JP6067232B2 - Method for producing retinal layer-specific neurons - Google Patents
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Description
本発明は、網膜層特異的神経細胞を製造する方法等に関するものである。 The present invention relates to a method for producing retinal layer-specific nerve cells and the like.
これまでに、網膜組織を構成する網膜層特異的神経細胞（視細胞、水平細胞、アマクリン細胞、神経節細胞など）を多能性幹細胞から製造する報告が知られている（特許文献１）。 So far, there has been known a report of producing retinal layer-specific nerve cells (visual cells, horizontal cells, amacrine cells, ganglion cells, etc.) constituting retinal tissues from pluripotent stem cells (Patent Document 1).
ヒト多能性幹細胞由来網膜層特異的神経細胞を化学物質の毒性や薬効評価スクリーニングなどに産業利用するためには、さらに高効率に網膜層特異的神経細胞を製造することが切望されていた。 In order to industrially utilize human pluripotent stem cell-derived retinal layer-specific neurons for screening of chemical toxicity and drug efficacy, it has been desired to produce retinal layer-specific neurons more efficiently.
本発明者らは、このような状況を鑑み鋭意検討した結果、本発明に至った。
即ち、本発明は
［１］ 霊長類多能性幹細胞由来の網膜組織に含まれる網膜前駆細胞に、Notchシグナル経路阻害物質を接触させることを特徴とする網膜層特異的神経細胞の製造方法。
［２］ 前記Notchシグナル経路阻害物質が、ガンマセクレターゼ活性阻害物質であることを特徴とする前項［１］記載の網膜層特異的神経細胞の製造方法。
［３］ 前記Notchシグナル経路阻害物質が、Ｎ−［Ｎ−（３，５−ジフルオロフェンアセチル）−Ｌ−アラニル］−Ｓ−フェニルグリシン ｔ−ブチルエステル（以下、「ＤＡＰＴ」という場合がある）であることを特徴とする前項［１］又は［２］記載の網膜層特異的神経細胞の製造方法。
［４］ 前記霊長類が、ヒトであることを特徴とする前項［１］〜［３］のいずれか記載の網膜層特異的神経細胞の製造方法。
［５］ 網膜層特異的神経細胞が視細胞であることを特徴とする前項［１］〜［４］のいずれか記載の網膜層特異的神経細胞の製造方法。
［６］ 網膜層特異的神経細胞が神経節細胞であることを特徴とする前項［１］〜［４］のいずれか記載の網膜層特異的神経細胞の製造方法。
［７］ 霊長類多能性幹細胞由来の網膜組織に含まれる網膜前駆細胞が、以下の工程で製造された網膜組織に含まれる網膜前駆細胞であることを特徴とする前項［１］〜［６］のいずれか記載の網膜層特異的神経細胞の製造方法。
（１）霊長類多能性幹細胞を、Wntシグナル経路阻害物質を含む無血清培地中で浮遊培養することにより霊長類多能性幹細胞の凝集体を形成させる第一工程
（２）第一工程で形成された凝集体を、基底膜標品を含む無血清培地中で浮遊培養する第二工程
（３）第二工程で培養された凝集体を、血清培地中で浮遊培養する第三工程および
（４）第三工程で培養された凝集体を、ソニック・ヘッジホッグ（以下、「Ｓｈｈ」という場合がある）シグナル経路作用物質とWntシグナル経路作用物質とを含む無血清培地中又は血清培地中で浮遊培養することにより、眼杯様構造体を形成させる第四工程
（５）第四工程で形成された眼杯様構造体を、浮遊培養する工程
［８］ 前項［１］〜［７］のいずれか記載の製造方法により製造される網膜層特異的神経細胞の毒性・薬効評価用試薬としての使用。
［９］ 前項［１］〜［７］のいずれか記載の製造方法により製造される網膜層特異的神経細胞の移植用生体材料としての使用。
As a result of intensive studies in view of such a situation, the present inventors have reached the present invention.
That is, the present invention is [1] A method for producing a retinal layer-specific nerve cell, which comprises contacting a retinal progenitor cell contained in a retinal tissue derived from a primate pluripotent stem cell with a Notch signal pathway inhibitor.
[2] The method for producing a retinal layer-specific nerve cell according to [1], wherein the Notch signal pathway inhibitor is a gamma secretase activity inhibitor.
[3] The Notch signaling pathway inhibitor is N- [N- (3,5-difluorophenacetyl) -L-alanyl] -S-phenylglycine t-butyl ester (hereinafter sometimes referred to as “DAPT”). The method for producing a retinal layer-specific nerve cell according to [1] or [2] above, wherein
[4] The method for producing retinal layer-specific nerve cells according to any one of [1] to [3] above, wherein the primate is a human.
[5] The method for producing a retinal layer-specific nerve cell according to any one of [1] to [4], wherein the retinal layer-specific nerve cell is a photoreceptor cell.
[6] The method for producing a retinal layer-specific nerve cell according to any one of [1] to [4], wherein the retinal layer-specific nerve cell is a ganglion cell.
[7] The above [1] to [6], wherein the retinal progenitor cells contained in the retinal tissue derived from primate pluripotent stem cells are retinal progenitor cells contained in the retinal tissue produced by the following steps. ] The manufacturing method of the retinal layer specific nerve cell in any one of.
(1) First step of forming primate pluripotent stem cell aggregates by suspension culture of primate pluripotent stem cells in a serum-free medium containing a Wnt signal pathway inhibitor (2) In the first step Second step of culturing the formed aggregate in a serum-free medium containing a basement membrane preparation (3) Third step of culturing the aggregate cultured in the second step in a serum medium and ( 4) The aggregate cultured in the third step is in a serum-free medium or serum medium containing a sonic hedgehog (hereinafter sometimes referred to as “Shh”) signal pathway agonist and a Wnt signal pathway agonist. The fourth step (5) of forming the eyecup-like structure by suspension culture [5] The step of subjecting the eyecup-like structure formed in the fourth step to suspension culture [8] The above [1] to [7] Retinal layer-specific nerve produced by any of the production methods Use as a reagent for cell toxicity / drug efficacy evaluation.
[9] Use of a retinal layer-specific nerve cell produced by the production method according to any one of [1] to [7] as a biomaterial for transplantation.
本発明製造方法によれば、霊長類多能性幹細胞由来網膜組織から高効率に網膜層特異的神経細胞を製造することが可能である。従って、本発明製造方法は、培養細胞を用いた化学物質等の毒性・薬効評価スクリーニングや細胞治療などを目的として、網膜層特異的神経細胞（視細胞、神経節細胞など）を効率よく製造するという観点から非常に有用である。 According to the production method of the present invention, it is possible to efficiently produce retinal layer-specific neurons from primate pluripotent stem cell-derived retinal tissue. Therefore, the production method of the present invention efficiently produces retinal layer-specific nerve cells (visual cells, ganglion cells, etc.) for the purpose of screening for toxicity and drug efficacy evaluation of chemical substances etc. using cultured cells and cell therapy. It is very useful from the viewpoint of.
以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。 Hereinafter, embodiments for carrying out the present invention will be described in detail.
本発明における「ベクター」とは、目的のポリヌクレオチド配列を目的の細胞へと移入させることができるベクターを意味する。このようなベクターとしては、例えば、原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物個体及び植物個体等の宿主細胞において自立複製が可能であり、又は、染色体中への組込みが可能である、ポリヌクレオチドの転写に適した位置にプロモーターを含有しているもの等を挙げることができる。
このようなベクターのうち、クローニングに適したベクターを「クローニングベクター」と記すこともある。このようなクローニングベクターは、通常、制限酵素部位を複数含むマルチプルクローニング部位を含む。現在、遺伝子のクローニングに使用可能なベクターは、当該技術分野において多数存在しており、販売元により、微妙な違い（例えば、マルチクローニングサイトの制限酵素の種類や配列）から名前を代えて販売されている。例えば、「Molecular Cloning（3rd edition）」 by Sambrook, J and Russell, D.W., Appendix 3 (Volume 3)， Vectors and Bacterial strains. A3.2 (Cold Spring Harbor USA, 2001)） に代表的なものが記載（発売元も記載）されており、このようなものを当業者は適宜目的に応じて使用することができる。
The “vector” in the present invention means a vector capable of transferring a target polynucleotide sequence to a target cell. Examples of such vectors include autonomous replication in host cells such as prokaryotic cells, yeast, animal cells, plant cells, insect cells, individual animals and individual plants, or integration into chromosomes. Examples thereof include those containing a promoter at a position suitable for polynucleotide transcription.
Among such vectors, a vector suitable for cloning may be referred to as a “cloning vector”. Such cloning vectors usually contain multiple cloning sites containing multiple restriction enzyme sites. At present, there are a large number of vectors that can be used for gene cloning in the technical field, and they are sold by vendors with different names (for example, types and sequences of restriction enzymes at multiple cloning sites). ing. For example, “Molecular Cloning (3rd edition)” by Sambrook, J and Russell, DW, Appendix 3 (Volume 3), Vectors and Bacterial strains. A3.2 (Cold Spring Harbor USA, 2001)) (The seller is also described), and those skilled in the art can appropriately use these according to the purpose.
本発明における「ベクター」は、「発現ベクター」、「レポーターベクター」、「組換えベクター」も含む。尚、「発現ベクター」とは、構造遺伝子及びその発現を調節するプロモーターに加えて種々の調節エレメントが宿主細胞の中で作動し得る状態で連結されている核酸配列を意味する。「調節エレメント」としては、例えば、ターミネーター、薬剤耐性遺伝子のような選択マーカー、及び、エンハンサーを含むもの等を挙げることができる。生物（例えば、動物）の発現ベクターのタイプ及び使用される調節エレメントの種類が宿主細胞に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。 The “vector” in the present invention also includes “expression vector”, “reporter vector”, and “recombinant vector”. The “expression vector” means a nucleic acid sequence in which various regulatory elements are operably linked in a host cell in addition to a structural gene and a promoter that regulates its expression. Examples of the “regulatory element” include those containing a terminator, a selection marker such as a drug resistance gene, and an enhancer. It is well known to those skilled in the art that the type of expression vector of an organism (eg, animal) and the type of regulatory element used can vary depending on the host cell.
本発明における「組換えベクター」としては、例えば、（ａ）ゲノムライブラリーのスクリーニングのためには、ラムダFIXベクター（ファージベクター）、（ｂ）cDNAのスクリーニングのためには、ラムダZAPベクター（ファージベクター）、（ｃ）ゲノムＤＮＡのクローニングするためには、例えば、pBluescript II SK＋/−, pGEM，pCR2.1ベクター（プラスミドベクター）等を挙げることができる。また「発現ベクター」としては、例えば、pSV2/neoベクター、pcDNAベクター、pUC18ベクター、pUC19ベクター、pRc/RSVベクター、pLenti6/V5-Destベクター、pAd/CMV/V5-DESTベクター、pDON-AI-2/neoベクター、pMEI-5/neoベクター等（プラスミドベクター）等を挙げることができる。また「レポーターベクター」としては、例えば、pGL2ベクター、pGL3ベクター、pGL4.10ベクター、pGL4.11ベクター、pGL4.12ベクター、pGL4.70ベクター、pGL4.71ベクター、pGL4.72ベクター、pSLGベクター、pSLOベクター、pSLRベクター、pEGFPベクター、pAcGFPベクター、pDsRedベクター等を挙げることができる。このようなベクターは、前述のMolecular Cloning誌を参考にして適宜利用すればよい。 The “recombinant vector” in the present invention includes, for example, (a) a lambda FIX vector (phage vector) for screening a genomic library, and (b) a lambda ZAP vector (phage for screening cDNA). For example, pBluescript II SK +/−, pGEM, pCR2.1 vector (plasmid vector) and the like can be used for cloning genomic DNA. Examples of the “expression vector” include pSV2 / neo vector, pcDNA vector, pUC18 vector, pUC19 vector, pRc / RSV vector, pLenti6 / V5-Dest vector, pAd / CMV / V5-DEST vector, pDON-AI-2 / neo vector, pMEI-5 / neo vector, etc. (plasmid vector). Examples of the “reporter vector” include pGL2 vector, pGL3 vector, pGL4.10 vector, pGL4.11 vector, pGL4.12 vector, pGL4.70 vector, pGL4.71 vector, pGL4.72 vector, pSLG vector, pSLO. Examples include vectors, pSLR vectors, pEGFP vectors, pAcGFP vectors, pDsRed vectors, and the like. Such a vector may be appropriately used with reference to the aforementioned Molecular Cloning magazine.
