JP2004000114A

JP2004000114A - Method for producing cadaverine

Info

Publication number: JP2004000114A
Application number: JP2002257374A
Authority: JP
Inventors: Takashi Mimizuka; 耳塚　孝; Hideki Sawai; 澤井　秀樹; Masanari Yamada; 山田　勝成; Kimiya Kato; 加藤　公哉
Original assignee: Toray Industries Inc
Current assignee: Toray Industries Inc
Priority date: 2002-04-08
Filing date: 2002-09-03
Publication date: 2004-01-08
Anticipated expiration: 2022-09-03
Also published as: JP4196620B2

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To obtain high-purity cadaverine in a high reaction yield, in a high purification yield in a high concentration and at a high reaction speed. <P>SOLUTION: The problem of the invention is solved by bringing a cell crushed liquid of Escherichia coli to which L-lysine decarboxylase gene having an N-terminal amino acid sequence provided with 6 histidines is transferred or Escherichia coli having the L-lysine decarboxylase gene localized on the surface of the cell into contact with high-concentrated L-lysine monohydrochloride. Further, the problem is solved by forming cadaverine in the high concentration in the high reaction yield and in the high production speed, adjusting the reaction solution to pH ≥13, extracting the reaction product with a polar organic solvent, collecting cadaverine by distillation and producing cadaverine from L-lysine monohydrochloride without controlling pH by treating L-lysine monohydrochloride with L-lysine decarboxylase. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、カダベリンの製造法に関するものである。カダベリンは医薬中間体などの合成原料やポリマー原料として期待され、需要が高まりつつある。
【０００２】
【従来の技術】
従来、Ｌ−リジンを微量のテトラリン過酸化物を含むシクロヘキサノール中で煮沸することによりカダベリンが得られることが知られている（非特許文献１参照。）。しかしながら高温反応であるために大量のエネルギーおよび有機溶媒が必要であるうえに、反応収率が非常に低い（３６％）。
【０００３】
また、２−シクロヘキセン−１−オンなどのビニルケトン類を触媒としてリジンから合成する方法（非特許文献２、特許文献１参照。）等が知られている。
【０００４】
また、この方法によって得られるカダベリンには不純物として、トリ−ｎ−ブチルアミンや２，３，４，５−テトラヒドロピリジンといった塩基性化合物が含有されている。
【０００５】
また一般的に、酵素反応進行時にｐＨが変化する際には、ｐＨを制御するために酸もしくはアルカリが適宜加えられ生成物の濃度が低下し、精製工程において濃縮操作が必要となり効率が悪くなるといった問題点がある。さらには、加えられた酸、アルカリにより酵素が変性失活してしまう。
また、カダベリンは生体内に普遍的に存在する生体アミンであり、その生合成系が解明されつつある（非特許文献３参照。）。また、エシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）由来のＬ−リジン脱炭酸酵素遺伝子が知られている（非特許文献４参照。）。
【０００６】
一方、細胞表面にタンパク質を局在化させる研究は、多くの細菌において行われている。大腸菌について細胞表面にタンパク質を局在化させる研究が活発に行われている（非特許文献５参照）。
【０００７】
しかしながら、カダベリンの製造について実際的な製造技術は確立されておらず、効率よく、より温和な条件下で高濃度かつ高純度のカダベリンを製造する方法の開発が望まれている。
【０００８】
【特許文献１】
特公平４−１０４５２号公報
【非特許文献１】
須山正，金尾清造；アミノ酸の脱炭酸（第４報）薬学雑誌，ｖｏｌ．８５（６），Ｐ．５３１−５３３（１９６５））
【非特許文献２】
Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｌｅｔｔｅｒｓ，８９３（１９８６）
【非特許文献３】
Ｃｅｌｉａ　ｗｈｉｔｅ　ｔａｂｏｒ　ａｎｄ　Ｈｅｒｂｅｒｔ　ｔａｂｏｒ；Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｅｖｉｅｗｓ，ｖｏｌ．４９，Ｐ．８１−９９（１９８５）
【非特許文献４】
Ｓｈｉ−ｙｕａｎｍｅｎｇ　ａｎｄ　Ｇｅｏｒｇｅ　Ｎ．　Ｂｅｎｎｅｔｔ；Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１７４，Ｐ．２６５９−２６６９（１９９２）
【非特許文献５】
Ｇｅｏｒｇｅ　Ｇｅｏｒｇｉｏｕ，Ｈｅａｔｈｅｒ　Ｌ．Ｐｏｅｔｓｃｈｋｅ，Ｃｈｒｉｓｓｔｏｓ　Ｓｔａｔｈｏｐｏｕｌｏｓ　ａｎｄ　Ｊｏｓｅｐｈ　Ａ．　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ；ＴＩＢＴＥＣＨ，ｖｏｌ．１１，Ｐ．６−１０（１９９３）
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
トリ−ｎ−ブチルアミンおよび２，３，４，５−テトラヒドロピリジンが多く含有されているカダベリンをポリマーの原料とする場合、たとえば、カダベリンを含む原料からポリアミドを加熱重縮合で合成する際には、反応温度が高温であるため、カダベリンに含まれるトリ−ｎ−ブチルアミンや２，３，４，５−テトラヒドロピリジンなどの塩基性化合物がポリアミドの分解反応を起こし得られたポリアミドに耐熱性が不足するといった問題点がある。
【００１０】
さらに、トリ−ｎ−ブチルアミンは、水性生物に有毒で、魚類に対する致死量は２０−４０ｍｇ／Ｌであるといった問題点もある。
【００１１】
本発明の課題は、このような不純物の少ないカダベリンの高反応収率、高精製収率、高生産速度、高濃度および高純度での工業的製造方法およびカダベリンの単離方法を提供することである。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
上記問題点を解決するために、本発明者らは、効率がよく、より温和な条件下で高濃度かつ高純度のカダベリンの製造方法について鋭意研究を行った結果、Ｌ−リジン塩水溶液にＬ−リジン脱炭酸酵素を作用させることによりカダベリンを高反応収率かつ高濃度で得られることを見出した。
【００１３】
すなわち、本発明は、「（１）Ｌ−リジン塩水溶液に、Ｌ−リジン脱炭酸酵素を作用させ、反応液からカダベリンを単離することを特徴とするカダベリンの製造方法。
（２）２，３，４，５−テトラヒドロピリジンの含有量が１．４ｗｔ％以下のカダベリン。
（３）トリ−ｎ−ブチルアミンの含有量が０．００６ｗｔ％以下のカダベリン。
（４）上記（１）の方法で得られたカダベリンまたは上記（２）あるいは（３）記載のカダベリンを原料として含有するポリアミド。」である。
【００１４】
【発明の実施の形態】
カダベリンとは１，５−ペンタンジアミンのことであり、ポリマー原料、医薬中間体の合成原料などとして有用な化合物である。
【００１５】
Ｌ−リジン脱炭酸酵素は、Ｌ−リジンをカダベリンに転換させる酵素であり、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｋ１２株をはじめとするエシェリシア属微生物のみならず、多くの生物に存在することが知られている。
【００１６】
本発明において使用されるＬ−リジン脱炭酸酵素に特に制限はないが、例えば、バシラス・ハロドゥランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）、バシラス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、エシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）、セレノモナス・ルミナンチウム（Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ　ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ）、ビブリオ・コレラ（Ｖｉｂｒｉｏ　ｃｈｏｌｅｒａｅ）、ビブリオ・パラヘモリティカス（Ｖｉｂｒｉｏ　ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、ストレプトマイセス・コエリカーラ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ストレプトマイセス・ピロサス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐｉｌｏｓｕｓ）、エイケネラ・コロデンス（Ｅｉｋｅｎｅｌｌａ　ｃｏｒｒｏｄｅｎｓ）、イユバクテリウム・アシダミノフィルム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｃｉｄａｍｉｎｏｐｈｉｌｕｍ）、サルモネラ・ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、ハフニア・アルベイ（Ｈａｆｎｉａ　ａｌｖｅｉ）、ナイセリア・メニンギチデス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、テルモプラズマ・アシドフィルム（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ　ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）、ピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｂｙｓｓｉ）またはコリネバクテリウム・グルタミカス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）由来のものが好ましく用いられる。さらに好ましくは安全性の認められているエシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）由来のものである。
【００１７】
本発明における生成物は、アルカリ性の化合物であるカダベリンであるために、反応が進行するにつれ、反応液のｐＨはアルカリ側に変化していく。しかし、Ｌ−リジン塩水溶液に、Ｌ−リジン脱炭酸酵素を作用させれば、反応液のｐＨを制御する必要がなく効率よくカダベリンを生産できる。用いるＬ−リジン塩については特に制限はない。好ましくは塩酸塩、硫酸塩、酢酸塩、硝酸塩、炭酸塩である。さらに好ましくはＬ−リジン一塩酸塩である。
【００１８】
Ｌ−リジン脱炭酸酵素は本来ビタミンＢ６と結合し存在するが、Ｌ−リジン塩水溶液にビタミンＢ６を添加することにより、生産速度および反応収率を向上させることができる。ビタミンＢ６を添加する方法には特に制限はない。反応中に適宜添加しても良い。好ましくはＬ−リジン脱炭酸酵素が溶液状態であれば、酵素溶液中に添加することが好ましい。反応液中でのビタミンＢ６の濃度については特に制限はなく。好ましくは反応液に０．０５ｍＭのビタミンＢ６濃度となるように加えればよい。用いるビタミンＢ６に特に制限はない。好ましくは、ピリドキシン、ピリドキサミン、ピリドキサルおよびピリドキサルリン酸から選ばれる少なくとも１種である。さらに好ましくはピリドキサルリン酸である。
【００１９】
また、Ｌ−リジン脱炭酸酵素を作用させた後、Ｌ−リジン塩が仕込み濃度の２０％以下にまでになった反応液からカダベリンを単離することにより、高精製収率でカダベリンが単離できる。２０％以下にまでになったことを確認する手段には特に制限はない。好ましくはＨＰＬＣ法によって確認することができる。さらに好ましくはｐＨの変化を経時的に測定し、Ｌ−リジン塩の濃度と関連づけて反応の終点を確認する方法が採用できる。
【００２０】
本発明において使用されるＬ−リジン脱炭酸酵素を得る方法に特に制限はないが、例えば、Ｌ−リジン脱炭酸酵素が細胞内で高発現した組換え細胞（細胞内発現組み換え細胞）などを適当な培地で培養し、増殖した細胞を回収し、当該細胞を破砕すればよい。
【００２１】
また、別の方法として、Ｌ−リジン脱炭酸酵素が細胞表面で局在化した組み換え細胞（細胞表面発現組み換え細胞）などを適当な培地で培養し、増殖した細胞を回収すればよい。
【００２２】
Ｌ−リジン脱炭酸酵素が細胞表面で局在化した組み換え細胞とは、少なくともＬ−リジン脱炭酸酵素が細胞表面に局在化している状態であり、細胞内に同時にＬ−リジン脱炭酸酵素が存在していても良い。
【００２３】
一方、細胞表面にＬ−リジン脱炭酸酵素を局在化させる具体的な方法としては、例えば、分泌シグナル配列の一部、細胞表面局在タンパク質の一部をコードする遺伝子配列、Ｌ−リジン脱炭酸酵素の構造遺伝子配列をこの順で有するＤＮＡを大腸菌菌に導入すればよい。
【００２４】
