JP6065073B2 - Microbe culture sheet - Google Patents
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Description
本発明は、微生物検査に用いられる微生物培養シートに関する。 The present invention relates to a microorganism culture sheet used for microorganism testing.
微生物の存在を確認したり、微生物数を測定したりする検査方法としては、寒天平板混釈法がある。この方法では、微生物が発育すると透明な寒天上に白濁したコロニーが形成されることから、このコロニーを計数することで生菌数検査を行っている。 As an inspection method for confirming the presence of microorganisms or measuring the number of microorganisms, there is an agar plate mixing method. In this method, when microorganisms grow, colonies that become cloudy are formed on transparent agar. Therefore, the viable cell count test is performed by counting the colonies.
しかし、このような寒天培地を用いる方法は、一般に培地を用時調製する必要があり、また、その調製作業が煩雑であるため、近年では、あらかじめ調製しておくことが可能で、且つ、被検液を接種することで微生物の発育が可能な環境が形成されるように設計された乾燥培地を備える微生物培養器具が開発されている。 However, in the method using such an agar medium, it is generally necessary to prepare the medium at the time of use, and the preparation work is complicated. Microbial culture devices having a dry medium designed so that an environment in which a microorganism can grow can be formed by inoculating a test solution have been developed.
例えば、特許文献１には、防水性基体上に、ゲル化剤及び／又は栄養成分を含有する冷水可溶粉末が接着剤により均一に接着された接着剤層を備えるシート状培養装置が開示されている。また、特許文献２には、防水性の基材シートの全面に、培地混合物や吸水性樹脂を塗布して培養層を形成し、該培養層の上に、接種する被検液の拡がりを一定にするための疎水性インキによる外枠層が形成されている微生物培養シートが開示されている。
For example,
ところで、微生物検査では、コロニーの計数が正確且つ容易に行える必要がある。上記特許文献１のシート状培養装置では、培地の用時調製の必要がなく、従来の寒天平板混釈法に比べて作業は簡易化されているが、その一方で、被検液を所定の範囲内に拡げるために、被検液を接種した後、専用のテンプレートをカバーシートの上から押し付けるという煩雑な作業を要する。この作業は、実際の検査結果に影響を及ぼす可能性が高く、慎重に行う必要がある。また、培養試験は１種類の検体につき数種類の希釈液を用いて行われるが、通常、検体は何種類もあるため、１つのシートに対して１回の上記作業が発生するたけでも大きな時間のロスにつながる。
By the way, in the microbial test, it is necessary to accurately and easily count the colonies. In the sheet-shaped culture apparatus of
これに対して、特許文献２の微生物培養シートでは、接種する被検液の拡がりを一定にするために、培養層上に疎水性インキによる外枠層が設けられているが、実際には、このような外枠層を設けただけでは、被検液が培養層上で均一に拡がらなかったり、枠外に遺漏したりする問題が発生し、被検液を培養層上に良好に拡げることは困難であった。
On the other hand, in the microorganism culture sheet of
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、培養層上に被検液を接種した後、その上にカバーシートを被せるだけで、接種した被検液を枠外に遺漏させることなく、培養層上に良好に拡げることができる、操作性に優れた微生物培養シートを提供することを目的とする。 The present invention has been made in view of the above circumstances, and after inoculating the test liquid on the culture layer, the cover test sheet can be covered on the culture layer without leaking the inoculated test liquid outside the frame. An object of the present invention is to provide a microorganism culture sheet excellent in operability that can be well spread on a culture layer.
本発明者らが鋭意研究を重ねたところ、カバーシートの培養層の表面と対向する側の面の被検液に対する接触角をある特定の数値範囲に調整することで、上記課題が解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。具体的には、以下のようなものを提供する。 As a result of extensive research conducted by the present inventors, the above problem can be solved by adjusting the contact angle of the surface of the cover sheet facing the culture layer to the test solution to a specific numerical range. The headline and the present invention were completed. Specifically, the following are provided.
（１） 基材シートと、上記基材シート上の所定の領域に形成された培養層と、上記培養層の外周又は上記培養層上に形成された、上記培養層上に接種される被検液の拡がる範囲を限定するための枠層と、上記培養層の表面を被覆するカバーシートと、を有し、上記カバーシートの上記培養層の表面と対向する側の面は、ＪＩＳ Ｒ３２５７に準拠したぬれ性試験方法の静滴法による水に対する接触角が５０〜１０５°の範囲内である微生物培養シート。 (1) A base material sheet, a culture layer formed in a predetermined region on the base material sheet, and a test to be inoculated on the culture layer formed on the periphery of the culture layer or on the culture layer A frame layer for limiting the range in which the liquid spreads, and a cover sheet that covers the surface of the culture layer, and the surface of the cover sheet facing the surface of the culture layer conforms to JIS R3257 The microorganism culture sheet whose contact angle with respect to water by the sessile drop method of the wettability test method is in the range of 50 to 105 °.
（２） 上記培養層は、ポリビニルピロリドンと、ゲル化剤、栄養成分、発色指示薬、選択剤、及び基質からなる群より選択される少なくとも１種と、を含有する培地液がパターン形成されたものである（１）に記載の微生物培養シート。 (2) The culture layer is formed by patterning a medium solution containing polyvinylpyrrolidone and at least one selected from the group consisting of a gelling agent, a nutritional component, a coloring indicator, a selective agent, and a substrate. The microorganism culture sheet according to (1), wherein
（３） 上記枠層は、疎水性樹脂からなる（１）又は（２）に記載の微生物培養シート。 (3) The microorganism culture sheet according to (1) or (2), wherein the frame layer is made of a hydrophobic resin.
（４） 上記カバーシートは、上記基材シートに固設されている（１）〜（３）いずれかに記載の微生物培養シート。 (4) The microorganism culture sheet according to any one of (1) to (3), wherein the cover sheet is fixed to the base sheet.
本発明の微生物培養シートによれば、培養層上に被検液を接種した後、その上からカバーシートを被せるだけで、接種した被検液を枠外に遺漏させることなく、培養層上に良好に拡げることができ、操作性に優れるので、微生物検査を効率的に行うことが可能となる。 According to the microorganism culture sheet of the present invention, after inoculating the test solution on the culture layer, the cover layer is simply covered with the cover sheet, so that the inoculated test solution is not leaked out of the frame and is excellent on the culture layer. Since the operability is excellent, the microbial test can be performed efficiently.
以下、本発明の具体的な実施形態について詳細に説明するが、本発明は、以下の実施形態に何ら限定されるものではなく、本発明の目的の範囲内において、適宜変更を加えて実施することができる。 Hereinafter, specific embodiments of the present invention will be described in detail. However, the present invention is not limited to the following embodiments, and may be implemented with appropriate modifications within the scope of the object of the present invention. be able to.
［微生物培養シート］
本発明の微生物培養シートは、基材シートと、上記基材シート上の所定の領域に形成された培養層と、上記培養層の外周又は上記培養層上に形成された、上記培養層上に接種される被検液の拡がる範囲を限定するための枠層と、上記培養層の表面を被覆するカバーシートと、を有し、上記カバーシートの上記培養層の表面と対向する側の面は、ＪＩＳ Ｒ３２５７に準拠したぬれ性試験方法の静滴法による水に対する接触角が５０〜１０５°の範囲内であることを特徴とする。
[Microbe culture sheet]
The microorganism culture sheet of the present invention includes a base sheet, a culture layer formed in a predetermined region on the base sheet, and an outer periphery of the culture layer or the culture layer formed on the culture layer. It has a frame layer for limiting the range of the test solution to be inoculated, and a cover sheet that covers the surface of the culture layer, and the surface of the cover sheet facing the surface of the culture layer is The contact angle to water by the sessile drop method of the wettability test method based on JIS R3257 is in the range of 50 to 105 °.
