ID NO: 1) and does not include an amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 1. Unrecognized antibody.
(2) The antibody according to (1), wherein the antibody is a monoclonal antibody.
(3) The antibody according to (1) or (2), wherein the autotaxin is human autotaxin.
(4) The monoclonal antibody is an antibody having a heavy chain variable region consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 and a light chain variable region consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3, (2) or The antibody according to (3).
(5) A method for measuring autotaxin comprising the amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 1 using the antibody according to any one of (1) to (4).
(6) A sandwich using the antibody according to any one of (1) to (4) and an antibody that recognizes an amino acid sequence in a region other than the amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 1 among the amino acid sequences of autotaxin A method for measuring autotaxin comprising an amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 1 by immunoassay.
(7) A sandwich immunoassay comprising the antibody according to any one of (1) to (4) and an antibody that recognizes an amino acid sequence of a region other than the amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 1 among the amino acid sequences of autotaxin Reagent for measuring autotaxin by
本発明は、オートタキシンを含む試料中から、Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ（配列番号１）からなるアミノ酸配列を含むオートタキシン（ＡＴＸｗｔ）を特異的に検出する抗体を提供する。また、前記抗体を用いた、簡便かつ短時間にＡＴＸｗｔを定量可能な測定方法および測定試薬も提供する。 The present invention provides an antibody that specifically detects autotaxin (ATXwt) containing an amino acid sequence consisting of Val-Glu-Pro-Lys (SEQ ID NO: 1) from a sample containing autotaxin. In addition, a measuring method and a measuring reagent that can quantitate ATXwt simply and in a short time using the antibody are also provided.
これまで行なわれてきたオートタキシンの測定は、配列番号１からなるアミノ酸配列の有無にかかわらず、オートタキシン全量を定量しており（特許文献１）、その値から臨床的有用性を評価してきたが、本発明の測定方法および測定試薬により、その有用性をより明確にできる可能性を有している。また、本発明の測定方法を用いて、これまで明らかにされていない各種疾患との関連性を検証することで、オートタキシンによる新たな疾患の診断等も期待できる。 The measurement of autotaxin carried out so far quantifies the total amount of autotaxin regardless of the presence or absence of the amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 1 (Patent Document 1), and clinical utility has been evaluated from the value. However, the measurement method and the measurement reagent of the present invention have a possibility of making the usefulness clearer. In addition, by using the measurement method of the present invention to verify the relevance to various diseases that have not been clarified so far, a new disease diagnosis or the like by autotaxin can be expected.
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の抗体は、オートタキシンのアミノ酸配列のうち、Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ（配列番号１）からなるアミノ酸配列を含むオートタキシン（以下、ＡＴＸｗｔと略す）を特異的に認識することを特徴としている。血液中に存在する自然状態のＡＴＸｗｔを検出するためには、前記自然状態のＡＴＸｗｔ立体構造を認識する抗体が必要であるが、本発明の抗体は、前記自然状態のＡＴＸｗｔとの結合能を有する。そのため、本発明の抗体は、血清からのＡＴＸｗｔの吸収や酵素免疫測定法（エンザイムイムノアッセイ）などによる血清診断にも用いることができる。
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
The antibody of the present invention specifically recognizes autotaxin (hereinafter abbreviated as ATXwt) containing an amino acid sequence consisting of Val-Glu-Pro-Lys (SEQ ID NO: 1) among the amino acid sequences of autotaxin. It is said. In order to detect the natural state ATXwt present in the blood, an antibody that recognizes the natural state ATXwt three-dimensional structure is necessary, but the antibody of the present invention has the ability to bind to the natural state ATXwt. . Therefore, the antibody of the present invention can also be used for serum diagnosis by absorption of ATXwt from serum or enzyme immunoassay (enzyme immunoassay).
本発明の抗ＡＴＸｗｔ抗体は、動物を免疫化して得た血清から精製されたポリクローナル抗体であってもよいし、又はモノクローナル抗体のいずれであってもよく、好ましくはモノクローナル抗体である。モノクローナル抗体としては、ハイブリドーマにより生産される抗体、抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した形質転換体により生産される遺伝子組み換え抗体、それらの抗体断片などを挙げることができる。抗体断片としては、ＡＴＸｗｔに対して特異的結合性を示す抗体断片であるＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ'）2、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二量化Ｖ領域断片（ｄｉａｂｏｄｙ）などが挙げられる。 The anti-ATXwt antibody of the present invention may be a polyclonal antibody purified from serum obtained by immunizing an animal, or may be a monoclonal antibody, preferably a monoclonal antibody. Examples of the monoclonal antibody include an antibody produced by a hybridoma, a recombinant antibody produced by a transformant transformed with an expression vector containing an antibody gene, and an antibody fragment thereof. Examples of antibody fragments include Fab, Fab ′, F (ab ′) 2 , single-chain antibody (scFv), dimerized V region fragment (diabody), and the like, which are antibody fragments exhibiting specific binding to ATXwt. It is done.
本発明の抗体は、配列番号１からなるアミノ酸配列を含む合成ペプチドをマウス、ラット、ウサギ等の動物に免疫することにより取得することができる。前記合成ペプチドの一例として、ヒトオートタキシン（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＡＢ００８５５．１、配列番号４）の５６９番目から５８６番目までのアミノ酸からなるオリゴペプチド（配列番号５）があげられる。なお、配列番号１に記載のアミノ酸配列（配列番号５に記載のアミノ酸配列のうち、５番目のバリンから８番目のリジンまでのアミノ酸）を維持する限り、配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるオリゴペプチドから、１アミノ酸から数アミノ酸の付加および／または欠損および／または他のアミノ酸への置換が生じてもよい。 The antibody of the present invention can be obtained by immunizing a mouse, rat, rabbit or other animal with a synthetic peptide comprising the amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 1. An example of the synthetic peptide is an oligopeptide (SEQ ID NO: 5) consisting of amino acids from 569 to 586 of human autotaxin (GenBank No. AAB00855.1, SEQ ID NO: 4). As long as the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 (the amino acid from the 5th valine to the 8th lysine among the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 5) is maintained, the amino acid sequence consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5. From an oligopeptide one amino acid to several amino acid additions and / or deletions and / or substitutions to other amino acids may occur.
