JP6015735B2 - Fine particle measuring device - Google Patents
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Description
本技術は、細胞等の微小粒子の特性を光学的に測定する微小粒子測定装置に関する。 The present technology relates to a microparticle measuring apparatus that optically measures the characteristics of microparticles such as cells.
フローサイトメータは、フローセルを通流する細胞やビーズなどの微小粒子に光を照射し、微小粒子から発せられる蛍光及び散乱光などを検出することによって、各微小粒子の特性を光学的に測定する装置である。 A flow cytometer optically measures the characteristics of each microparticle by irradiating the microparticles such as cells and beads flowing through the flow cell with light and detecting fluorescence and scattered light emitted from the microparticles. Device.
例えば細胞の蛍光を検出する場合、蛍光色素により標識した細胞にレーザー光などの適当な波長かつ強度を有する励起光を照射する。そして、蛍光色素から発せられる蛍光をレンズなどで集光し、フィルタ又はダイクロイックミラーなどの波長選択素子を用いて適当な波長域の光を選択し、選択された光をＰＭＴ（photo multiplier tube）などの受光素子を用いて検出する。このとき、波長選択素子と受光素子とを複数組み合わせることによって、細胞に標識された複数の蛍光色素からの蛍光を同時に検出し、解析することも可能である。更に、複数波長の励起光を組み合わせることで解析可能な蛍光色素の数を増やすこともできる。 For example, when detecting fluorescence of cells, cells labeled with a fluorescent dye are irradiated with excitation light having an appropriate wavelength and intensity such as laser light. Then, the fluorescence emitted from the fluorescent dye is collected by a lens or the like, light of an appropriate wavelength range is selected using a wavelength selection element such as a filter or a dichroic mirror, and the selected light is PMT (photo multiplier tube) or the like. The light receiving element is used for detection. At this time, it is also possible to simultaneously detect and analyze fluorescence from a plurality of fluorescent dyes labeled on cells by combining a plurality of wavelength selection elements and light receiving elements. Furthermore, the number of fluorescent dyes that can be analyzed can be increased by combining excitation light with a plurality of wavelengths.
フローサイトメータにおける蛍光検出には、フィルタなどの波長選択素子を用いて不連続な波長域の光を複数選択し、各波長域の光の強度を計測する方法の他に、連続した波長域における光の強度を蛍光スペクトルとして計測する方法もある。蛍光スペクトルの計測が可能なスペクトル型フローサイトメータでは、微小粒子から発せられる蛍光を、プリズム又はグレーティングなどの分光素子を用いて分光する。そして、分光された蛍光を、検出波長域幅が異なる複数の受光素子が配列された受光素子アレイを用いて検出する。受光素子アレイには、ＰＭＴ又はフォトダイオードなどの受光素子を一次元に配列したＰＭＴアレイ又はフォトダイオードアレイ、あるいはＣＣＤ又はＣＭＯＳなどの２次元受光素子などの独立した検出チャネルが複数並べられたものが用いられている。 For fluorescence detection in a flow cytometer, in addition to the method of selecting multiple light in the discontinuous wavelength range using a wavelength selection element such as a filter and measuring the light intensity in each wavelength range, in the continuous wavelength range There is also a method for measuring the intensity of light as a fluorescence spectrum. In a spectral flow cytometer capable of measuring a fluorescence spectrum, the fluorescence emitted from fine particles is dispersed using a spectroscopic element such as a prism or a grating. Then, the dispersed fluorescence is detected using a light receiving element array in which a plurality of light receiving elements having different detection wavelength band widths are arranged. In the light receiving element array, a plurality of independent detection channels such as a PMT array or a photodiode array in which light receiving elements such as a PMT or a photodiode are arranged one-dimensionally or a two-dimensional light receiving element such as a CCD or a CMOS are arranged. It is used.
フローサイトメータにおける計測値には様々な要因による誤差が含まれている。測定誤差の補正方法としては、例えば、蛍光特性が既知の標準サンプルを用いた方法が汎用されている。この方法は、標準サンプルを複数計測して得た基準値をもとに各受光素子について電流などの出力値と蛍光強度との関係（キャリブレーション情報）を取得し、この関係に基づいて計測値をキャリブレーションするものである。 The measurement value in the flow cytometer includes errors due to various factors. As a measurement error correction method, for example, a method using a standard sample with known fluorescence characteristics is widely used. This method obtains the relationship (calibration information) between the output value such as current and fluorescence intensity for each light receiving element based on the reference value obtained by measuring multiple standard samples, and the measured value based on this relationship Is to calibrate.
上記の補正方法では、フローサイトメータによる測定の都度に標準サンプルを計測し、レーザー光の出力や受光素子の設定値（例えばＰＭＴであれば電圧など）に応じたキャリブレーション情報を取得する必要があり、非常に煩雑であった。 In the above correction method, it is necessary to measure a standard sample every time measurement is performed with a flow cytometer, and to acquire calibration information according to the output of the laser light and the set value of the light receiving element (for example, voltage in the case of PMT). It was very complicated.
そこで、本技術は、測定誤差を簡便な処理によって補正可能な微小粒子測定装置を提供することを主な目的とする。 Accordingly, the main object of the present technology is to provide a fine particle measuring apparatus capable of correcting measurement errors by simple processing.
上記課題解決のため、本技術は、微小粒子からの蛍光を複数の受光素子で検出する検出部と、
前記複数の受光素子で検出された蛍光強度値に基づいてスペクトルデータを生成する処理部と、
を少なくとも有する微小粒子測定装置であって、
前記複数の受光素子は、少なくとも２以上の異なる検出波長域幅を有し、
前記処理部は、前記複数の受光素子の各々で検出された各蛍光強度値を各受光素子が有する検出波長域幅に基づき補正処理した補正強度値を用いて、前記スペクトルデータを生成する、微小粒子測定装置を提供する。
本技術では、前記検出部において、前記蛍光強度値を生成することができる。
また、本技術では、前記処理部は、前記複数の受光素子の各々で検出された各蛍光強度値を各受光素子が有する感度データに基づき補正処理した補正強度値を用いて、前記スペクトルデータを生成することもできる。加えて、前記処理部は、前記複数の受光素子の各々で検出された各蛍光強度値を各受光素子が有する相対感度に基づき補正処理した補正強度値を用いて、前記スペクトルデータを生成することもできる。
更に、本技術では、前記処理部は、前記複数の受光素子の各々で検出された各蛍光強度値を各受光素子が有する検出波長域幅及び感度データに基づき補正処理した補正強度値を用いて、前記スペクトルデータを生成することができる。
加えて、本技術では、前記処理部は、前記スペクトルデータを基準スペクトルデータと比較し、前記スペクトルデータを評価することができる。また、前記処理部は、前記スペクトルデータに対して少なくとも一つの蛍光色素から得られた基準スペクトルデータに基づくコンペンセーション処理を行い、前記蛍光色素に基づく情報を特定することもできる。更に、前記処理部は、前記スペクトルデータに対して前記微小粒子に含まれる複数の蛍光色素から得られた基準スペクトルデータに基づき最小二乗法を用いたコンペンセーション処理を行い、前記複数の蛍光色素に基づく情報を特定することもできる。加えて、前記処理部は、第一の軸を前記複数の受光素子の検出波長、第二の軸を蛍光強度値とし、前記スペクトルデータをプロットしたスペクトルチャートを生成することもできる。
本技術に係る微小粒子測定装置は、前記スペクトルチャートを表示する表示部を更に有することができる。
また、本技術では、微小粒子からの蛍光より複数の受光素子で検出された蛍光強度値に基づいてスペクトルデータを生成する処理部、を少なくとも有する情報処理装置であって、
前記複数の受光素子は、少なくとも２以上の異なる検出波長域幅を有し、
前記処理部は、前記複数の受光素子の各々で検出された蛍光強度値を各受光素子が有する検出波長域幅に基づき補正処理した補正強度値を用いて、前記スペクトルデータを生成する、情報処理装置も提供する。
更に、本技術では、微小粒子からの蛍光を複数の受光素子で検出し、前記複数の受光素子で検出された蛍光強度値に基づいてスペクトルデータを生成するデータ解析方法であって、
前記複数の受光素子は、少なくとも２以上の異なる検出波長域幅を有し、
前記複数の受光素子の各々で検出された蛍光強度値は、各受光素子が有する検出波長域幅に基づき補正処理し、前記スペクトルデータの生成に用いられる、データ解析方法も提供する。
For the above problems solved, the present technique, a detector for detecting the fluorescence from the fine particles by a plurality of light receiving elements,
A processing unit that generates spectral data based on the detected fluorescence intensity values at said plurality of light receiving elements,
A microparticle measuring device having at least
The plurality of light receiving elements have at least two different detection wavelength band widths,
Wherein the processing unit uses the correction intensity values of each fluorescence intensity value detected at each and correction processing based on the detected wavelength band width having the light receiving elements of the plurality of light receiving elements, and generates the spectral data, A fine particle measuring apparatus is provided.
In this technique, in the detection unit can generate a pre Kihotaru light intensity value.
Further, in the present technique, the pre-Symbol processor, using the correction intensity value correction processing based on the respective fluorescence intensity values detected by each of the plurality of light receiving elements in the sensitivity data having the respective light receiving elements, the spectrum Data can also be generated. In addition, the processing unit uses the correction intensity values of each fluorescence intensity value detected at each and correction processing based on the relative sensitivity with the respective light receiving elements of the plurality of light receiving elements, and generates the spectral data You can also
Furthermore, in this technique, the processing unit, using a correction intensity value correction processing based on the respective fluorescence intensity values detected by each of the plurality of light receiving elements to detect the wavelength region width and sensitivity data included in the respective light receiving elements Thus, the spectrum data can be generated.