本発明における核酸分子を細胞内に導入する技術としては、例えば、形質転換、形質導入、トランスフェクション等を挙げることができる。このような導入技術としては、具体的には例えば、Ausubel F. A.ら編（１９８８）、Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, New York, NY; Sambrook J.ら（１９８７）Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed.及びその第三版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７等に記載される方法等を挙げることができる。遺伝子が細胞内に導入されたことを確認する技術としては、例えば、ノーザンブロット分析、ウェスタンブロット分析又は他の周知慣用技術等を挙げることができる。 Examples of techniques for introducing a nucleic acid molecule in the present invention into cells include transformation, transduction, transfection, and the like. Specific examples of such introduction techniques include Ausubel FA et al. (1988), Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, New York, NY; Sambrook J. et al. (1987) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd. Examples include Ed. And its third edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, a separate volume of experimental medicine “Gene Transfer & Expression Analysis Experimental Method”, Yodosha, 1997, and the like. Examples of the technique for confirming that the gene has been introduced into the cell include Northern blot analysis, Western blot analysis, and other well-known conventional techniques.
本発明における「幹細胞」とは、細胞分裂を経ても同じ分化能を維持する細胞のことであり、組織が傷害を受けたときにその組織を再生することができる。ここで幹細胞は、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）又は組織幹細胞（組織性幹細胞、組織特異的幹細胞又は体性幹細胞ともいう）、又は人工多能性幹細胞（iPS細胞：induced pluripotent stem cell細胞）であり得るがそれらに限定されない。上記の幹細胞由来の組織細胞は組織再生が可能なことから分かるように生体に近い正常な細胞を分化できることが知られている。 The “stem cell” in the present invention is a cell that maintains the same differentiation ability even after cell division, and can regenerate the tissue when the tissue is damaged. Here, the stem cells are embryonic stem cells (ES cells) or tissue stem cells (also referred to as tissue stem cells, tissue-specific stem cells or somatic stem cells) or induced pluripotent stem cells (iPS cells: induced pluripotent stem cell cells). But you are not limited to them. It is known that the above stem cell-derived tissue cells can differentiate normal cells close to a living body, as can be seen from the fact that tissue regeneration is possible.
幹細胞は、所定の機関より入手でき、また、市販品を購入することもできる。例えば、ヒト胚性幹細胞であるＫｈＥＳ−１、ＫｈＥＳ−２及びＫｈＥＳ−３は、京都大学再生医科学研究所より入手可能である。マウス胚性幹細胞であるＥＢ５細胞は、独立行政法人理化学研究所より、Ｄ３株は、ＡＴＣＣより入手可能である。 Stem cells can be obtained from a predetermined institution, and commercially available products can also be purchased. For example, human embryonic stem cells KhES-1, KhES-2, and KhES-3 are available from the Institute of Regenerative Medicine, Kyoto University. EB5 cells, which are mouse embryonic stem cells, are available from RIKEN, and the D3 strain is available from ATCC.
幹細胞は、自体公知の方法により維持培養できる。例えば、幹細胞は、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、ＫｎｏｃｋｏｕｔＴＭ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅconfidential- 11 -ｎｔ（ＫＳＲ）、ＬＩＦを添加した無フィーダー細胞による培養により維持できる。 Stem cells can be maintained and cultured by a method known per se. For example, stem cells can be maintained by culturing with feeder-free cells supplemented with fetal calf serum (FCS), Knockout ™ Serum Replaceable Confidential-11-nt (KSR), LIF.
本発明における「多能性幹細胞」とは、インビトロにおいて培養することが可能で、かつ、胎盤を除く生体を構成するすべての細胞（三胚葉（外胚葉、中胚葉、内胚葉）由来の組織）に分化しうる能力（分化万能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ））を有する幹細胞をいい、胚性幹細胞（ES細胞）もこれに含まれる。「多能性幹細胞」は、受精卵、クローン胚、生殖幹細胞、組織内幹細胞から得られる。また、体細胞に数種類の遺伝子を導入することにより、胚性幹細胞に似た分化万能性を人工的に持たせた細胞（人工多能性幹細胞ともいう）も含む。多能性幹細胞は、自体公知の方法で作成することが可能である。作成方法としては、例えばＣｅｌｌ １３１（５）ｐｐ．８６１−８７２や、Ｃｅｌｌ １２６（４）ｐｐ．６６３−６７６に記載の方法などが挙げられる。 The “pluripotent stem cell” in the present invention can be cultured in vitro and all cells constituting the living body excluding the placenta (tissues derived from the three germ layers (ectoderm, mesoderm, endoderm)) Stem cells having the ability to differentiate into (pluripotency), including embryonic stem cells (ES cells). A “pluripotent stem cell” is obtained from a fertilized egg, a cloned embryo, a germ stem cell, or a stem cell in tissue. It also includes cells (also referred to as induced pluripotent stem cells) that have been artificially provided with pluripotency similar to embryonic stem cells by introducing several types of genes into somatic cells. Pluripotent stem cells can be prepared by a method known per se. For example, Cell 131 (5) pp. 861-872, Cell 126 (4) pp. The method of 663-676 is mentioned.
本発明における「胚性幹細胞（ES細胞）」とは、自己複製能を有し、多分化能（すなわち多能性「pluripotency」）を有する幹細胞であり、初期胚に由来する多能性幹細胞をいう。胚性幹細胞は、１９８１年に初めて樹立され、１９８９年以降ノックアウトマウス作製にも応用されている。１９９８年にはヒト胚性幹細胞が樹立されており、再生医学にも利用されつつある。 The “embryonic stem cell (ES cell)” in the present invention is a stem cell having self-renewal ability and pluripotency (ie, pluripotency “pluripotency”), and a pluripotent stem cell derived from an early embryo Say. Embryonic stem cells were first established in 1981, and have been applied since 1989 to the production of knockout mice. In 1998, human embryonic stem cells were established and are being used in regenerative medicine.
本発明における「人工多能性幹細胞」とは、繊維芽細胞等分化した細胞をOct3/4、Sox2、Klf4、Myc等数種類の遺伝子の発現により直接初期化して多分化能を誘導した細胞であり、2006年、山中らによりマウス細胞で樹立された（Takahashi K, Yamanaka S.Cell. 2006, 126(4), p663-676）。2007年、ヒト繊維芽細胞でも樹立され、胚性幹細胞と同様に多分化能を有する（Takahashi K, Tanabe K, Ohnuki M, Narita M, Ichisaka T, Tomoda K, Yamanaka S. Cell.2007, 131(5),p861-872. 、Yu J, Vodyanik MA, Smuga-Otto K, Antosiewicz-Bourget J, Frane JL, Tian S, Nie J, Jonsdottir GA, Ruotti V, Stewart R, Slukvin II, Thomson JA.,Science. 2007, 318(5858), p1917-1920. 、Nakagawa M, Koyanagi M, Tanabe K, Takahashi K, Ichisaka T, Aoi T, Okita K, Mochiduki Y, Takizawa N, Yamanaka S. Nat Biotechnol., 2008, 26(1), p101-106）。 The “artificial pluripotent stem cell” in the present invention is a cell in which differentiated cells such as fibroblasts are directly initialized by expression of several types of genes such as Oct3 / 4, Sox2, Klf4, Myc, etc. to induce pluripotency. In 2006, it was established with mouse cells by Yamanaka et al. (Takahashi K, Yamanaka S. Cell. 2006, 126 (4), p663-676). Established in human fibroblasts in 2007, it has pluripotency similar to embryonic stem cells (Takahashi K, Tanabe K, Ohnuki M, Narita M, Ichisaka T, Tomoda K, Yamanaka S. Cell. 2007, 131 ( 5), p861-872.Yu J, Vodyanik MA, Smuga-Otto K, Antosiewicz-Bourget J, Frane JL, Tian S, Nie J, Jonsdottir GA, Ruotti V, Stewart R, Slukvin II, Thomson JA., Science 2007, 318 (5858), p1917-1920., Nakagawa M, Koyanagi M, Tanabe K, Takahashi K, Ichisaka T, Aoi T, Okita K, Mochiduki Y, Takizawa N, Yamanaka S. Nat Biotechnol., 2008, 26 (1), p101-106).
遺伝子改変した多能性幹細胞は、例えば、相同組換え技術を用いることにより作製できる。改変多能性幹細胞の作製に際して改変される染色体上の遺伝子としては、例えば、組織適合性抗原の遺伝子、神経系細胞の障害に基づく疾患関連遺伝子などがあげられる。染色体上の標的遺伝子の改変は、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９４）；Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９３）；バイオマニュアルシリーズ８ジーンターゲッティング，ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製，羊土社（１９９５）等に記載の方法を用い、行うことができる。 Genetically modified pluripotent stem cells can be prepared, for example, by using homologous recombination techniques. Examples of the chromosomal gene that is modified when the modified pluripotent stem cell is prepared include a histocompatibility antigen gene, a disease-related gene based on a neuronal cell disorder, and the like. Modification of the target gene on the chromosome is the following: Manipulating the Mouse Embryo A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1994); Gene Targeting, A Practicing. Gene targeting, production of mutant mice using ES cells, methods described in Yodosha (1995) and the like can be used.
具体的には、例えば、改変する標的遺伝子（例えば、組織適合性抗原の遺伝子や疾患関連遺伝子など）のゲノム遺伝子を単離し、単離したゲノム遺伝子を用いて標的遺伝子を相同組換えするためのターゲットベクターを作製する。作製したターゲットベクターを幹細胞に導入し、標的遺伝子とターゲットベクターの間で相同組換えを起こした細胞を選択することにより、染色体上の遺伝子を改変した幹細胞を作製することができる。 Specifically, for example, for isolating a genomic gene of a target gene to be modified (for example, a histocompatibility antigen gene or a disease-related gene), and homologous recombination of the target gene using the isolated genomic gene Create a target vector. By introducing the prepared target vector into a stem cell and selecting a cell that has undergone homologous recombination between the target gene and the target vector, a stem cell with a modified gene on the chromosome can be prepared.
標的遺伝子のゲノム遺伝子を単離する方法としては、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）やＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）等に記載された公知の方法があげられる。また、ゲノムＤＮＡライブラリースクリーニングシステム（Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ製）やＵｎｉｖｅｒｓａｌ ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒＴＭＫｉｔｓ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ製）などを用いることにより、標的遺伝子のゲノム遺伝子を単離することができる。 As a method for isolating a genomic gene of a target gene, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), Current Protocols in Molecular 7 in BioJ. Known methods. In addition, the genomic gene of the target gene can be isolated by using a genomic DNA library screening system (manufactured by Genome Systems) or Universal Genome WalkerTM Kits (manufactured by CLONTECH).
