JP6094393B2 - 被覆体、及び被覆体の使用方法 - Google Patents

Description

本発明は、固相基板上に試料溶液を接触させる際に、該溶液を基板上に保持する目的で使用する被覆体及びその方法に関する。

マイクロアレイは、固相基板表面に生理活性物質を固定化したデバイスである。例えば
核酸マイクロアレイの場合、核酸がプラスチックやガラスなどの固相基板上に固定されている。核酸マイクロアレイの使用形態は、細胞などの検体から検出、増幅した核酸を含む溶液をマイクロアレイ上に展開し、所定時間反応させる。マイクロアレイ上に固定された核酸と試料溶液中の核酸が、塩基配列の相同性に対応してハイブリダイゼーション反応を生じ、この反応率を蛍光色素や放射同位体などの標識物によって定量化することにより、試料溶液に含まれる核酸の配列に関する情報を得ることができる。

一般的に生理活性物質の反応は液相反応であるため、マイクロアレイ上に固定された生理活性物質と試料を反応させるためには、試料を溶液状態でマイクロアレイ表面に接触させ、一定時間保持する必要がある。この操作では試料溶液をマイクロアレイ表面が前面にわたって均一に接触することが重要となる。均一な接触とは、液相の厚みが一定であり、気泡などが含まれていないことである。また、反応中の試料溶液の蒸発を防ぐことも重要となる。試料溶液とマイクロアレイの接触が不均一であったり、試料溶液の一部が蒸発したりすると、マイクロアレイ上の位置によって反応効率に差異が生じてしまい、得られたデータの信頼性が低くなる。

試料溶液とマイクロアレイの均一に展開させるために、ハイブリカバーとマイクロアレイとの間に一定の空間を持たせる方法が検討された（例えば、特許文献１）。
しかしながら、ハイブリカバーをマイクロアレイ上に乗せるだけでは、ハイブリダイゼーション中にハイブリカバーが動いてしまい肝心な生理活性物質上をカバーできなくなるという問題があった。

特開２００３−２１６３７

本発明は、基板上に液体を貯留するために、前記基板上に設置される被覆体であって、液体の展開性を向上させ、かつ、液体と固相基板の不均一な接触を低減した被覆体を提供することを目的とする。

このような目的は、下記（１）〜（９）の本発明によって達成する。
（１）基板上に液体を貯留するために、前記基板上に設置される被覆体であって、前記基板は、その上側表面に検体捕獲部を有し、前記被覆体は、凹部と、前記凹部と前記検体捕獲部の相対位置を合わせるための係止部とを有し、前記凹部は、前記検体捕獲部を覆う液体を貯留するための貯留部と、前記貯留部に連通した２つ以上の流路部とを有し、前記流路部は、前記貯留部と連通した連通口と、前記連通口とは反対側の端部に開放口とを有することを特徴とする被覆体。
（２）前記検体捕獲部は、生物由来物を捕獲する物質が点着固定されたものである上記（１）に記載の被覆体。
（３）前記係止部は、前記被覆体の先端面に配置された２つ以上の第１係止部と、前記被覆体の側面の対向する位置に配置された２つ以上の第２係止部とを有するものである上記（１）または（２）に記載の被覆体。
（４）前記第１係止部は、前記被覆体の先端方向に、前記被覆体が前記基板より延在した部分の少なくとも一部が、前記基板の先端面に接するように屈曲したものである上記（３）に記載の被覆体。

（５）前記第２係止部は、前記被覆体の側面方向に、前記被覆体が前記基板より延在した部分の少なくとも一部が、前記基板の側面に接するように屈曲したものである上記（３）または（４）に記載の被覆体。
（６）前記凹部の深さは、０．２ｍｍ以上、１ｍｍ以下である上記（１）ないし（５）いずれかに記載の被覆体。
（７）前記流路の連通口の幅は、前記貯留部における前記連通口の幅方向と平行方向の最大幅より狭いものである上記（１）ないし（６）いずれかに記載の被覆体。
（８）前記被覆体の素材がプラスチックである上記（１）ないし（７）いずれかに記載の被覆体。
（９）前記プラスチックが透明または半透明である上記（８）に記載の被覆体。
（１０）上記（１）ないし（９）いずれかに記載の被覆体を前記基板上に設置し、前記開口部に生物由来物を含む液体を注入し、基板上に生物由来物を含む液体を貯留する方法。

