JP6071373B2 - New oil-degrading bacteria detection system from the environment - Google Patents
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Description
本発明は、石油分解菌検出用プライマーセット、及び該プライマーセットを含むPCR(ポリメラーゼ連鎖反応)キットに関する。更には、本発明は、上記プライマーセットを用いた土壌中の石油分解菌の定量方法、並びに該定量方法を利用した土壌中の石油分解菌の挙動解析方法及び土壌浄化方法に関する。 The present invention relates to a primer set for detecting petroleum-degrading bacteria, and a PCR (polymerase chain reaction) kit including the primer set. Furthermore, the present invention relates to a method for quantifying petroleum-degrading bacteria in soil using the primer set, a method for analyzing the behavior of petroleum-degrading bacteria in soil using the quantification method, and a soil purification method.
石油を運搬する際の事故や工場からの漏洩などに起因する「石油系炭化水素による土壌汚染」が従来から問題となっており、法整備や漏洩対策が進められている。石油系炭化水素汚染土壌対策の法律としては、まずアメリカが1980年に「スーパーファンド法」を制定した。この法律では土壌汚染に関わった当事者全てに浄化費用等の負担を求め、土壌中の全石油系炭化水素(TPH)濃度を1,000 mg/kg以下にすることが義務付けられている。 “Soil pollution by petroleum hydrocarbons” caused by accidents when transporting oil, leaks from factories, etc. has been a problem in the past, and legislation and countermeasures against leaks are being promoted. The US first enacted the “Superfund Law” in 1980 as a law for measures against soil contaminated with petroleum hydrocarbons. This law requires all parties involved in soil contamination to pay for purification costs, etc., and the total petroleum hydrocarbon (TPH) concentration in the soil must be less than 1,000 mg / kg.
日本では2002年に「土壌汚染対策法」が制定されたが、石油系炭化水素汚染への対策が十分に整っていないことを理由に石油を汚染物質の対象としていなかった。その後、2006年に「油汚染対策ガイドライン〜鉱油類を含む土壌に起因する油臭・油膜問題への土地所有者等による対応の考え方〜」が発表され、石油系炭化水素汚染土壌の浄化では「油臭の解消」と「土壌中の油分濃度の低減」が必要となった。さらに、2010年4月からは「土壌汚染対策法」の改正により汚染土壌の運搬が制限され、出来る限り原位置で汚染土壌を浄化することが求められるようになった。 In Japan, the “Soil Contamination Countermeasures Law” was enacted in 2002, but oil was not targeted for pollutants because of the lack of adequate countermeasures against petroleum hydrocarbon contamination. Later, in 2006, the “Oil Pollution Countermeasure Guidelines-Approaches to Land Owners' Response to Oil Odor / Oil Film Problems Caused by Soil Containing Mineral Oil” was announced. It was necessary to eliminate oil odor and reduce oil concentration in soil. Furthermore, since April 2010, the amendment of the “Soil Contamination Countermeasures Law” restricted the transportation of contaminated soil, and it became necessary to purify contaminated soil as much as possible.
現在、石油系炭化水素汚染土壌の浄化には主に重油を利用した焼却処理や加熱分解処理が行われている。これらの方法では、まず汚染土壌を掘り起こし、処理場まで運搬しなければならない。しかしながら、土壌汚染対策法の改正により汚染土壌の運搬が制限されることとなったため、本処理方法は適さない。また、焼却処理では汚染油分の10倍もの燃料が必要となり、石油価格によってコストが大きく変動するという課題がある。さらに、焼却後の土壌は微生物を含め有機物がなくなることから、土壌の再利用が難しい。 At present, incineration and thermal decomposition treatment using heavy oil is mainly performed for purification of petroleum hydrocarbon-contaminated soil. In these methods, the contaminated soil must first be dug up and transported to a treatment plant. However, this treatment method is not suitable because the amendment of the Soil Contamination Countermeasures Law restricts the transportation of contaminated soil. Incineration requires 10 times as much fuel as polluted oil, and there is a problem that the cost varies greatly depending on the oil price. Furthermore, since the soil after incineration is free of organic matter including microorganisms, it is difficult to reuse the soil.
そこで近年、微生物機能により汚染を浄化するバイオレメディエーション(bioremediation)の研究が進んでいる。バイオレメディエーションは焼却処理や洗浄処理に比べて省資源であり、土壌が再利用できる利点がある。さらに、原位置で土壌を浄化出来ることから、今後の土壌汚染対策法の改正で更なる普及が見込まれる。しかし、バイオレメディエーションは従来の方法と比較し、浄化に時間がかかるなどの欠点がある。 Therefore, in recent years, research on bioremediation that purifies contamination by microbial function is in progress. Bioremediation is more resource-saving than incineration and cleaning, and has the advantage that soil can be reused. Furthermore, since the soil can be purified in situ, further spread is expected in future revisions to the Soil Contamination Countermeasures Law. However, bioremediation has drawbacks such as longer time for purification than conventional methods.
バイオレメディエーションには、微生物の栄養分を投与して土着の微生物を活性化するバイオスティミュレーション(biostimulation)と、汚染物質の分解能を有する微生物を外部から投入するバイオオーグメンテーション(bioaugmentation)がある。 Bioremediation includes biostimulation in which microorganism nutrients are administered to activate indigenous microorganisms, and bioaugmentation in which microorganisms having a resolution of pollutants are introduced from the outside.
バイオスティミュレーションでは、栄養塩を投与することで土壌中の石油分解菌を増加させ、油分分解が促進される。しかし、微生物の石油系炭化水素分解活性の維持が難しく、処理時間の短縮に課題が残る。バイオオーグメンテーションでは、外部から栄養塩と石油分解菌を投与することで、土壌に残留しやすい石油成分である長鎖直鎖状アルカン、芳香族、長鎖環状アルカンなどを分解出来る。しかし、投与する石油分解菌の安全性や有害な中間生成物の有無などを確認する必要があるため、バイオオーグメンテーションの普及に向けてはさまざまな課題が残っている。 In biostimulation, administration of nutrients increases petroleum degrading bacteria in the soil and promotes oil breakdown. However, it is difficult to maintain the petroleum hydrocarbon decomposition activity of microorganisms, and there remains a problem in shortening the processing time. In bioaugmentation, long-chain linear alkanes, aromatic, long-chain cyclic alkanes and the like, which are petroleum components that are likely to remain in the soil, can be decomposed by administering nutrient salts and petroleum-degrading bacteria from the outside. However, since it is necessary to confirm the safety of the oil-degrading bacteria to be administered and the presence or absence of harmful intermediate products, various problems remain for the spread of bioaugmentation.
