JP6077757B2 - Staining agent for electron microscope observation and staining method for sample for electron microscope observation - Google Patents
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Description
本発明は、電子顕微鏡観察用染色剤および電子顕微鏡観察用試料の染色方法に関する。 The present invention relates to a staining agent for electron microscope observation and a staining method for a sample for electron microscope observation.
生体試料の微細な構造等を観察する装置として、光学顕微鏡や電子顕微鏡が知られている。特に、電子顕微鏡は光学顕微鏡と比べて分解能が高いため、より微細な構造を観察する際に有効である。しかしながら、生体試料は、炭素、酸素、窒素、水素などの軽元素を含んで構成されているため、電子線を十分に散乱させることができない。したがって、電子顕微鏡で観察しても、電子顕微鏡像に十分なコントラストが得られない場合がある。そのため、電子顕微鏡で生体試料を観察する際には、一般的に、試料を重金属等で電子染色する。試料を電子染色することにより、電子線の散乱を促し、電子顕微鏡像にコントラストをつけることができる。 As an apparatus for observing the fine structure of a biological sample, an optical microscope and an electron microscope are known. In particular, since the electron microscope has a higher resolution than the optical microscope, it is effective for observing a finer structure. However, since the biological sample is configured to include light elements such as carbon, oxygen, nitrogen, and hydrogen, the electron beam cannot be sufficiently scattered. Therefore, even when observed with an electron microscope, sufficient contrast may not be obtained in the electron microscope image. Therefore, when observing a biological sample with an electron microscope, the sample is generally electronically stained with heavy metal or the like. By electron-staining the sample, scattering of the electron beam can be promoted, and contrast can be given to the electron microscope image.
従来、電子染色剤（電子顕微鏡観察用染色剤）として、酢酸ウラニルが用いられていた。酢酸ウラニルは、高い染色効果を有しており、酢酸ウラニルで生体試料を染色することにより、高いコントラストの電子顕微鏡像を得ることができる。 Conventionally, uranyl acetate has been used as an electron stain (stain for electron microscope observation). Uranyl acetate has a high staining effect, and a high contrast electron microscope image can be obtained by staining a biological sample with uranyl acetate.
また、特許文献１には、電子染色剤として、白金ブルー（［Ｐｔ４（ＮＨ３）８（Ｃ６Ｈ１３Ｏ５）４］＋５）が開示されている。 Patent Document 1 discloses platinum blue ([Pt 4 (NH 3 ) 8 (C 6 H 13 O 5 ) 4 ] +5 ) as an electron stain.
上述したように、酢酸ウラニルは高い染色効果を有しているが、放射性物質のため、入手や使用に厳しい規制がある。そのため、酢酸ウラニルに代替する電子染色剤が求められている。上述した特許文献１に開示された白金ブルーは、酢酸ウラニルに代替する電子染色剤の１つとして知られている。 As described above, uranyl acetate has a high staining effect, but because of the radioactive substance, there are strict regulations on its availability and use. Therefore, there is a need for an electronic stain that replaces uranyl acetate. Platinum blue disclosed in Patent Document 1 described above is known as one of electron staining agents that substitute for uranyl acetate.
白金ブルーは、時間が経過すると変質する場合があるため、使用にあわせて合成することが望ましい。しかしながら、白金ブルーの合成には、通常５〜７日程度の時間が必要であり、かつ高度な化学的知識を必要とする。したがって、白金ブルーを用いた電子染色では、白金ブルーの合成に時間や手間がかかってしまい、簡便に電子染色を行うことができないという問題があった。 Since platinum blue may change in quality over time, it is desirable to synthesize it according to use. However, the synthesis of platinum blue usually requires about 5-7 days and requires advanced chemical knowledge. Therefore, in the electron staining using platinum blue, there is a problem that the synthesis of platinum blue takes time and labor, and the electron staining cannot be easily performed.
本発明は、以上のような問題点に鑑みてなされたものであり、本発明のいくつかの態様によれば、簡便に電子染色を行うことができ、かつ高い染色効果を有する電子顕微鏡観察用染色剤および電子顕微鏡観察用試料の染色方法を提供することができる。 The present invention has been made in view of the above-described problems, and according to some embodiments of the present invention, it is possible to easily perform electron staining and for electron microscope observation having a high staining effect. A staining method and a staining method of a sample for electron microscope observation can be provided.
（１）本発明に係る電子顕微鏡観察用染色剤は、三酢酸イッテルビウムを含有する。 (1) The stain for electron microscope observation according to the present invention contains ytterbium triacetate.
このような電子顕微鏡観察用染色剤によれば、高い染色効果を有することができる。さらに、三酢酸イッテルビウムは、合成等の必要がなく、例えば、水に溶解させるだけで電子染色剤として用いることができる。したがって、簡便に電子染色を行うことができる。さらに、ネガティブ染色においても、高い染色効果を有することができる。 Such a staining agent for electron microscope observation can have a high staining effect. Furthermore, ytterbium triacetate does not require synthesis or the like, and can be used as an electron stain simply by dissolving it in water, for example. Therefore, it is possible to easily perform electron staining. Furthermore, it can have a high staining effect even in negative staining.
（２）本発明に係る電子顕微鏡観察用試料の染色方法は、
本発明に係る電子顕微鏡観察用染色剤に試料を接触させる工程を含む。
(2) The staining method of the sample for electron microscope observation according to the present invention is as follows:
A step of bringing the sample into contact with the electron microscope observation stain according to the present invention.