本発明によれば、基板上に液体を貯留するために、前記基板上に設置される被覆体であって、液体の展開性を向上させ、かつ、液体と固基板の不均一な接触を低減した被覆体を提供することができる。

本発明の被覆体の第一実施形態の一例を示す下面図である。 本発明の被覆体の第一実施形態の一例を示す上面図である。 本発明の被覆体の使用状態の一例を示す下面図である。 本発明の被覆体の第一実施形態の一例を示す側面図である。 本発明の被覆体の使用状態の一例を示す側面図である。 本発明の被覆体の第一実施形態の一例を示す正面図である。 本発明の被覆体の使用状態の一例を示す正面図である。

本発明の被覆体の一例を、図を参照しながら詳細に説明する。

図１は本発明の一実施形態に係る被覆体１００を、下から見た下面図であり、図２は被覆体１００を上から見た上面図である。尚、本発明において、被覆体の下面とは、凹部を有し、基板上に液体を貯留するために、基板表面と貼り合わされる面であり、上面とは、下面の反対側の面である。
図１に示すように、本発明の一実施形態に係る被覆体１００は、第１領域１０と、第１領域１０に隣接した第２領域２０とからなり、第１領域１０に凹部１１を有し、第２領域２０に係止部２１〜２４を有し、さらに、凹部１１は、流路部１１１、１１２、および貯留部１１３を有する。

（凹部）
図３は、本発明の一実施形態に係る被覆体１００を、基板上に設置した一例の下面図である。
図３に示すように、凹部１１は、被覆体１００が基板２００上に設置される際に、基板２００と接する面側に設けられたものであり、基板２００と被覆体１００の間に、液体を貯留することが可能な空間を与えるものである。

（貯留部）
また、図１および図３に示すように、凹部１１は、基板２００の検体捕獲部２１０を覆う液体を貯留するための貯留部１１３と、前記貯留部１１３に連通した流路部１１１と１１２とを有する。
貯留部１１３は、基板２００の検体捕獲部２１０の全面を最小限の面積で覆うものであり、最少減の液量の液体で、検体捕獲部２１０の表面全体を充たすことができる。
尚、貯留部１１３の平面形状は特に限定されず、３角形や４角形等の多角形であっても良いが、液体の展開性が良好である点や、発生した気泡が後述する開口部から抜けやすい点から略円状や略楕円状であることが好ましい。

（流路部）
また、流路部１１１は貯留部１１３に連通した連通口と、前記連通口とは反対側の端部に開放口１１４を有する。また、貯留部１１３において、流路部１１１と対向する位置に流路部１１２が配置され、流路部１１２は貯留部１１３に連通した連通口と、前記連通口とは反対側の端部に開放口１１５を有する。
ここで、基板２００の検体捕獲部２１０を覆う液体は、例えば開放口１１４から注入され、流路部１１１を通過して貯留部１１３に展開される。あるいは、開放口１１５から注入され、流路部１１２を通過して貯留部１１３に展開されても良い。

尚、開放口１１４、１１５の内、いずれか一方から液体を注入した場合、他方の開放口から押し出された空気が抜けるため、貯留部１１３に液体を注入する際の液詰まりが起こりにくくなる。また、液詰まりにより発生する凹部１１への気泡の混入による液体と検体捕獲部２１０の不均一な接触を防ぐことができる。
さらに、凹部１１に気泡が入ってしまった場合でも、基板２００を傾けて開放口に気泡を移動させることで、気泡を取り除くことが容易となる。
尚、本発明にかかる被覆体において、貯留部に連通した流路部は、２つ以上であればよく、図１の実施形態に限定されることはなく、３つ以上の流路部を有していても前記効果を発揮することができる。