標的遺伝子を相同組換えするためのターゲットベクターの作製、及び相同組換え体の効率的な選別は、Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９３）；バイオマニュアルシリーズ８ジーンターゲッティング，ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製，羊土社（１９９５）等に記載の方法にしたがって作製することができる。なお、ターゲットベクターは、リプレースメント型、インサーション型いずれでも用いることができ、また、選別方法としては、ポジティブ選択、プロモーター選択、ネガティブ選択、ポリＡ選択などの方法を用いることができる。 Generation of target vectors for homologous recombination of target genes and efficient selection of homologous recombinants are described in Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993); Biomanual Series 8 Gene Targeting, A mutant mouse using ES cells can be prepared according to the method described in Yodosha (1995). The target vector can be either a replacement type or an insertion type, and as a selection method, methods such as positive selection, promoter selection, negative selection, and poly A selection can be used.
選別した細胞株の中から目的とする相同組換え体を選択する方法としては、ゲノムＤＮＡに対するサザンハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法等があげられる。 Examples of a method for selecting a target homologous recombinant from the selected cell lines include Southern hybridization method and PCR method for genomic DNA.
本発明における「組織」とは、形態や性質が異なる複数種類の細胞が一定のパターンで立体的に配置した構造を有する細胞集団の構造体をさす。 The “tissue” in the present invention refers to a structure of a cell population having a structure in which a plurality of types of cells having different shapes and properties are three-dimensionally arranged in a certain pattern.
本発明における「網膜組織」とは生体網膜において各網膜層を構成する視細胞、水平細胞、双極細胞、アマクリン細胞、網膜節細胞、これらの前駆細胞または網膜前駆細胞などの細胞が、少なくとも複数種類、層状で立体的に配列した網膜組織を意味する。それぞれの細胞がいずれの網膜層を構成する細胞であるかは、公知の方法、例えば細胞マーカーの発現により確認できる。 The “retinal tissue” in the present invention means at least a plurality of types of cells such as photoreceptor cells, horizontal cells, bipolar cells, amacrine cells, retinal node cells, progenitor cells or retinal progenitor cells constituting each retinal layer in a living retina. , Meaning retinal tissue arranged in layers and three-dimensionally. Which retinal layer each cell constitutes can be confirmed by a known method, for example, expression of a cell marker.
網膜細胞マーカーとしては、Ｒaｘ（網膜の前駆細胞）、ＰＡＸ６（前駆細胞），ｎｅｓｔｉｎ（視床下部ニューロンの前駆細胞では発現されるが網膜前駆細胞では発現されない）、Ｓｏｘ１（視床下部神経上皮で発現され、網膜では発現されない）、Ｃｒｘ（視細胞の前駆細胞）、などが挙げられるが、これらに限定されない。また特に、上記網膜層特異的ニューロンのマーカーとしては、Ｃｈｘ１０（双極細胞）、Ｌ７（双極細胞）、 Ｔｕｊ１（節細胞）、Ｂｒｎ３ （節細胞）、Ｃａｌｒｅｔｉｎｉｎ（アマクリン細胞）、Ｃａｌｂｉｎｄｉｎ（水平細胞）、Ｒｈｏｄｏｐｓｉｎ（視細胞）、Recoverin（視細胞）、ＲＰＥ６５（色素上皮細胞）、Ｍｉｔｆ （色素上皮細胞）Nrl（杆体細胞）、Rxr-gamma（錐体細胞）などが挙げられるが、これらに限定されない。 As retinal cell markers, Rax (progenitor cell of retinal), PAX6 (progenitor cell), nestin (expressed in progenitor cell of hypothalamic neuron but not expressed in retinal progenitor cell), Sox1 (expressed in hypothalamic neuroepithelium) , Not expressed in the retina), Crx (progenitor cell of photoreceptor), and the like. In particular, as markers for the retinal layer-specific neurons, Chx10 (bipolar cells), L7 (bipolar cells), Tuj1 (node cells), Brn3 (node cells), Calretinin (amacrine cells), Calbindin (horizontal cells), Examples include, but are not limited to, Rhodopsin (photocell), Recoverin (photocell), RPE65 (pigment epithelial cell), Mitf (pigment epithelial cell) Nrl (rod cell), Rxr-gamma (cone cell).
本発明における「網膜層」とは、網膜を構成する各層を意味し、具体的には、網膜色素上皮層、視細胞層、外境界膜、外顆粒層、外網状層、内顆粒層、内網状層、神経節細胞層、神経線維層および内境界膜を挙げることができる。 The “retinal layer” in the present invention means each layer constituting the retina. Specifically, the retinal pigment epithelium layer, photoreceptor layer, outer boundary membrane, outer granular layer, outer reticulated layer, inner granular layer, inner granular layer, Mention may be made of the reticular layer, the ganglion cell layer, the nerve fiber layer and the inner limiting membrane.
本発明における「網膜層特異的神経細胞」とは、網膜層を構成する細胞であって網膜層に特異的な神経細胞を意味する。 The “retinal layer-specific nerve cell” in the present invention means a cell constituting the retinal layer and specific to the retinal layer.
本発明における「網膜前駆細胞」とは、視細胞、水平細胞、双極細胞、アマクリン細胞、網膜節細胞のいずれの成熟な網膜細胞にも分化しうる前駆細胞をいう。
一方、視細胞前駆細胞、水平細胞前駆細胞、双極細胞前駆細胞、アマクリン細胞前駆細胞、網膜節細胞前駆細胞とは、それぞれ、視細胞、水平細胞、双極細胞、アマクリン細胞、網膜節細胞への分化が決定付けられている前駆細胞をいう。
The “retinal progenitor cell” in the present invention refers to a progenitor cell that can differentiate into any mature retinal cell of a photoreceptor cell, a horizontal cell, a bipolar cell, an amacrine cell, and a retinal node cell.
On the other hand, photoreceptor precursor cells, horizontal cell precursor cells, bipolar cell precursor cells, amacrine cell precursor cells, and retinal node precursor cells are differentiated into photoreceptor cells, horizontal cells, bipolar cells, amacrine cells, and retinal node cells, respectively. Refers to progenitor cells that have been determined.
本発明において用いられる培地は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えば、ＢＭＥ培地、ＢＧＪｂ培地、ＣＭＲＬ １０６６培地、Ｇｌａｓｇｏｗ ＭＥＭ培地、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ＭＥＭ Ｚｉｎｃ Ｏｐｔｉｏｎ培地、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ １９９培地、Ｅａｇｌｅ ＭＥＭ培地、αＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ハム培地、ＲＰＭＩ １６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、およびこれらの混合培地など、動物細胞の培養に用いることのできる培地であれば特に限定されない。 The medium used in the present invention can be prepared using a medium used for culturing animal cells as a basal medium. As the basal medium, for example, BME medium, BGJb medium, CMRL 1066 medium, Glasgow MEM medium, Improved MEM Zinc Option medium, IMDM medium, Medium 199 medium, Eagle MEM medium, αMEM medium, DMEM medium, Ham medium, RPMI 1640 medium , Fischer's medium, and mixed media thereof are not particularly limited as long as they can be used for animal cell culture.
本発明における「無血清培地」とは、無調整又は未精製の血清を含まない培地を意味する。精製された血液由来成分や動物組織由来成分（例えば、増殖因子）が混入している培地は無調整又は未精製の血清を含まない限り無血清培地に該当するものとする。 The “serum-free medium” in the present invention means a medium that does not contain unconditioned or unpurified serum. A medium mixed with purified blood-derived components or animal tissue-derived components (for example, growth factors) corresponds to a serum-free medium unless it contains unadjusted or unpurified serum.
培地は、上述したようなものである限り特に限定されない。しかしながら、調製の煩雑さを回避するという観点からは、かかる無血清培地として、市販のＫＳＲを適量（例えば、１−２０％）添加した無血清培地（ＧＭＥＭ又はｄＭＥＭ、０．１ｍＭ ２−メルカプトエタノール、０．１ｍＭ 非必須アミノ酸Ｍｉｘ、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム）を使用できる。 The medium is not particularly limited as long as it is as described above. However, from the viewpoint of avoiding complicated preparation, a serum-free medium (GMEM or dMEM, 0.1 mM 2-mercaptoethanol) to which an appropriate amount (for example, 1-20%) of commercially available KSR is added as such a serum-free medium. 0.1 mM non-essential amino acids Mix, 1 mM sodium pyruvate).
また、無血清培地は、血清代替物を含有していてもよい。血清代替物は、例えば、アルブミン、トランスフェリン、脂肪酸、コラーゲン前駆体、微量元素、２−メルカプトエタノール又は３’チオールグリセロール、あるいはこれらの均等物などを適宜含有するものであり得る。かかる血清代替物は、例えば、ＷＯ９８／３０６７９記載の方法により調製できる。また、本発明の方法をより簡便に実施するために、血清代替物は市販のものを利用できる。かかる市販の血清代替物としては、例えば、Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ−ｄｅｆｉｎｅｄ Ｌｉｐｉｄ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ（Ｇｉｂｃｏ社製）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ社製）が挙げられる。 The serum-free medium may contain a serum substitute. The serum substitute may appropriately contain, for example, albumin, transferrin, fatty acid, collagen precursor, trace element, 2-mercaptoethanol or 3'thiolglycerol, or an equivalent thereof. Such serum replacement can be prepared, for example, by the method described in WO98 / 30679. Moreover, in order to implement the method of this invention more simply, a serum substitute can utilize. Examples of such commercially available serum substitutes include Chemically-defined Lipid concentrated (Gibco) and Glutamax (Gibco).
また、浮遊培養で用いる無血清培地は、脂肪酸又は脂質、アミノ酸（例えば、非必須アミノ酸）、ビタミン、増殖因子、サイトカイン、抗酸化剤、２−メルカプトエタノール、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類等を含有できる。 The serum-free medium used in suspension culture contains fatty acids or lipids, amino acids (for example, non-essential amino acids), vitamins, growth factors, cytokines, antioxidants, 2-mercaptoethanol, pyruvic acid, buffers, inorganic salts, and the like. Can be contained.
本発明における「血清培地」とは、無調整又は未精製の血清を含む培地を意味する。培地は、上述したようなものである限り特に限定されない。また、脂肪酸又は脂質、アミノ酸（例えば、非必須アミノ酸）、ビタミン、増殖因子、サイトカイン、抗酸化剤、２−メルカプトエタノール、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類等を含有できる。 The “serum medium” in the present invention means a medium containing unadjusted or unpurified serum. The medium is not particularly limited as long as it is as described above. Moreover, fatty acids or lipids, amino acids (for example, non-essential amino acids), vitamins, growth factors, cytokines, antioxidants, 2-mercaptoethanol, pyruvic acid, buffers, inorganic salts, and the like can be contained.
本発明における「浮遊培養」とは、細胞または細胞塊を培養器材等に接着させない条件で培養することをいう。 “Floating culture” in the present invention means culturing under conditions that do not allow cells or cell masses to adhere to culture equipment or the like.