このような電子顕微鏡観察用試料の染色方法によれば、試料を、簡便かつ良好に電子染色することができる。 According to such a method for staining an electron microscope observation sample, the sample can be easily and satisfactorily electron-stained.
（３）本発明に係る電子顕微鏡観察用試料の染色方法において、
前記電子顕微鏡観察用染色剤に接触した試料を、鉛化合物を含有する染色液に接触させる工程をさらに含んでいてもよい。
(3) In the method for staining a sample for electron microscope observation according to the present invention,
A step of contacting the sample in contact with the electron microscope observation stain with a staining solution containing a lead compound may be further included.
このような電子顕微鏡観察用試料の染色方法によれば、染色効果を高めることができる。 According to such a method for staining an electron microscope observation sample, the staining effect can be enhanced.
以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。なお、以下に説明する実施形態は、特許請求の範囲に記載された本発明の内容を不当に限定するものではない。また以下で説明される構成の全てが本発明の必須構成要件であるとは限らない。 Hereinafter, preferred embodiments of the present invention will be described in detail. The embodiments described below do not unduly limit the contents of the present invention described in the claims. Also, not all of the configurations described below are essential constituent requirements of the present invention.
１． 第１実施形態
１．１． 電子顕微鏡観察用染色剤
まず、第１実施形態に係る電子顕微鏡観察用染色剤について説明する。
1. 1. First embodiment 1.1. Electron Microscope Observation Staining Agent First, the electron microscope observation staining agent according to the first embodiment will be described.
本実施形態に係る電子顕微鏡観察用染色剤は、三酢酸イッテルビウム（Ｙｂ（ＣＨ３ＣＯＯ）３）を含有する。なお、三酢酸イッテルビウムを含有するとは、三酢酸イッテルビウムの水和物を含有している場合も含むものとする。三酢酸イッテルビウムの水和物としては、例えば、酢酸イッテルビウム四水和物（Ｙｔｔｅｒｂｉｕｍ（III） ａｃｅｔａｔｅ ｔｅｔｒａｈｙｄｒａｔｅ， Ｙｂ（ＣＨ３ＣＯＯ）３・４Ｈ２Ｏ）が挙げられる。 The stain for electron microscope observation according to the present embodiment contains ytterbium triacetate (Yb (CH 3 COO) 3 ). It should be noted that “containing ytterbium triacetate” includes the case of containing hydrate of ytterbium triacetate. Examples of the hydrate of ytterbium triacetate include ytterbium acetate tetrahydrate (Yterbium (III) acetate tetrahydrate, Yb (CH 3 COO) 3 .4H 2 O).
ここで、電子顕微鏡観察用染色剤とは、電子顕微鏡観察の対象となる試料を染色するための染色剤（電子染色剤）をいう。なお、染色とは、いわゆる電子染色をいい、試料の特定の部位に電子の散乱を促す物質（重金属等）を吸着または結合させることをいう。電子顕微鏡観察用染色剤を用いて試料を染色することにより、電子顕微鏡像にコントラストをつけることができる。 Here, the electron microscope observation staining agent refers to a staining agent (electron staining agent) for staining a sample to be observed with an electron microscope. Note that the staining refers to so-called electron staining, in which a substance (such as heavy metal) that promotes electron scattering is adsorbed or bound to a specific portion of a sample. By staining the sample with a staining agent for electron microscope observation, contrast can be given to the electron microscope image.
また、染色された試料の観察に用いられる電子顕微鏡としては、例えば、走査電子顕微鏡（Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ、ＳＥＭ）、透過電子顕微鏡（Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ、ＴＥＭ）、走査透過電子顕微鏡（Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ、ＳＴＥＭ）などが挙げられる。 Examples of the electron microscope used for observing the stained sample include a scanning electron microscope (SEM), a transmission electron microscope (Transmission Electron Microscope, TEM), a scanning transmission electron microscope (Scanning Transmission Electron Microscope, TEM), and the like. STEM).
本実施形態に係る電子顕微鏡観察用染色剤は、例えば、三酢酸イッテルビウム水溶液である。三酢酸イッテルビウム水溶液の濃度は特に限定されず、例えば、１〜１０質量％である。 The electron microscope observation stain according to this embodiment is, for example, an aqueous ytterbium triacetate solution. The density | concentration of the ytterbium triacetate aqueous solution is not specifically limited, For example, it is 1-10 mass%.
本実施形態に係る電子顕微鏡観察用染色剤は、三酢酸イッテルビウムに加えて、さらに、三酢酸イッテルビウム以外の物質を含有していてもよい。 In addition to ytterbium triacetate, the stain for electron microscope observation according to the present embodiment may further contain a substance other than ytterbium triacetate.
