JP6060934B2

JP6060934B2 - Joint aging preventive

Info

Publication number: JP6060934B2
Application number: JP2014099149A
Authority: JP
Inventors: 吉川　雅之; 雅之吉川; 松田　久司; 久司松田; 誠宏中村
Original assignee: Nomura Co Ltd
Current assignee: Nomura Co Ltd
Priority date: 2014-05-13
Filing date: 2014-05-13
Publication date: 2017-01-18
Anticipated expiration: 2034-05-13
Also published as: JP2015214520A

Description

本発明は，エビネランを原料とした溶媒抽出物，ならびにこれを原料として製造される医薬に関する。 The present invention relates to a solvent extract obtained from ebinanelan as a raw material, and a pharmaceutical produced using this as a raw material.

エビネランは，日本，中国，台湾，韓国などの山地の陰地に自生するラン科（Orchidaceae）の多年生草木である。エビネランは，その全草または根茎が九子連環草と称され，扁桃腺，痔癒および打撲傷の治療薬として用いられている。
また，エビネランの根茎には，ジフェナントレン化合物やインドール配糖体などの有用な成分が含まれていることが知られている（特許文献１から３）。しかしながら，エビネランの根茎を除いた全草の有効性については，完全に明らかになっているとはいえない。
Ebineran is a perennial plant of the Orchidaceae family that grows naturally in the shade of mountains such as Japan, China, Taiwan, and Korea. Ebineran, whose whole plant or rhizome is called the Kyokurenkankan, is used as a treatment for tonsils, heel healing and bruises.
In addition, it is known that the rhizome of Ebinellan contains useful components such as diphenanthrene compounds and indole glycosides (Patent Documents 1 to 3). However, the effectiveness of the whole plant, excluding the rhizomes of Ebinellan, is not completely clear.

特開平１０−２６５４２５JP-A-10-265425 特開平１０−２６５４９２JP-A-10-265492 特開平１０−２６５４９３JP-A-10-265493

上記事情を背景として本発明では，エビネランの全草を有効に活用するための抽出物等の提供を課題とする。 In view of the above circumstances, an object of the present invention is to provide an extract or the like for effectively utilizing the whole plant of Ebinellan.

発明者らは，鋭意研究の結果，エビネランの全草を用いた抽出物が，ヒアルロニダーゼ阻害作用およびAGEs生成抑制作用を有することを見出し，本発明を完成させた。
すなわち，エビネランの全草（花部を含む）を用いた溶媒抽出物は，ヒアルロニダーゼ阻害作用およびAGEs生成抑制作用をもとに，肌荒れ防止や関節の老化の予防など，生体内の様々なアンチエイジング作用が期待される。このことから，発明者らは，エビネランの全草を用いた溶媒抽出物，ならびにこれを原料とする医薬の発明を完成させたものである。 As a result of intensive studies, the inventors have found that an extract using the whole plant of Ebinellan has a hyaluronidase inhibitory action and an AGEs production inhibitory action, and has completed the present invention.
In other words, the solvent extract using the whole plant of Ebinellan (including the flower part) has various anti-aging in vivo such as prevention of rough skin and prevention of joint aging based on hyaluronidase inhibitory action and AGEs production inhibitory action. Expected to work. Based on this, the inventors have completed the invention of a solvent extract using the whole plant of Ebinellan and a medicine using this as a raw material.

本発明は，以下の構成からなる。
本発明の第一の構成は，エビネラン原料を，溶媒を用いて抽出を行うことを特徴とする関節の老化予防薬である。 The present invention has the following configuration.
The first configuration of the present invention is a joint aging preventive agent characterized by extracting an ebinane raw material using a solvent.