In addition, in the present technology, the processing unit can compare the spectrum data with reference spectrum data and evaluate the spectrum data. The processing unit may perform compensation processing based on reference spectral data obtained from at least one fluorescent dye on the spectral data, and specify information based on the fluorescent dye. Furthermore, the processing unit performs a compensation process using a least square method on the spectral data based on reference spectral data obtained from a plurality of fluorescent dyes included in the microparticles, and applies the plurality of fluorescent dyes to the plurality of fluorescent dyes. Based on the information can also be specified. In addition, the processing unit can also detect the wavelength of the first axis said plurality of light receiving elements, the second axis and fluorescence intensity value, to produce a spectrum chart obtained by plotting the spectral data.
The microparticle measurement apparatus according to the present technology may further include a display unit that displays the spectrum chart.
Also, in this technique, a least with the information processing apparatus processing unit, for generating spectral data on the basis of the fluorescence intensity values detected by the plurality of light receiving elements than fluorescent light from the microparticle,
The plurality of light receiving elements have at least two different detection wavelength band widths,
Wherein the processing unit uses the correction intensity value correction processing based on each detected fluorescence intensity values of said plurality of light receiving elements to detect the wavelength region width included in each light receiving element, to generate the spectral data, information A processing device is also provided.
Furthermore, in this technique, to detect the fluorescence from the fine particles by a plurality of light receiving elements, a data analysis method for generating spectral data on the basis of the detected fluorescence intensity values at said plurality of light receiving elements,
The plurality of light receiving elements have at least two different detection wavelength band widths,
Each detected fluorescence intensity values of said plurality of light receiving elements, and correction processing based on the detected wavelength band width each light receiving element having the used for generating spectral data, also provides data analysis method.
本技術において、「微小粒子」には、細胞や微生物、リポソームなどの生体関連微小粒子、あるいはラテックス粒子やゲル粒子、工業用粒子などの合成粒子などが広く含まれるものとする。 In the present technology, “microparticles” widely include living body-related microparticles such as cells, microorganisms, and liposomes, or synthetic particles such as latex particles, gel particles, and industrial particles.
生体関連微小粒子には、各種細胞を構成する染色体、リポソーム、ミトコンドリア、オルガネラ（細胞小器官）などが含まれる。細胞には、動物細胞（血球系細胞など）及び植物細胞が含まれる。微生物には、大腸菌などの細菌類、タバコモザイクウイルスなどのウイルス類、イースト菌などの菌類などが含まれる。更に、生体関連微小粒子には、核酸やタンパク質、これらの複合体などの生体関連高分子も包含され得るものとする。また、工業用粒子は、例えば有機もしくは無機高分子材料、金属などであってもよい。有機高分子材料には、ポリスチレン、スチレン・ジビニルベンゼン、ポリメチルメタクリレートなどが含まれる。無機高分子材料には、ガラス、シリカ、磁性体材料などが含まれる。金属には、金コロイド、アルミなどが含まれる。これら微小粒子の形状は、一般には球形であるのが普通であるが、非球形であってもよく、また大きさや質量なども特に限定されない。 Biologically relevant microparticles include chromosomes, liposomes, mitochondria, organelles (organelles) that constitute various cells. The cells include animal cells (such as blood cells) and plant cells. Microorganisms include bacteria such as Escherichia coli, viruses such as tobacco mosaic virus, and fungi such as yeast. Furthermore, biologically relevant microparticles may include biologically relevant polymers such as nucleic acids, proteins, and complexes thereof. The industrial particles may be, for example, an organic or inorganic polymer material, a metal, or the like. Organic polymer materials include polystyrene, styrene / divinylbenzene, polymethyl methacrylate, and the like. Inorganic polymer materials include glass, silica, magnetic materials, and the like. Metals include gold colloid, aluminum and the like. The shape of these fine particles is generally spherical, but may be non-spherical, and the size and mass are not particularly limited.
本技術により、サンプル解析の都度に標準サンプルを計測しなくとも、測定誤差を補正して正確な解析結果を得ることが可能な微小粒子測定装置が提供される。 According to the present technology, there is provided a fine particle measuring apparatus capable of correcting a measurement error and obtaining an accurate analysis result without measuring a standard sample every time a sample analysis is performed.
以下、本技術を実施するための好適な形態について図面を参照しながら説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本技術の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本技術の範囲が狭く解釈されることはない。説明は以下の順序で行う。
１．第一実施形態に係る微小粒子測定装置
（１）装置の構成
（２）蛍光強度の補正処理
［第一の補正強度値の算出］
［第二の補正強度値の算出］
（３）データ表示
（４）データ解析
２．第二実施形態に係る微小粒子測定装置
（１）装置の構成
（２）蛍光強度の補正処理
［第一の補正強度値の算出］
［第二の補正強度値の算出］
（３）データ表示
Hereinafter, preferred embodiments for carrying out the present technology will be described with reference to the drawings. In addition, embodiment described below shows an example of typical embodiment of this technique, and, thereby, the scope of this technique is not interpreted narrowly. The description will be made in the following order.
1. 1. Fine particle measuring apparatus according to the first embodiment (1) Configuration of apparatus (2) Fluorescence intensity correction process [Calculation of first corrected intensity value]
[Calculation of second corrected intensity value]
(3) Data display (4) Data analysis Microparticle Measurement Device (1) Configuration of Second Embodiment (1) Device Configuration (2) Fluorescence Intensity Correction Processing [Calculation of First Correction Intensity Value]
[Calculation of second corrected intensity value]
(3) Data display
１．第一実施形態に係る微小粒子測定装置
（１）装置の構成
図１は、本技術の第一実施形態に係る微小粒子測定装置Ａの機能的構成を説明するブロック図である。また、図２は、微小粒子測定装置Ａの検出部１０の構成を説明する模式図である。
1. Configuration of Microparticle Measurement Device (1) Device According to First Embodiment FIG. 1 is a block diagram illustrating a functional configuration of a microparticle measurement device A according to the first embodiment of the present technology. FIG. 2 is a schematic diagram illustrating the configuration of the detection unit 10 of the microparticle measurement apparatus A.
微小粒子測定装置Ａは、微小粒子に対してレーザー光を照射して、微小粒子から発せられる蛍光を検出し、検出された蛍光の強度を電気信号に変換して出力する検出部１０と、ＣＰＵ２０、メモリ３０及びハードディスク（記憶部）４０と、を含む。微小粒子測定装置Ａにおいて、ＣＰＵ２０、メモリ３０及びハードディスク（記憶部）４０は処理部を構成する。また、微小粒子測定装置Ａは、ユーザインターフェースとして、マウス５１及びキーボード５２と、ディスプレイ６１及びプリンタ６２を含んで構成される表示部６０と、を含む。 The microparticle measuring apparatus A irradiates the microparticles with laser light, detects fluorescence emitted from the microparticles, converts the intensity of the detected fluorescence into an electric signal, and outputs the detected signal, and the CPU 20. , Memory 30 and hard disk (storage unit) 40. In the fine particle measuring apparatus A, the CPU 20, the memory 30, and the hard disk (storage unit) 40 constitute a processing unit. The fine particle measuring apparatus A includes a mouse 51 and a keyboard 52, and a display unit 60 including a display 61 and a printer 62 as user interfaces.
検出部１０は、従来の微小粒子測定装置と同様の構成とできる。具体的には、光源１０１からのレーザー光を微小粒子Ｐに対して集光・照射する照射系と、微小粒子Ｐから発生する蛍光を分光する分光素子１０２と分光された光を検出する受光素子アレイ１０３とを含む検出系と、から構成される。微小粒子測定装置Ａにおいて、微小粒子Ｐは、フローセル内又はマイクロチップに形成された流路内を一列に配列されて通流される。 The detection unit 10 can have the same configuration as that of a conventional fine particle measuring apparatus. Specifically, an irradiation system for condensing and irradiating laser light from the light source 101 to the microparticles P, a spectroscopic element 102 for spectroscopically splitting fluorescence generated from the microparticles P, and a light receiving element for detecting the spectroscopic light And a detection system including the array 103. In the microparticle measuring apparatus A, the microparticles P are arranged in a line and flow through the flow cell or the flow path formed in the microchip.
照射系は、光源１０１の他、微小粒子Ｐに対してレーザー光を集光・照射するための集光レンズ、ダイクロイックミラー及びバンドパスフィルター等（不図示）からなる。なお光源１０１は、互いに異なる波長を発光する光源を２つ以上組み合わせたものでもよく、その場合２つ以上のレーザー光が微小粒子Ｐを照射する場所は、同一であっても異なっていても構わない。また、検出系は、微小粒子Ｐから発生する蛍光を集光し、分光素子１０２に導光するための集光レンズ等（不図示）を含んでいてもよい。ここでは、受光素子アレイ１０３として、検出波長域幅が異なる３２チャネルのＰＭＴ（photo multiplier tube）を一次元に配列したＰＭＴアレイを用いた構成を例示した。なお、受光素子アレイ１０３には、フォトダイオードアレイ、あるいはＣＣＤ又はＣＭＯＳなどの２次元受光素子などの検出波長域幅が異なる独立した検出チャネルが複数並べられたものも用いることができる。 The irradiation system includes, in addition to the light source 101, a condensing lens for condensing and irradiating the fine particles P with laser light, a dichroic mirror, a bandpass filter, and the like (not shown). The light source 101 may be a combination of two or more light sources that emit different wavelengths. In this case, the location where the two or more laser beams irradiate the microparticles P may be the same or different. Absent. Further, the detection system may include a condensing lens or the like (not shown) for condensing the fluorescence generated from the fine particles P and guiding it to the spectroscopic element 102. Here, the configuration using a PMT array in which 32-channel PMTs (photo multiplier tubes) having different detection wavelength band widths are arranged one-dimensionally is illustrated as the light receiving element array 103. The light receiving element array 103 may be a photodiode array or a two-dimensional light receiving element such as a CCD or CMOS in which a plurality of independent detection channels having different detection wavelength band widths are arranged.