本発明者らは、これまでに石油汚染土壌のバイオレメディエーションの効率化のために、難分解性の炭化水素を分解できる石油分解菌の単離を行った(特許文献１)。また、石油分解菌の挙動を把握するための、ロドコッカス属又はゴルドニア属に属する石油分解菌を特異的に検出可能にするプライマーセットについても報告している(特許文献２)。さらに、土壌中の栄養成分(Total-C・Total-N・Total-P)の重量とその比を特定の範囲に調整することにより土壌微生物数を増加・維持し、油分分解を促進できることを報告している(特許文献３)。 In order to improve the efficiency of bioremediation of petroleum-contaminated soil, the present inventors have isolated petroleum-degrading bacteria capable of degrading persistent hydrocarbons (Patent Document 1). In addition, a primer set that can specifically detect petroleum-decomposing bacteria belonging to the genus Rhodococcus or Gordonia for grasping the behavior of petroleum-degrading bacteria has also been reported (Patent Document 2). Furthermore, it has been reported that by adjusting the weight and ratio of nutrient components (Total-C, Total-N, Total-P) in the soil to a specific range, the number of soil microorganisms can be increased and maintained, and oil decomposition can be promoted. (Patent Document 3).
石油分解菌は炭化水素成分を代謝するが、その酸化にはアルカンヒドロキシラーゼ遺伝子(alkB遺伝子)が関与することが知られている。これまでに様々な細菌からalkB遺伝子が単離されてきた。これらalkB遺伝子を解析した結果、Hist-1、Hist-2、Hist-3及びHYGモチーフと呼ばれる保存された領域を有することが明らかとなっている(図４)。今までHist-1及びHist-3保存領域を利用した石油分解菌検出プライマーが設計され、細菌のalkB遺伝子の有無を調べることが可能となっている(非特許文献１)。 Petroleum-decomposing bacteria metabolize hydrocarbon components, and it is known that the alkane hydroxylase gene (alkB gene) is involved in the oxidation. So far, the alkB gene has been isolated from various bacteria. As a result of analyzing these alkB genes, it has been revealed that they have conserved regions called Hist-1, Hist-2, Hist-3 and HYG motifs (FIG. 4). Up to now, petroleum-degrading bacteria detection primers using Hist-1 and Hist-3 conserved regions have been designed, and it is possible to examine the presence or absence of bacterial alkB gene (Non-patent Document 1).
前述するバイオスティミュレーション及びバイオオーグメンテーションは共に石油汚染浄化の効率が悪いという問題がある。そこで、土壌中の石油分解菌数をモニタリングすることができれば石油分解菌数を制御することが可能となるので、石油汚染浄化を効率化することができると考えられる。しかしながら、汚染土壌中の石油分解菌数を高感度で定量できる方法は知られていない。 Both the biostimulation and bioaugmentation described above have a problem that the efficiency of oil pollution purification is poor. Therefore, if the number of petroleum-decomposing bacteria in the soil can be monitored, it becomes possible to control the number of petroleum-degrading bacteria, so that it is considered possible to improve the efficiency of oil pollution purification. However, there is no known method for quantifying the number of petroleum-degrading bacteria in contaminated soil with high sensitivity.
特許文献２に記載のプライマーセットは、特定の石油分解菌を検出するためのものであって石油分解菌全体を定量するものではない。非特許文献１に記載のプライマーは、検出感度が低い上に、増幅領域が長すぎるため、増幅効率の観点から見れば、リアルタイムPCRに適用するには不向きである。
The primer set described in
そこで、本発明は、石油分解菌を特異的に高感度で定量することができる、石油分解菌検出用プライマーセット、及び該プライマーセットを含むPCRキットを提供することを目的とする。更には、本発明は、上記プライマーセットを用いた土壌中の石油分解菌の定量方法、並びに該定量方法を利用した土壌中の石油分解菌の挙動解析方法及び土壌浄化方法を提供することを目的とする。 Accordingly, an object of the present invention is to provide a primer set for detecting petroleum-degrading bacteria and a PCR kit including the primer set that can specifically quantify petroleum-degrading bacteria with high sensitivity. Furthermore, the present invention aims to provide a method for quantifying petroleum-degrading bacteria in soil using the primer set, a method for analyzing the behavior of petroleum-degrading bacteria in soil, and a soil purification method using the quantification method. And
本発明者らは、配列番号１及び２に記載される塩基配列からなるDNAを縮重プライマーとして使用しリアルタイムPCRを行うことによって、上記目的を達成することができるという知見を得た。 The present inventors have found that the above object can be achieved by performing real-time PCR using DNA consisting of the nucleotide sequences described in SEQ ID NOS: 1 and 2 as degenerate primers.
本発明は、これら知見に基づき、更に検討を重ねて完成されたものであり、次の石油分解菌検出用プライマーセット、PCRキット、土壌中の石油分解菌の定量方法、土壌中の石油分解菌の挙動解析方法、及び土壌浄化方法を提供するものである。 The present invention has been completed based on these findings, and has been completed. The following primer set for detecting petroleum-degrading bacteria, PCR kit, method for quantifying petroleum-degrading bacteria in soil, petroleum-degrading bacteria in soil The behavioral analysis method and soil purification method are provided.
項１． (a) 配列番号１に記載される塩基配列中の連続する12塩基以上のDNA、又は配列番号１に記載される塩基配列を含む最大25塩基のDNAからなる縮重プライマー、及び
(b) 配列番号２に記載される塩基配列中の連続する12塩基以上のDNA、又は配列番号２に記載される塩基配列を含む最大25塩基のDNAからなる縮重プライマー
を含む石油分解菌検出用プライマーセット。
項２．項１に記載のプライマーセットを含む石油分解菌検出用PCRキット。
項３．項１に記載のプライマーセットを含む石油分解菌検出及び定量用リアルタイムPCRキット。
項４．i) 対象土壌に含まれるDNAを抽出及び精製する工程と、
ii) このDNAを鋳型として、請求項１に記載のプライマーセットを用いてPCRを行い、増幅されたDNAを検出する工程と、
iii) 検出した値を用いて、石油分解菌数を算出する工程
を含むことを特徴とする土壌中の石油分解菌の定量方法。
項５．項４に記載の定量方法により得られた値を用いて、土壌中の石油分解菌数の経時変化を解析する工程を含むことを特徴とする土壌中の石油分解菌の挙動解析方法。
項６．項４に記載の定量方法を行って、得られた石油分解菌数が一定値以下である場合に、栄養物質及び／又は石油分解菌を投入する工程を含むことを特徴とする土壌浄化方法。
項７．項４に記載の定量方法を行い、得られた栄養物質中の石油分解菌数に基づいて、投入する栄養物質の種類及び／又は量を決定する工程を更に含むことを特徴とする、項６に記載の方法。
(b) Petroleum-degrading bacteria detection comprising degenerate primers consisting of DNA of 12 or more consecutive bases in the base sequence described in SEQ ID NO: 2 or DNA of up to 25 bases including the base sequence described in SEQ ID NO: 2 Primer set.
ii) using this DNA as a template, performing PCR using the primer set according to
iii) A method for quantifying petroleum-degrading bacteria in soil, comprising a step of calculating the number of petroleum-degrading bacteria using the detected value.