分泌シグナル配列の一部に制限はない。宿主においてタンパク質を分泌するために必要な配列であればよい。大腸菌においては、例えばリポプロテインの配列の一部であり、具体的には、アミノ酸配列としてＭＫＡＴＫＬＶＬＧＡＶＩＬＧＳＴＬＬＡＧＣＳＳＮＡＫＩＤＱ（アミノ酸の一文字表記）と翻訳される遺伝子配列であることが好ましい。
細胞表面局在タンパク質の一部をコードする遺伝子配列に特に制限はない。大腸菌においては、例えば外膜結合タンパク質の配列の一部であり、具体的にはＯｍｐＡ（外膜結合タンパク質）の４６番目のアミノ酸から１５９番目のアミノ酸までの配列の一部であることが好ましい。
【００２５】
Ｌ−リジン脱炭酸酵素遺伝子、リポプロテイン遺伝子およびＯｍｐＡ遺伝子をクローニングする方法に特に制限はない。既知の遺伝子情報に基づき、ＰＣＲ　（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ）法を用いて必要な遺伝領域を増幅取得する方法、既知の遺伝子情報に基づきゲノムライブラリーやｃＤＮＡライブラリーより相同性や酵素活性を指標としてクローニングする方法などが挙げられる。本発明においては、これらの遺伝子は、遺伝的多形性などによる変異型も含む。なお、遺伝的多形性とは、遺伝子上の自然突然変異により遺伝子の塩基配列が一部変化しているものをいう。例えばＥ．ｃｏｌｉ　Ｋ１２株の染色体ＤＮＡよりＰＣＲ法を用いてＬ−リジン脱炭酸酵素をコードする遺伝子であるｃａｄＡ遺伝子またはｌｄｃ遺伝子をクローニングする。この際使用する染色体ＤＮＡはＥ．ｃｏｌｉ由来であればどの菌株由来でもよい。
【００２６】
Ｌ−リジン脱炭酸酵素が細胞表面に局在化していることの確認は、例えばＬ−リジン脱炭酸酵素を抗原として作製した抗体により、細胞表面発現組み換え細胞を免疫反応後、包埋、薄切りし、電子顕微鏡（免疫電顕法）により観察することで確認できる。
【００２７】
本発明では、Ｌ−リジン脱炭酸酵素は、Ｌ−リジン脱炭酸酵素の細胞内もしくは細胞表面での活性が上昇した組換え細胞から調製されたものが好ましく使用できる。細胞内もしくは細胞表面でＬ−リジン脱炭酸酵素の活性を上昇させる方法に特に制限はない。具体的には、例えば、Ｌ−リジン脱炭酸酵素の酵素量を増加させる方法、もしくは酵素の構造遺伝子自体に変異を導入して、酵素そのものの比活性を上昇させることなどが挙げられる。
【００２８】
細胞内もしくは細胞表面の酵素量を増加させる手段としては、遺伝子の転写調節領域の改良、遺伝子のコピー数の増加、蛋白への翻訳の効率化などが挙げられる。
【００２９】
転写調節領域の改良とは、遺伝子の転写量を増加させる改変を加えることをいう。例えば、プロモーターに変異を導入することによってプロモーター強化を行い、下流にある遺伝子の転写量を増加させることができる。プロモーターに変異を導入する以外にも、宿主内で強力に発現するプロモーターを導入しても良い。例えば大腸菌においては、ｌａｃ、ｔａｃ、ｔｒｐなどのプロモーターが挙げられる。また、エンハンサーを新たに導入することによって遺伝子の転写量を増加させることができる。染色体ＤＮＡのプロモーター等の遺伝子導入については、例えば特開平１−２１５２８０号公報に記載されている。
【００３０】
遺伝子のコピー数の上昇は、具体的には、遺伝子を多コピー型のベクターに接続して組換えＤＮＡを作製し、該組換えＤＮＡを宿主細胞に保持させることにより達成することができる。ここでベクターとは、プラスミドやファージ等広く用いられているものを含むが、これら以外にも、トランソポゾン（Ｂｅｒｇ，Ｄ．Ｅ　ａｎｄ　Ｂｅｒｇ．Ｃ．Ｍ．，　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．，ｖｏｌ．１，Ｐ．４１７（１９８３））やＭｕファージ（特開平２−１０９９８５号公報）も含む。遺伝子を相同組換え用プラスミド等を用いた方法で染色体に組み込んでコピー数を上昇させることも可能である。
蛋白の翻訳効率を上昇させる方法としては、例えば原核生物においてはＳＤ配列（Ｓｈｉｎｅ，　Ｊ．　ａｎｄ　Ｄａｌｇａｒｎｏ，　Ｌ．，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　７１，　１３４２−１３４６　（１９７４））、真核生物では　Ｋｏｚａｋのコンセンサス配列（Ｋｏｚａｋ，　Ｍ．，　Ｎｕｃ．　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，　Ｖｏｌ．１５，ｐ．８１２５−８１４８（１９８７））を導入、改変することや、使用コドンの最適化（特開昭５９−１２５８９５）などが挙げられる。
【００３１】
Ｌ−リシン脱炭酸酵素の細胞内もしくは細胞表面での活性を上昇させる手段としては、Ｌ−リジン脱炭酸酵素の構造遺伝子自体に変異を導入して、Ｌ−リジン脱炭酸酵素そのものの活性を上昇させることも挙げられる。
【００３２】
遺伝子に変異を生じさせるには、部位特異的変異法（Ｋｒａｍｅｒ，Ｗ．　ａｎｄ　ｆｒｉｔａ，Ｈ．Ｊ．，　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１５４，Ｐ．３５０（１９８７））リコンビナントＰＣＲ法（ＰＣＲ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ　Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、特定の部分のＤＮＡを化学合成する方法、または当該遺伝子をヒドロキシアミン処理する方法や当該遺伝子を保有する菌株を紫外線照射処理、もしくはニトロソグアニジンや亜硝酸などの化学薬剤で処理する方法がある。
【００３３】
組換え細胞としては、微生物、動物、植物、または昆虫由来のものが好ましく使用できる。例えば動物を用いる場合、マウス、ラットやそれらの培養細胞などが用いられる。植物を用いる場合、例えばシロイヌナズナ、タバコやそれらの培養細胞が用いられる。また、昆虫を用いる場合、例えばカイコやその培養細胞などが用いられる。また、微生物を用いる場合、例えば、大腸菌などが用いられる。
【００３４】
また、Ｌ−リジン脱炭酸酵素を複数種組み合わせて使用しても良い。
【００３５】
Ｌ−リジン脱炭酸酵素を得るために、組換え細胞を培養する方法に特に制限はないが、例えば微生物を培養する場合、使用する培地は、炭素源、窒素源、無機イオンおよび必要に応じその他有機成分を含有する培地が用いられる。例えば、大腸菌の場合しばしばＬＢ培地が用いられる。炭素源としては、グルコース、ラクトース、ガラクトース、フラクトース、アラビノース、マルトース、キシロース、トレハロース、リボースや澱粉の加水分解物などの糖類、グリセロール、マンニトールやソルビトールなどのアルコール類、グルコン酸、フマール酸、クエン酸やコハク酸等の有機酸類を用いることができる。窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水等を用いることができる。有機微量栄養素としては、各種アミノ酸、ビタミンＢ１等のビタミン類、ＲＮＡ等の核酸類などの要求物質または酵母エキス等を適量含有させることが望ましい。それらの他に、必要に応じて、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加される。
【００３６】
培養条件にも特に制限はなく、例えば大腸菌の場合、好気条件下で１６〜７２時間程度実施するのが良く、培養温度は３０℃〜４５℃に、特に好ましくは３７℃に、培養ｐＨは５〜８に、特に好ましくはｐＨ７に制御するのがよい。なおｐＨ調整には無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、さらにアンモニアガス等を使用することができる。
【００３７】
増殖した細胞内発現組み換え細胞は、遠心分離等により培養液から回収することができる。回収した細胞内発現組み換え細胞から細胞破砕液を調整するには、通常の方法が用いられる。すなわち、細胞内発現組み換え細胞を超音波処理、ダイノミル、フレンチプレス等の方法にて破砕し、遠心分離により細胞残渣を除去することにより細胞破砕液が得られる。
【００３８】
細胞破砕液からＬ−リジン脱炭酸酵素を精製するには、硫安分画、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、等電点沈殿、熱処理、ｐＨ処理など酵素の精製に通常用いられる手法が適宜組み合わされて用いられる。
【００３９】
一般的な工業化される酵素反応は休止細胞を用いるが、本発明においては作用させるＬ−リジン脱炭酸酵素は、Ｌ−リジン脱炭酸酵素活性を有する休止細胞、その細胞破砕液などが使用できるが、細胞破砕液が好ましい。細胞破砕液を用いるとより高生産速度でカダベリンが得られる。
【００４０】
さらに、部分的に精製したＬ−リジン脱炭酸酵素を作用させることによりＬ−リジンの分解およびカダベリンの分解を抑制することができ、より高収率かつ高純度のカダベリンが得られる。部分的な精製とは、工業的に容易な処理のみ行うことであり例えば熱処理、ｐＨ処理等が挙げられる。好ましくは熱処理である。さらに好ましくは単離精製したＬ−リジン脱炭酸酵素を作用させることである。Ｌ−リジン脱炭酸酵素を部分的に精製、または単離精製することで、Ｌ−リジンの分解やカダベリンの分解を引き起こす酵素を取り除くことができる。
【００４１】
さらに、Ｌ−リジン脱炭酸酵素が細胞表面に局在化している細胞を作用させれば、Ｌ−リジンの分解およびカダベリンの分解を抑制することができ、より高収率かつ高純度、高生産速度でカダベリンが得れらる。さらにはその細胞を回収することで繰り返し酵素反応に利用することができる。しかも酵素の調整が非常に簡便である。
【００４２】
一般的に酵素というものは本来あるべきアミノ酸配列で自然界に存在するため、人工的にアミノ酸配列を付与もしくは欠如させると酵素の活性を失うことが多い。しかし本発明において細胞内にＬ−リジン脱炭酸酵素を発現させる場合、Ｌ−リジン脱炭酸酵素のＮ末端アミノ酸配列に１から３０個のアミノ酸配列を付与したＬ−リジン脱炭酸酵素が好ましく使用できる。ここで、Ｎ末端に付与するものは６から１０個のヒスチジン残基が好ましい。このように、Ｎ末端アミノ酸配列にアミノ酸を付与することで、Ｌ−リジン脱炭酸酵素の精製を簡便にできるようにすることができる。Ｎ末端アミノ酸配列に１から３０個のアミノ酸を付与する方法に特に制限はない。例えばＬ−リジン脱炭酸酵素遺伝子に付与したいアミノ酸配列に相当する塩基配列を遺伝子工学的手法を用い、組み換えればよい。用いる遺伝子工学的手法に特に制限はないが。好ましくはＰＣＲ法やＤＮＡ断片同士の連結による方法がある。
【００４３】
Ｌ−リジン脱炭酸酵素によるＬ−リジン塩水溶液からカダベリンへの変換は、上記のようにして得られるＬ−リジン脱炭酸酵素を、Ｌ−リジン塩水溶液に接触させることによって行うことができる。
【００４４】
用いるＬ−リジン脱炭酸酵素の量に特に制限はない。、Ｌ−リジン塩水溶液をカダベリンに変換する反応を触媒するのに十分な量であればよい。好ましくは反応液中の酵素濃度が２５から７０ｍｇ／Ｌである。好ましくは５０ｍｇ／Ｌである。一方、休止細胞を使用する際は、反応液中の細胞濃度が５から１５ｇ／Ｌである。好ましくは１０ｇ／Ｌである。
【００４５】
反応温度は、通常、２８〜５５℃、好ましくは４５℃前後である。
【００４６】
反応液の状態に特に制限はない。好ましくは静置または攪拌状態である。攪拌状態にする方法には特に制限はない。好ましくは攪拌翼により攪拌する方法である。
【００４７】
本発明で使用するＬ−リジン脱炭酸酵素は、固定化することで繰り返しカダベリン合成反応に使用することができ、酵素の調製に必要なコストを低減させることができる。固定化方法としては、アクリルアミドなどの合成高分子に包括する方法、セファロースやスチレン樹脂を骨格とするイオン交換性担体や疎水性担体に吸着させる方法、または、ガラス担体に共有結合で結合させる方法などが挙げられる。
【００４８】
反応時間は、使用する酵素活性、Ｌ−リジン塩濃度などの条件によって異なるが、通常、１〜７２時間である。また、反応は、Ｌ−リジン塩を供給しながら連続的に行ってもよい。
【００４９】
このように生成したカダベリンを反応終了後、反応液から採取する方法としては、反応終了液をアルカリでｐＨ１２から１４にし、極性有機溶媒で抽出すれば良い。
【００５０】
用いるアルカリに特に制限はない。好ましくは水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウムを用いることができる。
【００５１】
用いる極性有機溶媒に特に制限はない。好ましくはアニリン、シクロヘキサノン、１−オクタノール、イソブチルアルコール、シクロヘキサノール、クロロホルムを用いることができる。
【００５２】
このようにして得られたカダベリンは、トリ−ｎ−ブチルアミンおよび２，３，４，５−テトラヒドロピリジンなどの不純物が少ない。本発明の方法で製造することで、以下の方法で分析した場合に、トリ−ｎ−ブチルアミンの含有量が、０．００６ｗｔ％以下のカタベリンが得られる。さらに、以下の方法で分析した場合に、２，３，４，５−テトラヒドロピリジンの含有量が１．４ｗｔ％以下のものが得られる。さらに、トリ−ｎ−ブチルアミンの含有量が、０．００６ｗｔ％以下であり、かつ、２，３，４，５−テトラヒドロピリジンの含有量が１．４ｗｔ％以下のものが得られる。
【００５３】
トリ−ｎ−ブチルアミンおよび２，３，４，５−テトラヒドロピリジンの分析は、ＧＣ−ＭＳ法によって以下の条件で行う。
【００５４】
ＧＣ／ＭＳ：ＨＰ６９８０／ＨＰ５９７３Ａ
Ｃｏｌｕｍｎ：ＮＵＫＯＬ　３０ｍ×０．２４ｍｍＩ．Ｄ．　０．２μｍ　Ｆｉｌｍ
Ｏｖｅｎ：１２０℃（一定）
ＩｎＪ：２００℃（Ｓｐｌｉｔ　１０：１）
Ｆｌｏｗ：Ｈｅ　２．４ｍｌ／ｍｉｎ　（ｃｏｎｓｔ．Ｆｌｏｗ）
ＭＳ：２３０℃（ＳＣＡＮ　ｍ／ｚ＝３０〜４００）
このようにして得られたカダベリンは、ポリアミドの原料として有用である。
【００５５】
ポリアミドの製造方法としては、カダベリンとジカルボン酸の塩、および水の混合物を、加熱して脱水反応を進行させる加熱重縮合法が用いられる。また、加熱重縮合後、固相重合することによって、分子量を上昇させることも可能である。固相重合は、１００℃〜融点の温度範囲で、真空中、あるいは不活性ガス中で加熱することにより進行し、加熱重縮合では分子量が不十分なポリアミドを高分子量化することができる。
【００５６】
用いるジカルボン酸に特に制限はなく。例えばアジピン酸が好ましい。
【００５７】
本発明で得られるカダベリンをポリアミドの原料とすることで、耐熱性の高いポリアミドが得られる。
【００５８】
【実施例】
以下に実施例を示し、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例の記載に限定されるものではない。
【００５９】
［Ｌ−リジン濃度およびカダベリン濃度のＨＰＬＣによる分析方法］
使用カラム：ＣＡＰＣＥＬＬ　ＰＡＫ　Ｃ１８（資生堂）