本実施形態に係る電子顕微鏡観察用染色剤は、例えば、タンパク質などの生体高分子を含んで構成される生体試料、ウイルス、リポソーム等の微粒子、炭素、酸素、窒素、水素などの軽元素を含んで構成される試料等を染色することができる。 The staining agent for electron microscope observation according to the present embodiment includes, for example, a biological sample including a biopolymer such as a protein, fine particles such as viruses and liposomes, and light elements such as carbon, oxygen, nitrogen, and hydrogen. It is possible to stain a sample composed of
１．２． 電子顕微鏡観察用試料の作製方法
次に、第１実施形態に係る電子顕微鏡観察用試料の作製方法について説明する。本実施形態に係る電子顕微鏡観察用試料の作製方法は、本実施形態に係る電子顕微鏡観察用試料の染色方法を含む。以下、本実施形態に係る電子顕微鏡観察用試料の作製方法の一例として、本実施形態に係る電子顕微鏡観察用試料の作製方法を、生体試料に適用した場合について説明する。
1.2. Next, a method for producing an electron microscope observation sample according to the first embodiment will be described. The method for producing an electron microscope observation sample according to the present embodiment includes the electron microscope observation sample staining method according to the present embodiment. Hereinafter, as an example of a method for producing an electron microscope observation sample according to the present embodiment, a case where the electron microscope observation sample preparation method according to the present embodiment is applied to a biological sample will be described.
まず、生体試料をエポキシ樹脂に包埋する。具体的には、まず、灌流固定または浸漬固定した生体試料を切り出す。そして、切り出された生体試料を、カコジル酸緩衝１〜４％パラホルムアルデヒドと１〜４％グルタールアルデヒドとの混合液に浸漬し、前固定する。なお、前固定は、カコジル酸緩衝１〜４％パラホルムアルデヒドだけで行ってもよいし、１〜４％グルタールアルデヒドだけで行ってもよい。次に、前固定された生体試料を、カコジル酸緩衝液で洗浄し、１〜２％四酸化オスミウムで後固定する。そして、後固定された生体試料を上昇エタノール系列で脱水した後、エポキシ樹脂に包埋する。このようにして、生体試料をエポキシ樹脂に包埋することができる。なお、生体試料を包埋するための材料はエポキシ樹脂に限定されず、例えば、メタクリル酸樹脂、ポリエステル樹脂、パラフィン等を用いてもよい。 First, a biological sample is embedded in an epoxy resin. Specifically, first, a biological sample fixed with perfusion or immersion is cut out. Then, the cut biological sample is immersed in a mixed solution of cacodylate buffered 1 to 4% paraformaldehyde and 1 to 4% glutaraldehyde and prefixed. In addition, pre-fixation may be performed only with cacodylate buffer 1 to 4% paraformaldehyde, or may be performed only with 1 to 4% glutaraldehyde. Next, the pre-fixed biological sample is washed with a cacodylate buffer and post-fixed with 1-2% osmium tetroxide. Then, the post-fixed biological sample is dehydrated with an ascending ethanol series and then embedded in an epoxy resin. In this way, the biological sample can be embedded in the epoxy resin. In addition, the material for embedding a biological sample is not limited to an epoxy resin, For example, you may use a methacrylic acid resin, a polyester resin, a paraffin, etc.
次に、エポキシ樹脂に包埋された生体試料を薄片化する。薄片化は、例えば、ミクロトーム（ウルトラミクロトーム）を用いて行われる。 Next, the biological sample embedded in the epoxy resin is sliced. Thinning is performed using, for example, a microtome (ultra microtome).
次に、薄片化された生体試料を染色する。染色は、本実施形態に係る電子顕微鏡観察用染色剤を薄片化された生体試料に接触させることにより行われる。例えば、染色は、三酢酸イッテルビウム水溶液に、薄片化された生体試料を浸漬させることにより行われる。ここで、三酢酸イッテルビウム水溶液の温度は、例えば、５℃以上５０℃以下である。また、浸漬時間は、例えば、１分以上１０時間以下である。その後、染色された生体試料を純水等で洗浄する。 Next, the sliced biological sample is stained. Staining is performed by bringing the electron microscope observation stain according to the present embodiment into contact with a thinned biological sample. For example, the staining is performed by immersing the sliced biological sample in an aqueous ytterbium triacetate solution. Here, the temperature of the ytterbium triacetate aqueous solution is, for example, 5 ° C. or more and 50 ° C. or less. Moreover, immersion time is 1 minute or more and 10 hours or less, for example. Thereafter, the stained biological sample is washed with pure water or the like.
以上の工程により、電子顕微鏡観察用試料を作製することができる。 Through the above steps, an electron microscope observation sample can be produced.
１．３． 実施例１
以下、実施例を挙げて本実施形態をさらに詳細に説明するが、本発明はこれによって制限されるものではない。
1.3. Example 1
EXAMPLES Hereinafter, although an Example is given and this embodiment is described in detail, this invention is not restrict | limited by this.
（１）試料作製
本実施例では、三酢酸イッテルビウムで染色された生体試料の（透過）電子顕微鏡観察用試料を作製した。生体試料としては、腎臓糸球体、肝臓、海馬、およびほうれん草の葉を用いた。具体的には、まず、灌流固定した生体試料（腎臓糸球体、肝臓、海馬、ほうれん草の葉）を切り出し、カコジル酸緩衝２％パラホルムアルデヒドと２％グルタールアルデヒドとの混合液に浸漬し、前固定した。次に、前固定された生体試料を、カコジル酸緩衝液で洗浄し、２％四酸化オスミウムで後固定した。そして、上昇エタノール系列で脱水し、エポキシ樹脂に包埋した。
(1) Sample preparation In this example, a (transmission) electron microscope observation sample of a biological sample stained with ytterbium triacetate was prepared. As biological samples, kidney glomeruli, liver, hippocampus, and spinach leaves were used. Specifically, first, a perfusion-fixed biological sample (kidney glomerulus, liver, hippocampus, spinach leaf) was cut out and immersed in a mixture of cacodylate buffered 2% paraformaldehyde and 2% glutaraldehyde. Fixed. Next, the pre-fixed biological sample was washed with a cacodylate buffer and post-fixed with 2% osmium tetroxide. And it dehydrated with the rising ethanol series, and was embedded in the epoxy resin.