Item 7.
本発明のプライマーセットを用いた石油分解菌の検出方法によれば、石油分解菌を特異的に高感度で検出及び定量することが可能となる。また、本発明によれば、幅広い石油分解菌を検出することが可能である。本発明により、バイオレメディエーション中の石油分解菌の挙動を正確に把握することが可能となり、石油分解菌の追加投与のタイミングや処理内容を適切に決定することができる。これにより、バイオレメディエーションの効率を高めることができる。 According to the method for detecting petroleum degrading bacteria using the primer set of the present invention, it becomes possible to detect and quantify petroleum degrading bacteria with high sensitivity specifically. Moreover, according to the present invention, it is possible to detect a wide range of petroleum degrading bacteria. According to the present invention, it is possible to accurately grasp the behavior of petroleum degrading bacteria during bioremediation, and it is possible to appropriately determine the timing and processing content of additional administration of petroleum degrading bacteria. Thereby, the efficiency of bioremediation can be increased.
以下、本発明について詳細に説明する。 Hereinafter, the present invention will be described in detail.
１．プライマーセット
本発明の石油分解菌検出用プライマーセットは、以下の縮重プライマーを含むことを特徴とする：
(a) 配列番号１に記載される塩基配列中の連続する12塩基以上のDNA、又は配列番号１に記載される塩基配列を含む最大25塩基のDNAからなる縮重プライマー、及び
(b) 配列番号２に記載される塩基配列中の連続する12塩基以上のDNA、又は配列番号２に記載される塩基配列を含む最大25塩基のDNAからなる縮重プライマー。
配列番号１：5'-AACTAYMTCGARCAYTAYGG-3' (alkB-F1)
配列番号２：5'-TGRTCKSWRTGNCGYTGVARGTG-3' (alkB-R2)
1. Primer Set The primer set for detecting petroleum degrading bacteria of the present invention is characterized by comprising the following degenerate primers:
(a) a degenerate primer consisting of a DNA having 12 or more consecutive nucleotides in the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1, or a DNA having a maximum of 25 nucleotides containing the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1; and
(b) A degenerate primer comprising a DNA having 12 or more consecutive bases in the base sequence described in SEQ ID NO: 2 or a DNA having a maximum of 25 bases including the base sequence described in SEQ ID NO: 2.
Sequence number 1: 5'-AACTAYMTCGARCAYTAYGG-3 '(alkB-F1)
Sequence number 2: 5'-TGRTCKSWRTGNCGYTGVARGTG-3 '(alkB-R2)
配列番号１及び２において、Yはチミン又はシトシンを、Mはアデニン又はシトシンを、Rはグアニン又はアデニンを、Vはアデニン、グアニン又はシトシンを、Nはアデニン、グアニン、シトシン又はチミンを表す。 In SEQ ID NOs: 1 and 2, Y represents thymine or cytosine, M represents adenine or cytosine, R represents guanine or adenine, V represents adenine, guanine or cytosine, and N represents adenine, guanine, cytosine or thymine.
本発明において縮重プライマーとは、配列中に複数の塩基を取り得る箇所(M、N、R、V及びY)を含む塩基配列において、取り得る全ての塩基配列(Yはチミン又はシトシンを、Mはアデニン又はシトシンを、Rはグアニン又はアデニンを、Vはアデニン、グアニン又はシトシンを、Nはアデニン、グアニン、シトシン又はチミン)の組み合わせを含むプライマーのことを意味する。 In the present invention, the degenerate primer refers to all possible base sequences (Y is thymine or cytosine) in a base sequence including a portion (M, N, R, V and Y) that can take a plurality of bases in the sequence. M means adenine or cytosine, R means guanine or adenine, V means adenine, guanine or cytosine, and N means a primer containing a combination of adenine, guanine, cytosine or thymine).
(a)の縮重プライマーは、好ましくは配列番号１に記載される塩基配列を含む最大25塩基のDNAからなり、より好ましくは配列番号１に記載される塩基配列を3’末端側に含む最大25塩基のDNAからなる。 The degenerate primer of (a) is preferably composed of DNA of a maximum of 25 bases including the base sequence described in SEQ ID NO: 1, more preferably a maximum including the base sequence described in SEQ ID NO: 1 on the 3 ′ end side. Consists of 25 base DNA.
(b)の縮重プライマーは、好ましくは配列番号２に記載される塩基配列を含む最大25塩基のDNAからなり、より好ましくは配列番号２に記載される塩基配列を3’末端側に含む最大25塩基のDNAからなる。 The degenerate primer (b) is preferably composed of DNA having a maximum of 25 bases including the base sequence described in SEQ ID NO: 2, more preferably a maximum including the base sequence described in SEQ ID NO: 2 on the 3 ′ end side. Consists of 25 base DNA.
各プライマーは、公知のDNA合成装置等を用いて化学的に合成することができる。また、当該技術分野においてよく知られる他の方法を用いて合成することもできる。 Each primer can be chemically synthesized using a known DNA synthesizer or the like. It can also be synthesized using other methods well known in the art.
本発明のプライマーセットを所定のPCR条件に供することにより、特定の石油分解菌を特異的に増幅することができる。 By subjecting the primer set of the present invention to predetermined PCR conditions, specific petroleum-degrading bacteria can be specifically amplified.
PCRの条件は、適宜設定し、至適化することができるが、通常、95℃・3〜10分の加熱後、95℃・15〜30秒、60℃・30〜60秒の反応を30〜40サイクル程度行う。 PCR conditions can be set and optimized as appropriate, but after heating at 95 ° C for 3 to 10 minutes, a reaction at 95 ° C for 15 to 30 seconds, 60 ° C for 30 to 60 seconds is usually performed. Perform about 40 cycles.
本発明における石油分解菌とは、石油、特に石油に含まれる炭化水素を分解可能な細菌のことをいう。 The petroleum decomposing bacteria in the present invention refers to bacteria capable of decomposing petroleum, particularly hydrocarbons contained in petroleum.
本発明の対象となる石油分解菌は、検出可能であれば特に限定されないが、例えば、ゴルドニア属(Gordonia)、ロドコッカス属(Rhodococcus)、アシネトバクター属(Acinetobacter)、バチルス属(Bacillus)、シュードモナス属(Pseudomonas)、アクロモバクター属(Achromobacter)、アルカリゲネス属(Alcaligenes)、ミコバクテリウム属(Mycobacterium)、スフィンゴモナス属(Sphingomonas)、ラルストニア属(Ralstonia)等の細菌が例示される。 Petroleum-decomposing bacteria that are the subject of the present invention are not particularly limited as long as they can be detected.For example, Gordonia, Rhodococcus, Acinetobacter, Bacillus, Pseudomonas ( Examples include bacteria such as Pseudomonas, Achromobacter, Alcaligenes, Mycobacterium, Sphingomonas and Ralstonia.
