JP6086472B2 - Determination of optimal reaction solution for bioassay - Google Patents
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Description
本発明は、生物発光を用いるアッセイを行う際、必要な最適反応溶液に関するものである。 The present invention relates to an optimal reaction solution required when performing an assay using bioluminescence.
バイオアッセイにおける適切な反応溶液の選択・使用は結果を左右する重要条件である。特に反応溶液の選択が重視されるバイオアッセイとしては、(１)レポータージーンアッセイ(reporter-gene assay)、(２)ツーハイブリットアッセイ(two-hybrid assay)、(３)酵素結合免疫吸着法(enzyme-linked immunosorbent assay)、(４)放射免疫アッセイ(ラジオイムノアッセイ、RIA)等を取り上げられる(非特許文献１、非特許文献２)。
また、その他のバイオアッセイとして、所謂「分子プローブ」を用いるバイオアッセイ法があり反応溶液の選択が結果を大きく左右する。例えば、細胞内での蛋白質−蛋白質相互作用を発色でイメージングする方法であり、(１)蛍光蛋白質間蛍光共鳴エネルギー転移を利用したフレット法(FRET)(非特許文献３)や、(２)蛍光蛋白質や発光蛋白質を２分割し、その蛋白質断片間の再結合による発光回復を特徴とする２分子型相補法(２-molecule-format protein complementation assay(PCA))等が開発されていた(非特許文献４)。本発明者らによっても蛋白質組継ぎ反応を用いたアッセイ法が開発された(protein splicing assay (PSA))(非特許文献５)。
その後、本発明者らによって、(１)一分子型生物発光プローブ(integrated-molecule-format bioluminescent probe；又は簡単にsingle-chain probe)が開発され、単一融合分子内蛋白質-蛋白質間の相互作用が検出できるようになり(非特許文献６、特許文献１)、その派生手法として、(２)発光酵素の遺伝子配列を円順列置換(circular permutation)したことを特徴とする生物発光プローブも開発された(非特許文献７、特許文献２)。更に、本発明者らにより、(３)発光酵素に人為的な歪みをかけることによって起こる酵素活性の相違を指標とした分子歪みセンサー(molecular tension-indexed bioluminescent probe)が開発された(非特許文献８、特許文献３)。
最近本発明者らは、レポータージーンアッセイと一分子型生物発光プローブを合体した多重認識型生物発光プローブ(multiple recognition-type bioluminescent probe)を開発した(非特許文献９)。このプローブは、一つの検量物質に対して２回センシングすることを特徴とする。更に２色の一分子型生物発光プローブを組み合わせることによってマルチカラー生物発光イメージングプローブセットを開発した(特許文献４)。このプローブは、検体の多面的な生理活性の多色イメージングできることを特徴とする。
Selection and use of an appropriate reaction solution in a bioassay is an important condition that affects the results. Bioassays that place particular importance on selection of reaction solutions include (1) reporter-gene assay, (2) two-hybrid assay, and (3) enzyme-linked immunosorbent assay (enzyme-). linked immunosorbent assay), (4) radioimmunoassay (RIA), etc. (Non-patent
As another bioassay, there is a bioassay method using a so-called “molecular probe”, and selection of a reaction solution greatly affects the result. For example, it is a method for imaging protein-protein interactions in cells by color development. (1) Fret method (FRET) using fluorescence resonance energy transfer between fluorescent proteins (Non-patent Document 3), (2) Fluorescence A 2-molecule-format protein complementation assay (PCA), which is characterized by recovery of luminescence by splitting a protein or photoprotein into two parts and recombination between the protein fragments, has been developed (non-patented) Reference 4). The present inventors have also developed an assay using a protein splicing reaction (protein splicing assay (PSA)) (Non-patent Document 5).
Subsequently, the present inventors developed (1) an integrated-molecule-format bioluminescent probe (or simply a single-chain probe), and the interaction between a single fusion intramolecular protein and protein. As a derivation method, (2) a bioluminescent probe characterized by circular permutation of the gene sequence of the luminescent enzyme has been developed. (Non-patent document 7, Patent document 2). Furthermore, the present inventors have developed (3) a molecular strain-indexed bioluminescent probe that uses the difference in enzyme activity caused by artificially straining the luminescent enzyme as an index (Non-Patent Document). 8, Patent Document 3).
Recently, the present inventors have developed a multiple recognition-type bioluminescent probe that combines a reporter gene assay and a single-molecule bioluminescent probe (Non-patent Document 9). This probe is characterized by sensing twice for one calibration substance. Furthermore, a multicolor bioluminescence imaging probe set was developed by combining two-color single-molecule bioluminescence probes (Patent Document 4). This probe is characterized by being capable of multicolor imaging of multifaceted physiological activities of a specimen.
バイオアッセイは必ず反応溶液を必要とし、その発光信号の種類によって、(１)蛍光蛋白質を利用する手法と、(２)生物発光酵素(ルシフェラーゼ)を用いる手法に大別される。蛍光蛋白質を利用する場合には、自己蛍光によってバックグラウンドが非常に高くなることに加え、外部光源が必要となる。蛍光を測定するためには精密な分光フィルターを取り付けた、比較的大型の発光検出器(例、蛍光顕微鏡)が必要となるという問題点がある(非特許文献５)。一方、生物発光的な手法の場合は、前記問題は生じないが、蛍光に比べて弱光であり、基質を必ず必要とする問題点があった。また、発光酵素に依存するため、塩濃度、温度、pH、重金属イオンの濃度等によって発光量が容易に変動する問題がある。蛍光を基盤とした手法においても同様な問題点を有する。したがって、pHを固定し発光反応条件を最適化するために、蛍光法・発光法ともに幅広く反応溶液が使用されている。
このような背景から、従来の蛍光や生物発光に基づいた様々なアッセイ法において最適バッファー条件の決定は、アッセイ法の成否を左右する重要な決め手である。また、バイオアッセイの特徴に応じて、十分な検出感度、選択性、信号安定性が得られるように、反応溶液および添加物の最適化が強く求められていた。
反応溶液(アッセイバッファー)には、アッセイ効果を向上させるために様々な添加物が使用されてきた。添加物に求められる機能としては、(１)プロテアーゼによる蛋白質の分解を阻止し、(２)干渉物質の影響を抑え、(３)緩衝溶液として働いてもらうことによって安定的な信号発信をサポートし、(４)細胞膜を穏やかに壊すなど、homogenousなアッセイ条件を整えるものであり、(５)蛋白質を安定化させ、(６)発光反応の中核になるプローブの性能には阻害しないことが求められる。
A bioassay always requires a reaction solution, and is roughly classified into (1) a technique using a fluorescent protein and (2) a technique using a bioluminescent enzyme (luciferase) depending on the type of luminescence signal. When a fluorescent protein is used, an external light source is required in addition to a very high background due to autofluorescence. In order to measure fluorescence, there is a problem that a comparatively large light emission detector (for example, a fluorescence microscope) equipped with a precise spectral filter is required (Non-Patent Document 5). On the other hand, in the case of a bioluminescent method, the above-mentioned problem does not occur, but there is a problem that the light is weaker than fluorescence and a substrate is always required. In addition, since it depends on the luminescent enzyme, there is a problem that the amount of luminescence easily varies depending on the salt concentration, temperature, pH, concentration of heavy metal ions, and the like. The fluorescence-based method has similar problems. Therefore, in order to fix pH and optimize luminescence reaction conditions, reaction solutions are widely used for both fluorescence and luminescence methods.
Against this background, the determination of optimum buffer conditions in various assay methods based on conventional fluorescence and bioluminescence is an important decisive factor that determines the success or failure of the assay method. In addition, depending on the characteristics of the bioassay, there has been a strong demand for optimization of reaction solutions and additives so that sufficient detection sensitivity, selectivity, and signal stability can be obtained.
Various additives have been used in the reaction solution (assay buffer) to improve the assay effect. The functions required of additives include (1) preventing protein degradation by proteases, (2) suppressing the influence of interfering substances, and (3) supporting stable signal transmission by having it act as a buffer solution. , (4) homogenous assay conditions such as gently breaking the cell membrane, (5) stabilizing the protein, and (6) not impairing the performance of the probe that is the core of the luminescence reaction. .
反応溶液における主な添加物のうち、塩類としては、NaCl，KCl,(NH4)2SO4などを添加し、SH試薬としてメルカプトエタノール、DTT等を添加し、ポリオールとしてグリセロールやスクロース等を添加し、キレート試薬としてEGTA、EDTA等を添加する。
界面活性剤としては、polyoxyethylene(10)octylphenyl ether (TritonX-100；TX100)，Nonidet P-40 (NP40)，polyoxyethylene sorbitan monolaurate (Tween20；TW20)，polyoxyethylene sorbitan monooleate (Tween80；TW80)，polyoxyethylene(20)cetyl ether (Brij58)，sodium dodecyl sulfate (SDS)等を添加する。界面活性剤の選択にあたっては、親水度の度合いが、TW20＞Brij58＞TW80＞TX100＞NP40の順であり、界面活性度の度合いがNP40＞TX100＞Brij58＞TW20＞TW80の順であることを参考として、適宜選択してきた。
蛋白質分解を阻止するために使うProtease Inhibitorとしては、アプロチニン(分子量6.5kD)、ロイペプチン(分子量：427)、ペプスタチンＡ(pepstatin，分子量：686)、phenylmetylsulfonyl Fluoride(PMSF、分子量：174)、アンチパイン(Antipain，分子量：605)、キモスタチン(chymostatin，分子量：608)等が使われる。他に、Pefabloc SC(AEBSF，240 Da)，DFP(184 Da)，p-APMSF(216 Da)，STI(20,100 Da)，Leupeptin(460 Da)，N-Tosyl-L-phenylalaninechloromethylketone，3,4-dichloroisocoumarin(215 Da)，EDTA-Na2(372 Da)，EGTA(380 Da)，1,10-phenanthroline(198 Da)，phosphoramidon(580 Da)，Dithiobis(2-amino-4-methylpentane)，E-64(357 Da)，cystatin，bestatin，Epibestatin hydrochloride，aprotinin，minocycline，ALLN(384 Da)等の蛋白質分解阻害剤として利用されてきた。
また、以下の機能性化学物質を添加することもある。Sodium molybdateを添加することによって受容体を安定化させ、分解から守る役割を得られる。Glycerolは蛋白質のブロッキング剤などで使えるものであり、ジチオトレイトール(dithiothreitol，DTT)は還元剤として使われてきた。
また、バッファー剤として、p-Toluenesulphonic acid，tartaric acid，citric acid，phthalate，glycine，trans-aconitic acid，formic acid，3,3-dimethylglutaric acid，phenylacetic acid，sodium acetate，succinic acid，sodium cacodylate，sodium hydrogen maleate，maleic acid，sodium phosphate，KH2PO4，imidazole，2,4,6-trimethylpyridine，Triethanolamine hydrochloride，sodium 5,5-diethylbarbiturate，N-ethylmorpholine，sodium pyrophosphate，Tris(hydroxymethyl)aminomethane，bicine，2-amino-2-methylpropane-1,3-diol，diethanolamine，potassium p-phenolsulphonate，boric acid，sodium borate，ammonia，glycine，Na2CO3/NaHCO3，sodium borate，またはこの組み合わせが使われてきた。
このような背景から、反応溶液に添加する添加物の選択は極めて重要であり、既存のバイオアッセイを遂行するために添加物の適切な選択および反応溶液の最適化が強く求められていた。
Among the major additives in the reaction solution, the salts, NaCl, KCl, (NH 4 ) was added and 2 SO 4, was added mercaptoethanol, and DTT such as SH reagent, addition of glycerol and sucrose and the like as a polyol EGTA, EDTA or the like is added as a chelating reagent.
As surfactants, polyoxyethylene (10) octylphenyl ether (TritonX-100; TX100), Nonidet P-40 (NP40), polyoxyethylene sorbitan monolaurate (Tween20; TW20), polyoxyethylene sorbitan monooleate (Tween80; TW80), polyoxyethylene (20) Add cetyl ether (Brij58), sodium dodecyl sulfate (SDS), etc. In selecting surfactants, the degree of hydrophilicity is in the order of TW20>Brij58>TW80>TX100> NP40, and the degree of surface activity is in the order of NP40>TX100>Brij58>TW20> TW80 As appropriate.
Protease inhibitors used to inhibit proteolysis include aprotinin (molecular weight 6.5 kD), leupeptin (molecular weight: 427), pepstatin A (pepstatin, molecular weight: 686), phenylmetylsulfonyl fluoride (PMSF, molecular weight: 174), antipine ( Antipain, molecular weight: 605), chymostatin (molecular weight: 608), etc. are used. In addition, Pefabloc SC (AEBSF, 240 Da), DFP (184 Da), p-APMSF (216 Da), STI (20,100 Da), Leupeptin (460 Da), N-Tosyl-L-phenylalanine chloromethylketone, 3,4- dichloroisocoumarin (215 Da), EDTA-Na2 (372 Da), EGTA (380 Da), 1,10-phenanthroline (198 Da), phosphoramidon (580 Da), Dithiobis (2-amino-4-methylpentane), E-64 (357 Da), cystatin, bestatin, Epibestatin hydrochloride, aprotinin, minocycline, ALLN (384 Da) and the like, have been used as protein degradation inhibitors.
