JP5504469B2 - Method for analyzing behavior of hydrocarbon-degrading bacteria and soil purification method - Google Patents
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Description
本発明は、炭化水素分解菌検出用プライマーセット、及び、それを用いた炭化水素分解菌の定量方法に関する。更には、それらを利用した炭化水素分解菌の挙動解析方法及び土壌浄化方法に関する。 The present invention relates to a primer set for detecting hydrocarbon-degrading bacteria and a method for quantifying hydrocarbon-degrading bacteria using the primer set. Furthermore, it is related with the behavioral analysis method and soil purification method of hydrocarbon decomposing bacteria using them.
石油は今日の産業活動において最も重要な資源の一つである。しかしながら、石油輸送過程や石油の利用に伴う工場やその跡地等において、土壌や水圏環境への石油汚染が世界各地で発生しており、地球規模での問題となっている。我が国では、2002年に施行された「土壌汚染防止法」に引き続き、石油汚染に関して2006年に「油汚染対策ガイドライン−鉱油類を含む土壌に起因する油臭・油膜問題への土地所有者等による対応の考え方−」が中央環境審議会土壌農薬部会土壌汚染技術基準等専門委員会により発表された。
石油汚染土壌の浄化には、土壌中の石油成分を重油により焼却して浄化する方法が実用化されているが、多大なエネルギーと大型の処理プラントが必要である。一方、微生物機能により汚染を浄化するバイオレメディエーションが研究され始めており、欧米や日本を中心に、石油を分解する特殊微生物が分離・同定され、石油分解メカニズムが徐々に明らかとなってきている。
Oil is one of the most important resources in today's industrial activities. However, oil pollution to the soil and hydrosphere environment has occurred in various parts of the world in factories and sites associated with the oil transportation process and the use of oil, which is a global problem. In Japan, following the “Soil Contamination Prevention Law” enacted in 2002, the “Oil Pollution Control Guideline-Oil Ownership by Oil Owners and Oil Film Problems Caused by Soil Containing Mineral Oils” The concept of “response” was announced by the Special Committee on Soil Contamination Technical Standards of the Soil Pesticide Subcommittee of the Central Environmental Council.
For purification of petroleum-contaminated soil, a method of purifying petroleum components in the soil by incineration with heavy oil has been put into practical use, but a great deal of energy and a large processing plant are required. On the other hand, bioremediation that purifies pollution by microbial function has begun to be studied, and special microorganisms that decompose petroleum have been separated and identified mainly in Europe, the United States and Japan, and the mechanism of petroleum decomposition has gradually become clear.
例えば、土壌浄化能力に優れた微生物として、ロドコッカス（Rhodococcus）属及びゴ
ルドニア（Gordonia）属に属する微生物が報告されている（特許文献１参照）。
For example, microorganisms belonging to the genus Rhodococcus and the genus Gordonia have been reported as microorganisms excellent in soil purification ability (see Patent Document 1).
しかし、バイオレメディエーションにより微生物機能を用いて石油を浄化する場合は、長時間を要し、浄化能の維持が重要課題の一つと考えられる。また、バイオレメディエーションの効率化には環境状態に適した手段を選択し実施することが重要と考えられ、環境中に投入した微生物の挙動を解析し、適切な微生物量を維持・管理することが非常に重要であると考えられる。
本発明は、バイオレメディエーションを効率化する技術を提供することを主な目的とする。即ち、本発明は、炭化水素分解菌を特異的に定量し得る炭化水素分解菌検出用プライマーセット、更に当該プライマーセットを利用した土壌中の炭化水素分解菌挙動解析方法及び土壌浄化方法を提供することを主な目的とする。 The main object of the present invention is to provide a technique for improving the efficiency of bioremediation. Specifically, the present invention provides a primer set for detecting hydrocarbon-degrading bacteria capable of specifically quantifying hydrocarbon-degrading bacteria, and further provides a method for analyzing the behavior of hydrocarbon-degrading bacteria in soil and a soil purification method using the primer set. The main purpose.
本発明者は上記課題を解決することを主な目的として鋭意検討を重ねた結果、バイオレメディエーション、特に実汚染土壌のバイオレメディエーションにおいて効率化を図るためには、汚染土壌中で炭化水素分解菌を優先種とすることが重要であると考えた。更に炭化水素分解菌が優先種である状態の維持・管理のため、バイオレメディエーション中の炭化水素分解菌の挙動を正確に把握することが重要と考えた。本発明者らはこのような観点から更に検討を進め、炭化水素分解菌のみを特異的に定量する技術を確立した。更に当該技術を用いて、土壌中の炭化水素分解菌の挙動を解析する方法及び効率的な土壌浄化方法を確立した。 As a result of intensive studies with the main purpose of solving the above-mentioned problems, the present inventor, in order to improve efficiency in bioremediation, particularly bioremediation of actual contaminated soil, We thought it important to make it a priority species. Furthermore, in order to maintain and manage the state where hydrocarbon-degrading bacteria are the preferred species, it was important to accurately grasp the behavior of hydrocarbon-degrading bacteria during bioremediation. The present inventors have further studied from such a viewpoint and established a technique for specifically quantifying only hydrocarbon-degrading bacteria. Furthermore, using this technology, a method for analyzing the behavior of hydrocarbon-degrading bacteria in the soil and an efficient soil purification method were established.
即ち、本発明は、以下のプライマーセット、炭化水素分解菌の定量方法、挙動解析方法及び土壌浄化方法を提供する。 That is, the present invention provides the following primer set, method for quantifying hydrocarbon-degrading bacteria, behavior analysis method, and soil purification method.
１.配列表の配列番号１の塩基配列で表されるプライマー、及び
配列表の配列番号２の塩基配列で表されるプライマーからなるロドコッカス（Rhodococcus）属に属する炭化水素分解菌検出用プライマーセット。
1. A primer set for detecting hydrocarbon-degrading bacteria belonging to the genus Rhodococcus, comprising a primer represented by the base sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing and a primer represented by the base sequence of SEQ ID NO: 2 of the sequence listing.
２．配列表の配列番号３の塩基配列で表されるプライマー、及び
配列表の配列番号４の塩基配列で表されるプライマーからなるゴルドニア（Gordonia）属に属する炭化水素分解菌検出用プライマーセット。
2. A primer set for detecting a hydrocarbon-degrading bacterium belonging to the genus Gordonia, comprising a primer represented by the base sequence of SEQ ID NO: 3 in the sequence listing and a primer represented by the base sequence of SEQ ID NO: 4 of the sequence listing.
３．項１に記載のプライマーセットと項２に記載のプライマーセットとを含む炭化水素分解菌検出用ＰＣＲキット。 3. A PCR kit for detecting a hydrocarbon-degrading bacterium comprising the primer set according to Item 1 and the primer set according to Item 2.
４．i)対象土壌に含まれるDNAを抽出・精製する工程と、
ii)このDNAを鋳型として、項１に記載のプライマーセットを用いてPCRを行い、増幅され
たDNAを検出する工程と、
iii)検出した値を用いて、炭化水素分解菌数を算出する工程
を含むことを特徴とする土壌中の炭化水素分解菌の定量方法。
4). i) extracting and purifying DNA contained in the target soil;
ii) using this DNA as a template, performing PCR using the primer set of Item 1, and detecting the amplified DNA;
iii) A method for quantifying hydrocarbon-degrading bacteria in soil, comprising a step of calculating the number of hydrocarbon-degrading bacteria using the detected value.
５．i)対象土壌に含まれるDNAを抽出する工程と、
ii)このDNAを鋳型として、項２に記載のプライマーセットを用いてPCRを行い、増幅され
たDNAを検出する工程と、
iii)検出した値を用いて、炭化水素分解菌数を算出する工程
を含むことを特徴とする土壌中の炭化水素分解菌の定量方法。
5. i) a step of extracting DNA contained in the target soil;
ii) using this DNA as a template, performing PCR using the primer set described in Item 2, and detecting the amplified DNA;
iii) A method for quantifying hydrocarbon-degrading bacteria in soil, comprising a step of calculating the number of hydrocarbon-degrading bacteria using the detected value.
５−１．i)対象土壌に含まれるDNAを抽出する工程と、
ii)このDNAを鋳型として、項３に記載のPCRキットを用いてPCRを行い、増幅されたDNAを
検出する工程と、
iii)検出した値を用いて、炭化水素分解菌数を算出する工程
を含むことを特徴とする土壌中の炭化水素分解菌の定量方法。
5-1. i) a step of extracting DNA contained in the target soil;
ii) using this DNA as a template, performing PCR using the PCR kit according to Item 3, and detecting the amplified DNA;
iii) A method for quantifying hydrocarbon-degrading bacteria in soil, comprising a step of calculating the number of hydrocarbon-degrading bacteria using the detected value.
