JP6057994B2 - Oxidation and amination of primary alcohols - Google Patents
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Description
本発明は、以下の工程
ａ）式
ＨＯ−（ＣＨ2）x−Ｒ1
［式中、Ｒ1は、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ2及び−ＣＯＯＲ2を包含する群から選択されており、ｘは、少なくとも３であり、かつＲ2は、Ｈ、アルキル及びアリールを包含する群から選択されている］の第一級アルコールを準備する工程
ｂ）第一級アルコールを、ＮＡＤ（Ｐ）+依存性アルコールデヒドロゲナーゼと接触させることによる酸化工程、及び
ｃ）工程ａ）からの酸化産物をトランスアミナーゼと接触させる工程
を包含し、ここで、ＮＡＤ（Ｐ）+依存性アルコールデヒドロゲナーゼ及び／又はトランスアミナーゼは組換え型酵素又は単離酵素である方法、この方法を実施するための全細胞触媒、並びに第一級アルコールの酸化のための係る全細胞触媒の使用に関する。
The present invention comprises the following steps: a) Formula HO— (CH 2 ) x —R 1
Wherein R 1 is selected from the group comprising —OH, —SH, —NH 2 and —COOR 2 , x is at least 3 and R 2 represents H, alkyl and aryl. B) an oxidation step by contacting the primary alcohol with a NAD (P) + dependent alcohol dehydrogenase; and c) from step a). Contacting the oxidized product with a transaminase, wherein the NAD (P) + -dependent alcohol dehydrogenase and / or transaminase is a recombinant enzyme or an isolated enzyme, a total method for carrying out this method It relates to the use of cell catalysts and such whole cell catalysts for the oxidation of primary alcohols.
ポリアミドは、アミド基の繰り返し単位を含むことを特徴としている一種のポリマーである。"ポリアミド"との用語は、化学的に類似したタンパク質とは異なり、通常は合成の市販の熱可塑性プラスチックに関する。ポリアミドは、第一級アミン又は第二級アミンから誘導され、これらは、通常は炭化水素の分解に際して取得される。しかしながら、誘導体、より厳密にはアミノカルボン酸、ラクタム及びジアミンも、ポリマー製造のために使用することができる。関心が持たれているのは、さらに、再生原料から出発してバイオテクノロジー法により取得することができる出発物質としての短鎖のガス状アルカンである。 Polyamide is a type of polymer characterized by containing repeating units of amide groups. The term “polyamide”, unlike chemically similar proteins, usually relates to synthetic commercially available thermoplastics. Polyamides are derived from primary or secondary amines, which are usually obtained upon hydrocarbon decomposition. However, derivatives, more precisely aminocarboxylic acids, lactams and diamines can also be used for the production of the polymers. Also of interest are short-chain gaseous alkanes as starting materials that can be obtained by biotechnological processes starting from recycled raw materials.
商業的に需要が高い数多くのポリアミドは、ラクタムから出発して製造される。例えば、"ポリアミド ６"はε−カプロラクタムの重合によって、また、"ポリアミド １２"はラウリンラクタムの重合によって得られることができる。商業的に関心が持たれている更に別の製品には、ラクタムのコポリマー、例えばε−カプロラクタムとラウリンラクタムとのコポリマーが含まれる。 A number of commercially demanding polyamides are produced starting from lactams. For example, “polyamide 6” can be obtained by polymerization of ε-caprolactam and “polyamide 12” can be obtained by polymerization of lauric lactam. Yet another product of commercial interest includes lactam copolymers, such as epsilon-caprolactam and laurin lactam copolymers.
アミンの慣例的な化学技術的な製造は、化石原料の供給に依存しており、効率が悪く、かつ、この場合、大量の不所望な副生成物が、合成のいくつかの工程で８０％に至るまで発生する。このようなプロセスの一例が、ラウリンラクタムの製造であり、これはブタジエンの三量化によって通常は取得される。三量化生成物のシクロドデカトリエンが水素化され、そこから結果生じるシクロドデカンがシクロデカノンへと酸化され、これは引き続きヒドロキシルアミンと反応させられてシクロドデカノンオキシム(Cyclododekanoxin)が得られ、これが最終的にベックマン転位を介してラウリンラクタムへと変換される。 Routine chemo-technical production of amines relies on fossil feed supplies, which are inefficient and in this case large amounts of undesired by-products are 80% in some steps of the synthesis. Occurs until. An example of such a process is the production of lauric lactam, which is usually obtained by trimerization of butadiene. The trimerized product cyclododecatriene is hydrogenated, from which the resulting cyclododecane is oxidized to cyclodecanone, which is subsequently reacted with hydroxylamine to give cyclododecanone oxime, which is the final product. It is converted to laurin lactam via Beckmann rearrangement.
これらの欠点を踏まえて、再生原料から出発する生体触媒の使用下でアミンを取得するために方法が開発されていた。ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０６７４４７は、化学的に類似した産物、より厳密にはω−アミノカルボン酸を、一連の適した酵素活性を有し、かつカルボン酸を相応のω−アミノカルボン酸へと変換することができる細胞の使用下で製造するための生体系を記載している。しかしながら、この場合に使用されるシュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida) ＧＰＯ１由来のＡｌｋＢＧＴ−オキシダーゼ系の公知の欠点は、それが第一級アルコールへの脂肪族アルカンの選択的な酸化を行うことができない点である。むしろ、多数の酸化産物が生じる；殊に、高度に酸化された産物、例えば相応のアルデヒド、ケトン又は相応のカルボン酸の割合が反応時間の増大とともに高まり（Ｃ．Ｇｒａｎｔ，Ｊ．Ｍ．Ｗｏｏｄｌｅｙ ａｎｄ Ｆ．Ｂａｇａｎｚ（２０１１），Ｅｎｚｙｍｅ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ４８，４８０−４８６）、これにより所望のアミンの収率が相応して低減する。 In light of these drawbacks, methods have been developed to obtain amines using biocatalysts starting from regenerated raw materials. PCT / EP2008 / 067447 converts chemically similar products, more precisely ω-aminocarboxylic acids, with a series of suitable enzymatic activities and converts carboxylic acids into the corresponding ω-aminocarboxylic acids. Describes a biological system for manufacturing under the use of cells. However, the known disadvantage of the AlkBGT-oxidase system derived from Pseudomonas putida GPO1 used in this case is that it cannot perform the selective oxidation of aliphatic alkanes to primary alcohols. It is. Rather, a large number of oxidation products are produced; in particular, the proportion of highly oxidized products such as the corresponding aldehydes, ketones or corresponding carboxylic acids increases with increasing reaction time (C. Grant, JM Woodley and F. Baganz (2011), Enzyme and Microbiology Technology 48, 480-486), which correspondingly reduces the yield of the desired amine.
こうした背景から、本発明の基礎を成している課題は、生体触媒の使用下でのアルコールの改善された酸化法を提供することである。更に別の課題は、この方法を、収率を高め、かつ／又は副生成物の濃度を下げるように改善することである。最後に、ポリアミド又はそれらを再生原料に基づいて製造するための出発物質の製造を可能にする方法が必要とされる。 Against this background, the problem underlying the present invention is to provide an improved process for the oxidation of alcohols using biocatalysts. Yet another challenge is to improve the process to increase yield and / or reduce the concentration of by-products. Finally, there is a need for a process that allows the production of polyamides or starting materials for producing them on the basis of recycled raw materials.
これらと更に別の課題とは、本出願の対象によって、殊に添付の独立請求項の対象によっても解決され、ここで、実施形態は従属請求項からもたらされる。 These and further problems are solved by the subject matter of the present application, in particular by the subject matter of the appended independent claims, wherein the embodiments result from the dependent claims.
本発明によれば、課題は、第１の観点においては、以下の工程
ａ）式
ＨＯ−（ＣＨ2）x−Ｒ1
［式中、Ｒ1は、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ2及び−ＣＯＯＲ2を包含する群から選択されており、ｘは、少なくとも３であり、かつＲ2は、Ｈ、アルキル及びアリールを包含する群から選択されている］の第一級アルコールを準備する工程
ｂ）第一級アルコールを、ＮＡＤ（Ｐ）+依存性アルコールデヒドロゲナーゼと接触させることによる酸化工程、及び
ｃ）工程ａ）からの酸化産物をトランスアミナーゼと接触させる工程
を包含し、ここで、ＮＡＤ（Ｐ）+依存性アルコールデヒドロゲナーゼ及び／又はトランスアミナーゼは組換え型酵素又は単離酵素である方法によって解決される。
According to the present invention, the problem is that in the first aspect the following steps a) Formula HO— (CH 2 ) x —R 1
Wherein R 1 is selected from the group comprising —OH, —SH, —NH 2 and —COOR 2 , x is at least 3 and R 2 represents H, alkyl and aryl. B) an oxidation step by contacting the primary alcohol with a NAD (P) + dependent alcohol dehydrogenase; and c) from step a). Contacting the oxidized product with a transaminase, wherein the NAD (P) + dependent alcohol dehydrogenase and / or transaminase is resolved by a method that is a recombinant enzyme or an isolated enzyme.
第１の観点の第１の実施形態においては、工程ａ）を、有利には組換え型又は単離されているモノオキシゲナーゼによる、式Ｈ−（ＣＨ2）x−Ｒ1のアルカンのヒドロキシル化によって行う。 In a first embodiment of the first aspect, step a) is preferably hydroxylated of an alkane of formula H— (CH 2 ) x —R 1 with a recombinant or isolated monooxygenase. To do.
第１の実施形態の一実施形態でもある、第１の観点の第２の実施形態においては、ＮＡＤ（Ｐ）+依存性アルコールデヒドロゲナーゼは、補因子として少なくとも１個の亜鉛原子を有するＮＡＤ（Ｐ）+依存性アルコールデヒドロゲナーゼである。 In a second embodiment of the first aspect, which is also an embodiment of the first embodiment, the NAD (P) + dependent alcohol dehydrogenase is a NAD (P) having at least one zinc atom as a cofactor. ) + Dependent alcohol dehydrogenase.
第２の実施形態の一実施形態である、第１の観点の第３の実施形態においては、アルコールデヒドロゲナーゼは、バシラス・ステアロサーモフィラス(Bacillus stearothermophilus)（データバンクコード Ｐ４２３２８）のアルコールデヒドロゲナーゼ又はその変異体である。 In a third embodiment of the first aspect, which is an embodiment of the second embodiment, the alcohol dehydrogenase is an alcohol dehydrogenase of Bacillus stearothermophilus (databank code P42328) or It is a mutant.