本発明の微生物培養シートによれば、培養層上に被検液を接種した後、その上からカバーシートを被せるだけで、接種した被検液を枠外に遺漏させることなく、培養層上に良好に拡げることができ、操作性に優れることから、効率的な微生物検査を実現することができる。従来より、被検液の拡がる範囲を限定するための枠層を有する微生物培養シートは報告されているが、枠層を設けただけでは、被検液の接種後にカバーシートを被せると被検液が均一に拡がらず、また、被検液がカバーシートをつたって枠外に遺漏することがあった。本発明の微生物培養シートでは、被検液と接触するカバーシートに着目し、該カバーシートの被検液と接触する側の面、すなわち、培養層の表面と対向する側の面の被検液に対する接触角をある特定の数値範囲に調整することで、上記の従来の問題点が解決できることを見出した点に意義がある。 According to the microorganism culture sheet of the present invention, after inoculating the test solution on the culture layer, the cover layer is simply covered with the cover sheet, so that the inoculated test solution is not leaked out of the frame and is excellent on the culture layer. Since it is easy to operate and has excellent operability, it is possible to realize an efficient microbial test. Conventionally, a microorganism culture sheet having a frame layer for limiting the range in which the test solution spreads has been reported. However, if a cover layer is placed after inoculation of the test solution only by providing the frame layer, the test solution May not spread evenly, and the test liquid may leak out of the frame through the cover sheet. In the microorganism culture sheet of the present invention, paying attention to the cover sheet in contact with the test solution, the test solution on the surface of the cover sheet that contacts the test solution, that is, the surface on the side facing the surface of the culture layer It is significant that it has been found that the above-mentioned conventional problems can be solved by adjusting the contact angle with respect to a certain numerical range.
本発明の一実施形態に係る微生物培養シートを図１（Ａ）、（Ｂ）に示す。図１（Ａ）は部分透視平面図であり、図１（Ｂ）は、図１（Ａ）に示す矢印Ｘ−Ｘ’に沿って切断した断面図である。なお、本明細書において以下に示す各図（図１，２）、模式的に示した図であり、各部の大きさや形状は、理解を容易にするために適宜誇張して示している。 A microorganism culture sheet according to an embodiment of the present invention is shown in FIGS. 1A is a partially transparent plan view, and FIG. 1B is a cross-sectional view taken along the arrow X-X ′ shown in FIG. In the present specification, the following drawings (FIGS. 1 and 2) are shown schematically, and the size and shape of each part are appropriately exaggerated for easy understanding.
本発明の一実施形態に係る微生物培養シート１では、方形の基材シート１０上に円形の培養層２０が形成され、培養層２０の外周には疎水性樹脂からなる円形の枠層３０が形成されている。すなわち、基材シート１０と枠層３０とにより形成された凹部領域に培養層２０が形成されている形態となっている。ここで、培養層２０と枠層３０との間には隙間がなく、両層は接触している。そして、培養層２０と枠層３０とを被覆するように、方形の透明カバーシート４０が設けられている。カバーシート４０の培養層２０の表面と対向する側の面の接触角は、被検液を良好に拡げることができる数値に調整されている。
In the
本発明の一実施形態に係る微生物培養シート１によれば、培養層２０上に被検液を接種した後、その上からカバーシート４０を被せるだけで、カバーシート４０と接触した被検液が枠外に遺漏することなく培養層２０上で速やかに拡がる。そして、被検液の拡がりは、培養層２０の外周に形成されている枠層３０によって制限されて、均一なものとなる。また、本発明の一実施形態に係る微生物培養シート１では、枠層３０は培養層２０の外周に形成されており、培養層２０上に形成されていないので、培養層２０が被検液の吸水により膨潤してゲル状となった際に崩れるおそれがない。さらに、培養層２０と枠層３０とは接触しているので、隙間に被検液が貯留することがない。
According to the
以下、本発明の実施形態に係る微生物培養シートの各構成について、詳細に説明する。 Hereinafter, each structure of the microorganism culture sheet which concerns on embodiment of this invention is demonstrated in detail.
＜基材シート＞
本発明の微生物培養シートでは、基材シート上に培養層が形成されるため、基材シートは、耐溶媒性や印刷適性を有していることが好ましい。また、基材シートには、微生物培養シートとして耐水性が求められ、さらに、培養層を形成する際の乾燥処理に耐え得る耐熱性も求められる。基材シートは、上記のような耐水性及び耐熱性を有していれば、特に限定されるものではないが、例えば、ポリエステル系樹脂、ポリエチレン系樹脂、ポリプロピレン系樹脂、ポリスチレン系樹脂、ポリカーボネート系樹脂、ポリ塩化ビニル系樹脂等の公知の樹脂を材料とする合成樹脂シートが、透明性に優れる点において好ましい。微生物培養シートは、培養層中で発育した微生物のコロニーを観察、計数するものであるが、基材シートの透明性が高いと、微生物培養シートの背面側（基材シート側）からの投射光や側面側からの入射光によりコロニーの視認性を高めることができるので、コロニーの計測が容易となる。なお、透明性は必ずしも要求されるものではなく、例えば、微生物の種類、コロニーの着色の有無等によっては、発泡により白色を呈するシートや着色されたシートを用いてもコロニーの計測に影響がない場合があるので、適宜選択すればよい。
<Base material sheet>
In the microorganism culture sheet of the present invention, since the culture layer is formed on the base material sheet, the base material sheet preferably has solvent resistance and printability. In addition, the substrate sheet is required to have water resistance as a microorganism culture sheet, and further to have heat resistance that can withstand a drying treatment when forming a culture layer. The base sheet is not particularly limited as long as it has water resistance and heat resistance as described above. For example, a polyester resin, a polyethylene resin, a polypropylene resin, a polystyrene resin, and a polycarbonate resin A synthetic resin sheet made of a known resin such as a resin or a polyvinyl chloride resin is preferable in terms of excellent transparency. The microorganism culture sheet is for observing and counting the colonies of microorganisms that have grown in the culture layer. If the substrate sheet is highly transparent, the projection light from the back side (substrate sheet side) of the microorganism culture sheet Since the visibility of the colonies can be enhanced by the incident light from the side and the side, the colonies can be easily measured. Transparency is not always required. For example, depending on the type of microorganism, the presence or absence of coloring of the colony, even if a white sheet or colored sheet is used due to foaming, colony measurement is not affected. In some cases, it may be selected as appropriate.
基材シートは、単層でもよいし、２層以上の積層シートでもよい。積層シートとしては、例えば、上記プラスチックシートの２種以上を積層した積層シートが挙げられる。そのほか、上記プラスチックシートに紙基材を積層した積層シート、紙基材に合成樹脂をコーティングした積層シート等も好適に用いることができる。また、合成樹脂を主原料とした合成紙も用いることができる。このような合成紙の市販品としては、例えば、ユポ・コーポレーション社製の「ユポ」、東洋紡社製の「クリスパー」等が挙げられる。 The base sheet may be a single layer or a laminated sheet having two or more layers. As a laminated sheet, the laminated sheet which laminated | stacked 2 or more types of the said plastic sheet is mentioned, for example. In addition, a laminated sheet in which a paper base material is laminated on the plastic sheet, a laminated sheet in which a paper base material is coated with a synthetic resin, and the like can be suitably used. Further, synthetic paper using synthetic resin as a main raw material can also be used. Examples of such commercially available synthetic paper include “YUPO” manufactured by Yupo Corporation, “Chrisper” manufactured by Toyobo Co., Ltd., and the like.
また、基材シートは、培養層との密着性を向上させるために、あらかじめ培養層を形成する側の面に表面処理を施したものでもよい。基材シートに対する表面処理としては、特に限定されるものではなく、例えば、コロナ放電処理、オゾン処理、グロー放電処理、酸素ガス又は窒素ガス等を用いる低温プラズマ処理等の公知の表面処理が挙げられる。また、アンカーコート剤の塗布により表面処理を施したものでもよい。 Moreover, in order to improve the adhesiveness with the culture layer, the base sheet may have been subjected to surface treatment on the surface on which the culture layer is formed in advance. The surface treatment for the substrate sheet is not particularly limited, and examples thereof include known surface treatments such as corona discharge treatment, ozone treatment, glow discharge treatment, and low-temperature plasma treatment using oxygen gas or nitrogen gas. . Moreover, what surface-treated by application | coating of an anchor coating agent may be used.
さらに、基材シートは、カール等がなく平坦であることが好ましい。厚みは、特に限定されるものではなく、通常、２５〜１５００μｍ、好ましくは５０〜５００μｍである。また、本実施形態では、基材シートの形状は方形であるが、これに限定されるものではなく、円形、楕円形、多角形等であってもよい。基材シートの大きさも、特に限定されるものではなく、通常、３０〜１００ｃｍ２である。 Furthermore, the base sheet is preferably flat without curling. The thickness is not particularly limited, and is usually 25 to 1500 μm, preferably 50 to 500 μm. Moreover, in this embodiment, although the shape of a base material sheet is a square, it is not limited to this, Circular, an ellipse, a polygon, etc. may be sufficient. The magnitude | size of a base material sheet is also not specifically limited, Usually, it is 30-100 cm < 2 >.