６．項４又は５に記載の定量方法により得られた値を用いて、土壌中の炭化水素分解菌数の経時変化を解析する工程を含むことを特徴とする土壌中の炭化水素分解菌の挙動解析方法。 6). Analyzing the behavior of hydrocarbon-degrading bacteria in soil, comprising the step of analyzing the time-dependent change in the number of hydrocarbon-degrading bacteria in the soil using the value obtained by the quantitative method according to Item 4 or 5 Method.
６−１．更に対象土壌から採取した試料単位重量当りのDNA量に基づいて算出した値を
用いて、土壌中の総バクテリア数の経時変化を解析する工程を含む
項６に記載の挙動解析方法。
6-1. Item 7. The behavior analysis method according to Item 6, further comprising a step of analyzing the time-dependent change in the total number of bacteria in the soil using a value calculated based on the amount of DNA per unit weight of the sample collected from the target soil.
７．対象土壌に約1×108〜1×109 cells/g-soilの範囲で炭化水素分解菌を投与する工
程と、
項４又は５に記載の定量方法により得られた値を用いて、土壌中の炭化水素分解菌数の経時変化を解析する工程と
を含むことを特徴とする土壌浄化方法。
7). Administering a hydrocarbon-degrading bacterium to the target soil in a range of about 1 × 10 8 to 1 × 10 9 cells / g-soil;
A method for soil purification comprising the step of analyzing the time-dependent change in the number of hydrocarbon-degrading bacteria in the soil using the value obtained by the quantitative method according to Item 4 or 5.
７−１．更に、対象土壌から採取した試料単位重量当りのDNA量に基づいて算出した値
を用いて、土壌中の総バクテリア数の経時変化を解析する工程を含む
項７に記載の土壌浄化方法。
7-1. Item 8. The soil remediation method according to Item 7, further comprising a step of analyzing a temporal change in the total number of bacteria in the soil using a value calculated based on the amount of DNA per unit weight of the sample collected from the target soil.
８．更に、投与した炭化水素分解菌の数が一定値以下となった場合に、投与した炭化水素分解菌と同じ又は異なる炭化水素分解菌を追加投与する工程と
を含むことを特徴とする項７に記載の土壌浄化方法。
8). The method further includes a step of additionally administering a hydrocarbon-decomposing bacterium that is the same as or different from the administered hydrocarbon-decomposing bacterium when the number of administered hydrocarbon-decomposing bacterium becomes a predetermined value or less. The soil purification method as described.
８−１．一定値が、1×108cells/g-soil〜1×109 cells/g-soilの範囲から設定される
値である項８に記載の土壌浄化方法。
8-1. Item 9. The soil remediation method according to Item 8, wherein the constant value is a value set from a range of 1 × 10 8 cells / g-soil to 1 × 10 9 cells / g-soil.
以下、本発明について、更に詳細に説明する。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
１．プライマーセット
(1)Rhodococcus属炭化水素分解菌検出用プライマーセット
本発明は、Rhodococcus属に属する炭化水素分解菌を特異的に検出可能にするプライマ
ーセットを提供する。
1. Primer set
(1) Primer set for detecting a Rhodococcus genus hydrocarbon-degrading bacterium The present invention provides a primer set that can specifically detect a hydrocarbon-degrading bacterium belonging to the genus Rhodococcus.
当該プライマーセットは、
配列表の配列番号１の塩基配列で表されるプライマー、および
配列表の配列番号２の塩基配列で表されるプライマー
からなる。
The primer set is
It consists of a primer represented by the base sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing and a primer represented by the base sequence of SEQ ID NO: 2 of the sequence listing.
各プライマーは、公知のＤＮＡ合成装置等を用いて化学的に合成することができる。また、当該技術分野においてよく知られる他の方法を用いて合成することもできる。 Each primer can be chemically synthesized using a known DNA synthesizer or the like. It can also be synthesized using other methods well known in the art.
本発明のプライマーセットを所定のPCR条件に供することにより、特定の炭化水素分解
菌を特異的に増幅することができる。
By subjecting the primer set of the present invention to predetermined PCR conditions, specific hydrocarbon-degrading bacteria can be specifically amplified.
PCRの条件は、適宜設定し、至適化することができるが、通常、95℃・5〜10分の加熱後、95℃・15〜20秒、60℃・30〜60秒、72℃・45〜75秒の反応を30サイクル程度行う。 PCR conditions can be set and optimized as appropriate, but usually after heating at 95 ° C for 5-10 minutes, 95 ° C for 15-20 seconds, 60 ° C for 30-60 seconds, 72 ° C The reaction for 45 to 75 seconds is performed for about 30 cycles.
対象となるRhodococcus属に属する炭化水素分解菌は、検出可能であれば特に限定され
ないが、Rhodococcus属に属し、かつアルカンヒドロキシラーゼ遺伝子を有する菌、例え
ば、Rhodococcus sp. ODNM2B、Rhodococcus sp. ODNM1C、Rhodococcus sp. NDMI54、Rhodococcus sp. NDMI114、Rhodococcus sp. NDKK48、Rhodococcus sp. NDKY82A、Rhodococcus sp. NDKK1、Rhodococcus sp. NDKK2、Rhodococcus sp. NDKK5、Rhodococcus sp. NDKK6、Rhodococcus sp. NDKK7、及び、Rhodococcus equiに属する菌等が挙げられる。特に、Rhodococcus sp. NDKK6の検出に好適である。
The target hydrocarbon-degrading bacterium belonging to the genus Rhodococcus is not particularly limited as long as it can be detected, but belongs to the genus Rhodococcus and has an alkane hydroxylase gene, such as Rhodococcus sp. ODNM2B, Rhodococcus sp. ODNM1C, Rhodococcus sp.NDMI54, Rhodococcus sp.NDMI114, Rhodococcus sp.NDKK48, Rhodococcus sp.NDKY82A, Rhodococcus sp.NDKK1, Rhodococcus sp.NDKK2, Rhodococcus sp.NDKK5, Rhodococcus sp.NDKK6, RhoNDoccus, Examples include bacteria. In particular, it is suitable for detection of Rhodococcus sp. NDKK6.
なお、ロドコッカス エスピー（Rhodococcus sp.）NDKK6株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒305-8566茨城県つくば市東1-1-1中央第6）に、受託番号 FERM P-20708として、平成17年11月10日に寄託されている。 Rhodococcus sp. NDKK6 is registered with the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Patent Biological Depositary Center (Central 1-1-1 Higashi 1-1-1, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture 305-8566). It has been deposited as 20708 on November 10, 2005.
２．Gordonia属炭化水素分解菌検出用プライマーセット
本発明は、Gordonia属に属する炭化水素分解菌を特異的に検出可能にするプライマーセットを提供する。
2. Primer set for detecting hydrocarbon-degrading bacteria belonging to the genus Gordonia The present invention provides a primer set that can specifically detect hydrocarbon-degrading bacteria belonging to the genus Gordonia.
当該プライマーセットは、
配列表の配列番号３の塩基配列で表されるプライマー、および
配列表の配列番号４の塩基配列で表されるプライマー
からなる。
The primer set is
It consists of a primer represented by the base sequence of SEQ ID NO: 3 in the sequence listing and a primer represented by the base sequence of SEQ ID NO: 4 of the sequence listing.
各プライマーは、公知のＤＮＡ合成装置等を用いて化学的に合成することができる。また、当該技術分野においてよく知られる他の方法を用いて合成することもできる。 Each primer can be chemically synthesized using a known DNA synthesizer or the like. It can also be synthesized using other methods well known in the art.
本発明のプライマーセットを所定のPCR条件に供することにより、特定の炭化水素分解
菌を特異的に増幅することができる。
By subjecting the primer set of the present invention to predetermined PCR conditions, specific hydrocarbon-degrading bacteria can be specifically amplified.
対象となるGordonia属に属する炭化水素分解菌は、検出可能であれば特に限定されないが、Gordonia属に属し、かつアルカンヒドロキシラーゼ遺伝子を有する菌、例えば、Gordonia sp. YS5、Gordonia sp. YS3、Gordonia sp. NDKY76A、Gordonia sp. NDKK46、Gordonia sp. NDKY2C、及びGordonia sp. NDKYB2B等が挙げられる。特に、Gordonia sp. NDKY76A株の検出に好適である。 The target hydrocarbon-degrading bacterium belonging to the genus Gordonia is not particularly limited as long as it is detectable, but bacteria belonging to the genus Gordonia and having an alkane hydroxylase gene, such as Gordonia sp. YS5, Gordonia sp. YS3, Gordonia sp. NDKY76A, Gordonia sp. NDKK46, Gordonia sp. NDKY2C, and Gordonia sp. NDKYB2B. In particular, it is suitable for detection of Gordonia sp. NDKY76A strain.
