JP6012352B2 - Extracting and purifying method of tengu sericin, and pharmaceutical composition, food and cosmetics containing tengu sericin - Google Patents
Extracting and purifying method of tengu sericin, and pharmaceutical composition, food and cosmetics containing tengu sericin Download PDFInfo
- Publication number
- JP6012352B2 JP6012352B2 JP2012203552A JP2012203552A JP6012352B2 JP 6012352 B2 JP6012352 B2 JP 6012352B2 JP 2012203552 A JP2012203552 A JP 2012203552A JP 2012203552 A JP2012203552 A JP 2012203552A JP 6012352 B2 JP6012352 B2 JP 6012352B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- sericin
- tengu
- mol
- solution
- powder
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Landscapes
- Cosmetics (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
Description
本発明は、天蚕セリシンの抽出・精製方法および天蚕セリシンを含む抗加齢用医薬組成物および抗加齢用食品、抗ガン用医薬組成物および抗ガン用食品、免疫賦活用医薬組成物および免疫賦活用食品、さらに、天蚕セリシンを含む化粧料に関する。 The present invention relates to a method for extraction / purification of tengu sericin, an anti-aging pharmaceutical composition and anti-aging food containing tengu sericin, an anti-cancer pharmaceutical composition and an anti-cancer food, an immunostimulating pharmaceutical composition, and immunization. The invention relates to a food to be used, and further to a cosmetic containing sericin.
従来より、絹糸昆虫が産生する絹糸から絹タンパク質を抽出して、例えば、健康増進のための飲食品やサプリメント、化粧料、医薬品材料などへ応用する試みがなされている。ただ、従来、研究対象となっているのは、家蚕（B.mori）の絹タンパク質（フィブロイン、セリシン）がほとんどであり、他の野蚕（カイコガ科（Bombycidae）のクワコ（Bombyx mandarina）や、ヤママユガ科（Saturniidae）の天蚕（Antheraea yamamai）、柞蚕（Anteraea pernyi）楓蚕（Eriogyna pyretorum）、蓖蚕（Pilosamia Cynthia ricini）、樗蚕（Samia cynthia）、栗虫（Caligura japonica）、チュッサー蚕（Antheraea mylitta）、ムガ蚕（Antheraea assama）など）の絹タンパク質についての研究はあまり進んでいない。その理由としては、野蚕の絹タンパク質の場合、絹繊維（繭層）に含まれる夾雑物などの成分が多く、さらに、強固な繭構造を有することから、精製処理が難しいことなどが挙げられる。 Conventionally, attempts have been made to extract silk protein from silk thread produced by silk insects and to apply it to, for example, foods and drinks for health promotion, supplements, cosmetics, and pharmaceutical materials. However, most of the research subjects in the past are silk proteins (fibroin, sericin) of B.mori, and other wild silkworms (Bombyx mandarina), Saturniidae (Antheraea yamamai), ae (Anteraea pernyi) 楓 蚕 (Eriogyna pyretorum), 蓖 蚕 (Pilosamia Cynthia ricini), 樗 蚕 (Samia cynthia), chestnut (Caligura japonica), Chuther moth (Antheraea mylitta) ) And silk protein of Antheraea assama, etc.) are not well studied. The reason for this is that, in the case of wild silk protein, there are many components such as foreign substances contained in the silk fiber (cocoon layer), and further, since it has a strong cocoon structure, it is difficult to purify it.
本発明者は、野蚕のなかでも天蚕（Antheraea yamamai）の絹タンパク質の生理機能に関する研究を進め、効率的に天蚕セリシンを抽出する方法を提案するとともに（特許文献１）、天蚕セリシンの免疫賦活機能（免疫細胞増殖活性）について報告している（非特許文献１）。 The present inventor has advanced research on the physiological function of silk protein of Antheraea yamamai among wild silkworms, and proposes a method for efficiently extracting Tenjiri sericin (Patent Document 1), and immunostimulatory function of Tenjiri sericin. (Immune cell proliferation activity) has been reported (Non-patent Document 1).
具体的には、非特許文献１には、１）天蚕の繭層を100倍量の温水（65℃）で3分間洗浄し、得られた繭層を50倍量の0.4％（W/V）Na２CO３、0.1％（W/V）NaOH溶液により98℃、7分の精練処理を行うこと、２）得られた抽出液を急冷（15min,25℃）し、遠心または１時間静置することにより、Ca(COO)２等の不純物を沈殿させ、その上澄み液を透析し凍結乾燥させて天蚕セリシンパウダーを得たこと、３）天蚕セリシンパウダーには、免疫賦活機能（免疫細胞増殖活性）が確認されたこと、などが記載されている。非特許文献１の抽出方法によれば、Ca(COO)２等の不純物を沈殿除去するための時間を大幅に短縮することができる。 Specifically, Non-Patent Document 1 describes: 1) Washing a cocoon cocoon layer with 100 times the amount of warm water (65 ° C) for 3 minutes, and then removing the cocoon layer obtained by 0.4 times (W / V) ) Scouring treatment with Na 2 CO 3 , 0.1% (W / V) NaOH solution at 98 ° C for 7 min. 2) Quenching the obtained extract (15 min, 25 ° C) and centrifuging or letting it stand for 1 hour. 3) Precipitation of impurities such as Ca (COO) 2 and dialysis and lyophilization of the supernatant liquid to obtain a tense sericin powder. 3) Tendon sericin powder has an immunostimulatory function (immune cell proliferation). (Activity) has been confirmed. According to the extraction method of Non-Patent Document 1, it is possible to significantly reduce the time for removing impurities such as Ca (COO) 2 by precipitation.
しかしながら、非特許文献１の方法の場合、天蚕セリシンの収率については必ずしも十分でなく、効率性やコストの点においてさらに改善すべき点があると考えられた。また、天蚕セリシンの機能についてもさらなる検討が望まれていた。 However, in the case of the method of Non-Patent Document 1, the yield of sericin sericin is not necessarily sufficient, and it is considered that there are further points to be improved in terms of efficiency and cost. In addition, further studies have been desired on the function of tengu sericin.
本発明の天蚕セリシンの抽出・精製方法は、以下のことを特徴としている。
＜１＞以下の工程：
（１）90℃〜98℃であり、かつ、0.010〜0.025％のNaOHと0.490〜0.475％のNa２CO３を含み、NaOHとNa２CO３の合計が全液量の0.5％であるNaOH／Na２CO３混合液に、天蚕由来の絹繊維を1〜10分間浸漬して、天蚕セリシンを含む精練液を得る精練工程；
（２）精練液を含む容器を、外部から15℃〜25℃の水で冷却する第１冷却工程；
（３）精練液を含む容器を、外部から0℃〜10℃の水または氷水で冷却する第２冷却工程；
（４）第１、２冷却工程を経た精練液を遠心分離する遠心工程；および
（５）遠心分離後の精練液を透析して天蚕セリシン溶液を得る透析工程
を含む。
＜２＞第１冷却工程における冷却時間は5〜10分であり、第２冷却工程における冷却時間は、30分〜1時間である。
＜３＞精練工程におけるNaOH／Na２CO３混合液は、NaOHの濃度が0.025％であり、かつ、Na２CO３の濃度が0.475％である。
＜４＞透析工程後、（６）天蚕セリシン溶液を凍結乾燥して天蚕セリシン粉末を得る工程を含む。
The method for extracting and purifying Tenjiri sericin of the present invention is characterized by the following.
<1> The following steps:
(1) is 90 ° C. to 98 ° C., and comprises Na 2 CO 3 and 0.010 to 0.025% of NaOH 0.490~ 0.475%, NaOH sum of NaOH and Na 2 CO 3 is 0.5% of the total liquid volume Scouring step of obtaining a scouring solution containing sericin from tengu by immersing silk fiber derived from tengu for 1 to 10 minutes in / Na 2 CO 3 mixed solution;
(2) The 1st cooling process which cools the container containing a scouring liquid with 15 to 25 degreeC water from the outside;
(3) a second cooling step of cooling the container containing the scouring solution with water or ice water at 0 ° C. to 10 ° C. from the outside;
(4) a centrifuging step for centrifuging the scoured liquid that has undergone the first and second cooling steps; and (5) a dialysis step for dialysis of the scoured liquid after centrifugation to obtain a sericin solution.
<2> The cooling time in the first cooling step is 5 to 10 minutes, and the cooling time in the second cooling step is 30 minutes to 1 hour.
<3> The NaOH / Na 2 CO 3 mixed solution in the scouring step has a NaOH concentration of 0.025% and a Na 2 CO 3 concentration of 0.475%.
<4> After the dialysis step, (6) including a step of freeze-drying the tengu sericin solution to obtain a tengu sericin powder.
本発明の天蚕セリシン溶液は、＜５＞前記＜１＞〜＜３＞の天蚕セリシンの抽出・精製方法によって得られた天蚕セリシン溶液であって、天蚕セリシンを含む天蚕セリシン溶液であって、天蚕セリシンは、アミノ酸組成として、スレオニン13.0 Mol％以上15.0 Mol％以下、セリン20.0 Mol％以上23.4 Mol％以下、ヒスチジン2.0 Mol％以上2.6 Mol％以下、アルギニン3.5 Mol％以上3.7Mol％以下を含み、かつ、分子量が15kDa〜120kDaであることを特徴としている。 The tengu sericin solution of the present invention is a tengu sericin solution obtained by the method for extracting and purifying tengu sericin according to <5> above <1> to <3>, and is a tengu sericin solution containing tengu sericin, Sericin has an amino acid composition containing threonine 13.0 mol% to 15.0 mol% , serine 20.0 mol% to 23.4 mol% , histidine 2.0 mol% to 2.6 mol% , arginine 3.5 mol% to 3.7 mol% , and The molecular weight is 15 kDa to 120 kDa.
本発明の天蚕セリシン粉末は、＜６＞前記＜４＞の天蚕セリシンの抽出・精製方法によって得られた天蚕セリシン粉末であって、アミノ酸組成として、スレオニン13.0 Mol％以上15.0 Mol％以下、セリン20.0 Mol％以上23.4 Mol％以下、ヒスチジン2.0 Mol％以上2.6 Mol％以下、アルギニン3.5 Mol％以上3.7Mol％以下を含み、かつ、分子量が15kDa〜120kDaであることを特徴としている。 The tengu sericin powder of the present invention is a tengu sericin powder obtained by <6> the method for extracting and purifying tengu sericin of <4>, and has an amino acid composition of threonine of 13.0 mol% to 15.0 mol% , serine 20.0 It is characterized by containing Mol% or more and 23.4 Mol% or less , histidine 2.0 Mol% or more and 2.6 Mol% or less , arginine 3.5 Mol% or more and 3.7 Mol% or less , and having a molecular weight of 15 kDa to 120 kDa.