微小粒子測定装置Ａにおいて、検出部１０は、蛍光の他、レーザー光の照射によって微小粒子Ｐから発生する光であって、例えば前方散乱光、側方散乱光、レイリー散乱及びミー散乱等の散乱光なども検出するように構成してもよい。 In the microparticle measurement apparatus A, the detection unit 10 is light generated from the microparticles P by irradiation with laser light in addition to fluorescence, and is, for example, scattering such as forward scattered light, side scattered light, Rayleigh scattering, and Mie scattering. You may comprise so that light etc. may be detected.
（２）蛍光強度の補正処理
ＣＰＵ２０及びメモリ３０は、ハードディスク４０に格納された蛍光強度補正プログラム４１とＯＳ４３と共働して、検出部１０から出力される電気信号に基づき、蛍光の強度値の補正処理を行う。この補正処理は、蛍光の強度値を各受光素子（ここではチャネル１〜３２のＰＭＴ）の検出波長域幅で補正して第一の補正強度値を算出するステップと、第一の補正強度値を各ＰＭＴの感度データを用いて補正して第二の補正強度値を算出するステップとを含む。
(2) Correction Processing of Fluorescence Intensity The CPU 20 and the memory 30 cooperate with the fluorescence intensity correction program 41 stored in the hard disk 40 and the OS 43 to calculate the fluorescence intensity value based on the electric signal output from the detection unit 10. Perform correction processing. The correction processing includes a step of calculating the first correction intensity value by correcting the fluorescence intensity value with the detection wavelength band width of each light receiving element (here, the PMTs of the channels 1 to 32), and the first correction intensity value. And calculating the second corrected intensity value by using the sensitivity data of each PMT.
［第一の補正強度値の算出］
第一の補正強度値の算出は、各ＰＭＴで取得された蛍光の強度値を、それぞれのＰＭＴの検出波長域幅で除すことにより行われる。
[Calculation of first corrected intensity value]
The calculation of the first corrected intensity value is performed by dividing the fluorescence intensity value acquired by each PMT by the detection wavelength band width of each PMT.
具体的には、チャネル１〜３２のＰＭＴのうち、チャネルｋのＰＭＴで得られたｎ番目の強度値をＩ［ｋ、ｎ］とし、チャネルｋのＰＭＴの検出下限波長をＬ［ｋ］かつ検出上限波長をＨ［ｋ］とする。この場合、第一の補正強度値Ｊ１［ｋ、ｎ］は、次の式により算出される。ここで、ｋは１〜３２の整数を表す。
Ｊ１［ｋ、ｎ］＝Ｉ［ｋ、ｎ］／（Ｈ［ｋ］−Ｌ［ｋ］）
Specifically, among the PMTs of channels 1 to 32, the nth intensity value obtained by the PMT of channel k is I [k, n], the detection lower limit wavelength of the PMT of channel k is L [k], and Let the detection upper limit wavelength be H [k]. In this case, the first corrected intensity value J 1 [k, n] is calculated by the following equation. Here, k represents an integer of 1 to 32.
J 1 [k, n] = I [k, n] / (H [k] −L [k])
チャネル１〜３２のＰＭＴで検出される光の波長域幅は、分光素子１０２を含む検出部１０の光学系が非線形性を有している場合、各ＰＭＴ間で異なった幅となる（後掲の図５参照）。このため、各ＰＭＴで取得される蛍光の強度値は、検出波長域幅が広いチャネルでは相対的に高く、検出波長域幅が狭いチャネルでは相対的に低くなり、このことが測定誤差の要因となる。 When the optical system of the detection unit 10 including the spectroscopic element 102 has nonlinearity, the wavelength band width of light detected by the PMTs of the channels 1 to 32 is different between the PMTs (described later). FIG. 5). For this reason, the intensity value of the fluorescence acquired by each PMT is relatively high in a channel with a wide detection wavelength band, and relatively low in a channel with a narrow detection wavelength band, which is a cause of measurement error. Become.
特に、分光素子１０２により分光された蛍光を受光素子アレイ１０３を用いて検出し、微小粒子Ｐの蛍光スペクトルを計測する場合、各ＰＭＴで取得される蛍光の強度値をそのまま用いた蛍光スペクトルでは、上記測定誤差によってスペクトル形状に歪みが生じる。すなわち、横軸をチャネル番号、縦軸を強度値とした２次元グラフ（以下、「スペクトルチャート」と称する）を、横軸を検出波長、縦軸を強度値としたスペクトルチャートと比較すると、前者では検出波長域幅が広いチャネルほど強度値が相対的に大きくなる。このため、両者の蛍光スペクトル形状は一致せず、ずれが生じることとなる。 In particular, when the fluorescence dispersed by the spectroscopic element 102 is detected using the light receiving element array 103 and the fluorescence spectrum of the microparticle P is measured, in the fluorescence spectrum using the fluorescence intensity value acquired by each PMT as it is, The measurement error causes distortion in the spectrum shape. That is, when comparing a two-dimensional graph (hereinafter referred to as a “spectrum chart”) having a channel number on the horizontal axis and an intensity value on the vertical axis with a spectrum chart having the detected wavelength on the horizontal axis and the intensity value on the vertical axis, the former Then, a channel with a wider detection wavelength band has a relatively large intensity value. For this reason, both fluorescence spectrum shapes do not correspond, and a shift | offset | difference arises.
各ＰＭＴで取得された蛍光の強度値をそれぞれのＰＭＴの検出波長域幅で除して得られる第一の補正強度値では、このような光学系の非線形性に起因した測定誤差を補償することが可能となる。 The first correction intensity value obtained by dividing the fluorescence intensity value acquired by each PMT by the detection wavelength band width of each PMT compensates the measurement error due to such nonlinearity of the optical system. Is possible.
各ＰＭＴの検出波長域幅（Ｈ［ｋ］−Ｌ［ｋ］）は、検出部１０を構成する分光素子１０２、集光レンズ、ダイクロイックミラー及びバンドパスフィルターなどの光学素子の種類や配置によって一意に決定される（後掲の図５参照）。このため、光学素子の選定及び配置を含む装置設計が完了した段階で、各ＰＭＴの検出波長域幅を取得しておくことで、各ＰＭＴで取得された蛍光の強度値から第一の補正強度値を算出することが可能となる。 The detection wavelength band width (H [k] -L [k]) of each PMT is unique depending on the type and arrangement of optical elements such as the spectroscopic element 102, the condensing lens, the dichroic mirror, and the band pass filter that constitute the detection unit 10. (See FIG. 5 below). For this reason, when the device design including the selection and arrangement of the optical elements is completed, the first correction intensity is obtained from the intensity value of the fluorescence acquired by each PMT by acquiring the detection wavelength band width of each PMT. The value can be calculated.
［第二の補正強度値の算出］
第二の補正強度値の算出は、各ＰＭＴにおける第一の補正強度値を、それぞれのＰＭＴの相対感度で除すことにより行われる。
[Calculation of second corrected intensity value]
The calculation of the second correction intensity value is performed by dividing the first correction intensity value in each PMT by the relative sensitivity of each PMT.
具体的には、チャネル１〜３２のＰＭＴのうち、チャネルｋのＰＭＴの相対感度をＳ［ｋ］とする。この場合、第二の補正強度値Ｊ２［ｋ、ｎ］は、次の式により算出される。
Ｊ２［ｋ、ｎ］＝Ｊ１［ｋ、ｎ］／Ｓ［ｋ］
Specifically, among the PMTs of channels 1 to 32, the relative sensitivity of the PMT of channel k is S [k]. In this case, the second corrected intensity value J 2 [k, n] is calculated by the following equation.
J 2 [k, n] = J 1 [k, n] / S [k]
ここで、相対感度とは、同一強度及び同一波長の光をＰＭＴに照射して各チャネルで得られた強度値を、最も高い強度値が得られたチャネルの強度値に対する相対値により示したものである。相対感度は、同一強度及び同一波長の光をＰＭＴに照射した場合に各チャネルから出力される電気信号量を記録した感度データから予め算出しておくことができる。この感度データは、各ＰＭＴに内在する感度差と、ユーザによって各ＰＭＴに設定された感度差（ゲイン）の両方が反映されたものである。なお、ゲインは、ユーザが印加電圧などの設定値を変化させることによって適宜調整が可能である。 Here, the relative sensitivity is a value obtained by irradiating the PMT with light having the same intensity and the same wavelength and indicating the intensity value obtained in each channel by a relative value with respect to the intensity value of the channel from which the highest intensity value was obtained. It is. Relative sensitivity can be calculated in advance from sensitivity data that records the amount of electrical signal output from each channel when the PMT is irradiated with light of the same intensity and the same wavelength. This sensitivity data reflects both the sensitivity difference inherent in each PMT and the sensitivity difference (gain) set for each PMT by the user. The gain can be appropriately adjusted by the user changing a set value such as an applied voltage.
チャネル１〜３２のＰＭＴの感度は、ＰＭＴの個体差及びゲインの設定差によって、各ＰＭＴ間で異なる（後掲の図６参照）。このため、各ＰＭＴで取得される蛍光の強度値は、感度が高いチャネルでは相対的に高く、感度が低いチャネルでは相対的に低くなり、このことも測定誤差の要因となっている。 The PMT sensitivities of the channels 1 to 32 differ among the PMTs due to individual differences of PMTs and gain setting differences (see FIG. 6 described later). For this reason, the intensity value of the fluorescence acquired by each PMT is relatively high in a channel with high sensitivity and relatively low in a channel with low sensitivity, which also causes measurement errors.