PCRにおける反応条件は、適宜設定し、至適化することができるが、通常、95℃・5〜10分の加熱後、95℃・15〜20秒、61℃・30〜60秒、72℃・45〜75秒の反応を30サイクル程度行う。 Reaction conditions in PCR can be set and optimized as appropriate, but usually 95 ° C for 15 to 20 seconds, 61 ° C for 30 to 60 seconds, 72 ° C after heating at 95 ° C for 5 to 10 minutes・ React for 45 to 75 seconds for about 30 cycles.
なお、ゴルドニア エスピー (Gordoniasp. ) NDKY76A株は、独立行政法人産業技術総
合研究所特許生物寄託センター（〒305-8566茨城県つくば市東1-1-1中央第6）に、受託番号 FERM P-20709として、平成17年11月10日に寄託されている。
The Gordoniasp. NDKY76A strain is registered with the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Patent Biological Depositary Center (Chuo 6-1-1 1-1 Tsukuba City, Ibaraki Prefecture, Japan) at FERM P-20709. It was deposited on November 10, 2005.
３．炭化水素分解菌検出用ＰＣＲキット
本発明のPCRキットは、上記Rhodococcus属炭化水素分解菌検出用プライマーセット及びGordonia属炭化水素分解菌検出用プライマーセットを含む。
3. PCR Kit for Detection of Hydrocarbon Degrading Bacteria The PCR kit of the present invention comprises the above primer set for detecting Rhodococcus genus hydrocarbon decomposing bacteria and the primer set for detecting Gordonia genus hydrocarbon decomposing bacteria.
本発明のPCRキットを用いれば、上記二つのPCR反応を同時に行うことにより、１回の手間で目的とする特定の炭化水素分解菌を効率良く検出することができる。より詳細に、Rhodococcus属炭化水素分解菌とGordonia属炭化水素分解菌は相同性の高い部分を含んでい
るため、競合する可能性があるにもかかわらず、本発明のプライマーセットを用いれば、それぞれを特異的に検出することができる。
By using the PCR kit of the present invention, the target specific hydrocarbon-degrading bacterium can be efficiently detected in one time by performing the two PCR reactions simultaneously. More specifically, since the Rhodococcus genus hydrocarbon-degrading bacterium and Gordonia genus hydrocarbon-degrading bacterium contain highly homologous parts, the primer set of the present invention can be used in spite of the possibility of competition. Can be specifically detected.
本発明のキットには、上記プライマーセット以外に、検出などに必要となる公知の手段を含めることもできる。例えば、増幅用試薬や検出用試薬などを含むことができる。 In addition to the above primer set, the kit of the present invention can also contain known means necessary for detection and the like. For example, amplification reagents and detection reagents can be included.
４．炭化水素分解菌数の定量方法
本発明は、上記プライマーセット又はPCRキットを利用した炭化水素分解菌の定量方法
を提供する。即ち、本発明のプライマーセット又はPCRキットを用いれば、対象土壌試料
における炭化水素分解菌の存在を検出したり、菌数を定量したりすることができる。
4). Method for quantifying the number of hydrocarbon-degrading bacteria The present invention provides a method for quantifying hydrocarbon-degrading bacteria using the above primer set or PCR kit. That is, if the primer set or PCR kit of the present invention is used, the presence of hydrocarbon-degrading bacteria in the target soil sample can be detected, or the number of bacteria can be quantified.
検出乃至定量を行うためには、土壌から採取した試料からDNAを抽出・精製し、これを
テンプレートとして本発明のプライマーセット を用いて、所定の条件でポリメラーゼ連
鎖反応（PCR）を行い、特定の炭化水素分解菌を増幅し、増幅されたDNAを検出し、更に検出した値を用いて、炭化水素分解菌数を算出することにより、行うことができる。
In order to perform detection or quantification, DNA is extracted and purified from a sample collected from soil, and this is used as a template to perform polymerase chain reaction (PCR) under predetermined conditions using the primer set of the present invention. This can be done by amplifying hydrocarbon-degrading bacteria, detecting the amplified DNA, and calculating the number of hydrocarbon-degrading bacteria using the detected value.
土壌からDNAを抽出する方法は公知の方法に従って行うことができる。例えば、クロロ
ホルム溶液による抽出を用いることができる。あるいは市販のDNA抽出試薬を用いてもよ
い。
A method for extracting DNA from soil can be performed according to a known method. For example, extraction with a chloroform solution can be used. Alternatively, a commercially available DNA extraction reagent may be used.
抽出したDNAの精製も公知の方法に従って行うことができ、例えば、電気泳動によるDNAの分離と切り出しを行って精製することができる。また市販のDNA精製キットにより行う
ことができる。
Purification of the extracted DNA can also be performed according to a known method. For example, it can be purified by separation and excision of DNA by electrophoresis. Moreover, it can carry out with a commercially available DNA purification kit.
DNAの検出方法も特に限定されず、公知の方法に従って行うことができるが、Real-timeアッセイを行い、PCR産物を増幅サイクルごとに逐次検出することが好ましい。 The method for detecting DNA is not particularly limited, and can be performed according to a known method. However, it is preferable to perform a real-time assay and sequentially detect PCR products for each amplification cycle.
検出した値を、公知の方法に従って作成した検量線にあてはめることにより、炭化水素分解菌数を算出することができる。 By applying the detected value to a calibration curve prepared according to a known method, the number of hydrocarbon-decomposing bacteria can be calculated.
より具体的に、土壌中のRhodococcus属炭化水素分解菌の定量は、
i)対象土壌に含まれるDNAを抽出・精製する工程と、
ii)このDNAを鋳型として、上記Rhodococcus属炭化水素分解菌検出用プライマーセット を用いて、所定の条件でPCRを行い、増幅されたDNAを検出する工程と、
iii)検出した値を用いて、Rhodococcus属炭化水素分解菌の数を算出する工程と
を含む方法により行うことができる。
More specifically, the quantification of Rhodococcus hydrocarbon-degrading bacteria in soil is:
i) extracting and purifying DNA contained in the target soil;
ii) using this DNA as a template, using the above-mentioned primer set for detecting Rhodococcus genus hydrocarbon-degrading bacteria, performing PCR under predetermined conditions, and detecting the amplified DNA;
iii) calculating the number of Rhodococcus genus hydrocarbon-degrading bacteria using the detected value.
工程ii）のPCRにおける条件は、適宜設定し、至適化することができるが、アニーリ
ング温度が60℃の条件とすることが好ましい。他の条件も適宜設定し得るが、通常、95℃・5〜10分の加熱後、95℃・15〜20秒、60℃・30〜60秒、72℃・45〜75秒の反応を30サイ
クル程度行う。
The conditions in the PCR of step ii) can be appropriately set and optimized, but it is preferable that the annealing temperature is 60 ° C. Other conditions can be set as appropriate, but after heating at 95 ° C for 5-10 minutes, the reaction at 95 ° C for 15-20 seconds, 60 ° C for 30-60 seconds, 72 ° C for 45-75 seconds Do about a cycle.
また、工程iii）においては、下記式により、土壌1 g当たりの炭化水素分解菌数を算出することができる。
Rhodococcus属炭化水素分解菌数（cells/g-sample）= （3×1016）×e（-0.7747×Ct値）
［式中、Ct値は実験より得られた値であり、閾値に到達したときのサイクル数（threshold cycle）を表す。］
In step iii), the number of hydrocarbon-decomposing bacteria per gram of soil can be calculated by the following formula.
Number of Rhodococcus hydrocarbon-degrading bacteria (cells / g-sample) = (3 x 10 16 ) x e (-0.7747 x Ct value)
[In the formula, the Ct value is a value obtained from an experiment and represents the number of cycles when the threshold is reached. ]
また、土壌中のGordonia属炭化水素分解菌の定量は、
i)対象土壌に含まれるDNAを抽出する工程と、
ii)このDNAを鋳型として、Gordonia属炭化水素分解菌検出用プライマーセットを用いて所定の条件でPCRを行い、増幅されたDNAを検出する工程と、
iii)検出した値を用いて、Gordonia属炭化水素分解菌の数を算出する工程と
を含む方法により、行うことができる。
In addition, the quantification of Gordonia genus hydrocarbon-degrading bacteria in soil is
i) a step of extracting DNA contained in the target soil;
ii) using this DNA as a template, performing PCR under predetermined conditions using a primer set for detecting a Gordonia genus hydrocarbon-degrading bacterium, and detecting the amplified DNA;
and iii) calculating the number of Gordonia genus hydrocarbon-degrading bacteria using the detected value.