In addition, the following functional chemical substances may be added. Sodium molybdate can be added to stabilize the receptor and protect it from degradation. Glycerol can be used as a protein blocking agent, and dithiothreitol (DTT) has been used as a reducing agent.
In addition, p-Toluenesulphonic acid, tartaric acid, citric acid, phthalate, glycine, trans-aconitic acid, formic acid, 3,3-dimethylglutaric acid, phenylacetic acid, sodium acetate, succinic acid, sodium cacodylate, sodium hydrogen maleate, maleic acid, sodium phosphate, KH 2 PO 4 , imidazole, 2,4,6-trimethylpyridine, Triethanolamine hydrochloride,
Under such circumstances, selection of additives to be added to the reaction solution is extremely important, and in order to perform existing bioassays, appropriate selection of additives and optimization of the reaction solution have been strongly demanded.
一方で、従来のバイオアッセイをこなすためには、いくつかの反応バッファーを用いなければならない問題点もあり、方法の煩雑さやコスト増加の原因となっていた。また、使用者側の作業工程を煩雑にする原因でもあった。
例えば、レポータージーンアッセイの場合、まずマイクロプレート上の培養細胞にレポータージーンを含むプラスミドを導入する。その後、リガンド刺激を12時間程度行い、培地を捨てた後phosphate buffered saline(PBS)バッファー(１番目に必要なバッファー)で細胞を一回洗浄する。次にマイクロプレート上の細胞を細胞溶解バッファー(２番目に必要なバッファー)で20分溶解する。この細胞溶解バッファーと基質入りのアッセイバッファー(３番目に必要なバッファー)を一定割合で混合し直ちに発光値を測定する。即ち、少なくとも３つのバッファーと長い測定工程を必要とした。
また、「一分子型生物発光プローブ」を使用する場合においても同様の測定工程を踏まなければならなかった。まず、マイクロプレートに培養した真核細胞に「一分子型生物発光プローブ」の発現ベクターを導入し、16時間再培養する。その細胞にリガンド刺激を20-30分行い、最後に培地を捨てPBSバッファー(１番目に必要なバッファー)で１−２回洗浄する。残った細胞を溶解バッファー(２番目に必要なバッファー)で20分処理する。その後、溶解液に基質入りのアッセイバッファー(３番目に必要なバッファー)と抵当な割合で混合し発光反応を引き起こす。発光値を直ちにルミノメーターで測定する(非特許文献８、非特許文献９)。
前記いずれの従来法においても、複数の反応バッファーを使用しており、煩雑な測定工程と長い時間を要するものであったため、測定工程を省け測定時間を短縮する改良が強く求められてきた。
On the other hand, in order to perform a conventional bioassay, there is a problem that several reaction buffers must be used, which causes a complicated method and an increase in cost. It is also a cause of complicating the work process on the user side.
For example, in the case of a reporter gene assay, a plasmid containing a reporter gene is first introduced into cultured cells on a microplate. Thereafter, ligand stimulation is performed for about 12 hours, the medium is discarded, and the cells are washed once with a phosphate buffered saline (PBS) buffer (the first necessary buffer). Next, the cells on the microplate are lysed with a cell lysis buffer (second necessary buffer) for 20 minutes. The cell lysis buffer and the assay buffer containing the substrate (third necessary buffer) are mixed at a fixed ratio, and the luminescence value is immediately measured. That is, at least three buffers and a long measurement step were required.
In addition, when the “single molecule bioluminescent probe” is used, the same measurement process must be performed. First, an expression vector of a “single molecule bioluminescent probe” is introduced into eukaryotic cells cultured on a microplate and re-cultured for 16 hours. The cells are stimulated with ligand for 20-30 minutes, and finally the medium is discarded and washed 1-2 times with PBS buffer (first necessary buffer). The remaining cells are treated with lysis buffer (second necessary buffer) for 20 minutes. Thereafter, the lysate is mixed with an assay buffer containing the substrate (the third necessary buffer) at a mortar ratio to cause a luminescence reaction. The luminescence value is immediately measured with a luminometer (Non-Patent
In any of the above conventional methods, since a plurality of reaction buffers are used, which requires a complicated measurement process and a long time, an improvement to omit the measurement process and shorten the measurement time has been strongly demanded.
本発明は、バイオアッセイのための反応条件を最適化する反応溶液とその添加物を提供しようとするものであり、この反応溶液の最適化によって従来の複数の反応溶液(細胞溶解バッファー(Lysis buffer)とアッセイバッファー(assay buffer)など)の使用による煩雑なプロトコールを要せず、素早く簡便に測定できるような測定工程の圧縮、高感度かつ安定的な発光測定を可能にしようとするものである。
すなわち、本発明は、特に従来の生物発光を用いたバイオアッセイを生細胞に適用する際に必須とされた細胞溶解工程を省略し、リガンド刺激から直接発光測定しても高感度のバイオアッセイが可能な生物発光用反応バッファーを提供することを目的とする。
The present invention seeks to provide reaction solutions and their additives that optimize reaction conditions for bioassays, and optimization of the reaction solution allows the conventional reaction solutions (Lysis buffer (Lysis buffer)) to be used. ) And assay buffer (assay buffer, etc.), and it is intended to enable measurement process compression, high sensitivity, and stable luminescence measurement so that measurement can be performed quickly and easily. .
That is, the present invention eliminates the cell lysis step, which is essential when applying a bioassay using conventional bioluminescence to living cells, and a highly sensitive bioassay can be obtained even when directly measuring luminescence from ligand stimulation. An object is to provide a possible bioluminescence reaction buffer.
本発明では、細胞溶解で用いられる細胞溶解液と、発光測定時に用いられていた反応溶液の組合せを検討して、基本バッファーとしてTris-バッファー及びHBSSバッファーを含み、界面活性剤としてNP-40及びTW80を含む生物発光用反応バッファーを用いることで、細胞溶解工程を経ることなく、リガンド刺激から直接発光測定できる生物発光バイオアッセイが可能となった。さらにPEG等の高分子、金属イオン、糖成分、ハロゲンイオンなどを添加することで、さらに高感度のバイオアッセイを可能とした。
本発明においては、まず、従来に使われてきたバイオアッセイ用反応溶液類の組成から各添加剤(重金属イオン、ハロゲンイオン、高分子添加剤、ポリオール、グリコール類等)の寄与度を検討した。また細胞溶解剤(SDS，NP-40,TW80，Triton等)の性能も検討した。この研究によって、バイオアッセイの性能向上に寄与する添加物とその有効濃度例を確認できた。また、従来、細胞溶解ステップ(Step１)とアッセイステップ(Step２)のそれぞれの工程で用いられていた細胞溶解液と発光測定用反応溶液との組合せの検討から、基本バッファーとしてTris-バッファー及びHBSSバッファーを含み、界面活性剤としてNP-40及びTW80を含む生物発光用反応バッファーを用いることで、細胞溶解工程の省略が可能となり、リガンド刺激から直接発光測定できる生物発光バイオアッセイ用反応バッファーを提供することができた。
上記、バイオアッセイ用添加剤の検討結果と併せて、生物発光バイオアッセイ用反応バッファー及びそれを用いた生物発光バイオアッセイ法に係る本発明を完成させた。
In the present invention, a combination of a cell lysate used for cell lysis and a reaction solution used at the time of luminescence measurement was examined, including Tris-buffer and HBSS buffer as basic buffers, NP-40 and HBSS as surfactants By using a bioluminescence reaction buffer containing TW80, a bioluminescence bioassay capable of directly measuring luminescence from ligand stimulation without going through a cell lysis step has become possible. Furthermore, by adding a polymer such as PEG, metal ions, sugar components, halogen ions, etc., a more sensitive bioassay was made possible.
In the present invention, first, the contribution of each additive (heavy metal ions, halogen ions, polymer additives, polyols, glycols, etc.) was examined from the composition of reaction solutions for bioassays that have been used conventionally. The performance of cell lysing agents (SDS, NP-40, TW80, Triton, etc.) was also examined. This study confirmed the additive that contributes to the improvement of bioassay performance and its effective concentration examples. In addition, the Tris-buffer and the HBSS buffer are used as basic buffers based on the examination of the combination of the cell lysate and the reaction solution for luminescence measurement that were used in the cell lysis step (Step 1) and assay step (Step 2). By using a bioluminescence reaction buffer containing NP-40 and TW80 as surfactants, the cell lysis step can be omitted, and a reaction buffer for bioluminescence bioassay that can measure luminescence directly from ligand stimulation is provided. I was able to.
Together with the results of the above-described investigation of bioassay additives, the present invention relating to a reaction buffer for bioluminescence bioassay and a bioluminescence bioassay method using the same was completed.
本発明の完成に至った経緯を具体的に説明すると、以下の通りである。
従来、バイオアッセイは「細胞溶解バッファー(Lysis Buffer)」、「洗浄バッファー(Wash Buffer)」、「アッセイバッファー(Assay Buffer)」に分けてアッセイを行ってきた。このことに配慮して、最初の実施例では最適な細胞溶解バッファーとアッセイバッファー間の相性を調べた(実施例１)。観察された発光の輝度や安定性を比べた結果、Promega製以外では、C3の細胞溶解バッファーが人工生物発光酵素(ALuc)に適したバッファー条件を提供することが確認できた。C3は、Tris-HClバッファーを基本とし、NP-40、アジ化ナトリウム、MgCl2及びNaClを配合している。また、C3と組み合わせるアッセイバッファーとしては、HBSSやTEバッファー(polyethylene glycol molecular weight 400(PEG400)添加)がよいことが確認できた(図１Ａ、Ｂ)。以下、C3を基本のバッファーとして選択することとし、他のバッファー成分の組み合わせを検討した。その際、HBSSやTE-PEGバッファーの組み合わせが良いことを考慮した。
ところで、本発明においては、全ての発光酵素を対象とするものであるが、バッファー成分の最適な組み合わせを検討するための実施例では、主として、高輝度かつ持続的に観察可能な人工発光酵素(ALuc)を用いた。(なお、当該ALucは、本発明者らが新たに開発した人工発光酵素であり、本出願と同日付で特許出願している。)
まず、人工発光酵素(ALuc)を用いて、C3の細胞溶解バッファーと組み合わせのよい一連のアッセイバッファーを調べてみた(実施例２)。観察された発光の輝度や安定性を比べた結果、C3といい相性を持つアッセイバッファーは、PBSバッファー、HBSSバッファー、TE-PEGバッファーであることが確認できた(図２)。
次いで、最も効果の高かったC3細胞溶解液とHBSSアッセイバッファーとを組み合わせた系により、更なるバッファー添加剤に関する検討を行った(実施例３)。重金属添加による発光効果は、アッセイバッファーにアルミニウムイオン、銅イオン、鉄イオン、Moイオン、亜鉛イオンなどが有効な添加剤であることが確認できた(図３)。
さらに、C3細胞溶解液とHBSSアッセイバッファーとを組み合わせた系を、本発明者が新たに開発した一分子型生物発光プローブ(ALuc)を用いた実際の検出実験(男性ホルモン)に適用し、ポリエチレングリコール(PEG)の添加効果を調べた(実施例４)。その結果、PEGの添加は有効であり、特にPEG400やPEG620において著しい効果が見込まれることが分かったが、その添加割合は1％程度が望ましいことが確認された(図４)。この一分子型生物発光プローブ(ALuc)に適用した同一の系により、アッセイバッファーに対するハロゲンイオンの添加効果を更に調べた(実施例５)ところ、ハロゲンイオンの添加は一定の有効な結果が見込まれることが分かった。ハロゲンイオンの中では、KIがKBrより全般的に効果がよく、特に最終濃度が50mM程度が良かった。KBrの場合は、最終濃度が100mM程度で効果が高い(図５)。同一の系により、アッセイバッファーに対する糖類添加効果を調べた(実施例６)ところ、一部の糖類の添加において一定の有効な結果が確認できた。スクロースやグルコースの添加によって全般的に効果がよかった。糖類ではないがGlycineによってもよい効果が得られた。添加濃度は2mg/mL(最終濃度)が全般的によい結果につながった(図６)。
以上のような細胞溶解バッファー、反応バッファーおよび添加剤に関する基礎研究を積み重ねた結果、細胞溶解(lysis)時間を必要としないone-shot反応溶液の開発の可能性が高まった。
The details of the completion of the present invention will be specifically described as follows.
Conventionally, bioassays have been divided into “cell lysis buffer (Lysis Buffer)”, “wash buffer (Wash Buffer)”, and “assay buffer (Assay Buffer)”. Considering this, in the first example, the compatibility between the optimal cell lysis buffer and the assay buffer was examined (Example 1). As a result of comparing the brightness and stability of the observed luminescence, it was confirmed that the cell lysis buffer of C3 provided buffer conditions suitable for artificial bioluminescent enzyme (ALuc) except for those manufactured by Promega. C3 is based on Tris-HCl buffer and contains NP-40, sodium azide, MgCl 2 and NaCl. Further, it was confirmed that HBSS and TE buffer (added with polyethylene glycol molecular weight 400 (PEG400)) were good as the assay buffer combined with C3 (FIGS. 1A and 1B). Hereinafter, C3 was selected as a basic buffer, and combinations of other buffer components were examined. At that time, it was considered that the combination of HBSS and TE-PEG buffer was good.