基材シートには、桝目柄が印刷されていてもよい。桝目柄が印刷された基材シートによれば、コロニーが多数形成された場合に、数ヶ所の枡目内の菌数を計測按分するだけで、おおよその全体数を求めることができるので、効率的な微生物検査が可能となる。使用するインクは、水に不溶で、微生物の生育に影響を与えないものを使用することが好ましい。印刷の版式は、着色剤、樹脂、溶剤等の選択範囲が広い点でグラビア印刷が好ましい。枡目の大きさは１ｃｍ角程度が適当である。 A checkerboard pattern may be printed on the base sheet. According to the base material sheet printed with a checkerboard pattern, when a large number of colonies are formed, the approximate total number can be obtained simply by measuring and apportioning the number of bacteria in a few checkerboards. Microbial testing is possible. It is preferable to use an ink that is insoluble in water and does not affect the growth of microorganisms. The printing plate type is preferably gravure printing because it has a wide selection range of colorants, resins, solvents and the like. The size of the mesh is about 1 cm square.
＜培養層＞
本発明の微生物培養シートでは、上記基材シート上の所定の領域に、培養層が形成されている。培養層は、被検液等に由来する水分を含むことで微生物の発育が可能な環境を形成できるものであればよく、例えば、コロニーの形成が可能な足場となるもの（例えば、ゲル状物質、増粘物質等）に、微生物の発育を促進するための栄養成分や微生物の検出を容易にするための成分等を含有させた培地液がパターン形成された後、乾燥されたものが挙げられる。好ましくは、バインダーに、ゲル化剤、栄養成分、発色指示薬、選択剤、及び基質からなる群より選択される少なくとも１種を含有させた培地液が印刷や塗布によりパターン形成された後、乾燥されたものである。ここで、バインダーとは、ゲル化剤、栄養成分、発色指示薬、選択剤、基質等を基材に固着させる役割を有するものであり、例えば、ポリビニルピロリドン、ポリエチレンオキサイド、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルアルコール等が挙げられる。これらの中でもポリビニルピロリドンが好ましい。ポリビニルピロリドンは、濃度を調整することで容易に粘度調整することができるので、ゲル化剤、栄養成分等を均一に分散させやすく、また、上記基材シート上の必要な部分へのパターン形成も行いやすい。さらに、ポリビニルピロリドンは皮膜性が高いので、パターン形成後に溶媒を除去すると、ゲル化剤、栄養成分等を取り込んだ成膜が可能である。そして、基材シートに対して良好な密着性を示すので、接着剤を使用せずに培養層を形成することができる。
<Culture layer>
In the microorganism culture sheet of the present invention, a culture layer is formed in a predetermined region on the substrate sheet. The culture layer only needs to be capable of forming an environment in which microorganisms can grow by containing water derived from a test solution or the like. For example, the culture layer serves as a scaffold capable of forming colonies (for example, a gel-like substance). , Thickeners, etc.) are formed after patterning a medium solution containing nutrient components for promoting the growth of microorganisms and components for facilitating the detection of microorganisms, and then dried. . Preferably, a medium solution containing at least one selected from the group consisting of a gelling agent, a nutritional component, a coloring indicator, a selection agent, and a substrate is formed into a binder by patterning by printing or application, and then dried. It is a thing. Here, the binder has a role of fixing a gelling agent, a nutritional component, a coloring indicator, a selective agent, a substrate and the like to the base material, for example, polyvinylpyrrolidone, polyethylene oxide, hydroxypropylcellulose, polyvinyl alcohol, etc. Is mentioned. Among these, polyvinylpyrrolidone is preferable. Since the viscosity of polyvinylpyrrolidone can be easily adjusted by adjusting the concentration, it is easy to uniformly disperse the gelling agent, nutrients, etc. In addition, pattern formation on the necessary part on the substrate sheet is also possible. Easy to do. Furthermore, since polyvinylpyrrolidone has a high film property, if the solvent is removed after pattern formation, film formation incorporating a gelling agent, nutrient components, and the like is possible. And since a favorable adhesiveness is shown with respect to a base material sheet, a culture layer can be formed, without using an adhesive agent.
ゲル化剤を含有する培地液を乾燥させた培養層は、被検液の接種により増粘又はゲル化し、微生物の発育に適した環境となる。また、カバーシートとの密着性が向上するので、培養時の水分の蒸発を抑制することもできる。ゲル化剤としては、例えば、カラギーナン、グアーガム、キタンサンガム、ローカストビーンガム、アルギン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース等の高分子多糖類が好適である。高分子多糖類をゲル化剤として用いた培養層は、透明性が高いので視認性に優れるからである。本発明の微生物培養シートでは、特に、グアーガムが好適である。グアーガムによれば、低濃度で極めて高い粘度を呈するので、少量で菌の発育に適した環境を作ることができる。 The culture layer obtained by drying the medium solution containing the gelling agent is thickened or gelled by inoculation with the test solution, and becomes an environment suitable for the growth of microorganisms. Moreover, since adhesiveness with a cover sheet improves, it can also suppress the evaporation of the water | moisture content at the time of culture | cultivation. As the gelling agent, for example, high-molecular polysaccharides such as carrageenan, guar gum, chitansan gum, locust bean gum, algin, carboxymethylcellulose, and hydroxyethylcellulose are suitable. This is because a culture layer using a high molecular polysaccharide as a gelling agent is highly transparent and has excellent visibility. In the microorganism culture sheet of the present invention, guar gum is particularly suitable. According to guar gum, an extremely high viscosity is exhibited at a low concentration, so that an environment suitable for the growth of bacteria can be created with a small amount.
栄養成分は、検査対象である微生物の種類に応じて、適宜選択することができる。例えば、一般生菌検査用としては、酵母エキス／ペプトン／ブドウ糖混合物、肉エキス／ペプトン混合物、ペプトン／大豆ペプトン／ブドウ糖混合物等や、これらにリン酸二カリウム及び／又は塩化ナトリウムを加えた混合物が挙げられ、大腸菌又は大腸菌群検査用としては、デソキシコール酸ナトリウム／ペプトン／クエン酸鉄アンモニウム／塩化ナトリウム／リン酸二カリウム／乳糖混合物、ペプトン／乳糖／リン酸二カリウム混合物等が挙げられる。本発明の微生物培養シートでは、これらの中から、発育させようとする微生物の種類に応じて、１種又はそれ以上の栄養成分を選択し、混合して用いることができる。なお、培養層中に栄養成分を含まない場合や不足する栄養成分がある場合には、被検液に栄養成分を加え、微生物を生育してもよい。 The nutrient component can be appropriately selected according to the type of microorganism to be examined. For example, for the inspection of general viable bacteria, yeast extract / peptone / glucose mixture, meat extract / pepton mixture, peptone / soybean peptone / glucose mixture, etc., and a mixture obtained by adding dipotassium phosphate and / or sodium chloride to these. Examples of the Escherichia coli or coliform group test include sodium desoxycholate / peptone / ammonium iron citrate / sodium chloride / dipotassium phosphate / lactose mixture, and peptone / lactose / dipotassium phosphate mixture. In the microorganism culture sheet of the present invention, one or more nutrient components can be selected from these according to the type of microorganism to be grown and mixed for use. In addition, when a nutrient layer is not included in a culture layer, or when there is a lacking nutrient component, a nutrient component may be added to the test solution to grow a microorganism.
発色指示薬を含有する場合には、発色指示薬が培養過程で発育する微生物の代謝により産出される特異物質との反応、ｐＨ変化の認識、酵素との反応等によって発色してコロニーを着色するので、コロニー数の計数が極めて容易になる。このような発色指示薬としては、例えば、トリフェニルテトラゾリウムクロライド（ＴＴＣ）、ｐ−トリルテトラゾリウムレッド、テトラゾリウムバイオレット、ペテトリルテトラゾリウムブルー等のテトラゾリム塩、ニュートラルレッド混合物、フェノールレッド、ブロムチモールブルー、チモールブルー混合物等のｐＨ指示薬が挙げられる。 When it contains a color indicator, the color indicator develops color by reacting with specific substances produced by the metabolism of microorganisms that develop during the culture process, recognizing pH changes, reaction with enzymes, etc. Counting the number of colonies is extremely easy. Examples of such a color indicator include tetrazolim salts such as triphenyltetrazolium chloride (TTC), p-tolyltetrazolium red, tetrazolium violet, petetryltetrazolium blue, neutral red mixture, phenol red, bromthymol blue, and thymol blue mixture. PH indicators such as
検出目的以外の微生物の発育を抑える選択剤を含有してもよい。選択剤としては、例えば、抗生物質、合成抗菌剤、界面活性剤、静菌又は殺菌作用を有する色素、無機塩等が挙げられる。 You may contain the selection agent which suppresses the growth of microorganisms other than the detection objective. Examples of the selective agent include antibiotics, synthetic antibacterial agents, surfactants, bacteriostatic or bactericidal dyes, inorganic salts, and the like.