２．PCRキット
本発明のPCRキットは、上記石油分解菌検出用プライマーセットを含むことを特徴とする。本発明のPCRキットは、より詳細には、石油分解菌検出用PCRキット、又は石油分解菌検出及び定量用リアルタイムPCRキットである。
2. PCR kit The PCR kit of the present invention is characterized by comprising the above-described primer set for detecting petroleum degrading bacteria. More specifically, the PCR kit of the present invention is a PCR kit for detecting petroleum-degrading bacteria or a real-time PCR kit for detecting and quantifying petroleum-degrading bacteria.
本発明の石油分解菌検出用PCRキットを用いることにより、石油分解菌を特異的に検出することができる。また、本発明の石油分解菌検出用及び定量用リアルタイムPCRキットを用いることにより、石油分解菌を特異的に検出及び定量することができる。 By using the PCR kit for detecting petroleum-degrading bacteria of the present invention, petroleum-degrading bacteria can be specifically detected. In addition, by using the real-time PCR kit for detecting and quantifying petroleum-degrading bacteria of the present invention, it is possible to specifically detect and quantify petroleum-degrading bacteria.
本発明のキットには、上記プライマーセット以外に、増幅や検出などに必要となる公知の手段を含めることもできる。例えば、PCR用DNAポリメラーゼ、PCR用バッファー、dNTP、SYBR Green I、TaqMan(登録商標)プローブなどを含むことができる。 In addition to the above primer set, the kit of the present invention can also contain known means necessary for amplification and detection. For example, a DNA polymerase for PCR, a buffer for PCR, dNTP, SYBR Green I, a TaqMan (registered trademark) probe, and the like can be included.
３．石油分解菌数の定量方法
本発明の土壌中の石油分解菌の定量方法は、以下の工程を含むことを特徴とする：
i) 対象土壌に含まれるDNAを抽出及び精製する工程と、
ii) このDNAを鋳型として、上記プライマーセットを用いてPCRを行い、増幅されたDNAを検出する工程と、
iii) 検出した値を用いて、石油分解菌数を算出する工程。
3. Method for Quantifying Petroleum Decomposing Bacteria The method for quantifying petroleum decomposing bacteria in soil according to the present invention comprises the following steps:
i) extracting and purifying DNA contained in the target soil;
ii) using this DNA as a template, performing PCR using the above primer set, and detecting the amplified DNA;
iii) A step of calculating the number of petroleum-degrading bacteria using the detected value.
本発明のプライマーセットを用いることにより、対象土壌試料における幅広い石油分解菌を定量することができる。本発明の定量方法は、リアルタイムPCRを利用したものである。 By using the primer set of the present invention, a wide range of petroleum degrading bacteria in the target soil sample can be quantified. The quantitative method of the present invention utilizes real-time PCR.
工程i)の土壌からDNAを抽出する方法は、公知の方法に従って行うことができる。例えば、クロロホルム溶液による抽出を用いることができる。また、市販のDNA抽出試薬を用いてもよい。 The method for extracting DNA from the soil in step i) can be performed according to a known method. For example, extraction with a chloroform solution can be used. A commercially available DNA extraction reagent may also be used.
抽出したDNAの精製も公知の方法に従って行うことができ、例えば、電気泳動によるDNAの分離と切り出しを行って精製することができる。また、市販のDNA精製キットにより行うことができる。 Purification of the extracted DNA can also be performed according to a known method. For example, it can be purified by separation and excision of DNA by electrophoresis. Moreover, it can carry out with a commercially available DNA purification kit.
工程ii）のPCRにおける条件は、適宜設定し、至適化することができるが、アニーリング温度は60℃の条件とすることが好ましい。他の条件も適宜設定し得るが、通常、95℃・3〜10分の加熱後、95℃・15〜30秒、60℃・30〜60秒の反応を30〜40サイクル程度行う。 The conditions in the PCR of step ii) can be appropriately set and optimized, but the annealing temperature is preferably 60 ° C. Although other conditions can also be set as appropriate, the reaction at 95 ° C. for 15 to 30 seconds and 60 ° C. for 30 to 60 seconds is usually performed for about 30 to 40 cycles after heating at 95 ° C. for 3 to 10 minutes.
DNAの検出方法も特に限定されず、公知の方法に従って行うことができるが、例えば、リアルタイムPCRで通常利用される蛍光検出方法を使用することができる。 The method for detecting DNA is not particularly limited, and can be performed according to a known method. For example, a fluorescence detection method usually used in real-time PCR can be used.
工程iii）においては、検出した値を、公知の方法に従って作成した検量線にあてはめることにより、石油分解菌数を算出することができる。 In step iii), the number of petroleum degrading bacteria can be calculated by applying the detected value to a calibration curve prepared according to a known method.
例えば、下記式により、土壌1 g当たりの石油分解菌数を算出することができる。
石油分解菌数(cells/g-sample) = (3×1014) × e(-0.516×Ct値)
［式中、Ct値は実験より得られた値であり、閾値に到達したときのサイクル数(threshold cycle)を表す。］
For example, the number of petroleum degrading bacteria per gram of soil can be calculated by the following formula.
Number of petroleum-degrading bacteria (cells / g-sample) = (3 × 10 14 ) × e (-0.516 × Ct value)
[In the formula, the Ct value is a value obtained from an experiment, and represents the number of cycles when the threshold value is reached. ]
本発明の定量方法による石油分解菌の検出限界は1 × 106 cells/g-soilである。 The detection limit of petroleum degrading bacteria by the quantification method of the present invention is 1 × 10 6 cells / g-soil.
４．石油分解菌の挙動解析方法
本発明の土壌中の石油分解菌の挙動解析方法は、上記石油分解菌の定量方法により得られた値を用いて、土壌中の石油分解菌数の経時変化を解析する工程を含むことを特徴とする。より詳細には、本発明のプライマーセットを用いて、土壌中の石油分解菌数の定量を経時的に行い、菌数の変動をモニタリングして解析することにより、土壌中の石油分解菌数の挙動を解析する。
4). Method for Analyzing Behavior of Petroleum Decomposing Bacteria The method for analyzing the behavior of petroleum decomposing bacteria in the soil according to the present invention uses the values obtained by the above-mentioned method for quantifying petroleum decomposing bacteria to analyze changes over time in the number of petroleum degrading bacteria in soil. Including the step of: More specifically, by using the primer set of the present invention, the number of petroleum-degrading bacteria in the soil is quantified over time, and by monitoring and analyzing the change in the number of bacteria, the number of petroleum-degrading bacteria in the soil is analyzed. Analyze behavior.