By the way, in the present invention, all luminescent enzymes are targeted, but in the examples for examining the optimal combination of buffer components, artificial luminescent enzymes (mainly high brightness and continuously observable) ALuc) was used. (The ALuc is an artificial luminescent enzyme newly developed by the present inventors and has been filed for patent on the same date as the present application.)
First, an artificial luminescent enzyme (ALuc) was used to examine a series of assay buffers that could be combined with C3 cell lysis buffer (Example 2). As a result of comparing the luminance and stability of the observed luminescence, it was confirmed that the assay buffers having a good affinity with C3 were PBS buffer, HBSS buffer, and TE-PEG buffer (FIG. 2).
Next, further buffer additives were examined using a system in which the most effective C3 cell lysate and HBSS assay buffer were combined (Example 3). As for the luminescence effect by adding heavy metals, it was confirmed that aluminum ions, copper ions, iron ions, Mo ions, zinc ions and the like are effective additives in the assay buffer (FIG. 3).
Furthermore, a system combining C3 cell lysate and HBSS assay buffer was applied to an actual detection experiment (male hormone) using a single molecule bioluminescent probe (ALuc) newly developed by the present inventor, and polyethylene. The effect of adding glycol (PEG) was examined (Example 4). As a result, it was found that the addition of PEG was effective, and in particular, a remarkable effect was expected with PEG400 and PEG620, but it was confirmed that the addition ratio is preferably about 1% (FIG. 4). Further examination of the effect of adding halogen ions to the assay buffer using the same system applied to this single-molecule bioluminescent probe (ALuc) (Example 5) shows that the addition of halogen ions is expected to give a certain effective result. I understood that. Of the halogen ions, KI was generally more effective than KBr, with a final concentration of about 50 mM being particularly good. In the case of KBr, the effect is high at a final concentration of about 100 mM (FIG. 5). When the saccharide addition effect with respect to the assay buffer was examined using the same system (Example 6), a certain effective result was confirmed with the addition of some saccharides. The effect was generally good by the addition of sucrose and glucose. Although it was not a saccharide, good effects were obtained with Glycine. An addition concentration of 2 mg / mL (final concentration) generally led to good results (FIG. 6).
As a result of accumulating basic research on cell lysis buffer, reaction buffer and additives as described above, the possibility of developing a one-shot reaction solution that does not require cell lysis time has increased.
従来の細胞溶解バッファーとアッセイバッファーに分けた煩雑なバイオアッセイにおける煩雑なプロトコールを回避するために、本発明で見出した添加物を反映した形での新規バッファーを組み立てた。
具体的にはC14からC22までの組成および図７と図８で示したように、本発明の上記実施例で見出した細胞溶解とアッセイ用のバッファーを合体する検証を行った。特にC19−C22の結果(図７)から分かるように２つ以上の界面活性剤を混合して使う手法は極めて有効であり、またC23-C26の結果(図８)で分かるようにバッファーの混合比(界面活性剤の混合比ともなる)によってより有効な場合があることが分かった。このような工夫から、発光反応を害することなく生細胞から瞬時に発光測定にまで持っていける、新規発光反応溶液(one-shotバッファーと称する)を完成した。
In order to avoid the complicated protocol in the complicated bioassay divided into the conventional cell lysis buffer and the assay buffer, a novel buffer reflecting the additive found in the present invention was assembled.
Specifically, as shown in the composition of C14 to C22 and FIG. 7 and FIG. 8, verification was carried out by combining the cell lysis and the assay buffer found in the above Example of the present invention. In particular, as can be seen from the results for C19-C22 (Fig. 7), the method of mixing two or more surfactants is extremely effective, and as shown by the results for C23-C26 (Fig. 8), mixing of the buffers It was found that there are cases where it is more effective depending on the ratio (which is also the mixing ratio of the surfactant). From such a device, a new luminescence reaction solution (referred to as a one-shot buffer) that can be taken from living cells to luminescence measurement instantly without harming the luminescence reaction has been completed.
本発明のバッファーの特徴は、界面活性剤の特徴を十分に生かし、それぞれの短所を補う形で反応溶液の組成を組み立てたことである。
より具体的には、以下に説明する。まず、界面活性剤の「親水度の度合い」は、TW20＞Brij58＞TW80＞TX100＞NP40の順で、「界面活性度」はNP40＞TX100＞Brij58＞TW20＞TW80の順であることを参考に、少量のSDSに加え、界面活性度の両端にあるNP40とTW80を混合することによって、強力な溶解力を持たせながらそれぞれの界面活性剤が持つ弱点を相互補うように工夫した。その結果、発光反応を害することなく細胞を短時間で溶解しながら同時に発光測定も可能なone-shot反応溶液を完成した。
このone-shot反応溶液の効果は、実施例９と１０に具体的に示されている。男性ホルモンに応答する一分子型プローブを発現する真核細胞にステロイドホルモンや化学物質刺激を行い、本発明のone-shotバッファー添加後、間もなく発光測定を行った(実施例９、１０)。その結果、男性ホルモン受容体を含む一分子型プローブの場合、男性ホルモンにもっとも強く反応した(図９)。また女性ホルモン受容体を含む一分子型プローブは女性ホルモン抗がん剤(OHT)に強く反応した(図１０)。これらの結果は、細胞を瞬時に溶解しながら発光測定も可能とする当該one-shotバッファーの利点を克明に示している結果であった。
これらの知見を得たことで、本発明を完成した。
The feature of the buffer of the present invention is that the composition of the reaction solution is assembled in such a way as to make full use of the features of the surfactant and compensate for each disadvantage.
More specifically, it will be described below. First, the “degree of hydrophilicity” of the surfactant is in the order of TW20>Brij58>TW80>TX100> NP40, and the “surfactance” is in the order of NP40>TX100>Brij58>TW20> TW80. In addition to a small amount of SDS, by mixing NP40 and TW80 at both ends of the surface activity, we devised to complement each other's weaknesses while having strong dissolving power. As a result, a one-shot reaction solution capable of simultaneously measuring luminescence while lysing cells in a short time without harming the luminescence reaction was completed.
The effect of this one-shot reaction solution is specifically illustrated in Examples 9 and 10. Steroid hormones and chemical substances were stimulated to eukaryotic cells expressing single-molecule probes that respond to male hormones, and luminescence measurement was performed shortly after adding the one-shot buffer of the present invention (Examples 9 and 10). As a result, in the case of a single molecule type probe containing an androgen receptor, it reacted most strongly to androgen (FIG. 9). The single-molecule probe containing the female hormone receptor reacted strongly with the female hormone anticancer drug (OHT) (FIG. 10). These results clearly show the advantages of the one-shot buffer that enables luminescence measurement while lysing cells instantaneously.
Obtaining these findings completed the present invention.
すなわち、本発明は、以下の通りである。
〔１〕 生細胞に対して細胞溶解工程を経ずに、生物発光を用いたバイオアッセイを行うための生物発光用反応バッファーであって、
下記(１)及び(２)を含むことを特徴とする生物発光用反応バッファー；
（１）Tris-バッファー及びHBSSバッファーを含む基本バッファー、
（２）NP-40及びTW80を含む界面活性剤。
〔２〕 前記(２)の界面活性剤として、さらにSDSを含む、前記〔１〕に記載の生物発光用反応バッファー。
〔３〕 さらに、少なくとも下記(３)〜(６)のいずれか１つの添加剤を配合することを特徴とする、前記〔１〕又は〔２〕に記載の生物発光用反応バッファー；
（３）PEG及びPPGから選択された少なくとも１種の高分子化合物、
（４）Mg(II)、Fe(III)，Cu(II)，Mo(VI)及びZn(II)から選択された少なくとも１種の多価イオン、
（５）Br-及びＩ-から選択された少なくとも１種のハロゲンイオン、
（６）スクロース、グルコース、及びグリシンから選択されたポリオール類。
〔４〕 前記(１)の基本バッファー中のTris-バッファー及びHBSSバッファーの配合比が、容量(v/v)％で20〜50：50〜20であって、かつ、
前記(２)の界面活性剤中のNP-40及びTW80の配合比が、容量(v/v)％で1：1〜10であることを特徴とする、前記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の生物発光用反応バッファー。
〔５〕 生物発光を用いたバイオアッセイが、男性ホルモン、女性ホルモン、又はストレスホルモンから選択されたステロイドホルモンに応答する生物発光プローブを用いたバイオアッセイであることを特徴とする、前記〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の生物発光用反応バッファー。
〔６〕 生細胞を、細胞溶解工程を経ることなく、生物発光用反応バッファーに懸濁させ、得られた懸濁液中の生物発光強度を測定する、生物発光を用いたバイオアッセイ法であって、
下記(１)及び(２)を含む生物発光用反応バッファーを用いることを特徴とする、バイオアッセイ法；
（１）Tris-バッファー及びHBSSバッファーを含む基本バッファー、
（２）NP-40及びTW80を含む界面活性剤。
〔７〕 バイオアッセイ法が、男性ホルモン、女性ホルモン、又はストレスホルモンから選択されたステロイドホルモンに応答する生物発光プローブを用いたバイオアッセイ法であることを特徴とする、前記〔６〕に記載のバイオアッセイ法。
That is, the present invention is as follows.
[1] A bioluminescence reaction buffer for performing a bioassay using bioluminescence without undergoing a cell lysis step for living cells,
A bioluminescence reaction buffer comprising the following (1) and (2):
(1) Basic buffer including Tris-buffer and HBSS buffer,
(2) A surfactant containing NP-40 and TW80.
[2] The bioluminescence reaction buffer according to [1], further including SDS as the surfactant of (2).
[3] The bioluminescence reaction buffer according to [1] or [2], further comprising at least any one of the following additives (3) to (6):
(3) at least one polymer compound selected from PEG and PPG;
(4) at least one multivalent ion selected from Mg (II), Fe (III), Cu (II), Mo (VI) and Zn (II);
(5) Br -, and I - at least one halogen ion selected from,
(6) Polyols selected from sucrose, glucose, and glycine.
[4] The mixing ratio of the Tris-buffer and the HBSS buffer in the basic buffer of (1) is 20-50: 50-20 in volume (v / v)%, and
[1] to [3], wherein the mixing ratio of NP-40 and TW80 in the surfactant (2) is 1: 1 to 10 in volume (v / v)%. The reaction buffer for bioluminescence according to any one of the above.
[5] The bioassay using bioluminescence is a bioassay using a bioluminescence probe that responds to a steroid hormone selected from male hormone, female hormone, or stress hormone. The reaction buffer for bioluminescence according to any one of to [4].
[6] A bioassay method using bioluminescence in which living cells are suspended in a bioluminescence reaction buffer without undergoing a cell lysis step, and the bioluminescence intensity in the obtained suspension is measured. And
A bioassay method characterized by using a bioluminescence reaction buffer comprising the following (1) and (2):
(1) Basic buffer including Tris-buffer and HBSS buffer,
(2) A surfactant containing NP-40 and TW80.
[7] The bioassay method according to [6], wherein the bioassay method is a bioassay method using a bioluminescent probe that responds to a steroid hormone selected from male hormones, female hormones, or stress hormones. Bioassay method.
本発明により、細胞溶解(lysis)時間を必要としない、バイオアッセイ用のone-shot反応溶液であって、安定でかつ感度も優れた、最適化された反応溶液を提供できた。
バイオアッセイ用反応溶液の最適化によって、アッセイ時のバックグラウンド光が押さえられるため、信号強度の増加、輝度の増加が見込まれる。また、実験手順が簡便化・省略できたため、時間と労働力の節約が可能である。その結果、バイオアッセイにおけるS/N比の改善、再現性の向上、コストダウンに繋がる。
According to the present invention, it is possible to provide an optimized reaction solution which is a one-shot reaction solution for a bioassay which does not require cell lysis time and which is stable and excellent in sensitivity.
By optimizing the reaction solution for bioassay, the background light at the time of the assay is suppressed, so that an increase in signal intensity and an increase in luminance are expected. In addition, the experimental procedure can be simplified and omitted, saving time and labor. As a result, the S / N ratio in the bioassay is improved, the reproducibility is improved, and the cost is reduced.