第１〜第３の実施形態の一実施形態である、第１の観点の第４の実施形態においては、モノオキシゲナーゼは、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)のＡｌｋＢＧＴ、カンジダ・トロピカリス(Candida tropicalis)由来又はヒヨコマメ(Cicer arietinum)由来のシトクロムＰ４５０を包含する群から選択されている。 In the fourth embodiment of the first aspect, which is one embodiment of the first to third embodiments, the monooxygenase is Pseudomonas putida AlkBGT, Candida tropicalis. It is selected from the group comprising cytochrome P450 derived from or derived from Cicer arietinum.
第１〜第４の実施形態の一実施形態でもある、第１の観点の第５の実施形態においては、トランスアミナーゼが、以下のトランスアミナーゼ及びその変異体の群から選択されており、このトランスアミナーゼは、クロモバクテリウム・ビオラセウム(Chromobacterium violaceum) ＡＴＣＣ １２４７２（データバンクコード ＮＰ＿９０１６９５）のトランスアミナーゼ由来のＶａｌ２２４に相当するアミノ酸配列の位置に、イソロイシン、バリン、フェニルアラニン、メチオニン及びロイシンを包含する群から選択されるアミノ酸を有し、かつクロモバクテリウム・ビオラセウム(Chromobacterium violaceum) ＡＴＣＣ １２４７２（データバンクコード ＮＰ＿９０１６９５）のトランスアミナーゼ由来のＧｌｙ２３０に相当するアミノ酸配列の位置に、トレオニンとは異なるアミノ酸及び有利にはセリン、システイン、グリシン及びアラニンを包含する群からのアミノ酸を有することを特徴としている。 In a fifth embodiment of the first aspect, which is also an embodiment of the first to fourth embodiments, the transaminase is selected from the following group of transaminases and variants thereof, An amino acid selected from the group including isoleucine, valine, phenylalanine, methionine and leucine at the position of the amino acid sequence corresponding to Val224 derived from transaminase of Chromobacterium violaceum ATCC 12472 (data bank code NP — 901695) And amino acid sequence corresponding to Gly230 derived from transaminase of Chromobacterium violaceum ATCC 12472 (data bank code NP_901695). The different amino acids and preferably from Nin serine, cysteine, is characterized by having an amino acid from the group comprising glycine and alanine.
第１〜第５の実施形態の一実施形態でもある、第１の観点の第６の実施形態においては、工程ｂ）及び／又は工程ｃ）を、単離された又は組換え型のアラニンデヒドロゲナーゼ及び無機窒素源の存在下で実施する。 In a sixth embodiment of the first aspect, which is also an embodiment of the first to fifth embodiments, step b) and / or step c) is carried out with an isolated or recombinant alanine dehydrogenase And in the presence of an inorganic nitrogen source.
第１〜第６の実施形態の一実施形態でもある、第１の観点の第７の実施形態においては、ＮＡＤ（Ｐ）+依存性アルコールデヒドロゲナーゼ、トランスアミナーゼ、モノオキシゲナーゼ及びアラニンデヒドロゲナーゼを包含する群からの少なくとも１つの酵素が組換え型であり、かつ相応の酵素を有する全細胞触媒の形態で準備する。 In a seventh embodiment of the first aspect, which is also an embodiment of the first to sixth embodiments, from the group comprising NAD (P) + dependent alcohol dehydrogenase, transaminase, monooxygenase and alanine dehydrogenase At least one of the enzymes is recombinant and is prepared in the form of a whole cell catalyst having the corresponding enzyme.
第７の実施形態の一実施形態である、第１の観点の第８の実施形態においては、すべての酵素を１つ以上の全細胞触媒の形態で準備し、ここで、有利には全細胞触媒がすべての必要な酵素を有する。 In an eighth embodiment of the first aspect, which is an embodiment of the seventh embodiment, all the enzymes are provided in the form of one or more whole-cell catalysts, wherein advantageously all cells The catalyst has all the necessary enzymes.
第１〜第８の実施形態の一実施形態でもある、第１の観点の第９の実施形態においては、工程ｂ）において、有利には工程ｂ）及びｃ）において、−１．３８より大きい、有利には０〜１．２のｌｏｇＰを有する有機補助溶媒が存在している。 In a ninth embodiment of the first aspect, which is also an embodiment of the first to eighth embodiments, in step b), advantageously in steps b) and c), greater than -1.38. There is preferably an organic cosolvent with a log P of 0 to 1.2.
第９の実施形態の一実施形態である、第１の観点の第１０の実施形態においては、補助溶媒は、不飽和脂肪酸、有利にはオレイン酸を包含する群から選択されている。 In a tenth embodiment of the first aspect, which is an embodiment of the ninth embodiment, the co-solvent is selected from the group comprising unsaturated fatty acids, preferably oleic acid.
第９の実施形態の有利な一実施形態である、第４の観点の第１１の実施形態においては、補助溶媒は、式Ｒ3−Ｏ−（ＣＨ2）x−Ｏ−Ｒ4［式中、Ｒ3及びＲ4は、それぞれ互いに無関係に、メチル、エチル、プロピル及びブチルを包含する群から選択されており、かつｘは１〜４であり、ここで、有利には、Ｒ3及びＲ4は、それぞれメチルであり、かつｘは２である］の化合物である。 In an eleventh embodiment of the fourth aspect, which is an advantageous embodiment of the ninth embodiment, the co-solvent is of the formula R 3 —O— (CH 2 ) x —O—R 4 [wherein , R 3 and R 4 , independently of one another, are selected from the group comprising methyl, ethyl, propyl and butyl, and x is from 1 to 4, where R 3 and R are preferably 4 are each methyl and x is 2.].
第９の実施形態の有利な一実施形態である、第１の観点の第１２の実施形態においては、補助溶媒は、ジアルキルエーテルを包含する群から選択されており、かつ有利にはジメチルエーテルである。 In a twelfth embodiment of the first aspect, which is an advantageous embodiment of the ninth embodiment, the co-solvent is selected from the group comprising dialkyl ethers and is preferably dimethyl ether .
本発明によれば、課題は、第２の観点においては、有利には補因子として少なくとも１個の亜鉛原子を有するＮＡＤ（Ｐ）+依存性アルコールデヒドロゲナーゼ、トランスアミナーゼ、任意にモノオキシゲナーゼ、及び任意にアラニンデヒドロゲナーゼを有し、ここで、これらの酵素は組換え型酵素である、全細胞触媒によって解決される。 According to the invention, the problem is that, in a second aspect, NAD (P) + -dependent alcohol dehydrogenase, transaminase, optionally monooxygenase, and optionally having at least one zinc atom as a cofactor Having alanine dehydrogenase, where these enzymes are solved by whole cell catalysis, which is a recombinant enzyme.
本発明によれば、課題は、第３の観点においては、式ＨＯ−（ＣＨ2）x−Ｒ1［式中、Ｒ1は、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ2及び−ＣＯＯＲ2を包含する群から選択されており、ｘは、少なくとも３であり、かつＲ2は、Ｈ、アルキル及びアリールを包含する群から選択されている］の第一級アルコールの酸化及びアミノ化のための本発明の第２の観点に従った全細胞触媒の使用によって解決される。 According to the present invention, the problem is that in a third aspect, the formula HO— (CH 2 ) x —R 1 , wherein R 1 includes —OH, —SH, —NH 2 and —COOR 2 . Wherein x is at least 3 and R 2 is selected from the group comprising H, alkyl and aryl] for the oxidation and amination of primary alcohols This is solved by the use of a whole cell catalyst according to the second aspect of the invention.
第１の実施形態の一実施形態である、第３の観点の第１の実施形態においては、この使用は、−１．３８より大きい、有利には０〜１．２のｌｏｇＰを有し、かつ有利にはジメチルエーテルである有機補助溶媒の存在を包含する。 In a first embodiment of the third aspect, which is an embodiment of the first embodiment, this use has a log P of greater than −1.38, preferably 0 to 1.2, And preferably includes the presence of an organic co-solvent which is dimethyl ether.
第２の実施形態の一実施形態である、第３の観点の第２の実施形態においては、補助溶媒は、不飽和脂肪酸を包含する群から選択されており、有利にはオレイン酸である。 In a second embodiment of the third aspect, which is an embodiment of the second embodiment, the co-solvent is selected from the group comprising unsaturated fatty acids, preferably oleic acid.
第２及び第３の観点の更に別の実施形態は、本発明の第１の観点のすべての実施形態を包含する。 Still other embodiments of the second and third aspects encompass all embodiments of the first aspect of the invention.
本発明の発明者は、意想外にも、第一級アルコールの酸化を比較的少量の副産物の発生下で実施するために用いることができるアルコールデヒドロゲナーゼの群があることを見出した。 The inventors of the present invention have surprisingly found that there is a group of alcohol dehydrogenases that can be used to carry out the oxidation of primary alcohols with the generation of relatively small amounts of by-products.
さらに、発明者は、意想外にも、アルコールを副産物の著しい発生を伴わずに生体触媒の使用下でアミノ化することができる一連の酵素活性が存在していることを見出し、ここで、還元当量を添加又は除去する必要はない。 In addition, the inventors have unexpectedly found that there is a range of enzymatic activities that can aminate alcohols in the use of biocatalysts without significant by-product generation, where reduction There is no need to add or remove equivalents.
さらに、発明者は、意想外にも、ポリアミドを、意想外にも全細胞触媒の使用下で、かつ再生原料から出発して製造することができる方法を見出した。 Furthermore, the inventor has unexpectedly found a process in which polyamides can be produced unexpectedly using whole cell catalysts and starting from regenerated raw materials.
さらに、本発明の発明者は、意想外にも、第一級アルコールのアミノ化を、事前の酸化後に、特に好ましくは特定の配列特性によって特徴付けられるトランスアミナーゼの群により実施することができることを見出した。 Furthermore, the inventors of the present invention have surprisingly found that amination of primary alcohols can be carried out after prior oxidation, particularly preferably with a group of transaminases characterized by specific sequence characteristics. It was.