移動相：０．１％（ｗ／ｗ）Ｈ３ＰＯ４：アセトニトリル＝４．５：５．５
検出：ＵＶ　３６０ｎｍ
サンプル前処理：分析サンプル２５μｌに内標として０．０３Ｍ　１，４−ジアミノブタンを２５μｌ、０．０７５Ｍ　炭酸水素ナトリウムを１５０μｌおよび０．２Ｍ　２，４−ジニトロフルオロベンゼンのエタノール溶液を添加混合し３７℃で１時間保温する。上記反応溶液５０μｌを１ｍｌアセトニトリルに溶解後、１０，０００ｒｐｍで５分間遠心した後の１０μｌをＨＰＬＣ分析した。
【００６０】
参考例１（Ｌ−リジン脱炭酸酵素の調整）
（１）Ｌ−リジン脱炭酸酵素遺伝子のクローニングおよび細胞内発現ベクターの作製
Ｌ−リジン脱炭酸酵素を用いてＬ−リジン塩からカダベリンに変換させるために、Ｅ．ｃｏｌｉのＬ−リジン脱炭酸酵素遺伝子（ｃａｄＡ）のクローニングを行った。
【００６１】
データベース（ＧｅｎＢａｎｋ）に登録されているＬ−リジン脱炭酸酵素遺伝子（ｃａｄＡ）（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．Ｍ７６４１１）の塩基配列を参考にオリゴヌクレオチドプライマー５−ａｔｇａａｃｇｔｔａｔｔｇｃａａｔａｔｔｇ　−３’（配列番号：１）、５’−　ｇｃｔｇａｔｇｇｇｔｇａｇａｔａｇａａｔｇ−３’（配列番号：２）を合成した。Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｋ１２株（ＡＴＣＣ１０７９８）から常法に従い調整したゲノムＤＮＡの溶液を増幅鋳型として０．２ｍｌのミクロ遠心チューブに０．２μｌづつ取り、各プライマーを２０ｐｍｏｌ、２０ｍＭ　トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、２．５ｍＭ　ＫＣｌ、１００μｇ／ｍｌゼラチン、５０μＭ各ｄＮＴＰ、２単位　ＬＡＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造製）となるように各試薬を加え、全量を５０μｌとした。ＤＮＡの変性条件を９４℃、３０秒、プライマーのアニーリング条件を５５℃、３０秒、ＤＮＡプライマーの伸長反応条件を７２℃、３分の各条件でＢｉｏＲａｄ社のサーマルサイクラーを用い、３０サイクル反応させた（ポリメラーゼ連鎖反応：以後、ＰＣＲ法と記す）。尚、本実施例におけるＰＣＲ法は特に断らない限り、本条件にて行った。このＰＣＲ法により得られた産物を１％アガロースにて電気泳動し、ｃａｄＡ遺伝子を含む約２．１ｋｂのＤＮＡ断片を常法に従い調整した。この断片を、プラスミドベクターｐＴ７ｂｌｕｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＥｃｏＲＶ部位の３’−末端にＴ塩基が付加された間隙に、常法に従ったライゲーション反応により挿入し、得られたプラスミドをｐＴ７−ｃａｄＡと命名した。
【００６２】
このｐＴ７−ｃａｄＡを増幅鋳型として、オリゴヌクレオチド５’−　ｃｇｃｃａｔｇｇｇｃｃａｔｃａｔｃａｔｃａｔｃａｔｃａｔｃａｔｃａｔａｔｇａａｃｇｔｔａｔｔｇｃａａｔａｔｔｇ　−３’（配列番号：３）、５’−　ｃｇｃｇｇａｔｃｃｇｃｔｇａｔｇｇｇｔｇａｇａｔａｇａａｔｇ　−３’（配列番号：４）をプライマーセットとしたＰＣＲ法を行った。ここで得られる産物は、オリゴヌクレオチド（配列番号：３）由来の塩基配列と、（配列番号：４）由来の塩基配列が、それぞれｃａｄＡ遺伝子を含むＤＮＡ断片の５’末端、および３’末端に付加されている。この産物を１％アガロースにて電気泳動し、約２．１ｋｂのＤＮＡ断片を常法に従い調整した。この断片を、プラスミドベクターｐＴ７ｂｌｕｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＥｃｏＲＶ部位の３’−末端にＴ塩基が付加された間隙に、常法に従ったライゲーション反応により挿入し、得られたプラスミドをｐＴ７−ｃａｄＡ１と命名した。
【００６３】
このｐＴ７−ｃａｄＡ１をＮｃｏＩ、及びＢａｍＨＩで消化し、得られた２．１ｋｂのＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩ断片を、予めＮｃｏＩ、及びＢａｍＨＩで消化しておいたｐＴＶ１１８Ｎ（宝酒造製）のＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩ間隙に常法に従ったライゲーション反応により挿入し、得られたプラスミドをｐＬＤＣ１と命名した（図１）。このプラスミドを導入した大腸菌を培養することで、Ｌ−リジン脱炭酸酵素のＮ末端アミノ酸配列に６個のヒスジチン残基が付加された分子量約８０ｋＤａの組み換えＬ−リジン脱炭酸酵素を生産することができる。
【００６４】
（２）組み換えＬ−リジン脱炭酸酵素の産生
ｐＬＤＣ１でＥ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９株をアンピシリン耐性に形質転換し、得られた形質転換体をＪＭ１０９／ｐＬＤＣ１株と命名した。
【００６５】
次にＪＭ１０９／ｐＬＤＣ１株で組み換えＬ−リジン脱炭酸酵素を産生させた。まず、ＪＭ１０９／ｐＬＤＣ１株をそれぞれ５０μｇ／ｍｌのアンピシリンナトリウムを含んだ滅菌ＬＢ培地（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．　ｅｔ．　ａｌ、２００１、　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　３ｒｄ．　ｅｄｉｔｉｏｎ、　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ．　Ｐｒｅｓｓ）（ＬＢ−ａｍｐ培地）５ｍｌに１白金耳植菌し、３７℃で２４時間振とうして前培養を行った。
【００６６】
この前培養液をＬＢ−ａｍｐ培地５０ｍｌに全量植菌し、３７℃、振幅３０ｃｍで、１８０ｒｐｍの条件下で３時間培養した後に１ｍＭ　ＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−１−ｔｈｉｏ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）添加し、更に４時間培養した。対照実験として、ＪＭ１０９株をｐＴＶ１１８Ｎで形質転換した形質転換体（以後、ＪＭ１０９／ｐＴＶ１１８Ｎ株とする）を用い同様の培養を行った。こうして得られた菌体を集め、５ｍｌのＴＢＳ緩衝液（宝酒造製）に再懸濁後、超音波破砕および遠心分離により細胞破砕液を調製した。これらのＬ−リジン脱炭酸酵素活性の測定を単位時間当たりに生成するカダベリンの濃度を測定することにより行った。その結果、対照実験であるＪＭ１０９／ｐＴＶ１１８Ｎ株由来の細胞破砕液に対して、ＪＭ１０９／ｐＬＤＣ１株においてはＬ−リジン脱炭酸酵素活性は約１００倍に上昇していた。また、この細胞破砕液をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分画し、Ｐｅｎｔａ−Ｈｉｓ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ抗体（ＱＩＡＧＥＮ社製）でウエスタンブロッティングを行った結果、ＪＭ１０９／ｐＬＤＣ１株由来の細胞破砕液のみから、分子量約８０ｋＤａの組み換えＬ−リジン脱炭酸酵素を検出した。
【００６７】
（３）組み換えＬ−リジン脱炭酸酵素の精製
この組み換えＬ−リジン脱炭酸酵素は、Ｎ末端アミノ酸配列に６個のヒスチジン残基があることこから、ニッケルイオンとの相互作用を利用した精製を行った。まず、１０ｍｌのキレーティング　セファロース　ファースト　フロー（Ｃｈｉｌａｔｉｎｇ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ）担体（アマシャム　バイオサイエンス社製）を充填したカラムシステムを構築した。このカラムに５０ｍｌの５０ｍＭ　硫酸ニッケル水溶液、５０ｍｌのＴＢＳ緩衝液の順で流した後、（２）と同様の方法で得られたＪＭ１０９／ｐＬＤＣ１株の５００ｍＬ培養液由来の５０ｍｌ細胞破砕液を流した。その後、１００ｍｌの５ｍＭ　イミダゾールを含むＴＢＳ緩衝液、１００ｍｌの５０ｍＭ　イミダゾールを含むＴＢＳ緩衝液をこの順序で流した。更に５０ｍｌの６００ｍＭ　イミダゾールを含むＴＢＳ緩衝液を流した。カラムに流した各々の緩衝液のＬ−リジン脱炭酸酵素活性を（２）と同様の方法で測定したところ、６００ｍＭ　イミダゾールを含むＴＢＳ緩衝液のみに活性があった。また、カラムに流した各々の緩衝液をＳＤＳ−ＰＡＧＥし、クマシーブリリアントブルーで染色たところ、６００ｍＭ　イミダゾールを含むＴＢＳ緩衝液から、約８０ｋＤａの単一バンドを検出した。また、カラムに流した各々の緩衝液を（２）と同様の方法でウエスタンブロッティングを行ったところ、６００ｍＭ　イミダゾールを含むＴＢＳ緩衝液のみに約８０ｋＤａタンパク質を検出し、この精製タンパク質はＬ−リジン脱炭酸酵素活性を有する組み換えＬ−リジン脱炭酸酵素であることを確認した。
【００６８】
（４）Ｌ−リジン脱炭酸酵素の細胞表面発現ベクターの作製
まず、リポプロテインの配列の一部および外膜結合タンパク質（ＯｍｐＡ）の４６番目のアミノ酸から１５９番目のアミノ酸までの配列を一つのカセットとしてクローニングした。
【００６９】
データベース（ＧｅｎＢａｎｋ）に登録されている外膜結合タンパク質（ｏｍｐＡ）（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＮＣ＿０００９１３）の塩基配列を参考にオリゴヌクレオチドプライマー５−ａｔａａａｇｃｔｔａｔｇａａａｇｃｔａｃｔａａａｃｔｇｇ−３’（配列番号：５）、５’−ａｔａｇｔｃｇａｃｇｔｔｇｔｃｃｇｇａｃｇａｇｔｇｃｃｇ−３’（配列番号：６）、５’−ａｔａａａｇｃｔｔａｔｇａａａｇｃｔａｃｔａａａｃｔｇｇｔａｃｔｇｇｇｃｇｃｇｇｔａａｔｃｃｔｇｇｇｔｔｃｔａｃｔｃｔｇｃｔｇｇｃａｇｇｔｔｇｃｔｃｃａｇｃａａｃｇｃｔａａａａｔｃｇａｔｃａｇａａｃｃｃｇｔａ−３’（配列番号：７）を合成した。Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｋ１２株（ＡＴＣＣ１０７９８）から常法に従い調整したゲノムＤＮＡの溶液を増幅鋳型として（配列番号：５）（配列番号：６）（配列番号：７）をプライマーセットとしたＰＣＲ法を行った。このＰＣＲ法により得られた産物を２％アガロースにて電気泳動し、ｏｍｐＡ遺伝子を含む約０．４ｋｂのＤＮＡ断片を常法に従い調整した。この断片を、プラスミドベクターｐＴ７ｂｌｕｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＥｃｏＲＶ部位の３’−末端にＴ塩基が付加された間隙に、常法に従ったライゲーション反応により挿入し、得られたプラスミドをｐＴＭ７と命名した。
【００７０】
このｐＴＭ７をＨｉｎｄ　ＩＩＩ、及びＳａｌ　Ｉで消化し、得られた約０．４ｋｂのＨｉｎｄ　ＩＩＩ　Ｓａｌ　Ｉ断片を、予めＨｉｎｄ　ＩＩＩ、及びＳａｌ　Ｉで消化しておいたｐＵＣ１９（宝酒造製）のＨｉｎｄ　ＩＩＩ／Ｓａｌ　Ｉ間隙に常法に従ったライゲーション反応により挿入し、得られたプラスミドをｐＴＭ１４と命名した。
【００７１】
次に、Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｋ１２株（ＡＴＣＣ１０７９８）のＬ−リジン脱炭酸酵素遺伝子（ｃａｄＡ）のクローニングを行った。
【００７２】
データベース（ＧｅｎＢａｎｋ）に登録されているＬ−リジン脱炭酸酵素遺伝子（ｃａｄＡ）（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．Ｍ７６４１１）の塩基配列を参考にオリゴヌクレオチドプライマー５−ｔａｔｇｔｃｇａｃａｔｇａａｃｇｔｔａｔｔｇｃａａｔａｔ　−３’（配列番号：８）、５’−ｇｇａｇａｇｃｔｃｔｔａｔｔｔｔｔｔｇｃｔｔｔｃｔｔｃｔｔｔ−３’（配列番号：９）を合成した。Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｋ１２株（ＡＴＣＣ１０７９８）から常法に従い調整したゲノムＤＮＡの溶液を増幅鋳型として（配列番号：８）（配列番号：９）をプライマーセットとしたＰＣＲ法を行った。
【００７３】
このＰＣＲ法により得られた産物を１％アガロースにて電気泳動し、ｃａｄＡ遺伝子を含む約２．１ｋｂのＤＮＡ断片を常法に従い調整した。この断片を、プラスミドベクターｐＴ７ｂｌｕｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＥｃｏＲＶ部位の３’−末端にＴ塩基が付加された間隙に、常法に従ったライゲーション反応により挿入し、得られたプラスミドをｐＴＭ１５と命名した。
【００７４】
これら調整したｐＴＭ１５をＳａｌ　Ｉ、及びＳａｃ　Ｉで消化し、得られた約２．１ｋｂのＳａｌ　Ｉ　　Ｓａｃ　Ｉ断片を、予めＳａｌ　Ｉ、及びＳａｃ　Ｉで消化しておいたｐＴＭ１４のＳａｌ　Ｉ／Ｓａｃ　Ｉ間隙に常法に従ったライゲーション反応により挿入し、得られたプラスミドをｐＴＭ１６（図２）と命名した。
【００７５】
このプラスミドを導入した大腸菌を培養することで、Ｌ−リジン脱炭酸酵素が細胞表面に局在化され、その大腸菌を回収するだけでＬ−リジン脱炭酸酵素を調整することができるようになる。
（５）Ｌ−リジン脱炭酸酵素が細胞表面に局在化した細胞の調整
ｐＴＭ１６でＥ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９株をアンピシリン耐性に形質転換し、得られた形質転換体をＪＭ１０９／ｐＴＭ１６株と命名した。
【００７６】
次にＪＭ１０９／ｐＴＭ１６株で組み換えＬ−リジン脱炭酸酵素を産生させた。まず、ＪＭ１０９／ｐＴＭ１６株をそれぞれ５０μｇ／ｍｌのアンピシリンナトリウムを含んだ滅菌ＬＢ培地（ＬＢ−ａｍｐ培地）５ｍｌに１白金耳植菌し、３７℃で２４時間振とうして前培養を行った。
【００７７】
この前培養液をＬＢ−ａｍｐ培地５０ｍｌに全量植菌し、３７℃、振幅３０ｃｍで、１８０ｒｐｍの条件下で３時間培養した後に１ｍＭ　ＩＰＴＧを添加し、更に４時間培養した。こうして得られた菌体を遠心回収し、１０ｍｌのＴＢＳ緩衝液（宝酒造製）で３回洗浄後、遠心し菌体を回収した。
【００７８】
実施例１，２　比較例１（Ｌ−リジンの種類の効果）
１０００ｍｌのフラスコに、表１に示すＬ−リジンまたはＬ−リジン塩を終濃度１．３５Ｍになるように各種Ｌ−リジンを加え調整した水溶液５００ｍｌを加えた。その後、終濃度５０ｍｇ／Ｌになるように参考例１（３）で得た精製した組み換えＬ−リジン脱炭酸酵素を加え作用させた。４５℃で４８時間反応した後の反応液中に含まれるカダベリンの濃度を測定した。その結果を表１に示す。
【００７９】
【表１】