浮遊培養を行う際に用いられる培養器は、「浮遊培養する」ことが可能なものであれば特に限定されず、当業者であれば適宜決定することが可能である。このような培養器としては、例えば、フラスコ、組織培養用フラスコ、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マイクロポア、マルチプレート、マルチウェルプレート、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、ローラーボトルが挙げられる。そしてこれらの培養器は、浮遊培養する観点から、細胞非接着性であることが好ましい。細胞非接着性の培養器としては、培養器の表面が、細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理（例えば、細胞外マトリクス等によるコーティング処理）されていないものを使用できる。 The incubator used for the suspension culture is not particularly limited as long as it can perform “suspension culture” and can be appropriately determined by those skilled in the art. Examples of such incubators include flasks, tissue culture flasks, dishes, petri dishes, tissue culture dishes, multi dishes, micro plates, micro well plates, micro pores, multi plates, multi well plates, chamber slides, Petri dishes, tubes, trays, culture bags, and roller bottles. These incubators are preferably non-cell-adhesive from the viewpoint of suspension culture. As the non-cell-adhesive incubator, those in which the surface of the incubator has not been artificially treated (for example, coating treatment with an extracellular matrix or the like) for the purpose of improving adhesion with cells can be used.
本発明における「霊長類」とは、霊長目に属するほ乳類動物をいい、霊長類としては、キツネザルやロリス、ツバイなどの原猿亜目と、サル、類人猿、ヒトなどの真猿亜目が挙げられる。 The “primate” in the present invention refers to a mammal animal belonging to the primate, and examples of the primate include apes of primates such as lemurs, loris, and tsubai, and apes of primates such as monkeys, apes and humans.
＜本発明製造方法について＞
次に、本発明製造方法について説明する。本発明製造方法は、霊長類多能性幹細胞由来の網膜組織に含まれる網膜前駆細胞に、Notchシグナル経路阻害物質を接触させることを特徴とする網膜層特異的神経細胞の製造方法である。本発明製造方法によると、網膜前駆細胞から網膜層特異的神経細胞を製造することができる。
<About the production method of the present invention>
Next, the manufacturing method of the present invention will be described. The production method of the present invention is a method for producing a retinal layer-specific nerve cell, which comprises contacting a retinal progenitor cell contained in a retinal tissue derived from a primate pluripotent stem cell with a Notch signal pathway inhibitor. According to the production method of the present invention, retinal layer-specific neurons can be produced from retinal progenitor cells.
＜Notchシグナル経路阻害物質＞
本発明製造方法で用いるNotchシグナル経路阻害物質について説明する。
<Notch signaling pathway inhibitor>
The Notch signal pathway inhibitor used in the production method of the present invention will be described.
Notchシグナル経路作用物質は、Notchにより媒介されるシグナル伝達を増強し得るものである限り特に限定されない。Notchシグナル経路作用物質としては、例えば、Notch受容体、Notch受容体アゴニスト、Notchリガンド（Delta様 (DLL1、DLL3、DLL4) 及びJagged (JAG1、JAG2) ファミリー）、ガンマセクレターゼ阻害剤などをあげることができる。 The Notch signaling pathway agent is not particularly limited as long as it can enhance signal transduction mediated by Notch. Examples of Notch signal pathway agonists include Notch receptors, Notch receptor agonists, Notch ligands (Delta-like (DLL1, DLL3, DLL4) and Jagged (JAG1, JAG2) family), gamma secretase inhibitors, and the like. it can.
ガンマセクレターゼ阻害剤としては、例えば、Ｎ−［Ｎ−（３，５−ジフルオロフェンアセチル）−Ｌ−アラニル］−Ｓ−フェニルグリシン ｔ−ブチルエステル（ＤＡＰＴ）を挙げることが出来る。 Examples of the gamma secretase inhibitor include N- [N- (3,5-difluorophenacetyl) -L-alanyl] -S-phenylglycine t-butyl ester (DAPT).
ガンマセクレターゼ阻害剤の濃度は、網膜前駆細胞から視細胞前駆細胞又は視細胞への分化を促進し得る濃度である限り特に限定されない。かかる濃度は、例えば一般的なガンマセクレターゼ阻害剤の場合、約０．１〜１０００μＭ、好ましくは約１〜１００μＭ、より好ましくは約１０μＭであり得る。 The concentration of the gamma secretase inhibitor is not particularly limited as long as it is a concentration that can promote differentiation from retinal progenitor cells to photoreceptor progenitor cells or photoreceptor cells. Such a concentration can be, for example, about 0.1 to 1000 μM, preferably about 1 to 100 μM, more preferably about 10 μM, for a common gamma secretase inhibitor.
ガンマセクレターゼ阻害剤は、霊長類多能性幹細胞から製造される網膜組織のうち、霊長類多能性幹細胞の浮遊培養開始後１５日目以降２００日目以内に培地中に添加される。好ましくは、ガンマセクレターゼ阻害剤は、分化誘導２０日目以降１５０日目以内、より好ましくは分化誘導２５日以降１００日以内の時期に培地に添加される。 The gamma secretase inhibitor is added to the medium within 15 to 200 days after the start of suspension culture of primate pluripotent stem cells among retinal tissues produced from primate pluripotent stem cells. Preferably, the gamma secretase inhibitor is added to the medium at a time within 20 days after differentiation induction and within 150 days, more preferably within 25 days after differentiation induction within 100 days.
ガンマセクレターゼ阻害剤の存在下での接着培養の期間は、視細胞前駆細胞又は視細胞をより効率的に産生できる長さであり得る。かかる期間の長さは、例えば約３日間以上、好ましくは約５〜１００日間、より好ましくは約７〜３０日間であり得る。 The duration of the adhesion culture in the presence of a gamma secretase inhibitor can be of a length that can produce photoreceptor precursor cells or photoreceptor cells more efficiently. The length of such a period can be, for example, about 3 days or more, preferably about 5 to 100 days, more preferably about 7 to 30 days.
＜霊長類多能性幹細胞由来の網膜組織の製造方法＞
本発明製造方法で用いる「霊長類多能性幹細胞由来の網膜組織」について説明する。
<Method of producing retinal tissue derived from primate pluripotent stem cells>
The “retinal tissue derived from primate pluripotent stem cells” used in the production method of the present invention will be described.
霊長類多能性幹細胞由来の網膜組織は、例えば、以下の［１］（霊長類多能性幹細胞から網膜組織を製造する方法）又は［２］（霊長類多能性幹細胞から眼杯様構造体を製造し、さらに眼杯様構造体から網膜組織を製造する方法）の製造方法により製造することができる。 The retinal tissue derived from primate pluripotent stem cells is, for example, the following [1] (method for producing retinal tissue from primate pluripotent stem cells) or [2] (cuplet-like structure from primate pluripotent stem cells) The body can be further manufactured by the manufacturing method of the method of manufacturing retinal tissue from the eyecup-like structure.
［１］．下記（１）〜（３）の工程を含むことを特徴とする網膜組織の製造方法。
（１）霊長類多能性幹細胞を、Wntシグナル経路阻害物質を含む無血清培地中で浮遊培養することにより霊長類多能性幹細胞の凝集体を形成させる第一工程
（２）第一工程で形成された凝集体を、基底膜標品を含む無血清培地中で浮遊培養する第二工程、及び
（３）第二工程で培養された凝集体を、血清培地中で浮遊培養する第三工程
[1]. The manufacturing method of the retinal tissue characterized by including the process of following (1)-(3).
(1) First step of forming primate pluripotent stem cell aggregates by suspension culture of primate pluripotent stem cells in a serum-free medium containing a Wnt signal pathway inhibitor (2) In the first step A second step of culturing the formed aggregate in a serum-free medium containing a basement membrane preparation, and (3) a third step of culturing the aggregate cultured in the second step in a serum medium.
Ｗｎｔシグナル経路阻害物質は、Ｗｎｔにより媒介されるシグナル伝達を抑制し得るものである限り特に限定されない。Ｗｎｔシグナル経路阻害物質としては、例えば、Ｄｋｋ１、Cerberus蛋白、Ｗｎｔ受容体阻害剤、可溶型Ｗｎｔ受容体、Ｗｎｔ抗体、カゼインキナーゼ阻害剤、ドミナントネガティブＷｎｔ蛋白、ＣＫＩ−７（Ｎ−（２−アミノエチル）−５−クロロ−イソキノリン−８−スルホンアミド）、Ｄ４４７６（４−{４−（２，３−ジヒドロベンゾ［１，４］ジオキシン−６−イル）−５−ピリジン−２−イル−１Ｈ−イミイダゾール−２−イル}ベンズアミド）、IWR-1-endo（IWR1e）、IWP-2などが挙げられる。 The Wnt signal pathway inhibitor is not particularly limited as long as it can suppress signal transduction mediated by Wnt. Examples of the Wnt signal pathway inhibitor include Dkk1, Cerberus protein, Wnt receptor inhibitor, soluble Wnt receptor, Wnt antibody, casein kinase inhibitor, dominant negative Wnt protein, CKI-7 (N- (2- Aminoethyl) -5-chloro-isoquinoline-8-sulfonamide), D4476 (4- {4- (2,3-dihydrobenzo [1,4] dioxin-6-yl) -5-pyridin-2-yl- 1H-imidazol-2-yl} benzamide), IWR-1-endo (IWR1e), IWP-2 and the like.
上記［１］の製造方法に用いられるＷｎｔシグナル経路阻害物質の濃度は、多能性幹細胞の凝集体が形成する濃度であればよい。例えばIWR1e等の通常のＷｎｔシグナル経路阻害物質の場合は、約0.1μM 〜100μM、好ましくは約1μM〜10μM、より好ましくは3μM前後の濃度で添加する。 The concentration of the Wnt signal pathway inhibitor used in the production method of [1] above may be a concentration at which aggregates of pluripotent stem cells are formed. For example, in the case of a normal Wnt signal pathway inhibitor such as IWR1e, it is added at a concentration of about 0.1 μM to 100 μM, preferably about 1 μM to 10 μM, more preferably around 3 μM.
Ｗｎｔシグナル経路阻害物質は、浮遊培養前に無血清培地に添加されていてもよく、また、浮遊培養開始後数日以内（例えば、５日以内）に培地に添加してもよい。好ましくは、Ｗｎｔシグナル経路阻害物質は、浮遊培養開始後５日以内、より好ましくは３日以内、最も好ましくは浮遊培養開始と同時に無血清培地に添加する。また、Wntシグナル経路阻害物質を添加した状態で、浮遊培養開始後1８日目まで、より好ましくは１２日目まで培養する。 The Wnt signal pathway inhibitor may be added to the serum-free medium before suspension culture, or may be added to the medium within a few days (for example, within 5 days) after the start of suspension culture. Preferably, the Wnt signal pathway inhibitor is added to the serum-free medium within 5 days after the start of suspension culture, more preferably within 3 days, and most preferably simultaneously with the start of suspension culture. In addition, the cells are cultured until the 18th day, more preferably the 12th day after the start of suspension culture, with the addition of a Wnt signal pathway inhibitor.
第一工程における培養温度、ＣＯ２濃度等の培養条件は適宜設定できる。培養温度は特に限定されるものではないが、例えば約３０〜４０℃、好ましくは約３７℃前後である。またＣＯ２濃度は、例えば約１〜１０％、好ましくは約５％前後である。 Culture conditions such as culture temperature and CO 2 concentration in the first step can be set as appropriate. The culture temperature is not particularly limited, but is, for example, about 30 to 40 ° C., preferably about 37 ° C. The CO 2 concentration is, for example, about 1 to 10%, preferably about 5%.
本発明における「凝集体」とは、培地中に分散していた細胞が集合して形成した塊をいうが、本発明における「凝集体」には、浮遊培養開始時に分散していた細胞が形成した凝集体と浮遊培養開始時に既に形成されていた凝集体とが含まれるものとする。
「凝集体を形成させる」とは、細胞を集合させて細胞の凝集体を形成させて培養させる際に、「一定数の分散した幹細胞を迅速に凝集」させることで質的に均一な細胞の凝集体を形成させることをいう。
The “aggregate” in the present invention refers to a mass formed by aggregation of cells dispersed in the medium. In the “aggregate” in the present invention, cells dispersed at the start of suspension culture are formed. And aggregates that have already been formed at the start of suspension culture.