本発明の発明者は、意想外にも、アルコールデヒドロゲナーゼ、トランスアミナーゼ及びアラニンデヒドロゲナーゼを包含する、第一級アルコールの酸化及びアミノ化のための系において、ＡｌｋＪ型とは異なるアルコールデヒドロゲナーゼの使用、殊にＮＡＤ（Ｐ）+依存性アルコールデヒドロゲナーゼの使用が、特に全細胞触媒を使用して実施する場合に、この方法の収率に鑑みて好ましいことを見出した。 The inventor of the present invention surprisingly uses the use of alcohol dehydrogenases different from AlkJ type in systems for the oxidation and amination of primary alcohols, including alcohol dehydrogenases, transaminases and alanine dehydrogenases, in particular. We have found that the use of NAD (P) + dependent alcohol dehydrogenase is preferred in view of the yield of this method, especially when carried out using whole cell catalysts.
本発明による方法は、多数の工業用に関連したアルコールに適用することができる。有利な実施形態においては、ω−ヒドロキシ−カルボン酸又はそのエステル、有利にはメチルエステルが重要であり、これをω−アミノカルボン酸へと酸化及びアミノ化する。更に別の実施形態においては、ジオールが重要であり、これをジアミンへと酸化及びアミノ化する。更に別の実施形態においては、第一級アルコールはヒドロキシアルキルアミンである。ここで、炭素鎖の長さは可変であり、かつｘは少なくとも３である。有利には、炭素鎖は３個より多い炭素原子を有し、すなわち、ｘ＝４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又はこれより多い。例示的な化合物には、ω−ヒドロキシ−ラウリン酸、ω−ヒドロキシ−ラウリン酸−メチルエステル、及びアルカン−ジオール、殊に１，８−オクタン−ジオール及び１，１０−デカン−ジオールである。 The process according to the invention can be applied to a number of industrially relevant alcohols. In an advantageous embodiment, the ω-hydroxy-carboxylic acid or its ester, preferably the methyl ester, is important and is oxidized and aminated to the ω-aminocarboxylic acid. In yet another embodiment, the diol is important and is oxidized and aminated to a diamine. In yet another embodiment, the primary alcohol is a hydroxyalkylamine. Here, the length of the carbon chain is variable and x is at least 3. Advantageously, the carbon chain has more than 3 carbon atoms, ie x = 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 19, 20 or more. Exemplary compounds are ω-hydroxy-lauric acid, ω-hydroxy-lauric acid-methyl ester, and alkane-diols, especially 1,8-octane-diol and 1,10-decane-diol.
特に有利な実施形態においては、Ｒ1は、−ＯＨ及び−ＣＯＯＲ2を包含する群から選択されており、ｘは少なくとも１１であり、かつＲ2は、Ｈ、メチル、エチル及びプロピルを包含する群から選択されている。最も有利な実施形態においては、第一級アルコールは、ω−ヒドロキシ−脂肪酸−メチルエステルである。 In a particularly advantageous embodiment, R 1 is selected from the group comprising —OH and —COOR 2 , x is at least 11 and R 2 comprises H, methyl, ethyl and propyl. Selected from the group. In the most advantageous embodiment, the primary alcohol is an ω-hydroxy-fatty acid-methyl ester.
本発明によれば、方法の工程ｂ）においては、ＮＡＤ（Ｐ）+依存性アルコールデヒドロゲナーゼを、第一級アルコールの酸化のために使用する。これは、本発明により用いられる全ての酵素活性ポリペプチドのように、酵素活性ポリペプチド若しくはその溶解産物、又は粗溶解産物から純粋なポリペプチドに至るまでの精製ステップ全体におけるポリペプチドの調製物を包含する細胞であってよい。この分野の当業者には、酵素活性ポリペプチドを適した細胞中で過発現させて精製若しくは単離することができることが公知である。そのため、ポリペプチドの発現のために、当業者によく用いられるすべての発現系を使用することができる。精製のために、クロマトグラフィー法、例えば、タグを持った組換えタンパク質の、固定化リガンド、例えばヒスチジンタグの場合にはニッケルイオン、標的タンパク質に結合したグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼの場合には固定化グルタチオン又はマルトース結合タンパク質を包含するタグの場合には固定化マルトースを使用したアフィニティークロマトグラフィー精製が考慮に入れられる。 According to the invention, in step b) of the process, NAD (P) + dependent alcohol dehydrogenase is used for the oxidation of primary alcohols. This, like all enzymatically active polypeptides used according to the present invention, is a preparation of the polypeptide in the entire purification step from the enzymatically active polypeptide or its lysate, or from the crude lysate to the pure polypeptide. It may be an enclosing cell. One skilled in the art knows that enzymatically active polypeptides can be overexpressed in suitable cells and purified or isolated. Therefore, all expression systems commonly used by those skilled in the art can be used for polypeptide expression. For purification, chromatographic methods, for example, immobilization of recombinant proteins with tags, immobilization ligands, such as nickel ions in the case of histidine tags, immobilization in the case of glutathione-S-transferase bound to the target protein In the case of tags that include glutathione or maltose binding protein, affinity chromatography purification using immobilized maltose is taken into account.
精製された酵素活性ポリペプチドは、可溶性で又は固定化されて用いることができる。当業者には、ポリペプチドを有機固相又は無機固相に共有結合的若しくは非共有結合的に、例えばスルフヒドリル結合ケミストリー（例えばＰｉｅｒｃｅ社のキット）によって固定化することができる適した方法が公知である。 The purified enzyme active polypeptide can be used in a soluble or immobilized state. Those skilled in the art know suitable methods by which a polypeptide can be immobilized covalently or non-covalently to an organic or inorganic solid phase, for example by sulfhydryl binding chemistry (eg, a kit from Pierce). is there.
有利な実施形態においては、全細胞触媒として又は発現系として使用される細胞は、原核細胞、有利には細菌細胞である。更に別の有利な実施形態においては、哺乳動物細胞である。更なる有利な実施形態においては、下等真核細胞、有利には酵母細胞である。例示的な原核細胞には、エシェリキア(Escherichia)、特にエシェリキア・コリ(Escherichia coli)、シュードモナス(Pseudomonas)属及びコリネバクテリウム(Corynebacterium)属の菌株が含まれる。例示的な下等真核細胞には、サッカロミセス(Saccharomyces)属、カンジダ(Candida)属、ピチア(Pichia)属、ヤロウィア(Yarrowia)属、シゾサッカロミセス(Schizosaccharomyces)属、特にカンジダ・トロピカリス(Candida tropicalis)菌株、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)菌株、ピチア・パストリス(Pichia pastoris)菌株、ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)菌株及びサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerivisiae)菌株が含まれる。 In an advantageous embodiment, the cell used as a whole cell catalyst or as an expression system is a prokaryotic cell, preferably a bacterial cell. In yet another advantageous embodiment, it is a mammalian cell. In a further advantageous embodiment, lower eukaryotic cells, preferably yeast cells. Exemplary prokaryotic cells include strains of Escherichia, in particular Escherichia coli, Pseudomonas and Corynebacterium. Exemplary lower eukaryotic cells include the genera Saccharomyces, Candida, Pichia, Yarrowia, Schizosaccharomyces, and in particular Candida tropicalis. Tropicalis strains, Schizosaccharomyces pombe strains, Pichia pastoris strains, Yarrowia lipolytica strains and Saccharomyces cerivisiae strains are included.
特に有利な実施形態においては、アルコールデヒドロゲナーゼは、亜鉛含有ＮＡＤ（Ｐ）+依存性アルコールデヒドロゲナーゼであり、すなわち、この触媒活性酵素は、システイン残基を含む特徴的な配列モチーフによってポリペプチドに共有結合している少なくとも１個の亜鉛原子を補因子として包含する。特に有利な実施形態においては、このアルコールデヒドロゲナーゼは、バシラス・ステアロサーモフィラス（データバンクコード Ｐ４２３２８）のアルコールデヒドロゲナーゼ又はその変異体である。 In a particularly advantageous embodiment, the alcohol dehydrogenase is a zinc-containing NAD (P) + dependent alcohol dehydrogenase, i.e. the catalytically active enzyme is covalently attached to the polypeptide by a characteristic sequence motif comprising a cysteine residue. At least one zinc atom as a cofactor. In a particularly advantageous embodiment, the alcohol dehydrogenase is an alcohol dehydrogenase of Bacillus stearothermophilus (Databank code P42328) or a variant thereof.