【００８０】
原料として、Ｌ−リジン塩水溶液を用いると、より高濃度かつ高反応収率でカダベリンが得られた。
【００８１】
実施例３〜７（ビタミンＢ６の添加の効果）
１０００ｍｌのフラスコに、Ｌ−リジン一塩酸塩を終濃度１．３５Ｍになるように調整した水溶液５００ｍｌを加えた。次に表２に示す各種ビタミンＢ６を終濃度０．０５ｍＭになるように添加した。最後に終濃度５０ｍｇ／Ｌになるように参考例１（３）で得た精製した組み換えＬ−リジン脱炭酸酵素を加え作用させた。４５℃で４８時間反応した後の反応液中に含まれるカダベリンの濃度を測定した。その結果を表２に示す。
【００８２】
【表２】

【００８３】
この結果、ビタミンＢ６をＬ−リジン塩水溶液に添加することにより、より高収率でカダベリンを得られた。
【００８４】
実施例８〜１１（反応停止の条件の効果）
１０００ｍｌのフラスコに、終濃度１．３５ＭになるようにＬ−リジン一塩酸塩を加え調整した水溶液５００ｍｌを加えた。次にピリドキサルリン酸一水和物を終濃度０．０５ｍＭになるように添加した。最後に、終濃度５０ｍｇ／Ｌになるように参考例１（３）で得た精製した組み換えＬ−リジン脱炭酸酵素を加え、４５℃において作用させた。残存Ｌ−リジン濃度をＨＰＬＣにより常に測定し、表３に示す残存Ｌ−リジン濃度に達した際に反応溶液を８０℃に加熱し反応を停止した。これら反応液に水酸化ナトリウムを添加し、反応液のｐＨを１３以上にした。次にクロロホルムを反応液と等量加え、クロロホルム相にカダベリンを抽出した。最後にこのクロロホルム相を、減圧蒸留（３０ｍｍＨｇ、８０℃）することによりカダベリンを単離した。この単離操作における精製収率を表３にまとめる。
【００８５】
【表３】

【００８６】
この結果、反応停止条件としてＬ−リジン塩濃度が仕込み濃度の２０％以下になった反応液からカダベリンを単離することにより、高精製収率でカダベリンが得られた。
【００８７】
実施例１２〜１６（得られたＬ−リジン脱炭酸酵素の精製状態の効果）
参考例１に示す方法により得られたＪＭ１０９／ｐＬＤＣ１株を培養し表４に示すような精製処理をおこなった。また、Ｌ−リジン脱炭酸酵素が細胞表面に局在化したＪＭ１０９／ｐＴＭ１６株の培養も行った。比較例として参考例１に示す方法により得られたＪＭ１０９／ｐＴＶ１１８Ｎ株の培養も行った。
【００８８】
１０００ｍｌのフラスコに、終濃度１．３５ＭになるようにＬ−リジン一塩酸塩を加え調整した水溶液５００ｍｌを加えた。次にピリドキサルリン酸一水和物を終濃度０．０５ｍＭになるように添加した。最後に、ＪＭ１０９／ｐＴＶ１１８Ｎ菌体（比較例２）、ＪＭ１０９／ｐＬＤＣ１菌体（実施例１２）およびＪＭ１０９／ｐＴＭ１６菌体（実施例１６）は２７０ｍｌの培養液から得られた菌体（Ｌ−リジン脱炭酸酵素濃度を終濃度５０ｍｇ／Ｌ添加することに相当する菌体量）を、また表４に示す各精製状態の組み換えＬ−リジン脱炭酸酵素（実施例１３，１４，１５）は終濃度５０ｍｇ／Ｌになるように加え、４５℃において作用させた。経時的にカダベリンの濃度を測定した結果を図３に示す。また、反応が進行しなくなった時間におけるカダベリン収率およびカダベリンの生産速度を求め、表５および図３に示す。
【００８９】
【表４】

【００９０】
【表５】

【００９１】
この結果、組み換えＬ−リジン脱炭酸酵素を精製することで、高生産速度、高収率でカダベリンが得られた。また、Ｌ−リジン脱炭酸酵素を細胞表面に局在化させることで高生産速度、高収率でカダベリンが得られた。
【００９２】
参考例２（既存の化学合成法によるカダベリンの調製）
Ｌ−リジン一塩酸塩２０ｇ（Ｆｌｕｋａ社製）シクロヘキサノール１００ｍｌ（シグマアルドリッチジャパン製）に懸濁し、次いで２８％ナトリウムメトキシド／メタノール溶液（シグマアルドリッチジャパン製）２１．２ｍｌ、２−シクロヘキセン−１−オン１ｍｌ（シグマアルドリッチジャパン製）を加え、１５５℃で３時間加熱撹拌した。反応終了後、反応混合物に塩化水素４ｇ（シグマアルドリッチジャパン製）を含むイソプロパノール溶液２０ｍｌ（シグマアルドリッチジャパン製）を加え、析出した生成物を回収し、乾燥することによりカダベリン二塩酸塩を得た（特公平４−１０４５２の実施例３記載の方法）。この水溶液に、水酸化ナトリウム水溶液を添加することによってカダベリン二塩酸塩をカダベリンに変換し、クロロホルムで抽出して、減圧蒸留（３０ｍｍＨｇ、８０℃）することにより、カダベリンを得た。
【００９３】
実施例１７〜２１　比較例３（不純物の同定）
実施例１２〜１６で得られた各反応液を実施例８〜１１に示した精製方法によりカダベリンを単離した。不純物の分析を、下記に示す条件でＧＣ−ＭＳ法により行い、参考例２で調製したカダベリン（比較例３）の不純物分析と比較した結果を表６に示す。
ＧＣ／ＭＳ：ＨＰ６９８０／ＨＰ５９７３Ａ
Ｃｏｌｕｍｎ：ＮＵＫＯＬ　３０ｍ×０．２４ｍｍＩ．Ｄ．　０．２μｍ　Ｆｉｌｍ
Ｏｖｅｎ：１２０℃（一定）
ＩｎＪ：２００℃（Ｓｐｌｉｔ　１０：１）
Ｆｌｏｗ：Ｈｅ　２．４ｍｌ／ｍｉｎ　（ｃｏｎｓｔ．Ｆｌｏｗ）
ＭＳ：２３０℃（ＳＣＡＮ　ｍ／ｚ＝３０〜４００）
【００９４】
【表６】