特に、分光素子１０２により分光された蛍光を受光素子アレイ１０３を用いて検出し、微小粒子Ｐの蛍光スペクトルを計測する場合、各ＰＭＴで取得される蛍光の強度値をそのまま用いた蛍光スペクトルでは、上記測定誤差によってスペクトル形状に歪みが生じる。すなわち、感度が高いチャネルほど強度値が相対的に大きくなっているため、蛍光スペクトル形状がいびつとなり、不正確なものとなる。 In particular, when the fluorescence dispersed by the spectroscopic element 102 is detected using the light receiving element array 103 and the fluorescence spectrum of the microparticle P is measured, in the fluorescence spectrum using the fluorescence intensity value acquired by each PMT as it is, The measurement error causes distortion in the spectrum shape. That is, since the intensity value is relatively larger in the channel with higher sensitivity, the fluorescence spectrum shape becomes distorted and inaccurate.
各ＰＭＴにおける第一の補正強度値を、それぞれのＰＭＴの相対感度で除して得られる第二の補正強度値では、このような受光素子間の感度差に起因した測定誤差を補償することが可能となる。 The second correction intensity value obtained by dividing the first correction intensity value in each PMT by the relative sensitivity of each PMT can compensate for a measurement error due to such a sensitivity difference between the light receiving elements. It becomes possible.
（３）データ表示
ＣＰＵ２０、メモリ３０及びハードディスク４０を含んで構成される処理部は、算出された第一の補正強度値又は第二の補正強度値を座標軸としたスペクトルチャートを生成して、表示部６０に出力する。
(3) Data display The processing unit including the CPU 20, the memory 30, and the hard disk 40 generates and displays a spectrum chart using the calculated first correction intensity value or the second correction intensity value as coordinate axes. To the unit 60.
スペクトルチャートは、各ＰＭＴの検出波長を横軸にとり、第一の補正強度値を縦軸にとったものとできる（後掲の図８〜１２の（Ｂ）参照）。また、スペクトルチャートは、好ましくは、検出波長を横軸にとり、第二の補正強度値を縦軸にとったものとされる（後掲の図８〜１２の（Ｃ）参照）。 In the spectrum chart, the detection wavelength of each PMT is taken on the horizontal axis, and the first corrected intensity value is taken on the vertical axis (see FIGS. 8 to 12 (B) below). The spectrum chart preferably has the detection wavelength on the horizontal axis and the second corrected intensity value on the vertical axis (see (C) of FIGS. 8 to 12 described later).
スペクトルチャートには、所定の検出波長において所定の蛍光強度値で検出された微小粒子の数（イベント数あるいは密度）に基づいて、強度値を平均値や標準誤差、中央値、四分位点などの統計的な数値で表示することができる（後掲の図９参照）。更に、スペクトルチャートを、イベント数をとった座標軸を追加した３次元グラフとして表示することもでき、この３次元グラフを疑似３Ｄ表示することもできる。また、微小粒子の数（イベント数あるいは密度）に関する情報（頻度情報）を反映させた色相、彩度及び／又は明度によりスペクトルチャートを多色表示することも可能である（後掲の図８参照）。 The spectrum chart shows the average value, standard error, median, quartile, etc. based on the number of fine particles (number of events or density) detected at a given fluorescence intensity value at a given detection wavelength. (See FIG. 9 below). Furthermore, the spectrum chart can be displayed as a three-dimensional graph to which a coordinate axis taking the number of events is added, and this three-dimensional graph can also be displayed in a pseudo 3D manner. It is also possible to display the spectrum chart in multiple colors by hue, saturation and / or brightness reflecting information (frequency information) on the number of fine particles (number of events or density) (see FIG. 8 described later). ).
（４）データ解析
ＣＰＵ２０、メモリ３０及びハードディスク４０を含んで構成される処理部は、算出された第一の補正強度値又は第二の補正強度値を第一のパラメータ、各ＰＭＴの検出波長を第二のパラメータとするスペクトルデータを生成し、これを用いて各種の解析を実行することができる。ここで第一のパラメータは、計測を行った複数の微小粒子Ｐの全てあるいは一部について計算した、第一の補正強度値又は第二の補正強度値の平均値、標準誤差、中央値及び四分位点などの統計的な数値とできる。
(4) Data analysis The processing unit including the CPU 20, the memory 30, and the hard disk 40 uses the calculated first correction intensity value or the second correction intensity value as the first parameter, and the detection wavelength of each PMT. Spectral data as the second parameter is generated, and various analyzes can be performed using this. Here, the first parameter is the first correction intensity value or the average value of the second correction intensity values, the standard error, the median value, and the four values calculated for all or part of the plurality of fine particles P that have been measured. It can be a statistical value such as quantile.
また、処理部は、生成されたスペクトルデータと、ハードディスク（記憶部）４０に保持された基準スペクトルデータとを比較して、両者の一致度を評価することができる。更に、その結果を表示部６０に出力することもできる。ここで、基準スペクトルデータとは、既知の蛍光物質を含んでなる微小粒子を事前に微小粒子測定装置Ａで測定し、上述の補正処理を施すことによって得たスペクトルデータか、あるいは当該蛍光物質の蛍光スペクトルを通常の蛍光分光光度計により計測して得たスペクトルデータの、いずれであってもよい。これは、微小粒子測定装置Ａより得られた計測値が、補正によって通常の蛍光分光光度計で得られた計測値と直接比較可能となるためである。基準スペクトルデータは、ハードディスク４０内にリファレンスデータ４２として蓄積されている。基準スペクトルデータとの一致度の評価方法には、例えば各検出波長における差分の和、差分の絶対値の和、差分の二乗和などを利用できる。 Further, the processing unit can compare the generated spectrum data with the reference spectrum data held in the hard disk (storage unit) 40 and evaluate the degree of coincidence between them. Further, the result can be output to the display unit 60. Here, the reference spectral data is spectral data obtained by measuring in advance a microparticle containing a known fluorescent substance with the microparticle measuring apparatus A and performing the above correction processing, or the reference spectral data of the fluorescent substance. Any of spectrum data obtained by measuring the fluorescence spectrum with a normal fluorescence spectrophotometer may be used. This is because the measurement value obtained from the microparticle measuring apparatus A can be directly compared with the measurement value obtained with a normal fluorescence spectrophotometer by correction. The reference spectrum data is stored as reference data 42 in the hard disk 40. As a method for evaluating the degree of coincidence with the reference spectrum data, for example, a sum of differences at each detection wavelength, a sum of absolute values of differences, a square sum of differences, or the like can be used.
微小粒子Ｐを微小粒子測定装置Ａで測定し、これを補正して得たスペクトルデータについて、１ないし２以上の基準スペクトルデータとの比較を行うことにより、測定を行った微小粒子Ｐが発する蛍光が、基準スペクトルデータに記録された蛍光のうちのいずれかと類似するか否かを判定することができる。これにより、例えば測定を行った微小粒子Ｐに含まれる蛍光物質の種類が不明な場合において、記録された基準スペクトルデータの中から類似度が高いものを探索して、微小粒子Ｐに含まれる蛍光物質の種類を予測することが可能となる。 Fluorescence emitted from the measured microparticle P by comparing the spectral data obtained by measuring the microparticle P with the microparticle measuring apparatus A and correcting it with one or more reference spectral data. Can be determined to be similar to any of the fluorescence recorded in the reference spectral data. Thereby, for example, when the type of the fluorescent substance contained in the measured microparticle P is unknown, the recorded reference spectrum data having a high similarity is searched, and the fluorescence contained in the microparticle P is searched. It is possible to predict the type of substance.
更に、微小粒子Ｐを微小粒子測定装置Ａで測定し、これを補正して得たスペクトルデータについて、同一の微小粒子Ｐについてあらかじめ計測して得ておいた基準スペクトルデータとの比較を行うことにより、微小粒子測定装置Ａの状態診断を行うこともできる。すなわち、微小粒子測定装置Ａは、受光素子アレイの動作異常、フローセルないしマイクロチップ内における微小粒子の流れの乱れ、レンズや分光素子など各部品の温度変化や振動などによるずれなどの影響によってその状態が悪化し、計測の正確性が低下する場合がある。このような装置状態を診断する目的で、同一サンプルを微小粒子測定装置Ａと蛍光分光光度計とで測定し、その結果の比較を行うことは、有力な方法であるといえる。本技術によれば、微小粒子測定装置Ａで得られた計測結果を蛍光分光光度計と直接比較可能となるため、状態診断を簡便かつ正確に行うことが可能となる。 Further, by measuring the fine particles P with the fine particle measuring apparatus A and correcting the measured fine particle P, comparison is made with reference spectral data obtained by measuring the same fine particles P in advance. Moreover, the state diagnosis of the fine particle measuring apparatus A can also be performed. That is, the state of the microparticle measuring apparatus A is affected by abnormal operation of the light receiving element array, disturbance of the flow of microparticles in the flow cell or microchip, temperature deviation of each component such as a lens and a spectroscopic element, and displacement due to vibration. May deteriorate and the accuracy of measurement may be reduced. For the purpose of diagnosing such an apparatus state, it can be said that it is an effective method to measure the same sample with the microparticle measuring apparatus A and the fluorescence spectrophotometer and compare the results. According to the present technology, since the measurement result obtained by the microparticle measuring apparatus A can be directly compared with the fluorescence spectrophotometer, the state diagnosis can be performed easily and accurately.