本発明の教示は、この中で記載した生体高分子の正確なアミノ酸配列又は核酸配列の使用下だけでなく、１つ以上のアミノ酸又は核酸の欠失、添加又は置換によって得られることができる係る高分子の変異体の使用下でも行うことができる。有利な実施形態においては、核酸配列又はアミノ酸配列の"変異体"との用語−これ以降、この中で使用している"相同体"と同じ意味を持ち、かつ入れ替え可能に用いる−は、相応する元の野生型核酸配列又はアミノ酸配列に鑑みて、７０、７５、８０、８５、９０、９２、９４、９６、９８、９９％又はこれより高いパーセントの相同性−この場合、同定と同じ意味で使用する−を有する他の核酸配列又はアミノ酸配列を意味し、ここで、有利には、触媒活性中心を形成するアミノ酸とは異なるアミノ酸又は構造若しくはフォールディングのために必須のアミノ酸が欠失若しくは置換されているか、又は置換されている場合は単に保存置換されており、例えばアスパルテートの代わりにグルタメートが、又はバリンの代わりにロイシンが保存置換されている。従来技術は、２つの配列の相同性の程度を算定するために使用することができるアルゴリズムを記載している（例えば、Ａｒｔｈｕｒ Ｌｅｓｔ（２００８），Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，３rd ｅｄｉｔｉｏｎ）。本発明の更に別のより有利な実施形態においては、アミノ酸配列又は核酸配列の変異体は、有利には上記の配列相同性に加えて、野生型分子若しくは元の分子と本質的に同じ酵素活性を有する。例えば、プロテアーゼとして酵素活性のポリペプチドの変異体は、ポリペプチド酵素と同じ若しくは本質的に同じタンパク質分解活性を有し、すなわち、ペプチド結合の加水分解を触媒する性質を有する。特別な実施形態においては、"本質的に同じ酵素活性"との用語は、野生型ポリペプチドの基質に鑑みて、バックグラウンド活性を明らかに超えるか又は／かつ野生型ポリペプチドが同じ基質に鑑みて有するＫM値及び／又はｋcat値の３未満、有利には２、さらに有利には１のオーダーだけ異なる活性を意味する。更に別の有利な実施形態においては、核酸配列又はアミノ酸配列の"変異体"との用語には、核酸配列若しくはアミノ酸配列の少なくとも１つの活性部位及び／又は断片が含まれる。更に別の有利な実施形態においては、この中で使用している"活性部位"との用語は、アミノ酸配列の全長より短い配列を有するか若しくはアミノ酸配列の全長より短い配列をコードするアミノ酸配列又は核酸配列を意味し、ここで、野生型アミノ酸配列より短い長さを有するアミノ酸配列又はコードされたアミノ酸配列は、野生型ポリペプチド又はその変異体と同じ酵素活性を、例えばアルコールデヒドロゲナーゼ、モノオキシゲナーゼ又はトランスアミナーゼとして有する。特別な実施形態においては、核酸の"変異体"との用語には、その相補鎖が、有利にはストリンジェントな条件下で、野生型核酸に結合している核酸が含まれる。ハイブリダイゼーション反応の厳密性は、当業者であれば容易に定めることが可能であり、これは一般的にプローブの長さ、洗浄に際しての温度及び塩濃度に依存する。一般的に、比較的長いプローブは、ハイブリダイゼーションのために比較的高い温度を要し、それに対して、比較的短いプローブは低い温度で行える。ハイブリダイゼーションが起こるかどうかは、一般的に、その周囲に存在する相補鎖に、それも融点を下回ってアニールする変性ＤＮＡの性質に依存する。ハイブリダイゼーション反応及び相応の条件の厳密性は、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．１９９５に詳細に記載されている。有利な実施形態においては、この中で使用している核酸の"変異体"との用語には、元の核酸と同じアミノ酸配列又はこのアミノ酸配列の変異体を遺伝コードの縮重の範囲内でコードする任意の核酸配列が含まれる。 The teachings of the present invention can be obtained not only under the use of the exact amino acid sequence or nucleic acid sequence of the biopolymer described herein, but also by deletion, addition or substitution of one or more amino acids or nucleic acids. It can also be carried out using polymer mutants. In an advantageous embodiment, the term “variant” of a nucleic acid sequence or amino acid sequence—having the same meaning and being used interchangeably hereinafter as “homologue” is used accordingly. 70, 75, 80, 85, 90, 92, 94, 96, 98, 99% or higher percent homology in this context, meaning the same as identification in this case As used herein, means other nucleic acid sequences or amino acid sequences, wherein amino acids that are different from the amino acids that form the catalytically active center or amino acids that are essential for structure or folding are deleted or substituted Or substituted, it is simply a conservative substitution, e.g. glutamate instead of aspartate or leucine instead of valine. Has been replaced. Prior art describes an algorithm that can be used to determine the degree of homology between two sequences (e.g., Arthur Lest (2008), Introduction to bioinformatics, 3 rd edition). In yet another more advantageous embodiment of the invention, the amino acid sequence or nucleic acid sequence variant advantageously has essentially the same enzymatic activity as the wild type or original molecule in addition to the sequence homology described above. Have For example, a variant of a polypeptide that is enzymatically active as a protease has the same or essentially the same proteolytic activity as a polypeptide enzyme, ie, has the property of catalyzing the hydrolysis of peptide bonds. In a particular embodiment, the term “essentially the same enzyme activity” means that the background activity is clearly exceeded in view of the substrate of the wild-type polypeptide or / and the wild-type polypeptide is in view of the same substrate. less than 3 K M value and / or the k cat values have been advantageously 2, more advantageously means only of the order different activity. In yet another advantageous embodiment, the term “variant” of a nucleic acid sequence or amino acid sequence includes at least one active site and / or fragment of the nucleic acid sequence or amino acid sequence. In yet another advantageous embodiment, the term “active site” as used herein is an amino acid sequence having a sequence shorter than the full length of the amino acid sequence or encoding a sequence shorter than the full length of the amino acid sequence, or Means a nucleic acid sequence, wherein the amino acid sequence having a shorter length than the wild type amino acid sequence or the encoded amino acid sequence has the same enzymatic activity as the wild type polypeptide or variant thereof, e.g. alcohol dehydrogenase, monooxygenase or Has as transaminase. In a particular embodiment, the term “variant” of a nucleic acid includes a nucleic acid whose complementary strand is bound to a wild-type nucleic acid, advantageously under stringent conditions. The stringency of the hybridization reaction can be easily determined by those skilled in the art, and this generally depends on the length of the probe, the temperature during washing and the salt concentration. In general, longer probes require higher temperatures for hybridization, while shorter probes can be performed at lower temperatures. Whether hybridization occurs generally depends on the nature of the denatured DNA that anneals to its surrounding complementary strand, also below the melting point. The stringency of hybridization reactions and corresponding conditions is described in Ausubel et al. 1995, which is described in detail. In an advantageous embodiment, the term "variant" of the nucleic acid used therein includes the same amino acid sequence as the original nucleic acid or a variant of this amino acid sequence within the degeneracy of the genetic code. Any nucleic acid sequence that encodes is included.
アルコールデヒドロゲナーゼは、数十年前から生化学において醸造技術による発酵処理との関係で高く注目され、かつバイオテクノロジー的に関連性の強い酵素種であり、これは異なる群のアイソフィームを含む。例えば、ＮＡＤ（Ｐ）+の代わりにフラボ補因子を使用するシュードモナス・プチダ ＧＰＯ１ ＡｌｋＪ型の膜結合したフラビン依存性アルコールデヒドロゲナーゼが存在する。更に別の群に含まれるのは、細菌中又は不活性の形態で酵母中に見出される、酸素感受性の鉄含有アルコールデヒドロゲナーゼである。他の群には、ＮＡＤ（Ｐ）+依存性アルコールデヒドロゲナーゼ、なかでも亜鉛含有アルコールデヒドロゲナーゼ（活性中心が、アルコール基質を固定するシステイン配位された亜鉛原子を有する）が含まれる。有利な実施形態においては、この中で使用している"アルコールデヒドロゲナーゼ"との用語は、アルデヒド若しくはケトンを相応の第一級若しくは第二級アルコールへと酸化する酵素と解する。有利には、本発明による方法におけるアルコールデヒドロゲナーゼは、ＮＡＤ（Ｐ）+依存性アルコールデヒドロゲナーゼ、すなわち、ＮＡＤ（Ｐ）+を補因子としてアルコールの酸化のために又はＮＡＤ（Ｐ）Ｈを相応のアルデヒド若しくはケトンの還元のために使用するアルコールデヒドロゲナーゼである。最も有利な実施形態においては、このアルコールデヒドロゲナーゼは、ＮＡＤ（Ｐ）+依存性の亜鉛含有アルコールデヒドロゲナーゼである。有利な実施形態においては、この中で使用している"ＮＡＤ（Ｐ）+依存性アルコールデヒドロゲナーゼ"との用語は、ＮＡＤ+及び／又はＮＡＤＰ+依存性のアルコールデヒドロゲナーゼを表す。 Alcohol dehydrogenase has been attracting much attention in relation to fermentation treatment by brewing techniques in biochemistry for several decades, and is a biotechnologically relevant enzyme species, which includes a different group of isophies. For example, there is a Pseudomonas putida GPO1 AlkJ type membrane-bound flavin-dependent alcohol dehydrogenase that uses a flavo cofactor instead of NAD (P) + . Included in yet another group are oxygen sensitive iron-containing alcohol dehydrogenases found in bacteria or in an inactive form in yeast. Another group includes NAD (P) + -dependent alcohol dehydrogenases, especially zinc-containing alcohol dehydrogenases (the active center has a cysteine coordinated zinc atom that fixes the alcohol substrate). In an advantageous embodiment, the term “alcohol dehydrogenase” as used herein is understood to be an enzyme that oxidizes an aldehyde or ketone to the corresponding primary or secondary alcohol. Advantageously, the alcohol dehydrogenase in the process according to the invention is a NAD (P) + -dependent alcohol dehydrogenase, ie for the oxidation of alcohol with NAD (P) + as a cofactor or NAD (P) H as a corresponding aldehyde. Or alcohol dehydrogenase used for the reduction of ketones. In the most advantageous embodiment, the alcohol dehydrogenase is a NAD (P) + dependent zinc-containing alcohol dehydrogenase. In an advantageous embodiment, the term “NAD (P) + dependent alcohol dehydrogenase” as used herein represents an NAD + and / or NADP + dependent alcohol dehydrogenase.
本発明によれば、工程ｃ）においては、トランスアミナーゼを使用する。有利な実施形態においては、この中で使用している"トランスアミナーゼ"との用語は、供与体分子、有利にはアミノ酸から、受容体分子、有利にはα−ケトカルボン酸へのα−アミノ基の転移を触媒する酵素を意味する。有利な実施形態においては、トランアミナーゼは、以下のトランスアミナーゼ及びその変異体の群から選択されており、これらは、クロモバクテリウム・ビオラセウム ＡＴＣＣ １２４７２（データバンクコード ＮＰ＿９０１６９５）のトランスアミナーゼ由来のＶａｌ２２４に相当するアミノ酸配列の位置に、イソロイシン、バリン、フェニルアラニン、メチオニン及びロイシンを包含する群から選択されるアミノ酸を有し、かつクロモバクテリウム・ビオラセウム ＡＴＣＣ １２４７２（データバンクコード ＮＰ＿９０１６９５）のトランスアミナーゼ由来のＧｌｙ２３０に相当するアミノ酸配列の位置に、トレオニンとは異なるアミノ酸及び有利にはセリン、システイン、グリシン及びアラニンを包含する群からのアミノ酸を有することを特徴としている。特に有利な実施形態においては、トランスアミナーゼは、クロモバクテリウム・ビオラセウム ＤＳＭ３０１９１由来のω−トランスアミナーゼ、シュードモナス・プチダ Ｗ６１９由来、シュードモナス・エルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)ＰＡ０１由来、ストレプトマイセス・セリカラー(Streptomyces coelicolor)Ａ３（２）由来及びストレプトマイセス・アベルミティリス(Streptomyces avermitilis)ＭＡ ４６８０由来のトランスアミナーゼを包含する群から選択されている。 According to the invention, transaminase is used in step c). In an advantageous embodiment, as used herein, the term “transaminase” refers to the α-amino group from a donor molecule, preferably an amino acid, to an acceptor molecule, preferably an α-ketocarboxylic acid. An enzyme that catalyzes transfer. In an advantageous embodiment, the transaminase is selected from the group of transaminases and variants thereof which correspond to Val224 from transaminase of Chromobacterium violaceum ATCC 12472 (databank code NP_901695). Corresponding to Gly230 derived from transaminase of Chromobacterium violaceum ATCC 12472 (databank code NP — 901695) having an amino acid selected from the group including isoleucine, valine, phenylalanine, methionine and leucine In the position of the amino acid sequence to which the amino acid differs from threonine and preferably from the group comprising serine, cysteine, glycine and alanine It is characterized in that. In a particularly advantageous embodiment, the transaminase is an omega-transaminase from Chromobacterium violaceum DSM30191, from Pseudomonas putida W619, from Pseudomonas aeruginosa PA01, Streptomyces coelicolor A3 ( 2) Selected from the group comprising transaminases derived from and from Streptomyces avermitilis MA 4680.