本発明の抗加齢用医薬組成物は、＜７＞前記天蚕セリシン溶液または前記天蚕セリシン粉末を含むことを特徴としている。 The anti-aging pharmaceutical composition of the present invention is characterized by comprising <7> the tengu sericin solution or the tengu sericin powder.
本発明の抗加齢用食品は、＜８＞前記天蚕セリシン溶液または前記天蚕セリシン粉末を含むことを特徴としている。 The anti-aging food of the present invention is characterized in that it contains <8> the tengu sericin solution or the tengu sericin powder.
本発明の抗ガン用医薬組成物は、＜９＞前記天蚕セリシン溶液または前記天蚕セリシン粉末を含むことを特徴としている。 The pharmaceutical composition for anticancer of the present invention is characterized by comprising <9> the tengu sericin solution or the tengu sericin powder.
本発明の抗ガン用食品は、＜１０＞前記天蚕セリシン溶液または前記天蚕セリシン粉末を含むことを特徴としている。 The anti-cancer food of the present invention is characterized in that it contains <10> the tengu sericin solution or the tengu sericin powder.
本発明の免疫賦活用医薬組成物は、＜１１＞前記天蚕セリシン溶液または前記天蚕セリシン粉末を含むことを特徴としている。 The immunostimulatory pharmaceutical composition of the present invention is characterized by comprising <11> the tengu sericin solution or the tengu sericin powder.
本発明の免疫賦活用食品は、＜１２＞前記天蚕セリシン溶液または前記天蚕セリシン粉末を含むことを特徴としている。 The immunostimulating food of the present invention is characterized in that it contains <12> the sericin solution or the sericin powder.
本発明の化粧料は、＜１３＞前記天蚕セリシン溶液または前記天蚕セリシン粉末を含むことを特徴としている。 The cosmetic of the present invention is characterized in that it comprises <13> the sericin solution or the sericin powder.
本発明の天蚕セリシン抽出・精製方法によれば、天蚕セリシンの収率を高め、抽出・精製に伴うコストも抑制することができる。本発明の天蚕セリシン抽出・精製方法によって得られた天蚕セリシンは、従来知られていなかった抗加齢作用や顕著な抗ガン作用、免疫賦活作用、UV吸収作用を発揮する。 According to the method for extracting and purifying sericin of the present invention, the yield of sericin sericin can be increased and the cost associated with extraction and purification can be suppressed. Tendon sericin obtained by the tengu sericin extraction / purification method of the present invention exhibits an anti-aging action, a marked anti-cancer action, an immunostimulatory action, and a UV absorption action that were not conventionally known.
本発明の天蚕セリシンの抽出・精製方法の原料として使用される絹繊維は、天蚕（Antheraea yamamai）が吐糸したものであって、例えば、天蚕が蛹化の前に形成した楕円球状の繭層を切開し、適宜な長さの繊維に切断したものを使用することができる。 The silk fiber used as a raw material for the extraction / purification method of the tengu sericin of the present invention is spun by Tenther (Antheraea yamamai), for example, the oval spider layer formed by Tendon before hatching Can be cut and cut into fibers of an appropriate length.
以下、本発明の天蚕セリシン抽出・精製方法の一実施形態について説明する。 Hereinafter, an embodiment of the method for extracting and purifying sericin of the present invention will be described.
本発明の天蚕セリシン抽出・精製方法は、以下の工程：
（１）90℃〜98℃であり、かつ、0.010〜0.050％のNaOHと0.490〜0.450％のNa２CO３を含み、NaOHとNa２CO３の合計が全液量の0.5％であるNaOH／Na２CO３混合液に、天蚕由来の絹繊維を浸漬して、天蚕セリシンを含む精練液を得る精練工程；
（２）精練液を含む容器を、外部から15℃〜25℃の水で冷却する第１冷却工程；
（３）精練液を含む容器を、外部から0℃〜10℃の水または氷水で冷却する第２冷却工程；
（４）第１、２冷却工程を経た精練液を遠心分離する遠心工程；および
（５）遠心分離後の精練液を透析して天蚕セリシン溶液を得る透析工程
を含む。
The method for extracting and purifying sericin of the present invention includes the following steps:
(1) NaOH that is 90 ° C. to 98 ° C. and contains 0.010 to 0.050% NaOH and 0.490 to 0.450% Na 2 CO 3 , and the total of NaOH and Na 2 CO 3 is 0.5% of the total liquid amount A scouring step of immersing silk fiber derived from tengu in a / Na 2 CO 3 mixed solution to obtain a scouring solution containing tengu sericin;
(2) The 1st cooling process which cools the container containing a scouring liquid with 15 to 25 degreeC water from the outside;
(3) a second cooling step of cooling the container containing the scouring solution with water or ice water at 0 ° C. to 10 ° C. from the outside;
(4) a centrifuging step for centrifuging the scoured liquid that has undergone the first and second cooling steps; and (5) a dialysis step for dialysis of the scoured liquid after centrifugation to obtain a sericin solution.
本発明の天蚕セリシン抽出・精製方法では、好ましくは、精練工程の前に天蚕由来の絹繊維を洗浄する工程を含むことができる。 In the method of extracting and purifying sericin of the present invention, it is preferable that a step of washing silk fiber derived from tempura before the scouring step can be included.
絹繊維の洗浄は、例えば、取得した天蚕由来の絹繊維（繭層）を、40℃〜80℃程度の温水（純水）に2〜10分間程度浸漬して行うことができる。この際、絹繊維と温水との浴比は、1：50〜1：200程度の範囲を好ましく例示することができる。なお、本発明において、「浴比」とは、絹繊維の重量と、液体（水、アルカリ溶液）の重量（液量）との比をいう。 The washing of the silk fibers can be performed, for example, by immersing the obtained silk fiber derived from tengu (cocoon layer) in warm water (pure water) at about 40 ° C. to 80 ° C. for about 2 to 10 minutes. Under the present circumstances, the range of about 1: 50-1: 200 can be preferably illustrated for the bath ratio of silk fiber and warm water. In the present invention, the “bath ratio” refers to the ratio of the weight of the silk fiber and the weight (liquid amount) of the liquid (water, alkaline solution).
洗浄工程によって、絹繊維に付着していた夾雑物や細菌類などを除去することができる。洗浄工程によって予め夾雑物などを除去することで、セリシン抽出物に不純物が混入することが抑制される。 By the washing process, impurities, bacteria, and the like attached to the silk fibers can be removed. By removing impurities and the like in advance by the washing step, it is possible to prevent impurities from being mixed into the sericin extract.
次に、精練工程では、90℃〜98℃であり、かつ、0.010〜0.050％（w/v）のNaOHと0.490〜0.450％（w/v）のNa２CO３を含み、NaOHとNa２CO３の合計が全溶液量の0.5％（w/v）であるNaOH／Na２CO３混合液（混合水溶液）に、天蚕由来の絹繊維を浸漬して天蚕セリシンを抽出する。高価な溶剤を使用する必要がないことから、コストを低く抑えることができる。 Next, in the scouring process, it is 90 ° C to 98 ° C, and contains 0.010 to 0.050% (w / v) NaOH and 0.490 to 0.450% (w / v) Na 2 CO 3 , and NaOH and Na 2 Tendon-derived silk fibers are immersed in a NaOH / Na 2 CO 3 mixed solution (mixed aqueous solution) in which the total amount of CO 3 is 0.5% (w / v) of the total solution amount, and tenjiki sericin is extracted. Since it is not necessary to use an expensive solvent, the cost can be kept low.
NaOH／Na２CO３混合液において、NaOHが0.010〜0.050％（w/v）、Na２CO３が0.490〜0.450％（w/v）の割合で、合わせて、混合液の全体量の0.5％（w/v）となるように配合されていることで、セリシン由来成分の損失やフィブロイン由来成分の混入を抑制することができ、安定かつ高収率でセリシンを抽出することができる。 In the NaOH / Na 2 CO 3 mixed solution, NaOH is 0.010 to 0.050% (w / v) and Na 2 CO 3 is 0.490 to 0.450% (w / v). % (W / v), the loss of sericin-derived components and the mixing of fibroin-derived components can be suppressed, and sericin can be extracted in a stable and high yield.
NaOHとNa２CO３の濃度が上記範囲外であると、天蚕セリシンの抽出が不十分であったり、天蚕セリシンが溶液中で溶解しない状態になったりすることで、天蚕セリシンの収率が低下する。また、例えば、NaOH／Na２CO３混合液が0.5％（w/v）より大きい場合には、過度にセリシンが分解されて特異的機能の解析が難しくなるとともに、精練液にフィブロイン由来の成分が混入する恐れがある。 If the concentration of NaOH and Na 2 CO 3 is outside the above range, the extraction of Tenshin sericin will be insufficient, or Tenjin sericin will not dissolve in the solution, resulting in a decrease in Tendon sericin yield. To do. In addition, for example, when the NaOH / Na 2 CO 3 mixture is larger than 0.5% (w / v), sericin is excessively decomposed and it becomes difficult to analyze specific functions, and components derived from fibroin are contained in the scouring solution. There is a risk of contamination.
さらに、NaOH／Na２CO３混合液は、NaOHが0.025％（w/v）であり、Na２CO３が0.475％（w/v）であることが特に好ましい。NaOHとNa２CO３がこの割合であることによって、天蚕セリシンが過度に分解されることなく、天蚕セリシンの収率は最大になる。 Furthermore, it is particularly preferable that the NaOH / Na 2 CO 3 mixed solution has a NaOH content of 0.025% (w / v) and a Na 2 CO 3 content of 0.475% (w / v). This ratio of NaOH and Na 2 CO 3 maximizes the yield of sericin sericin without excessive degradation of sericin sericin.
また、NaOH／Na２CO３混合液の温度が90℃以下の場合には効率的にセリシンを抽出することが難しく、一方、NaOH／Na２CO３混合液の温度が98℃以上の場合には、過度にセリシンが分解されて特異的機能の解析が難しくなるとともに、精練液にフィブロイン由来の成分が混入する恐れがある。 Moreover, when the temperature of the NaOH / Na 2 CO 3 mixture is 90 ° C or lower, it is difficult to extract sericin efficiently, while when the temperature of the NaOH / Na 2 CO 3 mixture is 98 ° C or higher. , Sericin is excessively decomposed, making it difficult to analyze specific functions, and components derived from fibroin may be mixed in the scouring solution.