加えて、微小粒子Ｐを微小粒子測定装置Ａで測定し、これを補正して得たスペクトルデータに対して、複数の基準スペクトルデータを用いたコンペンセーション処理を行うことにより、微小粒子Ｐに含まれる複数の蛍光色素の定量を行うことができる。例えば微小粒子Ｐが複数の色素｛D1, D2, …, Dn｝で染色されている場合、コンペンセーション処理に用いる基準スペクトルデータには、｛D1, D2, …, Dn｝の各蛍光色素で単染色されたサンプルより得られたものが含まれることが望ましい。コンペンセーション処理の方法としては、例えば最小二乗法を採用することができる。 In addition, the fine particles P are included in the fine particles P by measuring the fine particles P with the fine particle measuring apparatus A and performing compensation processing using a plurality of reference spectrum data on the spectrum data obtained by correcting the fine particles. A plurality of fluorescent dyes can be quantified. For example fine particle P is multiple dyes {1 D, D 2, ... , D n} if it is stained with the reference spectrum data used for compensation processing, {D 1, D 2, ..., D n} It is desirable to include those obtained from samples that are single-stained with each of the fluorescent dyes. As a method of compensation processing, for example, a least square method can be employed.
２．第二実施形態に係る微小粒子測定装置
（１）装置の構成
図３は、本技術の第二実施形態に係る微小粒子測定装置Ｂの検出部１０の構成を説明する模式図である。微小粒子測定装置Ｂの機能的構成は、図１に示した第一実施形態に係る微小粒子測定装置Ａと同様であるので説明を省略する。
2. Configuration of Microparticle Measurement Device (1) Device According to Second Embodiment FIG. 3 is a schematic diagram illustrating the configuration of the detection unit 10 of the microparticle measurement device B according to the second embodiment of the present technology. The functional configuration of the microparticle measurement apparatus B is the same as that of the microparticle measurement apparatus A according to the first embodiment shown in FIG.
微小粒子測定装置Ｂは、フィルタなどの波長選択素子を用いて不連続な波長域の光を複数選択し、各波長域の光の強度を計測する点で、連続した波長域における光の強度を蛍光スペクトルとして計測する微小粒子測定装置Ａと異なっている。 The fine particle measuring apparatus B selects a plurality of light in a discontinuous wavelength range using a wavelength selection element such as a filter, and measures the light intensity in each wavelength range. It is different from the microparticle measuring apparatus A that measures as a fluorescence spectrum.
微小粒子測定装置Ｂの検出部１０は、光源１０１からのレーザー光を微小粒子Ｐに対して集光・照射する照射系と、微小粒子Ｐから発生する蛍光から所定の波長域の光を選択する波長選択素子１０４〜１０６と選択された光を検出する受光素子１０７〜１１０とを含む検出系と、から構成される。微小粒子測定装置Ｂにおいて、微小粒子Ｐは、フローセル内又はマイクロチップに形成された流路内を一列に配列されて通流される。 The detection unit 10 of the microparticle measurement apparatus B selects light in a predetermined wavelength region from the irradiation system that collects and irradiates the laser light from the light source 101 onto the microparticles P and the fluorescence generated from the microparticles P. The detection system includes wavelength selection elements 104 to 106 and light receiving elements 107 to 110 that detect the selected light. In the microparticle measurement apparatus B, the microparticles P are arranged in a line and flow through the flow cell or the flow path formed in the microchip.
照射系は、光源１０１の他、微小粒子Ｐに対してレーザー光を集光・照射するための集光レンズ、ダイクロイックミラー及びバンドパスフィルター等（不図示）からなる。なお光源１０１は、互いに異なる波長を発光する光源を２つ以上組み合わせたものでもよく、その場合２つ以上のレーザー光が微小粒子Ｐを照射する場所は、同一であっても異なっていても構わない。また、検出系は、微小粒子Ｐから発生する蛍光を集光し、波長選択素子１０４に導光するための集光レンズ等（不図示）を含んでいてもよい。ここでは、受光素子１０７〜１１０として、検出波長域幅が異なるＰＭＴ（photo multiplier tube）を用いた構成を例示した。以下、受光素子１０７〜１１０のチャネル番号を１〜４とする。なお、受光素子１０７〜１１０には、フォトダイオードを用いることもできる。 The irradiation system includes, in addition to the light source 101, a condensing lens for condensing and irradiating the fine particles P with laser light, a dichroic mirror, a bandpass filter, and the like (not shown). The light source 101 may be a combination of two or more light sources that emit different wavelengths. In this case, the location where the two or more laser beams irradiate the microparticles P may be the same or different. Absent. Further, the detection system may include a condensing lens or the like (not shown) for condensing the fluorescence generated from the microparticles P and guiding it to the wavelength selection element 104. Here, a configuration using PMTs (photo multiplier tubes) having different detection wavelength band widths as the light receiving elements 107 to 110 is illustrated. Hereinafter, the channel numbers of the light receiving elements 107 to 110 are 1 to 4. Note that photodiodes may be used for the light receiving elements 107 to 110.
微小粒子測定装置Ｂにおいて、検出部１０を、蛍光に加えて散乱光なども検出するように構成できる点は、微小粒子測定装置Ａと同様である。 In the minute particle measuring apparatus B, the point that the detection unit 10 can be configured to detect not only fluorescence but also scattered light is the same as the minute particle measuring apparatus A.
（２）蛍光強度の補正処理
微小粒子測定装置Ｂは、検出部１０から出力される電気信号に基づき、蛍光の強度値の補正処理を行う。この補正処理は、蛍光の強度値を各受光素子（ここではチャネル１〜４のＰＭＴ）の検出波長域幅で補正して第一の補正強度値を算出するステップと、第一の補正強度値を各ＰＭＴの感度データを用いて補正して第二の補正強度値を算出するステップとを含む。
(2) Correction Processing of Fluorescence Intensity The microparticle measurement device B performs correction processing of the fluorescence intensity value based on the electrical signal output from the detection unit 10. The correction processing includes a step of calculating a first correction intensity value by correcting the fluorescence intensity value with the detection wavelength band width of each light receiving element (here, the PMTs of channels 1 to 4), and a first correction intensity value. And calculating the second corrected intensity value by using the sensitivity data of each PMT.
［第一の補正強度値の算出］
第一の補正強度値を算出は、各ＰＭＴで取得された蛍光の強度値を、それぞれのＰＭＴの検出波長域幅で除すことにより行われる。
[Calculation of first corrected intensity value]
The first corrected intensity value is calculated by dividing the fluorescence intensity value acquired by each PMT by the detection wavelength band width of each PMT.
具体的には、チャネル１〜４のＰＭＴのうち、チャネルｋのＰＭＴで得られたｎ番目の強度値をＩ［ｋ、ｎ］とし、チャネルｋのＰＭＴの検出下限波長をＬ［ｋ］かつ検出上限波長をＨ［ｋ］とする。この場合、第一の補正強度値Ｊ１［ｋ、ｎ］は、次の式により算出される。ここで、ｋは１〜４の整数を表す。
Ｊ１［ｋ、ｎ］＝Ｉ［ｋ、ｎ］／（Ｈ［ｋ］−Ｌ［ｋ］）
Specifically, among the PMTs of channels 1 to 4, the nth intensity value obtained by the PMT of channel k is I [k, n], the detection lower limit wavelength of the PMT of channel k is L [k], and Let the detection upper limit wavelength be H [k]. In this case, the first corrected intensity value J 1 [k, n] is calculated by the following equation. Here, k represents an integer of 1 to 4.
J 1 [k, n] = I [k, n] / (H [k] −L [k])
チャネル１〜４のＰＭＴで検出される光の波長域幅は、波長選択素子１０４〜１０６を含む検出部１０の光学系が非線形性を有している場合、各ＰＭＴ間で異なった幅となる。このため、各ＰＭＴで取得される蛍光の強度値は、検出波長域幅が広いチャネルでは相対的に高く、検出波長域幅が狭いチャネルでは相対的に低くなり、このことが測定誤差の要因となる。 When the optical system of the detection unit 10 including the wavelength selection elements 104 to 106 has nonlinearity, the wavelength band width of the light detected by the PMTs of the channels 1 to 4 is different between the PMTs. . For this reason, the intensity value of the fluorescence acquired by each PMT is relatively high in a channel with a wide detection wavelength band, and relatively low in a channel with a narrow detection wavelength band, which is a cause of measurement error. Become.
各ＰＭＴで取得された蛍光の強度値をそれぞれのＰＭＴの検出波長域幅で除して得られる第一の補正強度値では、このような光学系の非線形性に起因した測定誤差を補償することが可能となる。 The first correction intensity value obtained by dividing the fluorescence intensity value acquired by each PMT by the detection wavelength band width of each PMT compensates the measurement error due to such nonlinearity of the optical system. Is possible.
各ＰＭＴの検出波長域幅（Ｈ［ｋ］−Ｌ［ｋ］）は、検出部１０を構成する波長選択素子１０４〜１０６、集光レンズ、ダイクロイックミラー及びバンドパスフィルターなどの光学素子の種類や配置によって一意に決定される。このため、光学素子の選定及び配置を含む装置設計が完了した段階で、各ＰＭＴの検出波長域幅を取得しておくことで、各ＰＭＴで取得された蛍光の強度値から第一の補正強度値を算出することが可能となる。 The detection wavelength band width (H [k] −L [k]) of each PMT is the type of optical element such as the wavelength selection elements 104 to 106, the condensing lens, the dichroic mirror, and the band pass filter that constitute the detection unit 10. Uniquely determined by placement. For this reason, when the device design including the selection and arrangement of the optical elements is completed, the first correction intensity is obtained from the intensity value of the fluorescence acquired by each PMT by acquiring the detection wavelength band width of each PMT. The value can be calculated.