【００９５】
この結果、Ｌ−リジン脱炭酸酵素を用い生成したカダベリンを精製することにより、水性生物に有毒で、また酸と接触すると反応してしまうトリ−ｎ−ブチルアミンの含有量が０．００６ｗｔ％以下かつ２，３，４，５−テトラヒドロピリジンの含有量が１．４ｗｔ％以下の高純度カダベリンが得られた。
【００９６】
参考例３（カダベリンとアジピン酸の塩の調製）
実施例１５のカダベリン１０．３ｇを、水２５ｇ中に溶解した水溶液を、４０℃のウォーターバスに浸して撹拌しているところに、アジピン酸（カーク製）を約１ｇずつ、中和点付近では約０．２ｇずつ添加していき、アジピン酸添加量に対する水溶液のｐＨ変化を調べ、中和点を求めると、ｐＨ８．６６であった。ｐＨが８．６６になるように、カダベリンとアジピン酸の等モル塩の５０ｗｔ％水溶液を調製した。
【００９７】
参考例４（カダベリンとアジピン酸の塩の調整）
参考例２のカダベリン１０．３ｇを、水２５ｇ中に溶解した水溶液を、４０℃のウォーターバスに浸して撹拌しているところに、アジピン酸（カーク製）を約１ｇずつ、中和点付近では約０．２ｇずつ添加していき、アジピン酸添加量に対する水溶液のｐＨ変化を調べ、中和点を求めると、ｐＨ８．７２であった。ｐＨが８．７２になるようにカダベリンとアジピン酸の等モル塩の５０ｗｔ％水溶液を調製した。
【００９８】
実施例２２（ポリアミドの合成）
参考例３で調製したカダベリンとアジピン酸の等モル塩の５０ｗｔ％水溶液５０．０ｇを試験管に仕込み、オートクレーブに入れて、密閉し、窒素置換した。ジャケット温度を２６５℃に設定し、加熱を開始した。缶内圧力が１７．５ｋｇ／ｃｍ２に到達した後、缶内圧力を１７．５ｋｇ／ｃｍ２で３時間保持した。その後、ジャケット温度を２７５℃に設定し、２時間かけて缶内圧力を常圧に放圧した。その後、缶内温度が２４５℃に到達した時点で、加熱を停止した。室温に放冷後、試験管をオートクレーブから取り出し、ポリアミドを得た。
【００９９】
比較例４
参考例４で調製したカダベリンとアジピン酸の等モル塩の５０ｗｔ％水溶液５０．０ｇを用いる以外は、実施例２２と全く同様の方法でポリアミドを得た。
【０１００】
実施例２３（ポリアミドの評価）
実施例２２で得られたポリアミドおよび比較例４で得られたポリアミドを下記に示す方法で比較評価した。その結果を表７に示す。
【０１０１】
［ポリアミド中の２，３，４，５−テトラヒドロピリジン、およびトリ−ｎ−ブチルアミンの定量（ＧＣ−ＭＳ）］
ポリアミド約１５ｇを精秤して、メタノールでソックスレー抽出し、その抽出液を、下記条件でＧＣ−ＭＳ分析して、ポリアミド中に含まれる２，３，４，５−テトラヒドロピリジン、およびトリ−ｎ−ブチルアミンを定量した。

【０１０２】
［ＤＳＣ（示差走査熱量測定）］
セイコー電子工業製ロボットＤＳＣＲＤＣ２２０を用い、窒素雰囲気下、ポリアミドを約５ｍｇを採取し、次の条件で測定した。
融点＋２５℃に昇温して３分間保持し、ポリアミドを完全に融解させた後、２０℃／分の降温速度で、３０℃まで降温し、３分間保持した後、３０℃から融点＋２５℃まで２０℃／分の昇温速度で昇温したときに観測される吸熱ピークの温度、および熱量を求めた。
【０１０３】
［相対粘度（ηｒ）］
９８％硫酸中、０．０１ｇ／ｍｌ濃度、２５℃でオストワルド式粘度計を用いて測定を行った。
【０１０４】
［溶融滞留試験］
試験管にポリアミド約５ｇを仕込み、窒素雰囲気下、融点＋２０℃の温度のシリコンバスに浸漬し、ポリアミドが完全に溶融してから３０分間放置した後、ポリアミドを回収して相対粘度測定を行った。
【０１０５】
【表７】