次に、エポキシ樹脂に包埋された生体試料を薄片化した。薄片化は、ウルトラミクロトームを用いて行った。次に、薄片化された生体試料を、三酢酸イッテルビウム水溶液に室温で３０分間浸漬した。なお、三酢酸イッテルビウム水溶液は、三酢酸イッテルビウム四水和物（和光純薬工業株式会社製）を、蒸留水で溶解させることによって作製した。また、三酢酸イッテルビウム水溶液の濃度は、２質量％とした。その後、染色された生体試料を純水で洗浄した。このようにして、三酢酸イッテルビウムで染色された生体試料の電子顕微鏡観察用試料を作製した。 Next, the biological sample embedded in the epoxy resin was sliced. Thinning was performed using an ultramicrotome. Next, the sliced biological sample was immersed in an aqueous ytterbium triacetate solution at room temperature for 30 minutes. The aqueous ytterbium triacetate solution was prepared by dissolving ytterbium triacetate tetrahydrate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) with distilled water. Moreover, the density | concentration of the ytterbium triacetate aqueous solution was 2 mass%. Thereafter, the stained biological sample was washed with pure water. In this way, a sample for electron microscope observation of a biological sample stained with ytterbium triacetate was prepared.
なお、比較例として、酢酸ウラニル（２質量％）で染色された生体試料（腎臓糸球体、肝臓、海馬、ほうれん草の葉）の電子顕微鏡観察用試料を作製した。具体的には、三酢酸イッテルビウムにかえて酢酸ウラニルを用いて染色した点を除いて、上述した三酢酸イッテルビウムで染色した場合の試料作製工程と同様の工程でこれらの試料を作製した。 As a comparative example, an electron microscope observation sample of a biological sample (kidney glomerulus, liver, hippocampus, spinach leaf) stained with uranyl acetate (2% by mass) was prepared. Specifically, these samples were prepared in the same steps as the sample preparation step in the case of staining with ytterbium triacetate described above, except that it was stained with uranyl acetate instead of ytterbium triacetate.
（２）観察結果
このようにして作製された電子顕微鏡観察用試料を、透過電子顕微鏡で観察した。図１は、三酢酸イッテルビウムで染色された腎臓糸球体の透過電子顕微鏡像である。図２は、酢酸ウラニルで染色された腎臓糸球体の透過電子顕微鏡像である。
(2) Observation result The sample for electron microscope observation produced in this way was observed with the transmission electron microscope. FIG. 1 is a transmission electron microscope image of kidney glomeruli stained with ytterbium triacetate. FIG. 2 is a transmission electron microscope image of kidney glomeruli stained with uranyl acetate.
図１に示すように、三酢酸イッテルビウムで染色された腎臓糸球体の透過電子顕微鏡像では、核、蛸足細胞、内皮細胞、赤血球等が染色されていることが確認でき、これらが高いコントラストで鮮明に観察できた。また、図１に示す透過電子顕微鏡像では、図２に示す酢酸ウラニルで染色された腎臓糸球体の透過電子顕微鏡像と同程度の高いコントラストが得られた。このように、三酢酸イッテルビウムは、高い染色効果（電子染色効果）を有することがわかった。 As shown in FIG. 1, a transmission electron microscopic image of kidney glomeruli stained with ytterbium triacetate confirms that nuclei, podocytes, endothelial cells, erythrocytes, etc. are stained, and these have high contrast. It was clearly observable. Further, in the transmission electron microscope image shown in FIG. 1, the same high contrast as the transmission electron microscope image of the kidney glomerulus stained with uranyl acetate shown in FIG. 2 was obtained. Thus, it was found that ytterbium triacetate has a high staining effect (electronic staining effect).
図３は、三酢酸イッテルビウムで染色された肝臓の透過電子顕微鏡像である。図４は、酢酸ウラニルで染色された肝臓の透過電子顕微鏡像である。また、図５は、三酢酸イッテルビウムで染色された海馬の透過電子顕微鏡像である。図６は、酢酸ウラニルで染色された海馬の透過電子顕微鏡像である。また、図７は、三酢酸イッテルビウムで染色されたほうれん草の葉の透過電子顕微鏡像である。図８は、酢酸ウラニルで染色されたほうれん草の葉の透過電子顕微鏡像である。 FIG. 3 is a transmission electron microscopic image of the liver stained with ytterbium triacetate. FIG. 4 is a transmission electron microscopic image of the liver stained with uranyl acetate. FIG. 5 is a transmission electron microscope image of the hippocampus stained with ytterbium triacetate. FIG. 6 is a transmission electron microscope image of the hippocampus stained with uranyl acetate. FIG. 7 is a transmission electron microscope image of spinach leaves stained with ytterbium triacetate. FIG. 8 is a transmission electron microscope image of spinach leaves stained with uranyl acetate.