［第二の補正強度値の算出］
第二の補正強度値の算出は、各ＰＭＴにおける第一の補正強度値を、それぞれのＰＭＴの相対感度で除すことにより行われる。
[Calculation of second corrected intensity value]
The calculation of the second correction intensity value is performed by dividing the first correction intensity value in each PMT by the relative sensitivity of each PMT.
具体的には、チャネル１〜４のＰＭＴのうち、チャネルｋのＰＭＴの相対感度をＳ［ｋ］とする。この場合、第二の補正強度値Ｊ２［ｋ、ｎ］は、次の式により算出される。
Ｊ２［ｋ、ｎ］＝Ｊ１［ｋ、ｎ］／Ｓ［ｋ］
Specifically, among the PMTs of channels 1 to 4, the relative sensitivity of the PMT of channel k is S [k]. In this case, the second corrected intensity value J 2 [k, n] is calculated by the following equation.
J 2 [k, n] = J 1 [k, n] / S [k]
チャネル１〜４のＰＭＴの感度は、ＰＭＴの個体差及びゲインの設定差によって、各ＰＭＴ間で異なる。このため、各ＰＭＴで取得される蛍光の強度値は、感度が高いチャネルでは相対的に高く、感度が低いチャネルでは相対的に低くなり、このことも測定誤差の要因となっている。 The PMT sensitivities of channels 1 to 4 differ among the PMTs due to individual differences in PMT and gain setting differences. For this reason, the intensity value of the fluorescence acquired by each PMT is relatively high in a channel with high sensitivity and relatively low in a channel with low sensitivity, which also causes measurement errors.
各ＰＭＴにおける第一の補正強度値を、それぞれのＰＭＴの相対感度で除して得られる第二の補正強度値では、このような受光素子間の感度差に起因した測定誤差を補償することが可能となる。 The second correction intensity value obtained by dividing the first correction intensity value in each PMT by the relative sensitivity of each PMT can compensate for a measurement error due to such a sensitivity difference between the light receiving elements. It becomes possible.
（３）データ表示
微小粒子測定装置Ｂは、算出された第一の補正強度値又は第二の補正強度値を座標軸とした２次元グラフを生成して、表示部６０に出力する。
(3) Data Display The microparticle measurement device B generates a two-dimensional graph with the calculated first correction intensity value or second correction intensity value as the coordinate axis, and outputs it to the display unit 60.
２次元グラフは、各ＰＭＴの検出波長を横軸にとり、第一の補正強度値又は第二の補正強度値を縦軸にとったものとできる。図４（Ａ）に補正処理前のグラフ、（Ｂ）に第二の補正強度値によるグラフを示す。図４（Ａ）は、横軸にチャネル番号ｋ（ｋは１〜４の整数）、縦軸に各チャネルで取得された蛍光の強度値（Ｉ［ｋ］）の対数をとったグラフである。また、図４（Ｂ）は、横軸に検出波長、縦軸に各チャネルで取得された蛍光強度値の補正値（Ｊ１［ｋ］又はＪ２［ｋ］）の対数をとったグラフである。 In the two-dimensional graph, the detection wavelength of each PMT can be taken on the horizontal axis, and the first correction intensity value or the second correction intensity value can be taken on the vertical axis. FIG. 4A shows a graph before the correction process, and FIG. 4B shows a graph based on the second correction intensity value. FIG. 4A is a graph in which the horizontal axis represents the channel number k (k is an integer of 1 to 4) and the vertical axis represents the logarithm of the fluorescence intensity value (I [k]) acquired in each channel. . FIG. 4B is a graph in which the horizontal axis represents the detection wavelength and the vertical axis represents the logarithm of the correction value (J 1 [k] or J 2 [k]) of the fluorescence intensity value acquired in each channel. is there.
微小粒子測定装置Ｂでは、上記の補正処理によって、波長選択素子を用いて選択した不連続な波長域の光の強度の計測結果を、装置の光学系の非線形性及び受光素子間の感度差に起因した測定誤差を補償した状態で表示させることが可能である。 In the fine particle measuring apparatus B, the measurement result of the light intensity in the discontinuous wavelength range selected by using the wavelength selecting element is converted into the nonlinearity of the optical system of the apparatus and the sensitivity difference between the light receiving elements by the correction process. It is possible to display in a state where the measurement error caused is compensated.
本技術に係る微小粒子測定装置は、以下のような構成をとることもできる。
（１）微小粒子からの蛍光を検出する検出部と、
前記蛍光の強度値を補正処理した補正強度値を算出し、該補正強度値に基づいてスペクトルデータを生成する処理部と、
前記処理部において実行される指示を格納する記憶部と、
を少なくとも有する微小粒子測定装置であって、
前記指示は、前記補正強度値を算出させる指示である、微小粒子測定装置。
（２）前記検出部は、前記蛍光の強度値を生成する、（１）記載の微小粒子測定装置。
（３）前記検出部は、前記蛍光を前記蛍光の強度値に変換する複数の受光素子を有する、（１）又は（２）に記載の微小粒子測定装置。
（４）前記処理部は、前記複数の受光素子のそれぞれに対応する検出波長域幅に基づいて前記補正強度値を算出する、（３）記載の微小粒子測定装置。
（５）前記処理部は、前記補正強度値を第一の補正強度値とし、前記第一の補正強度値及び前記複数の受光素子のそれぞれに対応する相対感度データに基づいて第二の補正強度値を更に算出する、（３）又は（４）に記載の微小粒子測定装置。
（６）前記記憶部は、前記スペクトルデータと基準スペクトルデータとを比較させる指示を更に格納する、（１）から（５）のいずれかに記載の微小粒子測定装置。
（７）データを表示する表示部を更に有し、
前記記憶部は、前記スペクトルデータと基準スペクトルデータとを比較した結果を前記表示部に表示させる指示を更に格納する、（６）記載の微小粒子測定装置。
（８）微小粒子からの蛍光を検出し、かつ、前記蛍光を前記蛍光の強度値に変換する複数の受光素子を有する、検出部からのデータを受け取るためのデバイスであって、
前記蛍光の強度値を補正処理した補正強度値を算出し、該補正強度値に基づいてスペクトルデータを生成する処理部と、
前記処理部において実行される指示を格納する記憶部と、
を少なくとも有し、
前記指示は、前記蛍光の強度値を取得させる指示、前記蛍光の強度値を補正処理させる指示及び前記蛍光の強度値を補正処理した補正強度値に基づいてスペクトルデータを生成させる指示である、デバイス。
（９）前記処理部は、前記複数の受光素子のそれぞれに対応する検出波長域幅に基づいて前記補正強度値を算出する、（８）記載のデバイス。
（１０）前記記憶部は、前記スペクトルデータと基準スペクトルデータとを比較させる指示を更に格納する、（８）又は（９）に記載のデバイス。
（１１）データを表示する表示部を更に有し、
前記記憶部は、前記スペクトルデータと基準スペクトルデータとを比較した結果を前記表示部に表示させる指示を更に格納する、（１０）記載のデバイス。
（１２）微小粒子からの蛍光の強度値を補正処理した補正強度値を受け取るためのデバイスであって、
前記補正強度値に基づいてスペクトルデータを生成する処理部と、
前記処理部において実行される指示を格納する記憶部と、
を少なくとも有し、
前記指示は、前記補正強度値を取得させる指示及び前記補正強度値に基づいてスペクトルデータを生成させる指示である、デバイス。
（１３）前記記憶部は、前記スペクトルデータと基準スペクトルデータとを比較させる指示を更に格納する、（１２）記載のデバイス。
（１４）データを表示する表示部を更に有し、
前記記憶部は、前記スペクトルデータと基準スペクトルデータとを比較した結果を前記表示部に表示させる指示を更に格納する、（１３）記載のデバイス。
（１５）微小粒子からの蛍光を検出し、前記蛍光の強度値を補正処理した補正強度値に基づいてスペクトルデータを生成するデータ解析方法。
（１６）前記補正処理は、前記蛍光を前記蛍光の強度値に変換する複数の受光素子のそれぞれに対応する検出波長域幅に基づいて行われる、（１５）記載のデータ解析方法。
The fine particle measuring apparatus according to the present technology can also have the following configuration.
(1) a detection unit for detecting fluorescence from fine particles;
A processing unit that calculates a corrected intensity value obtained by correcting the intensity value of the fluorescence, and generates spectrum data based on the corrected intensity value;
A storage unit for storing instructions executed in the processing unit;
A microparticle measuring device having at least
The said instruction | indication is a microparticle measuring apparatus which is an instruction | indication which calculates the said correction | amendment intensity value.
(2) The microparticle measurement apparatus according to (1), wherein the detection unit generates an intensity value of the fluorescence.
(3) The microparticle measurement apparatus according to (1) or (2), wherein the detection unit includes a plurality of light receiving elements that convert the fluorescence into an intensity value of the fluorescence.
(4) The microparticle measurement apparatus according to (3), wherein the processing unit calculates the correction intensity value based on a detection wavelength band width corresponding to each of the plurality of light receiving elements.
(5) The processing unit sets the correction intensity value as the first correction intensity value, and sets the second correction intensity based on the first correction intensity value and relative sensitivity data corresponding to each of the plurality of light receiving elements. The microparticle measurement apparatus according to (3) or (4), wherein the value is further calculated.
(6) The microparticle measurement apparatus according to any one of (1) to (5), wherein the storage unit further stores an instruction for comparing the spectrum data with reference spectrum data.
(7) It further has a display unit for displaying data,
The storage unit according to (6), wherein the storage unit further stores an instruction to display a result of comparing the spectrum data and reference spectrum data on the display unit.