本発明の抗体の具体例として、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と、配列番号３に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とを有した抗体があげられる。なお、前記重鎖可変領域および／または前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＡＴＸｗｔへの特異的認識能を有する限り、１アミノ酸から数アミノ酸の付加および／または欠損および／または他のアミノ酸への置換が生じてもよい。ＡＴＸｗｔへの特異的認識能を維持する観点から、１又は数アミノ酸の付加、欠損及び／又は置換は、相補性決定領域（ＣＤＲ）ではなく、フレームワーク領域（ＦＲ）に生じることが好ましいが、ＣＤＲに生じる場合もある。 A specific example of the antibody of the present invention is an antibody having a heavy chain variable region consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 and a light chain variable region consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3. As long as the amino acid sequence of the heavy chain variable region and / or the light chain variable region has specific recognition ability to ATXwt, addition and / or deletion of several amino acids and / or other amino acids. Substitution may occur. From the viewpoint of maintaining the specific recognition ability to ATXwt, it is preferable that the addition, deletion and / or substitution of one or several amino acids occur in the framework region (FR), not the complementarity determining region (CDR), It can also occur in CDRs.
本発明のＡＴＸｗｔ認識抗体を用いた、オートタキシンの測定方法は、前処理等をする必要とすることなく、ＡＴＸｗｔを特異的に検出可能な方法である。本発明の測定方法の具体例として、ウエスタンブロッティング、組織染色など一般的な免疫学的手法があげられる。また、本発明のＡＴＸｗｔ認識抗体と、オートタキシンのアミノ酸配列のうち配列番号１からなるアミノ酸配列以外の領域のアミノ酸配列を認識する抗体とを組み合わせた、オートタキシン測定試薬を用いることで、ＡＴＸｗｔをサンドイッチイムノアッセイにより特異的に検出することができる。 The method for measuring autotaxin using the ATXwt-recognizing antibody of the present invention is a method capable of specifically detecting ATXwt without requiring pretreatment or the like. Specific examples of the measuring method of the present invention include general immunological techniques such as Western blotting and tissue staining. Further, by using an autotaxin measuring reagent in which the ATXwt-recognizing antibody of the present invention is combined with an antibody that recognizes an amino acid sequence in a region other than the amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 1 among the amino acid sequences of autotaxin, ATXwt is obtained. It can be specifically detected by sandwich immunoassay.
本明細書において「特異的抗体」とは、目的の抗原以外には実質的に結合しないことをいう。すなわち、「Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ（配列番号１）からなるアミノ酸配列を含むオートタキシンを特異的に認識する抗体」とは、Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ（配列番号１）からなるアミノ酸配列を含むオートタキシンに結合するものの、Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ（配列番号１）からなるアミノ酸配列を含まないオートタキシン欠損アイソフォームに対しては結合しないか、又はＶａｌ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ欠損オートタキシンアイソフォームに比べて、Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ（配列番号１）からなるアミノ酸配列を含むオートタキシンへの結合性が、１００倍以上、好ましくは１０００倍以上、更に好ましくは１００００倍以上である抗オートタキシン抗体のことをいう。 As used herein, “specific antibody” refers to substantially not binding other than the antigen of interest. That is, “an antibody that specifically recognizes autotaxin containing an amino acid sequence consisting of Val-Glu-Pro-Lys (SEQ ID NO: 1)” means an amino acid sequence consisting of Val-Glu-Pro-Lys (SEQ ID NO: 1). Does not bind to an autotaxin-deficient isoform that does not contain the amino acid sequence consisting of Val-Glu-Pro-Lys (SEQ ID NO: 1), or is Val-Glu-Pro-Lys deficient. Compared to the autotaxin isoform, the binding to autotaxin containing an amino acid sequence consisting of Val-Glu-Pro-Lys (SEQ ID NO: 1) is 100 times or more, preferably 1000 times or more, more preferably 10,000 times or more. Is an anti-autotaxin antibody.
以下に実施例を示すが、本発明は実施例に記載された例に限られるものではない。なお、以下の実施例で使用したヒト検体は、インフォームドコンセントのもと採血された検体を用い実施した。 Examples are shown below, but the present invention is not limited to the examples described in the Examples. In addition, the human sample used in the following examples was performed using a sample collected under informed consent.
実施例１ 抗原ペプチドの調製
（１）ヒトオートタキシン（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＡＢ００８５５．１、配列番号４）の５６９番目から５８６番目までのアミノ酸からなるオリゴペプチド（Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ、配列番号５）を定法に従い合成した。
（２）合成したペプチドを、Ｉｍｊｅｃｔ Ｋｅｙｈｏｌｅ Ｌｉｍｐｅｔ Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ（ＰＩＥＲＣＥ社；品番７７１５３）を用い、プロトコールに従って、コンジュゲーションすることで免疫抗原を作製した。
（３）配列番号５からなるオリゴペプチド、および配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるオリゴペプチドのうち、５番目のバリンから８番目のリジンまでのアミノ酸（すなわち、配列番号１からなるアミノ酸配列）を欠損させたオリゴペプチド（Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ、配列番号６）を、Ｉｍｊｅｃｔ Ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ（ＰＩＥＲＣＥ社；品番７７１７１）を用い、プロトコールに従って、コンジュゲーションすることでペプチド−ＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）を作製し、これをスクリーニング用抗原とした。
Example 1 Preparation of Antigen Peptide (1) Oligopeptide (Cys-Asp-Asp-Lys-Val-Glu) consisting of amino acids 569 to 586 of human autotaxin (GenBank No. AAB00855.1, SEQ ID NO: 4) -Pro-Lys-Asn-Lys-Leu-Asp-Glu-Leu-Asn-Lys-Arg-Leu, SEQ ID NO: 5) was synthesized according to a conventional method.
(2) An immunoantigen was prepared by conjugating the synthesized peptide according to a protocol using Image Keyhole Limet Hemocyanin (PIERCE; product number 77153).
(3) Of the oligopeptide consisting of SEQ ID NO: 5 and the oligopeptide consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 5, the amino acids from the fifth valine to the eighth lysine (that is, the amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 1) Oligopeptide (Cys-Asp-Asp-Lys-Asn-Lys-Leu-Asp-Glu-Leu-Asn-Lys-Arg-Leu, SEQ ID NO: 6) was deleted from Image Bovine serum albumin (PIERCE; product number) 77171) and peptide-BSA (Bovine serum albumin) was prepared by conjugation according to the protocol, and this was used as an antigen for screening.