有利な実施形態においては、この中で使用している"クロモバクテリウム・ビオラセウム ＡＴＣＣ １２４７２のトランスアミナーゼ由来のアミノ酸配列の位置Ｘに相当する位置"との用語は、試験される分子のアライメント中でのこの相当する位置が、クロモバクテリウム・ビオラセウム ＡＴＣＣ １２４７２のトランスアミナーゼ由来のアミノ酸配列の位置Ｘに対して相同性であることを意味する。当業者には、アミノ酸配列のアライメントを作製することができる多数のソフトウェアパッケージ及びアルゴリズムが公知である。例示的なソフトウェアパッケージ法には、ＥＭＢＬにより提供されるＣｌｕｓｔａｌＷパッケージ（Ｌａｒｋｉｎ ｅｔ ａｌ．２０１０）が含まれ、これはＡｒｔｈｕｒ Ｍ．Ｌｅｓｋ（２００８），Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎの中で説明及び記載されている。 In an advantageous embodiment, the term "position corresponding to position X of the amino acid sequence derived from the transaminase of Chromobacterium violaceum ATCC 12472" used herein is used in the alignment of the molecules to be tested. This corresponding position means that it is homologous to position X of the amino acid sequence derived from the transaminase of Chromobacterium violaceum ATCC 12472. Those skilled in the art are aware of numerous software packages and algorithms that can create amino acid sequence alignments. Exemplary software packaging methods include the ClustalW package (Larkin et al. 2010) provided by EMBL, which includes Arthur M. et al. Description and description in Lesk (2008), Introduction to Bioinformatics, 3rd edition.
本発明により使用される酵素は、有利には組換え酵素である。有利な実施形態においては、この中で使用している"組換え"との用語は、相応の核酸分子が自然には発生しないこと及び／又は遺伝子工学的を使用して製造されたことを意味する。有利な実施形態においては、相応のポリペプチドが組換え核酸によりコードされる場合には組換えタンパク質と言う。有利な実施形態においては、この中で使用している組換え細胞は、少なくとも１つの核酸又は組換えポリペプチドを有する細胞と解する。当業者には、組換え分子又は細胞を製造するために適した方法が公知であり、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９に記載の方法が挙げられる。 The enzyme used according to the invention is preferably a recombinant enzyme. In an advantageous embodiment, the term “recombinant” as used herein means that the corresponding nucleic acid molecule does not occur naturally and / or has been produced using genetic engineering. To do. In an advantageous embodiment, a corresponding polypeptide is said to be a recombinant protein if it is encoded by a recombinant nucleic acid. In an advantageous embodiment, the recombinant cell used therein is understood as a cell having at least one nucleic acid or recombinant polypeptide. The person skilled in the art knows suitable methods for producing recombinant molecules or cells, for example see Sambrook et al. , 1989.
本発明による教示は、単離酵素の使用下でも全細胞触媒の使用下でも行うことができる。有利な実施形態においては、この中で使用している"全細胞触媒"との用語は、所望の酵素活性を提供する、正常な、生存能力を有する代謝活性細胞を意味する。全細胞触媒は、代謝される基質を、本発明による方法の場合にはアルコール又はそこから生じる酸化産物を、サイトゾル酵素による代謝が行われる細胞内部に移送することが可能であるか、又はこの全細胞触媒は、対象物の酵素を、培地中の基質に直接曝されているその表面にもたらすことができる。当業者には、全細胞触媒の製造のための多数のシステムが公知であり、例えばＤＥ６０２１６２４５からのシステムが挙げられる。 The teaching according to the invention can be carried out either with isolated enzymes or with whole cell catalysts. In an advantageous embodiment, the term “whole cell catalyst” as used herein refers to a normal, viable, metabolically active cell that provides the desired enzymatic activity. The whole cell catalyst is capable of transferring the substrate to be metabolized, in the case of the method according to the invention, the alcohol or the oxidation product resulting therefrom, into the cell where metabolism by the cytosolic enzyme takes place, or this The whole cell catalyst can bring the enzyme of interest to its surface that is directly exposed to the substrate in the medium. A number of systems for the production of whole cell catalysts are known to the person skilled in the art, for example the system from DE 60216245.
一連の適用のために、単離酵素の使用が推奨される。有利な実施形態においては、この中で使用している"単離"との用語は、酵素がその天然源における形より純粋かつ／又は濃縮された形態で存在することを意味する。有利な実施形態においては、酵素がポリペプチド酵素であり、かつ相応の調製物のタンパク質分の質量の６０、７０、８０、９０又は有利には９５％となる場合には、酵素は単離されているものと見なす。当業者には、溶液中のタンパク質の質量の多数の測定法が公知であり、例えば、相応のタンパク質バンドの厚みを手がかりとした、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル、ＮＭＲ分光法又は質量分析に基づく方法による目視評価が挙げられる。 For a series of applications, the use of isolated enzymes is recommended. In an advantageous embodiment, the term “isolated” as used herein means that the enzyme is present in a form that is more pure and / or concentrated than in its natural source. In an advantageous embodiment, the enzyme is isolated if it is a polypeptide enzyme and is 60, 70, 80, 90 or preferably 95% of the protein mass of the corresponding preparation. It is assumed that The person skilled in the art knows many methods for measuring the mass of a protein in solution, for example by SDS-polyacrylamide gels, NMR spectroscopy or mass spectrometry based methods with the corresponding protein band thickness as a clue. Visual evaluation is mentioned.
本発明による方法の酵素接触反応は、典型的には、高い含水量を有する溶媒又は溶媒混合物中で、有利には酵素活性と適合するｐＨ値の調節のための適したバッファー系の存在下で実施する。しかしながら、疎水性の出発物質の場合、殊に３個以上の炭素原子を包む炭素鎖を有するアルコールの場合、酵素が基質と接触することを媒介し得る有機補助溶媒の付加的な存在が好ましい。この１つ以上の補助溶媒は、９５、９０、８５、８０、７５、７０、６５、６０、５５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０又は５体積％以下の総量で溶媒混合物中に存在する。 The enzyme-catalyzed reaction of the process according to the invention is typically carried out in a solvent or solvent mixture with a high water content, preferably in the presence of a suitable buffer system for adjusting the pH value compatible with the enzyme activity. carry out. However, in the case of hydrophobic starting materials, especially in the case of alcohols having a carbon chain enclosing three or more carbon atoms, the additional presence of an organic co-solvent that can mediate contact of the enzyme with the substrate is preferred. The one or more co-solvents are 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, or 5% by volume or less. Present in the solvent mixture in total amount.
ここで、補助溶媒の疎水性が重要な役割を果たす。それは、ｌｏｇＰ、ｎ−オクタノール／水の分配係数の常用対数によって表すことができる。有利な補助溶媒は、−１．３８より大きい、有利には−１〜＋２、さらに有利には０〜１．５のｌｏｇＰを有する。 Here, the hydrophobicity of the auxiliary solvent plays an important role. It can be represented by the common logarithm of logP, n-octanol / water partition coefficient. Preferred cosolvents have a log P of greater than -1.38, preferably -1 to +2, more preferably 0 to 1.5.
ｎ−オクタノール／水の分配係数Ｋow又はＰは、ある物質の、１−オクタノールと水とから成る二相系における濃度の比を示す無次元の分配係数である（Ｊ． Ｓａｎｇｓｔｅｒ，Ｏｃｔａｎｏｌ−Ｗａｔｅｒ Ｐａｒｔｉｔｉｏｎ Ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｓ：Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２ ｏｆ Ｗｉｌｅｙ Ｓｅｒｉｅｓ ｉｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ， １９９７を参照されたい)。より正確に言うと、Ｋow又はＰは、この物質の、水リッチな相中でのその濃度に対するオクタノールリッチな相中での濃度の比を表す。 The n-octanol / water partition coefficient K ow or P is a dimensionless partition coefficient indicating the concentration ratio of a substance in a two-phase system consisting of 1-octanol and water (J. Sangster, Octanol-Water). (Partition Coefficients: Fundamentals and Physical Chemistry, Vol. 2 of Wiley Series in Solution Chemistry, John Wiley & Sons, Chichter, 19). More precisely, K ow or P represents the ratio of the concentration of this substance in the octanol-rich phase to its concentration in the water-rich phase.
Ｋow値は、ある物質の親油性（脂溶性）と親水性（水溶性）との比のモデル基準である。ある物質の、オクタノール／水の系における分配係数を用いて、この物質の、水相を有する他の系における分配係数も評定できることが期待される。Ｋow値は、ある物質が、ｎ−オクタノールといった脂肪様の溶媒に比較的良好に溶ける場合には１より大きく、それが水に比較的良好に溶ける場合には１より小さい。相応して、ＬｏｇＰは、親油性物質については正、親水性物質については負である。全ての化学物質についてＫow値を測定することはできないので、予測のための非常に多岐にわたったモデルがあり、例えば定量的構造活性相関（ＱＳＡＲ）又は自由エネルギー直線関係（ＬＦＥＲ）による予測が挙げられ、これらは、例えばＥｕｇｅｎｅ Ｋｅｌｌｏｇｇ Ｇ，Ａｂｒａｈａｍ ＤＪ：Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙ：ｉｓ ＬｏｇＰ（ｏ／ｗ） ｍｏｒｅ ｔｈａｎ ｔｈｅ ｓｕｍ ｏｆ ｉｔｓ ｐａｒｔｓ？．Ｅｕｒ Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ． ２０００ Ｊｕｌ−Ａｕｇ；３５（７−８）：６５１−６１又はＧｕｄｒｕｎ Ｗｉｅｎｋｅ，"Ｍｅｓｓｕｎｇ ｕｎｄ Ｖｏｒａｕｓｂｅｒｅｃｈｎｕｎｇ ｖｏｎ ｎ−Ｏｃｔａｎａｌ／Ｗａｓｓｅｒ−Ｖｅｒｔｅｉｌｕｎｇｓｋｏｅｆｆｉｚｉｅｎｔｅｎ"，Ｄｏｋｔｏｒａｒｂｅｉｔ，Ｕｎｉｖ．Ｏｌｄｅｎｂｕｒｇ，１−１７２，１９９３に記載されている。 The K ow value is a model criterion for the ratio of lipophilicity (lipid solubility) to hydrophilicity (water solubility) of a substance. It is expected that the partition coefficient of a material in the octanol / water system can be used to assess the partition coefficient of this material in other systems with an aqueous phase. The K ow value is greater than 1 if a substance is relatively well soluble in fat-like solvents such as n-octanol, and is less than 1 if it is relatively well soluble in water. Correspondingly, LogP is positive for lipophilic substances and negative for hydrophilic substances. Since K ow values cannot be measured for all chemicals, there are very diverse models for prediction, such as quantitative structure-activity relationship (QSAR) or free energy linear relationship (LFER) predictions. These are, for example, Eugene Kellogg G, Abraham DJ: Hydrophobity: is LogP (o / w) more than the sum of parts? . Eur J Med Chem. 2000 Jul-Aug; 35 (7-8): 651-61 or Gudrun Wienke, "Messung und Voraubernung von n-Otnal / Wasser-Vertungungskoeffenienten", Doktorarbeit. Oldenburg, 1-172, 1993.