工程ii）のPCRにおける条件は、適宜設定し、至適化することができるが、アニーリン
グ温度が61℃の条件とすることが好ましい。他の条件も適宜設定し得るが、通常、95℃・5〜10分の加熱後、95℃・15〜20秒、61℃・30〜60秒、72℃・45〜75秒の反応を30サイク
ル程度行う。
The conditions for PCR in step ii) can be appropriately set and optimized, but it is preferable that the annealing temperature is 61 ° C. Other conditions can be set as appropriate, but after heating at 95 ° C for 5 to 10 minutes, reaction at 95 ° C for 15 to 20 seconds, 61 ° C for 30 to 60 seconds, 72 ° C for 45 to 75 seconds is usually performed. Do about a cycle.
また、工程iii）においては、下記式により、土壌1 g当たりの炭化水素分解菌数を算出することができる。
Gordonia属炭化水素分解菌数（cells/g-sample）= （8×1017）×e（-0.9518×Ct値）
［式中、Ct値は実験より得られた値であり、閾値に到達したときのサイクル数（threshold cycle）を表す。］
In step iii), the number of hydrocarbon-decomposing bacteria per gram of soil can be calculated by the following formula.
Number of Gordonia hydrocarbon-degrading bacteria (cells / g-sample) = (8 × 10 17 ) × e (-0.9518 × Ct value)
[In the formula, the Ct value is a value obtained from an experiment and represents the number of cycles when the threshold is reached. ]
５．炭化水素分解菌の挙動解析方法
本発明は、更に、炭化水素分解菌の挙動を解析する方法を提供する。即ち、上記本発明のプライマーセット又はPCRキットを用いて、土壌中の炭化水素分解菌数の定量を経時的
に行い、菌数の変動をモニタリングして解析することにより、土壌中の炭化水素分解菌数の挙動を解析することができる。
5). Method for Analyzing Behavior of Hydrocarbon-Decomposing Bacteria The present invention further provides a method for analyzing the behavior of hydrocarbon-degrading bacteria. That is, by using the primer set or PCR kit of the present invention, the number of hydrocarbon-decomposing bacteria in the soil is determined over time, and the change in the number of bacteria is monitored and analyzed, thereby decomposing hydrocarbons in the soil. The behavior of the number of bacteria can be analyzed.
解析におけるモニタリングの方法は、特に限定されず、適宜公知の方法に従って行うことができる。例えば、炭化水素分解菌数を、更に換算させた値を用いてモニタリングしてもよい。また、適当なグラフ又は図等の表示手段を用いてモニタリングすることもできる
。
The method of monitoring in the analysis is not particularly limited, and can be performed according to a known method as appropriate. For example, the number of hydrocarbon-degrading bacteria may be monitored using a further converted value. Moreover, it can also monitor using display means, such as a suitable graph or a figure.
また、モニタリングは、炭化水素分解菌数に加えて、更に１又は複数の指標を用いて行うこともできる。 Monitoring can also be performed using one or more indicators in addition to the number of hydrocarbon-degrading bacteria.
本発明の挙動解析方法においては、更に、土壌中の総バクテリア数の挙動解析や、油分濃度の挙動解析を組み合わせることもできる。
土壌中の総バクテリア数の解析は、公知の方法に従って行うことができ、例えば、環境eDNA法や平板希釈法を用いて行うことができる。
In the behavior analysis method of the present invention, a behavior analysis of the total number of bacteria in the soil and a behavior analysis of the oil concentration can also be combined.
Analysis of the total number of bacteria in the soil can be performed according to a known method, for example, using an environmental eDNA method or a plate dilution method.
環境eDNA法は、対象土壌から採取した試料単位重量当りのDNA量に基づいて算出した値
を用いて、土壌中の総バクテリア数を算出する方法である。単位重量が１gの場合、その数は対象土壌（又は試料）単位重量あたりの数（cells/g-soil又はcells/g-sample）の単位で表すことができる。例えば、環境eDNA法において、土壌バクテリア数は、対象土壌から採取した試料の単位重量あたりのDNA量（eDNA量）
を、下記式により換算することによって求めることができる。
The environmental eDNA method is a method of calculating the total number of bacteria in soil using a value calculated based on the amount of DNA per unit weight of sample collected from the target soil. When the unit weight is 1 g, the number can be expressed in units of the number (cells / g-soil or cells / g-sample) per unit weight of the target soil (or sample). For example, in the environmental eDNA method, the number of soil bacteria is the amount of DNA (eDNA amount) per unit weight of a sample collected from the target soil.
Can be obtained by conversion according to the following equation.
バクテリア数（cells/g-sample）＝eDNA量（μg/ml）×1.7×108
また、油分濃度の解析も公知の方法に従って行うことができる。例えば、適当な抽出液を用いて対象土壌から油分を抽出し、ガスクロマトグラフィーや赤外分光分析を用いて測定することにより解析することができる。
Number of bacteria (cells / g-sample) = eDNA amount (μg / ml) × 1.7 × 10 8
The analysis of the oil concentration can also be performed according to a known method. For example, the oil can be extracted from the target soil using a suitable extract and analyzed by gas chromatography or infrared spectroscopic analysis.
本発明の挙動解析方法により、特定の炭化水素分解菌の増加や減少など、土壌中の炭化水素分解菌の動向の詳細を把握することができ、それに応じた追加処理を行うことにより、バイオレメディエーションを効率化することができる。特に効率的なバイオレメディエーションを行うためには、炭化水素分解菌の菌数を維持すること、更に、炭化水素分解菌を優先種とすることが重要であると考えられる。本発明の挙動解析方法を用いれば、炭化水素分解菌の菌数の維持及び優先種とするための処理に適当なタイミングを簡便に把握することができる。 By the behavior analysis method of the present invention, it is possible to grasp the details of the trends of hydrocarbon-degrading bacteria in the soil, such as the increase or decrease of specific hydrocarbon-degrading bacteria, and by performing additional treatments accordingly, bioremediation Can be made more efficient. In order to perform particularly efficient bioremediation, it is considered important to maintain the number of hydrocarbon-degrading bacteria and to make hydrocarbon-degrading bacteria a priority species. By using the behavior analysis method of the present invention, it is possible to easily grasp the appropriate timing for the maintenance of the number of hydrocarbon-degrading bacteria and the treatment for making it a preferred species.
またバイオオーグメンテーションは外来の微生物を大量に投与することから、生態系が大きく変化してしまう可能性があるが、本発明における挙動解析法は、投与菌株の土壌環境への影響を解析する上でも役立つと考えられる。 Bioaugmentation involves the administration of a large amount of foreign microorganisms, which can greatly change the ecosystem, but the behavior analysis method of the present invention analyzes the effect of the administered strain on the soil environment. It is thought that it is also useful above.
６．土壌浄化方法
本発明は、更に、高効率化された土壌の浄化方法を提供する。
6). Soil purification method The present invention further provides a highly efficient soil purification method.
本発明の土壌浄化方法は、
対象土壌に約1×108〜1×109 cells/g-soilの範囲で炭化水素分解菌を投与する工程と、
上記本発明の定量方法により得られた値を用いて、土壌中の炭化水素分解菌数の経時変化を解析する工程を含む。
The soil purification method of the present invention comprises:
Administering a hydrocarbon-degrading bacterium to the target soil in a range of about 1 × 10 8 to 1 × 10 9 cells / g-soil;
Using the value obtained by the quantification method of the present invention, a step of analyzing the time-dependent change in the number of hydrocarbon-decomposing bacteria in the soil is included.
例えば、
対象土壌に約1×108〜1×109 cells/g-soilの範囲で炭化水素分解菌を投与する工程と、
i)対象土壌に含まれるDNAを抽出・精製する工程と、
ii)このDNAを鋳型として、Rhodococcus属炭化水素分解菌検出用プライマーセット及び／
又はGordonia属炭化水素分解菌検出用プライマーセットを用いて、所定の条件でPCRを行
い、増幅されたDNAを検出する工程と、
iii)検出した値を用いて、Rhodococcus属及び／又はGordonia属炭化水素分解菌の数を算
出する工程と、
上記ｉ）〜iii）の工程を含む定量を設定時間毎に行い、得られた値により炭化水素分解
菌数の経時変化を解析する工程を含む方法が挙げられる。
For example,
Administering a hydrocarbon-degrading bacterium to the target soil in a range of about 1 × 10 8 to 1 × 10 9 cells / g-soil;
i) extracting and purifying DNA contained in the target soil;
ii) Using this DNA as a template, a primer set for detecting Rhodococcus hydrocarbon-degrading bacteria and / or
Or, using a primer set for detection of Gordonia genus hydrocarbon-degrading bacteria, performing PCR under predetermined conditions, and detecting amplified DNA;
iii) calculating the number of Rhodococcus genus and / or Gordonia genus hydrocarbon-degrading bacteria using the detected value;
There is a method including a step of performing quantitative determination including the above steps i) to iii) every set time and analyzing a change in the number of hydrocarbon-degrading bacteria over time based on the obtained value.