図１および図２に示す腎臓糸球体の場合と同様に、図３、図５、図７に示す三酢酸イッテルビウムで染色された生体試料（肝臓、海馬、ほうれん草の葉）の透過電子顕微鏡像では、図４、図６，図８に示す酢酸ウラニルで染色された生体試料の透過電子顕微鏡像と同等の高いコントラストが得られた。このように、三酢酸イッテルビウムは、高い染色効果（電子染色効果）を有することがわかった。 As in the case of the kidney glomerulus shown in FIGS. 1 and 2, transmission electron microscopic images of biological samples (liver, hippocampus, spinach leaves) stained with ytterbium triacetate shown in FIGS. A high contrast equivalent to the transmission electron microscope image of the biological sample stained with uranyl acetate shown in FIGS. 4, 6, and 8 was obtained. Thus, it was found that ytterbium triacetate has a high staining effect (electronic staining effect).
本実施形態に係る電子顕微鏡観察用染色剤によれば、三酢酸イッテルビウムを含有していることにより、高い染色効果を有することができる。さらに、三酢酸イッテルビウムは、合成等の必要がなく、例えば、水等に溶解させるだけで電子染色剤として用いることができる。したがって、簡便に電子染色を行うことができる。 According to the electron microscope observation stain according to the present embodiment, a high staining effect can be obtained by containing ytterbium triacetate. Furthermore, ytterbium triacetate does not require synthesis or the like, and can be used as an electron stain simply by dissolving it in water or the like, for example. Therefore, it is possible to easily perform electron staining.
本実施形態に係る電子顕微鏡観察用試料の染色方法によれば、上述したように、簡便に電子染色を行うことができ、かつ高い染色効果を有する本実施形態に係る電子顕微鏡観察用染色剤を用いて染色するため、試料を、簡便かつ良好に染色することができる。 According to the method for staining an electron microscope observation sample according to this embodiment, as described above, the electron microscope observation staining agent according to this embodiment can be easily dyed and has a high staining effect. Since it is used and dye | stained, a sample can be dye | stained simply and favorably.
２． 第２実施形態
２．１． 電子顕微鏡観察用試料の作製方法
次に、第２実施形態に係る電子顕微鏡観察用試料の作製方法について説明する。
2. Second Embodiment 2.1. Next, a method for producing an electron microscope observation sample according to the second embodiment will be described.
第２実施形態に係る電子顕微鏡観察用試料の作製方法は、上述した第１実施形態に係る電子顕微鏡観察用試料の作製工程に加えて、さらに、第１実施形態に係る電子顕微鏡観察用染色剤に接触した試料を、鉛化合物を含有する染色液に接触させる工程を含む。 The electron microscope observation sample preparation method according to the second embodiment includes the electron microscope observation stain according to the first embodiment in addition to the electron microscope observation sample preparation step according to the first embodiment described above. A step of contacting the sample in contact with a staining solution containing a lead compound.
第２実施形態に係る電子顕微鏡観察用試料の作製方法は、例えば、三酢酸イッテルビウムで染色された試料を、鉛化合物を含有する染色液に浸漬する工程を含む。すなわち、第２実施形態に係る電子顕微鏡観察用試料の作製方法では、試料を、三酢酸イッテルビウムと鉛化合物を含有する染色液とによって二重染色する。 The method for producing an electron microscope observation sample according to the second embodiment includes, for example, a step of immersing a sample dyed with ytterbium triacetate in a staining solution containing a lead compound. That is, in the method for producing an electron microscope observation sample according to the second embodiment, the sample is double-stained with a staining liquid containing ytterbium triacetate and a lead compound.
鉛化合物としては、例えば、クエン酸鉛が挙げられる。このクエン酸鉛を含有する染色液（クエン酸鉛染色液）としては、例えば、レイノルド（Ｒｅｙｎｏｌｄｓ）法で処方されたものが挙げられる。クエン酸鉛染色液の温度は、例えば、５℃以上５０℃以下である。また、浸漬時間は、例えば、１分以上１０時間以下程度である。クエン酸鉛染色液に浸漬された試料は、純水等によって洗浄される。また、鉛化合物として、例えば、硝酸鉛を用いてもよい。以上の工程により、電子顕微鏡観察用試料を作製することができる。 Examples of the lead compound include lead citrate. Examples of the staining solution containing lead citrate (lead citrate staining solution) include those formulated by the Reynolds method. The temperature of the lead citrate staining solution is, for example, 5 ° C. or more and 50 ° C. or less. Moreover, immersion time is about 1 minute or more and 10 hours or less, for example. The sample immersed in the lead citrate staining solution is washed with pure water or the like. Further, as the lead compound, for example, lead nitrate may be used. Through the above steps, an electron microscope observation sample can be produced.
２．２． 実施例２
以下、実施例を挙げて本実施形態をさらに詳細に説明するが、本発明はこれによって制限されるものではない。
2.2. Example 2
EXAMPLES Hereinafter, although an Example is given and this embodiment is described in detail, this invention is not restrict | limited by this.
（１）試料作製
本実施例では、三酢酸イッテルビウムとクエン酸鉛染色液とで二重染色された生体試料の電子顕微鏡観察用試料を作製した。生体試料としては、腎臓糸球体、肝臓、海馬、およびほうれん草の葉を用いた。具体的には、上述した実施例１と同様の工程で、生体試料を三酢酸イッテルビウムで染色し、この三酢酸イッテルビウムで染色された生体試料をレイノルドのクエン酸鉛染色液に室温で１０分間浸漬し、その後、純水で洗浄した。
(1) Sample preparation In this example, a sample for electron microscope observation of a biological sample double-stained with ytterbium triacetate and a lead citrate staining solution was prepared. As biological samples, kidney glomeruli, liver, hippocampus, and spinach leaves were used. Specifically, the biological sample was stained with ytterbium triacetate in the same process as in Example 1 described above, and the biological sample stained with ytterbium triacetate was immersed in Reynold's lead citrate staining solution at room temperature for 10 minutes. And then washed with pure water.