本発明の第二の構成は，前記エビネラン原料が，エビネランの全草であることを特徴とする第一の構成に記載の関節の老化予防薬である。
本発明の第三の構成は，前記溶媒が，水，水溶性アルコール，又はこれらの混合溶媒であることを特徴とする第一又は第二の構成に記載の関節の老化予防薬である。 According to a second aspect of the present invention, there is provided the joint aging preventive agent according to the first aspect, wherein the raw material for ebinelan is the whole plant of ebinelan.
A third configuration of the present invention is the joint aging preventive agent according to the first or second configuration, wherein the solvent is water, a water-soluble alcohol, or a mixed solvent thereof.

本発明の第四の構成は，前記水溶性アルコールが，エタノール，又はメタノールであることを特徴とする第三の構成に記載の関節の老化予防薬である。 A fourth configuration of the present invention is the joint aging preventive agent according to the third configuration, wherein the water-soluble alcohol is ethanol or methanol.

本発明により，エビネランの全草を有効に活用するための抽出物等の提供が可能となった。すなわち，エビネランの全草を用いた溶媒抽出物は，ヒアルロニダーゼ阻害作用およびAGEs生成抑制作用を有する。このことから，エビネランの全草を用いた溶媒抽出物を原料として製造された医薬は，肌荒れ防止や関節の老化の予防など，生体内の様々なアンチエイジング作用を有する製品として期待できる。
According to the present invention, it has become possible to provide an extract or the like for effectively utilizing the whole plant of Ebinellan. That is, the solvent extract using the whole plant of Ebinellan has a hyaluronidase inhibitory action and an AGEs production inhibitory action. Therefore, a pharmaceutical produced from a solvent extract using the whole plant of Ebinellan can be expected as a product having various anti-aging effects in vivo, such as prevention of rough skin and prevention of joint aging.

ヒアルロニダーゼ阻害作用実験結果Hyaluronidase inhibitory test results AGEs生成抑制作用実験結果Results of AGEs production inhibitory action

本発明のエビネラン溶媒抽出物について説明を行う。 The ebinelan solvent extract of this invention is demonstrated.

本発明のエビネラン溶媒抽出物は，エビネラン原料を用いる。エビネラン原料としては，エビネランの全草を用いればよい。これらをそのまま用いてもよいし，乾燥させた後，原料として用いてもよい。 The ebinelan solvent extract of the present invention uses an ebinelan raw material. Ebinellan whole plant may be used as the raw material for ebinelan. These may be used as they are, or may be used as raw materials after being dried.

エビネラン原料について，溶媒を用いて抽出を行う。用いる溶媒としては，エビネラン原料からの有効成分の抽出が可能な限り特に限定する必要はなく，水，又は種々の有機溶媒を用いることができる。
溶媒として，水，メタノールやエタノールなどの水溶性アルコール，又はこれらの混合溶媒を用いることが好ましい。これにより，安価かつ効率的に，有効成分の抽出を行うことが可能となり，エビネラン溶媒抽出物の製造コストを減少させる効果を有する。
有機溶媒として，最も好ましくは，エタノールを用いることができる。エタノールは，人体への毒性が低い有機溶媒であるため，エビネラン溶媒抽出物や，これを原料に製造される医薬の安全性を向上させる効果を有する。 Extract the ebinelan raw material using a solvent. The solvent to be used is not particularly limited as long as the active ingredient can be extracted from the ebinelan raw material, and water or various organic solvents can be used.
As the solvent, it is preferable to use water, a water-soluble alcohol such as methanol or ethanol, or a mixed solvent thereof. This makes it possible to extract active ingredients at low cost and efficiently, and has the effect of reducing the production cost of the ebinelan solvent extract.
Most preferably, ethanol can be used as the organic solvent. Since ethanol is an organic solvent with low toxicity to the human body, it has the effect of improving the safety of ebinellan solvent extract and pharmaceuticals produced from this.