【０１０６】
その結果、本発明の方法によって得られた高純度カダベリンを使用することにより、相対粘度（ηｒ）の保持率の高い（耐熱性の高い）ポリアミドが得られた。
【０１０７】
【発明の効果】
本発明によれば、高反応収率、高精製収率、高生産速度、高濃度および高純度でのカダベリンの工業的製造方法およびカダベリンの単離方法が提供される。
【０１０８】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】Ｌ−リジン脱炭酸酵素細胞内発現ベクターｐＬＤＣ１のフィジカルマップを示す図である。
【図２】Ｌ−リジン脱炭酸酵素細胞表面発現ベクターｐＴＭ１６のフィジカルマップを示す図である。
【図３】実施例１２〜１６および比較例２における時間とカダベリン生産量の関係を示す図である。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for producing cadaverine. Cadaverine is expected as a raw material for synthesis such as pharmaceutical intermediates and as a raw material for polymers, and its demand is increasing.
[0002]
[Prior art]
Conventionally, it is known that cadaverine can be obtained by boiling L-lysine in cyclohexanol containing a small amount of tetralin peroxide (see Non-Patent Document 1). However, the high temperature reaction requires large amounts of energy and organic solvents, and the reaction yield is very low (36%).
[0003]
Further, a method of synthesizing from lysine using vinyl ketones such as 2-cyclohexen-1-one as a catalyst (see Non-Patent Document 2 and Patent Document 1) is known.
[0004]
Moreover, cadaverine obtained by this method contains a basic compound such as tri-n-butylamine or 2,3,4,5-tetrahydropyridine as an impurity.
[0005]
In general, when the pH changes during the progress of the enzymatic reaction, an acid or an alkali is appropriately added to control the pH, the concentration of the product decreases, and a concentration operation is required in the purification step, resulting in poor efficiency. There is such a problem. Further, the enzyme is denatured and inactivated by the added acid or alkali.
In addition, cadaverine is a biogenic amine that is ubiquitous in living organisms, and its biosynthetic system is being elucidated (see Non-Patent Document 3). In addition, an L-lysine decarboxylase gene derived from Escherichia coli is known (see Non-Patent Document 4).
[0006]
On the other hand, research on localizing proteins on the cell surface has been performed in many bacteria. Research on localizing proteins on the cell surface of Escherichia coli has been actively conducted (see Non-Patent Document 5).
[0007]
However, no practical production technology has been established for the production of cadaverine, and there is a demand for a method for efficiently producing cadaverine with high concentration and high purity under milder conditions.
[0008]
[Patent Document 1]
Japanese Patent Publication No. 4-10452
[Non-patent document 1]
Tadashi Suyama, Kiyozo Kanao; Decarboxylation of amino acids (Part 4) Pharmaceutical Journal, vol. 85 (6), p. 531-533 (1965))
[Non-patent document 2]
Chemistry letters, 893 (1986)
[Non-Patent Document 3]
Celia white tab and Herbert tabor; Microbiological Reviews, vol. 49, p. 81-99 (1985)
[Non-patent document 4]
Shi-yuanengeng and George N.M. Bennett; Journal of Bacteriology, vol. 174, p. 2659-2669 (1992)
[Non-Patent Document 5]
George Georgiu, Heather L .; Poetschke, Christos Stathopoulos and Joseph A. Francisco; TIBTECH, vol. 11, p. 6-10 (1993)
[0009]
[Problems to be solved by the invention]
When cadaverine containing a large amount of tri-n-butylamine and 2,3,4,5-tetrahydropyridine is used as a raw material of a polymer, for example, when a polyamide is synthesized from a raw material containing cadaverine by heating polycondensation, Since the reaction temperature is high, a polyamide obtained by a basic compound such as tri-n-butylamine or 2,3,4,5-tetrahydropyridine contained in cadaverine causes a decomposition reaction of the polyamide, resulting in insufficient heat resistance of the resulting polyamide. There is such a problem.
[0010]
Furthermore, tri-n-butylamine is toxic to aquatic organisms, and has a problem that the lethal dose to fish is 20 to 40 mg / L.
[0011]
An object of the present invention is to provide an industrial production method and a method for isolating cadaverine at a high reaction yield, a high purification yield, a high production rate, a high concentration and a high purity of cadaverine having a small amount of such impurities. is there.
[0012]
[Means for Solving the Problems]
In order to solve the above problems, the present inventors have conducted intensive research on a method for producing cadaverine with high efficiency and high concentration under milder conditions. -It has been found that cadaverine can be obtained at a high reaction yield and a high concentration by acting lysine decarboxylase.
[0013]
That is, the present invention provides "(1) a method for producing cadaverine, which comprises reacting L-lysine decarboxylase with an aqueous solution of L-lysine salt to isolate cadaverine from the reaction solution.
(2) Cadaverine having a content of 2,3,4,5-tetrahydropyridine of 1.4% by weight or less.
(3) Cadaverine having a tri-n-butylamine content of 0.006 wt% or less.
(4) A polyamide containing cadaverine obtained by the method (1) or cadaverine according to the above (2) or (3) as a raw material. ".
[0014]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Cadaverine is 1,5-pentanediamine, and is a compound useful as a raw material for a polymer, a raw material for synthesizing a pharmaceutical intermediate, and the like.
[0015]
L-lysine decarboxylase is an enzyme that converts L-lysine to cadaverine, and is known to be present in many organisms, not only Escherichia coli K12 strain and other Escherichia microorganisms.
[0016]
There is no particular limitation on the L-lysine decarboxylase used in the present invention. For example, Bacillus halodurans, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Selenomonas luminantium (Bacillus subtilis). Selenomonas ruminantium, Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus, Streptomyces koelikaras, Streptomyces koepicores, Streptomyces coelicolor estropi dens), Eubacterium acididaminophilum, Salmonella typhimurium, Hafnia alvei, Neisseria meningitides (Neisseria meningitides), Neisseria meningitides (Neisseria meningitides). -Those derived from Pyrococcus abyssi or Corynebacterium glutamicum are preferably used. More preferably, it is derived from Escherichia coli whose safety is recognized.
[0017]
Since the product in the present invention is cadaverine, which is an alkaline compound, the pH of the reaction solution changes toward the alkali side as the reaction proceeds. However, if L-lysine decarboxylase is allowed to act on the aqueous solution of L-lysine salt, cadaverine can be produced efficiently without the need to control the pH of the reaction solution. There is no particular limitation on the L-lysine salt used. Preferred are hydrochloride, sulfate, acetate, nitrate and carbonate. More preferred is L-lysine monohydrochloride.
[0018]
L-Lysine decarboxylase naturally exists by binding to vitamin B6, but by adding vitamin B6 to an aqueous L-lysine salt solution, the production rate and reaction yield can be improved. There is no particular limitation on the method of adding vitamin B6. It may be appropriately added during the reaction. Preferably, when L-lysine decarboxylase is in a solution state, it is preferably added to the enzyme solution. There is no particular limitation on the concentration of vitamin B6 in the reaction solution. Preferably, it is added to the reaction solution so that the concentration of vitamin B6 becomes 0.05 mM. There is no particular limitation on the vitamin B6 used. Preferably, it is at least one selected from pyridoxine, pyridoxamine, pyridoxal and pyridoxal phosphate. More preferred is pyridoxal phosphate.
[0019]
In addition, after reacting L-lysine decarboxylase, cadaverine is isolated from the reaction solution in which the concentration of L-lysine has reached 20% or less of the charged concentration, thereby isolating cadaverine with high purification yield. it can. There is no particular limitation on the means for confirming that it has reached 20% or less. Preferably, it can be confirmed by an HPLC method. More preferably, a method of measuring the change in pH over time and confirming the end point of the reaction in association with the concentration of the L-lysine salt can be adopted.
[0020]
The method for obtaining L-lysine decarboxylase used in the present invention is not particularly limited. For example, a recombinant cell in which L-lysine decarboxylase is highly expressed in a cell (an intracellularly expressed recombinant cell) or the like is suitable. What is necessary is just to culture | cultivate in a suitable culture medium, collect | recover the cell which multiplied, and crush the said cell.
[0021]
As another method, a recombinant cell in which L-lysine decarboxylase is localized on the cell surface (recombinant cell expressing the cell surface) or the like may be cultured in an appropriate medium, and the grown cells may be collected.
[0022]
A recombinant cell in which L-lysine decarboxylase is localized on the cell surface is a state in which at least L-lysine decarboxylase is localized on the cell surface, and L-lysine decarboxylase is simultaneously present in the cell. May be present.
[0023]
On the other hand, specific methods for localizing L-lysine decarboxylase on the cell surface include, for example, a part of a secretory signal sequence, a gene sequence encoding a part of a cell surface-localized protein, and L-lysine decarboxylase. DNA having the structural gene sequence of carbonic enzyme in this order may be introduced into Escherichia coli.
[0024]
There is no restriction on the part of the secretory signal sequence. Any sequence that is necessary for secreting the protein in the host may be used. In Escherichia coli, for example, it is a part of the sequence of lipoprotein, and specifically, it is preferably a gene sequence translated as an amino acid sequence of MKATKLVLGAVIGLSTLLAGCSSNAKIDQ (one letter code of amino acid).
There is no particular limitation on the gene sequence encoding a part of the cell surface localized protein. In Escherichia coli, for example, it is a part of the sequence of the outer membrane binding protein, and specifically, it is preferably a part of the sequence from the 46th amino acid to the 159th amino acid of OmpA (outer membrane binding protein).
[0025]
The method for cloning the L-lysine decarboxylase gene, lipoprotein gene and OmpA gene is not particularly limited. A method of amplifying and obtaining a necessary genetic region by using a PCR (polymerase chain reaction) method based on known gene information, and cloning using a homology or enzyme activity as an index from a genomic library or a cDNA library based on known gene information. And the like. In the present invention, these genes include mutants due to genetic polymorphism and the like. In addition, a genetic polymorphism means that the base sequence of a gene is partially changed due to a spontaneous mutation on the gene. For example, E. A cadA gene or an ldc gene, which is a gene encoding L-lysine decarboxylase, is cloned from the chromosomal DNA of E. coli K12 strain by PCR. The chromosomal DNA used at this time is E. coli. Any strain may be used as long as it is derived from E. coli.
[0026]
To confirm that L-lysine decarboxylase is localized on the cell surface, for example, after performing an immunoreaction on the cell surface-expressing recombinant cells with an antibody prepared using L-lysine decarboxylase as an antigen, embed and slice. Can be confirmed by observation with an electron microscope (immunoelectron microscopy).
[0027]
In the present invention, as the L-lysine decarboxylase, those prepared from recombinant cells having an increased intracellular or cell surface activity of L-lysine decarboxylase can be preferably used. There is no particular limitation on the method for increasing the activity of L-lysine decarboxylase in the cell or on the cell surface. Specifically, for example, a method of increasing the amount of L-lysine decarboxylase enzyme, or introducing a mutation into the structural gene of the enzyme itself to increase the specific activity of the enzyme itself can be mentioned.
[0028]
Means for increasing the amount of the enzyme in the cell or on the cell surface include improving the transcriptional regulatory region of the gene, increasing the copy number of the gene, and increasing the efficiency of translation into a protein.
[0029]
Improving the transcription regulatory region means adding a modification that increases the amount of gene transcription. For example, the promoter can be strengthened by introducing a mutation into the promoter to increase the transcription amount of the downstream gene. In addition to introducing a mutation into a promoter, a promoter that is strongly expressed in a host may be introduced. For example, in Escherichia coli, promoters such as lac, tac, and trp are exemplified. Moreover, the transcription amount of a gene can be increased by newly introducing an enhancer. The introduction of a gene such as a promoter of chromosomal DNA is described in, for example, JP-A-1-215280.
[0030]
Specifically, the increase in the copy number of the gene can be achieved by connecting the gene to a multi-copy type vector to prepare a recombinant DNA, and retaining the recombinant DNA in a host cell. Here, the vector includes widely used ones such as plasmids and phages, but in addition to these, transoposons (Berg, DE and Berg. CM, Bio / Technol., Vol. .417 (1983)) and Mu phage (JP-A-2-109985). It is also possible to increase the copy number by integrating the gene into the chromosome by a method using a homologous recombination plasmid or the like.
As a method for increasing the translation efficiency of a protein, for example, in prokaryotes, an SD sequence (Shine, J. and Dalgarno, L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 71, 1342-1346 (1974)) In eukaryotes, Kozak consensus sequences (Kozak, M., Nuc. Acids Res., Vol. 15, p. 8125-8148 (1987)) can be introduced and modified, and codon usage can be optimized (Japanese Unexamined Patent Publication No. -125895).
[0031]
Means for increasing the intracellular or cell surface activity of L-lysine decarboxylase include increasing the activity of L-lysine decarboxylase itself by introducing a mutation into the structural gene itself of L-lysine decarboxylase. There is also a thing to do.
[0032]
In order to generate a mutation in a gene, site-directed mutagenesis (Kramer, W. and frita, HJ, Methods in Enzymology, vol. 154, P. 350 (1987)) recombinant PCR (PCR Technology, Stockton) Press (1989), a method for chemically synthesizing a specific portion of DNA, a method for treating the gene with hydroxyamine, a method for treating a strain having the gene with ultraviolet irradiation, or a treatment with a chemical agent such as nitrosoguanidine or nitrous acid. There is a way.
[0033]
As the recombinant cells, those derived from microorganisms, animals, plants, or insects can be preferably used. For example, when using an animal, a mouse, a rat, or a cultured cell thereof is used. When a plant is used, for example, Arabidopsis thaliana, tobacco and their cultured cells are used. When insects are used, for example, silkworms and cultured cells thereof are used. When a microorganism is used, for example, Escherichia coli or the like is used.
[0034]
Further, a plurality of L-lysine decarboxylases may be used in combination.
[0035]
In order to obtain L-lysine decarboxylase, the method of culturing the recombinant cells is not particularly limited. For example, when culturing a microorganism, the medium used is a carbon source, a nitrogen source, inorganic ions, and other A medium containing an organic component is used. For example, in the case of E. coli, an LB medium is often used. As the carbon source, glucose, lactose, galactose, fructose, arabinose, maltose, xylose, trehalose, sugars such as hydrolysates of ribose and starch, alcohols such as glycerol, mannitol and sorbitol, gluconic acid, fumaric acid, and citric acid And organic acids such as succinic acid. Examples of the nitrogen source include inorganic ammonium salts such as ammonium sulfate, ammonium chloride, and ammonium phosphate; organic nitrogen such as soybean hydrolysate; ammonia gas; and aqueous ammonia. As organic trace nutrients, it is desirable to contain required amounts of various amino acids, vitamins such as vitamin B1, nucleic acids such as RNA, and yeast extract in an appropriate amount. In addition to these, a small amount of calcium phosphate, calcium sulfate, iron ion, manganese ion, or the like is added as needed.
[0036]
The culturing conditions are not particularly limited. For example, in the case of Escherichia coli, the culturing is preferably performed under aerobic conditions for about 16 to 72 hours, the culturing temperature is 30 to 45 ° C, particularly preferably 37 ° C, and the culturing pH is It is better to control the pH to 5 to 8, particularly preferably to pH 7. For pH adjustment, an inorganic or organic acidic or alkaline substance, furthermore, ammonia gas or the like can be used.
[0037]
The grown intracellularly expressed recombinant cells can be recovered from the culture solution by centrifugation or the like. To prepare a cell lysate from the collected intracellularly expressed recombinant cells, a usual method is used. That is, the cell-expressed recombinant cells are disrupted by sonication, dynomill, French press, or the like, and cell debris is obtained by removing cell residues by centrifugation.
[0038]
To purify L-lysine decarboxylase from cell lysate, ammonium sulfate fractionation, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, affinity chromatography, gel filtration chromatography, isoelectric point precipitation, heat treatment, pH treatment, etc. Techniques usually used for purification are used in appropriate combination.
[0039]
In general, an enzymatic reaction to be industrialized uses a quiescent cell. In the present invention, as the L-lysine decarboxylase to be acted on, a quiescent cell having L-lysine decarboxylase activity, a cell lysate thereof and the like can be used. A cell lysate is preferred. Cadaverine can be obtained at a higher production rate by using a cell lysate.
[0040]