また、本発明にかかる被覆体において、流路部の連通口の幅は、貯留部における前記連通口の幅方向と平行方向の最大幅より狭いものであることが好ましい。これにより、液体が貯留部に留まり易くなり、また貯留部に貯留された液体が蒸発し難くなる。
例えば、図１においては、流路部１１１の連通口の幅Ａは、貯留部１１３における、幅方向と平行方向の最大幅Ｂより狭く設計されている。

ここで、本発明にかかる被覆体において、凹部の深さは、０．２ｍｍ以上、１ｍｍ以下であることが好ましく、より好ましくは０．３ｍｍ以上、０．８ｍｍ以下であり、０．４以上、０．６ｍｍ以下であることがより一層好ましい。凹部の深さが、前記下限値未満の場合、貯留部に貯留できる液量が少ないため、検体捕獲部に点着固定された、生物由来物を捕獲する物質に対し、貯留された液体中の生物由来物が少なくなり、生物由来物を捕獲する物質と生物由来物との反応が、前記点着部間でばらつく場合がある。また、凹部の深さが、前記上限値より深い場合には、貯留部に貯留できる液量が多すぎるため、コスト面で好ましくない。

（係止部）
図１、図３に示すように、被覆体１００において、係止部２１〜２４は、凹部１１と、基板２００の検体捕獲部２１０の相対位置を合わせる役割を有する。
特に、検体捕獲部の面積が小さい場合には、被覆体の微小なズレにより、凹部の貯留部で検体捕獲部全面を覆うことができなくなる場合があるところ、係止部により、基板に対して、被覆体を所定の位置に固定することができ、凹部と、検体捕獲部の相対位置を合わせることができるものである。

また、図１に示すように、係止部２１〜２４は、被覆体１００の先端面に配置された第１係止部（係止部２１、２２）と、被覆体１００の側面の対向する位置に配置された第２係止部（係止部２３、２４）に分類される。
このように、係止部が、被覆体の先端面に配置された第１係止部と、被覆体の側面の対向する位置に配置された第２係止部を含むことにより、基板に対して、被覆体を縦横いずれの方向においても所定の位置に固定することができ、凹部と、検体捕獲部の相対位置をより確実に合わせることができる。
尚、第１係止部と第２係止部の数は、図１の実施形態に限定されることはなく、それぞれ３つ以上であっても前記効果を発揮することができる。

図４は、本発明の一実施形態に係る被覆体１００を、側面から見た側面図であり、図５は、本発明の一実施形態に係る被覆体１００を、基板上に設置した例の側面図である。
図４および図５に示すように、第１係止部（係止部２１、２２）は、被覆体１００の先端方向に、被覆体１００が基板２００より延在した部分が、基板２００の先端面に接するように垂直に屈曲したものである。第１係止部が、このような構造であることにより、前記効果をより顕著に発揮することができる。

図６は、本発明の一実施形態に係る被覆体１００を、正面から見た正面図であり、図７は、本発明の一実施形態に係る被覆体１００を、基板上に設置した例の正面図である。
図６および図７に示すように、第２係止部（係止部２３、２４）は、被覆体１００の側面方向に、被覆体１００が基板２００より延在した部分が、基板２００の側面に接するように垂直に屈曲したものである。第２係止部が、このような構造であることにより、前記効果をより顕著に発揮することができる。

尚、図１に示すように、係止部２１、２３は、第１スペーサー部２５を、係止部２２、２４は第２スペーサー部２６を介して、第１領域１０と一体に連接されている。第１スペーサー部２５、第２スペーサー部２６は、係止部２１〜２４と凹部１１の相対位置を定めるものであり、すなわち、係止部２１〜２４により、凹部１１と、検体捕獲部２１０の相対位置を確実に合わせることができるという効果に寄与するものである。
また、第１スペーサー部２５、第２スペーサー部２６は、開口部１１５の両端と被覆体１００の側面との間の領域で第１領域１０とそれぞれ接合し、開口部１１５を挟んで一対に併設されている。これにより、開口部１１５から液体を注入することが容易となり、また、凹部１１の貯留部１１３に液体を貯留した際、毛細管現象により、貯留部１１３から第２領域に液体が漏れ出ることを防止することができる。