(8) A device for detecting data from a microparticle, and having a plurality of light receiving elements for converting the fluorescence into an intensity value of the fluorescence, for receiving data from a detection unit,
A processing unit that calculates a corrected intensity value obtained by correcting the intensity value of the fluorescence, and generates spectrum data based on the corrected intensity value;
A storage unit for storing instructions executed in the processing unit;
Having at least
The instruction is an instruction for acquiring the fluorescence intensity value, an instruction for correcting the fluorescence intensity value, and an instruction for generating spectrum data based on the corrected intensity value obtained by correcting the fluorescence intensity value. .
(9) The device according to (8), wherein the processing unit calculates the correction intensity value based on a detection wavelength band width corresponding to each of the plurality of light receiving elements.
(10) The device according to (8) or (9), wherein the storage unit further stores an instruction for comparing the spectrum data with reference spectrum data.
(11) It further has a display unit for displaying data,
The device according to (10), wherein the storage unit further stores an instruction to display a result of comparing the spectrum data and reference spectrum data on the display unit.
(12) A device for receiving a corrected intensity value obtained by correcting the intensity value of fluorescence from a microparticle,
A processing unit for generating spectrum data based on the corrected intensity value;
A storage unit for storing instructions executed in the processing unit;
Having at least
The device is a device that is an instruction to acquire the corrected intensity value and an instruction to generate spectrum data based on the corrected intensity value.
(13) The device according to (12), wherein the storage unit further stores an instruction for comparing the spectrum data with reference spectrum data.
(14) It further has a display unit for displaying data,
The device according to (13), wherein the storage unit further stores an instruction to display a result of comparing the spectrum data and reference spectrum data on the display unit.
(15) A data analysis method for detecting fluorescence from fine particles and generating spectrum data based on a corrected intensity value obtained by correcting the intensity value of the fluorescence.
(16) The data analysis method according to (15), wherein the correction process is performed based on a detection wavelength band width corresponding to each of a plurality of light receiving elements that convert the fluorescence into an intensity value of the fluorescence.
図２に示した構成の検出部を備えたスペクトル型フローサイトメータを試作した。光源には、波長４８８ｎｍのレーザーダイオードと波長６３８ｎｍのレーザーダイオードを用いた。また、分光素子には、複数のプリズムを組み合わせたプリズムアレイを用いた。受光素子アレイには、３２チャネルのＰＭＴアレイを使用し、波長５００ｎｍから８００ｎｍの蛍光を分光検出した。 A spectrum type flow cytometer having a detection unit having the configuration shown in FIG. As the light source, a laser diode having a wavelength of 488 nm and a laser diode having a wavelength of 638 nm were used. Further, a prism array in which a plurality of prisms are combined was used as the spectroscopic element. A 32-channel PMT array was used as the light-receiving element array, and fluorescence with a wavelength of 500 nm to 800 nm was spectrally detected.
試作した装置において、各ＰＭＴの検出波長域幅を決定したグラフを図５に示す。グラフ中の「×」は各チャネルのＰＭＴの検出下限波長（Ｌ［ｋ］）を、「○」は検出上限波長（Ｈ［ｋ］）を示す。ここで、ｋは１〜３２の整数を表す。各ＰＭＴの検出波長域幅（Ｈ［ｋ］−Ｌ［ｋ］）は、チャネル番号が大きい長波長側のＰＭＴほど広くなっていることが確認される。なお、波長６３８ｎｍ付近の蛍光を検出するチャネル２１番前後のＰＭＴでは、波長６３８ｎｍの光源からのレーザー光の漏れ込みを防止する光学フィルタによって、検出される蛍光も制限されている。 FIG. 5 shows a graph in which the detection wavelength band width of each PMT is determined in the prototype device. In the graph, “x” indicates the detection lower limit wavelength (L [k]) of the PMT of each channel, and “◯” indicates the detection upper limit wavelength (H [k]). Here, k represents an integer of 1 to 32. It is confirmed that the detection wavelength band width (H [k] −L [k]) of each PMT becomes wider as the PMT on the long wavelength side with the larger channel number. In the PMT around channel 21 that detects fluorescence near the wavelength of 638 nm, the detected fluorescence is also limited by an optical filter that prevents leakage of laser light from the light source having a wavelength of 638 nm.
また、各ＰＭＴの相対感度を算出したグラフを図６に示す。相対感度は、同一強度及び同一波長の光を各ＰＭＴに照射して各チャネルで得られた強度値を、最も高い強度値が得られたチャネル３２の強度値を１とした相対値により示した。 FIG. 6 shows a graph for calculating the relative sensitivity of each PMT. The relative sensitivity is indicated by a relative value where the intensity value obtained in each channel by irradiating light of the same intensity and the same wavelength to each PMT is set to 1 as the intensity value of the channel 32 where the highest intensity value was obtained. .
初めに、F-4500型蛍光分光光度計（株式会社日立ハイテクノロジーズ）を用いて市販の蛍光ビーズの蛍光スペクトルを計測した。蛍光ビーズには、Sherotech社より入手したFluorescent Particle Kit （FPK）505、FPK528、FPK549、FPK667の４種を用いた。得られたスペクトルチャート（基準スペクトルチャート）を図７に示す。（Ａ）はFPK505、（Ｂ）はFPK528、（Ｃ）はFPK549、（Ｄ）はFPK667の蛍光スペクトルを示す。横軸は蛍光波長（５００〜８００ｎｍ）、縦軸は蛍光強度値（対数表示）である。なお、レーザー光の励起波長は、（Ａ）〜（Ｃ）が波長４８８ｎｍ、（Ｄ）が波長６３８ｎｍである。 First, the fluorescence spectrum of commercially available fluorescent beads was measured using an F-4500 type fluorescence spectrophotometer (Hitachi High-Technologies Corporation). Four types of fluorescent beads, Fluorescent Particle Kit (FPK) 505, FPK528, FPK549, and FPK667 obtained from Sherotech, were used. The obtained spectrum chart (reference spectrum chart) is shown in FIG. (A) shows the fluorescence spectrum of FPK505, (B) shows the fluorescence spectrum of FPK528, (C) shows the fluorescence spectrum of FPK549, and (D) shows the fluorescence spectrum of FPK667. The horizontal axis represents the fluorescence wavelength (500 to 800 nm), and the vertical axis represents the fluorescence intensity value (logarithmic display). The excitation wavelengths of the laser light are (A) to (C) having a wavelength of 488 nm and (D) having a wavelength of 638 nm.
次に、試作した装置を用いて蛍光ビーズの蛍光スペクトルを計測した。得られたスペクトルチャートを図８〜１２に示す。図８及び図９はFPK505、図１０はFPK528、図１１はFPK549、図１２はFPK667のチャートを示す。なお、図８では各チャネルでのイベント数をスペクトルの色によって表示した。また、図９では強度値をイベント数に基づく平均値（実線）及び平均値±標準偏差（破線）で表示している。 Next, the fluorescence spectrum of the fluorescent beads was measured using the prototype device. The obtained spectrum charts are shown in FIGS. 8 and 9 are charts of FPK505, FIG. 10 is a chart of FPK528, FIG. 11 is a chart of FPK549, and FIG. 12 is a chart of FPK667. In FIG. 8, the number of events in each channel is displayed by spectrum color. In FIG. 9, the intensity value is displayed as an average value (solid line) and an average value ± standard deviation (broken line) based on the number of events.
図８〜１２の（Ａ）は、横軸にチャネル番号、縦軸に各チャネルで取得された蛍光の強度値（Ｉ［ｋ］、ｋは１〜３２の整数を表す）の対数をとったスペクトルチャートである。 8A to 12A, the horizontal axis represents the channel number, and the vertical axis represents the logarithm of the fluorescence intensity value (I [k], k represents an integer of 1 to 32) acquired in each channel. It is a spectrum chart.
図８〜１２の（Ａ）のスペクトルチャートに示されるスペクトル形状は、図７に示した基準スペクトルチャートのスペクトル形状と明らかに異なっている。このことは、ＰＭＴで取得される蛍光の強度値（Ｉ［ｋ］）をそのまま用いた蛍光スペクトルでは、装置の光学系の非線形性及び受光素子間の感度差に起因した測定誤差によってスペクトル形状に歪みが生じていることを示している。 The spectrum shape shown in the spectrum charts of FIGS. 8 to 12 (A) is clearly different from the spectrum shape of the reference spectrum chart shown in FIG. This is because, in the fluorescence spectrum using the fluorescence intensity value (I [k]) obtained by the PMT as it is, the spectrum shape is caused by the measurement error caused by the nonlinearity of the optical system of the apparatus and the sensitivity difference between the light receiving elements. It shows that distortion has occurred.
図８〜１２の（Ｂ）には、横軸に検出波長、縦軸に各チャネルで取得された蛍光強度値の第一の補正値（Ｊ１［ｋ］、ｋは１〜３２の整数を表す）の対数をとったスペクトルチャートである。第一の補正強度値Ｊ１［ｋ］は、各ＰＭＴで取得された蛍光の強度値（Ｉ［ｋ］）を、図５に示したそれぞれのＰＭＴの検出波長域幅（Ｈ［ｋ］−Ｌ［ｋ］）で除すことにより得た。より具体的には、チャネルｋのＰＭＴで得られたｎ番目の強度値Ｉ［ｋ、ｎ］をＰＭＴの検出波長域幅（Ｈ［ｋ］−Ｌ［ｋ］）で除して第一の補正強度値Ｊ１［ｋ、ｎ］を得て、Ｊ１［ｋ、ｎ］の分布を横軸Ｌ［ｋ］〜Ｈ［ｋ］の範囲に描画してスペクトルチャートを作成した。 8B to 12B, the horizontal axis indicates the detection wavelength, and the vertical axis indicates the first correction value (J 1 [k], k is an integer from 1 to 32) acquired for each channel. It is a spectrum chart taking the logarithm of The first corrected intensity value J 1 [k] is the fluorescence intensity value (I [k]) acquired by each PMT, and the detection wavelength band width (H [k] − of each PMT shown in FIG. L [k]). More specifically, the n-th intensity value I [k, n] obtained by the PMT of the channel k is divided by the detection wavelength band width (H [k] −L [k]) of the PMT to obtain the first value. A corrected intensity value J 1 [k, n] was obtained, and a spectrum chart was created by drawing the distribution of J 1 [k, n] in the range of the horizontal axis L [k] to H [k].