本発明の微生物培養シートでは、培養層は、上記基材シートの全面に形成されていてもよく、特定の領域に形成されていてもよいが、栄養成分や発色指示薬は高価であるため、材料コストを考慮すると、特定の領域にパターン形成されていることが好ましい。本発明において、パターン形成とは、上記基材シートの上に、上記成分を含有する培地液を予定した形状に印刷、塗布、塗工、噴霧等することをいい、その方法は、特に限定されるものではない。例えば、スクリーン印刷、グラビア印刷、凸版印刷、転写印刷、フレキソ印刷、その他の印刷、ディスペンサーやインクジェット等による塗布、バー等を使用してコーティングするバーコートやナイフコート、ダイコート等の塗工、スプレー方式等の噴霧、その他の方法を用いることができる。パターン形成される培養層の形状は、円形が好ましい。例えば、培養層の形状が方形であると被検液が隅の方まで行き渡らない場合が起こり得るが、円形であればそのようなことが起こり難いからである。パターン形成される培養層の形状が円形の場合には、その直径は、好ましくは２０〜８０ｍｍ、より好ましくは３０〜７０ｍｍである。 In the microorganism culture sheet of the present invention, the culture layer may be formed on the entire surface of the substrate sheet, or may be formed in a specific region. Considering the cost, it is preferable that the pattern is formed in a specific region. In the present invention, the pattern formation refers to printing, coating, coating, spraying, etc. on the base sheet in a predetermined shape with the medium solution containing the above components, and the method is particularly limited. It is not something. For example, screen printing, gravure printing, letterpress printing, transfer printing, flexographic printing, other printing, application by dispenser or inkjet, bar coating, knife coating, die coating, etc. coating using a bar, spray method Or other methods can be used. The shape of the culture layer to be patterned is preferably circular. For example, if the culture layer has a square shape, the test solution may not reach the corners, but if it has a circular shape, this is unlikely to occur. When the shape of the culture layer to be patterned is circular, the diameter is preferably 20 to 80 mm, more preferably 30 to 70 mm.
微生物培養シートでは、培養層には、ある程度の厚みが必要である。培養層の厚みは、乾燥後において、５０〜１０００μｍであることが好ましく、２００〜６００μｍであることがより好ましい。また、培養層を形成するための培地液の塗布量は、乾燥後において、５〜４００ｇ／ｍ２であることが好ましく、１００〜３００ｇ／ｍ２であることがより好ましい。 In the microorganism culture sheet, the culture layer needs to have a certain thickness. The thickness of the culture layer is preferably 50 to 1000 μm, more preferably 200 to 600 μm after drying. The coating amount of the medium liquid for forming the culture layer, after drying, is preferably 5~400g / m 2, and more preferably 100 to 300 g / m 2.
＜枠層＞
本発明の微生物培養シートでは、上記培養層上に接種される被検液の拡がる範囲を限定するための枠層が形成されている。枠層は、上記培養層の上に形成されていてもよく、上記培養層の外周に形成されていてもよいが、培養層の上に形成されていると、培養層が被検液の吸水により膨潤してゲル状となった際に、崩れるおそれがあるため、上記培養層の外周に、すなわち、基材シートの上に直接であって、且つ、培養層の外周を囲むように形成されていることが好ましい。この場合、枠層と培養層との間に隙間があると、微生物を培養した際にその隙間に菌が遊走し、正確なコロニー数の計測が困難となる場合があるため、枠層と培養層との間には隙間がないことがより好ましい。
<Frame layer>
In the microorganism culture sheet of the present invention, a frame layer for limiting the range in which the test solution inoculated on the culture layer spreads is formed. The frame layer may be formed on the culture layer or may be formed on the outer periphery of the culture layer. However, when the frame layer is formed on the culture layer, the culture layer absorbs the test solution. Is formed on the outer periphery of the culture layer, that is, directly on the substrate sheet and surrounding the outer periphery of the culture layer. It is preferable. In this case, if there is a gap between the frame layer and the culture layer, when the microorganism is cultured, the bacteria may migrate to the gap and it may be difficult to accurately measure the number of colonies. More preferably, there are no gaps between the layers.
枠層は、疎水性樹脂からなることが好ましい。疎水性樹脂としては、特に限定されるものではないが、ＵＶ硬化樹脂又はホットメルト樹脂が好適である。枠層は、一定の高さでパターン形成することが好ましいが、ＵＶ硬化樹脂やホットメルト樹脂によれば、非溶媒系の状態でディスペンサー等による塗布により容易に形状加工ができ、加工後も光照射や冷却により硬化させるだけで容易にパターン形成できるからである。ＵＶ硬化樹脂としては、特に限定されるものではなく、例えば、ラジカル型では、アクリレート系、不飽和ポリエステル系が挙げられ、カチオン型では、エポキシアクリレート系、オキセタン系、ビニルエーテル系等を挙げることができる。ホットメルト樹脂としては、軟化点温度が１２０℃以下、より好ましくは１００℃以下のものが好適である。１２０℃を超えると基材シートが湾曲する場合がある。ホットメルト樹脂としては、例えば、ウレタン系、ポリアミド系、ポリオレフィン系、ポリエステル系、エチレン酢酸ビニル系、スチレンブタジエンゴム系やウレタンゴム系等の合成ゴム系等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。その他、熱発泡インクやＵＶ発泡剤等も好適に用いることができる。 The frame layer is preferably made of a hydrophobic resin. Although it does not specifically limit as hydrophobic resin, UV curable resin or hot-melt resin is suitable. The frame layer is preferably patterned at a certain height. However, with UV curable resin or hot melt resin, the shape can be easily processed by application with a dispenser or the like in a non-solvent system. This is because the pattern can be easily formed only by curing by irradiation or cooling. The UV curable resin is not particularly limited. For example, the radical type includes an acrylate type and an unsaturated polyester type, and the cationic type includes an epoxy acrylate type, an oxetane type, and a vinyl ether type. . As the hot melt resin, those having a softening point temperature of 120 ° C. or lower, more preferably 100 ° C. or lower are suitable. If it exceeds 120 ° C, the substrate sheet may be curved. Examples of the hot melt resin include, but are not limited to, urethane, polyamide, polyolefin, polyester, ethylene vinyl acetate, styrene butadiene rubber, urethane rubber, and other synthetic rubber is not. In addition, a thermal foaming ink, a UV foaming agent, etc. can also be used suitably.
枠層をパターン形成する方法としては、上記疎水性樹脂を予定した形状で基材シートに印刷、塗布、塗工できるものであれば、特に限定されるものではなく、例えば、スクリーン印刷、グラビア印刷、凸版印刷、転写印刷、フレキソ印刷等の印刷、ディスペンサーによる塗布、バー等を使用してコーティングするバーコートやナイフコート、ダイコート等の塗工等が挙げられる。これらの中でも、ディスペンサーによる塗布は、版を作製する必要がなく、プログラムを作成することで様々な形状を容易に描画することができる点において好ましい。 The method for forming the frame layer pattern is not particularly limited as long as the hydrophobic resin can be printed, applied, and coated on the base sheet in a predetermined shape. For example, screen printing and gravure printing are possible. In addition, printing such as letterpress printing, transfer printing, flexographic printing, coating with a dispenser, coating such as bar coating, knife coating, and die coating using a bar or the like can be given. Among these, application by a dispenser is preferable in that it is not necessary to prepare a plate, and various shapes can be easily drawn by creating a program.