また、比較例として、酢酸ウラニルとクエン酸鉛染色液とで二重染色された生体試料（腎臓糸球体、肝臓、海馬、およびほうれん草の葉）の電子顕微鏡観察用試料を作製した。具体的には、三酢酸イッテルビウムにかえて、酢酸ウラニルを用いる点を除いて、上述した三酢酸イッテルビウムとクエン酸鉛染色液とで二重染色された試料の試料作製工程と同様の工程でこれらの試料を作製した。 Further, as a comparative example, a sample for electron microscope observation of a biological sample (kidney glomerulus, liver, hippocampus, and spinach leaf) double-stained with uranyl acetate and lead citrate staining solution was prepared. Specifically, in place of ytterbium triacetate, except that uranyl acetate is used, these steps were performed in the same manner as the sample preparation step of the sample double-stained with ytterbium triacetate and lead citrate staining solution described above. A sample of was prepared.
（２）観察結果
このようにして作製された電子顕微鏡観察用試料を、透過電子顕微鏡で観察した。
(2) Observation result The sample for electron microscope observation produced in this way was observed with the transmission electron microscope.
図９は、三酢酸イッテルビウムとクエン酸鉛染色液とで二重染色された腎臓糸球体の透過電子顕微鏡像である。図１０は、酢酸ウラニルとクエン酸鉛染色液とで二重染色された腎臓糸球体の透過電子顕微鏡像である。図９に示すように、三酢酸イッテルビウムとクエン酸鉛染色液とで二重染色された腎臓糸球体の透過電子顕微鏡像では、核、蛸足細胞、内皮細胞、赤血球等が染色されていることが確認でき、これらが高いコントラストで鮮明に観察できた。また、図９に示す透過電子顕微鏡像では、図１０に示す酢酸ウラニルとクエン酸鉛染色液とで二重染色された腎臓糸球体の透過電子顕微鏡像と同程度の高いコントラストが得られた。また、図９に示す透過電子顕微鏡像では、図１に示す三酢酸イッテルビウムのみで染色された腎臓糸球体の透過電子顕微鏡像と比べて、より高いコントラストが得られた。このように、三酢酸イッテルビウムとクエン酸鉛染色液とで二重染色された場合、三酢酸イッテルビウムのみで染色された場合と比べて、より染色効果を高めることができることがわかった。 FIG. 9 is a transmission electron microscope image of kidney glomeruli double-stained with ytterbium triacetate and lead citrate staining solution. FIG. 10 is a transmission electron microscope image of kidney glomeruli double-stained with uranyl acetate and lead citrate staining solution. As shown in FIG. 9, in the transmission electron microscopic image of the kidney glomeruli double-stained with ytterbium triacetate and lead citrate staining solution, nuclei, podocytes, endothelial cells, erythrocytes, etc. are stained. Were confirmed, and these could be observed clearly with high contrast. Further, in the transmission electron microscope image shown in FIG. 9, the same high contrast as that of the transmission electron microscope image of the kidney glomeruli double-stained with uranyl acetate and lead citrate staining solution shown in FIG. 10 was obtained. Further, in the transmission electron microscope image shown in FIG. 9, a higher contrast was obtained as compared with the transmission electron microscope image of the kidney glomerulus stained only with ytterbium triacetate shown in FIG. Thus, it was found that the dyeing effect can be further enhanced when double-stained with ytterbium triacetate and lead citrate staining solution as compared with the case of dyeing with ytterbium triacetate alone.
図１１は、三酢酸イッテルビウムとクエン酸鉛染色液とで二重染色された肝臓の透過電子顕微鏡像である。図１２は、酢酸ウラニルとクエン酸鉛染色液とで二重染色された肝臓の透過電子顕微鏡像である。また、図１３は、三酢酸イッテルビウムとクエン酸鉛染色液とで二重染色された海馬の透過電子顕微鏡像である。図１４は、酢酸ウラニルとクエン酸鉛染色液とで二重染色された海馬の透過電子顕微鏡像である。また、図１５は、三酢酸イッテルビウムとクエン酸鉛染色液とで二重染色されたほうれん草の葉の透過電子顕微鏡像である。図１６は、酢酸ウラニルとクエン酸鉛染色液とで二重染色されたほうれん草の葉の透過電子顕微鏡像である。 FIG. 11 is a transmission electron microscope image of the liver double-stained with ytterbium triacetate and lead citrate staining solution. FIG. 12 is a transmission electron microscope image of the liver double-stained with uranyl acetate and lead citrate staining solution. FIG. 13 is a transmission electron microscope image of the hippocampus double-stained with ytterbium triacetate and lead citrate staining solution. FIG. 14 is a transmission electron microscope image of the hippocampus double-stained with uranyl acetate and lead citrate staining solution. FIG. 15 is a transmission electron microscope image of spinach leaves double-stained with ytterbium triacetate and lead citrate staining solution. FIG. 16 is a transmission electron microscope image of spinach leaves double-stained with uranyl acetate and lead citrate staining solution.