絹繊維とNaOH／Na２CO３混合液の好ましい浴比は、1：25〜1：100程度の範囲であり、より好ましくは、浴比1：50程度である。浴比がこの範囲であると、効率的にセリシンを抽出することができる。 A preferable bath ratio of the silk fiber and the NaOH / Na 2 CO 3 mixed solution is in the range of about 1:25 to 1: 100, more preferably about 1:50. When the bath ratio is within this range, sericin can be efficiently extracted.
そして、精練工程において、絹繊維をNaOH／Na２CO３混合液に浸漬する時間は、およそ1〜10分程度とすることができる。精練の時間が1分未満であるとセリシンの抽出が不十分になる恐れがあり、10分を超えて精練を行うと過度にセリシンが分解されて、セリシンの特異的機能を解析することが難しくなるとともに、精練液にフィブロイン由来の成分が混入する恐れがある。 In the scouring step, the time for immersing the silk fiber in the NaOH / Na 2 CO 3 mixed solution can be about 1 to 10 minutes. If scouring time is less than 1 minute, extraction of sericin may be insufficient, and if scouring exceeds 10 minutes, sericin is excessively decomposed and it is difficult to analyze the specific function of sericin. At the same time, components derived from fibroin may be mixed into the scouring liquid.
次に、抽出残渣が残存する精練液を、例えばガラスフィルターなどを用いて濾過し、抽出残渣と精練液とに分別することができる。この精練液には高分子量のセリシンが含まれ、一方、抽出残渣にはフィブロインが含まれている。 Next, the scouring liquid in which the extraction residue remains can be filtered using, for example, a glass filter, and separated into the extraction residue and the scouring liquid. This scouring solution contains high molecular weight sericin, while the extraction residue contains fibroin.
そして、この精練液を含む容器を、外部から15℃〜25℃の水で冷却する（第１冷却工程）。第１冷却工程での冷却時間は5〜10分程度であることが好ましい。さらに、第１冷却工程である程度の温度まで低下した精練液を、再び外部から0℃〜10℃の水または氷水で冷却する（第２冷却工程）。第２冷却工程での冷却時間は30分〜1時間程度であることが好ましい。 And the container containing this scouring liquid is cooled with 15 to 25 degreeC water from the exterior (1st cooling process). The cooling time in the first cooling step is preferably about 5 to 10 minutes. Further, the scouring liquid that has been lowered to a certain temperature in the first cooling step is again cooled with water or ice water at 0 ° C. to 10 ° C. from the outside (second cooling step). The cooling time in the second cooling step is preferably about 30 minutes to 1 hour.
このような２段階の冷却工程を経ることで、次の工程までの時間を大幅に短縮することができる。 By passing through such a two-stage cooling process, the time to the next process can be greatly shortened.
次に、２段階の冷却工程を経た精練液を、遠心分離機で遠心する（遠心工程）。遠心工程での回転数や時間などは、適宜設定することができるが、例えば、2000rpmで5分間程度遠心分離することができる。精練液を遠心することで、精練液中のCa(COO)２等の不純物を沈殿させることができる。 Next, the scoured liquid that has undergone the two-stage cooling process is centrifuged with a centrifuge (centrifugation process). The number of rotations, time, and the like in the centrifugation step can be appropriately set. For example, centrifugation can be performed at 2000 rpm for about 5 minutes. By centrifuging the scouring liquid, impurities such as Ca (COO) 2 in the scouring liquid can be precipitated.
そして、遠心分離後の精練液の上澄み液を透析して天蚕セリシン溶液を得る（透析工程）。なお、この透析工程の前に、精練液を濾紙によって濾過するなどの処理を行ってもよい。 Then, the supernatant of the semen solution after centrifugation is dialyzed to obtain a sericin solution (dialysis step). In addition, you may perform the process of filtering a scouring liquid with a filter paper before this dialysis process.
精練液の透析の方法は特に限定されないが、簡便かつ確実な方法として、例えば水による透析を例示することができる。具体的には、例えば、精練液を市販の透析用セルロースチューブに充填し、5〜25℃程度の流水あるいは純水による透析を所定の時間行うことができる。また、透析は、各種の有機酸でｐＨを調整して行うこともできる。さらに、市販の装置を用いた電気透析を採用することもできる。なお、透析後には、適宜、濾過処理を行うことも考慮される。透析によって天蚕セリシン由来の成分が流出することはなく、例えば、分子量１万以下の低分子のペプチドなどが取り除かれた天蚕セリシン溶液を得ることができる。この天蚕セリシン溶液中に含まれるセリシンは、＜１＞100〜120kDa付近のグループ、＜２＞35〜50kDa付近のグループ、及び＜３＞15〜25kDa付近のグループがラダー状になった蛋白質が検出された。特に、グループ＜１＞では100kDa付近に、グループ＜２＞では40kDa付近に、グループ＜３＞では20kDa付近に濃度の濃いバンドが見出された。 The method of dialysis of the scouring liquid is not particularly limited, but as a simple and reliable method, for example, dialysis with water can be exemplified. Specifically, for example, a commercially available cellulose tube for dialysis is filled with a scouring solution, and dialysis with running water or pure water at about 5 to 25 ° C. can be performed for a predetermined time. Dialysis can also be performed by adjusting the pH with various organic acids. Furthermore, electrodialysis using a commercially available apparatus can be employed. In addition, performing a filtration process suitably after dialysis is also considered. The components derived from sericin do not flow out by dialysis, and for example, a sericin solution from which low-molecular peptides having a molecular weight of 10,000 or less are removed can be obtained. The sericin contained in this Tenjiri sericin solution was detected as a ladder-like protein in <1> 100-120 kDa group, <2> 35-50 kDa group, and <3> 15-25 kDa group. It was done. In particular, a high concentration band was found near 100 kDa in group <1>, around 40 kDa in group <2>, and around 20 kDa in group <3>.
本発明の方法では、特に精練工程において、従来全く検討されてこなかった低濃度のNaOH（0.010〜0.050％（w/v））と、Na２CO３の混合液が使用されるため、高温での処理時間は短くてよく、このため、精練液を透析した天蚕セリシン溶液には、フィブロイン由来の成分が含まれず、セリシンが分解され過ぎることなく、そのアミノ酸組成や分子量が安定している。このため、抽出されたセリシンは、その特異的機能を解析するための試料として優れている。 In the method of the present invention, since a mixed solution of low concentration NaOH (0.010 to 0.050% (w / v)) and Na 2 CO 3 which has not been studied at all in the scouring process is used at a high temperature. Therefore, the sericin solution obtained by dialyzing the scouring solution does not contain fibroin-derived components, and sericin is not decomposed excessively and its amino acid composition and molecular weight are stable. For this reason, the extracted sericin is excellent as a sample for analyzing its specific function.
そして、この天蚕セリシン溶液を凍結乾燥することで、可溶性の天蚕セリシン粉末を得ることができる。 And this soluble sericin solution can be freeze-dried to obtain a soluble sericin powder.
本発明の方法で得た天蚕セリシン溶液および天蚕セリシン粉末は、飲食品、サプリメント、化粧料、医薬品材料などに利用することができ、また、天蚕セリシンの各種の機能解析などに好適に利用することができる。 Tendon sericin solution and tengu sericin powder obtained by the method of the present invention can be used for foods and drinks, supplements, cosmetics, pharmaceutical materials, etc., and suitably used for various functional analyzes of tengu sericin. Can do.
また、本発明の方法で得られた天蚕セリシン溶液（粉末）は、例えば、従来の方法（例えば、Isolation and characterization of a 41 kDa sericin from the wild silkmoth Antheraea yamamai, Journal of Insect Biotechnology and Sericology 2009 Vol. 78 No. 1 pp.11-16）で得られた天蚕セリシン粉末とは、異なるアミノ酸組成を有している。具体的には、本発明の方法で得られた天蚕セリシン溶液（粉末）は、従来の方法で得られた天蚕セリシン粉末と比較して、スレオニン、セリン、ヒスチジン、アルギニンなどが多く含まれている。より具体的には、本発明の方法で得られた天蚕セリシン粉末中のアミノ酸は、スレオニン13.0 Mol％以上、セリン20.0 Mol％以上、ヒスチジン2.0 Mol％以上、アルギニン3.5 Mol％以上含まれている。また、アスパラギン酸も15.0 Mol％以上、グリシンも19.0Mol％以上含まれている。 In addition, the tengu sericin solution (powder) obtained by the method of the present invention can be obtained by, for example, a conventional method (for example, Isolation and characterization of a 41 kDa sericin from the wild silkmoth Antheraea yamamai, Journal of Insect Biotechnology and Sericology 2009 Vol. 78 No. 1 pp.11-16) has a different amino acid composition from that of Tenjiri sericin powder. Specifically, the tengu sericin solution (powder) obtained by the method of the present invention contains more threonine, serine, histidine, arginine and the like than the tengu sericin powder obtained by the conventional method. . More specifically, the amino acids in the sericin powder obtained by the method of the present invention contain threonine 13.0 mol% or more, serine 20.0 mol% or more, histidine 2.0 mol% or more, and arginine 3.5 mol% or more. Further, aspartic acid is also contained at 15.0 mol% or more, and glycine is also contained at 19.0 mol% or more.
さらに、本発明者らによって、本発明の方法で得られた天蚕セリシン溶液および天蚕セリシン粉末の抗加齢作用が確認されている。したがって、本発明の方法で得られた天蚕セリシン（溶液または粉末）を有効成分として配合することで、抗加齢用の医薬組成物、食品（サプリメントなどを含む）などとすることができる。 Furthermore, the anti-aging action of the tengu sericin solution and tengu sericin powder obtained by the method of the present invention has been confirmed by the present inventors. Therefore, the anti-aging pharmaceutical composition, food (including supplements) and the like can be obtained by blending the sericin sericin (solution or powder) obtained by the method of the present invention as an active ingredient.
また、本発明の方法で得られた天蚕セリシン溶液および天蚕セリシン粉末には、免疫賦活作用と抗ガン作用も確認されている。したがって、本発明の方法で得られたセリシン（溶液または粉末）を有効成分として配合することで、免疫賦活用、抗ガン用の医薬組成物、食品（サプリメントなどを含む）などとすることもできる。 Moreover, the immunostimulatory action and the anticancer action are also confirmed in the sericin solution and the sericin powder obtained by the method of the present invention. Therefore, by using sericin (solution or powder) obtained by the method of the present invention as an active ingredient, it can be used as an immunostimulatory, anti-cancer pharmaceutical composition, food (including supplements, etc.), etc. .