解析におけるモニタリングの方法は、特に限定されず、適宜公知の方法に従って行うことができる。例えば、石油分解菌数を、更に換算させた値を用いてモニタリングしてもよい。また、適当なグラフ又は図等の表示手段を用いてモニタリングすることもできる。 The method of monitoring in the analysis is not particularly limited, and can be performed according to a known method as appropriate. For example, the number of petroleum degrading bacteria may be monitored using a further converted value. Moreover, it can also monitor using display means, such as a suitable graph or a figure.
また、モニタリングは、石油分解菌数に加えて、更に１又は複数の指標を用いて行うこともできる。 Monitoring can also be performed using one or more indicators in addition to the number of petroleum degrading bacteria.
本発明の挙動解析方法においては、更に、土壌中の総バクテリア数の挙動解析や、油分濃度の挙動解析を組み合わせることもできる。土壌中の総バクテリア数の解析は、公知の方法に従って行うことができ、例えば、環境DNA法や平板希釈法を用いて行うことができる。 In the behavior analysis method of the present invention, a behavior analysis of the total number of bacteria in the soil and a behavior analysis of the oil concentration can also be combined. The analysis of the total number of bacteria in the soil can be performed according to a known method, for example, using an environmental DNA method or a plate dilution method.
環境DNA法は、対象土壌から採取した試料単位重量あたりのDNA量に基づいて算出した値を用いて、土壌中の総バクテリア数を算出する方法である。単位重量が1 gの場合、その数は対象土壌(又は試料)単位重量あたりの数(cells/g-soil又はcells/g-sample)の単位で表すことができる。例えば、環境DNA法において、土壌バクテリア数は、対象土壌から採取した試料の単位重量あたりのDNA量(環境DNA量)を、下記式により換算することによって求めることができる。
バクテリア数(cells/g-sample) = 環境DNA量(μg/g-soil) × 4.0 × 109
The environmental DNA method is a method of calculating the total number of bacteria in soil using a value calculated based on the amount of DNA per unit weight of sample collected from the target soil. When the unit weight is 1 g, the number can be expressed in units of the target soil (or sample) unit weight (cells / g-soil or cells / g-sample). For example, in the environmental DNA method, the number of soil bacteria can be determined by converting the amount of DNA per unit weight (environmental DNA amount) of a sample collected from the target soil by the following formula.
Number of bacteria (cells / g-sample) = Environmental DNA content (μg / g-soil) × 4.0 × 10 9
また、油分濃度の解析も公知の方法に従って行うことができる。例えば、適当な抽出液を用いて対象土壌から油分を抽出し、ガスクロマトグラフィーや赤外分光分析を用いて測定することにより解析することができる。 The analysis of the oil concentration can also be performed according to a known method. For example, the oil can be extracted from the target soil using a suitable extract and analyzed by gas chromatography or infrared spectroscopic analysis.
本発明の挙動解析方法により、特定の石油分解菌の増加や減少など、土壌中の石油分解菌の動向の詳細を把握することができ、それに応じた追加処理を行うことにより、バイオレメディエーションを効率化することができる。特に効率的なバイオレメディエーションを行うためには、石油分解菌の菌数を維持すること、更に、石油分解菌を優先種とすることが重要であると考えられる。本発明の挙動解析方法を用いれば、石油分解菌の菌数の維持及び優先種とするための処理に適当なタイミングを簡便に把握することができる。 With the behavior analysis method of the present invention, it is possible to grasp the details of the trends of petroleum degrading bacteria in the soil, such as the increase or decrease of specific petroleum degrading bacteria, and by performing additional treatments accordingly, bioremediation is efficient. Can be In particular, in order to perform efficient bioremediation, it is considered important to maintain the number of petroleum-degrading bacteria and to make petroleum-degrading bacteria a priority species. By using the behavior analysis method of the present invention, it is possible to easily grasp the appropriate timing for the maintenance of the number of petroleum-degrading bacteria and the treatment for making it a preferred species.
またバイオオーグメンテーションは外来の細菌を大量に投与することから、生態系が大きく変化してしまう可能性があるが、本発明における挙動解析法は、投与菌株の土壌環境への影響を解析する上でも役立つと考えられる。 Bioaugmentation involves the administration of a large amount of exogenous bacteria, which may significantly change the ecosystem, but the behavior analysis method of the present invention analyzes the effect of the administered strain on the soil environment. It is thought that it is also useful above.
５．土壌浄化方法
本発明の土壌浄化方法は．上記石油分解菌の定量方法を行って、得られた石油分解菌数が一定値以下である場合に、栄養物質及び／又は石油分解菌を投入する工程を含むことを特徴とする。
5. Soil purification method The soil purification method of the present invention is as follows. When the above-mentioned method for quantifying petroleum-decomposing bacteria is carried out and the number of petroleum-degrading bacteria obtained is not more than a certain value, a step of introducing a nutrient substance and / or petroleum-degrading bacteria is included.
本発明の土壌浄化方法によれば、土壌中の石油分解菌の動向を把握し、それに応じて栄養物質及び／又は石油分解菌を投与することで、バイオレメディエーションを効率化することができる。 According to the soil purification method of the present invention, bioremediation can be made more efficient by grasping the trend of petroleum-degrading bacteria in the soil and administering the nutrient substance and / or petroleum-degrading bacteria accordingly.
特に、効率的なバイオレメディエーションを行うためには、石油分解菌を優先種とすることが重要と考えられる。石油分解菌の定量を行い、石油分解菌数の値が一定値以下となった場合に、石油分解菌を追加投与して、石油分解菌を優先種とすることにより、バイオレメディエーションを促進することができる。 In particular, in order to perform efficient bioremediation, it is considered important to use petroleum-degrading bacteria as a priority species. Quantify petroleum-degrading bacteria and, when the number of petroleum-degrading bacteria falls below a certain value, promote bioremediation by adding petroleum-degrading bacteria and making them the preferred species Can do.
上記一定値とは、例えば1 × 107 cells/g-soil〜1 × 109 cells/g-soilの範囲から設定される値である。このような値以下に低下したときに栄養物質及び／又は石油分解菌を追加投与するようにすることで、石油除去を効率よく促進させることができる。 The constant value is a value set from a range of, for example, 1 × 10 7 cells / g-soil to 1 × 10 9 cells / g-soil. When the nutrient substance and / or petroleum-degrading bacteria are additionally administered when the value falls below this value, oil removal can be promoted efficiently.