本発明の土壌浄化方法によれば、土壌中の炭化水素分解菌の動向を把握することができ、それに応じた追加処理を行うことで、バイオレメディエーションを効率化することができる。 According to the soil purification method of the present invention, the trend of hydrocarbon-degrading bacteria in the soil can be grasped, and bioremediation can be made more efficient by performing additional treatments accordingly.
追加処理としては、例えば、炭化水素分解菌の投与や、栄養分の投与、撹拌による通気などが考えられる。 As the additional treatment, for example, administration of hydrocarbon-degrading bacteria, administration of nutrients, aeration by stirring, and the like can be considered.
特に、効率的なバイオレメディエーションを行うためには、炭化水素分解菌を優先種とすることが重要と考えられる。上記方法により、炭化水素分解菌の動向を解析し、炭化水素分解菌を優先種となるように維持すること、例えば、一定期間後、炭化水素分解菌数の値が一定値以下となった場合に、炭化水素分解菌が過半数以上となるように追加投与して、炭化水素分解菌を優先種とすることにより、バイオレメディエーションを促進することができる。 In particular, in order to perform efficient bioremediation, it is considered important to use hydrocarbon-degrading bacteria as a priority species. Analyzing trends in hydrocarbon-degrading bacteria by the above method and maintaining hydrocarbon-degrading bacteria to be the preferred species, for example, when the number of hydrocarbon-degrading bacteria is below a certain value after a certain period of time In addition, bioremediation can be promoted by additionally administering the hydrocarbon-degrading bacterium so that it becomes a majority or more and making the hydrocarbon-degrading bacterium a preferred species.
具体的に、石油汚染土壌では、バクテリア数が1×109 cells/g-soil以下の土壌がほと
んどである。そのため、本発明の定量方法により投与した炭化水素分解菌の動向をモニタリングし、その菌数が一定値以下、例えば1×108cells/g-soil〜1×109 cells/g-soilの
範囲から設定される値或いは1億cells/g-sample台以下に低下したときに炭化水素分解菌
を追加投与するようにすることで、炭化水素分解菌が優先種である状態を維持でき、油分除去を効率よく促進させることができる。
Specifically, in oil-contaminated soil, most soils have a bacteria count of 1 × 10 9 cells / g-soil or less. Therefore, the trend of hydrocarbon-degrading bacteria administered by the quantification method of the present invention is monitored, and the number of bacteria is below a certain value, for example, a range of 1 × 10 8 cells / g-soil to 1 × 10 9 cells / g-soil It is possible to maintain a state where hydrocarbon-degrading bacteria are the preferred species and to remove oil by adding additional hydrocarbon-degrading bacteria when the value drops to below 100 million cells / g-sample Can be promoted efficiently.
この際、追加投与する炭化水素分解菌は、投与した炭化水素分解菌と同じ菌であってもよいが、異なる菌であることが好ましい。 At this time, the additional hydrocarbon-degrading bacterium may be the same as the administered hydrocarbon-degrading bacterium, but is preferably a different bacterium.
例えば、初期に、Rhodococcus属の炭化水素分解菌を投与し、当該菌株の挙動をモニタ
リングして、一定値以下に減少した場合に、Gordonia属の炭化水素分解菌を追加投与することが考えられる。また、初期にGordonia属の炭化水素分解菌を投与し、当該菌株の一定値以下に減少した場合に、Rhodococcus属の炭化水素分解菌を追加投与することが考えら
れる。
For example, it is conceivable that a hydrocarbon-degrading bacterium belonging to the genus Rhodococcus is administered at an early stage, and the behavior of the strain is monitored. In addition, when a hydrocarbon-degrading bacterium belonging to the genus Gordonia is administered in the initial stage and decreases to a certain value or less of the strain, it is possible to additionally administer a hydrocarbon-degrading bacterium belonging to the genus Rhodococcus.
特に、本発明では、Rhodococcus sp. NDKK6株とGordonia sp. NDKY76A株をそれぞれ定
量する技術を確立できたことから、これら炭化水素分解菌を組み合わせて投与することや異なる菌の追加処理によって挙動がどのように変化するかなどを解析し、より高効率なバイオレメディエーションを行うことができる。
In particular, in the present invention, the technology for quantifying the Rhodococcus sp. NDKK6 strain and the Gordonia sp. NDKY76A strain has been established, so it is possible to determine the behavior by administering these hydrocarbon-degrading bacteria in combination or by additional treatment with different bacteria. It is possible to perform more efficient bioremediation by analyzing how it changes.
更に、本発明の土壌浄化方法においては、土壌中の総バクテリア数の挙動解析や、油分濃度の挙動解析を組み合わせて行うことが好ましい。土壌バクテリア数からは、対象土壌における総合的なバクテリアの状況や土壌の特性を把握できると考えられる。一方、効率的なバイオレメディエーションを行うためには、炭化水素分解菌を優先種とすることが重要であると考えられる。そのため、土壌バクテリア数の解析に加えて、本発明で確立した炭化水素分解菌の挙動解析を行って、両者の相対的な関係を把握し、炭化水素分解菌が優先種となるような手段をとることで、バイオレメディエーションをより効率化させることができると考えられる。 Furthermore, in the soil purification method of the present invention, it is preferable to combine the behavior analysis of the total number of bacteria in the soil and the behavior analysis of the oil concentration. From the number of soil bacteria, it is considered that the overall bacteria situation and soil characteristics in the target soil can be grasped. On the other hand, in order to perform efficient bioremediation, it is considered important to use hydrocarbon-degrading bacteria as a priority species. Therefore, in addition to the analysis of the number of soil bacteria, the behavior analysis of the hydrocarbon-degrading bacteria established in the present invention is performed to grasp the relative relationship between the two, and a means for making the hydrocarbon-degrading bacteria the priority species. By taking it, it is considered that bioremediation can be made more efficient.
本発明においては、炭化水素分解菌を特異的に定量可能とする技術を確立した。本方法を用いることにより、バイオレメディエーション中の炭化水素分解菌の挙動を正確に把握することが可能となり、炭化水素分解菌の追加投与のタイミングや処理内容を適切に図ることができる。これにより、バイオレメディエーションの効率が格段に高まる。 In the present invention, a technique has been established that enables specific determination of hydrocarbon-degrading bacteria. By using this method, it is possible to accurately grasp the behavior of hydrocarbon-degrading bacteria during bioremediation, and it is possible to appropriately aim at the timing of the additional administration of the hydrocarbon-degrading bacteria and the processing content. This greatly increases the efficiency of bioremediation.
更に、本発明によれば、炭化水素分解菌数が減少する正確なタイミングを知ることができ、汚染土壌中で炭化水素分解菌を優先種とする方法が確立される。これにより、バイオレメディエーションを効率よく促進させることが可能となる。 Furthermore, according to the present invention, it is possible to know the exact timing when the number of hydrocarbon-degrading bacteria decreases, and a method is established in which hydrocarbon-degrading bacteria are the preferred species in contaminated soil. Thereby, it becomes possible to promote bioremediation efficiently.
更に、実用化するにあたっては、投与する炭化水素分解菌の安全性や環境への影響を解析しておく必要がある。その際、本発明で確立した炭化水素分解菌の定量方法は、投与する炭化水素分解菌の安全性や環境・生態系への影響の解析においても貢献できると考えられる。 Furthermore, before putting it into practical use, it is necessary to analyze the safety and environmental impact of the hydrocarbon-degrading bacteria to be administered. At that time, it is considered that the method for quantifying hydrocarbon-degrading bacteria established in the present invention can also contribute to the analysis of the safety of the administered hydrocarbon-degrading bacteria and the influence on the environment and ecosystem.
以下、本発明をより詳細に説明するために実施例及び比較例を用いて説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples and comparative examples, but the present invention is not limited to these examples.