本発明の範囲内では、ｌｏｇＰは、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｉｎｃ社（トロント在）より提供される方法に従って、プログラムモジュールＡＣＤ／ＬｏｇＰ ＤＢを用いて測定する。 Within the scope of the present invention, logP is measured using the program module ACD / LogP DB according to the method provided by Advanced Chemistry Development Inc. (Toronto).
有利な補助溶媒は、−１．３８より大きい、有利には−１〜＋２、さらに有利には０．７５〜１．５又は−０．５〜０，５又は−０．４〜０．４又は−０．３〜０．１のｌｏｇＰを有する。有利な実施形態においては、補助溶媒は、−１．３８より大きい、有利には−１〜＋２、さらに有利には０〜１．５のｌｏｇＰを有する式Ａｌｋ1−Ｏ−Ａｌｋ2のジアルキルエーテルであり、ここで、双方のアルキル置換基Ａｌｋ1及びＡｌｋ2は、それぞれ互いに無関係に、メチル、エチル、プロピル、ブチル、イソプロピル及びｔ−ブチルを包含する群から選択されている。特に有利な実施形態においては、補助溶媒はメチル−ｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）である。最も有利な実施形態においては、補助溶媒はジメトキシエタン（ＤＭＥ）である。更に別の有利な実施形態においては、補助溶媒は、式Ｒ3−Ｏ−（ＣＨ2）x−Ｏ−Ｒ4［式中、Ｒ3及びＲ4は、それぞれ互いに無関係に、メチル、エチル、プロピル及びブチルを包含する群から選択されており、かつｘは１〜４であり、ここで、有利には、Ｒ3及びＲ4は、それぞれメチルであり、かつｘは２である］の化合物である。 Preferred cosolvents are greater than −1.38, preferably −1 to +2, more preferably 0.75 to 1.5 or −0.5 to 0.5, or −0.4 to 0.4. Or a log P of -0.3 to 0.1. In an advantageous embodiment, the co-solvent is a dialkyl ether of the formula Alk 1 —O—Alk 2 having a log P of greater than −1.38, preferably −1 to +2, more preferably 0 to 1.5. Where both alkyl substituents Alk 1 and Alk 2 are each independently selected from the group comprising methyl, ethyl, propyl, butyl, isopropyl and t-butyl. In a particularly advantageous embodiment, the cosolvent is methyl tert-butyl ether (MTBE). In the most advantageous embodiment, the co-solvent is dimethoxyethane (DME). In yet another advantageous embodiment, the co-solvent is of the formula R 3 —O— (CH 2 ) x —O—R 4 , wherein R 3 and R 4 are each independently methyl, ethyl, A compound selected from the group comprising propyl and butyl, and x is 1-4, wherein preferably R 3 and R 4 are each methyl and x is 2. It is.
更に別の有利な実施形態においては、補助溶媒は、カルボン酸又は脂肪酸、有利には、少なくとも６個、より有利には少なくとも１２個の炭素原子を有する脂肪酸である。脂肪酸は、飽和脂肪酸、例えばラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、マルガリン酸、ステアリン酸、アラキン酸若しくはベヘン酸、又は不飽和の、例えばミリストレイン酸、パルミトレイン酸、ペトロセリン酸、オレイン酸、エライジン酸、バクセン酸、ガドレイン酸、イコセン酸若しくはエルカ酸であってよい。同様に可能なのは、種々の脂肪酸の混合物、例えば、主として不飽和脂肪酸を含有するヒゴタイ属の植物油(Kugeldisteloel)である。全ての脂肪酸が室温で著しく可溶性を示すとは限らないので、例えば温度を高めるか、又は有利には更に別の溶媒の添加といった更なる措置を施して、これを水相にし易くする必要が起こり得る。特に有利な実施形態においては、脂肪酸又はそのエステル、有利にはメチルエステル、最も有利にはラウリン酸メチルエステルを、このような更に別の溶媒として使用する。 In yet another advantageous embodiment, the co-solvent is a carboxylic acid or fatty acid, preferably a fatty acid having at least 6, more preferably at least 12 carbon atoms. Fatty acids are saturated fatty acids such as lauric acid, myristic acid, palmitic acid, margaric acid, stearic acid, arachidic acid or behenic acid, or unsaturated, such as myristoleic acid, palmitoleic acid, petroceric acid, oleic acid, elaidic acid, It may be vaccenic acid, gadoleic acid, icosenic acid or erucic acid. Also possible are mixtures of various fatty acids, for example Kugoldisteloel, which mainly contains unsaturated fatty acids. Not all fatty acids are very soluble at room temperature, so it is necessary to take further measures such as increasing the temperature or advantageously adding further solvents to make it easier to make it into the aqueous phase. obtain. In a particularly advantageous embodiment, fatty acids or esters thereof, preferably methyl esters, most preferably lauric acid methyl ester are used as such further solvents.
本発明による酵素カスケードは、本発明によればアラニンデヒドロゲナーゼの存在下で進行し得る。この態様により還元当量に左右されない(reduktionsaequivalentneutral)反応操作が可能となること、すなわち、反応が、還元当量の形態で電子を供給又は除去することなく進行する（なぜなら、アルコールデヒドロゲナーゼによりアルコール酸化の過程で作製されたＮＡＤＨは、アラニンの作製に際して、無機の窒素供与体、有利にはアンモニア又はアンモニア源の消費下で消費されるからである）ことが本発明の特別な長所である。 The enzyme cascade according to the invention can proceed according to the invention in the presence of alanine dehydrogenase. This embodiment allows a reaction operation that is independent of reducing equivalents, i.e., the reaction proceeds in the form of reducing equivalents without supplying or removing electrons (because of alcohol dehydrogenase in the course of alcohol oxidation). It is a special advantage of the present invention that the NADH produced is consumed in the production of alanine, preferably under the consumption of an inorganic nitrogen donor, preferably ammonia or an ammonia source.
有利な実施形態においては、この中で使用している"アラニンデヒドロゲナーゼ"との用語は、Ｌ−アラニンが、水とＮＡＤ+の消費下で、ピルベート、アンモニア及びＮＡＤＨへと変換することを触媒する酵素を意味する。有利には、アラニンデヒドロゲナーゼは、細胞内アラニンデヒドロゲナーゼ、さらに有利には、細菌性全細胞触媒の組換え型の細胞内アラニンデヒドロゲナーゼである。 In an advantageous embodiment, the term “alanine dehydrogenase” as used herein catalyzes the conversion of L-alanine to pyruvate, ammonia and NADH under the consumption of water and NAD +. Means an enzyme. Advantageously, the alanine dehydrogenase is an intracellular alanine dehydrogenase, more preferably a bacterial whole cell catalytic recombinant intracellular alanine dehydrogenase.
有利な実施形態においては、本発明による方法のために、全ての必要な活性を有する全細胞触媒、すなわち、ＮＡＤ（Ｐ）+依存性アルコールデヒドロゲナーゼ、トランスアミナーゼ及び場合によりモノオキシゲナーゼ及び／又はアラニンデヒドロゲナーゼを用いる。係る全細胞触媒の使用は、すべての活性を個々の作用因子の形態で用いることができ、かつ酵素を生物学的に活性な形態で大規模工業的に調製する必要が必ずしもないという利点を有する。当業者には、全細胞触媒の構築のために適した方法が公知であり、殊に１つ以上の組換えタンパク質の発現のためのプラスミド系の構築、又は使用される宿主細胞の染色体ＤＮＡへの組換えタンパク質をコードするＤＮＡの組み込みが挙げられる。 In an advantageous embodiment, for the method according to the invention, a whole cell catalyst having all the necessary activities, ie NAD (P) + dependent alcohol dehydrogenase, transaminase and optionally monooxygenase and / or alanine dehydrogenase, is used. Use. The use of such a whole cell catalyst has the advantage that all activities can be used in the form of individual agents and that the enzyme does not necessarily have to be prepared industrially in a biologically active form. . The person skilled in the art knows suitable methods for the construction of whole cell catalysts, in particular the construction of a plasmid system for the expression of one or more recombinant proteins or the chromosomal DNA of the host cell used. Incorporation of DNA encoding the recombinant protein of
上述の発明の詳細な説明、請求項及び図面に開示される本発明の特徴は、単独でも任意の組み合わせにおいても、本発明をその様々な実施形態において実現するために重要であり得る。 The features of the invention disclosed in the detailed description of the invention, the claims and the drawings, either alone or in any combination, can be important for implementing the invention in its various embodiments.
図１は、種々のトランスアミナーゼ、殊にクロモバクテリウム・ビオラセウム(Chromobacterium violaceum) ＡＴＣＣ １２４７２（データバンクコード ＮＰ＿９０１６９５，"ＴＡＣＶ＿ｃｏ"）を包含する例示的なアラインメントを示す。後者のトランスアミナーゼのＶａｌ２２４及びＧｌｙ２３０の位置に相当するアミノ酸残基は、全ての配列中で下線を引いている。このアラインメントは、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ２を使用して作成した。 FIG. 1 shows an exemplary alignment that includes various transaminases, in particular Chromobacterium violaceum ATCC 12472 (data bank code NP_901695, “TACV_co”). Amino acid residues corresponding to positions of Val224 and Gly230 of the latter transaminase are underlined in all sequences. This alignment was made using Clustal W2.