ここで、被覆体１００の素材は、特に限定されないが、被覆体１００全体を一体成型することが容易である点や、取り扱い時の安全性が高い点において、プラスチックであることが好ましい、
さらに、前記プラスチックは、透明、半透明であることが好ましい。これにより、凹部１１に注入した液体の展開の状態や、気泡の発生の有無を視認することができるため、液体と基板の不均一な接触を低減することができる。

また、被覆体１００を用いて、基板２００上に液体を貯留する方法は、特に限定されないが、例えば、前記基板２００の検体捕獲部２１０を有する面と、被覆体１００の凹部１１が形成された面が接するように貼り合わせ、開放口１１４から液体を注入することにより行われる。注入された液体は、流路部１１１を通過して貯留部１１３に展開される。
ここで、前記液体としては、特に限定されないが、検体捕獲部２１０に点着固定された、生物由来物を捕獲する物質と、特異的な反応性を有する生物由来物を含む液体等が挙げられる。
尚、前記生物由来物としては、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、糖鎖等が挙げられる。

また、被覆体１００は、第１領域１０と第２領域２０の境界に段差が設けられたものであることが好ましい。具体的には、図４に示すように、被覆体１００が基板２００と接する面側に、第１領域１０の高さが第２領域２０の高さより高くなっていることが好ましい。
これにより、凹部１１の貯留部１１３に液体を貯留した際、毛細管現象により、貯留部１１３から第２領域に液体が漏れ出ることを防止することができる。
前記段差は特に限定されないが、０．３μｍ以上、０．８μｍ以下であることが好ましく、０．４μｍ以上、０．６μｍ以下であることがより好ましい。前記段差が上記範囲内であることにより、前記効果をより顕著に発揮することができる。

本発明の好ましい実施の形態は上記の通りであるが、本発明はこれらに制限されない。また、本実施形態において、本発明の構成による作用および効果を述べているが、これら作用および効果は、一例であり、本発明を限定するものではない。

本発明の実施例を以下に記載するが、これに限定されるものではない。

（実施例１）
（１）マイクロアレイの作成
プラスチック基板（縦７５ｍｍ×横２５ｍｍ）に配列１のオリゴＤＮＡを５点スポットして固定化し、ＤＮＡマイクロアレイを得た。
配列１：aattcatggaaaaggtctgcgtcaaatccccagtcgtcatgcattgcc
（２）ハイブリダイゼーション溶液の調整
鋳型となる濃度１．５ｐｇ／μＬに調整したλＤＮＡ(タカラ社製λＤＮＡ)０．５μＬを配列２〜３のオリゴＤＮＡを使用してＰＣＲ反応にて増幅した。ＰＣＲ産物をＣｙ３にて蛍光標識したものをハイブリダイゼーションバッファーに加え、ハイブリダイゼーション溶液を得た。
配列２：acggacttcgttgctttccagtt
配列３：gaattacagcgcaacacagcaata

（３）被覆体の作製
下面視が図１、上面視が図２、側面視が図４、正面視が図６で示される被覆体を作成した。
具体的には、飽和環状ポリオレフィン樹脂（５−メチル−２−ノルボルネンの開環重合体の水素添加物を材料として、射出成形法により被覆体を作製した。被覆体は、長方形の平滑な板状（２５ｍｍ×２５ｍｍ×１ｍｍ）の第１領域を備え、第１領域の片面に深さ０．５ｍｍの凹部を設けた。
凹部には、第１領域の長辺と平行する長径（１７ｍｍ）を有する略楕円形の貯留部と、貯留部の短軸方向の対向する位置に配し、貯留部に連通する２つ流路を設けた。
流路の幅はいずれも５ｍｍであり、貯留部と連通する連通口の幅、連通口とは反対側の端部の幅も同様であった。
第１領域の一方の長辺に隣接した、第２領域には、第１スペーサー部と第２スペーサー部を開口部を挟んで一対に併設した。第１スペーサー部、第２スペーサー部にはいずれも先端および被覆体の側面に第１係止部および第２係止部を設けた。