１．バイオアッセイ用バッファー
（１−１）ライシスバッファー(細胞溶解液)とアッセイバッファー(反応液)
従来、バイオアッセイはライシスバッファー(細胞溶解液)とアッセイバッファー(反応液)に分けてアッセイを行ってきた。細胞を速やかに溶解するためには、高い溶解力、発光酵素への低い阻害性が必須であると考えられ、一方、バイオアッセイ反応の際には安定したアッセイ条件及びバックグラウンドを下げるために、自己発光を誘発する成分の除去や検討が必須であると考えられていたことによる。
従来、プロメガ(Promega)社でも、ライシスバッファー及びアッセイバッファーをそれぞれ、製品名Luciferase Assay Buffer(カタログ番号：E290A)及び製品名Luciferase Lysis Buffer(カタログ番号：E291A)として販売しており、NEB社でもそれぞれ製品名Luciferase Assay Buffer(カタログ番号：E3300S)及びLuciferase Lysis Buffer(カタログ番号：B3321)として販売している。なお、プロメガ(Promega)社、NEB社の市販品の成分組成は公表されていないが、いずれもアッセイバッファーとライシスバッファーに分けた複雑なプロトコールを提示している。
本発明では、前述のように、上記複雑なプロトコールの解消及び反応の安定性と感度向上の目的で、下記の各バッファー成分の組成の検討を行っている。
（ａ）界面活性剤：polyoxyethylene octylphenyl ether(TritonX-100；TX100)，Nonidet P-40(NP40)，polyoxyethylene sorbitan monolaurate(Tween20；TW20)，polyoxyethylene sorbitan monooleate(TW80)，polyoxyethylene cetyl ether(Brij58)，sodium dodecyl sulfate(SDS)等。
親水度の度合いとしては、TW20＞Brij58＞TW80＞TX100＞NP40、界面活性度の度合いとしてはNP40＞TX100＞Brij58＞TW20＞TW80の順であるとされている。
（ｂ）塩類：NaCl，KCl,(NH4)2SO4など
（ｃ）SH試薬：メルカプトエタノール、DTT等
（ｄ）ポリオール：グリセロール、グルコース、スクロース等
（ｅ）グリコール類：ポリエチレングリコール(PEG)、ポリプロピレングリコール(PPG)
（ｆ）キレート試薬：EGTA、EDTA等
（ｇ）Protease Inhibitor：アプロチニン(分子量6.5kD)、ロイペプチン(分子量：427)、ペプスタチンＡ(pepstatin，分子量：686)、phenylmetylsulfonyl Fluoride(PMSF、分子量：174)、アンチパイン(Antipain，分子量：605)、キモスタチン(chymostatin，分子量：608)、pefabloc SC(AEBSF，240 Da)，DFP(184 Da)，p-APMSF(216 Da)，STI(20,100 Da)，Leupeptin(460 Da)，N-Tosyl-L-phenylalaninechloromethylketone，3,4-dichloroisocoumarin(215 Da)，EDTA-Na2(372 Da)，EGTA(380 Da)，1,10-phenanthroline(198 Da)，phosphoramidon(580 Da)，Dithiobis(2-amino-4-methylpentane)，E-64(357 Da)，cystatin，bestatin，Epibestatin hydrochloride，aprotinin，minocycline，ALLN(384 Da)等
（ｇ）バッファー剤：p-Toluenesulphonic acid，tartaric acid，citric acid，phthalate，glycine，trans-aconitic acid，formic aicd，3,3-dimethylglutaric acid，phenylacetic acid，sodium acetate，succinic acid，sodium cacodylate，sodium hydrogen maleate，maleic acid，sodium phosphate，KH2PO4，imidazole，2,4,6-trimethylpyridine，Triethanolamine hydrochloride，sodium 5,5-diethylbarbiturate，N-ethylmorpholine，sodium pyrophosphate，Tris(hydroxymethyl)aminomethane，bicine，2-amino-2-methylpropane-1,3-diol，diethanolamine，potassium p-phenolsulphonate，boric acid，sodium borate，ammonia，グリシン(glycine)，Na2CO3/NaHCO3，sodium borate，またはこれらの組み合わせ
（ｈ）その他：Sodium molybdate(受容体の安定化)、ジチオトレイトール(dithiothreitol，DTT)(還元剤)
1. Bioassay buffer (1-1) Lysis buffer (cell lysate) and assay buffer (reaction solution)
Conventionally, bioassays have been performed by dividing into lysis buffer (cell lysate) and assay buffer (reaction solution). In order to rapidly lyse cells, high lysis power and low inhibitory activity against luminescent enzymes are considered essential, while in order to reduce stable assay conditions and background during bioassay reactions, This is because it was thought that the removal and examination of components that induce self-luminescence were essential.
Previously, Promega also sold the lysis buffer and assay buffer under the product name Luciferase Assay Buffer (catalog number: E290A) and the product name Luciferase Lysis Buffer (catalog number: E291A), respectively. The products are sold as Luciferase Assay Buffer (catalog number: E3300S) and Luciferase Lysis Buffer (catalog number: B3321). In addition, although the component composition of the commercial product of Promega (Promega) and NEB is not disclosed, both present complicated protocols divided into assay buffer and lysis buffer.
In the present invention, as described above, the composition of each buffer component described below is studied for the purpose of eliminating the complicated protocol and improving the stability and sensitivity of the reaction.
(A) Surfactant: Polyoxyethylene octylphenyl ether (TritonX-100; TX100), Nonidet P-40 (NP40), polyoxyethylene sorbitan monolaurate (Tween20; TW20), polyoxyethylene sorbitan monooleate (TW80), polyoxyethylene cetyl ether (Brij58), sodium dodecyl sulfate (SDS) etc.
The degree of hydrophilicity is TW20>Brij58>TW80>TX100> NP40, and the degree of surface activity is NP40>TX100>Brij58>TW20> TW80.
(B) Salts: NaCl, KCl, (NH 4 ) 2 SO 4 etc. (c) SH reagent: mercaptoethanol, DTT etc. (d) Polyol: glycerol, glucose, sucrose etc. (e) Glycols: Polyethylene glycol (PEG) Polypropylene glycol (PPG)
(F) Chelating reagents: EGTA, EDTA, etc. (g) Protease Inhibitor: Aprotinin (molecular weight 6.5 kD), leupeptin (molecular weight: 427), pepstatin A (pepstatin, molecular weight: 686), phenylmetylsulfonyl fluoride (PMSF, molecular weight: 174), Antipine (Antipain, molecular weight: 605), chymostatin (chymostatin, molecular weight: 608), pefabloc SC (AEBSF, 240 Da), DFP (184 Da), p-APMSF (216 Da), STI (20,100 Da), Leupeptin ( 460 Da), N-Tosyl-L-phenylalaninechloromethylketone, 3,4-dichloroisocoumarin (215 Da), EDTA-Na 2 (372 Da), EGTA (380 Da), 1,10-phenanthroline (198 Da), phosphoramidon (580 Da), Dithiobis (2-amino-4-methylpentane), E-64 (357 Da), cystatin, bestatin, Epibestatin hydrochloride, aprotinin, minocycline, ALLN (384 Da), etc. (g) Buffer: p-Toluenesulphonic acid, tartaric acid, citric acid, phthalate, glycine, trans-aconitic acid, formic aicd, 3,3-dimethylglutaric acid, phenylacetic acid, sodium acetate, succinic acid, sodium cacodylate, sodium hydrogen maleate, maleic acid, sodium phosphate, KH 2 PO 4 , imidazole, 2,4,6-trimethylpyridine, Triethanolamine hydrochloride,
（１−２）本発明の基本となるバッファー成分−１(HBSSバッファー)
本発明では、HBSSバッファー(Hanks' Balanced Salt Solution)を基本組成物として用いる。その調製手法は、公知のプロトコール(例えば、独立行政法人医薬基盤研究所のホームページhttp://cellbank.nibio.go.jp/legacy/sheet/att00011.htm)に従い、以下のように調製した。
まず以下の４種類の溶液をあらかじめ調製し，混合して利用する。
溶液１ 1.4％ NaHCO3 溶液
溶液２ NaCl 80.0g，KCl 4.0g，MgSO4・7H2O 2.0 g，Na2HPO4・2H2O 0.6g，glucose
10.0g，KH2PO4 0.6gを水800mlに溶かした溶液。
溶液３ CaCl2 1.4 gを水100mlに溶解した溶液。
溶液４ Phenol red 0.4gを秤量し，少量の水でペースト状にし，ついで水を加えて150 mlとする。
水酸化ナトリウム溶液(N/20)でpHを7.0に調整し全量を200mlとする。
使用する際には、87.5mlの滅菌水に溶液１を2.5ml、溶液２を8ml、溶液３を1ml、溶液４を1ml、それぞれ加えたものを使用する。Phenol redを使わない場合には、溶液４の混合を省略できる。
(1-2) Buffer component-1 (HBSS buffer) which is the basis of the present invention
In the present invention, HBSS buffer (Hanks' Balanced Salt Solution) is used as the basic composition. The preparation method was as follows according to a known protocol (for example, the homepage of the National Institute of Biomedical Innovation http://cellbank.nibio.go.jp/legacy/sheet/att00011.htm).
First, the following four types of solutions are prepared in advance and mixed for use.
A solution of 10.0 g and 0.6 g of KH 2 PO 4 in 800 ml of water.
Solution 3 A solution prepared by dissolving 1.4 g of
Adjust the pH to 7.0 with sodium hydroxide solution (N / 20) to make the total volume 200 ml.
When using, use 2.5 ml of sterile water, 8 ml of
（１−３）本発明の基本となるバッファー成分−２(Tris−バッファー)
トリスバッファーそのものは従来から広く使われているバッファー成分(ここでいうトリスはトリスヒドロキシメチルアミノメタンの略称であり、一般的な組成はトリス塩10mMにHClでpHを調整したもので、添加剤としてEDTA 1mMを入れる場合もある)であり、生体適合性が高い理由で、さまざまなバイオ研究で用いられている。しかし、トリスバッファーが生物発光反応に与える影響に関する研究は今まで十分されてなかった。
本発明ではトリスバッファーが生物発光に好適に使えるものであり、細胞溶解(Lysis)用にもアッセイ用にも用いられる基礎バッファー成分であることを見出した。
(1-3) Buffer component-2 (Tris-buffer) which is the basis of the present invention
Tris buffer itself is a buffer component that has been widely used (Tris here is an abbreviation for trishydroxymethylaminomethane, and its general composition is a tris salt adjusted to pH with 10 mM HCl. EDTA 1mM may be included), and it is used in various biological research because of its high biocompatibility. However, studies on the effect of Tris buffer on the bioluminescence reaction have not been sufficiently conducted so far.
In the present invention, it was found that Tris buffer can be suitably used for bioluminescence, and is a basic buffer component used for both cell lysis (Lysis) and assay.
（１−４）本発明におけるバッファー組成
上記基本的なバッファー成分のHBSSバッファー及びTris−バッファーを組み合わせて用いるが、その際両者を容量(v/v)％で20〜50：50〜20、好ましくは40〜60：60〜40、最も好ましくは、60：40で配合する。
界面活性剤としては、NP-40及びTW80、さらにSDSを組み合わせて用いるが、その際、NP-40：TW80：SDSを容量(v/v)％で1：0.1〜1：0〜0.5、好ましくは、1〜2：0.5〜2：0.1〜1、最も好ましくは、1：1：0.1の比で配合する。
界面活性剤のTW80を他の界面活性剤と組み合わせて含有させるが、その際の濃度が1〜10(v/v)％、好ましくは5〜10(v/v)％範囲で配合する。
ポリオールとしては、ポリエチレングリコール(PEG)及び糖成分(スクロース，グルコース)を組み合わせるが、PEG400が0.01〜10(v/v)％範囲、糖成分(スクロース，グルコース)は0〜20 mg/mL範囲で配合するが、好ましくはそれぞれPEG400が0.1〜10(v/v)％範囲、糖成分(スクロース，グルコース)は2〜10 mg/mL範囲で配合する。
重金属として、(Fe(III)，Cu(II)，Mo(VI)やZn(II))を単独又は組み合わせて含有させるが、その際の濃度が0.01〜1PPM範囲で、好ましくは１PPM配合する。
ハロゲンイオン(Br-やＩ)を単独又は組み合わせて含有させるが、その際の濃度が1〜100mM、好ましくは50〜100mMの範囲で配合する。
その他、発光安定性を向上させるためにビタミンCなどの還元剤を適宜配合すると、さらによい。
(1-4) Buffer composition in the present invention The above basic buffer components HBSS buffer and Tris-buffer are used in combination. In this case, both are used in a volume (v / v)% of 20-50: 50-20, preferably Is blended at 40-60: 60-40, most preferably 60:40.
As the surfactant, NP-40 and TW80 are used in combination with SDS, and NP-40: TW80: SDS is used at a capacity (v / v)% of 1: 0.1 to 1: 0 to 0.5, preferably Is blended at a ratio of 1-2: 0.5-2: 0.1-1 and most preferably 1: 1: 0.1.
Surfactant TW80 is contained in combination with other surfactants, and the concentration at that time is 1 to 10 (v / v)%, preferably 5 to 10 (v / v)%.
As the polyol, polyethylene glycol (PEG) and sugar components (sucrose, glucose) are combined, but PEG400 is in the range of 0.01 to 10 (v / v)%, sugar components (sucrose, glucose) in the range of 0 to 20 mg / mL. Preferably, PEG400 is added in a range of 0.1 to 10 (v / v)%, and sugar components (sucrose and glucose) are preferably added in a range of 2 to 10 mg / mL.