１．使用菌株及び条件
1-1．使用菌株及び培養条件
菌株は、以下の表１に示す株を用いた。
1. Strains used and conditions
1-1. The strains shown in Table 1 below were used as the strains used and the culture conditions .
、120 rpmで振とう培養した。
And cultured with shaking at 120 rpm.
2．Rhodococcus 属炭化水素分解菌検出用プライマーセット及びそれを用いた定量方法
2-1．プライマーの設計
特異的な炭化水素分解菌挙動解析法の確立のために、炭化水素分解菌を特異的に検出可能とするプライマーの設計を検討した。
2． Primer set for detection of Rhodococcus genus hydrocarbon-degrading bacteria and quantification method using the same
2-1. Primer design In order to establish a method for analyzing the behavior of hydrocarbon-degrading bacteria, we designed a primer that can specifically detect hydrocarbon-degrading bacteria.
アルカンは一般的にアルコールへと酸化され、代謝される。この反応を触媒する酵素がアルカンヒドロキシラーゼ（以下、「alk」とも称する」）であり、石油分解菌特有の酵
素である。当該alk遺伝子を指標としてプライマーの設計を行った。設計したプライマー
の塩基配列を表２に示す。
Alkanes are generally oxidized to alcohol and metabolized. An enzyme that catalyzes this reaction is alkane hydroxylase (hereinafter also referred to as “alk”), which is an enzyme peculiar to petroleum decomposing bacteria. Primers were designed using the alk gene as an index. Table 2 shows the nucleotide sequences of the designed primers.
設計したプライマーがRhodococcus属炭化水素分解菌を特異的に増幅するかを確認する
ために以下の方法でReal-time PCRによる評価を行った。
2-2-1．ゲノムDNAの抽出
培養液1 mlを遠心（6,000 rpm、室温、3分）し、集菌した。上清を除去し、400μlの10:1 TE緩衝液（トリスヒドロキシメチルアミノメタン1.20（g/l）、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩（g/l）、pH 8.0）を加えて菌体を懸濁した。懸濁液に塩化リゾチー
ムを0.5 mg/mlになるように添加し、37℃で30分静置した。その後、10 ％ドデシル硫酸ナトリウム（以下SDS）溶液を40μl加えよく混ぜ、フェノール・クロロホルム・イソアミルアルコール混合液（体積比25：24：1）を400μl加えよく混合し、遠心（12,000 rpm、室
温、10分）した。上清を分取し、上清の1/10量の3 M酢酸ナトリウムと2.5倍量のエタノールを加え−20℃で20分静置した。静置後、遠心（12,000 rpm、4℃、10分）し、上清を除
去した。70 ％エタノール1 mlを加え、遠心（12,000 rpm、4℃、10分）した。上清を除去し、アスピレーターで吸引乾燥した。乾燥後、RNase溶液（リボヌクレアーゼAを10:1 TE
緩衝液に溶解し（25μg/ml）、100℃で15分間煮沸した溶液）を50μl加え37℃で30分静置した。これをDNA溶液とした。また、DNA溶液を希釈し吸光光度計（島津、京都）で吸光度（260 nm）を測定し（2-2-1）式を用いてDNA濃度を求めた。
A260×希釈率×50（μg/ml）＝DNA濃度（μg/ml）………………（2-2-1）式
2-2-1. 1 ml of the genomic DNA extraction culture solution was centrifuged (6,000 rpm, room temperature, 3 minutes) and collected. Remove the supernatant and add 400 μl of 10: 1 TE buffer (Trishydroxymethylaminomethane 1.20 (g / l), disodium ethylenediaminetetraacetate (g / l), pH 8.0) to suspend the cells. did. Lysozyme chloride was added to the suspension so that the concentration was 0.5 mg / ml, and the mixture was allowed to stand at 37 ° C. for 30 minutes. Then, add 40 μl of 10% sodium dodecyl sulfate (hereinafter SDS) solution and mix well, add 400 μl of phenol / chloroform / isoamyl alcohol mixture (volume ratio 25: 24: 1), mix well, and centrifuge (12,000 rpm, room temperature, 10 Min). The supernatant was collected, 1/10 volume of 3 M sodium acetate and 2.5 volumes of ethanol were added, and the mixture was allowed to stand at −20 ° C. for 20 minutes. After standing, it was centrifuged (12,000 rpm, 4 ° C., 10 minutes), and the supernatant was removed. 1 ml of 70% ethanol was added and centrifuged (12,000 rpm, 4 ° C., 10 minutes). The supernatant was removed and dried by suction with an aspirator. After drying, RNase solution (ribonuclease A in 10: 1 TE
50 μl of a solution dissolved in a buffer solution (25 μg / ml) and boiled at 100 ° C. for 15 minutes was added, and the mixture was allowed to stand at 37 ° C. for 30 minutes. This was used as a DNA solution. In addition, the DNA solution was diluted, and the absorbance (260 nm) was measured with an absorptiometer (Shimadzu, Kyoto) to determine the DNA concentration using the formula (2-2-1).
A 260 × dilution rate × 50 (μg / ml) = DNA concentration (μg / ml) ……………… (2-2-1) formula
2-2-2 Real-time PCR法
200μl容チューブに表３に示すReal-time PCR溶液を加え、Applied Biosystems 7300 Real Time System（アプライドバイオシステムズ、USA）にセットして、Real-time PCRを
行い、増幅曲線と解離曲線を確認した。PCRの反応条件は、95℃・5〜10分の加熱後、95℃・15〜20秒、60℃・30〜60秒、72℃・45〜75秒の反応を30サイクルとした。なおReal-time PCRに用いた試料のうち、KAPA SYBR、ROX highはKAPA SYBR qPCR kit（KAPA BIOSYSTEMS、大阪）のプロトコールに従って用いた。
2-2-2 Real-time PCR method
Real-time PCR solution shown in Table 3 was added to a 200 μl tube and set in Applied Biosystems 7300 Real Time System (Applied Biosystems, USA). Real-time PCR was performed, and amplification curves and dissociation curves were confirmed. PCR reaction conditions were 95 ° C for 5-10 minutes, 95 ° C for 15-20 seconds, 60 ° C for 30-60 seconds, 72 ° C for 45-75 seconds for 30 cycles. Of the samples used for real-time PCR, KAPA SYBR and ROX high were used according to the protocol of KAPA SYBR qPCR kit (KAPA BIOSYSTEMS, Osaka).
ガティブコントロールとしてのE. coli JM109株、及びDNAテンプレートなし（NT）についてReal-time PCRを行った。
プライマーセット１（alkB1プライマー）を用いた結果を図１に、プライマーセット２
（alkB2プライマー）を用いた結果を図２に示す。
The result of using primer set 1 (alkB1 primer) is shown in FIG.
The results using (alkB2 primer) are shown in FIG.
Rhodococcus sp. NDKK6株とGordonia sp. NDKY76A株は、同じ塩基配列のalk遺伝子を有しているため、alkBプライマーで両方の株が検出されることが予想された。しかし、図２に示すように、alkB2プライマーを用いた場合には、Rhodococcus sp. NDKK6株のみReal-time PCRによる増幅が確認された。一方、alkB1プライマーを用いた場合には、図１に示されるように、Rhodococcus sp. NDKK6株とGordonia sp. NDKY76A株の両方が検出された。 Since the Rhodococcus sp. NDKK6 strain and the Gordonia sp. NDKY76A strain have the alk gene having the same nucleotide sequence, both strains were expected to be detected with the alkB primer. However, as shown in FIG. 2, when the alkB2 primer was used, amplification by Real-time PCR was confirmed only for Rhodococcus sp. NDKK6 strain. On the other hand, when alkB1 primer was used, both Rhodococcus sp. NDKK6 strain and Gordonia sp. NDKY76A strain were detected as shown in FIG.
更に、alkB2プライマーを用いて、他のGordonia属炭化水素分解菌（YS3、YS5株）も同
様に確認した結果、増幅は確認されなかった。
Furthermore, as a result of confirming other Gordonia genus hydrocarbon-degrading bacteria (YS3 and YS5 strains) in the same manner using the alkB2 primer, amplification was not confirmed.
よって、alkB2プライマーを用いてRhodococcus sp. NDKK6株を特異的に検出できることが明らかとなった。 Therefore, it was revealed that Rhodococcus sp. NDKK6 strain can be specifically detected using alkB2 primer.