（４）ハイブリダイゼーション反応
（１）で作製したＤＮＡマイクロアレイ上に（３）で作成した被覆体を設置し、９５℃で５分熱変性させたハイブリダイゼーション溶液を凹部内に分注した。ＤＮＡマイクロアレイを密封できる容器に入れ、加湿条件下にて５５℃で４時間反応を行った。ハイブリダイゼーション反応終了後、マイクロアレイの表面を洗浄して、ハイブリダイゼーション反応を終了した。

（５）測定
（４）で行ったハイブリダイゼーション反応終了後、スピンドライしたＤＮＡマイクロアレイについて、ＤＮＡマイクロアレイ用スキャナー（ＧｅｎｅＰｉｘ：Ａｘｏｎ社製４０００Ｂ）を用いて、プローブがスポットされた位置ごとに蛍光強度を測定した。蛍光強度の算出にあたっては、プローブごとに５個の測定値が得られるが、最高値及び最低値を除く中間の３個の測定値を平均化して、プローブごとに平均値を算出し、これを蛍光強度とした。得られた結果を表１に示す。

（比較例１）
本発明の被覆体の代わりに、凹部、係止部を有さない、長方形の平滑な板状のガラスカバーを使用して実施例１と同様に測定をおこなった。得られた結果を表１に示す。

表１から明らかなように、実施例１においては、基板に点着した５点のオリゴＤＮＡが、ハイブリダイゼーション溶液と均一に反応したのに対し、比較例１では、ハイブリダイゼーション溶液と十分に接触していない点着部があるために、シグナルの平均値が実施例１よりも低い値を示した。

１０ 第１領域
１１ 凹部
２０ 第２領域
２１ 係止部（第１係止部）
２２ 係止部（第１係止部）
２３ 係止部（第２係止部）
２４ 係止部（第２係止部）
２５ 第１スペーサー部
２６ 第２スペーサー部
１００ 被覆体
１１１ 流路部
１１２ 流路部
１１３ 貯留部
１１４ 開口部
１１５ 開口部
２００ 基板
２１０ 検体捕獲部

Claims (10)

1. 基板上に液体を貯留するために、前記基板上に設置される被覆体であって、
   前記基板は、その上側表面に検体捕獲部を有し、
   前記被覆体は、凹部と、前記凹部と前記検体捕獲部の相対位置を合わせるための係止部とを有し、
   前記凹部は、前記検体捕獲部を覆う液体を貯留するための貯留部と、前記貯留部に連通した２つ以上の流路部とを有し、
   前記流路部は、前記貯留部と連通した連通口と、前記連通口とは反対側の端部に開放口とを有することを特徴とする被覆体。
2. 前記検体捕獲部は、生物由来物を捕獲する物質が点着固定されたものである請求項１に記載の被覆体。
3. 前記係止部は、前記被覆体の先端面に配置された２つ以上の第１係止部と、前記被覆体の側面の対向する位置に配置された２つ以上の第２係止部とを有するものである請求項１または２に記載の被覆体。
4. 前記第１係止部は、前記被覆体の先端方向に、前記被覆体が前記基板より延在した部分の少なくとも一部が、前記基板の先端面に接するように屈曲したものである請求項３に記載の被覆体。
5. 前記第２係止部は、前記被覆体の側面方向に、前記被覆体が前記基板より延在した部分の少なくとも一部が、前記基板の側面に接するように屈曲したものである請求項３または４に記載の被覆体。
6. 前記凹部の深さは、０．２ｍｍ以上、１ｍｍ以下である請求項１ないし５いずれか１項に記載の被覆体。
7. 前記流路の連通口の幅は、前記貯留部における前記連通口の幅方向と平行方向の最大幅より狭いものである請求項１ないし６いずれかに記載の被覆体。
8. 前記被覆体の素材がプラスチックである請求項１ないし７いずれか１項に記載の被覆体。
9. 前記プラスチックが透明または半透明である請求項８に記載の被覆体。
10. 請求項１ないし９いずれか１項に記載の被覆体を前記基板上に設置し、前記開口部に生物由来物を含む液体を注入し、基板上に生物由来物を含む液体を貯留する方法。