As the heavy metal, (Fe (III), Cu (II), Mo (VI) or Zn (II)) is contained alone or in combination, and the concentration at that time is in the range of 0.01 to 1 PPM, preferably 1 PPM.
Halogen ions (Br - and I) are contained alone or in combination, and the concentration is in the range of 1 to 100 mM, preferably 50 to 100 mM.
In addition, it is further preferable that a reducing agent such as vitamin C is appropriately blended in order to improve the light emission stability.
本実施例のうち、細胞溶解工程を設けた後の生物発光測定工程において優れた成績を上げたバッファー組成は、基本的には、細胞溶解液としてC3バッファーを用いた場合であった。C3バッファーでは、Tris-HClバッファーを基本とし、界面活性性の優れたNP-40と、生理適合性の高いMgCl2との組合せが好成績の原因と考えられた。特に好成績を挙げた組合せは以下の通りである。
１．C3バッファーで細胞溶解後、C8やC10のアッセイバッファーを用いた場合。
２．C3バッファーで細胞溶解後、C6のアッセイバッファーを用いた場合。
３．C3バッファーで細胞溶解後、HBSSバッファーにAl(III)，Ca(II)，Cu(II)，Fe(III),またはMg(II)を添加したアッセイバッファーを用いた場合。
４．C3バッファーで細胞溶解後、HBSSバッファーに1％のPEGやPPGを添加したアッセイバッファーを用いた場合。
５．C3バッファーで細胞溶解後、HBSSバッファーにKI 50mMやKBr 100mMを添加したアッセイバッファーを用いた場合。
６．C3バッファーで細胞溶解後、HBSSバッファーに2mg/mLのD(+)glucoseやGlycineを添加したアッセイバッファーを用いた場合。
以上の結果から、one-shot反応溶液として好ましいバッファー組成を以下のように絞り込んだ。
すなわち、素早い溶解性が求められ、かつ高輝度での観察性が要求される、生物発光酵素利用技術における「one-shot反応溶液」の場合の基本的な組成としては、C3バッファーで基本としたTris-HClバッファーに、HBSSバッファーを組合せ、界面活性剤のNP-40、又はSDS、塩類のAl(III)，Ca(II)，Cu(II)，Fe(III),またはMg(II)、PEG又はPPG、ハロゲンイオン類(I-、Br-)、D(+)glucose又はGlycineを組み合わせて構築すればよいことがわかった。
そのような発想に基づき、「one-shot反応溶液」として、C3バッファーとHBSSバッファーとの組合せを基本としたC14〜C18バッファーを構築したが、生物発光プローブに適用したところ、好ましい結果が得られず、HBSSバッファーに代えてTW80を組み合わせたC19〜C22バッファーを用いた場合に、SDSを加えず、TW80を1〜10％範囲でC3と組み合わせた、「C19、C21、C22」が高速測定可能なone-shotバッファーとなることが確認できた。この際、TW80を選んだ理由としては、界面活性剤の親水性・界面活性度においてNP-40とバランスを取る位置にあることから追加添加剤として選択した。
また、本発明者らの別の発光酵素を用いた実験では、Tris-HClバッファーに配合する界面活性剤としてNP-40と共に、SDSを配合すると発光強度が高くなるという知見を得ていたので(結果を図示せず)、Tris-HClバッファーとNP-40を基本としたC3バッファーに代えて、両者の組み合わせにさらにSDSが配合されているC4バッファーを用いて以下の実験を行った。すなわち、C4バッファーを基本としてTW80及びHBSSバッファーとの配合比を変えたC23〜C26バッファーをone-shotバッファーとして用いた実験において、「C23、C24、C25」のいずれも、N/S比が高い優れた高速測定結果が得られた。
このように、C4バッファーに、HBSSを基本とするC13バッファーを組合せ、TW80を用い、基質のD-ルシフェリンを加えた、生物発光酵素用のone-shot反応バッファーを構築することができた。
In this example, the buffer composition that achieved excellent results in the bioluminescence measurement step after the cell lysis step was basically the case where C3 buffer was used as the cell lysate. The C3 buffer was based on the Tris-HCl buffer, and the combination of NP-40, which has excellent surface activity, and MgCl2, which has high physiological compatibility, was considered to be the cause of good results. The combinations that gave particularly good results are as follows.
1. When cells are lysed with C3 buffer and assay buffer such as C8 or C10 is used.
2. When cells are lysed with C3 buffer and C6 assay buffer is used.
3. When using an assay buffer with Al (III), Ca (II), Cu (II), Fe (III), or Mg (II) added to HBSS buffer after cell lysis with C3 buffer.
4). When using assay buffer with 1% PEG or PPG added to HBSS buffer after cell lysis with C3 buffer.
5. When using an assay buffer with
6). When using an assay buffer containing 2 mg / mL D (+) glucose or Glycine in HBSS buffer after cell lysis with C3 buffer.
From the above results, the preferred buffer composition for the one-shot reaction solution was narrowed down as follows.
In other words, the basic composition of the “one-shot reaction solution” in the bioluminescent enzyme utilization technology, which requires quick solubility and high brightness observation, is based on the C3 buffer. Tris-HCl buffer combined with HBSS buffer, surfactant NP-40 or SDS, salts Al (III), Ca (II), Cu (II), Fe (III), or Mg (II), It has been found that it may be constructed by combining PEG or PPG, halogen ions (I − , Br − ), D (+) glucose or Glycine.
Based on such an idea, a C14 to C18 buffer based on a combination of C3 buffer and HBSS buffer was constructed as a “one-shot reaction solution”, but when applied to a bioluminescent probe, favorable results were obtained. In addition, when C19 to C22 buffer combined with TW80 is used instead of HBSS buffer, SDS is not added and "C19, C21, C22" combining TW80 with C3 in the range of 1 to 10% can be measured at high speed. It was confirmed that this was a one-shot buffer. In this case, TW80 was selected as an additional additive because it is in a position to balance NP-40 in the hydrophilicity and surface activity of the surfactant.
In addition, in an experiment using another luminescent enzyme of the present inventors, it was found that luminescence intensity increases when SDS is added together with NP-40 as a surfactant to be added to the Tris-HCl buffer ( The results were not shown), and instead of the C3 buffer based on Tris-HCl buffer and NP-40, the following experiment was conducted using a C4 buffer in which SDS was further added to the combination of both. In other words, in the experiment using C23 to C26 buffer as a one-shot buffer with the mixing ratio of TW80 and HBSS buffer based on C4 buffer, all of “C23, C24, C25” have a high N / S ratio. Excellent high-speed measurement results were obtained.
Thus, a one-shot reaction buffer for a bioluminescent enzyme was constructed by combining a C4 buffer with a C13 buffer based on HBSS and using TW80 and adding the substrate D-luciferin.
（１−５）本発明の実施例で用いたバッファー溶液
本発明の実施例で用いたバッファー溶液の組成を以下に示す。
(1-5) Buffer solution used in the examples of the present invention The composition of the buffer solution used in the examples of the present invention is shown below.
２．本発明の対象とするバイオアッセイ
本発明はバッファー組成に関するものであり、以下のようなバイオアッセイへの応用が想定できる。レポータージーンアッセイ(reporter-gene assay)、ツーハイブリットアッセイ(two-hybrid assay)、蛋白質相補法(protein complementation assay)、インテインを介した蛋白質スプライシング法(intein-mediated protein splicing assay)、一分子型生物発光プローブ法(single-chain probe-based assay)を行う際に「細胞溶解ステップ」を踏まずに培養細胞から直接測定に持っていく。
例えば、レポータージーンアッセイを行う際、96穴プレート上のレポーター発現ベクターを持つ細胞にリガンド刺激を行う。その後、細胞を発光させるときに当該反応溶液50μLを添加して直ちに測定すればよい。
また、一分子型生物発光プローブを用いる場合、96穴プレート上の一分子型生物発光プローブを発現する細胞にリガンド刺激を行い、刺激後、当該反応溶液50μLを添加して直ちに測定すればよい。
2. Bioassay targeted by the present invention The present invention relates to a buffer composition and can be applied to the following bioassay. Reporter-gene assay, two-hybrid assay, protein complementation assay, intein-mediated protein splicing assay, single molecule bioluminescent probe When performing a single-chain probe-based assay, the cells are taken directly from the cultured cells without the “cell lysis step”.
For example, when performing a reporter gene assay, ligand stimulation is performed on cells having a reporter expression vector on a 96-well plate. Thereafter, when the cells are allowed to emit light, 50 μL of the reaction solution may be added and measured immediately.
In addition, when using a single molecule bioluminescent probe, ligand stimulation is performed on cells expressing a single molecule bioluminescent probe on a 96-well plate, and after stimulation, 50 μL of the reaction solution may be added and measured immediately.
３．本発明のバイオアッセイに用いるための発光酵素
本発明のバイオアッセイに用いるための発光酵素は、全ての発光酵素を対象とするものである。例えば、昆虫由来および海洋動物由来の生物発光酵素であり、典型的には、firefly luicferase、click beetle luciferase、Renilla luciferase、カイアシ類ルシフェラーゼ(Metridia longa luciferase、Metridia pacifica luciferase)などがあげられる。
本発明において、「カイアシ類ルシフェラーゼ」というとき、既知のカイアシ類に由来するルシフェラーゼと共通した酵素活性上及び構造上の特徴を有するルシフェラーゼをいう。具体的には、至適pH約5〜8、至適温度約4〜25℃を有し、「セレンテラジン」を基質として発光反応を触媒する酵素活性を有するルシフェラーゼであって、構造的には２つの酵素活性ドメインを有し、N末端に分泌シグナルを有し、分子量が20ｋD程度(18kD−28kD)で他の発光酵素と比較して最も小さい分子量を有するルシフェラーゼである。
また、本発明において、バッファー成分の最適な組み合わせを検討するための各実施例では、主として、カイアシ類ルシフェラーゼの１種である高輝度かつ持続的に観察可能な人工発光酵素(ALuc)を用いた。(なお、当該ALucは、本発明者らが新たに開発した人工発光酵素であり、本出願と同日付で特許出願している。)
具体的には、当該ALucは、以下の(ア)〜(オ)のいずれかに記載のアミノ酸配列を含み、カイアシルシフェラーゼ活性を有するポリペプチドである。
（ア）配列番号１〜７のいずれかに示されたアミノ酸配列、
（イ）配列番号１〜７のいずれかに示されたアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列、
なお、ここで数個とは、1〜20個、好ましくは1〜10個、より好ましくは1〜5個を表す。
（ウ）配列番号１〜１７のいずれかに示されたアミノ酸配列と90％以上の同一性を有するアミノ酸配列、
ここで、95％以上の同一性を有するアミノ酸配列であればさらに好ましい。
（エ）配列番号８に示されたアミノ酸配列、又は
（オ）配列番号８に示されたアミノ酸配列のうち、1-20位、又は211-215位の少なくともいずれかの領域において、１個以上のアミノ酸が欠損しているアミノ酸配列。
配列番号８に示されたアミノ酸配列のうち、Xaaで表されるアミノ酸について、以下に詳細に説明する。
配列番号８中のXaaで表されるアミノ酸のうち、3，22，26，27，30，33，35，37-39，62，63，67，71-75，87，127，138，140-142，155，185，197位のアミノ酸はどのようなアミノ酸であってもよく、そのうちの71−75位、140-142位のアミノ酸はその一部又は全部欠失していてもよい。親水性アミノ酸のうちで好ましい場合は、3位、22位、27位、33位、127位、140位、141位、155位はEであり、26位、30位、62位、67位、185位はDであり、35位、87位はKであり、37位はSであり、38位、39位、138位、142位、197位はTであり、63位はNであり、71位はRであり、そして73位はD又はHである。疎水性アミノ酸のうちで好ましい場合は、3位、37位、67位、72位、74位、75位、138位、197位はGであり、22位、27位、141位はIであり、30位はVであり、33位、39位、62位、63位、127位、140位、155位、185位はAであり、87位はLであり、そして26位、38位はFである。
また、同4，6，7，10，11，13，15，16，20，31，34，36，61，66，81，168位のアミノ酸は疎水性アミノ酸であって、好ましくは、4位がI又はVであり、6位がV又はLであり、7位がI又はLであり、10位がV又はLであり、11位がI又はLであり、13位がV又はFであり、15位がV又はLであり16位がV又はAであり、20位がA又はPであり、31位がL又はGであり、34位はI又はGであり36位はF又はGであり、61位はV又はLであり、66位はA又はGであり、81位はL又はMであり、そして168位はV又はAである。
同5，24，25，60，64，65，70，95，108，153，200，208位のアミノ酸は親水性アミノ酸であって、好ましくは、5位がQ又はKであり、24位がK又はEであり、25位がD又はNであり、60位がD又はNであり、64位がN又はSであり、65位がD又はRであり、70位がK又はRであり、95位がK又はRであり、108位がK又はHであり、153位がE又はDであり200位がD又はSであり、そして208位がK，H又はTである。
3. Luminescent enzyme for use in the bioassay of the present invention The luminescent enzyme for use in the bioassay of the present invention targets all luminescent enzymes. For example, bioluminescent enzymes derived from insects and marine animals, typically firefly luicferase, click beetle luciferase, Renilla luciferase, copepod luciferase (Metridia longa luciferase, Metridia pacifica luciferase) and the like.