天蚕セリシン粉末を医薬組成物の有効成分とする場合には、通常経口摂取に用いられる剤形に加工することができる。具体的には、錠剤、丸剤、粉剤、トローチ剤、分包包装、オブラート剤、エリキシル剤、懸濁剤、乳剤、液剤、シロップ、エアロゾル剤、および無菌包装粉剤などの形をとることができる。 When the sericin powder is used as an active ingredient of a pharmaceutical composition, it can be processed into a dosage form usually used for oral intake. Specifically, it can take the form of tablets, pills, powders, troches, sachets, packages, wafers, elixirs, suspensions, emulsions, solutions, syrups, aerosols, and sterile packaging powders. .
また、天蚕セリシン（溶液または粉末）を含む医薬組成物および食品には、許容される各種の添加剤として、例えば、慣用の賦形剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、保存剤、甘味剤、芳香剤なども適宜加えることができる。さらに具体的には、例えば、乳糖、デキストロース、ショ糖、ソルビトール、マンニトール澱粉、アラビアゴム、リン酸カルシウム、アルギン酸塩、トラガカント、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微晶セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、およびメチルセルロースなどが例示される。 In addition, for pharmaceutical compositions and foods that contain tengu sericin (solution or powder), various acceptable additives include, for example, conventional excipients, wetting agents, emulsifiers, dispersants, preservatives, sweeteners, A fragrance | flavor etc. can also be added suitably. More specifically, for example, lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol starch, gum arabic, calcium phosphate, alginate, tragacanth, gelatin, calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, and Examples include methylcellulose.
さらに、天蚕セリシン（溶液または粉末）を含む医薬組成物では、その投与対象は限定されないが、例えば、投与対象としては、ヒトを含む哺乳動物を例示することができる。また、天蚕セリシン粉末を含む医薬組成物では、投与量、投与期間などは、動物種や個体の体重等に応じて適宜決定することができる。 Furthermore, in the pharmaceutical composition containing tengu sericin (solution or powder), the administration subject is not limited, but examples of the administration subject include mammals including humans. Moreover, in a pharmaceutical composition containing tengu sericin powder, the dose, administration period, and the like can be appropriately determined according to the animal species, the body weight of the individual, and the like.
また、本発明の方法で得られた天蚕セリシン（天蚕セリシン溶液、粉末）には、優れたUV吸収作用があることが確認されてもいる。したがって、本発明の方法で得られた天蚕セリシンを有効成分として配合することで、UV吸収性を有する化粧料として有効に利用することができる。 In addition, it has been confirmed that the sericin sericin (a sericin solution, powder) obtained by the method of the present invention has an excellent UV absorbing action. Therefore, by blending the sericin sericin obtained by the method of the present invention as an active ingredient, it can be effectively used as a cosmetic having UV absorption.
本発明の天蚕セリシン含む化粧料は、例えば、本発明の方法で得られた天蚕セリシン（天蚕セリシン溶液、粉末）と、好適な化粧料基材成分とを混合することで得ることができる。 The cosmetic containing the sericin sericin of the present invention can be obtained, for example, by mixing the sericin sericin obtained by the method of the present invention (a sericin solution, powder) and a suitable cosmetic base material component.
化粧料基材成分は、例えば、水（精製水、温泉水、深層水等）、油剤、界面活性剤、金属セッケン、保湿剤、ゲル化剤、アルコール類、水溶性高分子、粉体、pH調整剤、皮膜形成剤、樹脂、紫外線防御剤、包接化合物、抗菌剤、香料、消臭剤、塩類、清涼剤、動物・微生物由来抽出物、植物抽出物、血行促進剤、収歛剤、抗脂漏剤、活性酸素消去剤、細胞賦活剤、角質溶解剤、酵素、ホルモン類、ビタミン類などを例示することができる。 Cosmetic base components include, for example, water (purified water, hot spring water, deep water, etc.), oil agent, surfactant, metal soap, moisturizer, gelling agent, alcohols, water-soluble polymer, powder, pH Conditioner, film forming agent, resin, UV protection agent, inclusion compound, antibacterial agent, fragrance, deodorant, salt, refreshing agent, animal / microbe-derived extract, plant extract, blood circulation promoter, astringent, Examples include antiseborrheic agents, active oxygen scavengers, cell activators, keratolytic agents, enzymes, hormones, vitamins, and the like.
本発明の化粧料は、その組成において、例えば、天蚕セリシンを化粧料基材に対して100〜2000ppmの範囲で含有し、pHが6.5〜11.0の範囲内であることが好ましい。天蚕セリシンの含有量が100ppm未満では上記の効果が得にくく、また2000ppmを超える場合にはべたつき感が増す傾向にある。 In the composition of the cosmetic of the present invention, it is preferable that, for example, sericin sericin is contained in the range of 100 to 2000 ppm with respect to the cosmetic base, and the pH is in the range of 6.5 to 11.0. When the content of sericin sericin is less than 100 ppm, it is difficult to obtain the above effect, and when it exceeds 2000 ppm, the sticky feeling tends to increase.
本発明の化粧料は、UV吸収波長領域が広く、ワイドバンドでの吸収効果と吸収率の顕著な高さとを有していることから、そのUV吸収効果を発現させる各種の形態での使用が考慮される。 The cosmetic of the present invention has a wide UV absorption wavelength region and has a wide band absorption effect and a remarkably high absorption rate, so that it can be used in various forms that exhibit the UV absorption effect. Be considered.
本発明のセリシン抽出・精製方法は、以上の実施形態に限定されるものではない。また、本発明の抗加齢用医薬組成物、抗加齢用食品、抗ガン用医薬組成物、抗ガン用食品、免疫賦活用医薬組成物、免疫賦活用食品および化粧料についても、以上の実施形態に限定されるものではない。 The sericin extraction / purification method of the present invention is not limited to the above embodiment. Further, the anti-aging pharmaceutical composition, anti-aging food, anti-cancer pharmaceutical composition, anti-cancer food, immunostimulating pharmaceutical composition, immunostimulating food and cosmetic of the present invention are also as described above. It is not limited to the embodiment.
以下、実施例により本発明のセリシン抽出・精製方法をさらに詳しく説明するが、本発明のセリシン抽出・精製方法は、以下の実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, the method for extracting and purifying sericin according to the present invention will be described in more detail with reference to examples. However, the method for extracting and purifying sericin according to the present invention is not limited to the following examples.
＜実施例１＞天蚕由来セリシンの抽出、精製
天蚕由来セリシンの抽出、精製の工程を図１に沿って説明する。図１は、本発明の天蚕セリシン抽出・精製方法の一実施形態を例示したフローチャートである。
<Example 1> Extraction and Purification of Tengu-derived Sericin The steps of extraction and purification of Tendon-derived sericin will be described with reference to FIG. FIG. 1 is a flowchart illustrating an embodiment of the method for extracting and purifying sericin of the present invention.
材料の絹繊維は、天蚕の繭を切開して得た繭層を使用した。この繭層を、65℃の純水（浴比1：100）で3分間洗浄して、夾雑物や細菌類を除去した。 As the silk fiber of the material, a cocoon layer obtained by incising a cocoon of a tengu was used. This soot layer was washed with 65 ° C. pure water (bath ratio 1: 100) for 3 minutes to remove impurities and bacteria.
次に、精練工程として、0.025％（w/v）NaOHと、0.475％（w/v）Na２CO３を含む98℃のNaOH／Na２CO３混合液に、洗浄した繭層を浴比1：50で7分間浸漬してセリシンを抽出し、精練液を得た。 Next, as a scouring process, the washed soot layer is bathed in a 98 ° C NaOH / Na 2 CO 3 mixture containing 0.025% (w / v) NaOH and 0.475% (w / v) Na 2 CO 3 . Sericin was extracted by dipping for 7 minutes at 1:50 to obtain a scouring solution.
さらに、この精練液を17Ｇガラスフィルターで沈殿物が混入しないように濾過し、抽出残渣（フィブロイン）と精練液とに分別した。 Furthermore, this scouring solution was filtered with a 17G glass filter so that no precipitate was mixed, and separated into an extraction residue (fibroin) and a scouring solution.
そして、第１冷却工程としてこの精練液を水道水で10分水冷（25℃）後、第２冷却工程として1時間氷冷（10℃）した。 Then, this scouring solution was cooled with tap water for 10 minutes (25 ° C.) as the first cooling step, and then ice-cooled (10 ° C.) for 1 hour as the second cooling step.
その後、遠心工程として、この精練液を遠心機で遠心（2,000rpm、5分間）して、精練液中のCa(COO)２等の不純物を沈殿させ、上澄み液を濾紙によって濾過した。 Thereafter, as a centrifuging step, this scouring solution was centrifuged (2,000 rpm, 5 minutes) to precipitate impurities such as Ca (COO) 2 in the scouring solution, and the supernatant was filtered through a filter paper.
そして、濾過後の精練液を透析用セルロースチューブ（エーディア株式会社、MWCO:10000）に充填し、20℃で流水透析2〜3日、純水透析1日行った後、再度、濾紙による濾過を行って天蚕セリシン溶液を得た。 Then, the filtered scouring solution is filled into a dialysis cellulose tube (Edia Co., Ltd., MWCO: 10000), running at 20 ° C for 2 to 3 days with flowing water dialysis, and 1 day with pure water dialysis, and then filtered again with filter paper. A tengu sericin solution was obtained.
この天蚕セリシン溶液を凍結乾燥して、天蚕セリシン粉末（可溶性パウダー）を得た。 This tengu sericin solution was lyophilized to obtain tengu sericin powder (soluble powder).
＜実施例２＞天蚕由来セリシンのアミノ酸組成分析
実施例１で得た天蚕セリシン粉末（可溶性パウダー）を6Nの塩酸1mlに溶解し、減圧封管した。封管したものを加水分解（110℃/24時間）を経て真空乾燥処理した後、Lithium citrate サンプルバッファー（pH2.2）で溶解し、孔径0.45μｍのフィルター（直径4mm, Millipore社）で濾過し、分析試料とした。分析試料は、アミノ酸アナライザー（JLC-500/v, 日本電子社）に注入してアミノ酸組成を測定した。
<Example 2> Analysis of amino acid composition of sericin derived from Tendon Tendon sericin powder (soluble powder) obtained in Example 1 was dissolved in 1 ml of 6N hydrochloric acid and sealed under reduced pressure. The sealed tube is hydrolyzed (110 ° C / 24 hours), vacuum-dried, dissolved in Lithium citrate sample buffer (pH 2.2), and filtered through a 0.45 µm pore size filter (diameter 4 mm, Millipore). An analysis sample was obtained. The analysis sample was injected into an amino acid analyzer (JLC-500 / v, JEOL Ltd.) and the amino acid composition was measured.