投与する栄養物質としては、土壌細菌の栄養となるものであれば、特に限定されず、対象とする土壌の種類や生息細菌の種類等により、適宜設定できる。栄養物質としては、例えば、バーク堆肥などの植物堆肥、馬糞堆肥、鶏糞堆肥、牛糞堆肥、豚糞堆肥などの家畜堆肥、海藻堆肥、稻ワラ、籾殻、尿素、硝酸アンモニウム、硝酸苦土アンモニウム、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、硝酸ソーダ、硝酸カルシウム、硝酸カリウム、石灰窒素、大豆カス、魚粉、過リン酸石灰、重過リン酸石灰、苦土過リン酸、苦土リン酸、硫リン安、リン硝安カリウム、塩リン安、活性汚泥炭化物などが挙げられる。また、栄養物質の投与形態も特に限定されず、例えば、栄養物質を含む土壌等の形態で投与してもよい。 The nutrient substance to be administered is not particularly limited as long as it is a nutrient for soil bacteria, and can be appropriately set depending on the type of soil to be used, the type of inhabiting bacteria, and the like. Examples of nutrients include plant compost such as bark compost, horse manure compost, chicken manure compost, cattle manure compost, pig manure compost, etc., livestock compost, seaweed compost, rice bran, rice husk, urea, ammonium nitrate, ammonium nitrate ammonium nitrate, ammonium chloride , Ammonium sulfate, ammonium phosphate, sodium nitrate, calcium nitrate, potassium nitrate, lime nitrogen, soybean meal, fish meal, superphosphate lime, heavy superphosphate lime, bitter hyperphosphate, bitter phosphate, ammonium sulfate, phosphorus Examples include potassium nitrate, ammonium phosphate, and activated sludge carbide. Moreover, the administration form of a nutrient substance is not specifically limited, For example, you may administer with forms, such as the soil containing a nutrient substance.
投与する石油分解菌の種類は、石油を分解することができる細菌であれば、特に限定されず、適宜設定することができる。具体的な細菌の種類としては、前述した種類の石油分解菌が挙げられるが、石油や炭化水素系の物質が多い土壌又は水から単離されたものは、一般的に石油の分解能が高いため好適である。 The kind of petroleum degrading bacteria to be administered is not particularly limited as long as it is a bacterium capable of degrading petroleum, and can be appropriately set. Specific types of bacteria include the above-mentioned types of petroleum-degrading bacteria, but those isolated from soil or water rich in petroleum and hydrocarbon-based substances generally have high petroleum resolution. Is preferred.
本発明の土壌浄化方法は、上記定量方法を行い、得られた栄養物質中の石油分解菌数に基づいて、投入する栄養物質の種類及び／又は量を決定する工程を更に含んでいてもよい。 The soil purification method of the present invention may further include a step of performing the above quantification method and determining the type and / or amount of the nutrient substance to be input based on the number of petroleum-decomposing bacteria in the obtained nutrient substance. .
栄養物質の中には、石油分解菌を含むものもある(例えば、堆肥)。そのような栄養物質を投与する場合には、予めその中に含まれる石油分解菌数を求めておくことで、土壌中の石油分解菌数を好適な範囲内に調整することができる栄養物質の投与量を決定すること、又は石油分解菌を投与する代わりに石油分解菌を含む栄養物質を投与する場合には、好適な栄養物質の種類を決定することができる。 Some nutritional substances contain petroleum-degrading bacteria (eg compost). When such a nutrient is administered, the number of petroleum-decomposing bacteria in the soil can be adjusted within a suitable range by obtaining the number of petroleum-degrading bacteria contained therein in advance. When determining the dosage, or when administering a nutrient containing a petroleum degrading bacterium instead of administering a petroleum degrading bacterium, the type of suitable nutrient can be determined.
更に、本発明の土壌浄化方法においては、土壌中の総バクテリア数の挙動解析や、油分濃度の挙動解析を組み合わせて行うことが好ましい。土壌バクテリア数からは、対象土壌における総合的なバクテリアの状況や土壌の特性を把握できると考えられる。一方、効率的なバイオレメディエーションを行うためには、石油分解菌を優先種とすることが重要であると考えられる。そのため、土壌バクテリア数の解析に加えて、本発明で確立した石油分解菌の挙動解析を行って、両者の相対的な関係を把握し、石油分解菌が優先種となるような手段をとることで、バイオレメディエーションをより効率化させることができると考えられる。 Furthermore, in the soil purification method of the present invention, it is preferable to combine the behavior analysis of the total number of bacteria in the soil and the behavior analysis of the oil concentration. From the number of soil bacteria, it is considered that the overall bacteria situation and soil characteristics in the target soil can be grasped. On the other hand, in order to perform efficient bioremediation, it is considered important to make petroleum-degrading bacteria a priority species. Therefore, in addition to the analysis of the number of soil bacteria, the behavior analysis of the oil-degrading bacteria established in the present invention should be performed to understand the relative relationship between the two and take measures to make the oil-degrading bacteria the preferred species. Therefore, it is considered that bioremediation can be made more efficient.
以下、本発明を更に詳しく説明するため実施例を挙げる。しかし、本発明はこれら実施例等になんら限定されるものではない。 Examples are given below to illustrate the present invention in more detail. However, the present invention is not limited to these examples.
比較例１（既存の石油分解菌検出プライマー）
非特許文献１(Smits et al., Enviromental Microbiology, 1(4), 307-317, 1999)で使用されていたプライマーの配列を表１に示す。
Comparative example 1 (existing petroleum-degrading bacteria detection primer)
Table 1 shows the primer sequences used in Non-Patent Document 1 (Smits et al., Environmental Microbiology, 1 (4), 307-317, 1999).
ロドコッカス・エリスロポリスNDKK6株を、土壌1 gあたり1 × 106、1 × 107、1 × 108及び1 × 109 cells/g-soilになるように滅菌土壌に添加した。50 ml容遠沈管に上記土壌1.0 gを量り取り、表２に示すDNA抽出緩衝液(pH 8.0)を8.0 ml、20%(w/v)ドデシル硫酸ナトリウム溶液を1.0 ml加え、1,500 rpm、室温で20分間撹拌した。撹拌後、50 ml容遠沈管から滅菌済み1.5 mlマイクロチューブに1.5 ml分取し、16℃、8,000 rpmで10分間遠心分離した。水層を新たなマイクロチューブに700μl分取し、フェノール・クロロホルム・イソアミルアルコール(25:24:1)を700μl加えて混和した後、16℃、13,000 rpmで10分遠心分離した。遠心分離後、水層を新たなマイクロチューブに500μl分取し、2-プロパノールを300μl加えて緩やかに混和し、16℃、13,000 rpmで15分遠心分離した。遠心分離後、上清を除去し、70%(v/v)エタノールを500μl加え16℃、13,000 rpmで5分遠心分離した。遠心分離後、上清を除去しアスピレーターで30分間減圧乾燥させた。 Rhodococcus erythropolis NDKK6 strain was added to sterilized soil at 1 × 10 6 , 1 × 10 7 , 1 × 10 8 and 1 × 10 9 cells / g-soil per 1 g of soil. Weigh 1.0 g of the above soil into a 50 ml centrifuge tube, add 8.0 ml of DNA extraction buffer (pH 8.0) shown in Table 2 and 1.0 ml of 20% (w / v) sodium dodecyl sulfate solution, 1,500 rpm, room temperature For 20 minutes. After stirring, 1.5 ml was taken from a 50 ml centrifuge tube into a sterilized 1.5 ml microtube and centrifuged at 16 ° C. and 8,000 rpm for 10 minutes. 700 μl of the aqueous layer was taken into a new microtube, 700 μl of phenol / chloroform / isoamyl alcohol (25: 24: 1) was added and mixed, and then centrifuged at 16 ° C. and 13,000 rpm for 10 minutes. After centrifugation, 500 μl of the aqueous layer was taken into a new microtube, 300 μl of 2-propanol was added, gently mixed, and centrifuged at 16 ° C. and 13,000 rpm for 15 minutes. After centrifugation, the supernatant was removed, 500 μl of 70% (v / v) ethanol was added, and the mixture was centrifuged at 16 ° C. and 13,000 rpm for 5 minutes. After centrifugation, the supernatant was removed and dried under reduced pressure with an aspirator for 30 minutes.