“Aggregate formation” means that when a cell is aggregated to form an aggregate of cells and cultured, a qualitatively uniform cell is formed by “aggregating a certain number of dispersed stem cells rapidly”. It means forming an aggregate.
凝集体を形成させる実験的な操作としては、例えば、ウェルの小さなプレート（９６穴プレート）やマイクロポアなどを用いて小さいスペースに細胞を閉じ込める方法、小さな遠心チューブを用いて短時間遠心することで細胞を凝集させる方法などが挙げられる。 Experimental operations for forming aggregates include, for example, a method of confining cells in a small space using a plate with a small well (96-well plate) or a micropore, or a short centrifugation using a small centrifuge tube. Examples thereof include a method for aggregating cells.
第一工程における多能性幹細胞の濃度は、多能性幹細胞の凝集体をより均一に、効率的に形成させるように当業者であれば適宜設定することができる。凝集体形成時の多能性幹細胞の濃度は、幹細胞の均一な凝集体を形成可能な濃度である限り特に限定されないが、例えば９６穴マイクロウェルプレートを用いてヒトＥＳ細胞を浮遊培養する場合、１ウェルあたり約１×１０の３乗〜約５×１０の４乗細胞、好ましくは約３×１０の３乗〜約３×１０の４乗細胞、より好ましくは約５×１０の３乗〜約２×１０の４乗細胞、最も好ましくは９×１０の３乗細胞前後となるように調製した液を添加し、プレートを静置して凝集体を形成させる。 The concentration of pluripotent stem cells in the first step can be appropriately set by those skilled in the art so that aggregates of pluripotent stem cells can be formed more uniformly and efficiently. The concentration of pluripotent stem cells at the time of aggregate formation is not particularly limited as long as it is a concentration capable of forming a uniform aggregate of stem cells. For example, when suspension culture of human ES cells using a 96-well microwell plate, About 1 × 10 3 to about 5 × 10 4 cells, preferably about 3 × 10 3 to about 3 × 10 4 cells, more preferably about 5 × 10 3 to a well A solution prepared so as to be about 2 × 10 4 cells, most preferably about 9 × 10 3 cells, is added, and the plate is allowed to stand to form aggregates.
多能性幹細胞の凝集体が形成されたことは、凝集体のサイズおよび細胞数、巨視的形態、組織染色解析による微視的形態およびその均一性、分化および未分化マーカーの発現およびその均一性、分化マーカーの発現制御およびその同期性、分化効率の凝集体間の再現性などに基づき、当業者であれば判断することが可能である。 The formation of aggregates of pluripotent stem cells is due to the size and number of the aggregates, the macroscopic morphology, the microscopic morphology and its homogeneity by tissue staining analysis, the expression and the homogeneity of differentiation and undifferentiation markers Those skilled in the art can judge based on the expression control and differentiation of differentiation markers, the reproducibility between aggregates of differentiation efficiency, and the like.
（２）第二工程
第一工程で形成された凝集体を、基底膜標品を含む無血清培地中で浮遊培養する第二工程について説明する。
(2) Second Step A second step of suspension culture of the aggregate formed in the first step in a serum-free medium containing a basement membrane preparation will be described.
「基底膜標品」としては、その上に基底膜形成能を有する所望の細胞を播腫して培養した場合に、上皮細胞様の細胞形態、分化、増殖、運動、機能発現などを制御する機能を有するような基底膜構成成分を含むものをいう。ここで、「基底膜構成成分」とは、動物の組織において、上皮細胞層と間質細胞層などとの間に存在する薄い膜状をした細胞外マトリックス分子をいう。基底膜標品は、例えば基底膜を介して支持体上に接着している基底膜形成能を有する細胞を、該細胞の脂質溶解能を有する溶液やアルカリ溶液などを用いて除去することで作成することができる。好ましい基底膜標品としては、基底膜成分として市販されている商品（例えばＭａｔｒｉｇｅｌ（以下マトリゲルという場合もある））や、基底膜成分として公知の細胞外マトリックス分子（例えばラミニン、ＩＶ型コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、エンタクチンなど）を含むものが挙げられる。 “Basement membrane preparation” controls epithelial cell-like cell morphology, differentiation, proliferation, motility, functional expression, etc. when desired cells with basement membrane-forming ability are seeded and cultured on it It includes a basement membrane component that has a function. Here, the “basement membrane component” refers to a thin membrane-like extracellular matrix molecule that exists between an epithelial cell layer and a stromal cell layer in an animal tissue. Basement membrane preparation is prepared by removing cells with basement membrane-forming ability that adhere to the support through the basement membrane using a solution or alkaline solution that has lipid-dissolving ability of the cells. can do. Preferred basement membrane preparations include commercially available basement membrane components (for example, Matrigel (hereinafter sometimes referred to as Matrigel)) and extracellular matrix molecules known as basement membrane components (for example, laminin, type IV collagen, heparan). And those containing proteoglycan sulfate, entactin, etc.).
Ｍａｔｒｉｇｅｌは、Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ Ｈｏｌｍ Ｓｗａｒｎ（ＥＨＳ）マウス肉腫由来の基底膜調製物である。Ｍａｔｒｉｇｅｌの主成分はＩＶ型コラーゲン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、エンタクチンであるが、これらに加えてＴＧＦ−β、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、組織プラスミノゲン活性化因子、ＥＨＳ腫瘍が天然に産生する増殖因子が含まれる。Ｍａｔｒｉｇｅｌの「ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｄｕｃｅｄ製品」は、通常のＭａｔｒｉｇｅｌよりも増殖因子の濃度が低く、その標準的な濃度はＥＧＦが＜０．５ｎｇ／ｍｌ、ＮＧＦが＜０．２ｎｇ／ｍｌ、ＰＤＧＦが＜５ｐｇ／ｍｌ、ＩＧＦ−１が５ｎｇ／ｍｌ、ＴＧＦ−βが１．７ｎｇ／ｍｌである。本発明の方法では、「ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｄｕｃｅｄ製品」の使用が好ましい。 Matrigel is a basement membrane preparation from Engelbreth Holm Swarn (EHS) mouse sarcoma. The main components of Matrigel are type IV collagen, laminin, heparan sulfate proteoglycan and entactin, but in addition to these, TGF-β, fibroblast growth factor (FGF), tissue plasminogen activator, and EHS tumor are naturally produced Growth factors are included. Matrigel's “growth factor reduced product” has a lower concentration of growth factors than normal Matrigel, with standard concentrations of <0.5 ng / ml for EGF, <0.2 ng / ml for NGF, and <5 pg for PDGF. / Ml, IGF-1 is 5 ng / ml, and TGF-β is 1.7 ng / ml. In the method of the present invention, it is preferable to use “growth factor reduced products”.
第二工程における浮遊培養で無血清培地に添加される基底膜標品の濃度としては、神経組織（例えば網膜組織）の上皮構造が安定に維持される限り特に限定されないが、例えばＭａｒｔｉｇｅｌを用いる場合には、好ましくは培養液の１／２０〜１／２００の容量、より好ましくは１／１００前後の容積を挙げることができる。基底膜標品は幹細胞の培養開始時に既に培地に添加されていてもよいが、好ましくは、浮遊培養開始後５日以内、より好ましくは浮遊培養開始２日以内に無血清培地に添加される。 The concentration of the basement membrane preparation added to the serum-free medium in the suspension culture in the second step is not particularly limited as long as the epithelial structure of nerve tissue (for example, retinal tissue) is stably maintained. For example, when using Martigel Preferably includes a volume of 1/20 to 1/200 of the culture solution, more preferably a volume of about 1/100. The basement membrane preparation may be already added to the medium at the start of stem cell culture, but is preferably added to the serum-free medium within 5 days after the start of suspension culture, more preferably within 2 days of the start of suspension culture.
第二工程で用いられる無血清培地は、第一工程で用いた無血清培地をそのまま用いることもできるし、新たな無血清培地に置き換えることもできる。
第一工程で用いた無血清培地をそのまま本工程に用いる場合、「基底膜標品」を培地中に添加すればよい。
The serum-free medium used in the second step can be the same as the serum-free medium used in the first step, or can be replaced with a new serum-free medium.
When the serum-free medium used in the first step is used in this step as it is, a “basement membrane preparation” may be added to the medium.
第一工程及び第二工程における浮遊培養に用いられる無血清培地は、上述したようなものである限り特に限定されない。しかしながら、調製の煩雑さを回避観点から、かかる無血清培地として、市販のＫＳＲ（Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）を適量添加した無血清培地（ＧＭＥＭ又はｄＭＥＭ、０．１ｍＭ ２−メルカプトエタノール、０．１ｍＭ 非必須アミノ酸Ｍｉｘ、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム）を使用することが好ましい。無血清培地へのＫＳＲの投与量としては特に限定されず、例えばヒトＥＳ細胞の場合は、通常１〜２０％であり、好ましくは２〜２０％である。 The serum-free medium used for suspension culture in the first step and the second step is not particularly limited as long as it is as described above. However, from the viewpoint of avoiding complicated preparation, a serum-free medium (GMEM or dMEM, 0.1 mM 2-mercaptoethanol, 0.1 mM non-essential) to which an appropriate amount of commercially available KSR (Knockout Serum Replacement) is added as such a serum-free medium The amino acids Mix, 1 mM sodium pyruvate) are preferably used. The dose of KSR to the serum-free medium is not particularly limited. For example, in the case of human ES cells, it is usually 1 to 20%, preferably 2 to 20%.
第二工程における培養温度、ＣＯ２濃度等の培養条件は適宜設定できる。培養温度は特に限定されるものではないが、例えば約３０〜４０℃、好ましくは約３７℃前後である。またＣＯ２濃度は、例えば約１〜１０％、好ましくは約５％前後である。 Culture conditions such as culture temperature and CO 2 concentration in the second step can be set as appropriate. The culture temperature is not particularly limited, but is, for example, about 30 to 40 ° C., preferably about 37 ° C. The CO 2 concentration is, for example, about 1 to 10%, preferably about 5%.
（３）第三工程
第二工程で培養された凝集体を、血清培地中で浮遊培養する第三工程について説明する。
(3) Third step The third step of suspension culture of the aggregate cultured in the second step in a serum medium will be described.
第三工程で用いられる血清培地は、第二工程で培養に用いた無血清培地に血清を直接添加したものを用いてもよいし、新たな血清培地におきかえたものを用いてもよい。 As the serum medium used in the third step, one obtained by directly adding serum to the serum-free medium used for culturing in the second step may be used, or one replaced with a new serum medium may be used.
第三工程で培地に添加される血清として、例えば、牛血清、仔牛血清、牛胎児血清、馬血清、仔馬血清、馬胎児血清、ウサギ血清。仔ウサギ血清、ウサギ胎児血清、ヒト血清など哺乳動物の血清などを用いることが出来る。 Examples of serum added to the medium in the third step include bovine serum, calf serum, fetal calf serum, horse serum, foal serum, fetal bovine serum, and rabbit serum. Sera from mammals such as baby rabbit serum, rabbit fetal serum, and human serum can be used.