Further, the action of partially purified L-lysine decarboxylase can suppress the degradation of L-lysine and the degradation of cadaverine, so that cadaverine with higher yield and higher purity can be obtained. The partial purification means that only industrially easy treatment is performed, and examples thereof include heat treatment and pH treatment. Preferably, it is a heat treatment. More preferably, L-lysine decarboxylase isolated and purified is allowed to act. By partially purifying or isolating and purifying L-lysine decarboxylase, an enzyme that causes L-lysine degradation or cadaverine degradation can be removed.
[0041]
Furthermore, when a cell in which L-lysine decarboxylase is localized on the cell surface is acted on, the degradation of L-lysine and the degradation of cadaverine can be suppressed, resulting in higher yield, higher purity, and higher production. You can get cadaverine at speed. Further, by collecting the cells, the cells can be repeatedly used for an enzymatic reaction. Moreover, the adjustment of the enzyme is very simple.
[0042]
In general, enzymes are naturally present in the natural amino acid sequence that should be present. Therefore, when an amino acid sequence is artificially added or deleted, the activity of the enzyme is often lost. However, when L-lysine decarboxylase is expressed in cells in the present invention, L-lysine decarboxylase in which 1 to 30 amino acid sequences are added to the N-terminal amino acid sequence of L-lysine decarboxylase can be preferably used. . Here, what is given to the N-terminal is preferably 6 to 10 histidine residues. As described above, by adding amino acids to the N-terminal amino acid sequence, L-lysine decarboxylase can be easily purified. There is no particular limitation on the method for providing 1 to 30 amino acids to the N-terminal amino acid sequence. For example, the base sequence corresponding to the amino acid sequence to be added to the L-lysine decarboxylase gene may be recombined using genetic engineering techniques. There are no particular restrictions on the genetic engineering technique used. Preferably, there is a PCR method or a method by ligation of DNA fragments.
[0043]
Conversion of the L-lysine salt aqueous solution to cadaverine by L-lysine decarboxylase can be performed by bringing the L-lysine decarboxylase obtained as described above into contact with the L-lysine salt aqueous solution.
[0044]
There is no particular limitation on the amount of L-lysine decarboxylase used. , An amount sufficient to catalyze the reaction of converting the aqueous L-lysine salt solution to cadaverine. Preferably, the enzyme concentration in the reaction solution is 25 to 70 mg / L. Preferably it is 50 mg / L. On the other hand, when using resting cells, the cell concentration in the reaction solution is 5 to 15 g / L. Preferably it is 10 g / L.
[0045]
The reaction temperature is generally 28 to 55C, preferably around 45C.
[0046]
The state of the reaction solution is not particularly limited. It is preferably in a standing or stirring state. There is no particular limitation on the method of stirring. Preferably, stirring is performed by a stirring blade.
[0047]
The L-lysine decarboxylase used in the present invention can be repeatedly used for cadaverine synthesis reaction by immobilization, and the cost required for enzyme preparation can be reduced. Examples of the immobilization method include a method involving inclusion in a synthetic polymer such as acrylamide, a method involving adsorption onto an ion-exchange carrier or a hydrophobic carrier having a sepharose or styrene resin skeleton, or a method involving covalent bonding to a glass carrier. Is mentioned.
[0048]
The reaction time varies depending on conditions such as the enzyme activity and L-lysine salt concentration used, but is usually 1 to 72 hours. Further, the reaction may be continuously performed while supplying the L-lysine salt.
[0049]
After the completion of the reaction, the cadaverine thus produced is collected from the reaction solution by adjusting the pH of the reaction solution to 12 to 14 with an alkali and extracting the solution with a polar organic solvent.
[0050]
There is no particular limitation on the alkali used. Preferably, sodium hydroxide, potassium hydroxide and calcium hydroxide can be used.
[0051]
There is no particular limitation on the polar organic solvent used. Preferably, aniline, cyclohexanone, 1-octanol, isobutyl alcohol, cyclohexanol and chloroform can be used.
[0052]
The cadaverine thus obtained is low in impurities such as tri-n-butylamine and 2,3,4,5-tetrahydropyridine. By producing by the method of the present invention, cataverine having a tri-n-butylamine content of 0.006 wt% or less can be obtained when analyzed by the following method. Furthermore, when analyzed by the following method, a product having a content of 2,3,4,5-tetrahydropyridine of 1.4 wt% or less is obtained. Further, a product having a tri-n-butylamine content of 0.006 wt% or less and a 2,3,4,5-tetrahydropyridine content of 1.4 wt% or less is obtained.
[0053]
Analysis of tri-n-butylamine and 2,3,4,5-tetrahydropyridine is performed by GC-MS under the following conditions.
[0054]
GC / MS: HP6980 / HP5973A
Column: NUKOL 30m × 0.24mm D. 0.2μm Film
Oven: 120 ° C (constant)
InJ: 200 ° C. (Split 10: 1)
Flow: He 2.4 ml / min (const. Flow)
MS: 230 ° C (SCAN m / z = 30 to 400)
The cadaverine thus obtained is useful as a raw material for polyamide.
[0055]
As a method for producing a polyamide, a heating polycondensation method in which a mixture of cadaverine and a dicarboxylic acid and water is heated to cause a dehydration reaction to proceed is used. Further, it is also possible to increase the molecular weight by performing solid phase polymerization after the heat polycondensation. Solid-state polymerization proceeds by heating in a vacuum or an inert gas at a temperature in the range of 100 ° C. to a melting point, and a polyamide having an insufficient molecular weight can be converted to a high molecular weight by heat polycondensation.
[0056]
There is no particular limitation on the dicarboxylic acid used. For example, adipic acid is preferred.
[0057]
By using cadaverine obtained in the present invention as a raw material for polyamide, a polyamide having high heat resistance can be obtained.
[0058]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples, but the present invention is not limited to these Examples.
[0059]
[Method for analyzing L-lysine concentration and cadaverine concentration by HPLC]
Column used: CAPCELL PAK C18 (Shiseido)
Mobile phase: 0.1% (w / w) H3PO4: acetonitrile = 4.5: 5.5
Detection: UV 360 nm
Sample pretreatment: 25 μl of an analysis sample, 25 μl of 0.03 M 1,4-diaminobutane, 150 μl of 0.075 M sodium bicarbonate and 0.2 M 2,4-dinitrofluorobenzene in ethanol were added as internal standards and mixed. Incubate at ° C for 1 hour. After dissolving 50 µl of the above reaction solution in 1 ml of acetonitrile, 10 µl after centrifugation at 10,000 rpm for 5 minutes was analyzed by HPLC.
[0060]
Reference Example 1 (Preparation of L-lysine decarboxylase)
(1) Cloning of L-lysine decarboxylase gene and preparation of intracellular expression vector
To convert L-lysine salts to cadaverine using L-lysine decarboxylase, E. coli L-lysine decarboxylase gene (cadA) was cloned.
[0061]
The oligonucleotide primer 5-atgaacgttattgcaattattg-3 '(SEQ ID NO: 1) and 5'-reference to the base sequence of the L-lysine decarboxylase gene (cadA) (Accession No. M76411) registered in the database (GenBank). gctgatggggtgagatagaatg-3 ′ (SEQ ID NO: 2) was synthesized. E. FIG. E. coli K12 strain (ATCC10798), 0.2 μl of a genomic DNA solution prepared according to a conventional method was placed in a 0.2 ml microcentrifuge tube as an amplification template, and each primer was prepared at 20 pmol, 20 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0), Each reagent was added so that 2.5 mM KCl, 100 μg / ml gelatin, 50 μM each dNTP, and 2 units LATaq DNA polymerase (manufactured by Takara Shuzo), and the total volume was adjusted to 50 μl. DNA denaturation conditions were 94 ° C for 30 seconds, primer annealing conditions were 55 ° C for 30 seconds, DNA primer extension reaction conditions were 72 ° C for 3 minutes, and a reaction was performed for 30 cycles using a BioRad thermal cycler. (Polymerase chain reaction: hereinafter referred to as PCR method). The PCR method in this example was performed under the same conditions unless otherwise specified. The product obtained by this PCR method was electrophoresed on 1% agarose, and a DNA fragment of about 2.1 kb containing the cadA gene was prepared according to a conventional method. This fragment was inserted into a gap where a T base was added to the 3′-end of the EcoRV site of a plasmid vector pT7blue (manufactured by Novagen) by a ligation reaction according to a conventional method, and the resulting plasmid was designated as pT7-cadA. Named.
[0062]
Using this pT7-cadA as an amplification template, oligonucleotide 5′-cgccatggggccatcatcatcatcatcatcatcatatgaacgttatttgcaatattg-3 ′ (SEQ ID NO: 3), 5′-cgcggatccgctgatgaggatgatgatgatgatgatgatgatgatgatgatgatgatgatgatgatgatgatgatgatgatgatgatgatgatgatgatgatgatgatgatgatgatgatgatgatgatagatg-3 The product obtained here has a nucleotide sequence derived from the oligonucleotide (SEQ ID NO: 3) and a nucleotide sequence derived from (SEQ ID NO: 4) at the 5 ′ end and the 3 ′ end of the DNA fragment containing the cadA gene, respectively. Has been added. This product was electrophoresed on 1% agarose, and a DNA fragment of about 2.1 kb was prepared according to a conventional method. This fragment was inserted into a gap where a T base was added to the 3′-end of the EcoRV site of a plasmid vector pT7blue (manufactured by Novagen) by a ligation reaction according to a conventional method, and the resulting plasmid was inserted into pT7-cadA1. Named.
[0063]
This pT7-cadA1 was digested with NcoI and BamHI, and the obtained 2.1 kb NcoI-BamHI fragment was inserted into the NcoI / BamHI gap of pTV118N (Takara Shuzo) previously digested with NcoI and BamHI. And the resulting plasmid was named pLDC1 (FIG. 1). By culturing Escherichia coli into which this plasmid was introduced, it was possible to produce a recombinant L-lysine decarboxylase having a molecular weight of about 80 kDa in which six histidine residues were added to the N-terminal amino acid sequence of L-lysine decarboxylase. it can.
[0064]
(2) Production of recombinant L-lysine decarboxylase
The p. coli JM109 strain was transformed to ampicillin resistance, and the obtained transformant was designated as JM109 / pLDC1 strain.
[0065]
Next, recombinant L-lysine decarboxylase was produced in the JM109 / pLDC1 strain. First, a sterilized LB medium (Sambrook, J. et. Al., 2001, Molecular Cloning 3rd. Edition, Cold Spring Harbor Lab. Press medium) containing 50 μg / ml of each of the JM109 / pLDC1 strains and 50 μg / ml of sodium ampicillin (LB-Amp). One platinum loop was inoculated into 5 ml and shaken at 37 ° C. for 24 hours to perform preculture.
[0066]
This preculture was inoculated in its entirety into 50 ml of LB-amp medium, cultured at 37 ° C., 30 cm in amplitude and 180 rpm for 3 hours, and then added with 1 mM IPTG (isopropyl-1-thio-β-D-galactoside). And further cultured for 4 hours. As a control experiment, a similar culture was carried out using a transformant obtained by transforming the JM109 strain with pTV118N (hereinafter referred to as the JM109 / pTV118N strain). The cells thus obtained were collected, resuspended in 5 ml of TBS buffer (Takara Shuzo), and then a cell lysate was prepared by sonication and centrifugation. These L-lysine decarboxylase activities were measured by measuring the concentration of cadaverine produced per unit time. As a result, the L-lysine decarboxylase activity was increased about 100-fold in the JM109 / pLDC1 strain compared to the cell lysate derived from the JM109 / pTV118N strain as a control experiment. The cell lysate was fractionated by SDS-PAGE and subjected to Western blotting with a Penta-His Antibody antibody (manufactured by QIAGEN). As a result, recombination with a molecular weight of about 80 kDa was performed only from the cell lysate derived from the JM109 / pLDC1 strain. L-Lysine decarboxylase was detected.
[0067]
(3) Purification of recombinant L-lysine decarboxylase
Since this recombinant L-lysine decarboxylase has six histidine residues in the N-terminal amino acid sequence, it was purified using the interaction with nickel ions. First, a column system packed with 10 ml of a chelating Sepharose Fast Flow carrier (manufactured by Amersham Bioscience) was constructed. After flowing 50 ml of a 50 mM nickel sulfate aqueous solution and 50 ml of a TBS buffer solution in this order over this column, a 50 ml cell lysate derived from a 500 mL culture of the JM109 / pLDC1 strain obtained in the same manner as in (2) was flowed. . Thereafter, 100 ml of a TBS buffer containing 5 mM imidazole and 100 ml of a TBS buffer containing 50 mM imidazole were flowed in this order. An additional 50 ml of TBS buffer containing 600 mM imidazole was flushed. When the L-lysine decarboxylase activity of each buffer solution passed through the column was measured in the same manner as in (2), only the TBS buffer solution containing 600 mM imidazole had activity. Further, each buffer solution passed through the column was subjected to SDS-PAGE and stained with Coomassie brilliant blue. As a result, a single band of about 80 kDa was detected from the TBS buffer solution containing 600 mM imidazole. When each buffer solution passed through the column was subjected to Western blotting in the same manner as in (2), about 80 kDa protein was detected only in the TBS buffer solution containing 600 mM imidazole. It was confirmed to be a recombinant L-lysine decarboxylase having carboxylase activity.
[0068]
(4) Preparation of L-lysine decarboxylase cell surface expression vector
First, a part of the lipoprotein sequence and the sequence from the 46th amino acid to the 159th amino acid of the outer membrane binding protein (OmpA) were cloned as one cassette.
[0069]
The oligonucleotide primer 5-ataaagctttattagaaaagtctataaactgg-3 '(SEQ ID NO: 5) and 5'-atagtcggggcgccgcc are referred to the nucleotide sequence of the outer membrane-associated protein (ompA) (Accession No. NC_000913) registered in the database (GenBank). '(SEQ ID NO: 6), 5'-ataaagctttgaaaagctactaaactggtactgggcgcggtaatcctgggttctactctgctggcaggttgctccagcaacgctacaatgcatgaccacca gacta E. FIG. A PCR method using (SEQ ID NO: 5) (SEQ ID NO: 6) (SEQ ID NO: 7) as a primer set was performed using a solution of genomic DNA prepared from E. coli K12 strain (ATCC10798) according to a conventional method as an amplification template. The product obtained by this PCR method was electrophoresed on 2% agarose, and a DNA fragment of about 0.4 kb containing the ompA gene was prepared according to a conventional method. This fragment was inserted into a gap where a T base was added to the 3′-end of the EcoRV site of a plasmid vector pT7blue (manufactured by Novagen) by a conventional ligation reaction, and the resulting plasmid was named pTM7. .
[0070]
This pTM7 was digested with Hind III and Sal I, and the obtained about 0.4 kb Hind III Sal I fragment was digested with Hind III and Sal I of Hind III / pUC19 (Takara Shuzo). The plasmid was inserted into the Sal I gap by a conventional ligation reaction, and the resulting plasmid was named pTM14.
[0071]
Next, E. The L-lysine decarboxylase gene (cadA) of E. coli K12 strain (ATCC10798) was cloned.
[0072]
The oligonucleotide primer 5-tatgtcgacatgaacgttattgcaatat-3 '(SEQ ID NO: 8) and 5'-reference to the nucleotide sequence of the L-lysine decarboxylase gene (cadA) (Accession No. M76411) registered in the database (GenBank). ggagagctcttattttttttgcttttcttctttt-3 ′ (SEQ ID NO: 9) was synthesized. E. FIG. Using a solution of genomic DNA prepared from E. coli K12 strain (ATCC10798) according to a conventional method as an amplification template, a PCR method was performed using (SEQ ID NO: 8) (SEQ ID NO: 9) as a primer set.
[0073]
The product obtained by this PCR method was electrophoresed on 1% agarose, and a DNA fragment of about 2.1 kb containing the cadA gene was prepared according to a conventional method. This fragment was inserted into a gap where a T base was added to the 3′-end of the EcoRV site of a plasmid vector pT7blue (manufactured by Novagen) by a conventional ligation reaction, and the resulting plasmid was named pTM15. .
[0074]
The thus prepared pTM15 was digested with SalI and SacI, and the resulting 2.1 kb SalI SacI fragment was obtained from SalI / SacI of pTM14 previously digested with SalI and SacI. The plasmid was inserted into the gap by a ligation reaction according to a conventional method, and the obtained plasmid was named pTM16 (FIG. 2).
[0075]
By culturing Escherichia coli into which this plasmid has been introduced, L-lysine decarboxylase is localized on the cell surface, and L-lysine decarboxylase can be adjusted only by collecting the E. coli.
(5) Preparation of cells in which L-lysine decarboxylase is localized on the cell surface
p. E. coli JM109 strain was transformed to ampicillin resistance, and the obtained transformant was designated as JM109 / pTM16 strain.
[0076]
Next, recombinant L-lysine decarboxylase was produced in JM109 / pTM16 strain. First, one loopful of the JM109 / pTM16 strain was inoculated into 5 ml of a sterilized LB medium (LB-amp medium) containing 50 μg / ml of sodium ampicillin, and precultured by shaking at 37 ° C. for 24 hours.
[0077]
This precultured solution was inoculated in its entirety into 50 ml of LB-amp medium, cultured at 37 ° C., at an amplitude of 30 cm, and at 180 rpm for 3 hours, then added with 1 mM IPTG, and further cultured for 4 hours. The cells thus obtained were collected by centrifugation, washed three times with 10 ml of TBS buffer (Takara Shuzo), and then centrifuged to collect the cells.
[0078]
Examples 1 and 2 Comparative Example 1 (Effects of L-Lysine Type)
To a 1000 ml flask, 500 ml of an aqueous solution prepared by adding L-lysine or an L-lysine salt shown in Table 1 by adding various L-lysines to a final concentration of 1.35 M was added. After that, the purified recombinant L-lysine decarboxylase obtained in Reference Example 1 (3) was added thereto to a final concentration of 50 mg / L to act. After reacting at 45 ° C. for 48 hours, the concentration of cadaverine contained in the reaction solution was measured. Table 1 shows the results.
[0079]
[Table 1]