2-3．Rhodococcus sp. NDKK6株の菌数とCt値の検量線作成
バイオレメディエーション中の石油分解菌の菌数を定量するため、alkB2プライマーセ
ットを用いてReal-time PCRを行い、Rhodococcus sp. NDKK6株の菌数とCt値の検量線を作成した。 まず、Rhodococcus sp. NDKK6株の培養液を6.14×1011cells/g-sample〜6.14
×107 cells/g-sampleに段階希釈した。滅菌した土壌又は実汚染土壌に段階希釈した培養液100μlを植菌した。培養液のみ、又は培養液を植菌した各土壌からDNAを抽出・精製し
てReal-time PCRを行い、それぞれ信頼性の高い検量線が得られるかを確認した。様々な
細菌のDNAが抽出される未滅菌の土壌でも、解離曲線は一つのピークが得られた。また、
検量線のR2値も0.9以上と問題なく目的の遺伝子のみを定量できることが分かった。また
、検量線の傾きも滅菌土壌と未滅菌土壌でほぼ違いはなかった。これらの結果をまとめてRhodococcus sp. NDKK6株の菌数を定量するための検量線を作成した。
2-3. Preparation of calibration curves for the number of bacteria and Ct values of Rhodococcus sp. NDKK6 strain Real-time PCR using alkB2 primer set was performed to quantify the number of petroleum-degrading bacteria during bioremediation. A calibration curve of numbers and Ct values was created. First, a culture solution of Rhodococcus sp. NDKK6 strain was added to 6.14 × 10 11 cells / g-sample to 6.14.
Dilute serially to × 10 7 cells / g-sample. 100 μl of serially diluted culture solution was inoculated into sterilized soil or actual contaminated soil. DNA was extracted and purified from the culture solution alone or each soil inoculated with the culture solution, and Real-time PCR was performed to confirm whether a highly reliable calibration curve was obtained. One peak of the dissociation curve was obtained even in unsterilized soil from which various bacterial DNAs were extracted. Also,
The R 2 value of the calibration curve was 0.9 or more, indicating that only the target gene can be quantified without any problem. The slope of the calibration curve was almost the same between sterilized soil and non-sterile soil. By combining these results, a calibration curve was prepared to quantify the number of Rhodococcus sp. NDKK6 strains.
それぞれの条件をまとめた結果から、Y=（3E+16）×EXP（-0.7747×Ct値）というRhodococcus属炭化水素分解菌数（cells/g-sample）を定量するための式が得られた（図３）。 From the results of summarizing each condition, an equation for quantifying the number of Rhodococcus hydrocarbon-degrading bacteria (cells / g-sample) of Y = (3E + 16) x EXP (-0.7747 x Ct value) was obtained. (Figure 3).
また、Real-time PCRを用いたRhodococcus sp. NDKK6株の検出限界を調べた結果、106cells/g-sampleと105cells/g-sampleの増幅曲線には有意な差がなかったことから、検出限界は1×106cells/g-sampleに決定した。 Moreover, as a result of examining the detection limit of Rhodococcus sp. NDKK6 strain using Real-time PCR, there was no significant difference in the amplification curves of 10 6 cells / g-sample and 10 5 cells / g-sample. The detection limit was determined to be 1 × 10 6 cells / g-sample.
これにより、Real-time PCRを用いたRhodococcus属炭化水素分解菌の定量方法が確立された。 Thereby, the quantification method of the Rhodococcus genus hydrocarbon decomposing bacteria using Real-time PCR was established.
3 Gordonia sp. 炭化水素分解菌株検出用プライマーセット及びそれを用いた定量方法
3-1．プライマーの設計
Gordonia sp. 炭化水素分解菌について、alk遺伝子を指標としてプライマーの設計を行った。設計したプライマーの一例を表４に示す。
3 Primer set for detection of Gordonia sp. Hydrocarbon-degrading strain and quantification method using the same
3-1. Primer design
Primers were designed for Gordonia sp. Hydrocarbon-degrading bacteria using the alk gene as an index. An example of the designed primer is shown in Table 4.
設計したプライマーがGordonia sp. 炭化水素分解菌のalk遺伝子断片を特異的に増幅することを確認するために、上記2-2と同様の方法でReal-time PCRを行った。但し、PCRの
条件は適宜調整し、上記プライマーセット３（alkG2プライマー）の場合は、95℃・5〜10分の加熱後、95℃・15〜20秒、61℃・30〜60秒、72℃・45〜75秒の反応を30サイクル程度に設定した。
alkG2プライマーを用い、Gordonia sp. NDKY76A株、Rhodococcus sp. NDKK6株、ネガティブコントロールとしてのE. coli JM109株、及びDNAテンプレートなし（NT）についてReal-time PCRを行った結果を図４に示す。 FIG. 4 shows the results of real-time PCR using alkG2 primer for Gordonia sp. NDKY76A strain, Rhodococcus sp. NDKK6 strain, E. coli JM109 strain as a negative control, and no DNA template (NT).
その結果、Gordonia sp. NDKY76A株のみにReal-time PCRによる増幅曲線が確認された
。また、解離曲線も一つのピークが得られ、目的の配列のみを増幅していた。
As a result, an amplification curve by Real-time PCR was confirmed only for Gordonia sp. NDKY76A strain. In addition, one peak was obtained in the dissociation curve, and only the target sequence was amplified.
よって、上記alkG2プライマーセットを用いてGordonia sp. NDKY76A株を特異的に検出
できることが明らかとなった。
Therefore, it was revealed that Gordonia sp. NDKY76A strain can be specifically detected using the alkG2 primer set.
3-3．Gordonia sp. NDKY76A株の菌数とCt値の検量線作成
バイオレメディエーション中の石油分解菌の菌数を定量するため、alkG2プライマーを
用いてReal-time PCRを行い、Gordonia sp. NDKY76A株の菌数とCt値の検量線を作成した
。まず、Gordonia sp. NDKY76A株の培養液を2.43×1011cells/g-sample〜2.43×107 cells/g-sampleに段階希釈した。滅菌した土壌又は未滅菌土壌に、段階希釈した培養液100μlを植菌した。培養液のみ又はそれぞれの条件の土壌から抽出したDNAを用いてReal-time PCRを行い、それぞれ信頼性の高い検量線が得られるかを確認した。
3-3. Preparation of calibration curve for the number of bacteria and Ct value of Gordonia sp. NDKY76A strain To quantify the number of petroleum-degrading bacteria during bioremediation, real-time PCR was performed using alkG2 primer, and the number of bacteria of Gordonia sp. And a calibration curve of Ct value was made. First, the culture solution of Gordonia sp. NDKY76A strain was serially diluted from 2.43 × 10 11 cells / g-sample to 2.43 × 10 7 cells / g-sample. 100 μl of serially diluted culture solution was inoculated into sterilized soil or unsterilized soil. Real-time PCR was carried out using only the culture solution or DNA extracted from the soil under the respective conditions, and it was confirmed whether a highly reliable calibration curve could be obtained.
その結果、Gordonia sp. NDKY76A株の培養液のみと土壌に植菌したもの、又は石油で汚染されている土壌とされていない土壌で検量線の傾きがほぼ同じであることから、抽出効率などに違いはないことが分かった。また、どの条件でもR2値が0.9以上と信頼性の高い
結果が得られた。そこで、これらの結果をまとめてGordonia sp. NDKY76A株の菌数を定量するための検量線を作成した。
As a result, since the slope of the calibration curve is almost the same for the culture solution of Gordonia sp.NDKY76A strain and the one inoculated in the soil, or the soil that is not contaminated with petroleum, I found no difference. In all conditions, the R 2 value was 0.9 or more, and a highly reliable result was obtained. Therefore, a standard curve for quantifying the number of bacteria in Gordonia sp. NDKY76A was prepared by combining these results.
それぞれの条件をまとめた結果、Y=（8E+17）×EXP（-0.9518×Ct値）というGordonia
属炭化水素分解菌数（cells/g-sample）を定量するための式が得られた（図５）。
As a result of summarizing each condition, Gordonia Y = (8E + 17) x EXP (-0.9518 x Ct value)
An equation for quantifying the number of genus hydrocarbon-degrading bacteria (cells / g-sample) was obtained (FIG. 5).
また、検出限界は106 cells/g-sampleに決定した。また、Real-time PCRを用いたGordonia sp. NDKY76A株の検出限界を調べた結果、106 cells/g-sampleと105 cells/g-sample
の増幅曲線には有意な差がなかったことから、検出限界は106 cells/g-sampleに決定した。
The detection limit was determined to be 10 6 cells / g-sample. In addition, the detection limit of Gordonia sp. NDKY76A strain using Real-time PCR was examined. As a result, 10 6 cells / g-sample and 10 5 cells / g-sample
Since there was no significant difference in the amplification curve, the detection limit was determined to be 10 6 cells / g-sample.