図９および図１０に示す腎臓糸球体の場合と同様に、図１１、図１３、図１５に示す三酢酸イッテルビウムとクエン酸鉛染色液とで二重染色された生体試料（肝臓、海馬、ほうれん草の葉）の透過電子顕微鏡像では、図１２、図１４，図１６に示す酢酸ウラニルとクエン酸鉛染色液とで二重染色された生体試料の透過電子顕微鏡像と同等の高いコントラストが得られた。また、図１１、図１３、図１５に示す透過電子顕微鏡像では、図３、図５、図７に示す三酢酸イッテルビウムのみで染色された生体試料（肝臓、海馬、ほうれん草の葉）の透過電子顕微鏡像と比べて、より高いコントラストが得られた。このように、三酢酸イッテルビウムとクエン酸鉛染色液とを用いた二重染色は、高い染色効果（電子染色効果）を有することがわかった。 As in the case of the kidney glomerulus shown in FIGS. 9 and 10, a biological sample (liver, hippocampus, spinach) double-stained with ytterbium triacetate and lead citrate staining solution shown in FIGS. The transmission electron microscopic image of (leaf) shows a high contrast equivalent to the transmission electron microscopic image of the biological sample double-stained with uranyl acetate and lead citrate staining solution shown in FIGS. It was. In addition, in the transmission electron microscope images shown in FIGS. 11, 13, and 15, the transmission electrons of biological samples (liver, hippocampus, spinach leaves) stained only with ytterbium triacetate shown in FIGS. A higher contrast was obtained compared to the microscopic image. Thus, it was found that double staining using ytterbium triacetate and lead citrate staining solution has a high staining effect (electronic staining effect).
本実施形態に係る電子顕微鏡観察用試料の作製方法によれば、三酢酸イッテルビウムを含有する電子顕微鏡観察用染色剤と鉛染色液とで二重染色を行うことにより、三酢酸イッテルビウムを含有する電子顕微鏡観察用染色剤のみで染色を行った場合と比較して、より染色効果を高めることができる。 According to the method for preparing an electron microscope observation sample according to the present embodiment, an electron containing ytterbium triacetate is obtained by performing double staining with an electron microscope observation stain containing ytterbium triacetate and a lead staining solution. The staining effect can be further enhanced as compared with the case where staining is performed only with a staining agent for microscopic observation.
３． 第３実施形態
３．１． 電子顕微鏡観察用試料の作製方法
次に、第３実施形態に係る電子顕微鏡観察用試料の作製方法について説明する。
3. Third Embodiment 3.1. Next, a method for producing an electron microscope observation sample according to the third embodiment will be described.
第３実施形態に係る電子顕微鏡観察用試料の作製方法では、本発明に係る電子顕微鏡観察用染色剤を、ネガティブ染色法に適用した。 In the method for producing an electron microscope observation sample according to the third embodiment, the electron microscope observation staining agent according to the present invention is applied to the negative staining method.
第３実施形態に係る電子顕微鏡観察用試料の作製方法は、本発明に係る電子顕微鏡観察用染色剤にウイルスやタンパク質等の試料を接触させることにより行う。具体的には、例えば、カーボン支持膜等を備えたグリッド上に、ウイルス等を含む試料を載せ、本実施形態に係る電子顕微鏡観察用染色剤（三酢酸イッテルビウム水溶液）を加える。これにより、染色剤の一部が、グリッドの支持膜と試料との間、試料の凹凸の凹部等に残留し、透過電子顕微鏡像にコントラストがつく（ネガティブ染色法）。 The method for preparing an electron microscope observation sample according to the third embodiment is performed by bringing a sample such as a virus or protein into contact with the electron microscope observation stain according to the present invention. Specifically, for example, a sample containing a virus or the like is placed on a grid provided with a carbon support film or the like, and the staining for electron microscope observation (ytterbium triacetate aqueous solution) according to the present embodiment is added. As a result, a part of the staining agent remains between the grid support film and the sample, in the concave and convex portions of the sample, and the transmission electron microscope image is contrasted (negative staining method).
３．２． 実施例３
以下、実施例を挙げて本実施形態をさらに詳細に説明するが、本発明はこれによって制限されるものではない。
3.2. Example 3
EXAMPLES Hereinafter, although an Example is given and this embodiment is described in detail, this invention is not restrict | limited by this.
（１）試料作製
本実施例では、三酢酸イッテルビウムで染色された、バクテリオファージの一種であるＴ４ファージの（透過）電子顕微鏡観察用試料を作製した。具体的には、支持膜を備えたグリッド上にＴ４ファージを吸着させ、三酢酸イッテルビウム水溶液を加える。そして、余分な三酢酸イッテルビウム水溶液を濾紙で吸い取り乾燥させた。なお、三酢酸イッテルビウム水溶液は、三酢酸イッテルビウム四水和物（和光純薬工業株式会社製）を、蒸留水で溶解させることによって作製した。また、三酢酸イッテルビウム水溶液の濃度は、２質量％とした。
(1) Sample preparation In this example, a sample for (transmission) electron microscope observation of T4 phage, which is a kind of bacteriophage, was stained with ytterbium triacetate. Specifically, T4 phage is adsorbed on a grid provided with a support film, and an ytterbium triacetate aqueous solution is added. Then, excess ytterbium triacetate aqueous solution was sucked with a filter paper and dried. The aqueous ytterbium triacetate solution was prepared by dissolving ytterbium triacetate tetrahydrate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) with distilled water. Moreover, the density | concentration of the ytterbium triacetate aqueous solution was 2 mass%.