実施例２ スクリーニング用組み換え抗原の調製
組み換え抗原への反応性確認のため、特許文献１に記載の方法に従い、スクリーニング用組み換え抗原を調製した。具体的な方法を以下に示す。
（１）Ａｕｔｏｔａｘｉｎ−ｔ（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｎｏ．Ｌ４６７２０）のうち、６０番目から２６４８番目までのヌクレオチドからなるｃＤＮＡ（配列番号７）をバキュロウイルス用トランスファーベクターｐＦＡＳＴＢａｃ−ＨＴ（インビトロジェン）に導入し、プロトコールに従い、ポリヒスチジンを付加した、配列番号１からなるアミノ酸配列を含むオートタキシン（ＡＴＸｗｔ）発現用バキュロウイルスプラスミドを調製した。
（２）ポリヒスチジンを付加した、配列番号１からなるアミノ酸配列を含まないオートタキシン（ＡＴＸδ）発現用プラスミドとして、（１）で作製したプラスミドを鋳型として、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（東洋紡績）を用いて、配列番号７からなるポリヌクレオチドのうち１７１７番目から１７２８番目のヌクレオチド（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｌ４６７２０の１７７６番目から１７８７番目までのヌクレオチドに相当）を欠損したポリヌクレオチド（配列番号８）を含むプラスミドを調製した。
（３）（１）および（２）で作製したプラスミドを用い、Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃシステム（インビトロジェン）にて組み換えバキュロウイルスを調製した。
（４）（３）で調製したバキュロウイルスを用いて、常法に従い、ｓｆ９昆虫細胞に感染させることにより、ＡＴＸｗｔまたはＡＴＸδを含む発現培養上清を調製した。
（５）発現タンパク質の精製を特許文献４に従い実施した。具体的には以下に示す方法で実施した。
（５−１）抗オートタキシンモノクローナル抗体Ｒ１０．７（特許文献１）をＨｉＴｒａｐ ＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＨＰカラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）に結合させ、ＡＴＸｗｔまたはＡＴＸδ発現培養上清を前記カラムにロードした。
（５−２）ＴＢＳ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で十分洗浄を行なった。
（５−３）１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）により結合したＡＴＸｗｔまたはＡＴＸδを溶出した。
Example 2 Preparation of Recombinant Antigen for Screening In order to confirm the reactivity to the recombinant antigen, a recombinant antigen for screening was prepared according to the method described in Patent Document 1. A specific method is shown below.
(1) Among Autotaxin-t (Genbank No. L46720), cDNA (SEQ ID NO: 7) consisting of nucleotides from the 60th to the 2648th is introduced into a baculovirus transfer vector pFASTBac-HT (Invitrogen), A baculovirus plasmid for autotaxin (ATXwt) expression containing an amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 1 to which polyhistidine was added was prepared.
(2) As an autotaxin (ATXδ) expression plasmid to which polyhistidine is added and does not contain the amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 1, using the plasmid prepared in (1) as a template, KOD-Plus-Mutageness Kit (Toyobo) A plasmid containing a polynucleotide (SEQ ID NO: 8) lacking the nucleotides 1717 to 1728 (corresponding to the nucleotides 1776 to 1787 of GenBank No. L46720) of the polynucleotide consisting of SEQ ID NO: 7 Was prepared.
(3) Using the plasmid prepared in (1) and (2), a recombinant baculovirus was prepared using the Bac-to-Bac system (Invitrogen).
(4) An expression culture supernatant containing ATXwt or ATXδ was prepared by infecting sf9 insect cells using the baculovirus prepared in (3) according to a conventional method.
(5) Purification of the expressed protein was performed according to Patent Document 4. Specifically, the following method was used.
(5-1) Anti-autotaxin monoclonal antibody R10.7 (Patent Document 1) was bound to a HiTrap NHS-activated HP column (GE Healthcare Bioscience), and ATXwt or ATXδ expression culture supernatant was loaded onto the column.
(5-2) Thorough washing was performed with TBS (10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7.4).
(5-3) Bound ATXwt or ATXδ was eluted with 100 mM citrate buffer (pH 5.0).
実施例３ モノクローナル抗体の作製
（１）ＷＫＹラット７週齢メスに対し、抗原２５０μｇをフロイント完全アジュバント（ＤＩＦＣＯ）と共に、エーテル麻酔下で後足に免疫を行なった。
（２）１カ月後、ラットより鼠頚リンパ節および腸骨リンパ節を採取し、Ｂ細胞を回収した。
（３）マウスミエローマ細胞株ＰＡＩとポリエチレングリコール存在下、常法に従い、細胞融合を行ない、約１０日間のＨＡＴ培地による選択を行なった。
（４）実施例１で作製した、スクリーニング用ペプチド−ＢＳＡコンジュゲート抗原を用いＡＴＸｗｔと反応性を示し、かつＡＴＸδと反応性を示さないクローンを選択した。具体的には下記に示す方法で実施した。
（４−１）ペプチド−ＢＳＡコンジュゲート抗原５０ｎｇ（１μｇ／ｍＬ溶液５０μＬ）をＴＢＳにより希釈し９６穴イムノプレート（ＭａｘｉＳｏｒｐ、Ｎａｌｇｅ ＮＵＮＣ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、品番４３０３４１）に添加し、４℃にて一昼夜保存、コーティングした。
（４−２）続いてＴＢＳにより３回の洗浄後、３％−ＢＳＡを含むＴＢＳ溶液を２５０μＬ／ウェルにて各ウェルに添加し、室温で２時間放置した。
（４−３）ＴＢＳにより３回洗浄を行ない、ハイブリドーマ細胞の培養上清を５０μＬ／ウェルにて添加し、室温で２時間放置した。
（４−４）ＴＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＴＢＳ）により６回洗浄を行なった後、ＨＲＰ標識抗ラットイムノグロブリン抗体（５０００倍希釈、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｑｕａｌｅｘ）および１％ ＢＳＡを含むＴＢＳＴを５０μＬ／ウェルにて添加し、室温で２時間放置した。
（４−５）ＴＢＳＴにより６回洗浄を行ない、続いてＴＭＢ基質（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ＆ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、品番：５０−７６−００）を５０μＬ／ウェルで添加し室温１０分放置した。
（４−６）１Ｍ リン酸にて反応を停止しＯＤ450の吸光度を測定し、目的のクローンを選択した。
（４−７）スクリーニング陽性ウェル中の細胞を限界希釈法によりモノクローナル化を行ないハイブリドーマとして樹立した。
（５）得られたハイブリドーマを、ＨＴ培地により約１０日間の培養を行った後、最終的にハイブリドーマ細胞培養用培地により培養を続けた。ハイブリドーマ細胞培養用培地は、ＧＩＴ培地（大日本住友製薬）５００ｍＬに対し、ＮＣＴＣ−１０９培地（インビトロジェン）を２７．５ｍＬ、不必須アミノ酸（インビトロジェン）を５．５ｍＬ、ペニシリン／ストレプトマイシン／グルタミン酸（インビトロジェン）を５．５ｍＬをろ過滅菌し添加したものを用いた。また、前記培地にＨＡＴ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＨＹＢＲＹＭＡＸ、品番：Ｈ０２６２）を添加したものをＨＡＴ培地として、ＨＴ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＨＹＢＲＹＭＡＸ，品番：Ｈ０１３７）を添加したものをＨＴ培地として、それぞれ用いた。
（６）培養上清を回収し、ＡＴＸｗｔを特異的に認識するモノクローナル抗体ＡＴＸＲ４＋４を回収した。
Example 3 Production of Monoclonal Antibody (1) A 7-week-old female WKY rat was immunized with 250 μg of antigen together with Freund's complete adjuvant (DIFCO) in ether under anesthesia.