これに表３に示すTE 10:1緩衝液(pH 8.0)を15μl加えよく溶解させ、これを環境DNA溶液とした。アガロース2.0 g、表４に示す50×TAE緩衝液(pH 8.0) 4.0 ml及び0.1 mMエチジウムブロマイド溶液20μlに蒸留水を加えて200 mlとし、1.0 %アガロースゲルを作製した。環境DNA溶液15μlにローディングダイ(東洋紡、大阪) 2.0μlを混合し、全量17μlをアガロースゲルにアプライした。これを100 Vで40分間電気泳動を行った後、アガロースゲルにUV照射し、DNAバンドを確認した。アガロースゲルからDNAバンドを切り出し、環境DNAを精製した。 To this, 15 μl of TE 10: 1 buffer solution (pH 8.0) shown in Table 3 was added and dissolved well, and this was used as an environmental DNA solution. Distilled water was added to 2.0 g of agarose, 4.0 ml of 50 × TAE buffer (pH 8.0) shown in Table 4 and 20 μl of 0.1 mM ethidium bromide solution to make 200 ml, and a 1.0% agarose gel was prepared. To 15 μl of the environmental DNA solution, 2.0 μl of a loading die (Toyobo, Osaka) was mixed, and a total amount of 17 μl was applied to an agarose gel. After electrophoresis at 100 V for 40 minutes, the agarose gel was irradiated with UV to confirm the DNA band. The DNA band was cut out from the agarose gel and the environmental DNA was purified.
KAPA SYBR FAST qPCR Master Mixを10μl、10μMのTS2S及びDeg1REプライマーを0.4μl、ROX highを0.4μl、精製した環境DNAを3μl含む20μlの反応液を200μl容チューブに加え、Applied Biosystems 7300 Real Time System (アプライドバイオシステムズ、USA)にセットして、リアルタイムPCRを行った。PCRの反応条件は、95℃・5〜10分の加熱後、95℃・15〜20秒、55℃・30〜60秒、72℃・45〜75秒の反応を40サイクルとした。なお、リアルタイムPCRに用いた試料のうち、KAPA SYBR、ROX highはKAPA SYBR qPCR kit (KAPA BIOSYSTEMS、大阪)のプロトコールに従って用いた。 Add 10 μl of KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix, 0.4 μl of 10 μM TS2S and Deg1RE primers, 0.4 μl of ROX high, 3 μl of purified environmental DNA to a 200 μl reaction tube, and then apply Applied Biosystems 7300 Real Time System ( Applied Biosystems, USA) and real-time PCR was performed. PCR reaction conditions were 95 ° C for 5 to 10 minutes, followed by 40 cycles of 95 ° C for 15 to 20 seconds, 55 ° C for 30 to 60 seconds, 72 ° C for 45 to 75 seconds. Of the samples used for real-time PCR, KAPA SYBR and ROX high were used according to the protocol of KAPA SYBR qPCR kit (KAPA BIOSYSTEMS, Osaka).
上記方法により滅菌土壌に添加したロドコッカス・エリスロポリスNDKK6株を定量したところ、1×107cells/g-soilまでしか検出できなかった(図５)。また、本プライマーセットの増幅領域は約550 bpであり、増幅効率の観点から見れば、リアルタイムPCRに適用するには不向きである。 When the Rhodococcus erythropolis NDKK6 strain added to the sterilized soil by the above method was quantified, only 1 × 10 7 cells / g-soil could be detected (FIG. 5). Moreover, the amplification region of this primer set is about 550 bp, and it is not suitable for application to real-time PCR from the viewpoint of amplification efficiency.
実施例１
（１）石油分解菌検出のための新規プライマーの設計
石油分解菌をより高感度で特異的に検出するためのプライマーを設計した。これまでに報告されているalkB遺伝子塩基配列のアライメントを行った。その結果、HYGモチーフとHist-3モチーフがより高度に保存されていることを見いだし、本配列を利用して縮重プライマーを設計した(図１)。HYGモチーフからは2種類(alkB-F1及びalkB-F2)、Hist-3モチーフからは3種類(alkB-R1、alkB-R2及びalkB-R3)設計した。これらプライマーを用いたPCRでは約140 bpのDNA断片が増幅されるため、リアルタイムPCRに適合する。
Example 1
(1) Design of new primer for detection of petroleum-degrading bacteria Primers were designed for specific detection of petroleum-degrading bacteria with higher sensitivity. The alkB gene nucleotide sequences reported so far were aligned. As a result, it was found that the HYG motif and the Hist-3 motif were more highly conserved, and a degenerate primer was designed using this sequence (FIG. 1). Two types (alkB-F1 and alkB-F2) were designed from the HYG motif, and three types (alkB-R1, alkB-R2 and alkB-R3) were designed from the Hist-3 motif. PCR using these primers is suitable for real-time PCR because a DNA fragment of about 140 bp is amplified.
（２）特異性の確認
設計したプライマーが特異的にalkB遺伝子を増幅するかを調べるために、設計したプライマーを用いてPCRを行った。鋳型には石油分解菌でalkB遺伝子を持っていることがわかっているロドコッカス・エリスロポリスNDKK6株、ゴルドニア・テラエNDKY76A株、及びシュードモナス・エルギノーサF721株全DNAを用いた。rTaq DNA polymeraseを0.2μl、10×buffer for rTaqを2μl、2 mMのdNTPsを2μl、10μMのフォワードプライマー及びリバースプライマーを1μl、鋳型DNAを50 ng含む20μlの反応液を200μl容チューブに加え、サーマルサイクラーにセットして、PCRを行った。PCRの反応条件は、95℃・5〜10分の加熱後、95℃・15〜30秒、55℃・30〜60秒、72℃・15〜30秒の反応を30サイクルとした。なお、PCRに用いた試薬のうち、rTaq DNA polymerase、10×buffer for rTaq、dNTPsはrTaq DNA polymerase(東洋紡、大阪)のプロトコールに従って用いた。PCR終了後、反応液10μlを2%アガロースで電気泳動し、DNAの増幅を調べた。
(2) Confirmation of specificity In order to investigate whether the designed primer specifically amplifies the alkB gene, PCR was performed using the designed primer. Rhodococcus erythropolis NDKK6 strain, Gordonia terae NDKY76A strain, and Pseudomonas aeruginosa F721 strain total DNA, which are known to have an alkB gene as an oil-degrading bacterium, were used as templates. Add 0.2 μl of rTaq DNA polymerase, 2 μl of 10 × buffer for rTaq, 2 μl of 2 mM dNTPs, 1 μl of 10 μM forward primer and reverse primer, and add 20 μl of reaction solution containing 50 ng of template DNA to a 200 μl tube. PCR was performed by setting in a cycler. The PCR reaction conditions were 95 ° C for 5-10 minutes, 95 ° C for 15-30 seconds, 55 ° C for 30-60 seconds, 72 ° C for 15-30 seconds for 30 cycles. Among the reagents used for PCR, rTaq DNA polymerase, 10 × buffer for rTaq, and dNTPs were used according to the protocol of rTaq DNA polymerase (Toyobo, Osaka). After completion of PCR, 10 μl of the reaction solution was electrophoresed with 2% agarose to examine DNA amplification.