[0080]
When an aqueous L-lysine salt solution was used as a raw material, cadaverine was obtained at a higher concentration and a higher reaction yield.
[0081]
Examples 3 to 7 (Effect of Addition of Vitamin B6)
500 ml of an aqueous solution prepared by adjusting L-lysine monohydrochloride to a final concentration of 1.35 M was added to a 1000 ml flask. Next, various vitamin B6 shown in Table 2 were added to a final concentration of 0.05 mM. Lastly, the purified recombinant L-lysine decarboxylase obtained in Reference Example 1 (3) was added to a final concentration of 50 mg / L to act. After reacting at 45 ° C. for 48 hours, the concentration of cadaverine contained in the reaction solution was measured. Table 2 shows the results.
[0082]
[Table 2]

[0083]
As a result, cadaverine was obtained at a higher yield by adding vitamin B6 to the aqueous L-lysine salt solution.
[0084]
Examples 8 to 11 (Effects of Reaction Stopping Conditions)
500 ml of an aqueous solution prepared by adding L-lysine monohydrochloride to a final concentration of 1.35 M was added to a 1000 ml flask. Next, pyridoxal phosphate monohydrate was added to a final concentration of 0.05 mM. Finally, the purified recombinant L-lysine decarboxylase obtained in Reference Example 1 (3) was added to a final concentration of 50 mg / L, and allowed to act at 45 ° C. The residual L-lysine concentration was constantly measured by HPLC, and when the residual L-lysine concentration shown in Table 3 was reached, the reaction solution was heated to 80 ° C. to stop the reaction. Sodium hydroxide was added to these reaction solutions to adjust the pH of the reaction solution to 13 or more. Next, chloroform was added in the same amount as the reaction solution, and cadaverine was extracted into the chloroform phase. Finally, cadaverine was isolated by vacuum distillation (30 mmHg, 80 ° C.) of the chloroform phase. Table 3 summarizes the purification yields in this isolation operation.
[0085]
[Table 3]

[0086]
As a result, cadaverine was obtained at a high purification yield by isolating cadaverine from the reaction solution in which the L-lysine salt concentration was 20% or less of the charged concentration as a reaction termination condition.
[0087]
Examples 12 to 16 (Effect of Purification State of L-Lysine Decarboxylase Obtained)
The JM109 / pLDC1 strain obtained by the method shown in Reference Example 1 was cultured and purified as shown in Table 4. The JM109 / pTM16 strain in which L-lysine decarboxylase was localized on the cell surface was also cultured. As a comparative example, the JM109 / pTV118N strain obtained by the method shown in Reference Example 1 was also cultured.
[0088]
500 ml of an aqueous solution prepared by adding L-lysine monohydrochloride to a final concentration of 1.35 M was added to a 1000 ml flask. Next, pyridoxal phosphate monohydrate was added to a final concentration of 0.05 mM. Finally, JM109 / pTV118N cells (Comparative Example 2), JM109 / pLDC1 cells (Example 12) and JM109 / pTM16 cells (Example 16) were obtained from a 270 ml culture (L-lysine). The final concentration of the recombinant L-lysine decarboxylase (Examples 13, 14, 15) in each purified state shown in Table 4 was determined by adding the decarboxylase concentration to the final concentration of 50 mg / L. It was added to 50 mg / L and acted at 45 ° C. FIG. 3 shows the results of measuring the concentration of cadaverine over time. In addition, the cadaverine yield and the cadaverine production rate at the time when the reaction did not progress were determined, and are shown in Table 5 and FIG.
[0089]
[Table 4]

[0090]
[Table 5]

[0091]
As a result, cadaverine was obtained at a high production rate and a high yield by purifying the recombinant L-lysine decarboxylase. In addition, cadaverine was obtained at a high production rate and a high yield by localizing L-lysine decarboxylase on the cell surface.
[0092]
Reference Example 2 (Preparation of cadaverine by existing chemical synthesis method)
20 g of L-lysine monohydrochloride (manufactured by Fluka) and 100 ml of cyclohexanol (manufactured by Sigma-Aldrich Japan) are suspended in the suspension, followed by 21.2 ml of a 28% sodium methoxide / methanol solution (manufactured by Sigma-Aldrich Japan) and 2-cyclohexene-1-. 1 ml (manufactured by Sigma-Aldrich Japan) was added, and the mixture was heated and stirred at 155 ° C for 3 hours. After completion of the reaction, 20 ml of an isopropanol solution (manufactured by Sigma-Aldrich Japan) containing 4 g of hydrogen chloride (manufactured by Sigma-Aldrich Japan) was added to the reaction mixture, and the precipitated product was collected and dried to obtain cadaverine dihydrochloride ( The method described in Example 3 of JP-B-4-10452). Cadaverine dihydrochloride was converted to cadaverine by adding an aqueous solution of sodium hydroxide to this aqueous solution, extracted with chloroform, and distilled under reduced pressure (30 mmHg, 80 ° C.) to obtain cadaverine.
[0093]
Examples 17 to 21 Comparative Example 3 (Identification of impurities)
Cadaverine was isolated from each of the reaction solutions obtained in Examples 12 to 16 by the purification method described in Examples 8 to 11. The impurities were analyzed by the GC-MS method under the following conditions, and the results of comparison with the impurity analysis of cadaverine (Comparative Example 3) prepared in Reference Example 2 are shown in Table 6.
GC / MS: HP6980 / HP5973A
Column: NUKOL 30m × 0.24mm D. 0.2μm Film
Oven: 120 ° C (constant)
InJ: 200 ° C. (Split 10: 1)
Flow: He 2.4 ml / min (const. Flow)
MS: 230 ° C (SCAN m / z = 30 to 400)
[0094]
[Table 6]

[0095]
As a result, by purifying cadaverine produced using L-lysine decarboxylase, the content of tri-n-butylamine that is toxic to aqueous organisms and reacts when contacted with acid is 0.006 wt% or less and High-purity cadaverine having a content of 2,3,4,5-tetrahydropyridine of 1.4% by weight or less was obtained.
[0096]
Reference Example 3 (Preparation of salt of cadaverine and adipic acid)
An aqueous solution obtained by dissolving 10.3 g of cadaverine of Example 15 in 25 g of water was immersed in a water bath at 40 ° C. and stirred. About 1 g of adipic acid (manufactured by Kirk) was added. Approximately 0.2 g was added, and the pH change of the aqueous solution with respect to the added amount of adipic acid was examined. The neutralization point was found to be 8.66. A 50 wt% aqueous solution of equimolar salts of cadaverine and adipic acid was prepared so that the pH was 8.66.
[0097]
Reference Example 4 (Preparation of salt of cadaverine and adipic acid)
An aqueous solution prepared by dissolving 10.3 g of cadaverine of Reference Example 2 in 25 g of water was immersed in a water bath at 40 ° C. and stirred, and about 1 g of adipic acid (manufactured by Kirk) was added. Approximately 0.2 g was added, and the pH change of the aqueous solution with respect to the added amount of adipic acid was examined. The neutralization point was found to be pH 8.72. A 50 wt% aqueous solution of equimolar salts of cadaverine and adipic acid was prepared so that the pH was 8.72.
[0098]
Example 22 (Synthesis of polyamide)
50.0 g of a 50 wt% aqueous solution of an equimolar salt of cadaverine and adipic acid prepared in Reference Example 3 was charged into a test tube, placed in an autoclave, sealed, and replaced with nitrogen. The jacket temperature was set at 265 ° C. and heating was started. After the pressure in the can reached 17.5 kg / cm 2, the pressure in the can was maintained at 17.5 kg / cm 2 for 3 hours. Thereafter, the jacket temperature was set at 275 ° C., and the pressure in the can was released to normal pressure over 2 hours. Thereafter, when the temperature in the can reached 245 ° C, the heating was stopped. After cooling to room temperature, the test tube was taken out of the autoclave to obtain a polyamide.
[0099]
Comparative Example 4
A polyamide was obtained in exactly the same manner as in Example 22, except that 50.0 g of a 50 wt% aqueous solution of an equimolar salt of cadaverine and adipic acid prepared in Reference Example 4 was used.
[0100]
Example 23 (Evaluation of polyamide)
The polyamide obtained in Example 22 and the polyamide obtained in Comparative Example 4 were comparatively evaluated by the following method. Table 7 shows the results.
[0101]
[Quantification of 2,3,4,5-tetrahydropyridine and tri-n-butylamine in polyamide (GC-MS)]
About 15 g of polyamide was precisely weighed and subjected to Soxhlet extraction with methanol. The extract was subjected to GC-MS analysis under the following conditions, and the 2,3,4,5-tetrahydropyridine and tri-n contained in the polyamide were analyzed. -Butylamine was quantified.

[0102]
[DSC (Differential Scanning Calorimetry)]
About 5 mg of polyamide was sampled under a nitrogen atmosphere using a robot DSCRDC220 manufactured by Seiko Denshi Kogyo and measured under the following conditions.
After the temperature was raised to the melting point + 25 ° C. and held for 3 minutes to completely melt the polyamide, the temperature was lowered to 30 ° C. at a temperature lowering rate of 20 ° C./min, and after holding for 3 minutes, from 30 ° C. to the melting point + 25 ° C. The temperature of the endothermic peak and the calorific value observed when the temperature was raised at a rate of 20 ° C./min were determined.
[0103]
[Relative viscosity (ηr)]
The measurement was performed using an Ostwald viscometer at a concentration of 0.01 g / ml and 25 ° C. in 98% sulfuric acid.
[0104]
[Melting retention test]
About 5 g of polyamide was charged into a test tube, immersed in a silicon bath having a melting point of + 20 ° C. in a nitrogen atmosphere, and allowed to stand for 30 minutes after the polyamide was completely melted. Then, the polyamide was recovered and the relative viscosity was measured. .
[0105]
[Table 7]

[0106]
As a result, by using the high-purity cadaverine obtained by the method of the present invention, a polyamide having a high relative viscosity (ηr) retention rate (high heat resistance) was obtained.
[0107]
【The invention's effect】
According to the present invention, there are provided a method for industrially producing cadaverine and a method for isolating cadaverine with high reaction yield, high purification yield, high production rate, high concentration and high purity.
[0108]
[Sequence list]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows a physical map of L-lysine decarboxylase intracellular expression vector pLDC1.
FIG. 2 shows a physical map of L-lysine decarboxylase cell surface expression vector pTM16.
FIG. 3 is a graph showing the relationship between time and cadaverine production in Examples 12 to 16 and Comparative Example 2.

Claims

A method for producing cadaverine, comprising reacting L-lysine decarboxylase with an aqueous L-lysine salt solution to isolate cadaverine from the reaction solution.

The method for producing cadaverine according to claim 1, wherein the L-lysine salt is any of a hydrochloride, a sulfate, an acetate, a nitrate, and a carbonate.

The method for producing cadaverine according to claim 1, wherein the L-lysine salt is a monohydrochloride.

The method for producing cadaverine according to any one of claims 1 to 3, wherein vitamin B6 is added.

The method for producing cadaverine according to claim 4, wherein the vitamin B6 is pyridoxal phosphate.

The cadaverine is isolated from a reaction solution in which the concentration of the L-lysine salt has become 20% or less of the charged concentration after the action of L-lysine decarboxylase. A method for producing cadaverine according to the above.

The method for producing cadaverine according to any one of claims 1 to 6, wherein the L-lysine decarboxylase is derived from the genus Escherichia.

The cadaverine according to any one of claims 1 to 7, wherein the L-lysine decarboxylase is L-lysine decarboxylase contained in a lysate of cells having L-lysine decarboxylase activity. Production method.

The method for producing cadaverine according to any one of claims 1 to 7, wherein the L-lysine decarboxylase is a partially purified L-lysine decarboxylase.

The method for producing cadaverine according to any one of claims 1 to 7, wherein the L-lysine decarboxylase is an isolated and purified L-lysine decarboxylase.

The method for producing cadaverine according to any one of claims 1 to 7, wherein the L-lysine decarboxylase is L-lysine decarboxylase localized on the cell surface.

The cadaverine according to any one of claims 1 to 11, wherein the L-lysine decarboxylase is a recombinant L-lysine decarboxylase having 1 to 30 amino acids added to the N-terminal amino acid sequence. Production method.

13. The method for producing cadaverine according to claim 12, wherein the L-lysine decarboxylase is a recombinant L-lysine decarboxylase having 6 to 10 histidine residues added to the N-terminal amino acid sequence.

The method for producing cadaverine according to any one of claims 1 to 13, wherein the reaction solution after the reaction is adjusted to pH 12 to 14 with an alkali, and cadaverine is extracted with a polar organic solvent.

The method for producing cadaverine according to claim 14, wherein the alkali is any one of sodium hydroxide, potassium hydroxide, and calcium hydroxide.

The method for producing cadaverine according to claim 14, wherein the polar organic solvent is any of aniline, cyclohexanone, 1-octanol, isobutyl alcohol, cyclohexanol, and chloroform.

Cadaverine having a content of 2,3,4,5-tetrahydropyridine of 1.4% by weight or less.

Cadaverine having a tri-n-butylamine content of 0.006 wt% or less.

Cadaverine having a content of 2,3,4,5-tetrahydropyridine of 1.4% by weight or less and a content of tri-n-butylamine of 0.006% or less.

A cadaverine obtained by the method according to any one of claims 1 to 16 or a polyamide containing cadaverine according to any one of claims 17 to 19 as a raw material.