In the present invention, the term “copepod luciferase” refers to a luciferase having an enzyme activity and a structural feature common to luciferases derived from known copepods. Specifically, it is an luciferase having an optimum pH of about 5 to 8, an optimum temperature of about 4 to 25 ° C., and having an enzyme activity that catalyzes a luminescence reaction using “coelenterazine” as a substrate. It is a luciferase having one enzyme active domain, a secretion signal at the N-terminus, a molecular weight of about 20 kD (18 kD-28 kD) and the smallest molecular weight compared to other luminescent enzymes.
Further, in the present invention, an artificial luminescent enzyme (ALuc) which is one kind of copepod luciferase and which can be observed continuously is used mainly in each example for examining the optimum combination of buffer components. . (The ALuc is an artificial luminescent enzyme newly developed by the present inventors and has been filed for patent on the same date as the present application.)
Specifically, the ALuc is a polypeptide having an amino acid sequence described in any of (a) to (e) below and having chiacyl luciferase activity.
(A) the amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 1 to 7,
(A) an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, inserted or added in the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 1 to 7;
Here, the term “several” means 1 to 20, preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5.
(C) an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 1 to 17,
Here, it is more preferable if the amino acid sequence has 95% or more identity.
(D) One or more amino acids in the region of positions 1-20 or 211-215 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8, or (e) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 Amino acid sequence in which the amino acid is missing.
Of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8, the amino acid represented by Xaa will be described in detail below.
Among amino acids represented by Xaa in SEQ ID NO: 8, 3, 22, 26, 27, 30, 33, 35, 37-39, 62, 63, 67, 71-75, 87, 127, 138, 140- The amino acids at positions 142, 155, 185, and 197 may be any amino acid, and the amino acids at
In addition, the amino acids at
The amino acids at
３．本発明において用いる測定方法、測定装置
リガンド活性の測定は、通常の生物発光アッセイに準じて実施すればよく、特に制限なく従来のプロトコールが適用できる。
生物発光強度を測定するためには、ルミノメーター(例、MiniLumat LB 9506 (Berthold)；GloMax 20/20n(Promega))が一般的に利用されてきた。プレート上で培養された細胞にライセートバッファーをかけることによって細胞溶解液を作り、基質と混合した後の発光値を即時に測定する。
96穴プレート上に培養された細胞を対象にリガンド活性を計測する場合には、既製の生物発光プレートリーダー(例、Mithras LB 940(Berthold)；SH-9000(Corona))を用いることができる。リガンド共存下で、発現されたプローブによる生物発光は、前記プレートリーダーに付いている自動基質溶液インジェクターを用いることによって瞬時に基質導入・発光測定ができる。
3. Measuring method and measuring apparatus used in the present invention Ligand activity may be measured according to a normal bioluminescence assay, and a conventional protocol can be applied without particular limitation.
Luminometers (eg, MiniLumat LB 9506 (Berthold);
In the case of measuring ligand activity in cells cultured on a 96-well plate, a ready-made bioluminescence plate reader (eg, Mithras LB 940 (Berthold); SH-9000 (Corona)) can be used. In the presence of a ligand, bioluminescence by the expressed probe can be instantaneously introduced into the substrate and measured for luminescence by using an automatic substrate solution injector attached to the plate reader.
４．スクリーニング方法の対象被検物質
これらのスクリーニング方法の対象となる被検物質には、例えば、有機または無機の化合物(特に低分子量の化合物)、生物活性を持つ蛋白質、ペプチド等が含まれる。これらの物質は、機能や構造が既知のものであっても未知のものであってもよい。また、「コンビナトリアルケミカルライブラリー」は、目的物質を効率的に特定するための被検物質群として有効な手段である。コンビナトリアルケミカルライブラリーの調製およびスクリーニングは、当該技術分野において周知である(例えば、米国特許第6,004,617号；5,985,365号を参照)。さらには、市販のライブラリー(例えば、米国ComGenex社製、ロシアAsinex社製、米国Tripos，Inc.社製、ロシアChemStar，Ltd社製、米国3D Pharmaceuticals社製、Martek Biosciences社製などのライブラリー)を使用することもできる。また、コンビナトリアルケミカルライブラリーを、本プローブを発現する細胞の集団に適用することによって、いわゆる「ハイスループットスクリーニング」を実施することもできる。
4). Test Substances Targeted by Screening Methods Examples of test substances that are targets of these screening methods include organic or inorganic compounds (particularly low molecular weight compounds), biologically active proteins, peptides, and the like. These substances may be known or unknown in function and structure. Further, the “combinatorial chemical library” is an effective means as a test substance group for efficiently specifying a target substance. The preparation and screening of combinatorial chemical libraries is well known in the art (see, eg, US Pat. Nos. 6,004,617; 5,985,365). Furthermore, commercially available libraries (for example, libraries such as those manufactured by ComGenex in the US, manufactured by Russian Asinex, manufactured by US Tripos, Inc., manufactured by Russian ChemStar, Ltd, manufactured by 3D Pharmaceuticals, manufactured by Martek Biosciences, etc.) Can also be used. In addition, so-called “high-throughput screening” can be performed by applying a combinatorial chemical library to a population of cells expressing the probe.
５．本発明で用いる用語、概念について
本発明におけるその他の用語や概念は、発明の実施形態の説明や実施例において詳しく規定する。なお、用語は基本的にはIUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclatureによるものであり、あるいは当該分野において慣用的に使用される用語の意味に基づくものである。また発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。例えば、遺伝子工学および分子生物学的技術はJ．Sambrook，E．F．Fritsch & T．Maniatis，"Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd edition)"，Cold Spring Harbor
Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York(1989)；D．M．Glover et al．ed.，"DNA Cloning"，2nd ed.，Vol.1 to 4，(The Practical Approach Series)，IRL Press，Oxford University Press(1995)；Ausubel，F．M．et al.，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，New York，N.Y，1995；日本生化学会編、「続生化学実験講座１、遺伝子研究法II」、東京化学同人(1986);日本生化学会編、「新生化学実験講座２、核酸III(組換えDNA技術)」、東京化学同人(1992)；R．Wu ed.，"Methods in Enzymology"，Vol.68(Recombinant DNA)，Academic Press，New York(1980)；R．Wu et al．ed.，"Methods in Enzymology"，Vol.100(Recombinant DNA，Part B) & 101(Recombinant DNA，Part C)，Academic Press，New York(1983)；R．Wu et al．ed.，"Methods in Enzymology"，Vol.153(Recombinant DNA，Part D)，154(Recombinant DNA，Part E) & 155(Recombinant DNA，Part F)，Academic Press，New York(1987)などに記載の方法あるいはそこで引用された文献記載の方法またはそれらと実質的に同様な方法や改変法により行うことができる。また、本発明で使用する各種蛋白質やペプチド、あるいはそれらをコードするDNAについては、既存のデータベース(URL：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/等)から入手することができる。
5. Terms and Concepts Used in the Present Invention Other terms and concepts in the present invention are defined in detail in the description of the embodiments and examples of the present invention. The terms are basically based on the IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature, or based on the meanings of terms commonly used in the field. Various techniques used for carrying out the invention can be easily and surely implemented by those skilled in the art based on known literatures and the like, except for the techniques that clearly indicate the source. For example, genetic engineering and molecular biology techniques are described in J. Sambrook, E .; F. Fritsch & T. Maniatis, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd edition)”, Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989); M. Glover et al. ed., "DNA Cloning", 2nd ed., Vol. 1 to 4, (The Practical Approach Series), IRL Press, Oxford University Press (1995); Ausubel, F. et al. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY, 1995; edited by the Japanese Biochemical Society; Academic Society, “New
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
本発明におけるその他の用語や概念は、当該分野において慣用的に使用される用語の意味に基づくものであり、本発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。また、各種の分析などは、使用した分析機器又は試薬、キットの取り扱い説明書、カタログなどに記載の方法を準用して行った。
なお、本明細書中に引用した技術文献、特許公報及び特許出願明細書中の記載内容は、本発明の記載内容として参照されるものとする。
EXAMPLES Hereinafter, although this invention is demonstrated in detail using an Example, the technical scope of this invention is not limited to a following example.
Other terms and concepts in the present invention are based on the meanings of terms that are conventionally used in the field, and various techniques used to implement the present invention include those that clearly indicate the source. Except for this, it can be easily and reliably carried out by those skilled in the art based on known documents and the like. In addition, various analyzes were performed by applying the methods described in the analytical instruments or reagents used, kit instruction manuals, catalogs, and the like.
In addition, the description content in the technical literature, the patent gazette, and the patent application specification cited in this specification shall be referred to as the description content of the present invention.
本実施例で使われた組成物質の化学構造の例：
（実施例１）ライシスバッファーとアッセイバッファーの組み合わせの検討
本実施例では、従来のバイオアッセイに使われる、ライシスバッファーとアッセイバッファーの組み合わせによる発光輝度の比較を行った(図１)。まず、COS-7細胞を96穴プレートに培養し、人工生物発光酵素(Aluc)を発現するベクターを導入し、さらに8時間培養した。その後、培地を捨てたのち、細胞をPBSバッファーで１回洗った。図１で示しているように、一連の細胞溶解バッファー( Promega社製品Luciferase Lysis Buffer(cat．E291A)、NEB製Lysis buffer(cat．B3321)、C1〜C4)のそれぞれを50μLで20分間細胞溶解を行った。プレート上各ウェルに、基質入りの3種類のアッセイバッファー(C8：HBSSバッファー、C10：TrisバッファーにEDTAとPEG400を添加した溶液(即ち、TE PEG400) 、C5：H2O)50μLを同時に垂らし、それからの発光強度をイメージ測定器(LAS-4000，FujiFilm)で測定した。
この結果から、プロメガ製Luciferase Lysis Buffer(cat．E291A)やC3の細胞溶解液による系では発光輝度が極めて高かった。また、アッセイバッファーにおいてHBSSやTE PEGバッファーが有効であることが確認できた。特にプロメガ製細胞溶解液(cat．E291A)に対してHBSSやTE PEGバッファーをアッセイバッファーとして採用した場合、高い発光安定性(89％〜92％)が見られた(図１Ｂ)。この％の値はアッセイバッファーを導入した最初に比べて5分後の発光値を示す。また、C3の溶解バッファーに加えて、HBSSバッファーをアッセイバッファーとして採用した場合、高い輝度と発光安定性(71％)が得られた。
(Example 1) Examination of combination of lysis buffer and assay buffer In this example, a comparison was made of the luminescence intensity of a combination of lysis buffer and assay buffer used in a conventional bioassay (Fig. 1). First, COS-7 cells were cultured in a 96-well plate, a vector expressing an artificial bioluminescent enzyme (Aluc) was introduced, and further cultured for 8 hours. Thereafter, after discarding the medium, the cells were washed once with PBS buffer. As shown in FIG. 1, each of a series of cell lysis buffers (Promega Luciferase Lysis Buffer (cat. E291A), NEB Lysis buffer (cat. B3321), C1-C4) was lysed in 50 μL for 20 minutes. Went. To each well on the plate, 50 μL of 3 kinds of assay buffers containing substrates (C8: HBSS buffer, C10: Tris buffer with EDTA and PEG400 added (ie, TE PEG400), C5: H 2 O) were dropped simultaneously. The emission intensity was measured with an image measuring device (LAS-4000, FujiFilm).
From this result, the luminance of luminescence was extremely high in a system using Luciferase Lysis Buffer (cat. E291A) manufactured by Promega or C3 cell lysate. It was also confirmed that HBSS and TE PEG buffer were effective in the assay buffer. In particular, when HBSS or TE PEG buffer was employed as an assay buffer for Promega cell lysate (cat. E291A), high luminescence stability (89% to 92%) was observed (FIG. 1B). This% value indicates the
（実施例２）C3と組み合わせ可能な最適アッセイバッファーの探索
実施例１の結果からC3が有効な細胞溶解バッファーであったことから、C3と組み合わせできる最適アッセイバッファーを更に探索した(図２)。まず、COS-7細胞を96穴プレートに培養し人工生物発光酵素(ALuc)発現用プラスミドを導入した。16時間CO２インキュベーターで培養した後、各ウェルに50μLのC3溶液で細胞溶解を20分間実施した。このライセットに対して、図２で示したように基質入りのアッセイバッファー50μLを同時に入れ、直ちにLAS-4000(FujiFilm)で相対的な発光輝度を測定した。更に基質入りのアッセイバッファー導入後、8分、16分経過後の発光値を測定し発光安定性を検証した。
その結果、図２Ａで分かるように、C3と相性のよいアッセイバッファーとしてPBS、HBSS、Tris-PEGバッファーがよいことが分かった。発光安定性においても図２Ｂで示すように PBS、HBSS、Tris−MgCl2などが比較的によいことが分かった。一方、PBSバッファーにBSAを添加した場合、発光輝度と安定性が悪くなることからbovine serum albumin(BSA)添加はアッセイバッファーに添加してはならない添加物であることが分かった。
(Example 2) Search for optimal assay buffer that can be combined with C3 Since C3 was an effective cell lysis buffer from the results of Example 1, an optimal assay buffer that could be combined with C3 was further searched (FIG. 2). First, COS-7 cells were cultured in a 96-well plate, and an artificial bioluminescent enzyme (ALuc) expression plasmid was introduced. After culturing in a CO 2 incubator for 16 hours, cell lysis was performed for 20 minutes with 50 μL of C3 solution in each well. As shown in FIG. 2, 50 μL of the assay buffer containing the substrate was simultaneously added to this lyset, and the relative emission luminance was immediately measured with LAS-4000 (FujiFilm). Furthermore, after introducing the assay buffer containing the substrate, the luminescence value was measured after 8 and 16 minutes, and the luminescence stability was verified.