血清の添加は、浮遊培養開始後７以降、より好ましくは9日目以降、最も好ましくは12日目に行う。血清濃度については、約1〜30％、好ましくは約3〜20%、より好ましくは10%前後で添加する。 The serum is added after 7 days from the start of suspension culture, more preferably after 9 days, and most preferably after 12 days. Regarding the serum concentration, it is added at about 1 to 30%, preferably about 3 to 20%, more preferably around 10%.
第三工程において、血清に加えてShhシグナル経路作用物質を添加することで網膜組織の製造効率を上昇させることが出来る。 In the third step, the production efficiency of retinal tissue can be increased by adding an Shh signal pathway agent in addition to serum.
第三工程で用いられる血清培地は、上述したようなものである限り特に限定されないが、前記無血清培地（ＧＭＥＭ又はDＭＥＭ、０．１ｍＭ ２−メルカプトエタノール、０．１ｍＭ 非必須アミノ酸Ｍｉｘ、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム）に血清を添加したものを用いることが好ましい。
また、かかる血清培地として、市販のＫＳＲ（Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）を適量添加したものを用いてもよい。
The serum medium used in the third step is not particularly limited as long as it is as described above, but the serum-free medium (GMEM or DMEM, 0.1 mM 2-mercaptoethanol, 0.1 mM non-essential amino acid Mix, 1 mM pyruvin). It is preferable to use a solution obtained by adding serum to (sodium acid).
Moreover, you may use what added a suitable quantity of commercially available KSR (Knockout Serum Replacement) as this serum culture medium.
第三工程において、血清に加えてShhシグナル経路作用物質を添加することで網膜組織の製造効率を上昇させることが出来る。 In the third step, the production efficiency of retinal tissue can be increased by adding an Shh signal pathway agent in addition to serum.
Shhシグナル経路作用物質としては、Ｓｈｈにより媒介されるシグナル伝達を増強し得るものである限り特に限定されない。Ｓｈｈシグナル経路作用物質としては、例えば、Hedgehogファミリーに属する蛋白（例えば、Ｓｈｈ）、Ｓｈｈ受容体、Ｓｈｈ受容体アゴニスト、Purmorphamine、SAGなどが挙げられる。 The substance acting on the Shh signal pathway is not particularly limited as long as it can enhance signal transduction mediated by Shh. Examples of substances acting on the Shh signal pathway include proteins belonging to the Hedgehog family (for example, Shh), Shh receptors, Shh receptor agonists, Purmorphamine, SAG and the like.
上記［１］の製造方法に用いられるShhシグナル経路作用物質の濃度は、例えばSAG等の通常のＳｈｈシグナル経路作用物質の場合は、約0.1nM 〜10μM、好ましくは約10nM〜1μM、より好ましくは100nM前後の濃度で添加する。 The concentration of the Shh signal pathway agonist used in the production method of [1] above is, for example, about 0.1 nM to 10 μM, preferably about 10 nM to 1 μM, more preferably in the case of a normal Shh signal pathway agonist such as SAG. Add at a concentration of around 100 nM.
このようにして製造された網膜組織は、凝集体の表面を覆うように存在する。上記［１］の製造方法により、網膜組織が製造されたことの確認は、免疫染色法等により確認することができる。
また、凝集体の表面に存在する網膜組織をピンセット等を用いて、凝集体から物理的に切り出すことも可能である。この場合、各凝集体の表面には、網膜組織以外の神経組織が形成される場合もあるため、凝集体から切り出した神経組織の一部を切り取り、これを用いて免疫染色法等により確認することで、その組織が網膜組織であることを確認することが出来る。
The retinal tissue thus produced exists so as to cover the surface of the aggregate. Confirmation that the retinal tissue has been produced by the production method of [1] above can be confirmed by immunostaining.
It is also possible to physically cut out the retinal tissue present on the surface of the aggregate from the aggregate using tweezers or the like. In this case, since a nerve tissue other than the retinal tissue may be formed on the surface of each aggregate, a part of the nerve tissue cut out from the aggregate is cut out and confirmed by an immunostaining method or the like using this. Thus, it can be confirmed that the tissue is a retinal tissue.
［２］．下記（１）〜（５）の工程を含むことを特徴とする眼杯様構造体を製造する方法。
（１）霊長類多能性幹細胞を、Wntシグナル経路阻害物質を含む無血清培地中で浮遊培養することにより多能性幹細胞の凝集体を形成させる第一工程
（２）第一工程で形成された凝集体を、基底膜標品を含む無血清培地中で浮遊培養する第二工程
（３）第二工程で培養された凝集体を血清培地中で浮遊培養する第三工程および
（４）第三工程で培養された凝集体を、Shhシグナル経路作用物質とWntシグナル経路作用物質とを含む無血清培地中又は血清培地中で浮遊培養することにより、眼杯様構造体を形成させる第四工程
（５）第四工程で形成された眼杯様構造体を、浮遊培養する工程
[2]. A method for producing an eyecup-like structure comprising the following steps (1) to (5):
(1) A first step in which primate pluripotent stem cells are cultured in suspension in a serum-free medium containing a Wnt signaling pathway inhibitor to form aggregates of pluripotent stem cells (2) formed in the first step A second step (3) in which the aggregates cultured in the second step are suspended in a serum-free medium containing a basement membrane preparation; Fourth step of forming an eyecup-like structure by suspension culture of the aggregate cultured in three steps in a serum-free medium or serum medium containing a Shh signal pathway agonist and a Wnt signal pathway agonist (5) A step of floating culture of the eyecup-like structure formed in the fourth step
（１）第一工程
第一工程において用いられるWntシグナル経路阻害物質、培養条件および好ましい形態等は、上記［１］の製造方法の第一工程において用いられるものと同様のものが挙げられる。
(1) 1st process The thing similar to what is used in the 1st process of the manufacturing method of said [1] is mentioned for the Wnt signal pathway inhibitory substance used in a 1st process, culture | cultivation conditions, and a preferable form.
（２）第二工程
第二工程において用いられる基底膜標品、培養条件および好ましい形態等は、上記［１］の製造方法の第二工程において用いられるものと同様のものが挙げられる。
(2) Second Step The basement membrane preparation, culture conditions, preferred forms, etc. used in the second step are the same as those used in the second step of the production method of [1] above.
（３）第三工程
第二工程で培養された凝集体を、血清培地中で浮遊培養する第三工程について説明する。
(3) Third step The third step of suspension culture of the aggregate cultured in the second step in a serum medium will be described.
第三工程で用いられる血清培地は、第二工程で培養に用いた無血清培地に血清を直接添加したものを用いてもよいし、新たな血清培地におきかえたものを用いてもよい。 As the serum medium used in the third step, one obtained by directly adding serum to the serum-free medium used for culturing in the second step may be used, or one replaced with a new serum medium may be used.
第三工程で培地に添加される血清として、例えば、牛血清、仔牛血清、牛胎児血清、馬血清、仔馬血清、馬胎児血清、ウサギ血清。仔ウサギ血清、ウサギ胎児血清、ヒト血清など哺乳動物の血清などを用いることが出来る。 Examples of serum added to the medium in the third step include bovine serum, calf serum, fetal calf serum, horse serum, foal serum, fetal bovine serum, and rabbit serum. Sera from mammals such as baby rabbit serum, rabbit fetal serum, and human serum can be used.
血清の添加は、例えばヒトES細胞を浮遊する場合、浮遊培養開始後7日目以降、より好ましくは9日目以降、最も好ましくは12日目に行う。血清濃度については、約1〜30％、好ましくは約3〜20%、より好ましくは10%前後で添加する。 For example, when human ES cells are suspended, serum is added on or after the 7th day, more preferably on or after the 9th day, and most preferably on the 12th day after the start of suspension culture. Regarding the serum concentration, it is added at about 1 to 30%, preferably about 3 to 20%, more preferably around 10%.
第三工程で用いられる血清培地は、上述したようなものである限り特に限定されないが、前記無血清培地（ＧＭＥＭ又はDＭＥＭ、０．１ｍＭ ２−メルカプトエタノール、０．１ｍＭ 非必須アミノ酸Ｍｉｘ、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム）に血清を添加したものを用いることが好ましい。
また、かかる血清培地として、市販のＫＳＲ（Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）を適量添加したものを用いてもよい。
（４）第四工程
第三工程で培養された凝集体を、Shhシグナル経路作用物質とWntシグナル経路作用物質とを含む無血清培地又は血清培地中で浮遊培養する第四工程について説明する。
The serum medium used in the third step is not particularly limited as long as it is as described above, but the serum-free medium (GMEM or DMEM, 0.1 mM 2-mercaptoethanol, 0.1 mM non-essential amino acid Mix, 1 mM pyruvin). It is preferable to use a solution obtained by adding serum to (sodium acid).
Moreover, you may use what added a suitable quantity of commercially available KSR (Knockout Serum Replacement) as this serum culture medium.
(4) Fourth Step A fourth step of suspension culture of the aggregate cultured in the third step in a serum-free medium or serum medium containing a Shh signal pathway agonist and a Wnt signal pathway agonist will be described.
Ｓｈｈシグナル経路作用物質としては、Ｓｈｈにより媒介されるシグナル伝達を増強し得るものである限り特に限定されない。Ｓｈｈシグナル経路作用物質としては、例えば、Hedgehogファミリーに属する蛋白（例えば、Ｓｈｈ）、Ｓｈｈ受容体、Ｓｈｈ受容体アゴニスト、Purmorphamine、SAGなどが挙げられる。 The substance acting on the Shh signal pathway is not particularly limited as long as it can enhance signal transduction mediated by Shh. Examples of substances acting on the Shh signal pathway include proteins belonging to the Hedgehog family (for example, Shh), Shh receptors, Shh receptor agonists, Purmorphamine, SAG and the like.
上記［２］の製造方法に用いられるShhシグナル経路作用物質の濃度は、例えばSAG等の通常のＳｈｈシグナル経路作用物質の場合は、約0.1nM 〜10μM、好ましくは約10nM〜1μM、より好ましくは100nM前後の濃度で添加する。 The concentration of the Shh signal pathway agonist used in the production method of [2] above is, for example, about 0.1 nM to 10 μM, preferably about 10 nM to 1 μM, more preferably in the case of a normal Shh signal pathway agonist such as SAG. Add at a concentration of around 100 nM.
Wntシグナル経路作用物質としては、例えばWntファミリーに属するタンパク質、Wnt受容体、Wnt受容体アゴニスト、GSK３β阻害剤（例えば、6-Bromoindirubin-3'-oxime（BIO）、CHIR99021、Kenpaullone）などが挙げられる。 Examples of Wnt signal pathway agonists include proteins belonging to the Wnt family, Wnt receptors, Wnt receptor agonists, GSK3β inhibitors (for example, 6-Bromoindirubin-3'-oxime (BIO), CHIR99021, Kenpaullone) and the like. .
上記［２］の製造方法に用いられるWntシグナル経路作用物質の濃度は、例えばCHIR99021等の通常のWntシグナル経路作用物質の場合には、約0.1μM 〜100μM、好ましくは約1μM〜30μM、より好ましくは3μM前後の濃度で添加する。 In the case of a normal Wnt signal pathway agonist such as CHIR99021, the concentration of the Wnt signal pathway agonist used in the production method of [2] is about 0.1 μM to 100 μM, preferably about 1 μM to 30 μM, more preferably. Is added at a concentration of around 3 μM.
Shhシグナル経路作用物質及びWntシグナル経路作用物質は、分化誘導開始後12日目以降25日目以内に添加する。好ましくは、15日目以降18日目以内に添加する。この際、第一工程で添加したWntシグナル経路阻害物質を含まない培地を使用することが好ましい。 The Shh signal pathway agonist and the Wnt signal pathway agonist are added within 12 to 25 days after the start of differentiation induction. Preferably, it is added within 15 days and 18 days. At this time, it is preferable to use a medium containing no Wnt signal pathway inhibitor added in the first step.