エビネラン溶媒抽出物は，優れたヒアルロニダーゼ阻害作用を有することから，肌荒れ防止や関節の老化の予防，抗炎症・抗アレルギーなどの作用が期待できる。
すなわち，ヒアルロニダーゼは，ヒアルロン酸の加水分解酵素であり，動物組織に広く分布している。その基質となるヒアルロン酸は，皮膚・靭帯・関節液・眼の硝子体などの組織に多く存在するムコ多糖の一種であり，例えば，皮膚や口腔においては，細胞の保護・栄養の運搬・組織水分の保持・柔軟性の維持等に，また関節液として組織構造・機能の維持及び潤滑性の保持等に重要な役割を果たしている。
皮膚や口腔，関節における生体ヒアルロン酸量は，老化又は病的状態により減少し，その結果，皮膚の乾燥・肌荒れ・ハリ・弾力性の低下，シミ・しわの増加あるいは関節の潤滑性悪化による関節痛等を引き起こす。このような状態に対して，ヒアルロニダーゼ阻害剤は，ヒアルロン酸の分解を抑制し，生体ヒアルロン酸量の維持に寄与する。
また，ヒアルロニダーゼ阻害剤は，ヒアルロン酸を配合した化粧料の皮膚への塗布や関節へのヒアルロン酸の注入等の措置による外因性ヒアルロン酸の安定化にも利用することができる。
さらには，ヒアルロニダーゼ阻害剤はヒアルロニダーゼに起因する抗炎症・抗アレルギー剤にも利用することができる。これはヒアルロニダーゼが炎症時に活性化され，結合組織のマトリックスを破壊し，炎症系の組織への浸潤・血管の透過性を亢進すること・I型アレルギーにおける肥満細胞からのヒスタミンの遊離の過程に介在している可能性が高いことによる。従って，抗炎症剤・抗アレルギー剤であるインドメタシン・アスピリン・クロモグリク酸ナトリウム・トラニラスト等には高いヒアルロニダーゼ阻害活性が認められている。
これらより，ヒアルロニダーゼ阻害作用剤は，肌荒れ防止や関節の老化の予防，抗炎症・抗アレルギーなどの効果が期待できる。 Since Ebinellan solvent extract has excellent hyaluronidase inhibitory action, it can be expected to prevent rough skin, prevent joint aging, and anti-inflammatory / anti-allergy.
That is, hyaluronidase is a hydrolase of hyaluronic acid and is widely distributed in animal tissues. Hyaluronic acid as a substrate is a kind of mucopolysaccharide that is abundant in tissues such as skin, ligaments, joint fluid, and vitreous body of the eye. For example, in the skin and oral cavity, cell protection, nutrient transport, and tissue It plays an important role in retention of moisture and maintenance of flexibility, and maintenance of tissue structure and function as a joint fluid and maintenance of lubricity.
The amount of living hyaluronic acid in the skin, oral cavity, and joints decreases due to aging or pathological conditions. As a result, joints are caused by dry skin, rough skin, firmness, decreased elasticity, increased spots, wrinkles, or poor joint lubrication. Causes pain. In such a state, the hyaluronidase inhibitor suppresses the decomposition of hyaluronic acid and contributes to the maintenance of the amount of biological hyaluronic acid.
Hyaluronidase inhibitors can also be used to stabilize exogenous hyaluronic acid by measures such as application of cosmetics containing hyaluronic acid to the skin and injection of hyaluronic acid into the joint.
Furthermore, hyaluronidase inhibitors can be used as anti-inflammatory / anti-allergic agents caused by hyaluronidase. This is because hyaluronidase is activated during inflammation, destroys the matrix of connective tissue, enhances invasion of inflammatory tissues and increases vascular permeability, and mediates the process of histamine release from mast cells in type I allergy It is highly likely that Therefore, high antihyaluronidase inhibitory activity has been observed in indomethacin, aspirin, cromoglycate sodium, tranilast and the like, which are anti-inflammatory agents and antiallergic agents.
From these, hyaluronidase inhibitors can be expected to have effects such as prevention of rough skin, prevention of joint aging, anti-inflammatory and anti-allergy.