この結果を表１に示す。また、比較のため、従来の方法（Isolation and characterization of a 41 kDa sericin from the wild silkmoth Antheraea yamamai, Journal of Insect Biotechnology and Sericology 2009 Vol.78 No.1 pp.11-16）で得た天蚕セリシン粉末のアミノ酸組成も示す。 The results are shown in Table 1. For comparison, Tenjiri sericin powder obtained by a conventional method (Isolation and characterization of a 41 kDa sericin from the wild silkmoth Antheraea yamamai, Journal of Insect Biotechnology and Sericology 2009 Vol.78 No.1 pp.11-16) The amino acid composition of is also shown.
このようなアミノ酸組成の違いによって、実施例１で得た天蚕セリシン粉末は、従来の天蚕セリシン粉末とは異なる薬理作用を有している可能性が示唆された。 Due to such a difference in amino acid composition, it was suggested that the tengu sericin powder obtained in Example 1 may have a different pharmacological action from the conventional tengu sericin powder.
＜実施例３＞精練工程における精練濃度の検討
実施例１の精練工程におけるNaOH／Na２CO３混合液について、NaOHとNa２CO３の濃度を変更し、天蚕セリシンを得るために好適な比率を検討した。
For NaOH / Na 2 CO 3 mixture in the refining process of the <Example 3> Examination of scouring concentration in scouring step Example 1, by changing the concentration of NaOH and Na 2 CO 3, suitable for obtaining a wild silkworm sericin ratio It was investigated.
具体的には、精練工程において、NaOHとNa２CO３の比率が異なる以下の５種類のNaOH／Na２CO３混合液；
（１）NaOH：0.010％、Na２CO３：0.490％、
（２）NaOH：0.025％、Na２CO３：0.475％（実施例１と同じ）、
（３）NaOH：0.050％、Na２CO３：0.450％、
（４）NaOH：0.100％、Na２CO３：0.400％、
（５）NaOH：0.200％、Na２CO３：0.300％、
を使用し、実施例１と同様の精練工程、第１冷却工程、第２冷却工程、遠心工程、透析工程を経て、天蚕セリシン粉末を得た。
Specifically, in the scouring process, the following five kinds of NaOH / Na 2 CO 3 mixed solutions having different ratios of NaOH and Na 2 CO 3 ;
(1) NaOH: 0.010%, Na 2 CO 3 : 0.490%,
(2) NaOH: 0.025%, Na 2 CO 3 : 0.475% (same as Example 1),
(3) NaOH: 0.050%, Na 2 CO 3: 0.450%,
(4) NaOH: 0.100%, Na 2 CO 3 : 0.400%,
(5) NaOH: 0.200%, Na 2 CO 3 : 0.300%,
The sericin powder was obtained through the same scouring step, first cooling step, second cooling step, centrifugation step and dialysis step as in Example 1.
また、以下の通り、精練工程の後には、繭層重量に基づいて練減率を算出し、さらに、練減量（当初の繭層重量−精練後の繭層重量）と、天蚕セリシン粉末の回収量に基づいて天蚕セリシンの収率を算出した。 In addition, as described below, after the scouring step, the reduction rate is calculated based on the weight of the cocoon layer, and further, the amount of reduction (the initial cocoon layer weight−the cocoon layer weight after scouring) and recovery of the sericin powder The yield of sericin sericin was calculated based on the amount.
練減率＝（当初の繭層重量−精練後の繭層重量）／当初の繭層重量×１００
収率＝天蚕セリシン粉末の回収量／練減量×１００
結果を表２に示す。
Reduction rate = (initial dredging layer weight-dredging dredging layer weight) / initial dredging layer weight x 100
Yield = Recovered amount of Tenjiri sericin powder / Reduction amount × 100
The results are shown in Table 2.
特に、（２）NaOH：0.025％、Na２CO３：0.475％（実施例１と同じ）の場合には、その他の場合と比較して、練減率が26.9％となり、天蚕セリシンの収率が54.0％と最も大きくなることが確認された。 In particular, in the case of (2) NaOH: 0.025%, Na 2 CO 3 : 0.475% (same as in Example 1), the reduction rate was 26.9% compared to the other cases, and the yield of sericin sericin Was found to be the largest at 54.0%.
＜実施例４＞天蚕セリシン粉末の作用効果の検討１
マウス脾臓リンパ細胞（Ａ：全リンパ球細胞、Ｂ：リンパ球Ｂ細胞）について、天蚕セリシンによる免疫賦活作用の検討を行った。
<Example 4> Examination 1 of effect of tengu sericin powder
Mouse spleen lymphocytes (A: total lymphocyte cells, B: lymphocyte B cells) were examined for the immunostimulatory effect of Tendon sericin.
免疫賦活活性試験は、マウス脾臓由来のリンパ球細胞の細胞数を指標とした。活性および細胞数は還元型発色試薬であるWST-1［2-(4-lodophenyl）-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium，monosodium salt］（和光純薬）を用い、細胞内のミトコンドリアが持つ還元作用によって生成されるホルマザン塩の量を測定することで算出した。 In the immunostimulatory activity test, the number of lymphocytes derived from mouse spleen was used as an index. The activity and the number of cells were reduced to WST-1 [2- (4-lodophenyl) -3- (4-nitrophenyl) -5- (2,4-disulfophenyl) -2H-tetrazolium, monosodium salt] It was calculated by measuring the amount of formazan salt produced by the reducing action of the mitochondria in the cell.
実験動物は4-6週齢のICR系統マウス（雄、日本SLC）を用いた。培地の組成は、10％ウシ胎児血清 (FBS)、2 mMグルタミン、50 mM 2-メルカプトエタノール、 100 U/ml ペニシリン、100 μg/mlストレプトマイシン、10% NaCO3を含むRPMI 1640培地（日水製薬）を使用した。培養は5%CO2存在下、37℃湿潤条件のCO2インキュベーター内でおこなった。 The experimental animals used were 4-6 week old ICR strain mice (male, Japan SLC). The composition of the medium is RPMI 1640 medium (Nissui Pharmaceutical) containing 10% fetal bovine serum (FBS), 2 mM glutamine, 50 mM 2-mercaptoethanol, 100 U / ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin, 10% NaCO 3. )It was used. Culturing was performed in a CO 2 incubator at 37 ° C. in the presence of 5% CO 2 .
リンパ球浮遊液の調製は、藤原・淀井（1996）の方法を用いた。ジエチルエーテルで麻酔したマウスの頚椎を脱臼させ、屠殺したマウスから脾臓を取り出し、PBS(-)中で脾臓を磨砕し、セルストレーナー（孔径100 mm、FALCON）でろ過した。ろ液を遠心分離（1,100 rpm，10 min）し、上清を取り除いた。赤血球を除去するため、溶血バッファーであるトリス塩化アンモニウム溶液（0.14 M NH4Cl，17 mM Tris-HCl，pH 7.65）5 mlを沈殿に加え、ピペッティング後5分間常温でインキュベートした。その後、遠心分離（1,100 rpm，10 min）して上清を除去し、再度同量のトリス塩化アンモニウム溶液を加え、同様の操作をおこなった。上清を取り除いた後、洗浄のために30 mlのPBS(-)を加え、遠心分離（1,100 rpm，10 min）後、上清を除去した。同様の操作を2回おこない、溶血バッファーを取り除いた。得られた沈殿物に20 mlの培地を加えて懸濁し、懸濁液を50 mlの組織培養用フラスコ（FALCON）に移し、CO2インキュベーター内で2時間インキュベートした。その後、リンパ球以外の吸着細胞を取り除くため静かに上清を回収した。 The lymphocyte suspension was prepared by the method of Fujiwara and Sakurai (1996). The cervical spine of a mouse anesthetized with diethyl ether was dislocated, the spleen was removed from the sacrificed mouse, the spleen was ground in PBS (−), and filtered with a cell strainer (pore diameter 100 mm, FALCON). The filtrate was centrifuged (1,100 rpm, 10 min), and the supernatant was removed. In order to remove erythrocytes, 5 ml of a tris ammonium chloride solution (0.14 M NH 4 Cl, 17 mM Tris-HCl, pH 7.65) as a hemolysis buffer was added to the precipitate and incubated at room temperature for 5 minutes after pipetting. Thereafter, the supernatant was removed by centrifugation (1,100 rpm, 10 min), the same amount of tris ammonium chloride solution was added again, and the same operation was performed. After removing the supernatant, 30 ml of PBS (-) was added for washing, and after centrifugation (1,100 rpm, 10 min), the supernatant was removed. The same operation was performed twice to remove the hemolysis buffer. The resulting precipitate was suspended by adding 20 ml of the medium, and the suspension was transferred to a 50 ml tissue culture flask (FALCON) and incubated in a CO 2 incubator for 2 hours. Thereafter, the supernatant was gently collected to remove adsorbed cells other than lymphocytes.
回収したリンパ球浮遊液は0.4％トリパンブルー溶液を用いて生細胞のみ染色し、ビュルケルチュルク血球計算盤を用いて計数した。細胞数は5×106 cells/mlとなるように培地で調製し、リンパ球細胞懸濁液とした。懸濁液を96 wellマイクロプレートの各wellに90 μlずつ分注し、実験区にはDMSOおよび超純水を用いて検定濃度に調製したサンプル溶液を、対照区にはサンプルを調製する際に用いた溶媒を10 μlずつ添加した。CO2インキュベーター内で48時間培養後、WST-1溶液（13 mg WST-1、 1.4 mg 1-Methoxy PMS、20 ml PBS(-)）を10 μl添加しさらに4時間培養し、マイクロプレートリーダーを用いて波長450 nmにおける各wellの吸光度を測定し、細胞数の変化を算出した。 The collected lymphocyte suspension was stained with only 0.4% trypan blue solution and counted using a Bürkerturk hemocytometer. The cell count was adjusted to 5 × 10 6 cells / ml in a medium to prepare a lymphocyte cell suspension. 90 μl of the suspension was dispensed into each well of a 96-well microplate, the sample solution prepared with DMSO and ultrapure water was used for the experimental group, and the sample solution was prepared for the control group. 10 μl of the solvent used was added. After culturing for 48 hours in a CO 2 incubator, add 10 μl of WST-1 solution (13 mg WST-1, 1.4 mg 1-Methoxy PMS, 20 ml PBS (-)), and further culture for 4 hours. The absorbance of each well at a wavelength of 450 nm was measured, and the change in the number of cells was calculated.
実験区の吸光度を（A）、対照区の吸光度を（B）、サンプルカラーコントロールの吸光度を（C）とすると、各吸光度から免疫賦活活性を算出する計算式は以下のようになる。 Assuming that the absorbance of the experimental group is (A), the absorbance of the control group is (B), and the absorbance of the sample color control is (C), the formula for calculating the immunostimulatory activity from each absorbance is as follows.