枠層の幅は、均一な幅に限定されるものではないが、最細部の幅が、０．５〜５．０ｍｍであることが好ましく、１．０〜３．０ｍｍであることがより好ましい。上記範囲であれば、培養層が吸水して膨潤した場合であっても、枠層の形状が崩れるおそれがない。また、枠層の高さは、被検液が接種された培養層にカバーシートを被せた際に、被検液と、該被検液に対する接触角を調整したカバーシートの面とが接触可能となる高さであれば、特に限定されるものではない。被検液と、該被検液に対する接触角を調整したカバーシートの面とが接触することで、被検液が培養層の上を枠層まで速やかに拡がり、被検液が培養層に吸水された後も、培養層とカバーシートとの密着性を保つことができ、培養中に培養層が乾燥することを防止できる。例えば、培養層の高さよりも１００〜１２００μｍ高いことが好ましく、２００〜１０００μｍ高いことがより好ましく、３００〜８００μｍ高いことがさらにより好ましい。 The width of the frame layer is not limited to a uniform width, but the most detailed width is preferably 0.5 to 5.0 mm, more preferably 1.0 to 3.0 mm. . If it is the said range, even if it is a case where a culture layer absorbs water and swells, there is no possibility that the shape of a frame layer may collapse. The height of the frame layer is such that when the cover sheet is placed on the culture layer inoculated with the test liquid, the test liquid can be brought into contact with the surface of the cover sheet whose contact angle with the test liquid is adjusted. If it becomes the height which becomes, it will not specifically limit. The test solution and the surface of the cover sheet with the contact angle adjusted to the test solution come into contact with each other, so that the test solution spreads quickly over the culture layer to the frame layer, and the test solution absorbs water into the culture layer. Even after the treatment, the adhesion between the culture layer and the cover sheet can be maintained, and the culture layer can be prevented from drying during the culture. For example, it is preferably 100 to 1200 μm higher than the culture layer height, more preferably 200 to 1000 μm higher, and even more preferably 300 to 800 μm higher.
なお、本発明の微生物培養シートでは、枠層は、疎水性材料のくりぬき品を培養層の外周に接着して形成されたものであってもよい。 In the microorganism culture sheet of the present invention, the frame layer may be formed by bonding a hollow material of a hydrophobic material to the outer periphery of the culture layer.
＜カバーシート＞
本発明の微生物培養シートは、培養中の落下菌等による汚染を防止するとともに、培養層の水分蒸発を防止するために、カバーシートを備えている。本発明の微生物培養シートでは、カバーシートの培養層の表面と対向する側の面、すなわち、培養層上に被検液を接種し、その上からカバーシートを被せた際に被検液と接触する面は、ＪＩＳ Ｒ３２５７に準拠したぬれ性試験方法の静滴法による水に対する接触角が５０〜１０５°範囲内である。接触角は、具体的には、ＪＩＳ Ｒ３２５７の「基板ガラス表面のぬれ性試験方法」内の「６．静滴法」に記載された方法に準拠（試験方法の種類：静滴法，試験対象：カバーシートの培養層の表面と対向する側の面，水滴の容量：４μｌ，測定時間：水滴を静置してから１０秒間，測定場所：５箇所）し、市販の接触角計により測定する。測定装置としては、例えば、協和界面化学社製の接触角計（製品名「ＤＭ５００」）を用いることができる。培養層の表面と対向する側の面の接触角が、５０〜１０５°範囲内であるカバーシートであれば、被検液を培養層上に接種した後、その上から被せるだけで被検液を迅速に且つ良好に培養層上に拡げることができる。なお、上記接触角が５０°未満であると、カバーシートを被せた際に、接種した被検液がカバーシートをつたって培養層上で不均一に拡がったり、枠外に遺漏したりする。また、上記接触角が１０５°を超えると、カバーシートを被せただけでは、被検液の拡がりが遅く、また、均一に拡げることができないため、作業効率が低下する。さらに、一般的に、上記接触角が１０５°を超えるシートは、製造が非常に困難であり、かなりの工夫を要するため、その使用は現実的ではない。なお、好ましくは、６０〜１００°の範囲内である。
<Cover sheet>
The microorganism culture sheet of the present invention includes a cover sheet in order to prevent contamination by falling bacteria during the culture and to prevent moisture evaporation of the culture layer. In the microorganism culture sheet of the present invention, the surface of the cover sheet facing the surface of the culture layer, that is, inoculating the test liquid on the culture layer and contacting the test liquid when the cover sheet is covered from above The surface to be contacted has a contact angle with respect to water by a sessile drop method of a wettability test method based on JIS R3257 within a range of 50 to 105 °. Specifically, the contact angle conforms to the method described in “6. Droplet method” in “Test method for wettability of substrate glass surface” of JIS R3257 (type of test method: drop method, test object : Surface of the cover sheet facing the surface of the culture layer, water droplet volume: 4 μl, measurement time: 10 seconds after leaving the water drop, measurement location: 5 locations), and measurement with a commercially available contact angle meter . As a measuring device, for example, a contact angle meter (product name “DM500”) manufactured by Kyowa Interface Chemical Co., Ltd. can be used. If the cover sheet has a contact angle of the surface facing the surface of the culture layer within the range of 50 to 105 °, the test solution is simply inoculated on the culture layer after being inoculated on the culture layer. Can be rapidly and well spread on the culture layer. When the contact angle is less than 50 °, when the cover sheet is covered, the inoculated test solution spreads unevenly on the culture layer through the cover sheet or leaks out of the frame. On the other hand, when the contact angle exceeds 105 °, the covering of the test solution is slow and cannot be uniformly spread only by covering the cover sheet, so that the working efficiency is lowered. Furthermore, in general, a sheet having a contact angle of more than 105 ° is very difficult to manufacture and requires considerable ingenuity, so that its use is not practical. In addition, Preferably, it exists in the range of 60-100 degrees.
本発明の微生物培養シートでは、カバーシートは、培養層の表面と対向する側の面の接触角が上記範囲内であれば、特に限定されるものではないが、防水性、水蒸気不透過性を有するとともに、微生物の培養後、カバーシートを通してコロニーを観察したり、計数したりできるように、透明であることが好ましい。このようなカバーシートとしては、一般に、合成樹脂シートが用いられる。合成樹脂シートとしては、例えば、ポリエチレン系樹脂、ポリプロピレン系樹脂、ポリエステル系樹脂、ポリアミド系樹脂、ポリスチレン系樹脂、ポリカーボネート系樹脂、ポリ塩化ビニル系樹脂、ポリ（メタ）アクリル系樹脂等の公知の樹脂を材料とするシートが挙げられる。本発明では、例えば、上記接触角を有する合成樹脂シートをそのまま用いてもよいし、上記接触角を有さない合成樹脂シートに対して表面処理を施し、接触角を上記範囲内に調整したものを用いてもよいし、上記接触角を有さない合成樹脂シートの表面に別の樹脂をコーティングし、接触角を上記範囲内に調整したものを用いてもよい。 In the microorganism culture sheet of the present invention, the cover sheet is not particularly limited as long as the contact angle of the surface facing the surface of the culture layer is within the above range, but it is waterproof and water vapor impermeable. It is preferable to be transparent so that colonies can be observed and counted through the cover sheet after culturing the microorganism. In general, a synthetic resin sheet is used as such a cover sheet. Examples of the synthetic resin sheet include known resins such as polyethylene resins, polypropylene resins, polyester resins, polyamide resins, polystyrene resins, polycarbonate resins, polyvinyl chloride resins, and poly (meth) acrylic resins. A sheet made of In the present invention, for example, the synthetic resin sheet having the contact angle may be used as it is, or the synthetic resin sheet having no contact angle is subjected to a surface treatment and the contact angle is adjusted within the above range. Alternatively, the surface of the synthetic resin sheet having no contact angle may be coated with another resin, and the contact angle adjusted within the above range may be used.
合成樹脂シートに対する表面処理としては、特に限定されるものではなく、例えば、コロナ放電処理、オゾン処理、グロー放電処理、酸素ガス又は窒素ガス等を用いる低温プラズマ処理等の公知の表面処理が挙げられる。また、アンカーコート剤の塗布により表面処理を施してもよい。 The surface treatment for the synthetic resin sheet is not particularly limited, and examples thereof include known surface treatments such as corona discharge treatment, ozone treatment, glow discharge treatment, and low-temperature plasma treatment using oxygen gas or nitrogen gas. . Further, the surface treatment may be performed by applying an anchor coating agent.
接触角の調整に用いる樹脂としては、例えば、ポリアミド系樹脂、ポリ（メタ）アクリル系樹脂、ポリオレフィン系樹脂、ポリエステル系樹脂、ポリプロピレン系樹脂等の公知の樹脂が挙げられ、これらは、単独又は２種以上を組み合わせて用いることができる。 Examples of the resin used for adjusting the contact angle include known resins such as polyamide resin, poly (meth) acrylic resin, polyolefin resin, polyester resin, and polypropylene resin. A combination of more than one species can be used.
カバーシートは、被検液を接種する際に持ち上げるため、適度の柔軟性を有することが好ましい。この点を考慮すると、カバーシートは、ポリエチレン系樹脂、ポリプロピレン系樹脂、及びポリエステル系樹脂を材料とする合成樹脂シートが好適である。 Since the cover sheet is lifted when the test solution is inoculated, it is preferable that the cover sheet has an appropriate flexibility. Considering this point, the cover sheet is preferably a synthetic resin sheet made of a polyethylene resin, a polypropylene resin, and a polyester resin.