浮遊培養開始から１８日目以降に、凝集体中から、眼杯様構造体が突起状に形成される。眼杯様構造体であるかは、当業者であれば顕微鏡、拡大鏡等による観察で確認が可能である。 From the 18th day after the start of suspension culture, a cup-like structure is formed in a protrusion shape from the aggregate. A person skilled in the art can confirm whether the structure is a cup-like structure by observation with a microscope, a magnifying glass, or the like.
（５）第四工程で形成された眼杯様構造体を、浮遊培養する工程
第四工程で形成された眼杯様構造体を、浮遊培養する工程について説明する。
(5) Step of floating culture of the eyecup-like structure formed in the fourth step The step of floating culture of the eyecup-like structure formed in the fourth step will be described.
眼杯様構造体は、上述の通り、凝集体中から突起状に形成されるので、当該突起を凝集体から物理的、形態的に切り出し、分離・培養することによって高純度の網膜組織を得ることができる。眼杯様構造体の切り出し方法としては特に限定されず、幹細胞の凝集体から微細ピンセットなどを用いて容易に切り出すことが可能である。 As described above, the eyecup-like structure is formed into a protrusion shape from the aggregate, so that a high-purity retinal tissue is obtained by physically and morphologically cutting the protrusion from the aggregate and separating and culturing. be able to. The method for cutting out the eyecup-like structure is not particularly limited, and can be easily cut out from the aggregate of stem cells using fine tweezers or the like.
上述のように製造した眼杯様構造体には網膜前駆細胞が含まれており、前記網膜前駆細胞にNotchシグナル経路阻害物質を接触させることにより、網膜前駆細胞から網膜層特異的神経細胞を製造することができる。 The eye cup-like structure produced as described above contains retinal progenitor cells, and retinal layer-specific neurons are produced from retinal progenitor cells by contacting the retinal progenitor cells with a Notch signaling pathway inhibitor. can do.
＜網膜層特異的神経細胞の確認方法＞
上述のように製造された網膜層特異的神経細胞を確認する方法として、網膜層特異的神経細胞が視細胞、視細胞前駆体、神経節細胞である場合を例として、説明する。
<Method for confirming retinal layer-specific nerve cells>
As a method for confirming the retinal layer-specific nerve cells produced as described above, the case where the retinal layer-specific nerve cells are photoreceptor cells, photoreceptor precursors, and ganglion cells will be described as an example.
製造された網膜層特異的神経細胞が、視細胞前駆細胞であるか否かは、公知の方法、例えば、視細胞前駆細胞マーカーの発現により確認できる。視細胞前駆細胞マーカーとしては、例えば、Ｃｒｘが挙げられる。 Whether or not the produced retinal layer-specific nerve cells are photoreceptor precursor cells can be confirmed by a known method, for example, expression of a photoreceptor precursor cell marker. Examples of the photoreceptor cell progenitor cell marker include Crx.
視細胞には桿体視細胞及び錐体視細胞が含まれる。製造された細胞が視細胞であるか否かは、自体公知の方法、例えば、視細胞マーカーの発現により確認できる。視細胞マーカーとしては、例えば、ロドプシン（桿体視細胞）、赤／緑オプシン（錐体視細胞）、青オプシン（錐体視細胞）、リカバリン（桿体視細胞、錐体視細胞）等が挙げられる。 The photoreceptor cells include rod photoreceptor cells and cone photoreceptor cells. Whether or not the produced cell is a photoreceptor can be confirmed by a method known per se, for example, expression of a photoreceptor marker. Examples of photoreceptor markers include rhodopsin (rod photoreceptor cells), red / green opsin (cone photoreceptor cells), blue opsin (cone photoreceptor cells), and recoverins (rod photoreceptor cells, cone photoreceptor cells). Can be mentioned.
また、製造された網膜層特異的神経細胞が、神経節細胞であるか否かは、公知の方法、例えば、神経節細胞マーカーの発現により確認できる。神経節細胞マーカーとしては、例えば、Ｂｒｎ３が挙げられる。 Further, whether or not the produced retinal layer-specific nerve cell is a ganglion cell can be confirmed by a known method, for example, expression of a ganglion cell marker. Examples of the ganglion cell marker include Brn3.
接着培養の終了後、網膜組織から視細胞前駆細胞又は視細胞が単離され得る。この単離は視細胞前駆細胞又は視細胞の表面マーカーに対する抗体等を用いて、自体公知の方法（セルソーター等）により行うことができる。また、培養の終了後、網膜組織から神経節細胞が単離され得る。この単離は神経節細胞の表面マーカーに対する抗体等を用いて、自体公知の方法（セルソーター等）により行うことができる。あるいは、多能性幹細胞として、視細胞前駆細胞のマーカー（例えばCrx）をコードする遺伝子や視細胞のマーカー（例えばリカバリン）、神経節細胞のマーカー（Brn3）に標識遺伝子（例えばＧＦＰ等の蛍光タンパク質）がインフレームにノックインされた細胞を用い、その標識遺伝子の発現を指標に、自体公知の方法（セルソーター等）によりそれぞれの細胞を単離することが出来る。 After completion of the adhesion culture, photoreceptor precursor cells or photoreceptor cells can be isolated from retinal tissue. This isolation can be carried out by a method known per se (cell sorter or the like) using an antibody against photoreceptor precursor cells or photoreceptor surface markers. Alternatively, ganglion cells can be isolated from retinal tissue after completion of culture. This isolation can be performed by a method known per se (cell sorter or the like) using an antibody against the surface marker of ganglion cells. Alternatively, as a pluripotent stem cell, a gene encoding a marker for photoreceptor progenitor cells (for example, Crx), a marker for photoreceptor cells (for example, recoverin), a marker gene for a marker for ganglion cells (Brn3) (for example, a fluorescent protein such as GFP) ) Can be isolated by a method known per se (cell sorter, etc.) using the cells knocked in frame and using the expression of the marker gene as an index.
＜網膜層特異的神経細胞の毒性・薬効評価用試薬としての使用＞
本発明製造方法により製造された網膜層特異的神経細胞は、網膜層特異的神経細胞の障害に基づく疾患の治療薬のスクリーニング、その他の原因による細胞損傷状態における治療薬に対しての細胞治療用移植用材料や疾患研究材料、創薬材料として利用可能である。また化学物質等の毒性・薬効評価においても、光毒性等の毒性研究、毒性試験等に活用可能である。
網膜層特異的神経細胞の障害に基づく疾患としては、例えば、有機水銀中毒、クロロキン網膜症、網膜色素変性症、加齢黄斑変性症、緑内障、糖尿病性網膜症、新生児網膜症、などが挙げられる。
<Use as a reagent for evaluating the toxicity and efficacy of retinal layer-specific neurons>
The retinal layer-specific nerve cell produced by the production method of the present invention is used for screening a therapeutic agent for a disease based on a disorder of a retinal layer-specific nerve cell, or for cell therapy against a therapeutic agent in a cell damage state caused by other causes. It can be used as a transplant material, disease research material, and drug discovery material. It can also be used for toxicity studies such as phototoxicity, toxicity tests, etc. in the evaluation of toxicity and drug efficacy of chemical substances.
Examples of diseases based on retinal layer-specific nerve cell disorders include organic mercury poisoning, chloroquine retinopathy, retinitis pigmentosa, age-related macular degeneration, glaucoma, diabetic retinopathy, retinopathy of newborn, etc. .
＜網膜層特異的神経細胞の移植用生体材料としての使用＞
本発明製造方法により製造された視細胞及び／又は神経節細胞は、細胞損傷状態において、当該細胞や、障害を受けた組織自体を補充する（例えば、移植手術に用いる）ためなどに用いる移植用生体材料として用いることができる。
<Use of retinal layer-specific neurons as biomaterial for transplantation>
The photoreceptor cells and / or ganglion cells produced by the production method of the present invention are used for transplantation in order to replenish the cells or the damaged tissue itself (for example, used for transplantation surgery) in a cell damage state. It can be used as a biomaterial.
以下の比較例および実施例により本発明をより具体的に説明するが、実施例は本発明の単なる例示を示すものにすぎず、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
（CrxノックインヒトES細胞の樹立）
視細胞前駆細胞のマーカー遺伝子の1つであるCrx遺伝子座にGFPをノックインしたヒトES細胞株の作製を実施した。
ヒトES細胞株（KhES-1：京都大学が樹立したヒトES細胞株）のゲノムDNA上Crx遺伝子を特異的に切断するZinc Finger Nuclease（ZFN）をSigmaAldrich社から購入した。単一細胞化したヒトES細胞を用いて、エレクトロポレーション法により、ZFNをコードするmRNAとGFP及び薬剤選択遺伝子であるネオマイシン耐性遺伝子が搭載されたノックインベクターを共導入し、マイトマイシンＣ処理したネオマイシン耐性マウス線維芽細胞上へ播種した。播種翌日から培地中にG418を添加し、薬剤選択を行った。得られた耐性クローンのコロニーをピックアップして培養を続け、PCR法やサザンブロット法により、ノックイン細胞を選別し、Crx::GFPノックインヒトES細胞株を樹立した。
The present invention will be described more specifically by the following comparative examples and examples. However, the examples are merely illustrative of the present invention and do not limit the scope of the present invention.
(Establishment of Crx knock-in human ES cells)
A human ES cell line in which GFP was knocked in at the Crx locus, which is one of the marker genes of photoreceptor precursor cells, was prepared.
Zinc Finger Nuclease (ZFN) that specifically cleaves the Crx gene on the genomic DNA of a human ES cell line (KhES-1: a human ES cell line established by Kyoto University) was purchased from SigmaAldrich. Neomycin treated with mitomycin C by co-introducing ZFN-encoding mRNA, GFP, and a knock-in vector loaded with a neomycin resistance gene, which is a drug selection gene, by electroporation using single humanized ES cells Seeded onto resistant mouse fibroblasts. From the day after sowing, G418 was added to the medium to select the drug. The obtained colonies of resistant clones were picked up and cultured, and knock-in cells were selected by PCR or Southern blotting to establish a Crx :: GFP knock-in human ES cell line.