これにより、Real-time PCRを用いたGordonia属炭化水素分解菌の定量方法が確立され
た。
This established a method for quantifying Gordonia genus hydrocarbon-degrading bacteria using Real-time PCR.
4. 炭化水素分解菌挙動解析法及びバイオレメディエーションへの応用
上記で確立したReal-time PCRを用いた炭化水素分解菌の定量方法で実際にバイオレメ
ディエーション中の炭化水素分解菌の挙動を解析できるか確認するために、実汚染土壌を用いて16日間実験を行った。実汚染土壌100 gに、Rhodococcus sp. NDKK6株を加えたもの（BR-1）とGordonia sp. NDKY76A株を加えたもの（BR-2）を作製し、さらに栄養源を5 %
（v/w）加えよく撹拌し、37℃で静置した。栄養源のみを5 %（v/w）加え同様の操作を行
ったもの（BS）を比較対象とした。
4. Analysis method of behavior of hydrocarbon-degrading bacteria and application to bioremediation Is it possible to analyze the behavior of hydrocarbon-degrading bacteria during bioremediation by the quantitative method of hydrocarbon-degrading bacteria using Real-time PCR established above? To confirm, an experiment was conducted for 16 days using actual contaminated soil. Prepare 100g of soil contaminated soil with Rhodococcus sp. NDKK6 strain (BR-1) and Gordonia sp. NDKY76A strain (BR-2) and add 5%
(V / w) was added and stirred well and allowed to stand at 37 ° C. A comparison was made with 5% (v / w) of the nutrient source and the same operation (BS).
4日ごとにIR法を用いて油分濃度を解析した。また、上記2及び3の定量方法を用いてRhodococcus sp. NDKK6株及びGordonia sp. NDKY76A株の菌数を経時的に解析し、その挙動を解析した。また平板希釈法を用いて総バクテリア数を解析した。 Oil concentration was analyzed every 4 days using IR method. In addition, the bacterial counts of Rhodococcus sp. NDKK6 strain and Gordonia sp. NDKY76A strain were analyzed over time using the quantification methods 2 and 3 described above, and their behavior was analyzed. The total bacterial count was analyzed using the plate dilution method.
4-1. IR法による油分濃度測定
油分濃度は、次のように測定した。土壌2 g、無水硫酸ナトリウム約0.4 g、シリカゲル約0.8 gを50 ml容共栓三角フラスコに採取しH997抽出液（堀場製作所、京都）を10 ml加
えた。マグネチックスターラーで1時間撹拌した。撹拌後抽出液をろ過し、これを油分抽
出サンプルとした。
4-1. Oil concentration measurement by IR method The oil concentration was measured as follows. 2 g of soil, about 0.4 g of anhydrous sodium sulfate, and about 0.8 g of silica gel were collected in a 50 ml stoppered conical flask and 10 ml of H997 extract (Horiba, Kyoto) was added. The mixture was stirred with a magnetic stirrer for 1 hour. After stirring, the extract was filtered and used as an oil extraction sample.
得られた油分抽出サンプルを油分濃度計の測定範囲に入るように、適宜希釈した。ろ液約6.5 mlを吸収セルに入れ油分濃度計（OCMA-350、堀場製作所、東京）を用いて測定を行った。下記式により測定値を油分濃度に換算した。 The obtained oil extract sample was appropriately diluted so as to fall within the measurement range of the oil concentration meter. About 6.5 ml of the filtrate was placed in an absorption cell and measured using an oil concentration meter (OCMA-350, Horiba, Tokyo). The measured value was converted into the oil concentration by the following formula.
総バクテリア数は、次のように測定した。土壌0.1 gに滅菌した生理食塩水1 mlを加え
土壌懸濁液を作製した。土壌懸濁液を滅菌した生理食塩水で段階希釈し、希釈液100μlをLB寒天プレートに塗布し、30℃で静置培養した。コロニーが形成した後、コロニー数を計測し、希釈率を乗ずることによって培養液中の菌数を算出した。
実汚染土壌を用いた実験結果を図６に示す。図６Ａに油分濃度の経時変化を、図６Ｂに炭化水素分解菌数の経時変化を、図６Ｃに総バクテリア数の経時変化を示す。 The experimental results using the actual contaminated soil are shown in FIG. FIG. 6A shows the change over time in the oil concentration, FIG. 6B shows the change over time in the number of hydrocarbon-decomposing bacteria, and FIG. 6C shows the change over time in the total number of bacteria.
上記のように炭化水素分解菌数と総バクテリア数を計測した結果、炭化水素分解菌数は徐々に減少するのに対し、総バクテリア数は増加傾向にあった。このことから、炭化水素分解菌数と総バクテリア数は対応しておらず、炭化水素分解菌の挙動を解析することの重要性が明らかになった。 As a result of measuring the number of hydrocarbon-decomposing bacteria and the total number of bacteria as described above, the number of hydrocarbon-degrading bacteria gradually decreased, whereas the total number of bacteria tended to increase. From this, the number of hydrocarbon-degrading bacteria and the total number of bacteria did not correspond, and the importance of analyzing the behavior of hydrocarbon-degrading bacteria became clear.
また、栄養塩のみを投与したBS条件よりも、炭化水素分解菌を添加したいずれの条件でも油分濃度の減少割合は大きくなったことから、炭化水素分解菌が投与後に一定期間優先種となることで浄化効率が促進することが示唆された。炭化水素分解菌を優先種とするように投与することでバイオレメディエーションの効率化が期待できることが示唆された。 In addition, since the rate of decrease in oil concentration was greater in any condition with hydrocarbon-degrading bacteria added than in BS conditions in which only nutrient salts were administered, hydrocarbon-degrading bacteria would become the preferred species for a certain period after administration. This suggests that the purification efficiency is promoted. It was suggested that the bioremediation efficiency can be expected by administering the hydrocarbon-degrading bacteria to be the preferred species.
Claims (8)
配列表の配列番号２の塩基配列で表されるプライマー
からなるロドコッカス（Rhodococcus）属に属する炭化水素分解菌検出用プライマーセッ
ト。 A primer set for detecting a hydrocarbon-degrading bacterium belonging to the genus Rhodococcus comprising a primer represented by the base sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing and a primer represented by the base sequence of SEQ ID NO: 2 of the sequence listing.
配列表の配列番号４の塩基配列で表されるプライマー
からなるゴルドニア（Gordonia）属に属する炭化水素分解菌検出用プライマーセット。 A primer set for detecting a hydrocarbon-degrading bacterium belonging to the genus Gordonia, comprising a primer represented by the base sequence of SEQ ID NO: 3 in the sequence listing and a primer represented by the base sequence of SEQ ID NO: 4 of the sequence listing.
ii)このDNAを鋳型として、請求項１に記載のプライマーセットを用いてPCRを行い、増幅
されたDNAを検出する工程と、
iii)検出した値を用いて、炭化水素分解菌数を算出する工程
を含むことを特徴とする土壌中の炭化水素分解菌の定量方法。 i) extracting and purifying DNA contained in the target soil;
ii) using this DNA as a template, performing PCR using the primer set according to claim 1, and detecting the amplified DNA;
iii) A method for quantifying hydrocarbon-degrading bacteria in soil, comprising a step of calculating the number of hydrocarbon-degrading bacteria using the detected value.
ii)このDNAを鋳型として、請求項２に記載のプライマーセットを用いてPCRを行い、増幅
されたDNAを検出する工程と、
iii)検出した値を用いて、炭化水素分解菌数を算出する工程
を含むことを特徴とする土壌中の炭化水素分解菌の定量方法。 i) a step of extracting DNA contained in the target soil;
ii) using this DNA as a template, performing PCR using the primer set according to claim 2, and detecting the amplified DNA;
iii) A method for quantifying hydrocarbon-degrading bacteria in soil, comprising a step of calculating the number of hydrocarbon-degrading bacteria using the detected value.
請求項４又は５に記載の定量方法により得られた値を用いて、土壌中の炭化水素分解菌数の経時変化を解析する工程
を含むことを特徴とする土壌浄化方法。 A step of administering hydrocarbon-degrading bacteria to the target soil in the range of 1 × 10 8 to 1 × 10 9 cells / g-soil;
A soil remediation method comprising a step of analyzing a time-dependent change in the number of hydrocarbon-decomposing bacteria in the soil using the value obtained by the quantification method according to claim 4 or 5.
を含むことを特徴とする請求項７に記載の土壌浄化方法。
The method further comprises a step of additionally administering a hydrocarbon-decomposing bacterium that is the same as or different from the administered hydrocarbon-decomposing bacterium when the number of administered hydrocarbon-degrading bacterium becomes a predetermined value or less. The soil purification method as described.
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