また，エビネラン溶媒抽出物は，優れたAGEs生成抑制作用を有することから，糖尿病合併症の治療あるいは予防や，アンチエイジングなどの作用が期待できる。
すなわち，糖尿病などで慢性的に高血糖が続くことや，老化などに長期間血糖が作用することにより，循環血液中や組織でAGEsの生成が促進され，血管合併症（糖尿病性血管障害）が発症する。糖尿病性血管障害では，毛細血管障害がおこり，動脈側の毛細血管の基底膜が肥厚することが特徴とされる。
また近年，老化に伴い体内のたんぱく質が糖化（AGEs化）を受け，その生成物が種々の老化現象を引き起こすとも報告されている。そこでAGEsの生成阻害によって糖尿病の合併症などを治療あるいは予防，またアンチエイジングに寄与する方法が求められ，いくつか示されており，このことからAGEs生成抑制剤は，糖尿病合併症の治療あるいは予防や，アンチエイジングなどに対する効果が期待できる。 In addition, Ebinellan solvent extract has an excellent inhibitory effect on AGEs production, so it can be expected to treat or prevent diabetic complications and anti-aging.
In other words, chronic hyperglycemia due to diabetes, etc., or long-term blood glucose acts on aging, etc., promotes the production of AGEs in the circulating blood and tissues, resulting in vascular complications (diabetic vascular disorder) Develops. Diabetic vasculopathy is characterized by capillary dysfunction and thickening of the basement membrane of arterial capillaries.
In recent years, it has been reported that proteins in the body undergo glycation (AGEs) with aging, and the products cause various aging phenomena. Therefore, it is necessary to treat or prevent diabetic complications by inhibiting the generation of AGEs, and to contribute to anti-aging, and several methods have been shown. Therefore, AGEs production inhibitors are used to treat or prevent diabetic complications. And anti-aging effects can be expected.

前述のような効果を目的として，エビネラン溶媒抽出物を原料に用いて医薬を製造することができる。本発明において医薬とは，薬事承認を得ているような医薬品に限定するものではなく，本発明の趣旨に基づき治療効果や予防効果の発揮が期待される医薬品，医薬部外品，サプリメント，又は健康食品など様々な形態の製品を指すものとして定義される。 For the purpose as described above, a pharmaceutical can be produced using an ebinellan solvent extract as a raw material. In the present invention, the drug is not limited to a drug that has been approved by the pharmaceutical affairs, but is a drug, quasi drug, supplement, or Defined as referring to various forms of products such as health foods.

医薬の一態様として，例えば，エビネラン溶媒抽出物をスプレードライや凍結乾燥することにより，有効成分の粉末を得，散剤や粉剤として製品化することができる。これに加え，賦形剤，基剤，乳化剤，溶剤，又は安定剤等の添加剤を加えることにより，顆粒剤，錠剤，カプセル剤，又は丸剤等として用いることもできる。
また，別の態様として，エビネラン溶媒抽出物の有機溶媒を除去後，残留物に水や，必要に応じ可溶化剤などを加えた液体成分とし，これをもとに，健康飲料や健康食品等を製造することができる。

As one aspect of the medicine, for example, the active ingredient powder can be obtained by spray-drying or freeze-drying the ebinellan solvent extract and commercialized as a powder or powder. In addition, it can also be used as granules, tablets, capsules, pills, etc. by adding additives such as excipients, bases, emulsifiers, solvents or stabilizers.
As another aspect, after removing the organic solvent from the ebinellan solvent extract, the residue is made into a liquid component with water or a solubilizing agent added as necessary. Based on this, health drinks, health foods, etc. Can be manufactured.

以下，本発明について，実施例を挙げて詳述するが，当然のことながら，本発明を実施例に基づいて限定的に解釈すべきものでないことはいうまでもない。 Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to examples, but it goes without saying that the present invention should not be construed in a limited manner based on the examples.