(2) One month later, cervical lymph nodes and iliac lymph nodes were collected from rats, and B cells were collected.
(3) In the presence of mouse myeloma cell line PAI and polyethylene glycol, cell fusion was carried out according to a conventional method, and selection was carried out using a HAT medium for about 10 days.
(4) Using the screening peptide-BSA conjugate antigen prepared in Example 1, a clone showing reactivity with ATXwt and showing no reactivity with ATXδ was selected. Specifically, it was carried out by the method shown below.
(4-1) Peptide-BSA conjugate antigen 50 ng (1 μg / mL solution 50 μL) was diluted with TBS, added to 96-well immunoplate (MaxiSorp, Nalge NUNC International, product number 430341), stored at 4 ° C. overnight, coated did.
(4-2) Subsequently, after washing three times with TBS, a TBS solution containing 3% -BSA was added to each well at 250 μL / well and left at room temperature for 2 hours.
(4-3) Washing was performed 3 times with TBS, and the culture supernatant of the hybridoma cells was added at 50 μL / well and allowed to stand at room temperature for 2 hours.
(4-4) After washing 6 times with TBST (TBS containing 0.05% Tween 20), 50 μL of TBST containing HRP-labeled anti-rat immunoglobulin antibody (5000-fold diluted, American Qualex) and 1% BSA Per well and left at room temperature for 2 hours.
(4-5) Washing was performed 6 times with TBST, and then TMB substrate (Kirkegaard & Perry Laboratories, product number: 50-76-00) was added at 50 μL / well and allowed to stand at room temperature for 10 minutes.
(4-6) The reaction was stopped with 1M phosphoric acid, the absorbance at OD 450 was measured, and the target clone was selected.
(4-7) Cells in the positive screening well were monoclonalized by the limiting dilution method and established as hybridomas.
(5) The obtained hybridoma was cultured in an HT medium for about 10 days, and finally cultured in a hybridoma cell culture medium. The culture medium for hybridoma cell culture is 27.5 mL of NCTC-109 medium (Invitrogen), 5.5 mL of nonessential amino acid (Invitrogen), 500 mL of GIT medium (Dainippon Sumitomo Pharma), penicillin / streptomycin / glutamic acid (Invitrogen) Was added by sterilizing and filtering 5.5 mL. In addition, HAT (Sigma-Aldrich, HYBRYMAX, product number: H0262) added to the medium was used as HAT medium, and HT (Sigma-Aldrich, HYBRYMAX, product number: H0137) was used as HT medium. .
(6) The culture supernatant was recovered, and a monoclonal antibody ATXR4 + 4 that specifically recognizes ATXwt was recovered.
実施例４ モノクローナル抗体ＡＴＸＲ４＋４の遺伝子配列
実施例３にて取得したＡＴＸｗｔ特異的モノクローナル抗体ＡＴＸＲ４＋４の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の遺伝子配列を決定した。
（１−１）重鎖遺伝子の増幅は、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉキット（ＱＩＡＧＥＮ）にてｔｏｔａｌ ＲＮＡを回収した後、Ｏｎｅ−ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲキット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用しプロトコールに従い実施した。ＰＣＲプライマーは、
（Ａ）５’−ｃｔｇａｇｇｔｔｃｔｃｃｃａｃｔｃ−３’（配列番号９、ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｌ２２６５２の１９番目から３５番目までのヌクレオチドに相当）および５’−ｇｔｃａｃｇｇｔｇａｃｔｇｇｃｔｃａ−３’（配列番号１０、ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｌ２２６５２の５８８番目から６０５番目までのヌクレオチドの相補鎖に相当）の組み合わせ、ならびに
（Ｂ）５’−ｇｇａｇｃｃｃａｇｔｃｃｔｇｇａｃ−３’（配列番号１１、ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｌ２２６５２の１番目から１７番目までのヌクレオチドに相当）および５’−ｃａｇａｔｇｇｇｇｃｔｇｔｔｇ−３’（配列番号１２、ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｌ２２６５２の４９４番目から５０８番目までのヌクレオチドの相補鎖に相当）の組み合わせ
を用いた。
（１−２）（１−１）で得られた２種類のＰＣＲ産物を回収し、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１０（アプライドバイオシステムズ）にてそれぞれシークエンスによりヌクレオチド配列を取得後、重鎖可変領域のヌクレオチド配列を決定した（配列番号１５）。配列番号１５の情報を基に翻訳した、重鎖可変領域のアミノ酸配列を配列番号２に示す。
（２−１）軽鎖遺伝子の増幅は、重鎖と同様に回収したｔｏｔａｌ ＲＮＡを用いＯｎｅ−ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲキットを使用しプロトコールに従い実施した。ＰＣＲプライマーは、５’−ｔｇａｃａｃａｇｔｃｔｃｃａ−３’（配列番号１３、ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＢＣ０８８２５５の８２番目から９５番目までのヌクレオチドに相当）および５’−ｔｇｇａｔｇｇｔｇｇｇａａｇａｔ−３’（配列番号１４、ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＢＣ０８８２５５の４２０番目から４３５番目までのヌクレオチドの相補鎖に相当）の組み合わせを用いた。
（２−２）（２−１）で得られたＰＣＲ産物を、重鎖と同様にシークエンスし塩基配列を決定した。なお、本方法では軽鎖可変領域全ての配列が決定できなかったため、５’−ｔｇｇａｔｇｇｔｇｇｇａａｇａｔ−３’（配列番号１４、ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＢＣ０８８２５５の４２０番目から４３５番目までのヌクレオチドの相補鎖に相当）を用い５’／３’ＲＡＣＥキット（ＲＯＣＨＥ）を用い、プロトコールに従い、軽鎖可変領域のヌクレオチド配列を決定した（配列番号１６）。配列番号１６の情報を基に翻訳した、軽鎖可変領域のアミノ酸配列を配列番号３に示す。
Example 4 Gene Sequence of Monoclonal Antibody ATXR4 + 4 The gene sequence of the heavy chain variable region and the light chain variable region of ATXwt-specific monoclonal antibody ATXR4 + 4 obtained in Example 3 was determined.