細胞増殖率（%）= [( A−C ) / B] ×100
図２−Ａに、天蚕セリシンの濃度に対する全リンパ球細胞の増殖率を示す。
Cell growth rate (%) = [(A−C) / B] × 100
FIG. 2-A shows the proliferation rate of total lymphocyte cells with respect to the concentration of sericin.
Ｂ細胞を単離するために、B cell Isolation Kit mouse（Miltenyi Biotec社）を用いた。最初に、前述の全リンパ球を得るための工程と同様の手順でマウス脾臓リンパ細胞を 2 時間インキュベートした後、マウスリンパ細胞数を確認し、全リンパ球が 5×107 cells/ml になるように15 mlのチューブに分注した。細胞を遠心（1000 g，10分，4℃）し、上清を取り途き、沈殿物を得た。再懸濁のために MACS バッファー{PBS(-), pH 7.2, 0.5% bovine serum albumin(BSA), 2 mM EDTA}を 200 μl 加えて混和し、Biotin-Antibody Cocktail を50 μl加えて混和した後、4℃で 15 分間インキュベートした。さらに、MACSバッファーを 150 μl、Anti-Biotin MicroBeads を 100 μl加えて混和し、再び 4℃ で 15 分間インキュベートした。次に、細胞洗浄のために15 mlのチューブにMACSバッファーを 5〜10 ml 加えて遠心（1000 g，10分，4℃）し、上清を取り除いた。沈殿物に MACSバッファーを500 μl加えて細胞を懸濁させ、分離カラム（MACS 社）にアプライした後、MACS バッファーを 3 ml 加えて洗浄し、さらに同様の洗浄を 2 回おこなった。その後フラクションを回収し、2.5×106cells/ml の Ｂ 細胞を得た。このＢ細胞を用いて前述の全リンパ球に対する同様の手順で吸光度による免疫賦活活性を算出した。 In order to isolate B cells, B cell Isolation Kit mouse (Miltenyi Biotec) was used. First, incubate mouse spleen lymphocytes for 2 hours using the same procedure as above to obtain total lymphocytes, then check the number of mouse lymphocytes and the total lymphocytes will be 5 × 10 7 cells / ml So as to dispense into 15 ml tubes. The cells were centrifuged (1000 g, 10 minutes, 4 ° C.), and the supernatant was removed to obtain a precipitate. Add 200 μl of MACS buffer {PBS (-), pH 7.2, 0.5% bovine serum albumin (BSA), 2 mM EDTA} for resuspension, mix, and add 50 μl of Biotin-Antibody Cocktail. And incubated at 4 ° C. for 15 minutes. Further, 150 μl of MACS buffer and 100 μl of Anti-Biotin MicroBeads were added and mixed, and incubated again at 4 ° C. for 15 minutes. Next, 5-10 ml of MACS buffer was added to a 15 ml tube for cell washing, centrifuged (1000 g, 10 minutes, 4 ° C.), and the supernatant was removed. The cell was suspended by adding 500 μl of MACS buffer to the precipitate, applied to a separation column (MACS), washed with 3 ml of MACS buffer, and the same washing was performed twice. Thereafter, fractions were collected to obtain 2.5 × 10 6 cells / ml B cells. Using this B cell, the immunostimulatory activity by absorbance was calculated in the same procedure as described above for all lymphocytes.
図２−Ｂに、天蚕セリシンの濃度に対するマウス脾臓リンパ球Ｂ細胞の増殖率を示している。図２に示したように、マウス脾臓の全リンパ球（Ａ）の細胞増殖率は、天蚕セリシンを添加しない場合（0％）と比較して、天蚕セリシン0.05％の場合は1.9倍、天蚕セリシン0.1％の場合には2.3倍に、天蚕セリシン0.2％の場合には、3.7倍になることが確認された。 FIG. 2-B shows the proliferation rate of mouse spleen lymphocyte B cells with respect to the concentration of sericin sericin. As shown in FIG. 2, the cell proliferation rate of total lymphocytes (A) in the mouse spleen was 1.9 times in the case of 0.05% sericin compared to the case where sericin was not added (0%). In the case of 0.1%, it was 2.3 times, and in the case of Tenjiri sericin 0.2%, it was confirmed to be 3.7 times.
また、マウス脾臓のリンパ球Ｂ細胞（Ｂ）の細胞増殖率は、天蚕セリシンを添加しない場合（0％）と比較して、天蚕セリシン0.05％の場合は2.5倍、天蚕セリシン0.1％の場合には4.6倍に、天蚕セリシン0.2％の場合には、5.3倍になることが確認された。 In addition, the cell proliferation rate of mouse spleen lymphocyte B cells (B) is 2.5 times in the case of sericin 0.05% and 0.1% in sericin sericin compared with the case where sericin sericin is not added (0%). Was 4.6 times, and in the case of Tendon sericin 0.2%, it was confirmed to be 5.3 times.
以上の結果から、本発明の方法で得た天蚕セリシンには、顕著な免疫賦活作用があることが確認された。 From the above results, it was confirmed that the tengu sericin obtained by the method of the present invention has a remarkable immunostimulatory effect.
＜実施例５＞天蚕セリシン粉末の作用効果の検討２
ヒト皮膚繊維芽細胞（NHDF）およびショウジョウバエ由来細胞（schneider S2 cell）について、天蚕セリシンによる影響を検討した。
<Example 5> Examination of action and effect of tengu sericin powder 2
The effects of natural sericin on human skin fibroblasts (NHDF) and Drosophila-derived cells (schneider S2 cells) were examined.
具体的には、天蚕セリシンを添加しない培地（0 mg/ml）、実施例１で得た天蚕セリシンを各濃度（0.25 mg/ml 0.5 mg/ml、1.0 mg/ml）に調製した培地で、ヒト皮膚繊維芽細胞（NHDF）の細胞を培養し、細胞数の変化を検討した。 Specifically, in a medium (0 mg / ml) to which no sericin sericin was added, a medium in which the sericin sericin obtained in Example 1 was prepared at various concentrations (0.25 mg / ml 0.5 mg / ml, 1.0 mg / ml), Human skin fibroblast (NHDF) cells were cultured, and changes in the number of cells were examined.
また、天蚕セリシンを添加しない培地（0 mg/ml）および実施例１で得た天蚕セリシンを各濃度（0.1 mg/ml、0.2 mg/ml、0.5 mg/ml）に調製した培地でショウジョウバエ由来細胞（schneider S2 cell）を培養し、細胞数の変化を検討した。 In addition, Drosophila-derived cells in a medium (0 mg / ml) to which no sericin sericin was added and in a medium prepared with various concentrations (0.1 mg / ml, 0.2 mg / ml, 0.5 mg / ml) of sericin sericin obtained in Example 1 (Schneider S2 cell) was cultured, and changes in the number of cells were examined.
結果を図３、図４に示す。 The results are shown in FIGS.
図３に示したように、実施例１で得られた天蚕セリシンは、ヒト皮膚繊維芽細胞（NHDF）に対して細胞増殖活性はないものの、細胞数の減少などは確認されず、正常細胞への悪影響はないことが確認された。 As shown in FIG. 3, the tengu sericin obtained in Example 1 has no cell proliferative activity against human dermal fibroblasts (NHDF), but a decrease in the number of cells was not confirmed, and normal cells were recovered. It was confirmed that there was no adverse effect.
一方、図４に示したように、実施例１で得られた天蚕セリシンは、ショウジョウバエ由来細胞（schneider S2 cell）を増殖することができることが確認された。特に、天蚕セリシンの濃度が0.1mg/mlの場合に115.9％の増殖活性が確認され、天蚕セリシンの濃度が0.2mg/mlの場合に113.6％の増殖活性が確認され、また天蚕セリシンの濃度が0.5mg/mlの場合に108.6％の増殖活性が確認された。 On the other hand, as shown in FIG. 4, it was confirmed that the tengu sericin obtained in Example 1 can proliferate Drosophila-derived cells (schneider S2 cells). In particular, the growth activity of 115.9% was confirmed when the concentration of Tenshin sericin was 0.1 mg / ml, the growth activity of 113.6% was confirmed when the concentration of Tenshin sericin was 0.2 mg / ml, and the concentration of Tenshin sericin was A growth activity of 108.6% was confirmed at 0.5 mg / ml.
以上の結果から、本発明の方法で得た天蚕セリシンには、正常細胞への悪影響がなく、正常細胞増殖作用があることから、天蚕セリシンを有効成分として配合することで医薬組成物や食品（サプリメントを含む）などに利用可能であることが確認された。 From the above results, the tengu sericin obtained by the method of the present invention has no adverse effect on normal cells and has a normal cell proliferating action. Therefore, by blending tengu sericin as an active ingredient, a pharmaceutical composition or food ( (Including supplements).
＜実施例６＞天蚕セリシン粉末の作用効果の検討３
ラット肝ガン細胞（dRLh84）について、天蚕セリシンによる影響を検討した。
<Example 6> Examination of action and effect of tengu sericin powder 3
Rat hepatoma cells (dRLh84) were examined for the effects of natural sericin.
具体的には、天蚕セリシンを添加しない培地（0 mg/ml）、実施例１で得た天蚕セリシンを各濃度（0.125 mg/ml、0.25 mg/ml、0.5 mg/ml、1.0 mg/ml、2.0 mg/ml）に調製した培地で、ラット肝ガン細胞（dRLh84）を培養し、細胞数の変化を検討した。 Specifically, a medium (0 mg / ml) to which no sericin sericin was added, and the sericin sericin obtained in Example 1 were prepared at various concentrations (0.125 mg / ml, 0.25 mg / ml, 0.5 mg / ml, 1.0 mg / ml, Rat liver cancer cells (dRLh84) were cultured in a medium prepared to 2.0 mg / ml), and changes in the number of cells were examined.
結果を図５に示す。 The results are shown in FIG.
図５に示したように、実施例１で得られた天蚕セリシンを添加することで、ラット肝ガン細胞の増殖を抑制することができることが確認された。特に、天蚕セリシンの濃度が2.0mg/mlの場合に37.1％の増殖抑制活性が確認され、天蚕セリシンの濃度が0.5mg/mlの場合に33.0％の増殖抑制活性が確認され、天蚕セリシンの濃度が0.25mg/mlの場合に27.5％の増殖抑制活性が確認された。 As shown in FIG. 5, it was confirmed that the proliferation of rat hepatoma cells can be suppressed by adding the tengu sericin obtained in Example 1. In particular, the growth inhibitory activity of 37.1% was confirmed when the concentration of sericin sericin was 2.0 mg / ml, and the growth inhibitory activity of 33.0% was confirmed when the concentration of sericin sericin was 0.5 mg / ml. In the case of 0.25 mg / ml, 27.5% growth inhibitory activity was confirmed.