＜＜実験例１，溶媒抽出物の作製＞＞
１．宮崎産エビネ（Calanthe discolor）の花部を含む全草1.8kgを20％含水メタノールにて，80℃，3時間加熱還流を行った。
２．得られた抽出液を濾過し，残渣に20％含水メタノールを加え，同様の抽出操作を5回行った。
３．抽出操作を行った含水メタノール液を合わせ，減圧下，溶媒を除去した（メタノール抽出物）。
４．メタノール抽出物に水を加え，酢酸エチル，n-ブタノールを用いて分液操作を行い，酢酸エチル移行部（9.39g，0.6%），n-ブタノール移行部（17.25g，1.0%）および水移行部（43.50g，2.4%）を得た。
５．得られた酢酸エチルおよびn-ブタノール移行部を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（BW-200（Fuji Silysia Chemical, Ltd.），CHCl3-MeOH-H2O），逆相ODSカラムクロマトフラフィー（Chromatorex ODS DM1020T（Fuji Silysia Chemical, Ltd.），H2O→MeOH）および逆相HPLC（COSMOSIL 5C18-MS-II）を用いて分離精製を行った。その結果，21種の化合物が得られた。 << Experimental Example 1, Preparation of Solvent Extract >>
1. A 1.8 kg whole plant including the flower part of Miyazaki shrimp (Calanthe discolor) was refluxed with 20% aqueous methanol at 80 ° C for 3 hours.
2. The obtained extract was filtered, 20% aqueous methanol was added to the residue, and the same extraction operation was performed 5 times.
3. The aqueous methanol solutions subjected to the extraction operation were combined, and the solvent was removed under reduced pressure (methanol extract).
4). Water was added to the methanol extract, and liquid separation was performed using ethyl acetate and n-butanol. The ethyl acetate transition part (9.39 g, 0.6%), n-butanol transition part (17.25 g, 1.0%) and water transition Part (43.50 g, 2.4%) was obtained.
5. The resulting ethyl acetate and n-butanol transition part was subjected to normal phase silica gel column chromatography (BW-200 (Fuji Silysia Chemical, Ltd.), CHCl3-MeOH-H2O), reverse phase ODS column chromatography (Chromatorex ODS DM1020T (Fuji Silysia Chemical, Ltd.), H2O → MeOH) and reverse phase HPLC (COSMOSIL 5C18-MS-II) were used for separation and purification. As a result, 21 kinds of compounds were obtained.

＜＜実験例２．ヒアルロニダーゼ阻害作用実験＞＞
エビネランのメタノール抽出物が，ヒアルロニダーゼ阻害作用を有するかどうかを調べることを目的に，実験を行った。 << Experimental Example 2. Hyaluronidase inhibitory action experiment >>
An experiment was conducted to examine whether the methanol extract of evinelan had a hyaluronidase inhibitory action.

＜実験方法＞
１．実験例１と同様の方法で得た，メタノール抽出物を実験に用いた。
２．1.9mg/mLヒアルロニダーゼ10μLに，メタノール抽出物20μLを加え，37℃で20分間インキュベートを行った。
３．インキュベート後，0.5mg/mL compound48/80を20μL加え，37℃で20分間インキュベートした
４．さらに，0.8mg/mLヒアルロン酸50μLを加え，37℃で40分間インキュベートを行い，0.4N NaOH20μL，ホウ酸溶液20μLを加え，100℃で3分間加熱を行った。
５．放冷後，10mg/mL p-ジメチルアミノベンズアルドヒドを600μL加え，37℃で20分間インキュベートした後，96穴マイクロプレートに分取し，マイクロプレートリーダー（SH-1000，コロナ電気社製）にて，吸光度（580nm）を測定した。 <Experiment method>
1. A methanol extract obtained in the same manner as in Experimental Example 1 was used in the experiment.
2. 20 μL of methanol extract was added to 10 μL of 1.9 mg / mL hyaluronidase and incubated at 37 ° C. for 20 minutes.
3. After incubation, 20 μL of 0.5 mg / mL compound 48/80 was added and incubated at 37 ° C. for 20 minutes. Furthermore, 0.8 mg / mL hyaluronic acid 50 μL was added, incubated at 37 ° C. for 40 minutes, 0.4 N NaOH 20 μL and boric acid solution 20 μL were added, and heated at 100 ° C. for 3 minutes.
5. After allowing to cool, add 600 μL of 10 mg / mL p-dimethylaminobenzaldehyde, incubate at 37 ° C for 20 minutes, dispense into a 96-well microplate, and place in a microplate reader (SH-1000, Corona Denki) The absorbance (580 nm) was measured.