(1-1) Amplification of the heavy chain gene was carried out according to the protocol using the One-step RT-PCR kit (QIAGEN) after recovering the total RNA with the RNeasy Mini kit (QIAGEN). PCR primers are
(A) 5′-ctgaggttctccccactc-3 ′ (SEQ ID NO: 9, corresponding to nucleotides 19 to 35 of GenBank No. L22652) and 5′-gtcacgggtgactggctca-3 ′ (SEQ ID NO: 10, 588 of GenBank No. L22652) (B) 5'-gggccccgtcctggac-3 '(SEQ ID NO: 11, corresponding to nucleotides 1 to 17 of GenBank No. L22652) and 5 A combination of '-cagatagggggctgttg-3' (SEQ ID NO: 12, corresponding to the complementary strand of nucleotides 494 to 508 of GenBank No. L22652) was used.
(1-2) Collect the two types of PCR products obtained in (1-1), obtain nucleotide sequences by sequencing at ABI PRISM 310 (Applied Biosystems), and then convert the nucleotide sequence of the heavy chain variable region Determined (SEQ ID NO: 15). The amino acid sequence of the heavy chain variable region translated based on the information of SEQ ID NO: 15 is shown in SEQ ID NO: 2.
(2-1) Amplification of the light chain gene was performed according to the protocol using the One-step RT-PCR kit using total RNA recovered in the same manner as the heavy chain. PCR primers were 5'-tgacacagtctcca-3 '(SEQ ID NO: 13, corresponding to nucleotides from GenBank No. BC0888255 from the 82nd to 95th nucleotides) and 5'-tgatgggtgggaagat-3' (SEQ ID NO: 14, GenBank No. BC088255). The combination of the 420th to 435th nucleotide complementary strands) was used.
(2-2) The PCR product obtained in (2-1) was sequenced in the same manner as the heavy chain to determine the base sequence. Since the entire light chain variable region sequence could not be determined by this method, 5′-tggatgggtgggaagat-3 ′ (SEQ ID NO: 14, corresponding to the complementary strand of nucleotides 420 to 435 of GenBank No. BC088255) Using the 5 ′ / 3 ′ RACE kit (ROCHE), the nucleotide sequence of the light chain variable region was determined according to the protocol (SEQ ID NO: 16). The amino acid sequence of the light chain variable region translated based on the information of SEQ ID NO: 16 is shown in SEQ ID NO: 3.
実施例５ ＡＴＸＲ４＋４のウエスタンブロッティングによる反応性解析
実施例２に従い調製したバキュロウイルス−昆虫細胞系で発現させ、精製したＡＴＸｗｔおよびＡＴＸδを用い、ウエスタンブロッティングによりＡＴＸＲ４＋４の反応性を検証した。なお、対照としてヒトオートタキシンＮ末端領域の大腸菌発現抗原を用い作製した抗オートタキシンモノクローナル抗体（Ｒ１．１Ａ９、全てのオートタキシンＮ末端を認識する抗体）を用いた。具体的には以下に示す方法で実施した。
（１）ＡＴＸｗｔまたはＡＴＸδを８０ｎｇ／レーンにて、還元条件下ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を行なった。
（２）電気泳動後、ポリフッ化ビニリデン膜にＳｅｍｉｄｒｙ Ｔｒａｎｓｂｌｏｔ（ＢＩＯＲＡＤ）を用い常法に従い転写した。
（３）非特異的結合を回避するために、転写後の膜を３％スキムミルクを含むＴＢＳ溶液にて２時間のブロッキングを行ない、その後１μｇ／ｍＬのＡＴＸＲ４＋４抗体またはＲ１．１Ａ９抗体と反応させた。
（４）ＴＢＳＴによる十分な洗浄後、１ Ｓｔｅｐ ＮＢＴ／ＢＣＩＰ試薬（ＰＩＥＲＣＥ）により抗体の結合を検出した。
Example 5 Reactivity Analysis by Western Blotting of ATXR4 + 4 The reactivity of ATXR4 + 4 was verified by Western blotting using ATXwt and ATXδ expressed in a baculovirus-insect cell system prepared according to Example 2 and purified. As a control, an anti-autotaxin monoclonal antibody (R1.1A9, an antibody that recognizes all autotaxin N-termini) prepared using an E. coli-expressed antigen in the human autotaxin N-terminal region was used. Specifically, the following method was used.
(1) SDS-PAGE electrophoresis was carried out under reducing conditions with ATXwt or ATXδ at 80 ng / lane.
(2) After electrophoresis, the membrane was transferred to a polyvinylidene fluoride membrane according to a conventional method using Semitrans Transblot (BIORAD).
(3) In order to avoid non-specific binding, the transferred membrane was blocked with a TBS solution containing 3% skim milk for 2 hours, and then reacted with 1 μg / mL of ATXR4 + 4 antibody or R1.1A9 antibody. .
(4) After sufficient washing with TBST, antibody binding was detected with 1 Step NBT / BCIP reagent (PIERCE).
結果、図１に示す通り、ＡＴＸＲ４＋４抗体は、ＡＴＸδとは反応性を示さずＡＴＸｗｔとのみ反応性を示す結果が得られた。一方、オートタキシンＮ末端を認識するモノクローナル抗体であるＲ１．１Ａ９抗体は、ＡＴＸｗｔおよびＡＴＸδを、いずれも同程度の感度で検出した。このことより、ＡＴＸＲ４＋４抗体はＡＴＸｗｔと特異的に反応するモノクローナル抗体であることが確認された。 As a result, as shown in FIG. 1, the ATXR4 + 4 antibody did not show reactivity with ATXδ, but only with ATXwt. On the other hand, the R1.1A9 antibody, which is a monoclonal antibody that recognizes the autotaxin N-terminus, detected ATXwt and ATXδ with the same sensitivity. This confirmed that the ATXR4 + 4 antibody is a monoclonal antibody that specifically reacts with ATXwt.
実施例６ 天然状態ＡＴＸｗｔへの反応性検証
（１）天然状態ＡＴＸｗｔへの反応性の検証のため実施例２により調製したＡＴＸｗｔを、特許文献４に記載の方法でオートタキシンを吸着して除いた牛血清に添加し、ＡＴＸｗｔのみを含む試料を調製した。
（２）試料中のオートタキシン濃度を、特許文献１に記載のオートタキシン定量法により決定した。
（２−１）ＡＴＸＲ４＋４抗体をＮＨＳ−Ｂｉｏｔｉｎ（Ｓｉｇｍａ）試薬を用い常法に従いビオチン標識を施した。
（２−２）Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（ベリタス）懸濁液１０μＬに対し、１０μｇのビオチン標識ＡＴＸＲ４＋４を添加した。
（２−３）１０分後、ＴＢＳＴにて十分洗浄した後、約０．４ｍｇ／ＬのＡＴＸｗｔを含む試料１ｍＬを添加し、緩やかに撹拌を続けながら１時間室温にて反応させた。
（２−４）磁石にてＡＴＸＲ４＋４抗体が結合したＤｙｎａｂｅａｄｓを回収し、上清中のオートタキシン濃度を測定した。なお、対照としてビオチン標識ＡＴＸＲ４＋４抗体を添加せずＤｙｎａｂｅａｄｓのみで処理した同一試料の上清中のオートタキシン濃度を測定しバックグラウンド値とした。
Example 6 Verification of reactivity to natural state ATXwt (1) ATXwt prepared in Example 2 for verification of reactivity to natural state ATXwt was removed by adsorbing autotaxin by the method described in Patent Document 4. A sample containing only ATXwt was prepared by adding to bovine serum.
(2) The autotaxin concentration in the sample was determined by the autotaxin quantification method described in Patent Document 1.
(2-1) ATXR4 + 4 antibody was labeled with biotin using NHS-Biotin (Sigma) reagent according to a conventional method.
(2-2) 10 μg of biotin-labeled ATXR4 + 4 was added to 10 μL of Dynabeads Streptavidin (Veritas) suspension.
(2-3) Ten minutes later, after thoroughly washing with TBST, 1 mL of a sample containing about 0.4 mg / L of ATXwt was added and allowed to react at room temperature for 1 hour while continuing gentle stirring.
(2-4) Dynabeads to which ATXR4 + 4 antibody was bound was collected with a magnet, and the autotaxin concentration in the supernatant was measured. As a control, the autotaxin concentration in the supernatant of the same sample treated with only Dynabeads without adding biotin-labeled ATXR4 + 4 antibody was measured and used as a background value.
結果、図２に示す通り、対照であるバックグラウンド中のオートタキシン濃度が０．３８ｍｇ／Ｌであったのに対し、ＡＴＸＲ４＋４抗体を結合させたＤｙｎａｂｅａｄｓにより処理したサンプル中のオートタキシン濃度は０．３１ｍｇ／Ｌと約２０％低減し、ＡＴＸＲ４＋４抗体は、溶液中にあるＡＴＸｗｔとの反応性を有していることが示された。 As a result, as shown in FIG. 2, the autotaxin concentration in the control background was 0.38 mg / L, whereas the autotaxin concentration in the sample treated with Dynabeads bound with the ATXR4 + 4 antibody was 0. The ATXR4 + 4 antibody was shown to be reactive with ATXwt in solution, reducing by approximately 20% to 31 mg / L.
実施例７ ヒト血清中のＡＴＸｗｔおよびＡＴＸδの検出
ヒト血清中のＡＴＸｗｔおよびＡＴＸδの存在検出を以下の手順にて行なった。
（１）プロトコールに従い１ｍＬ容量のＨｉＴｒａｐ ＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＨＰ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）カラムに５ｍｇのモノクローナル抗体を結合させたアフィニティーカラムを２種類作製した。一つは、ＡＴＸ４＋４モノクローナル抗体を結合させたアフィニティーカラムであり、本カラムに結合した物質にはＡＴＸｗｔが含まれ、本カラムの素通り画分にはＡＴＸδが含まれることが期待される。もう一つは、ＡＴＸ全てに結合能を有するＲ１０．２３抗体（特許文献１および特許文献４）を結合させたアフィニティーカラムであり、本カラムの素通り画分にはＡＴＸｗｔ、ＡＴＸδいずれも含まれないことが期待される。
（２）１．１６ｍｇ／Ｌのオートタキシンを含む健常者ヒト血清７ｍＬをＡＴＸＲ４＋４結合アフィニティーカラムにロードした。なお、各試料のオートタキシン濃度は特許文献１に記載のオートタキシン定量試薬を用い、全自動エンザイムイムノアッセイ装置 ＡＩＡ−１８００（東ソー、製造販売届出番号：１３Ｂ３Ｘ９０００２０００００２）にて定量している。
（３）素通り画分を回収する一方、カラムは十分量のＴＢＳにて洗浄後、１００ｍＭグリシン（ｐＨ２．５）溶液でカラムに結合した物質を溶出し、溶出画分はＴＢＳにて十分透析した後に、解析用サンプルとした。
（４）素通り画分は続いてＲ１０．２３を結合させたアフィニティーカラムにロードした。本作業により、本カラムに結合した物質には（３）の素通り画分に残存したＡＴＸδが含まれ、素通り画分にはＡＴＸｗｔ、ＡＴＸδいずれも含まれないことが期待される。
（５）（３）と同様に、素通り画分を回収する一方、カラムは十分量のＴＢＳにて洗浄後、１００ｍＭグリシン（ｐＨ２．５）溶液でカラムに結合した物質を溶出し、溶出画分はＴＢＳにて十分透析後解析用サンプルとした。２種類のカラムを共に素通りした画分中のオートタキシン濃度を定量した結果、０．００ｍｇ／ｍＬであることを確認し、ヒト血清中に存在したオートタキシン全てを２種類のカラムで結合回収できたことを確認した。
（６）ＡＴＸＲ４＋４結合カラムに結合後に溶出した画分（以下、ＡＴＸＲ４＋４結合画分とする）、およびＲ１０．２３結合カラムに結合後に溶出した画分（以下、Ｒ１０．２３結合画分とする）を、実施例５同様、電気泳動、膜への転写を実施し、ＡＴＸＲ４＋４抗体およびＲ１．１Ａ９抗体にてオートタキシンを検出した。
（７）同様の実験を、異なるヒト健常人血清についても実施した。
Example 7 Detection of ATXwt and ATXδ in human serum The presence of ATXwt and ATXδ in human serum was detected by the following procedure.
(1) According to the protocol, two types of affinity columns were prepared by binding 5 mg of monoclonal antibody to a 1 mL capacity HiTrap NHS-activated HP (GE Healthcare Bioscience) column. One is an affinity column to which an ATX4 + 4 monoclonal antibody is bound. The substance bound to this column contains ATXwt, and the passing fraction of this column is expected to contain ATXδ. The other is an affinity column in which R10.23 antibody (Patent Document 1 and Patent Document 4) having binding ability to all ATX is bound, and neither ATXwt nor ATXδ is included in the flow-through fraction of this column. It is expected.
(2) 7 mL of healthy human serum containing 1.16 mg / L autotaxin was loaded onto an ATXR4 + 4 binding affinity column. In addition, the autotaxin concentration of each sample is quantified with the fully automated enzyme immunoassay apparatus AIA-1800 (Tosoh, manufacturing and sales notification number: 13B3X90002000002) using the autotaxin assay reagent described in Patent Document 1.
(3) While collecting the flow-through fraction, the column was washed with a sufficient amount of TBS, and then the substance bound to the column was eluted with a 100 mM glycine (pH 2.5) solution, and the eluted fraction was sufficiently dialyzed with TBS. Later, it was used as a sample for analysis.
(4) The flow-through fraction was subsequently loaded onto an affinity column to which R10.23 was bound. As a result of this work, it is expected that the substance bound to this column contains ATXδ remaining in the flow-through fraction of (3), and the flow-through fraction contains neither ATXwt nor ATXδ.
(5) As in (3), while the flow-through fraction is collected, the column is washed with a sufficient amount of TBS, and then the substance bound to the column is eluted with a 100 mM glycine (pH 2.5) solution. Was used as a sample for analysis after sufficient dialysis with TBS. As a result of quantifying the autotaxin concentration in the fraction passed through the two types of columns, it was confirmed that the autotaxin concentration was 0.00 mg / mL, and all the autotaxin present in human serum could be bound and recovered with the two types of columns. I confirmed that.
(6) The fraction eluted after binding to the ATXR4 + 4 binding column (hereinafter referred to as ATXR4 + 4 binding fraction) and the fraction eluted after binding to the R10.23 binding column (hereinafter referred to as R10.23 binding fraction). As in Example 5, electrophoresis and transfer to a membrane were carried out, and autotaxin was detected with the ATXR4 + 4 antibody and the R1.1A9 antibody.
(7) A similar experiment was performed on different healthy human serums.
結果、図３（ａ）および図３（ｂ）（（ａ）、（ｂ）は異なる健常者血清を用いた結果それぞれを示す）に示す通り、ＡＴＸＲ４＋４結合画分、およびＲ１０．２３結合画分には、いずれも、Ｒ１．１Ａ９でのウエスタンブロッティングの結果によりオートオキシンが存在することが確認された。 As a result, as shown in FIG. 3 (a) and FIG. 3 (b) ((a) and (b) show the results using different healthy serums, respectively), the ATXR4 + 4 binding fraction and the R10.23 binding fraction In both cases, the presence of autooxin was confirmed by the results of Western blotting with R1.1A9.
一方、同一試料をＡＴＸＲ４＋４でウエスタンブロッティングした場合は、ＡＴＸＲ４＋４結合画分とのみ反応性を示す。このことから、ＡＴＸＲ４＋４結合カラムにはＡＴＸｗｔのみが結合し、Ｒ１０．２３結合カラムにはＡＴＸδのみが結合していることが確認できる。さらに、ヒト血清中には、ＡＴＸｗｔとＡＴＸδの、いずれもが存在し、その濃度に大きな差はないことも明らかとなった。 On the other hand, when the same sample is subjected to Western blotting with ATXR4 + 4, it shows reactivity only with the ATXR4 + 4 binding fraction. From this, it can be confirmed that only ATXwt is bound to the ATXR4 + 4 binding column and only ATXδ is bound to the R10.23 binding column. Furthermore, it has been clarified that both ATXwt and ATXδ are present in human serum, and there is no significant difference in their concentrations.
実施例８ ＡＴＸｗｔ特異的測定試薬の調製
特許文献１と同様の方法でＡＴＸｗｔ特異的測定試薬の調製を行なった。具体的には以下に示す方法で実施した。
（１）水不溶性担体（内部にフェライトを練り込んだ粒子径約１．５ｍｍのエチレンビニルアルコール製担体）に抗ヒトオートタキシンモノクローナル抗体（Ｒ１０．２３）を１００ｎｇ／担体になるように３０℃にて一昼夜物理的に吸着させ、その後１％ＢＳＡを含む１００ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）にて４０℃・４時間ブロッキングを行なうことで抗体固定化担体を調製した。
（２）抗ヒトオートタキシンモノクローナル抗体（ＡＴＸＲ４＋４）をアルカリフォスファターゼ標識用キット−ＮＨ２（同仁化学研究所、品番：ＬＫ１２）を用いてアルカリ性ホスファターゼと結合させることで標識抗体を調製した。
（３）磁力透過性の容器（容量１．２ｍＬ）に１２個の抗体固定化担体を入れた後、０．７μｇ／ｍＬの標識抗体を含む緩衝液（３％ＢＳＡを含むトリス緩衝液、ｐＨ８．０）５０μＬを容器に添加し凍結乾燥することでオートタキシン測定試薬を調製した。オートタキシン測定試薬は窒素充填下密閉封印シールを施し測定まで４℃にて保管した。
（４）既知濃度ヒトオートタキシン標準品を特許文献１に記載の方法で調製した。具体的には、下記に示す方法で実施した。
（４−１）オートタキシンモノクローナル抗体（Ｒ１０．２３）結合カラムを用い、牛血清中のオートタキシンを吸着させることで、オートタキシン非含有血清を調製した。
（４−２）実施例２に記載の方法で精製した組み換えＡＴＸｗｔを用い、オートタキシン非含有血清に適当な濃度添加することで、濃度の異なる５濃度（オートタキシン非含有血清を加えると６濃度）の標準品を作製した。標準品の濃度決定は特許文献１に記載のオートタキシン定量試薬にて決定した。
Example 8 Preparation of ATXwt-specific measuring reagent ATXwt-specific measuring reagent was prepared in the same manner as in Patent Document 1. Specifically, the following method was used.
(1) An anti-human autotaxin monoclonal antibody (R10.23) at 30 ° C. at 100 ng / carrier in a water-insoluble carrier (a carrier made of ethylene vinyl alcohol having a particle diameter of about 1.5 mm kneaded with ferrite inside). The antibody-immobilized carrier was prepared by physically adsorbing for a whole day and night, followed by blocking with 100 mM Tris buffer (pH 8.0) containing 1% BSA at 40 ° C. for 4 hours.
(2) A labeled antibody was prepared by binding an anti-human autotaxin monoclonal antibody (ATXR4 + 4) to alkaline phosphatase using an alkaline phosphatase labeling kit-NH2 (Dojindo Laboratories, product number: LK12).
(3) After 12 antibody-immobilized carriers are placed in a magnetically permeable container (capacity 1.2 mL), a buffer solution containing 0.7 μg / mL labeled antibody (Tris buffer solution containing 3% BSA, pH 8) 0.0) An autotaxin measuring reagent was prepared by adding 50 μL to a container and freeze-drying. The autotaxin measurement reagent was hermetically sealed under nitrogen filling and stored at 4 ° C. until measurement.
(4) A known standard human autotaxin standard was prepared by the method described in Patent Document 1. Specifically, the following method was used.
(4-1) Autotaxin-free serum was prepared by adsorbing autotaxin in bovine serum using an autotaxin monoclonal antibody (R10.23) binding column.
(4-2) Using recombinant ATXwt purified by the method described in Example 2 and adding appropriate concentration to autotaxin-free serum, 5 concentrations with different concentrations (6 concentrations when autotaxin-free serum is added) ) Was produced. The concentration of the standard product was determined using the autotaxin assay reagent described in Patent Document 1.
本実施例で調製した、ＡＴＸｗｔ特異的測定試薬について、標準品を用いて作成した検量線を図４に示す。図４の検量線は、縦軸に測定値のｌｏｇ値を、横軸に各標準品のオートタキシン濃度をとり、オートタキシン非含有血清試料における測定値を０．０１ｍｇ／Ｌでの値として代用し作成したものである。 FIG. 4 shows a calibration curve prepared using a standard product for the ATXwt-specific measurement reagent prepared in this example. The calibration curve in FIG. 4 takes the log value of the measured value on the vertical axis, the autotaxin concentration of each standard product on the horizontal axis, and substitutes the measured value in the autotaxin-free serum sample as a value at 0.01 mg / L. It was created.
実施例９ ＡＴＸｗｔ特異的測定試薬による測定（その１）
実施例８で調製した測定試薬を用い、健常者血清２種（オートタキシン濃度が低濃度の血清と中濃度の血清）、および健常者血清に、実施例２に記載の方法で精製した組み換えＡＴＸｗｔを添加した高濃度試料の計３種類の検体を１０重測定した際のばらつき（ＣＶ（％））を検証した。表１に示す通り、いずれもＣＶは５％以下であり測定精度は良好であった。
Example 9 Measurement with ATXwt-specific measuring reagent (1)
Recombinant ATXwt purified by the method described in Example 2 using the measurement reagent prepared in Example 8 and two normal serums (a serum with a low autotaxin concentration and a serum with a medium concentration) The variation (CV (%)) when ten kinds of three kinds of specimens of the high concentration sample added with the total amount were measured was verified. As shown in Table 1, the CV was 5% or less in all cases, and the measurement accuracy was good.
実施例１０ ＡＴＸｗｔ特異的測定試薬による測定（その２）
実施例８で調製した測定試薬を用い、健常者血清を、実施例８（４−１）で調製したオートタキシン非含有血清を用い２倍希釈系列を調製した。前記希釈系列を５重測定し、測定値の平均とばらつき（ＣＶ（％））をプロットする（図５）ことで実効検出感度を算出した。ＣＶが２０％になる濃度を算出した結果６８μｇ／Ｌとなり、実施例８で調製したＡＴＸｗｔ特異的測定試薬がＡＴＸｗｔを非常に高感度に測定する試薬であることが確認された。
Example 10 Measurement with ATXwt-specific measuring reagent (2)
Using the measurement reagent prepared in Example 8, a normal dilution serum was prepared, and the autotaxin-free serum prepared in Example 8 (4-1) was used to prepare a 2-fold dilution series. The dilution series was measured five times, and the average detection sensitivity and the variation (CV (%)) were plotted (FIG. 5) to calculate the effective detection sensitivity. As a result of calculating the concentration at which CV was 20%, it was 68 μg / L, and it was confirmed that the ATXwt-specific measurement reagent prepared in Example 8 is a reagent that measures ATXwt with very high sensitivity.
Claims (6)
オートタキシンのアミノ酸配列のうち、配列番号１からなるアミノ酸配列以外の領域のアミノ酸配列を認識する抗体と、
を用いて、サンドイッチイムノアッセイにより、配列番号１からなるアミノ酸配列を含むオートタキシンを検出する方法。 The antibody according to any one of claims 1 to 3 ,
An antibody that recognizes an amino acid sequence of a region other than the amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 1 among the amino acid sequences of autotaxin;
And autotaxin comprising the amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 1 by sandwich immunoassay.
オートタキシンのアミノ酸配列のうち、配列番号１からなるアミノ酸配列以外の領域のアミノ酸配列を認識する抗体と、
を含む、サンドイッチイムノアッセイによりオートタキシンを検出する試薬。 The antibody according to any one of claims 1 to 3 ,
An antibody that recognizes an amino acid sequence of a region other than the amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 1 among the amino acid sequences of autotaxin;
A reagent for detecting autotaxin by sandwich immunoassay.
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