As a result, as shown in FIG. 2A, it was found that PBS, HBSS, and Tris-PEG buffer are good as an assay buffer compatible with C3. Also in terms of luminescence stability, it was found that PBS, HBSS, Tris-MgCl 2 and the like were relatively good as shown in FIG. 2B. On the other hand, when BSA was added to the PBS buffer, the luminescence brightness and stability deteriorated, so it was found that the addition of bovine serum albumin (BSA) is an additive that should not be added to the assay buffer.
（実施例３）アッセイバッファーの添加剤としての重金属イオンの効果の検証
前記実施例１及び２の結果からC3が有効な細胞溶解バッファーであり、PBSやHBSSが有力なアッセイバッファーであることが分かった。
本実施例ではアッセイバッファーの添加剤として重金属イオンの効果を検証した(図３)。まず、COS-7細胞を96穴プレートに培養し人工生物発光酵素(ALuc)発現用プラスミドを導入した。16時間CO２インキュベーターで培養した後、各ウェルに50μLのC3溶液で細胞溶解を20分間実施した。このライセットに対して、図３で示した各重金属イオン1 PPMと基質入りのHBSSバッファー50μLを同時に入れ、直ちにLAS-4000で相対的な発光輝度を測定した。更に
基質入りのアッセイバッファー導入後、8分、16分経過後の発光値を測定し発光安定性を検証した。
その結果、図３Ａで分かるように、C3と HBSSに加えるに適した重金属添加剤は、Al(III)、Ca(II)、Cu(II)、Fe(III)、Mg(II)などが適していることが分かった。また発光輝度と安定性を総合的に判断した場合、 Al(III)、Cu(II)、Fe(III)、Mo(VI)、Zn(II)などがよい添加剤であることが分かった。また、Cd(II)、Co(II)、Ni(II)などは発光輝度を著しく損なうことから、添加してはならない重金属であることが分かった。
(Example 3) Verification of the effect of heavy metal ions as an additive for assay buffer From the results of Examples 1 and 2, it was found that C3 is an effective cell lysis buffer and PBS and HBSS are effective assay buffers. It was.
In this example, the effect of heavy metal ions as an additive for the assay buffer was verified (FIG. 3). First, COS-7 cells were cultured in a 96-well plate, and an artificial bioluminescent enzyme (ALuc) expression plasmid was introduced. After culturing in a CO 2 incubator for 16 hours, cell lysis was performed for 20 minutes with 50 μL of C3 solution in each well. To this lyset, 1 PPM of each heavy metal ion shown in FIG. 3 and 50 μL of HBSS buffer containing a substrate were simultaneously added, and the relative emission luminance was immediately measured with LAS-4000. Furthermore, after introducing the assay buffer containing the substrate, the luminescence value was measured after 8 and 16 minutes, and the luminescence stability was verified.
As a result, as can be seen in FIG. 3A, suitable heavy metal additives to be added to C3 and HBSS are Al (III), Ca (II), Cu (II), Fe (III), Mg (II), etc. I found out. In addition, it was found that Al (III), Cu (II), Fe (III), Mo (VI), Zn (II) and the like are good additives when comprehensively judging the luminance and stability of light emission. Cd (II), Co (II), Ni (II), etc. are heavy metals that should not be added because they significantly impair the luminance.
（実施例４）バイオアッセイ用反応溶液におけるグリコール類の添加効果
本実施例では、実際に発光プローブを用い、バイオアッセイ用反応溶液におけるグリコール類の添加効果を調べた(図４)。
まず、本発明者らが開発した一分子型生物発光プローブの製造法(非特許文献１０)に従って、新たな一分子型生物発光プローブを開発した。発光酵素においては多数のフランクトン由来の発光ルシフェラーゼを束ね、更にその中から熱力学的に安定性の高い配列を抽出する手法で、本発明者が新たに開発した人工生物発光酵素(ALuc)(本出願と同日付で出願)を二分割し、その間に男性ホルモン受容体(AR LBD)を挿入した(図４Ａ)。このプローブは男性ホルモン共存下で分子構造が変わるように設計されており、結果的に2分割した酵素断片が再結合される。
この実験のためにまず、COS-7細胞を96穴プレートに培養し、前記一分子型生物発光プローブをコードするプラスミドを導入した。16時間CO２インキュベーターで培養した後、各ウェルに50μLのC3溶液で細胞溶解を20分間実施した。このライセットに対して、図４Ｂで示した分量のPPGやPEGと基質を入れたHBSSバッファー50μLを調製してマルチチャンネルピペットで同時に入れ、直ちに従来のルミノメーター(GloMax 20/20n；Promega)を用いて発光値を測定した。
その結果、PPGやPEGの添加は有効な結果が見込まれることが分かった。更に添加量としては、アッセイバッファーの1％程度が適当であることが確認できた。
Example 4 Effect of Addition of Glycols in Bioassay Reaction Solution In this example, the effect of addition of glycols in the bioassay reaction solution was examined by actually using a luminescent probe (FIG. 4).
First, a new single molecule type bioluminescent probe was developed according to the method for producing a single molecule type bioluminescent probe developed by the present inventors (Non-patent Document 10). In the luminescent enzyme, a method of bundling a large number of luciferases derived from franktons, and further extracting a thermodynamically stable sequence from them, an artificial bioluminescent enzyme (ALuc) newly developed by the present inventor (ALuc) ( The application was filed on the same date as this application), and an androgen receptor (AR LBD) was inserted between them (FIG. 4A). This probe is designed to change its molecular structure in the presence of androgen, resulting in recombination of the two split enzyme fragments.
For this experiment, COS-7 cells were first cultured in a 96-well plate, and a plasmid encoding the monomolecular bioluminescent probe was introduced. After culturing in a CO 2 incubator for 16 hours, cell lysis was performed for 20 minutes with 50 μL of C3 solution in each well. For this lyset, prepare 50 μL of HBSS buffer containing the amount of PPG or PEG and the substrate shown in FIG. 4B, and simultaneously add them with a multichannel pipette. Immediately insert a conventional luminometer (
As a result, it was found that the addition of PPG and PEG is expected to be effective. Further, it was confirmed that about 1% of the assay buffer was appropriate as the addition amount.
（実施例５）バイオアッセイ用反応溶液におけるハロゲンイオン添加効果
本実施例では、バイオアッセイ用反応溶液におけるハロゲンイオン添加効果を調べた(図５)。前記実施例４で作製した一分子型生物発光プローブを用い、当該発光プローブが男性ホルモン認識をする際に用いる反応溶液中へのハロゲンイオン(Br-やI-)添加による効果を検討した。
まず、前記一分子型生物発光プローブをコードするプラスミドを、TransIT-LT1を用いて96穴プレートに培養したCOS-7細胞に導入した。16時間CO２インキュベーターで培養した後、各ウェルに50μLのC3溶液で細胞溶解を20分間実施した。このライセットに対して、図５Ｂで示した分量のKBrやKIと基質を入れたHBSSバッファー50μLを調製してマルチチャンネルピペットで同時に入れ、直ちに従来のルミノメーター(GloMax 20/20n；Promega)を用いて発光値を測定した。
その結果、ハロゲンイオンの添加が有効な添加剤であることが分かった。具体的にはKIであれば何れも良くて特に50mM程度入れた方が良かった。KBrであれば100mM程度を入れた方がよいことが分かった。
Example 5 Effect of Halogen Ion Addition in Bioassay Reaction Solution In this example, the effect of halogen ion addition in a bioassay reaction solution was examined (FIG. 5). Using the single-molecule bioluminescent probe prepared in Example 4, the effect of adding a halogen ion (Br − or I − ) to the reaction solution used when the luminescent probe recognizes androgen was examined.
First, a plasmid encoding the monomolecular bioluminescent probe was introduced into COS-7 cells cultured in a 96-well plate using TransIT-LT1. After culturing in a CO 2 incubator for 16 hours, cell lysis was performed for 20 minutes with 50 μL of C3 solution in each well. To this lyset, prepare 50 μL of HBSS buffer containing KBr, KI and substrate in the amount shown in FIG. 5B, and simultaneously add it with a multichannel pipette. Immediately insert a conventional luminometer (
As a result, it was found that addition of halogen ions is an effective additive. Specifically, any KI would be good, especially about 50 mM. It turned out that it is better to add about 100mM for KBr.
（実施例６）バイオアッセイ用反応溶液における多糖類添加効果
本実施例では、バイオアッセイ用反応溶液における多糖類添加効果を調べた(図６)。前記実施例４で作製した一分子型生物発光プローブを用い、当該発光プローブが男性ホルモン認識をする際に用いる反応溶液中への多糖類添加効果を検討した。
まず、前記一分子型生物発光プローブをコードするプラスミドを、TransIT-LT1を用いて96穴プレートに培養したCOS-7細胞に導入した。16時間CO２インキュベーターで培養した後、各ウェルに50μLのC3溶液で細胞溶解を20分間実施した。このライセットに対して、図で示した分量の多糖類と基質を入れたHBSSバッファー50μLを調製してマルチチャンネルピペットで同時に入れ、直ちに従来のルミノメーター(GloMax 20/20n；Promega)を用いて発光値を測定した。
その結果、スクロースやグルコースの添加が特に有効であることが分かった。また、多糖類ではなくても、グリシンの添加が有効であることが分かった。入れる量は2mg/mLが適正であることが分かった。
(Example 6) Effect of adding polysaccharide in reaction solution for bioassay In this example, the effect of adding polysaccharide in reaction solution for bioassay was examined (FIG. 6). Using the single-molecule bioluminescent probe prepared in Example 4, the effect of adding polysaccharide to the reaction solution used when the luminescent probe recognizes male hormones was examined.
First, a plasmid encoding the monomolecular bioluminescent probe was introduced into COS-7 cells cultured in a 96-well plate using TransIT-LT1. After culturing in a CO 2 incubator for 16 hours, cell lysis was performed for 20 minutes with 50 μL of C3 solution in each well. For this lyset, prepare 50 μL of HBSS buffer containing the amount of polysaccharide and substrate shown in the figure, add them simultaneously with a multichannel pipette, and immediately use a conventional luminometer (
As a result, it was found that addition of sucrose or glucose is particularly effective. Further, it was found that addition of glycine is effective even if it is not a polysaccharide. It was found that 2 mg / mL was appropriate.
（実施例７）一分子型生物発光プローブ(cSimgr8)によるストレスホルモンアッセイ試験−１
本発明のOne-shot bufferの好適性能を立証するために、ストレスホルモン受容体(the ligand binding domain of glucocorticoid receptor；GR LBD)を骨格とする一分子型生物発光プローブ(cSimgr8)に、本発明のC14〜C22の反応バッファーを適用したバイオアッセイを行った(図７)。なお、cSimgr8は、実施例４で示したように独自に開発した人工生物発光酵素(ALuc)を好適に２分割して円順列置換した後、その外側にストレスホルモン受容体(the ligand binding domain of glucocorticoid receptor；GR LBD)とその特異的な結合配列を繋げた形態の新規一分子型生物発光プローブである。
まず、COS-7細胞を96穴プレートに培養し、cSimgr8を導入した。更に16時間培養後、プレート上のCOS-7細胞を２つに分け、一方の細胞に10-5Mのストレスホルモン(cortisol)で20分間刺激し、もう一方の細胞にはコントロール(0.1％DMSO)で20分刺激した。その後、プレート上の培地を廃棄し細胞だけを残した。One-shotバッファーとして、C14〜C22の組成を持つバッファーを準備した。発光測定機器は、Promega製の高感度ルミノメーター(GloMax 20/20ｎ；Promega)を用いた。
アッセイの手順としては、まず培地除去した前記プレートの各ウェルに、前記C14〜C22いずれの溶液50μLを入れ数回ピペッティングした後、全量を1.6mLのエッペンチューブに移して、そのまま前記ルミノメーターで３秒間光量測定を行った。各バッファー別の結果を図７で示す。
(Example 7) Stress hormone assay test -1 using a single-molecule bioluminescent probe (cSimgr8)
In order to verify the preferable performance of the One-shot buffer of the present invention, a single molecule bioluminescent probe (cSimgr8) having a backbone of a stress hormone receptor (the ligand binding domain of glucocorticoid receptor; GR LBD) is used. A bioassay using a reaction buffer of C14 to C22 was performed (FIG. 7). As shown in Example 4, cSimgr8 is an artificial bioluminescent enzyme (ALuc) that was originally developed and divided into two parts by circular permutation. After that, a stress hormone receptor (the ligand binding domain of It is a novel single-molecule bioluminescent probe in the form of glucocorticoid receptor (GR LBD) and its specific binding sequence.