また、同様の工程で、三酢酸イッテルビウムで染色された、線維状タンパク質であるβ−アミロイドの（透過）電子顕微鏡観察用試料を作製した。 In the same process, a sample for (transmission) electron microscope observation of β-amyloid, which is a fibrous protein, stained with ytterbium triacetate was prepared.
なお、比較例として、酢酸ウラニル（２質量％）で染色された、Ｔ４ファージおよびβ−アミロイドの電子顕微鏡観察用試料を作製した。具体的には、三酢酸イッテルビウムにかえて酢酸ウラニルを用いて染色した点を除いて、上述した三酢酸イッテルビウムで染色した場合の試料作製工程と同様の工程でこれらの試料を作製した。 As a comparative example, an electron microscope observation sample of T4 phage and β-amyloid stained with uranyl acetate (2% by mass) was prepared. Specifically, these samples were prepared in the same steps as the sample preparation step in the case of staining with ytterbium triacetate described above, except that it was stained with uranyl acetate instead of ytterbium triacetate.
（２）観察結果
このようにして作製された電子顕微鏡観察用試料を、透過電子顕微鏡で観察した。図１７は、三酢酸イッテルビウムで染色（ネガティブ染色）されたＴ４ファージの透過電子顕微鏡像である。図１８は、酢酸ウラニルで染色（ネガティブ染色）されたＴ４ファージの透過電子顕微鏡像である。
(2) Observation result The sample for electron microscope observation produced in this way was observed with the transmission electron microscope. FIG. 17 is a transmission electron microscope image of T4 phage stained with ytterbium triacetate (negative staining). FIG. 18 is a transmission electron microscopic image of T4 phage stained with uranyl acetate (negative staining).
図１７に示すように、三酢酸イッテルビウムで染色されたＴ４ファージの透過電子顕微鏡像では、Ｔ４ファージが高いコントラストで鮮明に観察できた。また、図１７に示す透過電子顕微鏡像では、図１８に示す酢酸ウラニルで染色（ネガティブ染色）されたＴ４ファージの透過電子顕微鏡像と同程度の高いコントラストが得られた。 As shown in FIG. 17, in the transmission electron microscope image of T4 phage stained with ytterbium triacetate, T4 phage could be observed clearly with high contrast. Further, in the transmission electron microscope image shown in FIG. 17, a high contrast comparable to that of the transmission electron microscope image of T4 phage stained (negative staining) shown in FIG. 18 was obtained.
また、図１９は、三酢酸イッテルビウムで染色（ネガティブ染色）されたβ−アミロイドの透過電子顕微鏡像である。図２０は、酢酸ウラニルで染色（ネガティブ染色）されたβ−アミロイドの透過電子顕微鏡像である。 FIG. 19 is a transmission electron microscope image of β-amyloid stained with ytterbium triacetate (negative staining). FIG. 20 is a transmission electron microscopic image of β-amyloid stained with uranyl acetate (negative staining).
図１７および図１８に示すＴ４ファージの場合と同様に、図１９に示す三酢酸イッテルビウムで染色されたβ−アミロイドの透過電子顕微鏡像では、図２０に示す酢酸ウラニルで染色されたβ−アミロイドの透過電子顕微鏡像と同等の高いコントラストが得られた。 As in the case of T4 phage shown in FIGS. 17 and 18, the transmission electron microscopic image of β-amyloid stained with ytterbium triacetate shown in FIG. 19 shows the β-amyloid stained with uranyl acetate shown in FIG. A high contrast equivalent to the transmission electron microscope image was obtained.
本実施形態に係る電子顕微鏡観察用染色剤によれば、三酢酸イッテルビウムを含有していることにより、ネガティブ染色法においても、高い染色効果を有することができる。 According to the electron microscope observation staining agent according to the present embodiment, the inclusion of ytterbium triacetate can have a high staining effect even in the negative staining method.
なお、本発明は、実施の形態で説明した構成と実質的に同一の構成（例えば、機能、方法および結果が同一の構成、あるいは目的及び効果が同一の構成）を含む。また、本発明は、実施の形態で説明した構成の本質的でない部分を置き換えた構成を含む。また、本発明は、実施の形態で説明した構成と同一の作用効果を奏する構成又は同一の目的を達成することができる構成を含む。また、本発明は、実施の形態で説明した構成に公知技術を付加した構成を含む。 Note that the present invention includes substantially the same configuration (for example, a configuration having the same function, method, and result, or a configuration having the same purpose and effect) as the configuration described in the embodiment. In addition, the invention includes a configuration in which a non-essential part of the configuration described in the embodiment is replaced. In addition, the present invention includes a configuration that exhibits the same operational effects as the configuration described in the embodiment or a configuration that can achieve the same object. Further, the invention includes a configuration in which a known technique is added to the configuration described in the embodiment.
Claims (3)
前記電子顕微鏡観察用染色剤に接触した試料を、鉛化合物を含有する染色液に接触させる工程をさらに含む、電子顕微鏡観察用試料の染色方法。 In claim 2,
The dyeing | staining method of the sample for electron microscope observation which further includes the process of contacting the sample which contacted the said stain | dye for electron microscope observation with the dyeing | staining liquid containing a lead compound.
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