カバーシートの厚みは、特に限定されるものではないが、好ましくは１０〜２００μｍ、より好ましくは２０〜７０μｍである。カバーシートの厚みが、上記範囲内であれば、適度な柔軟性を有するので、被検液を接種する際のカバーシートの持ち上げ等の作業性が良好となる。また、機械的強度として十分であるため、連続帯状で供給して加工することも可能である。 Although the thickness of a cover sheet is not specifically limited, Preferably it is 10-200 micrometers, More preferably, it is 20-70 micrometers. If the thickness of the cover sheet is within the above range, the cover sheet has appropriate flexibility, so that workability such as lifting of the cover sheet when inoculating the test solution is improved. Further, since the mechanical strength is sufficient, it is possible to supply and process in a continuous belt shape.
カバーシートは、どのような形状であってもよいが、培養層への雑菌の侵入を防ぐため、培養層を十分に被覆できる大きさを有していることが好ましい。また、カバーシートは、上記培養層や枠層が形成された基材シートにあらかじめ固設されていてもよいし、また、別個に準備しておき、使用の際に併せてもよい。 The cover sheet may have any shape, but preferably has a size that can sufficiently cover the culture layer in order to prevent invasion of various bacteria into the culture layer. In addition, the cover sheet may be fixed in advance on the base material sheet on which the culture layer or the frame layer is formed, or may be prepared separately and used together.
カバーシートには、桝目柄が印刷されていてもよい。桝目柄が印刷されたカバーシートによれば、コロニーが多数形成された場合に、数ヶ所の枡目内の菌数を計測按分するだけで、おおよその全体数を求めることができるので、効率的な微生物検査が可能となる。なお、桝目柄の印刷は、カバーシートの培養層の表面と対向する面とは反対側の面に施されていることが好ましい。使用するインクは、水に不溶で、微生物の生育に影響を与えないものを使用することが好ましい。印刷の版式は、着色剤、樹脂、溶剤等の選択範囲が広い点でグラビア印刷が好ましい。枡目の大きさは１ｃｍ角程度が適当である。 A checkerboard pattern may be printed on the cover sheet. According to the cover sheet printed with a checkerboard pattern, when a large number of colonies are formed, the approximate total number can be obtained simply by measuring and apportioning the number of bacteria in a few checkers. Microbial testing is possible. In addition, it is preferable that the printing of the checkered pattern is performed on the surface opposite to the surface facing the surface of the culture layer of the cover sheet. It is preferable to use an ink that is insoluble in water and does not affect the growth of microorganisms. The printing plate type is preferably gravure printing because it has a wide selection range of colorants, resins, solvents and the like. The size of the mesh is about 1 cm square.
［微生物培養シートの製造方法］
本発明の微生物培養シートは、例えば、以下の方法により製造することができる。上記バインダーをアルコール系溶媒に溶解させ、得られた溶液に、上記のゲル化剤、栄養成分、選択剤等の成分を少なくとも１種を添加して混合し、培養層形成用培地液を調製する。次に、上記基材シートの上に、ディスペンサーを用いて上記疎水性樹脂からなる円状の枠層を形成した後、該枠層に囲まれた基材上に、上記培養層形成用培地液を塗布によりパターン形成した後、培地液に含まれるアルコールを除去して培養層を形成する。そして、上記カバーシートを、上記培養層を形成した基材シートの上に積層し、一辺の端部を接着することにより、微生物培養シートを得ることができる。なお、上記製造方法では、培養層形成用培地液を調製する際に使用する溶媒として、アルコール系溶媒を例示したが、これに限定されるものではなく、選択した培養層の構成成分を溶解又は分散し得るものであればよい。ただし、アルコール系溶媒は、水やトルエン等の高沸点溶媒のように、パターン形成後の溶媒除去工程において高温加熱する必要がないので、選択した成分が熱分解するおそれがなく、また、溶媒除去に長時間を要せず、生産効率に優れるため好ましい。アルコール系溶媒としては、炭素数が１〜５のアルコールが好ましく、炭素数１のメタノールがより好ましい。メタノールは、沸点が低く、乾燥による溶媒除去が容易であって、且つ、微生物の発育を阻害しないからである。なお、溶媒は、単独又は２種以上を混合して用いてもよく、その使用量は、選択した培養層の構成成分や溶媒の種類によって、適宜選択すればよい。
[Method for producing microorganism culture sheet]
The microorganism culture sheet of the present invention can be produced, for example, by the following method. The binder is dissolved in an alcohol-based solvent, and at least one component such as the gelling agent, nutrient component, and selective agent is added to and mixed with the obtained solution to prepare a culture solution for forming a culture layer. . Next, a circular frame layer made of the hydrophobic resin is formed on the substrate sheet using a dispenser, and then the culture layer forming medium solution is formed on the substrate surrounded by the frame layer. After forming a pattern by coating, alcohol contained in the medium solution is removed to form a culture layer. And the microorganism culture sheet can be obtained by laminating | stacking the said cover sheet on the base material sheet in which the said culture layer was formed, and adhere | attaching the edge part of one side. In the above production method, the alcohol solvent is exemplified as the solvent used when preparing the culture medium for forming the culture layer. However, the solvent is not limited thereto, and the constituent components of the selected culture layer are dissolved or dissolved. Any material that can be dispersed is acceptable. However, the alcohol solvent does not need to be heated at a high temperature in the solvent removal step after pattern formation like high-boiling solvents such as water and toluene. Is preferable because it does not require a long time and is excellent in production efficiency. As the alcohol solvent, an alcohol having 1 to 5 carbon atoms is preferable, and methanol having 1 carbon atom is more preferable. This is because methanol has a low boiling point, can be easily removed by drying, and does not inhibit the growth of microorganisms. In addition, a solvent may be used individually or in mixture of 2 or more types, What is necessary is just to select the usage-amount suitably according to the component of the selected culture layer, and the kind of solvent.
［微生物培養シートの使用方法］
図２は、本発明の一実施形態に係る微生物培養シートの使用方法の一例を順次示す図である。図２（Ａ）及び（Ｂ）に示すように、本発明の一実施形態に係る微生物培養シート１では、方形のカバーシート４０が同じく方形の基材シート１０に固設されており、基材シート１０には円形の培養層２０が形成され、培養層２０の外周には疎水性樹脂からなる円形の枠層３０が形成されている。本発明の一実施形態に係る微生物培養シート１では、まず、図２（Ｃ）に示すように、枠層３０によって囲まれた培養層２０上に、ピペット等を用いて被検液５０を接種する。その後、図２（Ｄ）に示すように、カバーシート４０と培養層２０に接種された被検液５０の液面とが接触するように、カバーシート４０を培養層２０に被覆させる。そうすると、カバーシート４０によって被検液５０が速やかに枠層３０の内側の培養層２０上に拡がる。
[How to use microorganism culture sheet]
FIG. 2 is a diagram sequentially illustrating an example of a method for using a microorganism culture sheet according to an embodiment of the present invention. As shown in FIGS. 2 (A) and 2 (B), in the
以下、実施例により、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの記載に何ら制限を受けるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention further in detail, this invention does not receive a restriction | limiting at all in these description.
＜実施例１＞
培養時に影響を与えない固着剤（ポリビニルピロリドン，商品名「ＰＶＰ Ｋ−９０」，日本触媒社製）２０ｇを、メタノール溶液２１０ｍｌに溶解させて、ポリビニルピロリドンのメタノール溶液を調製した。このポリビニルピロリドンのメタノール溶液に、ゲル化剤としてグアーガム粉末（商品名「ＮＥＯＶＩＳＣＯ Ｇ」，４００メッシュタイプ，三晶社製）６０ｇと、栄養成分としてトリプトン（商品名「ＢＡＣＴ ＴＲＹＰＴＯＮＥ」，Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ社製）３．２６ｇ、肉エキス（商品名「Ｌａｂ−Ｌｅｍｃｏ」，Ｏｘｏｉｄ社製）０．８２ｇ、酵母エキス（商品名「ＹＥＡＳＴ ＥＸＴＲＡＣＴ」，Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ社製）０．０３ｇ、ブドウ糖（商品名「Ｄ−（＋）−ＧＬＵＣＯＳＥ」，和光純薬工業社製）０．１６ｇ、塩化ナトリウム（和光純薬工業社製）０．４１ｇ、及びリン酸水素二ナトリウム（和光純薬工業社製）０．３７ｇと、を添加し混合することにより、培養層形成用培地液を調製した。
<Example 1>
20 g of a fixing agent (polyvinyl pyrrolidone, trade name “PVP K-90”, manufactured by Nippon Shokubai Co., Ltd.) that does not affect the culture was dissolved in 210 ml of a methanol solution to prepare a methanol solution of polyvinyl pyrrolidone. In this methanol solution of polyvinylpyrrolidone, 60 g of guar gum powder (trade name “NEOVISCO G”, 400 mesh type, manufactured by Sankisha Co., Ltd.) as a gelling agent and tryptone (trade name “BACT TRYPTONE”, Becton, Dickinson and Dickson) 3.26 g of Company), 0.82 g of meat extract (trade name “Lab-Lemco”, manufactured by Oxoid), 0.03 g of yeast extract (trade name “YAST EXTRAACT”, manufactured by Becton, Dickinson and Company), glucose (Trade name “D-(+)-GLUCOSE”, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 0.16 g, sodium chloride (produced by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 0.41 g, and disodium hydrogen phosphate (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) Add 0.37g and mix Thus, a culture solution for forming a culture layer was prepared.