First, COS-7 cells were cultured in a 96-well plate, and cSimgr8 was introduced. After further incubation for 16 hours, the COS-7 cells on the plate were divided into two, one cell was stimulated with 10 -5 M stress hormone (cortisol) for 20 minutes, and the other cell was control (0.1% DMSO). ) For 20 minutes. Thereafter, the medium on the plate was discarded, leaving only the cells. A buffer having a composition of C14 to C22 was prepared as a one-shot buffer. As the luminescence measuring instrument, a high sensitivity luminometer (
As an assay procedure, first add 50 μL of any of the above C14 to C22 solutions to each well of the plate from which the medium had been removed, pipette several times, transfer the entire amount to a 1.6 mL Eppendorf tube, and continue to use the luminometer. The light quantity was measured for 3 seconds. The results for each buffer are shown in FIG.
（実施例８）一分子型生物発光プローブ(cSimgr8)によるストレスホルモンアッセイ試験−２
(実施例７)と同じ一分子型生物発光プローブ(cSimgr8)によるストレスホルモンアッセイ試験を、本発明のC23〜C26の反応バッファーを適用して行った(図８)。
(実施例７)と同様に、COS-7細胞を96穴プレートに培養し、cSimgr8を導入した。更に16時間培養後、プレート上のCOS-7細胞を２つに分け、一方の細胞に10-5Mのストレスホルモン(cortisol)で20分間刺激し、もう一方の細胞にはコントロール(0.1％DMSO)で20分刺激した。その後、プレート上の培地を廃棄し細胞だけを残した。One-shotバッファーとして、C14〜C22の組成を持つバッファーを準備した。発光測定機器は、Promega製の高感度ルミノメーター(GloMax 20/20ｎ；Promega)を用いた。
アッセイの手順としては、まず培地除去した前記プレートの各ウェルに、前記C23〜C26いずれの溶液50μLを入れ数回ピペッティングした後、全量を1.6mLのエッペンチューブに移して、そのまま前記ルミノメーターで3秒間光量測定を行った。各バッファー別の結果を図８で示す。
Example 8 Stress Hormone Assay Test-2 with Single Molecule Bioluminescent Probe (cSimgr8)
A stress hormone assay test using the same single molecule type bioluminescent probe (cSimgr8) as in Example 7 was performed by applying the reaction buffer of C23 to C26 of the present invention (FIG. 8).
In the same manner as in Example 7, COS-7 cells were cultured in a 96-well plate and cSimgr8 was introduced. After further incubation for 16 hours, the COS-7 cells on the plate were divided into two, one cell was stimulated with 10 -5 M stress hormone (cortisol) for 20 minutes, and the other cell was control (0.1% DMSO). ) For 20 minutes. Thereafter, the medium on the plate was discarded, leaving only the cells. A buffer having a composition of C14 to C22 was prepared as a one-shot buffer. As the luminescence measuring instrument, a high sensitivity luminometer (
As an assay procedure, first add 50 μL of any of the C23 to C26 solutions to each well of the plate after removing the medium and pipet several times, then transfer the entire volume to a 1.6 mL Eppendorf tube, and continue using the luminometer. The light intensity was measured for 3 seconds. The results for each buffer are shown in FIG.
（実施例９） 一分子型生物発光プローブ(pLeu-rich)による男性ホルモンアッセイ試験
本発明のOne-shot bufferの好適性能を立証するために、男性ホルモン受容体(the ligand binding domain of androgen receptor；AR LBD)を骨格とする一分子型生物発光プローブ(pLeu-rich)に本バッファーを適用した。なお、pLeu-richは本発明者らがホタル由来発光ルシフェラーゼを用いて以前開発した一分子型生物発光プローブ(非特許文献１１)である。
まず、COS-7細胞を96穴プレートに培養し、pLeu-richを導入した。更に16時間培養後、プレート上のCOS-7細胞を２つに分け、一部の細胞に10-5Mの5α-dihydrotestosterone(DHT)，4-hydroxytamoxifen(OHT)，17β-estradiol(E2)，dichlorodiphenyltrichloroethane(DDT)，Polychlorinated biphenyls(PCB)で20分間刺激した。その後、培地を廃棄することによって細胞側のアッセイ準備を終えた。一方、反応バッファーにおいては、C29溶液にD-luciferinを混合した溶液を用いた。発光測定機器は、Promega製の高感度ルミノメーター(GloMax 20/20ｎ；Promega)を用いた。
アッセイの手順は、まず培地除去した前記プレートに、前記C16溶液50μLを入れ数回ピペッティングした後、全量を1.6mLのエッペンチューブに移して前記ルミノメーターで光量測定を行った。
その結果、図９で示している結果を得た。まず、DHTやE2に対して一定の検出能(バックグラウンドより約3-5倍)を示していることが分かった。しかも細胞溶解から測定に至るまでの時間が瞬時(数秒以内)にできることが分かった。この結果は、従来30分以上かかり、煩雑だった手順を非常に単純化しており、このような点から当該反応バッファーの優位性を示している結果である。
(Example 9) Male hormone assay test using single-molecule type bioluminescent probe (pLeu-rich) In order to verify the suitable performance of the one-shot buffer of the present invention, the male hormone receptor (the ligand binding domain of androgen receptor; This buffer was applied to a single molecule bioluminescent probe (pLeu-rich) with AR LBD) as the backbone. PLeu-rich is a single-molecule bioluminescent probe that was previously developed by the present inventors using firefly-derived luminescent luciferase (Non-patent Document 11).
First, COS-7 cells were cultured in a 96-well plate, and pLeu-rich was introduced. After further incubation for 16 hours, COS-7 cells on the plate were divided into two, and 10 -5 M 5α-dihydrotestosterone (DHT), 4-hydroxytamoxifen (OHT), and 17β-estradiol (E 2 ) were added to some cells. , Dichlorodiphenyltrichloroethane (DDT), and polychlorinated biphenyls (PCB) were stimulated for 20 minutes. The cell-side assay preparation was then completed by discarding the medium. On the other hand, as the reaction buffer, a solution in which D-luciferin was mixed with C29 solution was used. As the luminescence measuring instrument, a high sensitivity luminometer (
The assay procedure was as follows. First, 50 μL of the C16 solution was added to the plate from which the medium had been removed, and pipetting was performed several times. The entire amount was transferred to a 1.6 mL Eppendorf tube, and the light intensity was measured with the luminometer.
As a result, the result shown in FIG. 9 was obtained. First, it was found that shows a constant detectability (approximately 3-5 fold above background) with respect to DHT or E 2. Moreover, it was found that the time from cell lysis to measurement can be instantaneously (within a few seconds). This result is a result that shows the superiority of the reaction buffer from such a point, which has greatly simplified the complicated procedure that conventionally takes 30 minutes or more.
（実施例１０）一分子型生物発光プローブ(pSimer-r2)による女性ホルモンアッセイ試験
前記反応バッファー(One-shot buffer)の性能を立証するために、女性ホルモン受容体(the ligand binding domain of estrogen receptor；ER LBD)を骨格とする一分子型生物発光プローブ(pSimer-r2)に本バッファーを適用した。なお、pSimer-r2は本発明者らがコメツキムシ由来発光ルシフェラーゼ(click beetle luciferase；CBLuc)を用いて以前開発した一分子型生物発光プローブ(非特許文献１２)である。
まず、COS-7細胞を96穴プレートに培養し、pSimer-r2を導入した。更に16時間培養後、プレート上のCOS-7細胞を２つに分け、一部の細胞に10-5Mの5α-dihydrotestosterone(DHT)，4-hydroxytamoxifen(OHT)，17β-estradiol(E2)，dichlorodiphenyltrichloroethane(DDT)，Polychlorinated biphenyls(PCB)で20分間刺激した。残りの細胞は対照群(コントロール)として用いた。その後、培地を廃棄することによって細胞側のアッセイ準備を終えた。一方、One-shot反応バッファーにおいては、C16を用いた。発光測定機器は、Promega製の高感度ルミノメーター(GloMax 20/20；Promega)を用いた。
アッセイの手順は、まず培地除去した前記プレートに、前記C16溶液50μLを入れ数回ピペッティングした後、全量を1.6mLのエッペンチューブに移して前記ルミノメーターで光量測定を行った。
その結果、図１０で示している結果を得た。まず、4-hydroxytamoxifen(OHT)に対して一定の検出能(バックグラウンドより約5倍)を示していることが分かった。しかも細胞溶解から測定に至るまでの時間が瞬時(数秒以内)にできることが分かった。この結果は、従来30分以上かかり、煩雑だった手順を非常に単純化しており、このような点から当該反応バッファーの優位性を示している結果である。
(Example 10) Female hormone assay test using single molecule type bioluminescent probe (pSimer-r2) In order to verify the performance of the one-shot buffer, the ligand binding domain of estrogen receptor This buffer was applied to a single-molecule bioluminescent probe (pSimer-r2) having a backbone of ER LBD). PSimer-r2 is a single-molecule bioluminescent probe (Non-patent Document 12) previously developed by the present inventors using click beetle luciferase (CBLuc).
First, COS-7 cells were cultured in a 96-well plate, and pSimer-r2 was introduced. After further incubation for 16 hours, COS-7 cells on the plate were divided into two, and 10 -5 M 5α-dihydrotestosterone (DHT), 4-hydroxytamoxifen (OHT), and 17β-estradiol (E 2 ) were added to some cells. , Dichlorodiphenyltrichloroethane (DDT), and polychlorinated biphenyls (PCB) were stimulated for 20 minutes. The remaining cells were used as a control group (control). The cell-side assay preparation was then completed by discarding the medium. On the other hand, C16 was used in the One-shot reaction buffer. As the luminescence measuring instrument, a high sensitivity luminometer (
The assay procedure was as follows. First, 50 μL of the C16 solution was added to the plate from which the medium had been removed, and pipetting was performed several times.
As a result, the result shown in FIG. 10 was obtained. First, it was found that 4-hydroxytamoxifen (OHT) showed a certain detection ability (about 5 times the background). Moreover, it was found that the time from cell lysis to measurement can be instantaneously (within a few seconds). This result is a result that shows the superiority of the reaction buffer from such a point, which has greatly simplified the complicated procedure that conventionally takes 30 minutes or more.
Claims (7)
下記(１)及び(２)を含むことを特徴とする生物発光用反応バッファー；
（１）Tris-バッファー及びHBSSバッファーを含む基本バッファー、
（２）NP-40及びTW80を含む界面活性剤。 A bioluminescence reaction buffer for performing bioassay using bioluminescence of live cell lysis and copepod luciferase ,
A bioluminescence reaction buffer comprising the following (1) and (2):
(1) Basic buffer including Tris-buffer and HBSS buffer,
(2) A surfactant containing NP-40 and TW80.
（３）PEG及びPPGから選択された少なくとも１種の高分子化合物、
（４）Mg(II)、Fe(III)，Cu(II)，Mo(VI)及びZn(II)から選択された少なくとも１種の多価イオン、
（５）Br-及びＩ-から選択された少なくとも１種のハロゲンイオン、
（６）スクロース、グルコース、及びグリシンから選択されたポリオール類。 The bioluminescence reaction buffer according to claim 1 or 2, further comprising at least one of the following additives (3) to (6):
(3) at least one polymer compound selected from PEG and PPG;
(4) at least one multivalent ion selected from Mg (II), Fe (III), Cu (II), Mo (VI) and Zn (II);
(5) Br - and I - at least one halogen ion selected from,
(6) Polyols selected from sucrose, glucose, and glycine.
前記(２)の界面活性剤中のNP-40及びTW80の配合比が、容量(v/v)％で1：1〜10であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の生物発光用反応バッファー。 The mixing ratio of Tris-buffer and HBSS buffer in the basic buffer (1) is 20-50: 50-20 in volume (v / v)%, and in the surfactant (2) The bioluminescence reaction buffer according to any one of claims 1 to 3, wherein the mixing ratio of NP-40 and TW80 is 1: 1 to 10 in volume (v / v)%.
下記(１)及び(２)を含む生物発光用反応バッファーを用いることを特徴とする、バイオアッセイ法；
（１）Tris-バッファー及びHBSSバッファーを含む基本バッファー、
（２）NP-40及びTW80を含む界面活性剤。 The viable cells were suspended in for bioluminescence reaction buffer, dissolve the living cells, bioluminescence intensity of copepod luciferase resulting suspension to measure, a bioassay method using bioluminescence ,
A bioassay method characterized by using a bioluminescence reaction buffer comprising the following (1) and (2):
(1) Basic buffer including Tris-buffer and HBSS buffer,
(2) A surfactant containing NP-40 and TW80.
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