したがって、この天蚕セリシンにはガン細胞の増殖抑制作用があり、この天蚕セリシンを有効成分として配合することで抗ガン用医薬組成物や食品（サプリメントを含む）などに利用可能であることが確認された。 Therefore, it has been confirmed that this sericin sericin has a cancer cell growth inhibitory effect and can be used in anti-cancer pharmaceutical compositions and foods (including supplements) by incorporating this sericin sericin as an active ingredient. It was.
＜実施例７＞天蚕セリシン粉末の作用効果の検討４
線虫（C.elegans）に対して、実施例１で得られた天蚕セリシンが与える影響について検討した。
<Example 7> Examination 4 of effect of tengu sericin powder
The effect of the tengu sericin obtained in Example 1 on C. elegans was examined.
具体的には、実施例１の方法で得た天蚕セリシンを濃度1.0 mg/mlに調製した培地を用い、実験動物には、線虫（C. elegans）の野生型であるN2系統を用い、線虫の生存率と生存日数（寿命）を検討した。 Specifically, using a medium prepared with a sericin sericin obtained by the method of Example 1 to a concentration of 1.0 mg / ml, the N2 strain that is a wild type of C. elegans was used as an experimental animal, The survival rate and survival days (lifetime) of nematodes were examined.
また、比較として、カイコ由来のセリシンを添加した培地と、いずれのセリシンも添加していない培地（control）とを用意し、これらの培地においても線虫を培養し、線虫の生存率と生存日数（寿命）を比較検討した。
線虫は飼育プレート上で、インキュベーター（MIR-153、SANYO）を用い、20oCで飼育した。培地は、0.3％NaCl、0.25％ポリペプトン、1.7％寒天、0.5μg/ml コレステロール、1mM CaCl2、1mM MgSO4、25mM KH2PO4-KOH（pH 6.0）を含む Nematode Growth Medium（NGM）寒天培地を用い、これをコントロールとした。供試試料についても、同様の方法で調製した。プレートは、滅菌シャーレに各 NGM 寒天培地を約2.5 ml ずつ分注して作製した。線虫の飼育には、餌として大腸菌 Escherichia coli（OP50）を用いた。餌とする大腸菌は、 5mlのLB培地に一白銀耳懸濁させ、バイオシェーカー（BR-40LF、TAITEC）により、37oC、120rpm、15時間培養したものを用いた。この懸濁液を1プレートあたり約30μl滴下し、壁面に当らない程度にスプレッダーで広げた。大腸菌を塗った NGM 寒天培地（以下飼育プレート）は室温で 12 時間培養した後、使用するまで4℃で保存した。平均寿命の測定に用いる線虫は、4齢幼虫（L4）であるが、孵化直後から供試試料を与えた線虫を使用するためにあらかじめ各飼料を添加した飼育プレートで飼育しておいた。飼育プレート中の線虫の多くが L4 に成長するまで飼育し、1 試料に対して 2 枚の新しい飼育プレートを用意して、30 頭ずつ植え継いだ。この日を観察 0 日目とし、線虫が卵を産まなくなるまで毎日〜1日おきに新しい飼育プレートに植え継いだ。観察は毎日定時±2時間の範囲でおこない、死亡個体はその都度除外した。また、平均寿命の測定試験中に体内で卵が孵化してしまったものや、植え継ぎの際に外傷を負ってしまった個体も同様に除外した。
In addition, as a comparison, a medium supplemented with silkworm-derived sericin and a medium (control) without any sericin were prepared, and nematodes were cultured in these mediums, and the survival rate and survival of nematodes The number of days (lifetime) was compared.
Nematodes were bred at 20 ° C on a breeding plate using an incubator (MIR-153, SANYO). Nematode Growth Medium (NGM) agar medium containing 0.3% NaCl, 0.25% polypeptone, 1.7% agar, 0.5 μg / ml cholesterol, 1 mM CaCl 2 , 1 mM MgSO 4 , 25 mM KH 2 PO 4 -KOH (pH 6.0) This was used as a control. The test sample was prepared in the same manner. The plate was prepared by dispensing approximately 2.5 ml of each NGM agar medium into a sterile petri dish. For raising nematodes, Escherichia coli (OP50) was used as food. Escherichia coli used as food was suspended in 5 ml of LB medium and suspended in silver ears and cultured with a bioshaker (BR-40LF, TAITEC) at 37 ° C, 120 rpm for 15 hours. About 30 μl of this suspension was dropped per plate and spread with a spreader so as not to hit the wall surface. NGM agar medium coated with E. coli (hereinafter, rearing plate) was cultured at room temperature for 12 hours and then stored at 4 ° C until use. The nematode used to measure the average life span is the 4th instar larvae (L4), but was kept in a breeding plate with each feed added in advance to use the nematode given the test sample immediately after hatching . Many of the nematodes on the rearing plates were reared until they grew to L4, and two new rearing plates were prepared for each sample, and 30 new plants were planted. This day was designated as observation day 0, and the worms were planted on a new breeding plate every day or every other day until the nematode no longer lays eggs. Observations were made every day within a range of ± 2 hours, and dead individuals were excluded each time. Similarly, those in which eggs hatched in the body during the test for measuring the average life span and those that had been injured during planting were also excluded.
なお、各試料における平均寿命は以下の式により算出した。
平均寿命（days）＝
（線虫が死亡し始めた観察日 + 線虫が生きていた最後の観察日）/ 2
結果を表３および図６に示す。図６は、controlと天蚕セリシンの生存率、生存日数の比較を示したグラフである。
In addition, the average life in each sample was computed with the following formula | equation.
Average life (days) =
(The observation date when the nematode began to die + the last observation date when the nematode was alive) / 2
The results are shown in Table 3 and FIG. FIG. 6 is a graph showing a comparison of the survival rate and the number of days of survival between control and tengu sericin.
表３、図６に示したように、天蚕セリシンを培地としたものでは、対照区（control）の培地に対して平均寿命が9％延長された。 As shown in Table 3 and FIG. 6, in the case of using sericin sericin as the medium, the average lifespan was extended by 9% compared to the control medium.
このことから、天蚕セリシンには寿命延長作用があり、天蚕セリシンを有効成分として配合することで抗加齢用医薬組成物や抗加齢用食品などとすることができることが確認された。 From this, it has been confirmed that sericin sericin has a life extending action and can be made into an anti-aging pharmaceutical composition or anti-aging food by blending sericin sericin as an active ingredient.
＜実施例８＞天蚕セリシンの作用効果の検討５
実施例１で抽出された天蚕セリシン溶液について、UV吸光度を紫外可視近赤外分光光度計（日本分光株式会社製、V-570）で測定した。
<Example 8> Examination of action effect of tengu sericin 5
The UV absorbance of the Tendon sericin solution extracted in Example 1 was measured with an ultraviolet-visible near-infrared spectrophotometer (manufactured by JASCO Corporation, V-570).
結果を図７に示す。なお、図７では、比較例１として、特許文献１の実施例１で抽出された天蚕セリシン溶液ＡについてのUV吸光度（abs）を分光光度計（日立製作所株式会社製、U-1100）で測定したものであり、同文献１の表４並びに同文献１の図６に示されているものを曲線（Ａ）として示している。なお、図７の曲線（Ａ）の数値は、UV吸光度のスケールを同一にするために、特許文献１の図６のUV吸光度の１０００分の１に換算して表示している。 The results are shown in FIG. In FIG. 7, as Comparative Example 1, UV absorbance (abs) of Tenjiri sericin solution A extracted in Example 1 of Patent Document 1 was measured with a spectrophotometer (U-1100, manufactured by Hitachi, Ltd.). What is shown in Table 4 of the literature 1 and FIG. 6 of the literature 1 is shown as a curve (A). Note that the numerical value of the curve (A) in FIG. 7 is converted into 1/1000 of the UV absorbance in FIG. 6 of Patent Document 1 in order to make the UV absorbance scale the same.
図７の曲線（Ｂ）に示したように、実施例１で抽出された天蚕セリシン溶液（図７中では本願実施例８のセリシンと記載）は、セリシンの構成アミノ酸であるチロシンとフェニルアラニンの存在から波長280nmに吸収のピークを与え、310nm付近まで急峻に低下するが、それ以降の500nm付近まではなだらかに低下している。すなわち、このセリシンは紫外部の短波長（UV CおよびUV B）領域での吸収は高く、UV Aの領域でも吸収を示し、その吸収は500nm付近まで達し、その吸収波長領域がかなり広いことが分かった。したがって、UV吸収性に優れた化粧料として利用することが有効であると考えることができる。 As shown in the curve (B) of FIG. 7, the Tenjiri sericin solution extracted in Example 1 (described as sericin in Example 8 of the present application in FIG. 7) is the presence of tyrosine and phenylalanine, which are constituent amino acids of sericin. Absorption peak at a wavelength of 280 nm, and sharply decreases to around 310 nm, but then gradually decreases to around 500 nm. That is, this sericin has high absorption in the short wavelength region (UV C and UV B) of the ultraviolet region, and also shows absorption in the UV A region. The absorption reaches up to about 500 nm, and the absorption wavelength region is quite wide. I understood. Therefore, it can be considered that it is effective to use it as a cosmetic excellent in UV absorption.
また、実施例１の抽出技術で得られた天蚕セリシンは、図７の曲線（Ｂ）に示すように、全てのＵＶ波長帯域において、図７の曲線（Ａ）に示す従来の天蚕セリシン抽出技術で得られたセリシンよりもUV波長帯域吸収効果が高く、UV吸収性に優れた化粧料（例えばUVカット化粧料（乳液や化粧水など））として利用することが有効であると考えることができる。 In addition, as shown in the curve (B) of FIG. 7, the tengu sericin obtained by the extraction technique of Example 1 has the conventional tengu sericin extraction technique shown in the curve (A) of FIG. 7 in all the UV wavelength bands. It can be considered that it is effective to use as cosmetics (for example, UV-cut cosmetics (emulsions, lotions, etc.)) having higher UV wavelength band absorption effect and superior UV absorption than sericin obtained in .