＜実験結果＞
１．結果を図１に示す。
２．メタノール抽出物は，コントロールと比較して，40μg/mLの濃度で有意な阻害活性を有し，IC₅₀値も45μg/mLと非常に低い値であった。
３．これらの結果から，メタノール抽出物は，非常に優れたヒアルロニダーゼ阻害活性を有することが分かった。 <Experimental result>
1. The results are shown in FIG.
2. The methanol extract had significant inhibitory activity at a concentration of 40 μg / mL compared with the control, and the IC ₅₀ value was very low, 45 μg / mL.
3. From these results, it was found that the methanol extract has a very excellent hyaluronidase inhibitory activity.

＜＜実験例３．AGEs生成抑制作用＞＞
エビネランのメタノール抽出物が，AGEs生成抑制作用を有するかどうかを調べることを目的に，実験を行った。 << Experimental Example 3. AGEs production inhibitory action >>
An experiment was conducted with the aim of investigating whether the methanol extract of ebinelan has an inhibitory effect on AGEs formation.

＜実験方法＞
１．20mg/mLに調整したBSA溶液500μLと，250mg/mLに調整したD-glucose溶液400μL，および各濃度に調整したメタノール抽出物100μLをサンプルチューブ内で混和し，60℃で3日間，反応させた。
２．反応終了後，ブラックプレートに分取し，蛍光強度を測定した（em：440nm，ex:355nm）。 <Experiment method>
1. Mix 500 µL of BSA solution adjusted to 20 mg / mL, 400 µL of D-glucose solution adjusted to 250 mg / mL, and 100 µL of methanol extract adjusted to each concentration in a sample tube, and react at 60 ° C for 3 days. I let you.
2. After completion of the reaction, it was collected on a black plate and the fluorescence intensity was measured (em: 440 nm, ex: 355 nm).

＜実験結果＞
１．結果を図２に示す。
２．メタノール抽出物は，コントロールと比較して，30μg/mLの濃度で有意な生成抑制作用を示した。
３．加えて，IC₅₀値についても，陽性対照として用いたアミノグアニジンのIC₅₀値（約100μg/mL）よりも，33μg/mLとはるかに低いことが分かった。
４．これらの結果から，メタノール抽出物は，非常に優れたAGEs生成抑制作用を有することが分かった。 <Experimental result>
1. The results are shown in FIG.
2. The methanol extract showed a significant production inhibitory effect at a concentration of 30 μg / mL compared to the control.
3. In addition, the IC ₅₀ value was found to be much lower, 33 μg / mL, than the IC ₅₀ value of aminoguanidine used as a positive control (approximately 100 μg / mL).
4). From these results, it was found that the methanol extract has a very excellent AGE production inhibitory effect.

Claims

A joint aging preventive agent characterized by using, as a main raw material, an ebinellan solvent extract extracted from an evinelan raw material using a solvent.

The joint aging preventive agent according to claim 1, wherein the raw material for ebinelan is whole plant of ebinelan .

The joint aging preventive agent according to any one of claims 1 and 2, wherein the solvent is water, a water-soluble alcohol, or a mixed solvent thereof .

4. The joint aging preventive agent according to claim 3, wherein the water-soluble alcohol is ethanol or methanol .