図８〜１２の（Ｂ）のスペクトルチャートに示されるスペクトル形状は、図７に示した基準スペクトルチャートのスペクトル形状と概ね一致している。このことは、各ＰＭＴで取得された蛍光の強度値（Ｉ［ｋ］）をそれぞれのＰＭＴの検出波長域幅（Ｈ［ｋ］−Ｌ［ｋ］）で除す補正処理によって、装置の光学系の非線形性に起因した測定誤差を補償して、スペクトル形状の歪みを補正できたことを示している。 The spectrum shape shown in the spectrum chart of (B) in FIGS. 8 to 12 substantially matches the spectrum shape of the reference spectrum chart shown in FIG. This is because the optical intensity of the apparatus is corrected by dividing the fluorescence intensity value (I [k]) acquired by each PMT by the detection wavelength band width (H [k] −L [k]) of each PMT. This shows that the measurement error due to the nonlinearity of the system was compensated to correct the distortion of the spectral shape.
図８〜１２の（Ｃ）には、横軸に検出波長、縦軸に各チャネルで取得された蛍光強度値の第二の補正値（Ｊ２［ｋ］、ｋは１〜３２の整数を表す）の対数をとったスペクトルチャートである。第二の補正強度値Ｊ２［ｋ］は、第一の補正強度値（Ｊ１［ｋ］）を、図６に示したそれぞれのＰＭＴの相対感度（Ｓ［ｋ］）で除すことにより得た。 8C, the horizontal axis represents the detection wavelength, and the vertical axis represents the second correction value (J 2 [k], k is an integer from 1 to 32) acquired for each channel. It is a spectrum chart taking the logarithm of The second corrected intensity value J 2 [k] is obtained by dividing the first corrected intensity value (J 1 [k]) by the relative sensitivity (S [k]) of each PMT shown in FIG. Obtained.
図８〜１２の（Ｃ）のスペクトルチャートに示されるスペクトル形状は、図７に示した基準スペクトルチャートのスペクトル形状と良く一致している。特に、図８〜１２の（Ｂ）の第一の補正値（Ｊ１［ｋ］）に基づくスペクトルチャートでは、波長５００ｎｍ付近の領域でＰＭＴの感度差に起因すると思われるスペクトル形状の歪みがみられたが、図８〜１２の（Ｃ）の第二の補正値（Ｊ２［ｋ］）に基づくスペクトルチャートでは、この歪みが補正されている。このことは、第一の補正値（Ｊ１［ｋ］）をそれぞれのＰＭＴの相対感度（Ｓ［ｋ］）で除す補正処理によって、受光素子間の感度差に起因した測定誤差を補償して、スペクトル形状の歪みを補正できることが示された。 The spectrum shape shown in the spectrum chart of (C) of FIGS. 8-12 is in good agreement with the spectrum shape of the reference spectrum chart shown in FIG. In particular, in the spectrum chart based on the first correction value (J 1 [k]) in (B) of FIGS. 8 to 12, the distortion of the spectrum shape that seems to be caused by the PMT sensitivity difference is observed in the region near the wavelength of 500 nm. However, this distortion is corrected in the spectrum chart based on the second correction value (J 2 [k]) in (C) of FIGS. This compensates for a measurement error caused by a sensitivity difference between the light receiving elements by a correction process in which the first correction value (J 1 [k]) is divided by the relative sensitivity (S [k]) of each PMT. Thus, it was shown that the distortion of the spectral shape can be corrected.
以上の結果から、本技術に係る微小粒子測定装置によれば、微小粒子について、通常の蛍光分光光度計により計測して得られる基準スペクトルチャートと良く一致するスペクトル形状を計測可能であることが分かる。 From the above results, it can be seen that, according to the microparticle measurement apparatus according to the present technology, it is possible to measure a spectrum shape that closely matches a reference spectrum chart obtained by measuring with a normal fluorescence spectrophotometer. .
このため、本技術に係る微小粒子測定装置では、標識された蛍光色素の種類や量が未知のサンプルについて得られたスペクトル形状を、既知の蛍光物質のスペクトル形状を記録したデータベース（リフェレンスデータ）から検索することにより、サンプルに標識された蛍光色素の種類や量を推定することも可能となる。 For this reason, in the microparticle measuring apparatus according to the present technology, the database (reference data) in which the spectral shape obtained for a sample whose type and amount of the labeled fluorescent dye are unknown is recorded as the spectral shape of the known fluorescent substance. It is possible to estimate the type and amount of the fluorescent dye labeled on the sample by searching from the above.
また、本技術に係る微小粒子測定装置では、複数の蛍光色素で標識されたサンプルを解析する際のコンペンセーション計算を、従来必要とされていた各蛍光色素で単染色されたサンプルの計測を行うことなく、予め計測した各蛍光色素の蛍光スペクトルを用いて行うことも可能となる。そして、これにより、サンプル解析のための手間や時間、試薬などのリソースを低減することができる。 In addition, the microparticle measuring apparatus according to the present technology performs compensation calculation when analyzing a sample labeled with a plurality of fluorescent dyes, and measures a sample that is simply stained with each fluorescent dye that has been conventionally required. It is also possible to use the fluorescence spectrum of each fluorescent dye measured in advance. This can reduce labor, time, reagents, and other resources for sample analysis.
本技術に係る微小粒子測定装置によれば、サンプル解析の都度に標準サンプルを計測しなくとも、測定誤差を補正して正確な解析結果を得ることができる。従って、本技術に係る微小粒子測定装置は、細胞等の微小粒子の光学特性をより詳細に解析するため寄与する。 According to the microparticle measurement apparatus according to the present technology, an accurate analysis result can be obtained by correcting measurement errors without measuring a standard sample every time a sample analysis is performed. Therefore, the microparticle measuring apparatus according to the present technology contributes to analyze the optical characteristics of microparticles such as cells in more detail.
Ａ：微小粒子測定装置、Ｐ：微小粒子、１０：検出部、１０１：光源、１０２：分光素子、１０３：受光素子アレイ、１０４〜１０６：波長選択素子、１０７〜１１０：受光素子、２０：ＣＰＵ、３０：メモリ、４０：ハードディスク（記憶部）、４１：蛍光強度補正プログラム、４２：リファレンスデータ、４３：ＯＳ、５１：マウス、５２：キーボード、６０：表示部、６１：ディスプレイ、６２：プリンタ A: Fine particle measuring device, P: Fine particle, 10: Detection unit, 101: Light source, 102: Spectroscopic element, 103: Light receiving element array, 104 to 106: Wavelength selection element, 107 to 110: Light receiving element, 20: CPU , 30: memory, 40: hard disk (storage unit), 41: fluorescence intensity correction program, 42: reference data, 43: OS, 51: mouse, 52: keyboard, 60: display unit, 61: display, 62: printer
Claims (12)
前記複数の受光素子で検出された蛍光強度値に基づいてスペクトルデータを生成する処理部と、
を少なくとも有する微小粒子測定装置であって、
前記複数の受光素子は、少なくとも２以上の異なる検出波長域幅を有し、
前記処理部は、前記複数の受光素子の各々で検出された各蛍光強度値を各受光素子が有する検出波長域幅に基づき補正処理した補正強度値を用いて、前記スペクトルデータを生成する、微小粒子測定装置。 A detector for detecting the fluorescence from the fine particles by a plurality of light receiving elements,
A processing unit that generates spectral data based on the detected fluorescence intensity values at said plurality of light receiving elements,
A microparticle measuring device having at least
The plurality of light receiving elements have at least two different detection wavelength band widths,
Wherein the processing unit uses the correction intensity values of each fluorescence intensity value detected at each and correction processing based on the detected wavelength band width having the light receiving elements of the plurality of light receiving elements, and generates the spectral data, Fine particle measuring device.
前記複数の受光素子は、少なくとも２以上の異なる検出波長域幅を有し、
前記処理部は、前記複数の受光素子の各々で検出された各蛍光強度値を各受光素子が有する検出波長域幅に基づき補正処理した補正強度値を用いて、前記スペクトルデータを生成する、情報処理装置。 Processing unit that generates spectral data based on the fluorescence intensity values detected by the plurality of light receiving elements than fluorescent light from the fine particles, and at least with the information processing apparatus,
The plurality of light receiving elements have at least two different detection wavelength band widths,
Wherein the processing unit uses the correction intensity values of each fluorescence intensity value detected at each and correction processing based on the detected wavelength band width having the light receiving elements of the plurality of light receiving elements, and generates the spectral data, Information processing device.
前記複数の受光素子は、少なくとも２以上の異なる検出波長域幅を有し、
前記複数の受光素子の各々で検出された各蛍光強度値は、各受光素子が有する検出波長域幅に基づき補正処理し、前記スペクトルデータの生成に用いられる、データ解析方法。 Detecting the fluorescence from the fine particles by a plurality of light receiving elements, a data analysis method for generating spectral data on the basis of the detected fluorescence intensity values at said plurality of light receiving elements,
The plurality of light receiving elements have at least two different detection wavelength band widths,
Each of the plurality of fluorescent intensity value detected by each light receiving element, and correction processing based on the detected wavelength band width each light receiving element has, is used to generate the spectral data, the data analysis methods.
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