実施例１：ヒトES細胞由来網膜組織のNotchシグナル作用物質処理
Crx::GFPノックインヒトＥＳ細胞（KhES-1由来）を「Ueno, M. et al. PNAS 2006」 「Watanabe, K. et al. Nat Biotech 2007」に記載の方法に倣って培養し、実験に用いた。培地にはDMEM/F12 培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に20%ＫＳＲ（Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．１ｍＭ ２−メルカプトエタノール、１ｍＭ ピルビン酸、5〜10ng/ml bFGFを添加したものを用いた。０．２５％ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＥＳ細胞を単一分散し、非細胞接着性の９６穴培養プレート（スミロン スフェロイド プレート，住友ベークライト社）の１ウェルあたり９×１０＾３細胞になるように１００μｌの無血清培地で３７℃、５％ＣＯ２で浮遊培養した。その際の無血清培地には、Ｇ−ＭＥＭ培地に２０％ＫＳＲ、０．１ｍＭ ２−メルカプトエタノール、１ｍＭ ピルビン酸、20μM Ｙ27632、Wntシグナル経路阻害物質（3μM IWR1e）を添加した無血清培地を用いた。また、浮遊培養2日目から容積あたり１／１００量のマトリゲルを添加して浮遊培養した。浮遊培養12日目に容積あたり１／１０量の牛胎児血清及びShhシグナル経路作用物質（100nM SAG）を添加し浮遊培養することで、網膜組織を製造した。浮遊培養開始29日目の網膜組織にNotchシグナル作用物質（10μM DAPT（ガンマセクレターゼ活性阻害剤））を添加し、浮遊培養開始41日目（添加後12日目）に蛍光顕微鏡観察、浮遊培養開始43日目（添加後14日目）に4%パラホルムアルデヒド固定し凍結切片を製造した。製造した凍結切片は視細胞のマーカー遺伝子の１つであるRecoverin、神経節細胞マーカー遺伝子の１つであるBrn3について免疫染色を行い、DAPT添加の有無の結果を比較した。
その結果、DAPTを添加しない場合（図１A）と比較し、DAPTを添加した場合、GFP発現細胞が著しく増加していた（図１B）。また、凍結切片の免疫染色の結果から、DAPTを添加するとRecoverin陽性細胞が3〜5倍増加していることが明らかとなった（図1C,D）。 これらの結果は、視細胞が著しく増加したことを示している。また、Brn3の免疫染色結果から神経節細胞もDAPT添加により増加したことが分かった（図1E,F）。
Example 1: Treatment of a human ES cell-derived retinal tissue with a Notch signal agent
Crx :: GFP knock-in human ES cells (derived from KhES-1) were cultured according to the methods described in “Ueno, M. et al. PNAS 2006” and “Watanabe, K. et al. Nat Biotech 2007”, Using. The medium used was a DMEM / F12 medium (Invitrogen) supplemented with 20% KSR (Knockout Serum Replacement; Invitrogen), 0.1 mM 2-mercaptoethanol, 1 mM pyruvic acid, 5-10 ng / ml bFGF. ES cells were monodispersed using 0.25% trypsin-EDTA (Invitrogen), and 9 × 10 ^ 3 cells per well of a non-cell-adhesive 96-well culture plate (Sumilon Spheroid Plate, Sumitomo Bakelite) The suspension culture was carried out in 100 μl of serum-free medium at 37 ° C. and 5% CO 2 . For the serum-free medium, use a serum-free medium with 20% KSR, 0.1 mM 2-mercaptoethanol, 1 mM pyruvic acid, 20 μM Y27632, Wnt signal pathway inhibitor (3 μM IWR1e) added to G-MEM medium. It was. Further, from the second day of suspension culture, 1/100 amount of Matrigel per volume was added and suspension culture was performed. On the 12th day of suspension culture, 1/10 amount of fetal calf serum and Shh signal pathway agonist (100 nM SAG) per volume were added and suspension culture was performed to produce retinal tissue. Addition of Notch signaling substance (10μM DAPT (gamma secretase activity inhibitor)) to retinal tissue on the 29th day from the start of suspension culture, observation on the fluorescence microscope on the 41st day (12 days after the addition), and suspension culture start On day 43 (14 days after the addition), 4% paraformaldehyde was fixed and frozen sections were prepared. The prepared frozen sections were immunostained for Recoverin, which is one of the marker genes for photoreceptor cells, and Brn3, which is one of the ganglion cell marker genes, and the results with and without DAPT added were compared.
As a result, compared with the case where DAPT was not added (FIG. 1A), when DAPT was added, GFP-expressing cells were significantly increased (FIG. 1B). In addition, the results of immunostaining of frozen sections revealed that Recoverin-positive cells increased 3 to 5 times when DAPT was added (FIGS. 1C and D). These results indicate a significant increase in photoreceptor cells. The results of Brn3 immunostaining showed that ganglion cells also increased with the addition of DAPT (FIGS. 1E and F).
実施例２：凍結融解後のヒトES細胞由来網膜組織のNotchシグナル作用物質処理
RAX::GFPノックインヒトＥＳ細胞（KhES-1由来）を「Ueno, M. et al. PNAS 2006」 「Watanabe, K. et al. Nat Biotech 2007」に記載の方法に倣って培養し、実験に用いた。培地にはDMEM/F12 培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に20%ＫＳＲ（Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．１ｍＭ ２−メルカプトエタノール、１ｍＭ ピルビン酸、5〜10ng/ml bFGFを添加したものを用いた。浮遊培養による網膜組織の製造には、０．２５％ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＥＳ細胞を単一分散し、非細胞接着性の９６穴培養プレート（スミロン スフェロイド プレート，住友ベークライト社）の１ウェルあたり９×１０＾３細胞になるように１００μｌの無血清培地で３７℃、５％ＣＯ２で浮遊培養した。その際の無血清培地には、Ｇ−ＭＥＭ培地に２０％ＫＳＲ、０．１ｍＭ ２−メルカプトエタノール、１ｍＭ ピルビン酸、20μM Ｙ27632、Wntシグナル経路阻害物質（3μM IWR1e）を添加した無血清培地を用いた。また、浮遊培養開始2日目から容積あたり１／１００量のマトリゲルを添加した無血清培地を用いた。また、培養2日目から容積あたり１／１００量のマトリゲルを添加して浮遊培養した。浮遊培養開始12日目に容積あたり１／１０量の牛胎児血清及びShhシグナル経路作用物質（100nM SAG）を添加し浮遊培養することで、網膜組織を製造した。製造した浮遊培養開始33日目の網膜組織を凍結融解後、浮遊培養開始38日目の網膜組織にNotchシグナル作用阻害物質（10μM DAPT）を添加し、浮遊培養開始49日目（添加後11日目）に蛍光顕微鏡観察を実施した後、4%パラホルムアルデヒド固定し凍結切片を製造した。製造した凍結切片は視細胞マーカー遺伝子の１つであるRecoverin、神経節細胞マーカー遺伝子の１つであるBrn3について免疫染色を行い、DAPT添加の有無の結果を比較した。
その結果、DAPTを添加しない場合（図2A）と比較し、DAPTを添加した場合、GFP発現細胞が著しく製造されていた（図2B）。また、凍結切片の免疫染色の結果から、DAPTを添加するとRecoverin陽性細胞が5倍程度製造されていることが明らかとなった（図2C,D）。これらの結果は、視細胞が著しく製造されたことを示している。また、Brn3の免疫染色結果から神経節細胞もDAPT添加により製造されたことが分かった（図2E,F）。
Example 2: Treatment of human ES cell-derived retinal tissue after freeze-thawing with a Notch signal agent
RAX :: GFP knock-in human ES cells (derived from KhES-1) were cultured according to the methods described in “Ueno, M. et al. PNAS 2006” and “Watanabe, K. et al. Nat Biotech 2007” and were used for experiments. Using. The medium used was a DMEM / F12 medium (Invitrogen) supplemented with 20% KSR (Knockout Serum Replacement; Invitrogen), 0.1 mM 2-mercaptoethanol, 1 mM pyruvic acid, 5-10 ng / ml bFGF. For the production of retinal tissue by suspension culture, ES cells are monodispersed using 0.25% trypsin-EDTA (Invitrogen), and a non-cell-adhesive 96-well culture plate (Sumilon Spheroid Plate, Sumitomo Bakelite Co., Ltd.) is used. Suspension culture was performed at 37 ° C. and 5% CO 2 in 100 μl of serum-free medium so that 9 × 10 3 cells per well were obtained. For the serum-free medium, use a serum-free medium with 20% KSR, 0.1 mM 2-mercaptoethanol, 1 mM pyruvic acid, 20 μM Y27632, Wnt signal pathway inhibitor (3 μM IWR1e) added to G-MEM medium. It was. In addition, a serum-free medium supplemented with 1/100 volume of Matrigel per volume from the second day of suspension culture was used. Further, from the second day of culture, 1/100 volume of Matrigel per volume was added, and suspension culture was performed. On the 12th day from the start of suspension culture, 1/10 amount of fetal calf serum and Shh signal pathway agonist (100 nM SAG) per volume were added and suspension culture was performed to produce retinal tissue. The prepared retinal tissue on the 33rd day of suspension culture was frozen and thawed, then Notch signaling inhibitor (10μM DAPT) was added to the retinal tissue on the 38th day of suspension culture, and the suspension culture was started on the 49th day (11 days after the addition). Eyes) were observed with a fluorescence microscope, and fixed with 4% paraformaldehyde, and frozen sections were prepared. The prepared frozen sections were immunostained for Recoverin, which is one of the photoreceptor marker genes, and Brn3, which is one of the ganglion cell marker genes, and the results with and without the addition of DAPT were compared.
As a result, GFP-expressing cells were remarkably produced when DAPT was added, compared to when DAPT was not added (FIG. 2A). The results of immunostaining of frozen sections revealed that Recoverin-positive cells were produced about 5 times when DAPT was added (FIGS. 2C and D). These results indicate that the photoreceptor cells were significantly produced. The results of Brn3 immunostaining showed that ganglion cells were also produced by the addition of DAPT (FIGS. 2E and F).
実施例３：ヒトES細胞から製造した網膜層特異的神経細胞の眼への移植
眼球の強膜切開後、強膜切開創から硝子体中に注射針を挿入し、眼圧を低下させる。強膜切開創から網膜下腔に細胞移植針を用いて眼内灌流液を注入し、人工的に浅い網膜剥離の状態を形成する。形成した空間に細胞移植針または細胞移植デバイスを用いて網膜層特異的神経細胞を移植する。
Example 3: Transplantation of retinal layer-specific nerve cells produced from human ES cells into the eye After the scleral incision of the eyeball, an injection needle is inserted into the vitreous from the scleral incision to reduce the intraocular pressure. An intraocular perfusate is injected from the scleral incision into the subretinal space using a cell transplant needle to artificially form a shallow retinal detachment state. Retinal layer-specific neurons are transplanted into the formed space using a cell transplant needle or a cell transplant device.
本発明製造方法によれば、高効率に網膜層特異的神経細胞を製造することができる。また、本願発明製造方法により製造した網膜層特異的神経細胞は、化学物質等の毒性・薬効評価を行うための試薬として使用できるため、非常に有用である。 According to the production method of the present invention, retinal layer-specific nerve cells can be produced with high efficiency. In addition, retinal layer-specific nerve cells produced by the production method of the present invention are very useful because they can be used as reagents for evaluating toxicity and drug efficacy of chemical substances and the like.
Claims (6)
製造された網膜組織に含まれる網膜前駆細胞に、Notchシグナル経路阻害物質を接触させることを特徴とする網膜層特異的神経細胞の製造方法。
（１）霊長類多能性幹細胞を、Wntシグナル経路阻害物質および血清代替物を含む無血清培地中で浮遊培養することにより霊長類多能性幹細胞の凝集体を形成させる第一工程
（２）第一工程で形成された凝集体を、基底膜標品および血清代替物を含む無血清培地中で浮遊培養する第二工程
（３）第二工程で培養された凝集体を、ソニック・ヘッジホッグシグナル経路作用物質を含む血清培地中で浮遊培養する第三工程 A primate pluripotent stem cell-derived retinal tissue is produced by the following steps (1) to (3) :
A method for producing retinal layer-specific nerve cells, which comprises contacting a retinal progenitor cell contained in the produced retinal tissue with a Notch signal pathway inhibitor.
(1) First step of forming primate pluripotent stem cell aggregates by suspension culture of primate pluripotent stem cells in a serum-free medium containing a Wnt signaling pathway inhibitor and a serum substitute
(2) Second step of suspension culture of the aggregate formed in the first step in a serum-free medium containing a basement membrane preparation and a serum substitute
(3) Third step of suspension culture of the aggregate cultured in the second step in a serum medium containing a sonic hedgehog signal pathway agent
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