次に、基材シート（ポリエチレンテレフタレートフィルム，商品名「テイジンテトロンフィルム」，帝人デュポンフィルム社製）上に、ディスペンサー（製品名「ＳＨＯＴｍｉｎｉ２００α」，武蔵エンジニアリング社製）を用いて、熱可塑性樹脂（商品名「ＭＰ９７３」，コニシ社製）からなる円状の枠層（幅：１ｍｍ、高さ：７５０μｍ、直径：５２ｍｍ）を形成した。そして、該枠層の内側に、多孔ノズルを有するディスペンサー装置を用いて上記培養層形成用培地液を塗布し、乾燥させることにより培養層をパターン形成した。なお、乾燥時の培養層の厚さは、約２５０μｍであった。 Next, using a dispenser (product name “SHOTmini200α”, manufactured by Musashi Engineering Co., Ltd.) on a base sheet (polyethylene terephthalate film, product name “Teijin Tetron Film”, manufactured by Teijin DuPont Films Co., Ltd.), a thermoplastic resin (product A circular frame layer (width: 1 mm, height: 750 μm, diameter: 52 mm) having the name “MP973” (manufactured by Konishi Co., Ltd.) was formed. Then, the culture layer was applied to the inside of the frame layer using a dispenser device having a porous nozzle and dried to form a pattern of the culture layer. In addition, the thickness of the culture layer at the time of drying was about 250 micrometers.
そして、ＯＰＰフィルム（二軸延伸ポリプロピレンフィルム，商品名「ＯＰ−Ｕ１」，厚さ：４０μｍ，片面コロナ処理，東セロ社製、）からなるカバーシートと、培養層が形成された上記基材シートとを、カバーシートの非コロナ処理面と、基材シートの培養層面とが対向するように端部で接着させて、実施例１の微生物培養シートを得た。 And a cover sheet made of an OPP film (biaxially stretched polypropylene film, trade name “OP-U1”, thickness: 40 μm, single-sided corona treatment, manufactured by Tosero Co., Ltd.), and the base material sheet on which the culture layer is formed, Was adhered at the end so that the non-corona-treated surface of the cover sheet and the culture layer surface of the base sheet faced to obtain the microorganism culture sheet of Example 1.
＜実施例２＞
ポリアミド樹脂（商品名「バーサミド７１３」，コグニスジャパン社製）を１−プロパノールと２−プロパノールとの混合溶媒（質量比＝７：３）に溶解させ、グラビア印刷可能な粘度となるように調整した。これを、ＯＰＰフィルム（商品名「ＯＰ−Ｕ１」，厚さ：４０μｍ，片面コロナ処理，東セロ社製、）のコロナ処理面にグラビア印刷（樹脂全体の総塗布量：約１．０ｇ／ｍ２）し、バインダー樹脂層を有するカバーシートを製造した。そして、該カバーシートと、培養層が形成された上記基材シートとを、カバーシートのバインダー樹脂層と、基材シートの培養層面とが対向するように、端部で接着させて、実施例２の微生物培養シートを得た。
<Example 2>
A polyamide resin (trade name “Versamide 713”, manufactured by Cognis Japan Co., Ltd.) was dissolved in a mixed solvent of 1-propanol and 2-propanol (mass ratio = 7: 3) and adjusted to have a viscosity capable of gravure printing. . Gravure printing (total coating amount of the entire resin: about 1.0 g / m 2 ) on the corona-treated surface of the OPP film (trade name “OP-U1”, thickness: 40 μm, single-sided corona treatment, manufactured by Tosero Corp.) And a cover sheet having a binder resin layer was produced. Then, the cover sheet and the base material sheet on which the culture layer is formed are bonded at the end so that the binder resin layer of the cover sheet and the culture layer surface of the base material sheet face each other. Two microbial culture sheets were obtained.
＜実施例３＞
アクリルとプロピレンの共重合体のエマルジョン溶液（商品名「ＮＫポリマーＭＫ−１００ＷＰ」，溶媒：水，新中村化学社製）を、ＯＰＰフィルム（商品名「ＯＰ−Ｕ１」，厚さ：４０μｍ，片面コロナ処理，東セロ社製、）のコロナ処理面に、ワイヤバーを用いて塗工した後、６０℃で２分間乾燥させ、バインダー樹脂層（乾燥後の塗布量：約２．０ｇ／ｍ２）を有するカバーシートを製造した。そして、該カバーシートと、培養層が形成された上記基材シートとを、カバーシートのバインダー樹脂層と、基材シートの培養層面とが対向するように、端部で接着させ、実施例３の微生物培養シートを得た。
<Example 3>
An emulsion solution of a copolymer of acrylic and propylene (trade name “NK Polymer MK-100WP”, solvent: water, manufactured by Shin-Nakamura Chemical Co., Ltd.), OPP film (trade name “OP-U1”, thickness: 40 μm, single side After coating with a wire bar on the corona-treated surface of corona treatment (manufactured by Tosero Co., Ltd.), it was dried at 60 ° C. for 2 minutes to form a binder resin layer (coating amount after drying: about 2.0 g / m 2 ). A cover sheet was produced. Then, the cover sheet and the base material sheet on which the culture layer was formed were adhered at the ends so that the binder resin layer of the cover sheet and the culture layer surface of the base material sheet faced each other, Example 3 A microbial culture sheet was obtained.
＜比較例１＞
ＯＰＰフィルム（二軸延伸ポリプロピレンフィルム，商品名「ＯＰ−Ｕ１」，厚さ：４０μｍ，片面コロナ処理，東セロ社製、）からなるカバーシートと、培養層が形成された上記基材シートとを、上記カバーシートのコロナ処理面と、基材シートの培養層面とが対向するように、端部で接着させ、比較例１の微生物培養シートを得た。
<Comparative Example 1>
A cover sheet made of an OPP film (biaxially stretched polypropylene film, trade name “OP-U1”, thickness: 40 μm, single-sided corona treatment, manufactured by Tosero Co., Ltd.), and the substrate sheet on which the culture layer is formed, The microorganism culture sheet of Comparative Example 1 was obtained by adhering at the end so that the corona-treated surface of the cover sheet and the culture layer surface of the base sheet face each other.
＜比較例２＞
塩素化ポリプロピレン樹脂を水に分散させたエマルジョン溶液（商品名「スーパークロンＥ−５０３」，日本製紙ケミカル社製）を、ＯＰＰフィルム（商品名「ＯＰ−Ｕ１」，厚さ：４０μｍ，片面コロナ処理，東セロ社製、）のコロナ処理面に、ワイヤバーを用いて塗工した後、６０℃で２分間乾燥させ、バインダー樹脂層（乾燥後の塗布量：約１．５ｇ／ｍ２）を有するカバーシートを製造した。そして、該カバーシートと、培養層が形成された上記基材シートとを、カバーシートのバインダー樹脂層と、基材シートの培養層面とが対向するように、端部で接着させ、比較例２の微生物培養シートを得た。
<Comparative example 2>
An emulsion solution (trade name “Supercron E-503”, manufactured by Nippon Paper Chemicals Co., Ltd.) in which chlorinated polypropylene resin is dispersed in water is treated with an OPP film (trade name “OP-U1”, thickness: 40 μm, single-sided corona treatment) , Manufactured by Tosero Co., Ltd.), coated with a wire bar on a corona-treated surface, and dried at 60 ° C. for 2 minutes to have a binder resin layer (coating amount after drying: about 1.5 g / m 2 ) A sheet was produced. Then, the cover sheet and the base material sheet on which the culture layer is formed are adhered at the ends so that the binder resin layer of the cover sheet and the culture layer surface of the base material sheet face each other, and Comparative Example 2 A microbial culture sheet was obtained.