例１：本発明による方法の使用下での、アルコールデヒドロゲナーゼＡｌｋＪとの比較におけるＮＡＤ + 依存性アルコールデヒドロゲナーゼを使用した種々の基質のアミノ化 Example 1: under use of the method according to the invention, various amination of the substrate using the NA D + dependent alcohol dehydrogenase in comparison to the alcohol dehydrogenase AlkJ
酵素：
アラニン−デヒドロゲナーゼ：
バシラス・サチリスのＬ−アラニン−デヒドロゲナーゼを、大腸菌内で発現させた。まず、一晩培養を準備し、これを引き続き、本培養（ＬＢ−アンピシリン培地）に接種するために使用した。細胞を、振盪器で３０℃にて２４時間、１２０ｒｐｍで培養した。引き続き、滅菌条件下でＩＰＴＧ（０．５ｍＭ、イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド、Ｓｉｇｍａ社製）を誘導のために加え、かつ培養を２０℃にてさらに２４時間振盪した。
enzyme:
Alanine-dehydrogenase:
Bacillus subtilis L-alanine-dehydrogenase was expressed in E. coli. First, an overnight culture was prepared and subsequently used to inoculate the main culture (LB-ampicillin medium). The cells were cultured at 120 rpm on a shaker at 30 ° C. for 24 hours. Subsequently, IPTG (0.5 mM, isopropyl-β-thiogalactopyranoside, Sigma) was added for induction under sterile conditions, and the culture was shaken at 20 ° C. for a further 24 hours.
細胞を、遠心分離（８０００ｒｐｍ、２０分、４℃）し、洗浄し、かつ上清を除去した。引き続き、細胞を超音波（１秒間のパルス、４秒間の停止、時間：１０分、振幅値：４０％）の使用下で粉砕し、この混合物を、遠心分離（２０分、１８０００ｒｐｍ、４℃）し、そして酵素を、Ｈｉｐ−ｐｒｅｐカラムの使用下で精製した。 The cells were centrifuged (8000 rpm, 20 min, 4 ° C.), washed and the supernatant removed. Subsequently, the cells are pulverized using ultrasonic waves (pulse for 1 second, pause for 4 seconds, time: 10 minutes, amplitude value: 40%) and the mixture is centrifuged (20 minutes, 18000 rpm, 4 ° C.). And the enzyme was purified using a Hip-prep column.
バシラス・ステアロサーモフィラスのアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ−ｈＴ；Ｐ４２３２８．１））
バシラス・ステアロサーモフィラスのＮＡＤ + 依存性アルコールデヒドロゲナーゼの調製のために（Ｆｉｏｒｅｎｔｉｎｏ Ｇ，Ｃａｎｎｉｏ Ｒ，Ｒｏｓｓｉ Ｍ，Ｂａｒｔｏｌｕｃｃｉ Ｓ：Ｄｅｃｒｅａｓｉｎｇ ｔｈｅ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｃｈａｎｇｉｎｇ ｔｈｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ａｌｃｏｈｏｌ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｂｙ ｓｉｎｇｌｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔｓ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ １９９８，１１：９２５−９３０）、まず、一晩培養を準備し（１０ｍｌのＬＢ／アンピシリン培地、アンピシリン１００μｇ／ｍｌ、３０℃、１２０ｒｐｍ）、これを引き続き、培養容器に接種するために使用し、この容器をまた、３７℃にて１２時間、１２０ｒｐｍで振盪した。細胞を、遠心分離（８０００ｒｐｍ、２０分、４℃）し、洗浄し、上清を除去してペレットを凍結乾燥した。最後に、細胞を超音波（１秒間のパルス、４秒間の停止、時間：１０分、振幅値：４０％）の使用下で粉砕し、この混合物を、遠心分離（２０分、１８０００ｒｐｍ、４℃）し、そして酵素を粗抽出液として使用した。タンパク質濃度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評定した。
Bacillus stearothermophilus alcohol dehydrogenase (ADH-hT; P4238.1))
Bacillus stearothermophilus of stearothermophilus NA D + dependence (Fiorentino G for the preparation of alcohol dehydrogenase, Cannio R, Rossi M, Bartolucci S: Decreasing the stability and changing the substrate specificity of the Bacillus stearothermophilus alcohol dehydrogenase by single amino acid replacements. Protein Eng 1998, 11: 925-930), first prepare an overnight culture (10 ml of LB / ampicillin medium, ampicillin 100 μg / ml, 30 ° C., 120 rpm) and subsequently inoculate the culture vessel. Used for And, the vessel also 12 hours at 37 ° C., and shaken at 120 rpm. The cells were centrifuged (8000 rpm, 20 min, 4 ° C.), washed, the supernatant removed and the pellet lyophilized. Finally, the cells were pulverized using ultrasound (1 second pulse, 4 second pause, time: 10 minutes, amplitude value: 40%) and the mixture was centrifuged (20 minutes, 18000 rpm, 4 ° C. And the enzyme was used as a crude extract. Protein concentration was assessed by SDS-PAGE.
ＡｌｋＪ−アルコールデヒドロゲナーゼ（シュードモナス・オレオボランス(Pseudomonas oleovirans)ＧＰＯ１由来）
この酵素を、プラスミドｐＴＺＥ０３＿ＡｌｋＪ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ２０）及び抗生物質としてカナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を使用したことは除き、バシラス・ステアロサーモフィラスのアルコールデヒドロゲナーゼと同じ条件下で調製した。タンパク質濃度を、同様にＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評定した。
AlkJ-alcohol dehydrogenase (derived from Pseudomonas oleovirans GPO1)
This enzyme was prepared under the same conditions as the alcohol dehydrogenase of Bacillus stearothermophilus except that plasmid pTZE03_AlkJ (SEQ ID NO 20) and kanamycin (50 μg / ml) were used as antibiotics. Protein concentration was similarly assessed by SDS-PAGE.
クロモバクテリウム・ビオラセウム由来のトランスアミナーゼＣＶ−ωＴＡ
クロモバクテリウム・ビオラセウム由来のトランスアミナーゼＣＶ−ωＴＡの調製のために（Ｕ．Ｋａｕｌｍａｎｎ，Ｋ．Ｓｍｉｔｈｉｅｓ，Ｍ．Ｅ．Ｂ．Ｓｍｉｔｈ，Ｈ．Ｃ．Ｈａｉｌｅｓ，Ｊ．Ｍ．Ｗａｒｄ，Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．２００７，４１，６２８−６３７；ｂ）Ｍ．Ｓ．Ｈｕｍｂｌｅ，Ｋ．Ｅ．Ｃａｓｓｉｍｊｅｅ，Ｍ．Ｈａｋａｎｓｓｏｎ，Ｙ．Ｒ．Ｋｉｍｂｕｒｇ，Ｂ．Ｗａｌｓｅ，Ｖ．Ａｂｅｄｉ，Ｈ．−Ｊ．Ｆｅｄｅｒｓｅｌ，Ｐ．Ｂｅｒｇｌｕｎｄ，Ｄ．Ｔ．Ｌｏｇａｎ，ＦＥＢＳ Ｊｏｕｒｎａｌ ２０１２，２７９，７７９−７９２；ｃ）Ｄ．Ｋｏｓｚｅｌｅｗｓｋｉ，Ｍ．Ｇｏｅｒｉｔｚｅｒ，Ｄ．Ｃｌａｙ，Ｂ．Ｓｅｉｓｓｅｒ，Ｗ．Ｋｒｏｕｔｉｌ，ＣｈｅｍＣａｔＣｈｅｍ ２０１０，２，２７３−７７）、まず、一晩培養を準備し（ＬＢ／アンピシリン培地、３０℃、１２０ｒｐｍ）、これを引き続き、同じ培地を有する培養容器に接種するために使用し、この容器をまた、６００ｎｍで０．７の光学密度が達成されるまで、３７℃にて約３時間、１２０ｒｐｍで振盪した。引き続き、ＩＰＴＧの原液（０．５ｍＭ）を加え、かつ２０℃にて３時間、１２０ｒｐｍで培養した。細胞を遠心分離し、上清を除去して細胞を４℃で貯蔵した。最後に、細胞を超音波（１秒間のパルス、４秒間の停止、時間：１０分、振幅値：４０％）の使用下で粉砕し、この混合物を、遠心分離（２０分、１８０００ｒｐｍ、４℃）し、そして上清を粗抽出液として使用した。
Transaminase CV-ωTA derived from Chromobacterium violaceum
For the preparation of transaminase CV-ωTA from Chromobacterium violaceum (U. Kaulmann, K. Smithies, M. E. B. Smith, H. C. Hailes, J. M. Ward, Enzyme Microb. Technol. 2007, 41, 628-637; S. Humble, K.M. E. Cassimjee, M.C. Hankanson, Y. et al. R. Kimburg, B.M. Walse, V.M. Abedi, H .; -J. Federsel, P.M. Berglund, D.M. T.A. Logan, FEBS Journal 2012, 279, 779-792; Koszelewski, M .; Goeritzer, D.A. Clay, B.M. Seisser, W.M. Kroutil, ChemCatChem 2010, 2, 273-77), first prepared an overnight culture (LB / ampicillin medium, 30 ° C., 120 rpm), which was subsequently used to inoculate culture vessels with the same medium, The container was also shaken at 120 rpm for about 3 hours at 37 ° C. until an optical density of 0.7 at 600 nm was achieved. Subsequently, an IPTG stock solution (0.5 mM) was added, and the cells were cultured at 20 ° C. for 3 hours at 120 rpm. The cells were centrifuged, the supernatant removed and the cells stored at 4 ° C. Finally, the cells were pulverized using ultrasound (1 second pulse, 4 second pause, time: 10 minutes, amplitude value: 40%) and the mixture was centrifuged (20 minutes, 18000 rpm, 4 ° C. And the supernatant was used as a crude extract.
試験の実施：
実験的アプローチを、表１に記載している。
Test implementation:
The experimental approach is described in Table 1.