その結果、全てのPCRプライマーでNDKK6株、NDKY76A株及びF721株のalkBを検出できた。しかし、alkB-F1/alkB-R3 (図２Ｃ)、alkB-F2/alkB-R2 (図２Ｅ)、及びalkB-F2/alkB-R3 (図２Ｆ)の組み合わせでは大腸菌の全DNAを鋳型に用いた場合に非特異的な増幅が観察された。alkB-F1/alkB-R1 (図２Ａ）、alkB-F1/alkB-R2 (図２Ｂ)、及びalkB-F2/alkB-R1 (図２Ｄ)の組み合わせでは大腸菌の全DNAを鋳型に用いた場合においても非特異的な増幅は観察されなかった。
As a result, alkB of NDKK6 strain, NDKY76A strain and F721 strain could be detected with all PCR primers. However, in the combination of alkB-F1 / alkB-R3 (Fig. 2C), alkB-F2 / alkB-R2 (Fig. 2E), and alkB-F2 / alkB-R3 (Fig. 2F), E. coli total DNA was used as a template. In some cases non-specific amplification was observed. alkB-F1 / alkB-R1 (Fig. 2A), the combination of alkB-
（３）プライマーの検出限界
検出限界を調べるためにalkB-F1/alkB-R1、alkB-F1/alkB-R2、及びalkB-F2/alkB-R1プライマーセットを用いて、滅菌土壌に添加したロドコッカス・エリスロポリスNDKK6株(1 × 106から1 × 109 cells/g-soil)からのDNAを鋳型にリアルタイムPCRを行った。
(3) Detection limit of primer Rhodococcus added to sterilized soil using alkB-F1 / alkB-R1, alkB-F1 / alkB-R2, and alkB-F2 / alkB-R1 primer sets to investigate the detection limit Real-time PCR was performed using DNA from erythropolis NDKK6 strain (1 × 10 6 to 1 × 10 9 cells / g-soil) as a template.
比較例１と同様の方法により環境DNAを精製した。KAPA SYBR FAST qPCR Master Mixを10μl、10μMのフォワードプライマー及びリバースプライマーを1μl、ROX highを0.4μl、精製した環境DNAを1〜5μl含む20μlの反応液を200μl容チューブに加え、Applied Biosystems 7300 Real Time System (アプライドバイオシステムズ、USA)にセットして、リアルタイムPCRを行った。PCRの反応条件は、95℃・5〜10分の加熱後、95℃・15〜30秒、60℃・30〜60秒の反応を40サイクルとした。なお、リアルタイムPCRに用いた試料のうち、KAPA SYBR、ROX highはKAPA SYBR qPCR kit (カパバイオシステムズ、大阪)のプロトコールに従って用いた。 Environmental DNA was purified by the same method as in Comparative Example 1. Add 10 μl of KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix, 1 μl of 10 μM forward and reverse primers, 0.4 μl of ROX high, and 1 μl of purified environmental DNA to a 20 μl reaction solution to a 200 μl tube, and then Applied Biosystems 7300 Real Time Real-time PCR was performed using System (Applied Biosystems, USA). PCR reaction conditions were 95 ° C for 5-10 minutes, followed by 40 cycles of 95 ° C for 15-30 seconds and 60 ° C for 30-60 seconds. Of the samples used for real-time PCR, KAPA SYBR and ROX high were used according to the protocol of KAPA SYBR qPCR kit (Kapa Biosystems, Osaka).
結果を表５に示す。 The results are shown in Table 5.
alkB-F1/alkB-R1及びalkB-F2/alkB-R1プライマーセットを用いた場合では1 × 107 cells/g-soilのNDKK6株までしか検出することが出来なかった。一方、alkB-F1/alkB-R2プライマーセットを用いた場合では1 × 106 cells/g-soilまで検出できた(表５、図３)。 When alkB-F1 / alkB-R1 and alkB-F2 / alkB-R1 primer sets were used, only NDKK6 strains of 1 × 10 7 cells / g-soil could be detected. On the other hand, when the alkB-F1 / alkB-R2 primer set was used, up to 1 × 10 6 cells / g-soil could be detected (Table 5, FIG. 3).
（４）まとめ
土壌環境中の石油分解菌を特異的に検出・定量するシステムを構築した。本システムは土着の石油分解菌を1 × 106 cells/g-soilまで検出可能である。
(4) Summary A system for specifically detecting and quantifying petroleum-degrading bacteria in the soil environment was constructed. This system can detect indigenous petroleum-degrading bacteria up to 1 × 10 6 cells / g-soil.
Claims (7)
（２）配列番号１で表される縮重プライマー及び配列番号２で表される縮重プライマー；又は
（３）配列番号３で表される縮重プライマー及び配列番号４で表される縮重プライマー
を含む石油分解菌検出用プライマーセット。 (1) A degenerate primer represented by SEQ ID NO: 1 and a degenerate primer represented by SEQ ID NO: 4;
(2) a degenerate primer represented by SEQ ID NO: 1 and a degenerate primer represented by SEQ ID NO: 2; or
(3) A primer set for detecting petroleum-degrading bacteria, comprising a degenerate primer represented by SEQ ID NO: 3 and a degenerate primer represented by SEQ ID NO: 4 .
ii) このDNAを鋳型として、請求項１に記載のプライマーセットを用いてPCRを行い、増幅されたDNAを検出する工程と、
iii) 検出した値を用いて、石油分解菌数を算出する工程
を含むことを特徴とする土壌中の石油分解菌の定量方法。 i) extracting and purifying DNA contained in the target soil;
ii) using this DNA as a template, performing PCR using the primer set according to claim 1, and detecting the amplified DNA;
iii) A method for quantifying petroleum-degrading bacteria in soil, comprising a step of calculating the number of petroleum-degrading bacteria using the detected value.
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