［評価試験１］
上記実施例１〜３及び比較例１，２の微生物培養シートにおけるカバーシートの、培養層の表面と対向する側の面について、水に対する接触角を測定した。接触角は、接触角計（製品名「ＤＭ５００」，協和界面化学社製）を用い、ＪＩＳ Ｒ３２５７に準拠した方法にて測定した。具体的には、ＪＩＳ Ｒ３２５７の「基板ガラス表面のぬれ性試験方法」内の「６．静滴法」に記載された方法に準拠（試験方法の種類：静滴法，試験対象：カバーシートの培養層の表面と対向する側の面，使用する水：蒸留水，室温：２３℃，湿度：４０％ＲＨ，水滴の容量：４μｌ，測定時間：水滴を静置してから１０秒間，測定場所：５箇所）して測定し、５箇所の値の平均値を算出した。
[Evaluation Test 1]
The contact angle with respect to water was measured for the surface of the cover sheet in the microorganism culture sheets of Examples 1 to 3 and Comparative Examples 1 and 2 on the side facing the surface of the culture layer. The contact angle was measured by a method in accordance with JIS R3257 using a contact angle meter (product name “DM500”, manufactured by Kyowa Interface Chemical Co., Ltd.). Specifically, it conforms to the method described in “6. Droplet method” in “Test method for wettability of substrate glass surface” of JIS R3257 (type of test method: drop method, test object: cover sheet Surface facing the surface of the culture layer, Water used: Distilled water, Room temperature: 23 ° C., Humidity: 40% RH, Water droplet volume: 4 μl, Measurement time: 10 seconds after standing the water droplet : 5 locations) and measured, and the average value of the values at 5 locations was calculated.
また、上記実施例１〜３及び比較例１，２の微生物培養シートについて、培養層上に、それぞれピペットを用いて蒸留水１ｍｌを滴下し、その上にカバーシートを被覆した。そして、蒸留水の培養層上への展開性、及び蒸留水の枠外への遺漏の有無について確認した。結果を表１に示す。 Moreover, about the microorganism culture sheet | seat of said Examples 1-3 and Comparative Examples 1 and 2, 1 ml of distilled water was dripped on the culture layer using the pipette, respectively, and the cover sheet | seat was coat | covered on it. And the expandability on the culture layer of distilled water and the presence or absence of leakage outside the frame of distilled water were confirmed. The results are shown in Table 1.
表１に示すように、培養層の表面と対向する側のカバーシートの面の接触角が大きい実施例１〜３では、枠内の培養層上に滴下した蒸留水が速やかに且つ均一に展開し、また、蒸留水の枠外への漏れも認められなかった。
これに対して、接触角が小さい比較例１，２では、枠内の培養層上に滴下した蒸留水は均一に展開せず、また、カバーシートを伝って枠外に漏れ出した。
このことから、カバーシートの被覆により培養層上に接種した被検液を展開させる、微生物培養シートでは、培養層の表面と対向する側のカバーシートの面の被検液に対する接触角の大きさを調整することで、迅速且つ正確な微生物培養試験を行い得ることが示唆された。
As shown in Table 1, in Examples 1 to 3 where the contact angle of the surface of the cover sheet facing the surface of the culture layer is large, the distilled water dripped on the culture layer in the frame is rapidly and uniformly developed. Moreover, no leakage of distilled water outside the frame was observed.
On the other hand, in Comparative Examples 1 and 2 having a small contact angle, distilled water dropped on the culture layer in the frame did not spread uniformly and leaked out of the frame through the cover sheet.
For this reason, in the microorganism culture sheet in which the test liquid inoculated on the culture layer is spread by covering the cover sheet, the contact angle of the surface of the cover sheet opposite to the surface of the culture layer with respect to the test liquid is large. It was suggested that a quick and accurate microbial culture test can be performed by adjusting
［評価試験２］
実際の微生物培養試験では、被検液は、溶媒として生理食塩水やリン酸緩衝液が用いられることが多く、これらに野菜や肉の成分がわずかに混入している。そのため、上記にて測定した蒸留水に対する接触角の値は、間接的な測定値である。そこで、上記評価試験において被検液の代わりに蒸留水を用いたことの妥当性を、実際の微生物培養試験にて一般的に用いられる被検液に対する接触角の値と、蒸留水に対する接触角の値とを比較することで評価した。
[Evaluation Test 2]
In an actual microorganism culture test, a physiological saline or a phosphate buffer is often used as a test solution as a test solution, and vegetables and meat components are slightly mixed therein. Therefore, the value of the contact angle with respect to distilled water measured above is an indirect measured value. Therefore, the validity of using distilled water in place of the test solution in the above evaluation test, the value of the contact angle for the test solution generally used in actual microorganism culture tests, and the contact angle for distilled water It evaluated by comparing with the value of.
＜製造例１＞
生理食塩水１００ｍｌに市販のカット野菜２０ｇを入れ、ホモジナイズした後、１０−３に希釈し、被検液Ａを得た。
<Production Example 1>
20 g of commercially available cut vegetables were put into 100 ml of physiological saline and homogenized, and then diluted to 10 −3 to obtain a test solution A.
＜製造例２＞
生理食塩水１００ｍｌに市販の牛豚合挽き肉２０ｇを入れ、ホモジナイズした後、１０−３に希釈し、被検液Ｂを得た。
<Production Example 2>
20 g of commercially available ground beef pork was put into 100 ml of physiological saline and homogenized, and then diluted to 10 −3 to obtain a test solution B.
［評価］
上記実施例１の微生物培養シートにおけるカバーシートの、培養層の表面と対向する側の面について、蒸留水、被検液Ａ、及び被検液Ｂのそれぞれに対する接触角を測定した。なお、使用した液体以外の条件は、上記と同様とした。
[Evaluation]
With respect to the surface of the cover sheet of the microorganism culture sheet of Example 1 opposite to the surface of the culture layer, contact angles with respect to each of distilled water, test liquid A, and test liquid B were measured. The conditions other than the liquid used were the same as described above.
また、上記実施例１の微生物培養シートについて、蒸留水、被検液Ａ、及び被検液Ｂのそれぞれの培養層上への展開性、及び枠外への遺漏の有無について確認した。なお、使用した液体以外の条件は、上記と同様とした。結果を表２に示す。 Moreover, about the microorganism culture sheet | seat of the said Example 1, the expandability on each culture layer of distilled water, the test liquid A, and the test liquid B and the presence or absence of the leakage outside a frame were confirmed. The conditions other than the liquid used were the same as described above. The results are shown in Table 2.
表２に示すように、被検液Ａ及び被検液Ｂは、接触角の値、培養層上への展開性、及び遺漏の有無において、蒸留水を用いて評価した場合と同等の結果を示した。
これらの結果から、被検液の代わりに蒸留水を用いた上記評価試験には妥当性があることが確認された。
As shown in Table 2, the test solution A and the test solution B had the same results as those evaluated using distilled water in terms of the contact angle value, the developability on the culture layer, and the presence or absence of leakage. Indicated.
From these results, it was confirmed that the above-described evaluation test using distilled water instead of the test solution was valid.
１ 微生物培養シート
１０ 基材シート
２０ 培養層
３０ 枠層
４０ カバーシート
５０ 被検液
DESCRIPTION OF
Claims (4)
前記カバーシートの前記培養層の表面と対向する側の面は、ＪＩＳ Ｒ３２５７に準拠したぬれ性試験方法の静滴法による水に対する接触角が５０〜１０５°の範囲内であり、
前記培養層の高さは、２００〜６００μｍであり、
前記枠層の高さは、前記培養層の高さよりも３００〜８００μｍ高く、
前記培養層を形成するための培地液の塗布量は、乾燥後において、１００〜３００ｇ／ｍ ２ である微生物培養シート。 A base material sheet, a culture layer formed in a predetermined region on the base material sheet, and a test solution inoculated on the culture layer formed on the outer periphery of the culture layer or on the culture layer A frame layer for limiting the range, and a cover sheet covering the surface of the culture layer,
The surface of the cover sheet facing the surface of the culture layer has a contact angle with respect to water by the sessile drop method of the wettability test method according to JIS R3257 within a range of 50 to 105 °.
The culture layer has a height of 200 to 600 μm,
Height of the frame layer, 300 to 800 rather higher than the height of the culture layer,
The microorganism culture sheet in which the amount of the medium solution applied to form the culture layer is 100 to 300 g / m 2 after drying .
The microorganism culture sheet according to any one of claims 1 to 3, wherein the cover sheet is fixed to the base sheet.
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