基質を、相応量の補助溶媒（表２を参照されたい）に溶かし、かつ３００μｌの水に溶かしたＬ−アラニンを加えた。７５μｌの水に溶かした塩化アンモニウムを加えた。それぞれ２５μｌの水に溶かしたＮＡＤ+とＰＬＰを加えた。ｐＨ値を、６ＭのＮａＯＨ溶液７．５μｌの添加によって調節した。トランスアミナーゼとアラニンデヒドロゲナーゼを加えた。反応を、アルコールデヒドロゲナーゼの添加によって開始した。２２時間後、反応を、下記に示す誘導体化試薬の添加によって停止した。 The substrate was dissolved in a suitable amount of co-solvent (see Table 2) and L-alanine dissolved in 300 μl of water was added. Ammonium chloride dissolved in 75 μl of water was added. NAD + and PLP dissolved in 25 μl of water were added respectively. The pH value was adjusted by adding 7.5 μl of 6M NaOH solution. Transaminase and alanine dehydrogenase were added. The reaction was initiated by the addition of alcohol dehydrogenase. After 22 hours, the reaction was stopped by the addition of the derivatization reagent shown below.
アミンの誘導体化：
アセトニトリル（５００μｌ）に溶かした２００μｌのトリエチルアミン並びにＥＳＯＦ（エチルスクシンイミドオキシホルメート）（８０ｍｇ又は４０ｍｇ）を、５００μｌのサンプルに加えた。このサンプルを、引き続き４５℃にて１時間振盪し、引き続きジクロロメタンで抽出し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、かつＧＣ−ＭＳを使用して測定した。アラニンデヒドロゲナーゼを用いずに発酵する場合は、水溶液に、Ｌ−アラニン（５００ｍＭ）、ＮＡＤ+（２ｍＭ）及びＰＬＰ（０．５ｍＭ）を８．５のｐＨ値（ＮａＯＨの添加によって調節）で、かつＤＭＥ（１２０μｌ、２５ｍＭ）に溶かした基質を加えた。反応を、それぞれ２００μｌのアルコールデヒドロゲナーゼ（（ＮＡＤ+依存性）又はＡｌｋＪ）及びトランスアミナーゼの添加によって開始した。サンプルを、２５℃、３００ｒｐｍで２４時間振盪した。サンプルを、上記の通り後処理し、かつＧＣ−ＭＳで分析した。
Amine derivatization:
200 μl of triethylamine and ESOF (ethylsuccinimide oxyformate) (80 mg or 40 mg) dissolved in acetonitrile (500 μl) were added to 500 μl of sample. The sample was subsequently shaken for 1 hour at 45 ° C., subsequently extracted with dichloromethane, dried over sodium sulfate and measured using GC-MS. When fermenting without alanine dehydrogenase, the aqueous solution contains L-alanine (500 mM), NAD + (2 mM) and PLP (0.5 mM) at a pH value of 8.5 (adjusted by addition of NaOH), and Substrate dissolved in DME (120 μl, 25 mM) was added. The reaction was initiated by the addition of 200 μl of alcohol dehydrogenase ((NAD + dependent) or AlkJ) and transaminase, respectively. The sample was shaken for 24 hours at 25 ° C. and 300 rpm. Samples were worked up as described above and analyzed by GC-MS.
結果：result:
まとめ：
構造的に異なる一連の基質、すなわち、ヘキサン−１，６−ジオール（１）、６−アミノヘキサン−１−オール（２）及びエチル−６−ヒドロキシヘキサノエート（３）について、それぞれ、バシラス・ステアロサーモフィラスのＮＡＤ + 依存性アルコールデヒドロゲナーゼの使用下での反応が、アルコールデヒドロゲナーゼの使用下での反応より明らかに効率良く進行することが示された。この意想外の技術的な効果は、アラニンデヒドロゲナーゼの存在下と不存在下とで同様に示されることができた。
Summary:
For a series of structurally different substrates, namely hexane-1,6-diol (1), 6-aminohexane-1-ol (2) and ethyl-6-hydroxyhexanoate (3), respectively, It was shown that the reaction of stearothermophilus using NA D + -dependent alcohol dehydrogenase proceeds clearly more efficiently than the reaction using alcohol dehydrogenase. This unexpected technical effect could be shown as well in the presence and absence of alanine dehydrogenase.
例２：種々のアルコール基質のアミノ化
本発明による酵素系が構造的に多様な基質を変換することを確認するために、更に別のアルカノール及びアルカンジオールを、適した酵素の使用下にインヴィトロで相応のアミン若しくはジアミンへと変換した。ウマ肝臓由来のアルコールデヒドロゲナーゼ（ＨＬ−ＡＤＨ、Ｅ−イソ酵素(E-isoenzyme)；ＮＰ＿００１０７５９９７．１）及びバシラス・ステアロサーモフィラス由来のアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ−ｈＴ；Ｐ４２３２８．１）が同様に適していることが判明した。２つの異なるアミナーゼ、すなわち、クロモバクテリウム・ビオラセウム[16]（ＣＶ−ωＴＡ）由来のアミナーゼ及びアルスロバクタ−・シトレウス(Arthrobacter citreus)（ＡｒＳ−ωＴＡ）由来の（Ｓ）−選択的ω−ＴＡの変異体（Ａ．Ｒ．Ｍａｒｔｉｎ，Ｒ．ＤｉＳａｎｔｏ，Ｉ．Ｐｌｏｔｎｉｋｏｖ，Ｓ．Ｋａｍａｔ，Ｄ．Ｓｈｏｎｎａｒｄ，Ｓ．Ｐａｎｎｕｒｉ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．Ｊ．２００７，３７，２４６−２５５）を使用した。アラニンデヒドロゲナーゼは、バシラス・サチリス由来であった（Ｆ．Ｇ．Ｍｕｔｔｉ，Ｃ．Ｓ．Ｆｕｃｈｓ，Ｄ．Ｐｒｅｓｓｎｉｔｚ，Ｊ．Ｈ．Ｓａｔｔｌｅｒ，Ｗ．Ｋｒｏｕｔｉｌ，Ａｄｖ．Ｓｙｎｔｈ．Ｃａｔａｌ．２０１１，２５３，３２２７−３２３３）。
Example 2: Amination of various alcohol substrates In order to confirm that the enzyme system according to the invention converts structurally diverse substrates, further alkanols and alkanediols can be obtained in vitro using suitable enzymes. Conversion to the corresponding amine or diamine. Similarly suitable are alcohol dehydrogenases from horse liver (HL-ADH, E-isoenzyme; NP_001075997.1) and alcohol dehydrogenases from A. basilas stearothermophilus (ADH-hT; P423281) Turned out to be. Mutation of two different aminases, an aminase from Chromobacterium violaceum [16] (CV-ωTA) and a (S) -selective ω-TA from Arthrobacter citreus (ArS-ωTA) The body (AR Martin, R. DiSanto, I. Plotnikov, S. Kamat, D. Honnard, S. Pannuri, Biochem. Eng. J. 2007, 37, 246-255) was used. Alanine dehydrogenase was derived from Bacillus subtilis (FG Mutti, CS Fuchs, D. Pressnitz, JH Sattler, W. Kroutil, Adv. Synth. Catal. 2011, 253, 3227-. 3233).
この産物を、エチル（スクシンイミドオキシ）ホルメート（Ｉ．Ｅｄａｆｉｏｇｈｏ，Ｋ．Ｒ．Ｓｃｏｔｔ，Ｊ．Ａ．Ｍｏｏｒｅ，Ｖ．Ａ．Ｆａｍａｒ，Ｊ．Ｍ．Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９１，３４，３８７−３９２）で誘導体化し、かつＧＣ−ＭＳによってＡｇｉｌｅｎｔ Ｊ＆Ｗ ＨＰ−５カラム（３０ｍ、３２０μｍ、０．２５μｍ）の使用下で検出した。 This product was purified from ethyl (succinimidooxy) formate (I. Edafiogho, KR Scott, JA Moore, VA Famar, JM Nicholson, J. Med. Chem. 1991, 34, 387). -392) and detected by GC-MS using an Agilent J & W HP-5 column (30 m, 320 μm, 0.25 μm).
文献参照
ＰＣＴ／ＥＰ／２００８／０６７４４７（２００９）:ω−アミノカルボン酸、ω−アミノカルボン酸エステル、又はそれらのラクタムを産生する組換え細胞
Ｃ． Ｇｒａｎｔ，Ｊ．Ｍ．Ｗｏｏｄｌｅｙ ａｎｄ Ｆ．Ｂａｇａｎｚ（２０１１），Ｅｎｚｙｍｅ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ４８， ４８０−４８６
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Claims (16)
ａ）式
ＨＯ−（ＣＨ2）x−Ｒ1
［式中、Ｒ1は、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ2及び−ＣＯＯＲ2を包含する群から選択されており、ｘは、少なくとも３であり、かつＲ2は、Ｈ、アルキル及びアリールを包含する群から選択されている］の第一級アルコールを準備する工程
ｂ）第一級アルコールを、ＮＡＤ（Ｐ）+依存性アルコールデヒドロゲナーゼと接触させることによる酸化工程、及び
ｃ）工程ａ）からの酸化産物をトランスアミナーゼと接触させる工程
を包含する方法であって、ここで、ＮＡＤ（Ｐ）+依存性アルコールデヒドロゲナーゼ及び／又はトランスアミナーゼは組換え型酵素又は単離酵素である方法。 The following steps a) Formula HO— (CH 2 ) x —R 1
Wherein R 1 is selected from the group comprising —OH, —SH, —NH 2 and —COOR 2 , x is at least 3 and R 2 represents H, alkyl and aryl. B) an oxidation step by contacting the primary alcohol with a NAD (P) + dependent alcohol dehydrogenase; and c) from step a). Wherein the NAD (P) + -dependent alcohol dehydrogenase and / or transaminase is a recombinant enzyme or an isolated enzyme.
［式中、Ｒ3及びＲ4は、それぞれ互いに無関係に、メチル、エチル、プロピル及びブチルを包含する群から選択されており、かつｘは１〜４である］の化合物である、請求項１０記載の方法。 The co-solvent is of the formula R 3 —O— (CH 2 ) x —O—R 4
11. wherein R 3 and R 4 are each independently selected from the group comprising methyl, ethyl, propyl and butyl, and x is 1-4. The method described.
［式中、Ｒ1は、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ2及び−ＣＯＯＲ2を包含する群から選択されており、ｘは、少なくとも３であり、かつＲ2は、Ｈ、アルキル及びアリールを包含する群から選択されている］の第一級アルコールの酸化及びアミノ化のための、請求項１３記載の全細胞触媒の使用。 Formula HO— (CH 2 ) x —R 1
Wherein R 1 is selected from the group comprising —OH, —SH, —NH 2 and —COOR 2 , x is at least 3 and R 2 represents H, alkyl and aryl. 14. Use of the whole cell catalyst according to claim 13 for the oxidation and amination of primary alcohols selected from the group comprising:
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