＜実施例９＞Tricine-SDSポリアクリルアミド電気泳動による天蚕セリシンの分子量の検討
実施例１で得た天蚕セリシン粉末を、10％（Ｔ）、3％（Ｃ）の分離ゲル上に濃縮ゲルを重層した垂直型スラブゲルを用いて分離した（Schagger and Jagow, 1987）。電気泳動装置の陰極槽は0.1M Tris、0.1M Tricine、0.1%（W/V）SDSとし、陽極槽は0.2M Tris-HCl buffer (pH 8.9)とし、泳動用試料（10μl）は等量のTricine SDS-PAGE用sample buffer ［50mM Tris-HCl(pH 6.8)、4％（W/V） SDS、12％（W/V） glycerol、2％（V/V）β-mercaptethanol、0.01％（W/V） Serva blue ］を加え、３分間熱処理したものを用いた。分子量マーカーには、Protein Marker Kit （M.W. Range 97,000〜14,400, GEヘルスケアサイエンス社）を使用した。泳動は、分離ゲルに入るまでは印加電圧を30Vととし、その後、分離ゲルの下端に達するまでは印加電圧を100Vの定電圧で通電した。泳動後のゲルは、0.25％ Coomassie brilliant blure (CBB) R-250、45％ ethanol、7％ acetic acid 中で染色し、20％ ethanol、7％ acetic acid中で脱色した。
<Example 9> Examination of the molecular weight of Tenjiri sericin by Tricine-SDS polyacrylamide electrophoresis Tenjiri sericin powder obtained in Example 1 is overlaid on 10% (T) and 3% (C) separation gels. Was separated using a vertical slab gel (Schagger and Jagow, 1987). The cathode tank of the electrophoresis apparatus is 0.1M Tris, 0.1M Tricine, 0.1% (W / V) SDS, the anode tank is 0.2M Tris-HCl buffer (pH 8.9), and the sample for electrophoresis (10 μl) is the same amount. Sample buffer for Tricine SDS-PAGE [50 mM Tris-HCl (pH 6.8), 4% (W / V) SDS, 12% (W / V) glycerol, 2% (V / V) β-mercaptethanol, 0.01% (W / V) Serva blue] was added and heat-treated for 3 minutes. As a molecular weight marker, Protein Marker Kit (MW Range 97,000-14,400, GE Healthcare Science) was used. For electrophoresis, the applied voltage was 30 V until the separation gel was entered, and then the applied voltage was applied at a constant voltage of 100 V until the lower end of the separation gel was reached. The gel after electrophoresis was stained in 0.25% Coomassie brilliant blure (CBB) R-250, 45% ethanol, 7% acetic acid, and decolorized in 20% ethanol, 7% acetic acid.
電気泳動の結果を図８に示す。図８の左側のレーンはマーカーであり、右側レーンは実施例１で得た天蚕セリシン粉末のタンパク質のバンドを示している。この実施例１で得た天蚕セリシン粉末に含まれるセリシンは、＜１＞100〜120kDa付近のグループ、＜２＞35〜50kDa付近のグループ、及び＜３＞15〜25kDa付近のグループがラダー状になったタンパク質が検出された。特に、グループ＜１＞では100kDa付近に、グループ＜２＞では40kDa付近に、グループ＜３＞では20kDa付近に濃度の濃いバンドが見出された。 The result of electrophoresis is shown in FIG. The left lane in FIG. 8 is a marker, and the right lane shows the protein band of the tengu sericin powder obtained in Example 1. The sericin contained in the Tenjiri sericin powder obtained in Example 1 is in the form of a ladder in groups of <1> 100 to 120 kDa, <2> 35 to 50 kDa, and <3> 15 to 25 kDa. The detected protein was detected. In particular, a high concentration band was found near 100 kDa in group <1>, around 40 kDa in group <2>, and around 20 kDa in group <3>.
これに対し、特許文献１の方法で抽出された天蚕セリシン（比較例１）の分子量については、特許文献１の図４（Ｂ）にも示されるように41kDaのバンドのみである。したがって、本願発明（実施例１）の抽出方法によって抽出された天蚕セリシンはUV波長帯域で吸収能の高いタンパク質を多く含んでいることから、UV吸収性に優れた化粧料（UVカット化粧料など）として利用することが有効であると考えることができる。
On the other hand, the molecular weight of Tenjiri sericin (Comparative Example 1) extracted by the method of Patent Document 1 is only a 41 kDa band as shown in FIG. Therefore, the tengu sericin extracted by the extraction method of the present invention (Example 1) contains a lot of proteins having a high absorption ability in the UV wavelength band, so that cosmetics having excellent UV absorption (such as UV cut cosmetics) ) Can be considered effective.
Claims (13)
（１）90℃〜98℃であり、かつ、0.010〜0.025％のNaOHと0.490〜0.475％のNa２CO３を含み、NaOHとNa２CO３の合計が全液量の0.5％であるNaOH／Na２CO３混合液に、天蚕由来の絹繊維を1〜10分間浸漬して、天蚕セリシンを含む精練液を得る精練工程；
（２）精練液を含む容器を、外部から15℃〜25℃の水で冷却する第１冷却工程；
（３）精練液を含む容器を、外部から0℃〜10℃の水または氷水で冷却する第２冷却工程；
（４）第１、２冷却工程を経た精練液を遠心分離する遠心工程；および
（５）遠心分離後の精練液を透析して天蚕セリシン溶液を得る透析工程
を含むことを特徴とする天蚕セリシンの抽出・精製方法。 The following steps:
(1) is 90 ° C. to 98 ° C., and comprises Na 2 CO 3 and 0.010 to 0.025% of NaOH 0.490~ 0.475%, NaOH sum of NaOH and Na 2 CO 3 is 0.5% of the total liquid volume A scouring step of immersing silk fiber derived from tengu for 1 to 10 minutes in a / Na 2 CO 3 mixed solution to obtain a scouring solution containing tengu sericin;
(2) The 1st cooling process which cools the container containing a scouring liquid with 15 to 25 degreeC water from the outside;
(3) a second cooling step of cooling the container containing the scouring solution with water or ice water at 0 ° C. to 10 ° C. from the outside;
(4) Centrifugal step of centrifuging the scoured liquid that has undergone the first and second cooling steps; and (5) Tendon sericin characterized by including a dialysis step of dialysis of the scoured liquid after centrifugation to obtain a tengu sericin solution. Extraction and purification method.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2012203552A JP6012352B2 (en) | 2012-09-14 | 2012-09-14 | Extracting and purifying method of tengu sericin, and pharmaceutical composition, food and cosmetics containing tengu sericin |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2012203552A JP6012352B2 (en) | 2012-09-14 | 2012-09-14 | Extracting and purifying method of tengu sericin, and pharmaceutical composition, food and cosmetics containing tengu sericin |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2014058464A JP2014058464A (en) | 2014-04-03 |
| JP6012352B2 true JP6012352B2 (en) | 2016-10-25 |
Family
ID=50615299
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2012203552A Active JP6012352B2 (en) | 2012-09-14 | 2012-09-14 | Extracting and purifying method of tengu sericin, and pharmaceutical composition, food and cosmetics containing tengu sericin |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP6012352B2 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20190055624A (en) * | 2017-11-15 | 2019-05-23 | 재단법인 환동해산업연구원 | Method of preparing Cocoon Sericin extract, and composition including the same |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP6261109B2 (en) * | 2013-04-10 | 2018-01-17 | 国立大学法人岩手大学 | Extraction and purification method of silkworm sericin |
| TWI756643B (en) * | 2020-03-10 | 2022-03-01 | 森田生醫股份有限公司 | Sericin extract, manufacturing method and use thereof, and antioxidant composition including the same |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4412757B2 (en) * | 1999-03-04 | 2010-02-10 | セーレン株式会社 | Colon cancer preventive |
| JP2008208123A (en) * | 2007-02-02 | 2008-09-11 | Iwate Univ | Method for obtaining sericin in wild silkworm's silk and use of the same to toilet water and the like |
| JP2012082174A (en) * | 2010-10-13 | 2012-04-26 | Iwate Univ | Method of separating fibroin and sericin in cricula cocoon layer, and fibroin and sericin obtained by the method |
-
2012
- 2012-09-14 JP JP2012203552A patent/JP6012352B2/en active Active
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20190055624A (en) * | 2017-11-15 | 2019-05-23 | 재단법인 환동해산업연구원 | Method of preparing Cocoon Sericin extract, and composition including the same |
| KR101989934B1 (en) * | 2017-11-15 | 2019-09-30 | 재단법인 환동해산업연구원 | Method of preparing Cocoon Sericin extract, and composition including the same |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2014058464A (en) | 2014-04-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Baccari et al. | Mast cells in nonmammalian vertebrates: an overview | |
| KR20190112868A (en) | Native(telopeptide) Placental Collagen Compositions | |
| US20210030656A1 (en) | Topical silk compositions and methods of using | |
| JP6012352B2 (en) | Extracting and purifying method of tengu sericin, and pharmaceutical composition, food and cosmetics containing tengu sericin | |
| CN104940100A (en) | Human placenta extract, method for preparing the same and application | |
| CN105111781A (en) | Industrial production method of cephalopod melanin | |
| Singh et al. | Bombyx mori–A Review of its Potential as a Medicinal Insect | |
| Saad et al. | A comprehensive review of recent advances in silk sericin: Extraction approaches, structure, biochemical characterization, and biomedical applications | |
| KR20180028229A (en) | The Method of High-yield and High-purity Manufacturing of Allo-collagen Composition Extracted From Human origin | |
| JP6261109B2 (en) | Extraction and purification method of silkworm sericin | |
| US9492486B2 (en) | Preparation of bee venom with allergenic components removed | |
| KR101989517B1 (en) | Pharmaceutical Composition for Protecting or Treating Muscular Diseases comprising Hydrangea serrate Extract | |
| CN109966317A (en) | Neuroprotective composition, preparation method and its medical usage | |
| Li et al. | Toxicity study of isolated polypeptide from wool hydrolysate | |
| CN113456796B (en) | Anti-aging composition and preparation method and application thereof | |
| CN101302251B (en) | Cyanea-originated glucoprotein having immunopotentiation activity, preparation and use thereof | |
| CN107188988A (en) | A kind of purification process of bio-medical sodium alginate | |
| KR101618726B1 (en) | Method for making protein from Pollock skin | |
| CN104587274B (en) | A kind of leaf of bamboo homo-orientin extract | |
| CN103027927A (en) | Production process of transfer factor of spleen of laying hen | |
| CN103555527B (en) | Snake peptide healthcare wine and preparation method thereof | |
| AU2018100588A4 (en) | Cell culture mediums containing aqueous extract derived from herbal medicines | |
| CN112028980A (en) | Sericin, extraction method, application of sericin as cellular antiviral immunopotentiator and application of sericin | |
| JP5553329B2 (en) | Tengu silk sericin medium | |
| Lamboni et al. | Silk Proteins: A Natural Resource for Biomaterials |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20150911 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20160614 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20160812 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20160906 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20160920 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6012352 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |