JP6005651B2 - トランスフェラーゼの活性同定方法 - Google Patents

Description

本発明はサンプルの間の二基質蛋白質修飾酵素（bisubstrate protein modifying enzyme）の活性の差を同定するための方法、および二基質蛋白質修飾酵素の基質を同定するための方法に関する。二基質蛋白質修飾酵素としてはプロテインキナーゼがあげられる。

発明の背景
キナーゼまたはホスホトランスフェラーゼ（phosphotransferase）が、アデノシン３リン酸（ＡＴＰ）などの高エネルギードナー分子から、リン酸化として知られているプロセスにより、特異的基質にりん酸基を転移する酵素である。プロテインキナーゼの化学活性は、ＡＴＰのようなヌクレオチド三りん酸からりん酸基を転移し、それを遊離ヒドロキシル基を有する３つのアミノ酸の１つに共有結合することを含む。ほとんどのプロテインキナーゼがセリンとトレオニンの両方に作用するが、他のものはチロシンに作用し、いくかは３つのアミノ酸のすべてに作用する。他のアミノ酸をりん酸化するプロテインキナーゼ類としては、ヒスチジンがあげられる。

プロテインキナーゼは、情報伝達で基本的な役割を果たし、その結果、新陳代謝、成長、細胞周期進行、移動およびアポプトーシスなどの本質的な細胞過程の主要なメディエイターである。シグナルリング系路の分裂は癌腫を含む多くの疾病の病理学に関連している。その結果、形質導入を制御する酵素の活性を理解することは、それらの治療薬およびバイオマーカーの可能性のため、大きな関心が寄せられている。

蛋白質リン酸化はキナーゼ活性の反映である。現在の質量分析法（ＭＳ）に基づいているホスホプロテオミック分析（phosphoproteomic analysis）はただ一つのアッセイで、多発性シグナルリング系路の活性を評価する先例のない機会を提供する。しかしながら、そのような包括的アプローチはまだ可能でない。なぜなら多くの場合にはホスホプロテオミックのテクニックを使用して測定できる部位に作用するキナーゼの同一性を知らないからである。さらに、ヒトゲノムには５００以上のキナーゼ遺伝子があり、激しい研究にもかかわらず、キナーゼ活性の全体的およびバイアスのない分析方法はまだ報告されていない。

発明の要約
本発明者は、全体的な方法で、調査中の細胞または組織で活性であるかもしれないとの酵素への先入観なしで、プロテインキナーゼなどの二基質蛋白質修飾酵素の活性を定量化するための方法について工夫した。
従って、第１の態様では、本発明は以下の工程を含む、サンプル間の二基質蛋白質修飾酵素の活性の差を同定するための方法を提供する：
（ｉ）第１のサンプルを、前記酵素の非蛋白質性基質のｘの異なる濃度に暴露する工程、ここでｘは２であるかまたは２より大きい；
（ｉｉ）非蛋白質性基質のｘの異なる濃度のそれぞれにおいて前記サンプル内のポリペプチドの修飾を定量化する工程；
（ｉｉｉ）前記非蛋白質性基質についての前記酵素の親和性を決定する工程；
（ｉｖ）２番目のまたは次のサンプルについて工程（ｉ）から工程（ｉｉｉ）を繰り返す工程；および
（ｖ）前記サンプル間の前記非蛋白質性基質についての前記酵素の親和性を比較する工程；
ここで、サンプル間の前記非蛋白質性基質についての前記酵素の親和性における相違は、サンプル間の前記酵素の活性の差を示している。

発明の詳細な説明
本発明の第１の態様の方法は、サンプルの間の二基質蛋白質修飾酵素の活性の差を同定するための方法である。本発明の方法は、二基質蛋白質修飾酵素の非蛋白質性基質の異なった濃度での第１のサンプルのポリペプチドの修飾を定量化することを含む。非蛋白質性基質の濃度を変えると、それぞれの修飾のための酵素の親和性の計算ができる。サンプルの間の親和性定数の差は、サンプルの間の酵素の活性、または活性化の差を示す。本発明の第１の態様の方法はin vitro法である。「二基質蛋白質修飾酵素」は２つの基質を有し、その１つが蛋白質である酵素をいう。本明細書においては他の基質を非蛋白質性基質と呼び、これは酵素によって触媒された反応で非蛋白質性基質から蛋白質性基質に転移される基を有する分子である。また、そのような酵素は蛋白質トランスフェラーゼ（protein transferase）とも呼ばれる。トランスフェラーゼは、１つの分子（しばしば供与体と呼ばれる）から、他のもの（しばしば受容体と呼ばれる）への官能基の転移を触媒する酵素である。したがって、蛋白質トランスフェラーゼは、供与体から蛋白質である受容体への官能基の転移を触媒する酵素である。したがって、二基質蛋白質修飾酵素では、非蛋白質性基質が供与体であり、蛋白質（または、ポリペプチドまたはペプチドなどの蛋白質の一部）は受容体である。

二基質蛋白質修飾酵素の例としてはプロテインキナーゼがあげられる。この非蛋白質性基質はＡＴＰであり、リン酸化として知られているプロセスによりタンパク性基質にＡＴＰからりん酸基を転移する。他の例としては蛋白質アセチルトランスフェラーゼがあげられる。この非蛋白質性基質はアセチル基を有する化合物、たとえばアセチルコエンザイムＡ（アセチルＣｏＡ）であり；蛋白質グリコシルトランスフェラーゼ、この非蛋白質性基質は活性化ヌクレオチド糖（グリコシル供与体としても知られる）であり；蛋白質メチルトランスフェラーゼ、この非蛋白質性基質はメチル基を有する化合物であり；および蛋白質パルミトイルトランスフェラーゼ、この非蛋白質性基質はパルミトイルＣｏＡのような脂質パルミトイルを含む化合物である。

１つの実施態様では、二基質蛋白質修飾酵素はプロテインキナーゼである。
この実施態様では、本発明の第１の態様の方法は、以下の工程を含む、サンプルの間のプロテインキナーゼの活性の差を同定するための方法である：
（ｉ）ＡＴＰのｘの異なる濃度で第１のサンプルをインキュベートする工程、ここでｘは２または２よりも大きい；
（ｉｉ）ＡＴＰのｘの異なる濃度のそれぞれで、前記サンプル内のポリペプチドのリン酸化を定量化する工程；
（ｉｉｉ）ＡＴＰについての前記プロテインキナーゼの親和性を決定する工程；
（ｉｖ）第２または次のサンプルについて工程（ｉ）から（ｉｉｉ）を繰り返す工程；および
（ｖ）前記サンプル間でＡＴＰについての前記プロテインキナーゼの親和性を比較する工程；
ここで、サンプル間でＡＴＰについての前記プロテインキナーゼの親和性の相違がサンプルの間のプロテインキナーゼの活性の差を示している。

本発明の第１の態様の方法の工程（ｉ）は、第１のサンプルを前記酵素の非蛋白質性基質のｘの異なる濃度に暴露することを含む、ここでｘは２または２よりも大きい。この工程はそれに続いて２番目の、または引き続くサンプルについて繰り返される。

本発明の第１の態様の方法で使用されるサンプル（第１、第２、および／または引き続くサンプル）は、ペプチド類を含む任意のサンプルであることができる。サンプルは、典型的には生物学的サンプルであり、生物源から入手された任意のタイプのサンプルであることができ、例えば人間、動物、植物またはバクテリアから入手されたサンプルである。したがって、本発明は人間および非人間のソースから入手されたサンプルの使用を包含する。

本発明の第１の態様の方法で使用されるサンプルは、対象となるどんな種からも得ることができる。典型的に、サンプルは人間または動物から得られる。動物は、典型的には哺乳動物、例えば、マウス、ネズミまたはモルモットなどの齧歯動物、または牛、羊またはヤギなどの有てい類である。あるいはまた、動物は鳥、たとえば鶏であり、魚、たとえばゼブラ・フィッシュであり、ネマトーダ、たとえば虫線虫（Caenorhabditis elegans）、または昆虫、たとえばミバエキイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）などである。また、本発明の第１の態様の方法で使用されるサンプルは、バクテリアや酵母などの他の生物形から得られる。本発明の第１の態様の方法で使用されるサンプルは、典型的にはエシュリキア属大腸菌（Escherichia coli）、サルモネラ・エンテリカ（Salmonella enterica）、肺炎球菌（Streptococcus pneumoniae）または黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus,）などのバクテリア、またはパン酵母 サッカロマイシスセレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）、または分裂酵母シゾサッカロマイセスポンベ（Schizosaccharomyces pombe）などの酵母の実験的に重要な種からのサンプルである。あるいはまた、本発明の第１の態様の方法で使用されるサンプルは、植物、かび類またはウイルスから得られる。

典型的に、生物試料は人間から得られ、例えば、尿、血液などの体液、または別の組織のサンプルであることができる。典型的には、生物試料は、細胞ラインまたは組織、典型的には第１次組織である。たとえば、サンプルは人間または動物からの組織であることができる。人間または動物が、健康体であるか、または病体であることができる。別法として、サンプルは、健康であるか病気である人間または動物細胞から得られた細胞ラインであることができる。

サンプルは典型的には本発明の第１の態様の方法の工程（ｉ）の前に、サンプル中の細胞を溶解して細胞溶解物を製造することにより調製される。したがって、本発明の第１の態様の方法で使用されるサンプル（第１、第２、および／または引き続くサンプル）は、細胞溶解物であることができる。本明細書に使用される「細胞を溶解する（lysing cells）」という用語は、当技術分野で普通の意味、すなわち、細胞を破砕する（splitting open cells）ことをいう。細胞は、当技術分野で知られている任意の適当な手段、たとえば機械的な溶菌（例えば、ワーリングブレンダを使用する方法）、液体均質化、超音波処理または手動の溶菌（例えば、乳棒と乳鉢を使用する方法）などの物理的方法またはＣＨＡＰＳまたはトリトン−Ｘなどの洗浄液ベースの方法を使用して溶解することができる。典型的には、細胞は、プロテアーゼインヒビタ、および／または、ホスファターゼ阻害剤が必要に応じて補われた、トリス−ＨＣｌ、トリトン、およびＥＤＴＡの組み合わせを使用して溶解される。

本発明の第１の態様の方法は典型的には細胞溶解物などのサンプル内に存在している二基質蛋白質修飾酵素、例えば、細胞溶解物中に存在している内因性プロテインキナーゼの活性の差を同定するために使用される。細胞溶解物などのサンプルが酵素の非蛋白質性基質に暴露された時に、内因性蛋白質基質を修飾するようにそのような二基質蛋白質修飾酵素は作用する。

本発明の第１の態様の方法の工程（ｉ）では、第１のサンプルは前記酵素の非蛋白質性基質のｘの異なる濃度に暴露される。この工程は２番目の、または、次のサンプルについて繰り返される。この工程は、細胞溶解物であることができるサンプルへ、特定の濃度の非蛋白質性基質と任意に適当なバッファーを加えることによって行われる。典型的には、第１、第２又は引き続くサンプルが、酵素が非蛋白質性基質に作用するに適当な条件下で、ｘの異なる非蛋白質性基質の濃度でインキュベートされる。第１、第２の、または引き続くサンプルは十分な時間と適温において、必要であれば撹拌しつつ、インキュベートされる。１つの具体的な実施態様では、サンプルは、５分間３０℃で撹はんしつつインキュベートされる。例えば、反応は尿素の添加により停止できる。

本発明の第１の態様の方法の工程（ｉ）では、第１のサンプルは前記酵素の非蛋白質性基質のｘの異なる濃度に暴露され、ここで、ｘは２またはそれ以上である。概して、ｘは少なくとも３、典型的には４、５、６、７、８、９または１０である。しかしながら、ｘには制限はなく、非蛋白質性基質の濃度がグラフに記入でき、非蛋白質性基質についての酵素の親和性を計算するために使用される限り、非蛋白質性基質の異なった濃度の数を使用できる。

非蛋白質性基質のすべての適当な濃度も、本発明の第１の態様の方法で使用できる。二基質蛋白質修飾酵素がプロテインキナーゼである場合、本発明の第１の態様の方法における使用のためのＡＴＰの濃度は典型的には０〜５００マイクロモルの範囲内であり、より典型的には０〜１００マイクロモルである。例えば、０、１０、および１００マイクロモル、０、１００、２００、３００および５００マイクロモル、または０、１０、５０、１００および５００マイクロモルのＡＴＰが使用できる。

本発明の第１の態様の方法の工程（ｉｉ）は、非蛋白質性基質のｘの異なる濃度での、サンプル内のポリペプチドの修飾を定量化することを含む。典型的に、サンプルは細胞溶解物である。１つの実施態様では、修飾はリン酸化である。他の実施態様では、修飾は、アセチル化、ニトロ化、グリコシル化、メチル化、および／または脂質化である。

本発明の第１の態様の方法の工程（ｉｉ）を行う前に、典型的にはサンプルから消化によりペプチド類の混合物を得る。

蛋白質から、より長い蛋白質をより短いペプチド類に分解することによって、ペプチド類を典型的に得る。タンパク分解は一般的に消化とも呼ばれる。したがって、１つの実施態様では、サンプル内の蛋白質類の消化により、サンプルからペプチド類を得る。

蛋白質消化は、本発明では当技術分野で知られている任意の適当な薬剤を使用して行われる。蛋白質消化は、プロテアーゼを使用することで典型的に行われる。本発明では任意の適当なプロテアーゼが使用できる。本発明では、プロテアーゼは、典型的にはトリプシン、キモトリプシン、Ａｒｇ−Ｃ、ペプシン、Ｖ８、Ｌｙｓ−Ｃ、Ａｓｐ−Ｃ、および／またはＡｓｐＮである。あるいはまた、化学的に蛋白質を分解することができる。例えばヒドロキシルアミン、ギ酸、臭化シアン、ＢＮＰＳ−スカトール、２−ニトロ−５−チオシアノ安息香酸（ＮＴＣＢ）または他の適当な薬剤が使用できる。

本発明に使用されるペプチド類、および上で説明した蛋白質切断により典型的に製造されるペプチド類は、質量分析に適している。典型的に、そのようなペプチド類は約５から３０のアミノ酸長さであり、例えば７から２５のアミノ酸類、１０から２０のアミノ酸類、１２から１８のアミノ酸または１４から１６のアミノ酸類である。しかしながら、より短いかまたはより長いペプチド類、たとえば約２から約５０、約３から約４０、または約４から約４５のアミノ酸類なども使用できる。分析できるペプチドの長さは、質量分析計のそのような長いペプチド類を配列する能力によって制限される。ある場合には、最大３００のアミノ酸類のポリペプチドを分析できる。

１つの実施態様では、工程（ｉｉ）で定量化されるポリペプチドは、工程（ｉｉ）の前に精製される。精製は、本発明の第２の態様に関連して詳細に本明細書に記載された任意のテクニックを使用して行うことができる。そのようなテクニックは本発明の第１の態様に、その全体が適用可能である。

リン酸化などの修飾の定量化は、任意の適切な方法を使用して行われることができる。典型的には、定量化は質量分析法（ＭＳ）、たとえば液体クロマトグラフィー−質量分析法（ＬＣ−ＭＳ）をはじめとする任意の方法により行うことができる。ＬＣ−ＭＳまたはＬＣ−ＭＳ／ＭＳは典型的には無標識のＭＳである。

本発明の第１の態様の方法では、リン酸化の定量化は、典型的にはＷＯ２０１０／１１９２６１（国際特許出願Ｎｏ．ＰＣＴ／ＧＢ２０１０／０００７７０）に記載されているＴＩＱＵＡＳ（標的のシグナルリングの徹底的な定量化：targeted and in-depth quantification of signalling）のテクニックを使用することで行われる。この特許出願は本明細書に参考としてその全体が援用される。このテクニックは、シグナルリング系路活性（signalling pathway activity）の感受性の、迅速かつ包括的な定量化を許容する。この方法は、１つの分析で、同時に、蛋白質上の何千ものリン酸化部位の量を測定できる。ＷＯ２０１０／１１９２６１に示されるように、ＴＩＱＵＡＳのテクニックは、りん酸化ペプチド以外の修飾ペプチドを定量化するために使用できる。実際、ＴＩＱＵＡＳのテクニックは、質量分析法で検出されるすべての修飾を含むペプチド類を定量化するのに使用できる。

本発明の第１の態様の方法では、工程（ｉｉ）が、以下の工程を含む方法を使用して行われる：
（ａ） 工程（ｉ）で得られたペプチド類に参照修飾ペプチドを追加し、ペプチド類と参照修飾ペプチドの混合物を生成する工程；
（ｂ） 前記ペプチド類と参照修飾ペプチドの混合物について質量分析（ＭＳ）を行い、サンプル内のペプチド類に関するデータを得る工程；および
（ｃ） サンプル内のペプチド類に関するデータと、修飾ペプチドに関するデータベース中のデータとを、コンピュータプログラムを使用して比較する工程；
ここで、修飾ペプチドに関するデータベースが、以下を含む方法によってコンパイルされる；
ｉ） サンプルからペプチド類を得ること；
ｉｉ） 工程ｉで得られたペプチド類からの修飾ペプチドを富化すること；
ｉｉｉ） 工程ｉｉで得られた富化された修飾ペプチドについて、液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）を行うこと；
ｉｖ）修飾ペプチドを同定するために、工程ｉｉｉで検出された修飾ペプチドを、公知のリファレンスデータベースと比較すること：および
ｖ） 工程ｉｖで同定された修飾ペプチドに関連するデータを、データベースにコンパイルすること。

ＴＩＱＵＡＳのテクニックは、本発明の第２の態様に関連して詳細に本明細書に記載され、本発明の第１の態様に全体として適用可能である。

本発明の第１の態様の方法において、ＴＩＱＵＡＳのテクニックの代替手段として、リン酸化などの修飾の定量化を、定量化に代謝標識などの同位体標識を使用するＭＳのテクニックを使用して行うことができる。（例えば、培地内の安定な同位体で標識されたアミノ酸、（ＳＩＬＡＣ）；Olsen, J.V. et al. Cell 127, 635-648 (2006))、および化学誘導体化、（例えば、Ross, P. L.; et al. Mol Cell Proteomics 2004, 3, (12), 1154-69), ICAT (Gygi, S.P. et al. Nat Biotechnol 17, 994-999 (1999)), TMT (Dayon L et al, Anal Chem. 2008 Apr 15;80(8):2921-31) テクニックにより行うことができる。
本発明の方法では、リン酸化などの修飾は非断片化しているイオン類の強度を測定するＬＣ−ＭＳのテクニック、またはフラグメントイオンの強度を測定するＬＣ−ＭＳ／ＭＳのテクニック（たとえば、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）とも呼ばれる選択反応モニタリング（ＳＲＭ））で定量化することができる。

本発明の第１の態様の方法の工程（ｉｉｉ）は、非蛋白質性基質に対する酵素（プロテインキナーゼなどの）の親和性を決定することを含む。

非蛋白質性基質（例えば、ＡＴＰ）に対する酵素（例えば、プロテインキナーゼ）の親和性は、ミカエリス−メンテン速度論の原理を使用して決定することができる。例えば、親和性定数（Ａｃ，Ｋｍに関連する）は、図２Ａに示されるように、それぞれのペプチドについて計算されることができる。図２Ｂは２つの代表的な反応を示している：
ａ） ＡＴＰに対する高い親和性を有するプロテインキナーゼ活性（低いＡｃ）、およびｂ）ＡＴＰに対する低い親和性を有するプロテインキナーゼ活性（高いＡｃ）。

１つの実施態様では、本発明の第１の態様の方法の工程（ｉｉｉ）は以下を含む：
（ａ） 非蛋白質性基質の濃度が増加されたとき、ペプチドの修飾が増加しているかどうか決定すること；および非蛋白質性基質の濃度が増加されたとき、ペプチドの修飾が増加している場合には、
（ｂ） 非蛋白質性基質に対する酵素の親和性定数（Ａｃ）を計算する。

この実施態様では、酵素がプロテインキナーゼである場合には工程（ｉｉｉ）は以下を含む：
（ａ） 非蛋白質性基質の濃度が増加されたとき、ペプチドのリン酸化が増加しているかどうか決定すること；および非蛋白質性基質の濃度が増加されたとき、ペプチドのリン酸化が増加している場合には、
（ｂ）非蛋白質性基質に対する、プロテインキナーゼの親和性定数（Ａｃ）を計算する。

本発明の第１の態様の方法の工程（ｉｖ）は、第２または引き続くサンプルについて工程（ｉ）から工程（ｉｉｉ）を繰り返すことを含む。

そして、本発明の第１の態様の方法の工程（ｖ）は、サンプルの間の非蛋白質性基質に対する酵素の親和性を比較することを含む。

Ａｃの測定は酵素（プロテインキナーゼなどの）の非蛋白質性基質との反応の親和性により、サンプルの間の非蛋白質性基質に対する酵素の親和性の比較を許容する。サンプルの間の親和性定数の相違は、サンプルの間での酵素の活性化または活性の差を示す。

１つの実施態様では、本発明の第１の態様の方法は、サンプルの内因性蛋白質をリン酸化する際の内因のキナーゼ類の活性の定量化を行うことを含む。定量化は、本明細書に記載された方法の任意の方法を使用することで行われるが、本明細書に記載されたＴＩＱＵＡＳ方法を使用することで典型的に行われる。ＡＴＰの濃度を変えると、それぞれのリン酸化のためのプロテインキナーゼの親和性の計算をすることができる。サンプルの間の親和性定数における相違は、サンプルの間の内因のキナーゼの活性化または活性の差を示す。この方法は、例えば、病的または通常の細胞または組織、または酵素阻害剤またはアクチベータなどの薬物類で処理されたサンプル中の内因のキナーゼの活性の相違を検出するために使用することができる。

本発明者は、調査中の細胞または組織内で活性であるかもしれない酵素についての先入観無く、全体的な方法として、プロテインキナーゼ類などの二基質蛋白質修飾酵素の活性を定量化するためのテクニックについて工夫した。グローバル キナーゼ アクティビティ プロファイリング(Global Kinase Activity Profiling(GKAP))と名付けられたこのテクニックでは、定義された条件下で、細胞溶解物りん酸化内部基質に存在しているプロテインキナーゼは、溶解物の中にも存在している。次いで、反応生成物は、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳに基づく標準のホスホプロテオミクス(phosphoproteomics)のテクニックを使用することで定量化される。このアプローチで数１００のキナーゼ反応を定量化できた。それの３００より多くは生理的刺激（ＥＧＦでの処理）の関数として増加し、他のものはキナーゼ阻害剤ＬＹ２９２００４またはＵ０１２６の処理で減少した。また、ＧＫＡＰは、キナーゼ阻害剤での処理に対して異なった鋭敏度を示す白血病細胞系におけるキナーゼ活性のパターンが、著しく相違することを検出した。これらの結果は、ＧＫＡＰは成長因子と薬理学的阻害剤によって調節されたキナーゼ活性を検出し、これらの活性が細胞表現型および薬物反応と互いに関連することを明らかにしている。その結果、本発明者は、初めて、キナーゼ活性の全体的およびバイアスのない分析のためのアプローチを示した。

また、本発明者はプロテインキナーゼ類などの二基質蛋白質修飾酵素の基質を同定するための方法を開発した。この方法は、プロテインキナーゼ類などの二基質蛋白質修飾酵素の生体内の基質を同定するのに使用される。「二基質蛋白質修飾酵素の生体内の基質」は、生体内の基質であるそのような酵素の蛋白質、ポリペプチドまたはペプチド基質をいう。

従って、第２の態様では、本発明は以下を含む、二基質蛋白質修飾酵素の生体内の基質を同定するための方法を提供する：
（ｉ）第１の基質のｘの異なる濃度に二基質蛋白質修飾酵素を露出する工程、
ここでｘは２または２以上であり、第２の基質の濃度を一定とし、第１および第２の基質の１つは前記酵素の非蛋白質性基質であり、他方がポリペプチドの混合物である；
ｉｉ）前記第１の基質のｘのそれぞれの濃度でポリペプチドの前記混合物中のポリペプチドの修飾を定量化する工程；および
（ｉｉｉ）前記第１の基質に対する前記酵素の親和性を決定する工程；
ここで、前記第１の基質に対する前記酵素の高親和性が、前記ペプチドが前記酵素の生体内の基質であることを示唆する。

本発明の第２の態様の方法は、プロテインキナーゼなどの二基質蛋白質修飾酵素の生体内の基質を同定するための方法である。したがって、本発明はまたプロテインキナーゼなどの二基質蛋白質修飾酵素のインビトロ基質が、生体内基質にも存在することの同定も許容する。本発明の第２の態様の方法はインビトロの方法である。

１つの実施態様では、二基質蛋白質修飾酵素はプロテインキナーゼである。この実施態様では、本発明の第２の態様の方法は、以下を含むプロテインキナーゼの生体内基質を同定するための方法である：
ｉ）第１の基質のｘの異なる濃度にプロテインキナーゼを暴露する工程、ここでｘは、２または２より大きく、第２の基質の濃度は一定とし、第１と第２の基質のひとつはＡＴＰであり、他方はポリペプチドの混合物である；
ｉｉ）前記第１の基質のｘの異なる濃度のそれぞれにおいて、該ポリペプチドの混合物中のポリペプチドのリン酸化を定量化する工程；および
ｉｉｉ）前記第１の基質に対する前記プロテインキナーゼの親和性を決定する工程；
ここで、前記第１の基質に対する前記プロテインキナーゼの高親和性は、前記ペプチドが前記プロテインキナーゼの生体内の基質であることを示唆する。

本発明の第２の態様の方法の工程（ｉ）は、第１の基質のｘの異なる濃度へプロテインキナーゼなどの二基質蛋白質修飾酵素を暴露することを含む。ここでｘは、２または２より大きく、第２の基質の濃度は一定とし、第１と第２の基質のひとつは該酵素の非蛋白質基質（たとえばプロテインキナーゼに対してはＡＴＰである）であり、他方はポリペプチドの混合物である。「二基質蛋白質修飾酵素」は、２つの基質を有し、その１つが蛋白質であるものをいう。例えば、プロテインキナーゼは２つの基質を有し、ホスホリル化された蛋白質およびＡＴＰである。本発明の方法はプロテインキナーゼ類などの二基質蛋白質修飾酵素のこの特徴を利用する。

本発明の第２の態様の方法の工程（ｉ）は、第１の基質のｘの異なる濃度に二基質蛋白質修飾酵素を暴露することを含む。ここでｘは、２または２より大きく、第２の基質の濃度は一定とされる。典型的には、第１の基質のｘの異なる濃度で、二基質蛋白質修飾酵素は酵素が第１の基質に作用するに十分な時間、インキュベートされる。

１つの実施態様では、第１の基質は酵素の非蛋白質性基質であり、他方はポリペプチドの混合物である。この実施態様では、二基質蛋白質修飾酵素がプロテインキナーゼであるときに、第１の基質はＡＴＰであり、第２の基質はポリペプチドの混合物である。

別の実施態様では、第１の基質はポリペプチドの混合物であり、第２の基質は酵素の非蛋白質性基質である。この実施態様では、二基質蛋白質修飾酵素がプロテインキナーゼであるときに、第１の基質はポリペプチドの混合物であり、第２の基質はＡＴＰである。

本発明の第２の態様の方法で使用されるポリペプチドの混合物は、未消化タンパクの混合物、または蛋白質の消化で得られたペプチド類の混合物のどちらかであることができる。本明細書において使用される「ポリペプチド」の用語は、文脈に応じて蛋白質とペプチドの両方を含むものとして使用される。

本発明の第２の態様の方法で使用されるポリペプチドの混合物は、典型的にはサンプルから得る。本発明の第２の態様の方法で使用されるサンプルは、ペプチド類を含む任意のサンプルであることができる。サンプルは、典型的には生物学的サンプルであり、生物源から入手される任意のタイプのサンプルであることができ、例えば人間、動物、植物またはバクテリアから入手されたサンプルである。その結果、本発明は人間および非人間のソースから入手されたサンプルの使用を包含する。

本発明の方法で使用されるサンプルは、本発明の第１の態様と関連して定義されるように、対象となるどんな種からも得ることができる。

典型的に、生物試料は人間から得られ、例えば、尿、血液などの体液、または別の組織のサンプルであることができる。典型的に、生物試料は、細胞ライン(cell line)または組織、典型的には１次組織である。例えば、サンプルは人間または動物からの組織であることができる。人間または動物は、健康であるか、または病的であることができる。別法として、サンプルは、健康であるか病的な人間または動物細胞から得られた細胞ラインであることができる。

本発明の第２の態様の方法で使用されるポリペプチドの混合物が未消化タンパクの混合物であるときに、未消化タンパクの混合物は典型的にはサンプル中の細胞を溶解し細胞溶解物を製造することにより得られる。本明細書に使用される場合、「細胞を溶解する」という用語は、当技術分野での普通の意味、すなわち、細胞を破砕することを意味する。細胞は、当技術分野で知られている任意の適当な手段を使用することで溶解されることができる。例えば機械的な溶菌（例えば、ワーリングブレンダを使用する）、液体均質化、超音波処理または手動の溶菌（例えば、乳棒と乳鉢を使用する）などの物理的方法またはＣＨＡＰＳまたはトリトン（Triton）−Ｘなどの洗浄薬ベースの方法を使用することができる。典型的に、細胞はトリス−ＨＣｌ（Tris-HCl）、トリトンおよびＥＤＴＡの組み合わせを使用して溶解される。

典型的には工程（ｉ）を行う前に細胞溶解物から低分子物質を除去する。言い換えれば、蛋白質は溶解細胞の他の構成要素から分離される。任意の適当な手段、例えば、サイズ排除ろ過によりこれが達成される。１つの実施態様では、二基質蛋白質修飾酵素がプロテインキナーゼであるときに、工程（ｉ）を行う前に、典型的には、蛋白質（例えば、細胞溶解物の中の蛋白質）は脱リン酸化される。これは細胞溶解物から低分子物質を除去するとともに、またはこれに代えて行われる。任意の適当な手段で脱リン酸化を行うことができる。１つの実施態様では、細胞溶解物からの蛋白質は、内因のホスファターゼが蛋白質に作用するのを許容するに適当な期間の間、細胞溶解物をインキュベートすることによって、脱リン酸化される。あるいはまた、外因のホスファターゼを脱リン酸化に作用するように蛋白質に加えることができる。この実施態様における使用に適したホスファターゼとしては、ＰＴＰ１Ｂなどのチロシン特異性ホスファターゼ、ＰＰ２ｃ（ＰＰＰ２ＣＡ）などのセリン／トレオニンの特異的ホスファターゼ、ＰＨＰなどのヒスチジンホスファターゼ、ＶＨＲおよびＤＵＳＰ１ないしＤＵＳＰ２８などの二重特異性ホスファターゼ、およびアルカリホスファターゼなどがあげられる。

典型的には、本発明の第２の態様の方法で使用されるポリペプチドの混合物が未消化タンパクの混合物であるときには、工程（ｉｉ）の前に未消化タンパクの前記混合物からペプチド類の混合物を得る。

この実施態様では、本発明の第２の態様の方法は以下の工程を含む：
（ｉ）第１の基質のｘの異なる濃度に二基質蛋白質修飾酵素を暴露する工程、ここでｘは２または２より大きく、第２の基質の濃度は一定とされる、第１および第２の基質の１つは前記酵素の非蛋白質性基質であり、他方はポリペプチドの混合物であり、該ポリペプチドの混合物は未消化タンパクの混合物である；
前記未消化タンパクの混合物からペプチド類の混合物を得る工程；
（ｉｉ）前記第１の基質のｘの異なる濃度のそれぞれで、前記ペプチド類の混合物中のペプチドの修飾を定量化する工程；および
（ｉｉｉ）前記第１の基質に対する前記酵素の親和性を決定する工程、
ここで、前記第１の基質に対する前記酵素の高親和性は、前記ペプチドが前記酵素の生体内の基質であることを示唆する。

この実施態様において、二基質蛋白質修飾酵素がプロテインキナーゼである場合には、本発明の第２の態様の方法は以下の工程を含む：
（ｉ）第１の基質のｘの異なる濃度にプロテインキナーゼを暴露する工程、ここでｘは２または２より大きく、第２の基質の濃度は一定とされる、第１および第２の基質の１つはＡＴＰであり、他方はポリペプチドの混合物であり、該ポリペプチドの混合物は未消化タンパクの混合物である；
前記未消化タンパクの混合物からペプチド類の混合物を得る工程；
（ｉｉ）前記第１の基質のｘの異なる濃度で、前記ペプチド類の混合物中のペプチドのリン酸化を定量化する工程；および
（ｉｉｉ）前記第１の基質に対するプロテインキナーゼの親和性を決定する工程；
ここで、前記第１の基質に対する前記プロテインキナーゼの高親和性は、該ペプチドが前記プロテインキナーゼの生体内の基質であることを示唆している。

代替の実施態様では、本発明の第２の態様の方法で使用されるポリペプチドの混合物は、蛋白質の消化で得られたペプチド類の混合物である。
この実施態様では、本発明の第２の態様の方法は以下の工程を含む：
（ｉ）蛋白質の消化でペプチド類の混合物を得る工程；
第１の基質のｘの異なる濃度に二基質蛋白質修飾酵素を暴露する工程、ここでｘは２または２より大きく、第２の基質の濃度は一定とされる、第１および第２の基質の１つは前記酵素の非蛋白質性基質であり、他方はペプチドの混合物である；
（ｉｉ）前記第１の基質のｘの異なる濃度のそれぞれで、前記ペプチド類の混合物中のペプチドの修飾を定量化する工程；および
（ｉｉｉ）前記第１の基質に対する前記酵素の親和性を決定する工程、
ここで、前記第１の基質に対する前記酵素の高親和性は、前記ペプチドが前記酵素の生体内の基質であることを示唆する。

１つの実施態様において、二基質蛋白質修飾酵素がプロテインキナーゼである場合には、本発明の第２の態様の方法は以下の工程を含む：
（ｉ）蛋白質の消化でペプチド類の混合物を得る工程；
第１の基質のｘの異なる濃度にプロテインキナーゼを暴露する工程、ここでｘは２または２より大きく、第２の基質の濃度は一定とされる、第１および第２の基質の１つはＡＴＰであり、他方はペプチドの混合物である；
（ｉｉ）前記第１の基質のｘの異なる濃度のそれぞれで、前記ペプチド類の混合物中のペプチドのリン酸化を定量化する工程；および
（ｉｉｉ）前記第１の基質に対する前記プロテインキナーゼの親和性を決定する工程、
ここで、前記第１の基質に対する前記プロテインキナーゼの高親和性は、前記ペプチドがプロテインキナーゼの生体内の基質であることを示唆する。

したがって、これらの両方の実施態様では、本発明の第２の態様の方法の工程（ｉ）は、プロテインキナーゼなどの二基質蛋白質修飾酵素に暴露されたペプチド類の混合物をもたらす。

これらの両方の実施態様では、未消化タンパクの混合物からペプチド類の混合物を得る。典型的には、より長い蛋白質をより短いペプチド類に分解することによって、蛋白質からペプチド類を得る。また、タンパク分解は一般的に消化と呼ばれる。したがって、１つの実施態様では、サンプル内の蛋白質類の消化により、サンプルからペプチド類を得る。
本発明において蛋白質の消化は、当技術分野で知られている任意の適当な薬剤を使用して行われることができる。

蛋白質消化は、プロテアーゼを使用して典型的に行われる。任意の適当なプロテアーゼが本発明に使用されることができる。本発明では、プロテアーゼは、典型的にはトリプシン、キモトリプシン、Ａｒｇ−Ｃ、ペプシン、Ｖ８、Ｌｙｓ−Ｃ、Ａｓｐ−Ｃ、および／または、ＡｓｐＮである。あるいはまた、化学的に蛋白質を分解することができる。例えばヒドロキシルアミン、ギ酸、臭化シアン、ＢＮＰＳ−スカトール、２−ニトロ−５−チオシアノ安息香酸（ＮＴＣＢ）または他の適当な薬剤が使用できる。

本発明に使用されるペプチド類、および上で説明した蛋白質切断で典型的に製造されるペプチド類は、質量分析に適している。典型的に、そのようなペプチド類は約５から３０のアミノ酸長さであり、例えば７から２５のアミノ酸類、１０から２０のアミノ酸類、１２から１８のアミノ酸または１４から１６のアミノ酸類である。しかしながら、より短いかまたはより長いペプチド類、たとえば約２から約５０、約３から約４０、または約４から約４５のアミノ酸類なども使用できる。分析できるペプチドの長さは、質量分析計のそのような長いペプチド類を配列する能力によって制限される。ある場合には、最大３００のアミノ酸類のポリペプチドを分析できる。本明細書において「リン酸化蛋白質（phosphoprotein）」という用語は、りん酸化された蛋白質について言及するために使用され、「りん酸化ペプチド」という用語は、りん酸化されたペプチドについて言及するために使用される。

本明細書において「リン酸化部位(phosphosite)」という用語は、リン酸化の場所、たとえばりん酸化蛋白質またはペプチドのリン酸化部位を意味するために使用される。本明細書において「ホスホプロテオミクス(phosphoproteomics)」という用語は、りん酸化蛋白質の研究、特にはそのような蛋白質の同定、キャラクタリゼーションおよび識目録化（cataloguing）の研究を意味するために使用される。

１つの実施態様では、工程（ｉｉ）で定量化されるペプチドまたはポリペプチドは、工程（ｉｉ）の前に精製される。ペプチドまたはポリペプチドは、典型的にはクロマトグラフィーを使用して精製される。

典型的には、クロマトグラフィーは固定された金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）であり、例えば、Alcolea、M.P.他、J Proteome Res 8(8)、3808(2009)で説明された、改変されたＩＭＡＣ富化実験計画である。クロマトグラフィーの他のタイプも使用されることができ、たとえば二酸化チタン粉末（ＴｉＯ_２）クロマトグラフィー、および／または酸化ジルコニウム（ＺｒＯ_２）クロマトグラフィー(Alcolea MP、 Cutillas PR Methods Mol Biol658:111-26(2010))が使用できる。

別法として、ペプチドまたはポリペプチドは、抗体ベースの方法を使用して精製されることができる。本発明の１つの実施態様では、定量化されるペプチド類またはポリペプチド類がりん酸化ペプチドまたはポリペプチド類である場合、チロシン、トレオニン、セリンまたはヒスチジンなどのりん酸化アミノ酸への親和性を有する抗体が、固体マトリックスに結合される（固定される）。りん酸化ペプチドはこれらの抗体が特異的にりん酸化ペプチドに結合する能力によって富化される。そして、りん酸化ペプチドが抗体被覆基質上に保持されるのに対して、非リン酸化ペプチド類は洗浄除去される。固定された抗体からのりん酸化ペプチドの溶離は、低ｐＨ溶媒の使用、または抗体とりん酸化ペプチドの間の相互作用をなくす他の適切な方法により行われる。

本発明の別の実施態様では、定量化されるペプチド類が、アセチル化ペプチド類である場合、アセチル化アミノ酸残基に対する特異的抗体の使用により富化される。そのような抗体は、固体マトリックスに結合されて、次に、アセチル化アミノ酸残基に特異的に結合する抗体の能力によって富化される。そして、アセチル化ペプチドが固定された抗体の上に保持されるのに対して、非アセチル化ペプチドは洗浄除去される。

本発明の第２の態様の方法の工程（ｉ）は、プロテインキナーゼなどの二基質蛋白質修飾酵素をｘが２またはそれ以上であるｘの異なる濃度の第１の基質に暴露し、ここで第２の基質の濃度は一定とされ、第１および第２の基質の１つは前記酵素（たとえばプロテインキナーゼについてはＡＴＰ）の非蛋白質性基質であり、他方はポリペプチドの混合物である。

二基質蛋白質修飾酵素の例としては、プロテインキナーゼがあげられ、その非蛋白質性基質はＡＴＰであり、リン酸化として知られているプロセスにより蛋白質基質にＡＴＰからりん酸基を転移する。他の例としては、蛋白質アセチルトランスフェラーゼがあげられ、その非蛋白質性基質はアセチル基を有する化合物であり、たとえばアセチルコエンチームＡ（アセチルＣｏＡ）であり、蛋白質グリコシルトランスフェラーゼがあげられ、その非蛋白質性基質は活性化ヌクレオチド糖（グリコシルドナーとしても知られている）であり、蛋白質メチルトランスフェラーゼがあげられ、その非蛋白質性基質はメチル基有する化合物であり、蛋白質パルミトイルトランスフェラーゼがあげられ、その非蛋白質性基質は脂質パルミトイルを含む化合物、たとえばパルミトイルＣｏＡである。

１つの実施態様では、二基質蛋白質修飾酵素はプロテインキナーゼである。プロテインキナーゼは典型的に組換体プロテインキナーゼである。本発明の第２の態様の方法は、任意のプロテインキナーゼについて生体内の基質を同定するのに使用することができる。本発明の第２の態様の方法は、したがって、任意の特定のプロテインキナーゼの使用には制限されず、任意のプロテインキナーゼ、たとえば細胞溶解物の中に存在しているすべてのプロテインキナーゼを使用して行うことができる。

ヒトプロテインキナーゼは以下を含む多くのグループに分けることかできる：ＡＧＣキナーゼ、たとえばプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）、プロテインキナーゼＢ（ＰＫＢ）（Ａｋｔとしても知られている）、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）およびプロテインキナーゼＧ（ＰＫＧ）；チロシンキナーゼ；チロシンキナーゼ様キナーゼ；カルシウム／カルモデュリン依存性プロテインキナーゼ；カゼインキナーゼ１グループ；ＣＭＧＣグループ、たとえばＣＤＫ、ＭＡＰＫ、ＧＳＫ３、およびＣＬＫキナーゼ；ＳＴＥ、酵母Ｓｔｅｒｉｌｅ７、Ｓｔｅｒｉｌｅ１１、およびＳｔｅｒｉｌｅ２０キナーゼの相同体。例えば、本発明の方法で使用されるプロテインキナーゼは、プロテインキナーゼＢ（ＰＫＢ）としても知られているＡｋｔ１であることができる。

ＡＴＰの存在下でのプロテインキナーゼとのポリペプチドの混合物の反応は、例えば、尿素の添加で止めることができる。

本発明の第２の態様の方法では、プロテインキナーゼなどの二基質蛋白質修飾酵素をｘが２またはそれ以上であるｘの異なる濃度の第１の基質に暴露し、ここで第２の基質の濃度は一定とされ、第１および第２の基質の１つは前記酵素の非蛋白質性基質（たとえばプロテインキナーゼについてはＡＴＰ）であり、他方はポリペプチドの混合物である。したがって、酵素（例えば、プロテインキナーゼ）は前記酵素の非蛋白質性基質（たとえばプロテインキナーゼについてはＡＴＰ）またはポリペプチドの混合物のｘの異なる濃度に露出される、ここでｘは２またはそれ以上である。一般的にはｘは、少なくとも３、典型的には４または５、または６、７、８、９または１０でさえある。しかしながら、ｘには限定はなく、第１の基質の濃度がグラフに記入できる限り、使用することのできる第１の基質の多くの異なる濃度に暴露することができ、第１の基質に対するプロテインキナーゼの親和性について計算するのに使用される。

第１および第２の基質の任意の適当な濃度が、本発明の第２の態様の方法で使用されることができる。典型的には、二基質蛋白質修飾酵素がプロテインキナーゼであるときに、本発明における使用のためのＡＴＰの濃度は０〜５００マイクロモルまでの範囲内である。たとえば、０、１０、５０、１００および５００マイクロモルのＡＴＰの濃度が使用されることができる。

本発明の第２の態様の方法の工程（ｉｉ）は、第１の基質の異なるｘのそれぞれの濃度のときにペプチドまたはポリペプチドの修飾を定量化することを含む。１つの実施態様では、修飾はリン酸化である。他の実施態様では、修飾は、アセチル化、ニトロ化、グリコシル化、メチル化、および／または、脂質化である。

リン酸化などの修飾の定量化は、任意の適切な方法を使用することで行われる。典型的に、定量化は、液体クロマトグラフィー−質量分析法（ＬＣ−ＭＳ）などの質量分析法（ＭＳ）を始めとする任意の方法により行うことができる。ＬＣ−ＭＳまたはＬＣ−ＭＳ／ＭＳは典型的には無標識のＭＳである。

本発明の方法では、リン酸化の定量化は、典型的にはＴＩＱＵＡＳ（シグナルリングのターゲット化された徹底的な定量化）のテクニックを使用することで行われる。これはＷＯ２０１０／１１９２６１（国際特許出願Ｎｏ．ＰＣＴ／ＧＢ２０１０／０００７７０）に記載されており、この出願は本明細書に参考として全体が援用される。このテクニックはシグナルリング系路活性に感受性の、急速で包括的な定量化を許容する。この方法は、１つの簡単な分析により、蛋白質上の何千ものリン酸化部位の量を同時に測定することができる。ＷＯ２０１０／１１９２６１に示されるように、ＴＩＱＵＡＳのテクニックは、りん酸化ペプチド以外の修飾ペプチドを定量化するためにも使用できる。実際に、ＴＩＱＵＡＳのテクニックは、質量分析法で検出されるすべての修飾を含むペプチド類を定量化するために使用される。

本発明の第２の態様の方法の実施態様では、工程（ｉｉ）は以下の工程を含む方法を使用して行われる：
（ａ） 工程（ｉ）で得られたペプチド類に参照修飾ペプチドを加え、ペプチド類と参照修飾ペプチドの混合物を製造する工程；
（ｂ） 前記のペプチドと参照修飾ペプチドの混合物について質量分析（ＭＳ）を行い、サンプル中のペプチド類に関するデータを得る工程；および
（ｃ） コンピュータプログラムを使用して、修飾ペプチドに関するデータベース中のデータとサンプル中のペプチド類に関するデータを比較する工程；
ここで、修飾ペプチドのデータベースは、以下を含む方法によってコンパイルされる；
ｉ）サンプルからペプチド類を得る工程；
ｉｉ）工程ｉで得られたペプチド類から修飾ペプチドを富化する工程；
ｉｉｉ）工程ｉｉで得られた富化された修飾ペプチドについて液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）を行う工程；
ｉｖ）工程ｉｉｉで検出された修飾ペプチドを、既知のリファレンスデータベースと比較し、修飾ペプチドを同定する工程；および
ｖ）工程ｉｖで同定された同定された修飾ペプチドに関するデータをデータベースにコンパイルする工程。

二基質蛋白質修飾酵素がプロテインキナーゼであり、修飾がリン酸化である本発明の方法の１つの実施態様では、工程（ｉｉ）は以下の工程を含む方法を使用して行われる：
（ａ） 工程（ｉ）で得られたペプチド類に参照りん酸化ペプチドを加え、ペプチド類と参照りん酸化ペプチドの混合物を製造する工程；
（ｂ） 前記ペプチド類と参照りん酸化ペプチドの混合物について質量分析（ＭＳ）を行い、サンプル内のペプチド類に関するデータを得る工程；および
（ｃ） コンピュータプログラムを使用して、リン酸化ペプチドに関するデータベース中のデータとサンプル中のペプチド類に関するデータを比較する工程；
ここで、リン酸化ペプチドのデータベースは、以下を含む方法によってコンパイルされる；
ｉ）サンプルからペプチド類を得る工程；
ｉｉ）工程ｉで得られたペプチド類からりん酸化ペプチドを富化する工程；
ｉｉｉ）工程ｉｉで得られた富化されたりん酸化ペプチドについて液体クロマトグラフィータンデム質量分析法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）を行う工程；
ｉｖ）りん酸化ペプチドを同定するために、工程ｉｉｉで検出されたりん酸化ペプチドを、既知のファレンスデータベースと比較する工程；および
ｖ）工程ｉｖで同定されたりん酸化ペプチドに関するデータをデータベースにコンパイルする工程。

本発明のこの実施態様に関して、用語「ペプチド」は用語「ポリペプチド」と互換性を持って使用される。

この実施態様の工程（ａ）では、参照修飾ペプチド（典型的には参照りん酸化ペプチド）は工程（ｉ）で得られたペプチド類に追加され、ペプチド類と参照修飾ペプチド（典型的には参照りん酸化ペプチド）の混合物を製造する。その結果、工程（ａ）は１サンプルあたり１つのペプチド類（変性されたもの、典型的にはリン酸化されたものを含んでいる）の混合物をもたらす。また、参照修飾ペプチド（典型的には参照りん酸化ペプチド）は本明細書においては「内部標準」（ＩＳｓ）とも呼ばれる。典型的には、５から１０、例えば、６から９，または７から８の参照修飾ペプチド（典型的に参照りん酸化ペプチド）が加えられる。

本発明では、参照修飾ペプチドは典型的には、参照りん酸化ペプチドである。そのような参照りん酸化ペプチドは、しばしば内部標準（ＩＳ）蛋白質と呼ばれる、定義された特性と濃度の参照蛋白質から典型的に得る。ＩＳｓは市販の蛋白質、例えば、カゼインである場合がある。あるいはまた、ＩＳｓは特に本発明における使用のために合成される。本発明のこの実施態様では、参照りん酸化ペプチドはそれが定量化するのが望ましいりん酸化ペプチドのいくつかと同じ配列で典型的に合成されるが、炭素と窒素の安定した重同位元素が富化される。ペプチド類は、１回に１つのアミノ酸が加えられ、アミノ酸鎖またはポリペプチドを形成する固相化学を使用することで典型的に合成される。典型的には、そのようなペプチド類は一般的な^１２Ｃと^１４Ｎを置換する、^１３Ｃと^１５Ｎで富化される。この富化作用は、同じ配列を有する内因のりん酸化ペプチドより約６から１０ダルトン重い参照りん酸化ペプチドをもたらし、質量分析計を使用することでそれらを区別できるようにする。

本発明の別の実施態様では、本発明方法がアセチル化ペプチドを定量化するのに使用されるとき、参照修飾ペプチドは、参照アセチル化ペプチド類である。そのような参照アセチル化ペプチドは、典型的にはアセチル化アミノ酸類を含む合成ペプチドである。

参照修飾ペプチド（典型的には参照りん酸化ペプチド）は、比較されるサンプルのそれぞれに既知量で追加される。内因の修飾ペプチド（典型的にはりん酸化ペプチド）の信号は、川下の分析で参照修飾ペプチド（典型的には参照りん酸化ペプチド）に関する信号に対して規格化される。

１つの実施態様では、この実施態様の工程（ａ）は、工程（ａ）で得たペプチド類と参照修飾ペプチド（典型的には参照りん酸化ペプチド）の混合物から修飾ペプチド（典型的にはりん酸化ペプチド）を富化し、富化された修飾ペプチド（典型的にはりん酸化ペプチド）の混合物を製造する。その結果、この付加段階は１サンプルあたり１つの富化された修飾ペプチド（典型的にはりん酸化ペプチド）の混合物をもたらす。本発明のこの実施態様では、工程（ｂ）は、富化された修飾ペプチド（典型的にはりん酸化ペプチド）の混合物に質量分析法（ＭＳ）を行い、サンプル中のペプチド類に関連したデータを得ることを含む。本発明のこの実施態様では、工程（ａ）は典型的には富化されたりん酸化ペプチド（典型的にはりん酸化ペプチド）の混合物をもたらす。

修飾ペプチド（典型的にはりん酸化ペプチド）の富化工程は、クロマトグラフィーを使用することで典型的に行われる。１つの実施態様では、クロマトグラフィーは固定された金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）、二酸化チタン（ＴｉＯ_２）クロマトグラフィー、および／または二酸化ジルコニウム（ＺｒＯ_２）クロマトグラフィーである。典型的には、クロマトグラフィーは、ＩＭＡＣおよびＴｉＯ_２クロマトグラフィーである。

あるいはまた、修飾ペプチド（典型的にはりん酸化ペプチド）を富化する工程は、抗体に基づく方法を使用することで行われる。

本発明の１つの実施態様では、定量化されるペプチド類がりん酸化ペプチドである場合、チロシン、トレオニン、セリンまたはヒスチジンなどのりん酸化アミノ酸への親和性を有する抗体が、固体マトリックスに結合される（固定される）。りん酸化ペプチドはこれらの抗体が特異的にりん酸化ペプチドに結合する能力によって富化される。そして、りん酸化ペプチドが抗体被覆基質上に保持されるのに対して、非リン酸化ペプチド類は洗浄除去される。固定された抗体からのりん酸化ペプチドの溶離は、低ｐＨ溶媒の使用、または抗体とりん酸化ペプチドの間の相互作用をなくす他の適切な方法により行われる。

本発明の別の実施態様では、定量化されるペプチド類が、アセチル化ペプチドペプチド類である場合、アセチル化アミノ酸残基に対する特異的抗体の使用により富化される。そのような抗体は、固体マトリックスに結合されて、次に、アセチル化アミノ酸残基に特異的に結合する抗体の能力によって富化される。そして、アセチル化ペプチドが固定された抗体の上に保持されるのに対して、非アセチル化ペプチドは洗浄除去される。

本発明の方法の工程（ｂ）では、質量分析法（ＭＳ）が工程（ａ）で得たペプチド類と参照修飾ペプチド（典型的には参照りん酸化ペプチド）の混合物について行われ、サンプル中のペプチド類に関連したデータを得る。典型的に、このデータはサンプルのためのＭＳデータファイルの形である。
本発明のひとつの実施態様では、本発明方法の工程（ａ）が、工程（ａ）で得たペプチド類と参照修飾ペプチド（典型的には参照りん酸化ペプチド）の混合物から修飾ペプチド（典型的にはりん酸化ペプチド）を富化し、富化された修飾ペプチド（典型的にはりん酸化ペプチド）の混合物を精製することをさらに含む場合に、工程（ｂ）は富化された修飾ペプチド（典型的にはりん酸化ペプチド）の混合物に質量分析法（ＭＳ）を行い、典型的にはサンプルのＭＳデータファイルである、サンプル内のペプチド類に関するデータを得る。典型的に、質量分析法は液体クロマトグラフィー−質量分析法（ＬＣ−ＭＳ）である。その結果、工程（ｂ）は典型的に、ＬＣ−ＭＳ データファイル（それぞれのサンプルから１つ）をもたらす。

典型的には、サンプル内のペプチド類に関するデータは、ペプチド類の質量／電荷（ｍ／ｚ）比、電荷（ｚ）、および／または相対保持時間を含む。

本発明方法の工程（ｃ）では、サンプル中のペプチド類に関連するデータ（典型的にはＭＳデータファイル形式であり、より典型的にはＬＣ−ＭＳデータファイルの形式である）は、修飾ペプチド（典型的にはりん酸化ペプチド）に関するデータベースのデータと、コンピュータプログラムを使用して比較される。たとえば、サンプル中のペプチド類の（質量／電荷：ｍ／ｚ）比、電荷（ｚ）、および相対保持時間が、データベースの修飾ペプチドの（質量／電荷：ｍ／ｚ）比、電荷（ｚ）、および相対保持時間と比較される。これは、修飾ペプチド（典型的にはりん酸化ペプチド）に関するデータベースを使用することで、サンプルのそれぞれの修飾ペプチド（典型的にはりん酸化ペプチド）の同定と定量化を可能にする。

典型的には、コンピュータプログラムは、ＰＥＳＣＡＬ(Vanhaesebroeck、B.MoI Cell Proteomics 6(9)、1560-73、Cutillas、P.R.;2007)と呼ばれるプログラムである。ＰＥＳＣＡＬは、比較されるべきすべてのサンプルから、データベースに存在するそれぞれの修飾ペプチド（典型的にはりん酸化ペプチド）のために抽出されたイオンクロマトグラム（ＸＩＣ、すなわち溶出プロファイル）を構成する。修飾（典型的にはりん酸化）されるべき、先に同定されたペプチドの質量／電荷と保持時間（すなわち、手順の第１で構成されたデータベース中に存在するもの）にＸＩＣをセンタリングすることによって行われる。また、ＰＥＳＣＡＬは、ペプチドの電荷が同一性の正しい指摘の助けになると考えている。また、プログラムはそれぞれのＸＩＣのピーク高さとカーブの下の面積について計算する。データは、分析されたそれぞれの修飾ペプチド（典型的にはりん酸化ペプチド）の強度読み（ピーク面積または高さ）を、参照修飾ペプチド（典型的には参照りん酸化ペプチド）の強度読みで割ることによって規格化される。

この実施態様では、修飾ペプチドに関するデータベースは、以下の工程を含む方法によってコンパイルされる：
ｉ）サンプルからペプチド類を得る；
ｉｉ）工程ｉで得られたペプチド類から修飾ペプチドを富化する；
ｉｉｉ）工程ｉｉで得られた富化された修飾ペプチドに液体クロマトグラフィータンデム質量分析法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）を行う；
ｉｖ）修飾ペプチドを同定するために、工程ｉｉｉで得られた修飾ペプチドと既知のリファレンスデータベースを比較する；および
ｖ）工程ｉｖで同定された修飾ペプチドに関連するデータをデータベースにコンパイルする。

データベースがりん酸化ペプチドに関するデータベースであれば、それは、以下の工程を含む方法によってコンパイルされる：
ｉ）サンプルからペプチド類を得る；
ｉｉ）工程ｉで得られたペプチド類からりん酸化ペプチドを富化する；
ｉｉｉ）工程ｉｉで得られた富化されたりん酸化ペプチドに液体クロマトグラフィータンデム質量分析法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）を行う；
ｉｖ）りん酸化ペプチドを同定するために、工程ｉｉｉで得られたりん酸化ペプチドと既知のリファレンスデータベースを比較する；および
ｖ）工程ｉｖで同定されたりん酸化ペプチドに関連するデータをデータベースにコンパイルする。

この実施態様の工程ｉは、サンプルからペプチド類を得ることを含む。当技術分野で知られている任意の適切な方法および本明細書に記載される方法を使用して、サンプルからペプチド類を得ることができる。

サンプルは典型的に生物試料であり、上記のように生物源から入手されたすべてのタイプのサンプルであることができる。典型的に、サンプルは、細胞ラインまたは組織である。

本発明のいくつかの実施態様では、工程（ｉ）に使用されるサンプルは細胞ラインであり、サンプルは工程（ｉ）を行う前に阻害剤で処理される。阻害剤は任意の適当なタイプの阻害剤であることができる。典型的には、本発明の方法がりん酸化ペプチドを定量化するのに使用されるときには、阻害剤はホスファターゼ阻害剤である。ホスファターゼ阻害剤による処理はリン酸化の化学量論量を増加させ、データベースに含むことができるより大きい数のりん酸化ペプチドに帰結する。さらに、目的がアセチル化されたペプチド類およびメチル化されたペプチド類である場合には、それぞれメチル基転移酵素またはアセチル加水分解酵素の阻害剤を使用できる。

１つの実施態様では、本発明の方法のこの実施態様の工程ｉは以下を含む：
（１）サンプルの細胞を溶解する；
（２）工程（１）で得られた溶解細胞から蛋白質を抽出する；および
（３）前記蛋白質をペプチド類まで切断する。

本発明のこれらの態様は上で説明したとおりのものである。しかしながら、工程（３）が、ペプチド類の混合物が蛋白質の混合物から消化で得られる上で説明した発明の第２の態様の実施態様と同じ方法を使用することで典型的に行われる。

この実施態様の工程ｉｉでは、修飾ペプチド（典型的にはりん酸化ペプチド）は工程ｉで得られたペプチド類から富化される。その結果、工程ｉｉは修飾ペプチド（典型的にりん酸化ペプチド）の中で富化されたいくつかの画分をもたらす。

工程ｉｉにおける、修飾ペプチド（典型的にはりん酸化ペプチド）の富化は、多次元クロマトグラフィーを使用することで典型的に行われる。１つの実施態様では、多次元クロマトグラフィーは、強カチオン交換高速液クロマトグラフ（ＳＣＸ−ＨＰＬＣ）、固定された金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）、および二酸化チタン（ＴｉＯ_２）クロマトグラフィーで行われる。他の実施態様では、多次元クロマトグラフィーは、陰イオン交換高速液クロマトグラフ（ＳＡＸ−ＨＰＬＣ）、固定された金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）および二酸化チタン（ＴｉＯ_２）クロマトグラフィーを使用して行われる。本発明のこれらの実施態様では、クロマトグラフィー技術は逐次的に行われる。

別法として、工程（ｉｉ）の修飾ペプチド（典型的にはりん酸化ペプチド）の富化工程は、抗体に基づく方法で行われる。

本発明の１つの実施態様では、定量化されるペプチド類がりん酸化ペプチドである場合、チロシン、トレオニン、セリンまたはヒスチジンなどのりん酸化アミノ酸への親和性を有する抗体が、固体マトリックスに結合される。りん酸化ペプチドはこれらの抗体が特異的にりん酸化ペプチドに結合する能力によって富化される。そして、りん酸化ペプチドが抗体被覆基質上に保持されるのに対して、非リン酸化ペプチド類は洗浄除去される。固定された抗体からのりん酸化ペプチドの溶離は、低ｐＨ溶媒の使用、または抗体とりん酸化ペプチドの間の相互作用をなくす他の適切な方法により行われる。

本発明の別の実施態様では、定量化されるペプチド類が、アセチル化ペプチドペプチド類である場合、アセチル化アミノ酸残基に対する特異的抗体の使用により富化される。そのような抗体は、固体マトリックスに結合されて、次に、アセチル化アミノ酸残基に特異的に結合する抗体の能力によって富化される。そして、アセチル化ペプチドが抗体被覆基質の上に保持されるのに対して、非アセチル化ペプチドは洗浄除去される。

この実施態様の工程ｉｉｉでは、液体クロマトグラフィータンデム質量分析法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）が工程ｉｉで得られた富化された修飾ペプチド（典型的にりん酸化ペプチド）について行われる。

本発明の工程ｉｖ)では、修飾ペプチド（典型的にはりん酸化ペプチド）を同定するために、工程（ｉｉｉ）で検出された修飾ペプチド（典型的にはりん酸化ペプチド）を、既知のリファレンスデータベースと比較する。この工程は、典型的には市販のサーチエンジン、たとえばＭＡＳＣＯＴ、ＰｒｏｔｅｉｎＰｒｏｓｐｅｃｔｏｒ Ｐｈｅｎｙｘ、またはＳｅｑｕｅｓｔサーチエンジン（ただしこれらに限定されるものではない）を使用することで行われる。この実施態様の工程ｖでは、工程ｉｖで同定された修飾ペプチド（典型的にりん酸化ペプチド）に関連するデータが、データベースにコンパイルされる。このデータベースは次の生物学的実験における、りん酸化ペプチドの定量化に必要であるすべてのパラメータ類を記載する。典型的に、修飾ペプチド（典型的にりん酸化ペプチド）に関連するデータは、修飾ペプチド（典型的にりん酸化ペプチド）のアイデンティティ、質量／電荷（ｍ／ｚ）比、電荷（ｚ）および／または相対保持時間を含む。これは、サンプル中のペプチドに関連するデータ、典型的にはサンプル中のペプチド類（典型的にりん酸化ペプチド）の（質量／電荷数）比、電荷（ｚ）、および相対保持時間がデータベース内の修飾ペプチド（典型的にりん酸化ペプチド）の値と比較されることを許容して、その結果、サンプルの修飾ペプチドの識別と定量化を許す。

この実施態様では、データベースのコンパイルは本発明の第１および第２の態様の方法と当時に行われる必要はない。データベースのコンパイルは、非蛋白質性基質（本発明の第１の態様）または第１の基質（本発明の第２の態様）の異なる濃度のそれぞれにおいて、ペプチドの修飾（典型的にリン酸化）を定量化するために、本発明の方法で使用されるＴＩＱＵＡＳテクニックの前に別途行うことができる。

ＴＩＱＵＡＳ技術の基礎はＬＣ−ＭＳで検出して定量化できる、修飾ペプチド（典型的にりん酸化ペプチド）に関するデータベースの構築である。このデータベースは、次の生物学的実験における修飾ペプチド（典型的にりん酸化ペプチド）の定量化に必要であるすべてのパラメータ類を記載し、これは修飾ペプチド（典型的にりん酸化ペプチド）のアイデンティティ、質量／電荷比（ｍ／ｚ）、電荷および相対保持時間を含む。データベースは、多次元クロマトグラフィー（たとえば強カチオン交換、ＩＭＡＣまたはＴｉＯ_２）を使用して修飾ペプチド（典型的にりん酸化ペプチド）を富化することによって、構成される。そして、富化された修飾ペプチド（典型的にりん酸化ペプチド）の断片は修飾ペプチド（典型的にりん酸化ペプチド）の同定のためにＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって分析される。

生物学的実験から取られた修飾ペプチド（典型的にりん酸化ペプチド）についてのＬＣ−ＭＳにおいて、データベースに記載されたそれぞれの修飾ペプチド（典型的にりん酸化ペプチド）の定量化を自動化するＰＥＳＣＡＬ(Cutillas and Vanhaesebroeck, Molecular & Cellular Proteomics 6, 1560-1573 (2007))というコンピュータプログラムを作成した。これらの生物学的実験において、細胞溶解物の蛋白質は、トリプシンまたは他の適当なプロテアーゼを使用することで消化される。参照修飾ペプチド（典型的に参照りん酸化ペプチド）であるペプチド（たとえばりん酸化ペプチド）内部標準は、比較されるすべてのサンプルに既知量でスパイクされる(spiked)。得られたペプチド混合物の中の修飾ペプチド（典型的にりん酸化ペプチド）は、実行が簡単な（simple-to-perform）ＩＭＡＣまたはＴｉＯ_２抽出段階を使用して富化される。富化された修飾ペプチド（典型的にりん酸化ペプチド）は約１２０分（総サイクル）の１回のＬＣ−ＭＳ測定（典型的にはそうであるが限定はされない）で分析される。ＰＥＳＣＡＬは次いで、比較されるすべてのサンプルにわたり、データベースに存在するそれぞれの修飾ペプチド（典型的にりん酸化ペプチド）のために、抽出されたイオンクロマトグラム（ＸＩＣ、溶出プロファイル）を作成する。プログラムはそれぞれのＸＩＣのピーク高さと曲線下の面積を計算する。データは、それぞれの修飾ペプチド（典型的にりん酸化ペプチド）分析物質の強度読み値（ピーク面積または高さ）を、修飾ペプチド（典型的にりん酸化ペプチド）内部標準のもので割ることによって、規格化される。

本発明の第２の態様での方法でＴＩＱＵＡＳのテクニックを使用することに代わる手段は、リン酸化などの修飾の定量化が、代謝標識などのように、定量化に同位体標識を使用するＭＳのテクニックを使用することで行われる（例えば、stable isotope labeled amino acids in culture, (SILAC); Olsen, J.V. et al. Cell 127, 635-648 (2006)）。また化学誘導体化テクニック（たとえばiTRAQ (Ross, P. L.; et al. Mol Cell Proteomics 2004, 3, (12), 1154-69), ICAT (Gygi, S.P. et al. Nat Biotechnol 17, 994-999 (1999)), TMT (Dayon L et al, Anal Chem. 2008 Apr 15;80(8):2921-31)も使用できる。
本発明の方法では、非断片化しているイオン類の強度を測定するＬＣ−ＭＳのテクニックまたはフラグメントイオンの強度を測定するＬＣ−ＭＳ／ＭＳのテクニック（たとえばセレクティド 反応モニタリング（ＳＲＭ）、マルチプル反応モニタリング（ＭＲＭ）とも呼ばれる）でリン酸化などの修飾が定量化できる。

本発明の第２の態様の方法の工程（ｉｉｉ）は、第１の基質に対する酵素（たとえばプロテインキナーゼ）の親和性を決定することを含む。第１の基質に対する酵素（たとえばプロテインキナーゼ）の高親和性はポリペプチドが酵素（たとえばプロテインキナーゼ）の生体内の基質であることを示唆している。本発明の第２の態様の方法は、同時に第１の基質、すなわち酵素またはポリペプチドの混合物の非蛋白質性基質に対する、多数のペプチド類と関連した酵素の親和性を決定するのに使用される。それぞれのペプチド類についての第１の基質に対する酵素の親和性は格付けされ、そして、酵素の生体内の基質がペプチド類のどれであるかを決定する。第１の基質のために高親和性を示す修飾事象は、生体内でより起こりそうであって、真実の生理的基質である修飾部位の同定を許容する。

したがって、本発明の第２の態様の方法は、同時に第１の基質、すなわちＡＴＰまたはポリペプチドの混合物に対するプロテインキナーゼの親和性を、多数のペプチド類に関して、言い換えれば、多数のホスホサイト(phosphosites)に関して決定するのに使用される。次に、それぞれのペプチド類（ホスホサイト）についての第１の基質に対するプロテインキナーゼの親和性は格付けされ、プロテインキナーゼの生体内の基質がペプチド類のどれであるかを決定する。第１の基質に対する高親和性を示すりん酸化事象は、生体内でより起こりそうであって、真実の生理的基質であるリン酸化部位の識別を許容する。

第１の基質（例えば、ＡＴＰ）のための酵素（例えば、プロテインキナーゼ）の親和性は、ミカエリス−メンテン速度論の原理を使用することで決定することができる。例えば、親和性定数（Ｋｍに関連する、Ａｃ）は図２に示されているように、それぞれのペプチドについて計算される。図２Ｂは２つの代表的な反応を示している；
ａ） ＡＴＰに対して高親和性を有するプロテインキナーゼ活性（低いＡｃ）、およびｂ） ＡＴＰに対して低い親和性を有するプロテインキナーゼ活性（高いＡｃ）

１つの実施態様では、本発明の第２の態様の方法の工程（ｉｉｉ）は以下を含む：
（ａ）第１の基質の濃度が増加されているとき、ペプチドの修飾が増加されているかどうか決定する；および
第１の基質の濃度が増加されているとき、ペプチドの修飾が増加されている場合には；
（ｂ）第１の基質について、酵素の親和性定数（Ａｃ）を計算する。

この実施態様では、酵素がプロテインキナーゼである時、工程（ｉｉｉ）は以下を含む：
（ａ）第１の基質の濃度が増加されているとき、ペプチドのリン酸化が増加されているかどうか決定する；および
第１の基質の濃度が増加されているとき、ペプチドのリン酸化が増加されている場合には；
（ｂ）第１の基質について、プロテインキナーゼの親和性定数（Ａｃ）を計算する。

Ａｃの測定は酵素（プロテインキナーゼなどの）反応の基質との反応について、親和性により同定された基質のランキング付けを許容する。低いＡｃの基質は調査中の酵素（たとえばプロテインキナーゼ）の生体内の基質であるより強い傾向がある。

上記のＭＳベースのホスホプロテオミック(phosphoproteomic)分析には、シグナルリング系路活性の迅速で正確な定量化を許容する方法として素晴らしい潜在能力がある。シグナルリング系路の破壊から生じるさまざまな疾病に関する治療の調査と発達に、そのようなデータは非常に貴重であるだろう。しかしながら、通常、調査されたりん酸化事象の原因となるキナーゼが通常知られていないので、ＭＳベースのホスホプロテオミクスは現在、制限される。最大限の潜在力をこの分野で発揮するために、それぞれのりん酸化事象を制御するキナーゼのアイデンイティティで正確にホスホプロテオーム（ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｏｍｅ）を注釈することが必要である。

本発明者は、試験管内のキナーゼ分析と、プロテインキナーゼのりん酸化事象ダウンストリームのショットガン同定（shotgun identification）を可能にする定量的なホスホプロテオミクスを結合する戦略を開発した。パラダイムとしてＡｋｔ１を用い、このアプローチは以前に、それらの多くについて説明されていなかったこのキナーゼの、１００以上の潜在的基質ダウンストリーム（potential substrates downstream）の同定を可能にした。この戦略の精度を改良するために、発明者はそれぞれのリン酸化部位についてＡＴＰに対するＡｋｔ１の親和性の尺度を定義した。Ａｃと呼ばれるこの定数は、ミカエリス−メンテン酵素反応速度論に基づいている。Ａｃは、りんペプチドをＡＴＰに対して高親和性を有するもの（低いＡｃ）と、ＡＴＰに対して低親和性を有する（高いＡｃ）ものに分類するのに使用された。低いＡｃを有するホスホサイトがたぶんＡｋｔ１の本当の生体内の基質であると提案された。これらの２つのグループのモチーフ分析（motif analysis）が、低いＡｃを有するりんペプチドはモチーフのために富化され、これはＡｋｔ１のコンセンサスなリン酸化モチーフに対応し、その結果、おそらく真正な基質であった。

この戦略は、すべてのキナーゼについて基質を同定するために適用されることができ、その結果、シグナルリング系路活性への調査の分野に大きな進歩を提供する。本発明の方法は当技術分野で知られている方法に比較して利益を有する。なぜなら、キナーゼ活性の調査のための伝統的方法は、しばしば放射能で標識されたＡＴＰの使用を必要として、その結果、彼らの使用が実用的な問題によって制限されるからである。さらに、これらの方法の多くが、基質識別を可能にするために長い精製工程を必要として、そのため非常に高価であって、手間がかかる。本発明の第２の態様の方法はそのような制限を克服する。追加的要因は通常、他のテクニックが１または２，３のキナーゼ基質の識別をもたらすのに対し、発明者の方法は、一度に１００以上の基質を同定する潜在性を有する。既存のテクニックに対する本発明の方法の更なる利点は、キナーゼ基質反応の親和性を測定することによって基質の識別に一定レベルの信頼性を提供できるということである。

本発明の第２の態様の方法には、多くの用途がある。ホスホプロトテオム(phosphoproteome)の注釈に加えて、本発明の方法は、特異的キナーゼのダウンストリーム標的（downstream target）を同定するのに使用される。これらの読み取りは、キナーゼのキナーゼ活性のバイオマーカーとして有用であり、また薬物動態学(pharmacodymamic)マーカー、および疾病および予後のマーカーとしても用途がある。さらに、同定された新規な基質は、特異疾患についての潜在的な新規な薬物標的を明らかにすることができる。

本発明の第１の態様のための好ましい特徴は第２の態様に準用される。 本発明の第２の態様のための好ましい特徴は第１の態様に準用される。以下の実施例を参照しつつ本発明を詳細に説明する。実施例は例示の目的のためにのみ示される。実施例では、以下の多くの図を参照する：

Ａｋｔ１の濃度増大に対応して変化するペプチドリン酸化の動態（dynamics）。生体外のキナーゼ分析における、活性なＡｋｔ１の濃度増大に対応した５６１ペプチド類のリン酸化動態は、定量的なホスホプロテオミクス(phosphoproteomics)を使用することで評価された。Ａ．すべての５６１ペプチド類のための規格化されたりんペプチド強度ヒートマップ（heatmap)は、遭遇するＡｋｔ１へのリン酸化反応のダイバーシチ（diversity）について図説した。Ｂ．ペプチド類の代表的な基に対するリン酸化反応の詳細な図説。ａ）Ａｋｔ１のリン酸化。これは実験の内部対照として働く。ｂ）Ａｋｔ１活性へのゼロまたは減少している反応を示したペプチド類の代表的な基のリン酸化。ｃ） ほぼ線形応答を示したペプチド類の代表的な基のリン酸化、それらはＡｋｔ１ のホスホリル化ダウンストリームと同様の傾向を示す。ｄ） 迅速で、持続した反応を示したペプチド類の代表的な基のリン酸化、それらはＡｋｔ１のホスホリル化ダウンストリームと同様の傾向を示す。１２４りんペプチドがグループｃ）とｄ）に同定された。

Ａｋｔ１−ＡＴＰ親和性の計算Ａ．ミカエリス−メンテン速度論の原理と、ヘインズ−ウルフプロットの変法を使用して、親和性定数（Ａｃ）が、Ａｋｔ１の活性について、それぞれのリン酸化部位に対するＡＴＰへの親和性について決められた。Ｂ．２つの代表的な反応の実施例ａ） ＡＴＰに高い親和性（低いＡｃ）を有するＡｋｔ１活性。ｂ） ＡＴＰに低い親和性（高いＡｃ）を有するＡｋｔ１活性。評価されたりんペプチドでは、ＡＴＰに対して、５１．７％は低いＡｃ（＜５０マイクロＭ、ｎ＝１０８）のＡｋｔ１活性を有し、４８．３％は高いＡｃ（＞ ４９マイクロＭ、ｎ＝１０１）Ａｋｔ１活性を有することがわかった。

モチーフ分析は、低いＡｋｔ１−ＡＴＰ Ａｃを有するりんペプチドが好塩基性モチーフで富化されていることを明らかにした。グループＡ、Ａｃ＜５０マイクロＭ（ＡＴＰに対する高親和性）からのりんペプチドのモチーフ−Ｘ分析、およびグループＢ（＞ ４９マイクロＭ（ＡＴＰに対する低親和性）からのりんペプチドのモチーフ−Ｘ分析は、グループＡは好塩基性モチーフについて富化され、これはＡｋｔ１のコンセンサスなリン酸化モチーフに対応している（Alessi, D. R. et al., Molecular basis for the substrate specificity of protein kinase PKB; comparison with MAPKAP kinase-1 and p70 S6 kinase. FEBS, 1996. 399: p. 333-338８）。

図４は質量分析法による、キナーゼ活性のグローバルプロファイリング（Global Profiling of Kinase Activities：ＧＫＡＰ）の戦略を示している。（ａ）ＧＫＡＰワークフローのためのスキーム。ＡＴＰとＭｇ２＋が無細胞抽出液に加えられ、キナーゼ反応が許容され、内因のキナーゼが内生タンパク性基質をリン酸化した。そのような酵素反応の生成物は、トリプシンで消化され、最適化されたテクニックを使用してＴｉＯ_２により富化された結果として、りんペプチドが得られた{Montoya et al, Methods.2011 Aug;54(4):370-8}。キナーゼ活性の結果として生成されたリン酸化の場所を含むりんペプチドが、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって次に、検出されて、定量化される。（ｂ）位置１７３のセリン／トレオニンプロテインキナーゼＭＳＴ４の上に示されている配列（アスタリスクは修飾の場所を示した）でのペプチドにおけるキナーゼ活性の定量化の例質量／電荷数（ｍ／ｚ）８７８．９２９９における抽出イオンクロマトグラム（ＸＩＣ）は、ＡＴＰ濃度の関数として活性の増大を示している。青、赤、および緑色のカーブはそれぞれこのペプチドの１番目、２番目、および３番目の同位体のＸＩＣｓに対応している。（ｃ）（ｂ）に示されたペプチド類の規格化された活性。（ｄ）アッセイで検出されたすべての活性の規格化された強度の平均。（ｅ）アッセイにおいて、ＡＴＰ濃度の関数としてＰ３１／Ｆｕｊで検出された活性の数。（ｆ）アッセイにおける蛋白質の量とＡＴＰ濃度の関数としてのキナーゼ活性のパターン。（ｇ）細胞溶解物の５マイクロｇ中に検出された活性の実施例。すべての値は繰返し測定の平均値である。

図５はキナーゼ阻害剤に対する異なった感受性の白血病細胞系におけるキナーゼ活性のグローバルプロファイリングを示している。（ａ）ＧＫＡＰアプローチは示されたＡＴＰの濃度でＰ３１／ＦｕｊとKasumi-1に適用された。キナーゼ活性はそれぞれのりんペプチドの最大値に規格化された。（ｂ、ｃ、ｄ）活性の例は反応速度カーブ（左側のパネル）として、または左側のパネルの活性のカーブの下の面積（ＡＵＣ、右側のパネル）として示されている。

図６は成長因子とキナーゼ阻害剤のキナーゼ活性ダウンストリームのグローバルプロファイリングを示している。（ａ）ＧＫＡＰアプローチは、ＥＧＦ、またはＥＧＦとＬＹ９２００４またはＵ０１２６での処理の後に見られたＡＴＰの濃度で、上皮系細胞に適用された。キナーゼ活性はそれぞれのりんペプチドの最大値に規格化された。（ｂ）（ａ）のそれぞれの実験条件で検出された活性の数。（ｃ、ｄ、ｅ）活性の例は反応速度カーブ（左側のパネル）として、または左側のパネルの活性のカーブの下の面積（ＡＵＣ、右側のパネル）として示されている。

ＧＫＡＰまたはホスホプロテオミクス実験から得られたリン酸化モチーフの比較分析。 合計４４のモチーフがＧＫＡＰ活性のりんペプチドマーカー、またはホスホプロテオミクス実験から入手されたものにマッチされた。上皮細胞系列と白血病細胞についての結果は（ａ）と（ｂ）にそれぞれ示されている。簡単さのために、「Ｓ」はモチーフにおいて、ホスホリル化の中央のアミノ酸としてホスホセリンまたはホスホトレオニンのどちらかを示す。特定のペプチドは１より多いモチーフを含むことができることに留意。

実施例１−プロテインキナーゼＡｋｔ１の基質の識別
イントロダクション
本発明者は、Cartlidge et al (2005)［１］によるプロトコールから適合されたin vitroのキナーゼ分析と、ＭＳベースのショットガンホスホプロテオミクスを結合する戦略を開発し、特定のキナーゼに依存するりん酸化事象の調査を可能にした。要約すれば、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して全細胞溶解物から低分子（ＡＴＰを含む）を除去し、サンプルの内因のホスファターゼ活性化を利用することによって、脱ホスホリル化する。脱ホスホリル化されたサンプルは、in vitro分析基質として機能し、次に、制御された反応条件で、組換え型の、活性のキナーゼとインキュベートされた。サンプルは次いで溶液中のトリプシン消化に供され、次に、りんペプチドは、二酸化チタン粉末クロマトグラフィーを使用して部分的に精製された。富化されたりんペプチド（対象となるキナーゼによる修飾部位を含む）は、ThermoFisher LTQ-Orbitrap XLを使用するＬＣ−ＭＳ／ＭＳおよびＬＣ−ＭＳ分析法により同定され、定量化された。 TIQUAS（Targeted In-Depth Quantification of Signalling)のアプローチは、これらの定量化を行うために行われ、異なる反応条件（ＡＴＰ濃度）の下でリン酸化部位の動態を調査するために使用された。

この戦略は、プロテインキナーゼＡｋｔ１の基質を同定するために適用された。in-vitroでＡｋｔ１のホスホリル化されたダウンストリームである１００以上のペプチド類が同定された。ミカエリスーメンテン速度論の原理を使用して、それぞれの部位についてＡｋｔ１のＡＴＰに対する親和性定数（Ａｃ）が決定された。その結果、生体内で（すなわち、生理的条件下の細胞で）このキナーゼに、より依存する傾向があるリン酸化部位の識別を許容する。モチーフ分析は、蛋白質に対するＡｋｔ１の高親和性活性は、塩基性アミノ酸によって囲まれた部位に起こると確認した。これはキナーゼの既知のコンセンサスなリン酸化モチーフに対応している［２］。

材料と方法
細胞培養
ＭＣＦ１０Ａヒト乳房上皮細胞は５％のＣＯ_２と３７℃に保たれた湿潤インキュベータ内で、１％のペニシリンとストレプトマイシン、５％のウマ血清、２０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ、０．５マイクロｇ／ｍｌのヒドロコーチゾン、１００ｎｇ／ｍｌのコレラトキシン、および１０マイクロｇ／ｍｌのインシュリンで補われたＤＭＥＭ：Ｈａｍｓ Ｆ１２（１：１）培地を使用して行われた。

細胞溶解
細胞は二度氷冷されたＰＢＳ洗浄された。次いでプロテアーゼインヒビタ（１５ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ フェニルメチルスルホニル フルオライド（ＰＭＳＦ）、１０マイクロｇ／ｍｌ アプロチニン、１０マイクロｇ／ｍｌ ロイペプチン）が補われた４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００および２．５ｍＭ ＥＤＴＡで溶菌された。細胞は、インキュベーションの前に２０分間氷の上に、徹底的にこすり落とされて、ボルテックスされた。得られた溶解物は１０分間、４℃で１万３０００ｒｐｍで遠心沈殿によって透明にされた。

Ａｋｔ１ キナーゼ分析
セファデックスＧ−２５（ＧＥヘルスケア２８−９１８０−０７）カラム、４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．０、１ｍＭ ＤＴＴ、０．１ｍＭ ＥＧＴＡ、および０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００溶出緩衝液を使用してサイズ排除ろ過で細胞溶解物から低分子を除去した。そして、溶解物は２０分間３０℃に保持され、内因のホスファターゼによって蛋白質脱りん酸化された［３］。

１ｍｇの脱リン酸化溶解物は反応バッファ中に希釈され、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、１ｍＭ ＥＧＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、および０−５００マイクロＭのＡＴＰの最終濃度にされた［２］。次に、組換え型の、アクティブなＡｋｔ１（ミリポア１４−２７６）が加えられ、そして、混合物は１０分間３０℃でインキュベートされた。反応は８Ｍの最終濃度への尿素の添加で止められた。

溶液中のトリプシン消化とりんペプチド富化
蛋白質は、１５分間１０ｍＭ ＤＴＴで室温でインキュベートすることにより減少され、１６．６ｍＭヨードアセトアミド（ＩＡＭ）と１５分間室温でインキュベートすることによりアルキル化された。次にサンプルは、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファ（ｐＨ８）と１対４で希釈され、蛋白質は固定化されたＴＰＣＫ処理されたトリプシン（Thermo Scientific)で１６時間３７℃でインキュベートされ、消化された。ペプチドのサンプルは私たちの実験室で最適化された条件を使用してOasis HLB Cartridges(Waters WAT094225)を使用する逆相固相抽出法で脱塩した。

りんペプチドのクロマトグラフ的精製が、サンプルをＴｉＯ_２ビーズ(Titanspheres, GL Sciences 5020-7500) でインキュベートし、私たちの実験室で最適化された組成物のバッファーで洗浄し、ＮＨ_４ＯＨ（ｐＨ１１）で溶離することにより行われた。

りんペプチド溶液には酸が加えられ、真空乾燥され、０．１％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で、ＭＳ分析法のために再構成された。

質量スペクトル分析
エレクトロスプレイソースを備えたThermoFisher LTQ-Orbitrap XLと、Waters NanoAcquity UPLC Systemとの組み合わせを使用して、ＬＣ−ＭＳ、およびＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析が行われた。ペプチド類は、このシステムで、１．７μｍの粒子で充填されたWaters BEH130(Ethylene Bridged Hybrid)Ｃ１８逆相カラム（１００μｍｘ１００ｍｍ）とＡＣＮの増加する傾斜を使用して分離された。データ−依存モードでＭＳデータを取得した。オービトラップアナライザー（orbitrap analyzer）中でＭＳスキャンを実行して、ＬＴＱイオントラップにおける逐次的な分離、ＣＩＤフラグメンテーションおよび検出によって、５つの最も豊富なつのイオン類のＭＳ／ＭＳスキャンを取得した。

データ分析
りんペプチド識別において、Mascot Distiller(Matrix Science)が、ＭＳデータファイルからＭＳピークデータを抽出するのに使用された。次いで、サーチエンジンＭＡＳＣＯT(Matrix Science)を使用し、ＭＳ／ＭＳスペクトルデータと、ヒトのSwissProｔデータベースにおけるすべてのペプチドエントリーの理論上のＭＳ／ＭＳとを比較して、ペプチドと蛋白質を同定した。

りんペプチドは、ＴＩＱＵＡＳの原理を使用したＰｅｓｃａｌ（社内で開発されたコンピュータプログラム）を使用することで定量化された。

オンライン・ソフトMotif-X( http://motif-x.med.harvard.edu/ )が、提出されたりんペプチドデータから共通のリン酸化モチーフを抽出するのに使用された。

結果
Ａｋｔ１へのホスホサイト依存性の識別
脱リン酸化ＭＣＦ１０Ａ 細胞溶解物は、０、２または１０マイクロｇの組換え型のアクティブなＡｋｔ１ プロテインキナーゼおよび１００マイクロＭのＡＴＰを使用して説明された生体外のキナーゼ分析に供された。その後トリプシン消化、りんペプチド富化、およびＭＳ分析が行われた。ＭＳデータの定量分析は、Ａｋｔ１に依存している傾向があるりん酸化事象を同定するのに使用された。

５６１のりんペプチドが３個のサンプルにわたり、要求される信用度（ＭＡＳＣＯＴ予期スコア＜０．０５）で同定された。ＴＩＱＵＡＳは、Ａｋｔ１の濃度の異なる反応条件の下で、これらの部位のリン酸化の動態を定量化するのに使用された（図１Ａ）。Ａｋｔ１自身のりんペプチドの定量化は、実験（図１Ｂ ａ））の内部対照として作用し、量的方法が正当であると確認された。多くのりんペプチドが、Ａｋｔ１の濃度増大に応じなかったか、または減少を示すと同定された（図１Ｂ ｂ））。これらのりん酸化事象は、サンプルの内因のキナーゼとホスファターゼに依存しているようであり、その結果、Ａｋｔ１ の濃度の影響を受けなかった。１０マイクロｇのＡｋｔ１でインキュベートされた時と、０マイクロｇのＡｋｔ１でインキュベートされた時を比較すると、リン酸化が少なくとも１．５倍の増大を示したペプチド類は、キナーゼに依存性であると考えられ、ダウンストリームの基質であるようである。このグループはさらにＡｋｔ１に対してほぼ線形の反応を示すもの（図１Ｂ ｃ）と、より急速で持続的な反応を示すもの（図１Ｂ ｄ））とに分けられ、後者はしたがって、Ａｋｔ１により高い親和性を持ち、多分生体内でより真の基質であるであろう。１２４のりんペプチドが、多分Ａｋｔ１のダウンストリームであると同定され、その結果多くの潜在的な新規の基質が同定された。

ＡＴＰに対するＡｋｔ１依存性ホスホサイトの親和性のキャラクタリゼーション
潜在的Ａｋｔ１−依存性りん酸化事象のどれが生体内で最も起こりそうかを同定するために、アプローチは、それぞれのホスホサイトと関連してＡｋｔ１のＡＴＰに対する親和性を定量化するために工夫された。ＡＴＰに高親和性を示すりん酸化事象は、生体内で、より起こりそうである。その結果、それらの確率により候補基質を真の生理的基質として格付けすることを許容する。脱リン酸化ＭＣＦ１０Ａ 細胞溶解物は、説明した生体外のキナーゼ分析に供された。ただし今回は０、１０、５０、１００または５００マイクロＭのＡＴＰが、Ａｋｔ１の２マイクロｇで１０分間インキュベートされた。従来と同様、キナーゼ反応の後に、トリプシン消化、りんペプチド富化、およびＭＳ分析法を行った。ＭＳデータの定量分析は、ミカエリスーメンテン速度論の原理に基づき行われ、ＡＴＰに対するＡｋｔ１の活性について、それぞれのホスホサイトについて親和性定数（Ａｃ、Ｋｍに関連する）を決定した（図２Ａ）。

図２Ａで定義される親和性定数（Ａｃ）は、このアッセイ（ｎ＝２４５）において、ＡＴＰの濃度増大に対応して増加することがわかったすべてのりんペプチドについて計算された。私たちは、Ａｃ＜５０マイクロＭを有するりんペプチドは高いＡｋｔ１−ＡＴＰ親和性を示し、Ａｃ＞４９マイクロＭを有するりんペプチドは低いＡｋｔ１−ＡＴＰ親和性を示すと考えた（図２Ｂ）。評価されたりんペプチドでは、５１．７％は低いＡｃのＡｋｔ１活性（＜５０マイクロＭ、ｎ＝１０８）を有し、４８．３％は高いＡｃのＡｋｔ１活性（＞ ４９マイクロＭ、ｎ＝１０１）を有することがわかった。低いＡｃを有するりんペプチドはＡｋｔ１の真の生体内の基質である大きな可能性があるが、高いＡｃを有するりんペプチドはｉｎ ｖｉｔｒｏ分析の人工産物である可能性がある。

りんペプチド分類の妥当性確認
りんペプチド分類の妥当性を確認するために、Ｍｏｔｉｆ−Ｘが、低いＡｋｔ１−ＡＴＰ Ａｃと高いＡｋｔ１−ＡＴＰ Ａｃを有するりんペプチドについてコンセンサスリン酸化モチーフを分析するために使用された（図３）。分析は、Ａｃ＜５０マイクロＭ（ＡＴＰに対する高親和性）を有するりんペプチドのグループが好塩基性モチーフで富化され、これは公知のＡｋｔ１ ＲｘＲｘｘＳ／Ｔのコンセンサスリン酸化モチーフに対応している［２］。したがって、モチーフ分析は、生体内で、高いＡｋｔ１−ＡＴＰ親和性を有するりんペプチドが真実のＡｋｔ１基質であるより高い傾向があるという仮説の妥当性を確認した。

参照文献
1.Cartlidge, R.A., et al., The tRNA methylase METTL1 is phosphorylated and inactivated by PKB and RSK in vitro and in cells. EMBO J, 2005. 24(9): p. 1696-1705.
2.Alessi, D. R. et al., Molecular basis for the substrate specificity of protein kinase PKB; comparison with MAPKAP kinase-1 and p70 S6 kinase. FEBS, 1996. 399: p. 333-338.
3.Knebel, A., N. Morrice, and P. Cohen, A novel method to identify protein kinase substrates: eEF2 kinase is phosphorylated and inhibited by SAPK4/p38[delta]. EMBO J, 2001. 20(16): p. 4360-4369.

実施例２− 質量分析法によるプロテインキナーゼ活性の全体的なプロファイリング
材料と方法
材料
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから細胞培養試薬を購入した。他の試薬を以下に示すように購入した：
組替えヒトＥＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ ＡＦ−１００−１５）
ＬＹ２９４００２（メルク４４０２０２）
Ｕ０１２６（メルク６６２００５）
ＰＩ１０３（メルク５２８１００）
ＪＡＫ 阻害剤 Ｉ（メルク４２００９９）
アデノシン５’三リン酸二ナトリウム塩水化物（ＡＴＰ）(Sigma A2383)
ＴＬＣＫ−トリプシン（Thermo Scientific 20230)
オアシスＨＬＢ抽出カートリッジ(Waters WAT094225）
ＴｉＯ_２ チタン球(GL Sciences Inc5020-75010)
PepClean C-18 Spin カラム（Thermo Scientific 89870)
ＭＴＳアッセイ(CellTiter 96RAQueous One Solution Cell Proliferation assay、Promega Corporation、G3581)。

細胞培養
すべての細胞が５％のＣＯ_２の湿気のある環境の中で３７℃で維持された。白血病細胞ラインＰ３１／ＦｕｊとＫａｓｕｍｉ−１は１０％のＦＢＳ、１００単位／ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシンおよび５０マイクロＭのβメルカプトエタノールが補われたＲＰＭＩ−１６４０培地体で育てられた。細胞は０．５から２ｘ１０^６細胞／ｍＬで維持された。収穫の２４時間前に、５０×１０^６の細胞が０．５ｘ１０^６細胞／ｍＬの密度で新鮮培地にシードされた。ＭＣＦ１０Ａヒト乳房上皮細胞は５％のウマ血清、１００単位／ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシン、２０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ、０．５マイクロｇ／ｍｌのヒドロコーチゾン、１００ｎｇ／ｍｌのコレラトキシン、および１０マイクロｇ／ｍｌのインシュリンで補われたＤＭＥＭ：Ｆ１２（１：１）培地を使用して行われた。成長因子と阻害剤での処理の前に、細胞は１８時間、１００単位／ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシンのみが補われたＤＭＥＭ：Ｆ１２（１：１）内で維持された。次いで細胞は、５マイクロＭのＬＹ２９４００２または１０マイクロＭのＵ０１２６で１時間処理されて、その後１０分間、１００ｎｇ／ｍｌの組換え型のＥＧＦにより刺激された。

増殖検定
Ｐ３１／ＦｕｊとＫａｓｕｍｉ−１細胞ラインは１ｘ１０^５細胞／ｍＬ（１ウェルあたり１ｘ１０^４細胞）の濃度で９６穴プレート内にシードされた。２４時間の回復の後に、細胞はビヒクル（ＤＭＳＯ）、１００ｎＭ ＰＩ−１０３、１−マイクロＭのＪＡＫ 阻害剤 Ｉ、または１０マイクロＭのＵ０１２６で処理された。７２時間の処理の後に、細胞生存率が、メーカーの実験計画書に従って、ＭＴＳアッセイを使用することで測定された。それぞれの条件は５回分析された。ｔ−検定が、細胞ラインの相違を決定するために使用された。ｐ−値が＜０．０５であるときに、相違は有意であると統計的に考えられた。

ＧＫＡＰのための細胞溶解
ＭＣＦ１０Ａ 細胞と白血病細胞（遠心沈殿で、５分間の３００ｘ ｇで、集められた）は二度、ホスファターゼ阻害剤（１ｍＭ Ｎａ_３ＶＯ_４と１ｍＭ ＮａＦ）が補われた氷冷のリン酸緩衝溶液で洗浄された。そして、細胞は４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．４、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００とプロテアーゼインヒビタ（０．０５ＴＩＵ／ｍｇアプロチニン、１０マイクロＭのロイペプチン、０．７ｍＭのペプスタチンＡ、２７μＭのＴＬＣＫ、１ｍＭのＤＴＴ、および１ｍＭのＰＭＳＦ）、およびホスファターゼ阻害剤（５０ｍＭ ＮａＦ、１ｍＭ Ｎａ_３ＶＯ_４、および１マイクロＭのオカダ酸）が補われた２．５ｍＭ ＥＤＴＡ中に溶解された。細胞溶解物はボルテキシングによってさらに均質化された。そして、不溶性物質は１０分間の２０，０００ｘ ｇで遠心沈殿によって取り除かれた。上澄の蛋白質濃度はブラッドフォード分析により計算された。

In vitrｏ ＧＫＡＰ アッセイ
必要な量の蛋白質（示さなかった場合には５０マイクロｇ）を含む全細胞溶解物は、反応バッファと１：１に混ぜられ、４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．４、１．２５ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、および示された（０−５００マイクロＭ）量のＡＴＰを含む最終的な反応混合物を生成した。アッセイ混合物は５分間、３０℃で、撹はんしつつインキュベートされた。反応は８Ｍの最終濃度への尿素の添加により停止され、ホスホプロテオミクスＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析法のためにさらに処理された。

ホスホプロテオミクスのための細胞分解
ＭＣＦ１０Ａ 細胞と白血病細胞（遠心沈殿で、５分間の３００ｘ ｇで、集められた）は二度、ホスファターゼ阻害剤（１ｍＭ Ｎａ_３ＶＯ_４と１ｍＭ ＮａＦ）が補われた氷冷のリン酸緩衝溶液で洗浄された。次に、細胞は溶解され、蛋白質は８Ｍ尿素と、ホスファターゼ阻害剤（１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４、１ｍＭ ＮａＦ、２．５ｍＭ Ｎａ_４Ｐ_２Ｏ_７、１ｍＭ ｓ−グリセロールリン酸）が補われた２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）で変性された。細胞溶解物は超音波処理でさらに均質化され、そして、不溶性物質は１０分間の２０，０００ｘ ｇで遠心沈殿によって取り除かれた。上澄の蛋白質濃度はブラッドフォード分析で計算された。そして、蛋白質の５００マイクロｇを含む細胞溶解物のサンプルはホスホプロテオミクスＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析のためにさらに処理された。

ホスホプロテオミクス分析のための、溶液消化およびＴｉＯ_２ 親和性クロマトグラフィー
溶液中のトリプシン消化とＴｉＯ_２親和性クロマトグラフィーを使用するりんペプチド富化が、モントヤ他［１］に記載されるように、実行された。要約すれば、サンプルは、１６時間、ＴＬＣＫ−トリプシンでインキュベートする前に、ＤＴＴおよびヨードアセトアミドで逐次的なインキュベーションにより還元されアルキル化され、２Ｍ尿素まで２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）バッファで希釈された。消化はトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）の１％の最終濃度での添加により停止され、そして、サンプルは固相抽出法で脱塩された。りんペプチドは、次に、２５マイクロｌのＴｉＯ_２ビーズ（５０％のスラリー）がスピンカラムに充填された親和性クロマトグラフィで抽出されて、５％のＮＨ_４ＯＨ（ｐＨ 約１１．０）で溶離された。りんペプチド富化サンプルは、次いでギ酸で酸性化され、Speedvacを使用して乾燥され、ペレットは−８０℃で分析まで貯蔵された。
ＬＣ−ＭＳとＬＣ−ＭＳ／ＭＳ
ＬＣ−ＭＳとＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析が、先に説明したように、実行された［１，２］。

要約すれば、Mascot Daemon (v2.2.2; Matrix Science, London, UK) が、ＭＳデータを分析するのに使用された。このソフトウェアは、Ｍａｓｃｏｔ Ｄｉｓｔｉｌｌｅｒ（ｖ２．３．２）の使用を自動化し、ＭＳ／ＭＳデータをスムーズにしてセントロイドした。Ｍａｓｃｏｔサーチエンジン（ｖ２．２．０２）は、スイスのＰｒｏｔデータベース（２３０００のエントリーを含んでいて、０３／０３／２０１１にダウンロードした）のペプチド配列ライブラリでのすべてのエントリーに対して処理されたファイルを検索する。
検索パラメータは以下を含む：酵素、トリプシン；見のがされた許容された分裂の数（number of missed cleavages permitted）、２；固定された修飾、カルバミドメチル（Ｃ）；可変修飾、Ｇｌｎ−＞pyro-Ｇｌｕ（Ｎ−ターム Ｑ）、酸化（Ｍ）、ホスホ（ＳＴ）、ホスホ（Ｙ）；前駆イオンのマス許容度（mass tolerance）、５ｐｐｍ；フラグメントイオンのマス許容度、０．６Ｄａ。それらの期待値が（Ｍａｓｃｏｔによって返された時に）＜０．０５である場合に、ヒットは有意であると考えられている。社内のスクリプトがＭａｓｃｏｔ結果を抽出するのに使用された。次に、結果は更なる分析のためにエクセルファイルに入力された。多発性潜在的リン酸化部位を有するペプチド類について、Ｍａｓｃｏｔによって報告された第１と第２のヒットの間のデルタスコアは、正しい位置を同定するのに使用された［３］。Ｐｅｓｃａｌ［４］が、抽出されたイオンクロマトグラム（ＸＩＣ）の生成を自動化して、サンプルのピーク高さを計算するのに使用された。ＸＩＣｓはそれぞれのペプチドイオンの第１の３つの同位体のために組み立てられ、質量／電荷数、ｔＲ、電荷および同位体分布の制限の応用を許容する。それぞれの個々のＸＩＣのピーク高さを決定することによって、強度が計算できるだろう。結果として得られる定量データは規格化と統計分析のためにエクセルファイルにされた。ＡＴＰでインキュベートされたサンプルのペプチド強度は、対照試料（インキュベートのないもの）中のそれらの強度に規格化された。

結果
私たちは、in-vitroキナーゼ反応のための基質として全長プロテインを使用することにより、プロテインキナーゼ活性を、より効率的に、より包括的にアッセイすることができるという考えをテストすることを目指した。ここで報告されたテクニック（図４Ａ）では、細胞溶解物中に存在しているプロテインキナーゼは無細胞抽出液へのＡＴＰの添加の後に細胞溶解物の中に存在している内部基質のリン酸化を許容する（補因子が、キナーゼを活性化するために必要である）。そして、定義された期間のインキュベーションの後に、反応生成物は、定量的な質量スペクトル法［１，２，３］に基づく、標準的なホスホプロテオミクスのテクニックを使用することで定量化される。また、ＡＴＰの異なった濃度でアッセイを実行することによって、これがモニターされるそれぞれの活性のための実験条件にわたるキナーゼの酵素特性の評価を許容すると想定した。

最初に、ＡＴＰの異なる濃度（０マイクロＭ、１０マイクロＭまたは１００マイクロＭ）と全細胞溶解物の異なる濃度（蛋白質濃度によって測定される）を含む反応バッファで、Ｐ３１／Ｆｕｊ（白血病細胞ライン）から得られた細胞溶解物の中で異なる蛋白質量でインキュベートした。アプローチにより得られたデータは、１つの反応生成物ＭＳＴ４（配列ＬＡＤＦＧＶＡＧＱＬＴＤＴ＊ＱＩＫ、アスタリスクはホスホリル化アミノ酸を示す）を分析して示された（図４Ｂ）。このりんペプチドの抽出イオンクロマトグラムは、全細胞溶解物の中の蛋白質がちょうど５マイクロｇでインキュベートされた時にその強度が増大し、ＡＴＰ濃度の増大に伴って増大した（図４Ｂ）。これは活性分析において信号の増幅は固有であり、それを生じる態様は非常に感受性であることを示した。図４ＣはＡＴＰと蛋白質濃度の関数として、基本りん酸化レベルに対するこのりんペプチドの規格化された強度のプロットを示している。図４Ｄはこの実験で測定されたすべての活性種の規格化された平均強度を示している。インキュベートされていないサンプルに対し、ＡＴＰでインキュベートした後のりんペプチドの信号は２倍と画定された。この評価基準を使用して、７６と１９５の活性種がこれらの細胞の中で、それぞれ１０および１００マイクロＭのＡＴＰとのインキュベートの後に同定された（図４Ｅ−Ｆ）。ＧＫＡＰによって得られるキナーゼ活性がＡＴＰ濃度の関数として増加することがさらに確認された。予想されたように、これらの活性測定値は、反応混合物中の蛋白質量に比例した（図４Ｆ）。細胞溶解物中の５マイクロｇの蛋白質でさえ、１００よりも多いキナーゼ反応が検知された。それの例は図４Ｈに示されている。

次に、異なったがん細胞がキナーゼ活性における検出可能な相違を示すか否かを調べた。このために、ＧＫＡＰをＰ３１／ＦｕｊとＫａｓｕｍｉ−１に適用することを選んだ。２つの白血病細胞ラインはＭＥＫ、ＪＡＫ、ＳｃｒおよびＰＩ３Ｋ阻害剤への増殖鋭敏度の顕著に異なるパターンを示し、これらの化合物で処理された時に、Ｐ３１／Ｆｕｊは香住−１より増殖抑制に抵抗力があった［２］上に概説されたキナーゼ反応を定義する同じ評価基準を使用して、我々の分析はＡＴＰ濃度に比例しているこれらの白血病細胞ラインの８１キナーゼ反応を明かにした。（図５Ａ）。これらの活性の例は、図５Ｂ、５Ｃおよび５Ｄに示され、それぞれＫａｓｕｍｉ−１、Ｐ３１／Ｆｕｊのどちらかで増加するか、または変わりがなかった。図５Ｂ、５Ｃ、および５Ｄの左のパネルは、ＡＴＰ濃度の関数としての活性を示し、右のパネルはそれぞれのキナーゼ活性プロフィルについての曲線下面積（ＡＵＣ）を示している。これらの結果は、ＧＫＡＰが異なった遺伝表現型と目的化合物への異なった感受性のがん細胞におけるシグナリング経路活性化における相違を検出するために使用できることを示した。

次に、ＧＫＡＰによって定量化されるキナーゼ活性は、キナーゼ経路に影響することが知られている刺激の結果として調節でき、系路活性を読み取ることができるかどうかを調べた。これは、ＥＧＦでの処理の後にＧＫＡＰワークフローを上皮細胞ラインＭＣＦ１０Ａに適用することによって対処された。ＥＧＦはその受容体のいくつかのキナーゼ経路のダウンストリームを活性化することが知られている成長因子である。また、細胞はＥＧＦでの処理の前に、ＰＩ３ＫとＭＥＫに対する阻害剤、すなわちＬＹ９２００４とＵ０１２６でそれぞれ処理された。これらの実験において、ＧＫＡＰは４つの異なったＡＴＰ濃度（１０、５０、１００および５００マイクロＭ）で行なわれた。定量化されたりんペプチドの強度は基本リン酸化物（インキュベートなし、０マイクロＭのＡＴＰとして図６に示される）に対する倍率として示された。図６ＡはＥＧＦ、ＬＹ９２００４、およびＵ０１２６で影響されたキナーゼ活性のパターンを示す。２４０以上のキナーゼ活性種が未処置の飢餓細胞で検出された（図６Ｂ）。この数は細胞がＥＧＦで処理されたとき３７２（１．５倍に増大）まで増加した。両方のキナーゼ阻害剤も、これらの実験で検出されたＥＧＦ依存性キナーゼ活性の数を約３０％減少させた（図６Ｂ）。この実験で定量化されたキナーゼ活性の例は、図６Ｃ−Ｆに示される。ＡＴＰ濃度の関数としての活性は、酵素反応速度論で典型的なＳ字状曲線を示す（図６Ｃ−Ｆ、左のパネル）。図６Ｃ−Ｆの右のパネルはこれらのキナーゼ活性のＡＵＣを示している。ＥＧＦ刺激のときに増加するが、キナーゼ阻害剤での前処理により影響を受けなくなる例は図６Ｃに示されている。ＬＹ９２００３、Ｕ０１２６または両方により減少されるキナーゼ活性の例は、それぞれ図６Ｄ、６Ｅ、および６Ｆに示される。興味深いことに、ＬＹ９２００４とＵ０１２６（図６Ｄおよび６Ｅ）により影響を受けたキナーゼの活性ダウンストリームは、対照細胞における活性と重なり、目標ではないキナーゼのこれらの活性への貢献が取るにたらないことを示した。

上記の実験は、速度論的に数百のキナーゼ活性をプロファイルするために、ＧＫＡＰが使用できることを示した。しかしながら、アプローチの有用性は明確にこれらの活性に依存し、この活性はアッセイで検出された２，３ではなくすべてのペプチド類をリン酸化する異なるキナーゼにより寄与される。これはコファリング特異性（coffering specificity）の唯一の決定要因ではないが、異なるキナーゼは、その基質を、りん酸化部位を取り囲む直線的なモチーフの関係でリン酸化する［６］。したがって、ＧＫＡＰ実験でのリン酸化された異なったモチーフの評価は、観測された活性に貢献するキナーゼのレパートリーを推論するのに使用できる。私たちは、文献６から、異なったキナーゼ類によりホスホリル化されることが知られている４４のモチーフのリストをコンパイルして、それらをキナーゼ活性に関する我々のデータセットと適合させた。比較のために、この研究で使用された細胞ラインと同じものの大規模なフォスホプロテオミクスを実行して、これらの基本フォスホプロテオミクスに存在しているモチーフの分布を決定した。分析は、標準のフォスホプロテオミクス実験で存在しているすべてのモチーフは、上皮細胞ライン内のキナーゼ活性を定量化するのに使用されたりんペプチドの中にも存在していることを明らかにした（図７Ａ）。たただしフォスホプロテオミクスによって得られたリン酸化モチーフの数は活性種として得られたものの約４倍であった。また、白血病フォスホプロテオミクスに関連しているほとんどのリン酸化モチーフも活性種として存在していた（図７Ｂ）。ただし活性分析とフォスホプロテオミクスから得られたリン酸化モチーフは、白血病細胞と上皮系細胞ではほとんど重なっていないことが観測され、興味深い。

上記の結果は、ＧＫＡＰは、全部ではないにしろほとんどの、これらのアッセイで示されるべき細胞ラインまたは組織内に発現するキナーゼ活性の分析のための一般的な方法であることを示す。これはキナーゼ基質として短ペプチドを使用した従来の研究と対照的である［７，８］。これらは試験管内のキナーゼ反応のための特異性キナーゼのために選択された基質の添加に基づき、抗体に基づくアッセイと同じ制限を有し、その基質に対する選択性と特異性を有するキナーゼをより特徴付けるというバイアスが生じる。ここに、私たちは、キナーゼ活性が調査中の生体モデルで活性であるかもしれないというキナーゼの先入観なしで定量化されることを示した。また、キナーゼ反応が細胞で起こるように、そのようなキナーゼの基質が生体モデルで検討される状態で発現されなければならないと主張できる。キナーゼ／ホスファターゼ反応がどれくらい活発であるかにかかわらず、基質が発現されないキナーゼ活性は機能的重大性を持たないだろう［９］。ＧＫＡＰにより明らかにされない活性は、内在性キナーゼ活性だけではなく、基質の発現も考慮しなければならない。どちらも系路活性化に貢献するからである。さらに、ＧＫＡＰ分析評価で明らかにされたキナーゼ活性は、キナーゼの生理的基質である全長蛋白質に起こり、その結果、測定活性に貢献する非特異的キナーゼの可能性を減少させる。私たちは、ここにテクニックを示すために、定量的な読み取りとして無標識のＬＣ−ＭＳを使用したが、標識方法(Nat Biotechnol. 2007 Sep;25(9):1035-44.; Nat Biotechnol. 2004 Sep;22(9):1139-45. Epub 2004 Aug 15)もＧＫＡＰ性生物を検出して、定量化するのに使用できる。ＧＫＡＰは概念的に単純であるが、バイアスのない特異的方法におけるキナーゼ活性のプロフィルを描くための一般に適用可能なアプローチであり、その結果、信号伝達の機構を理解し、シグナル伝達阻害に基づく療法の発達を進めることを目的とする研究における広い適用性を有する。

参考文献
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Claims (15)

1. 以下の工程を含む、少なくとも１つのポリペプチドを含む生物サンプル間の、蛋白質トランスフェラーゼの活性の差を決定するための方法：
   （１−ｉ）第１のサンプルを、前記トランスフェラーゼの非蛋白質性基質のｘの異なる濃度に暴露する工程、ここでｘは２であるかまたは２より大きい；
   （１−ｉｉ）該非蛋白質性基質のｘの異なる濃度のそれぞれにおいて前記サンプル内のポリペプチドの修飾を定量化する工程；
   （１−ｉｉｉ）前記非蛋白質性基質についての前記トランスフェラーゼの親和性を決定する工程；
   （１−ｉｖ）２番目のまたは次のサンプルに対する工程（１−ｉ）から工程（１−ｉｉｉ）を繰り返す工程；および
   （１−ｖ）前記サンプルの間の前記非蛋白質性基質に対する前記トランスフェラーゼの親和性を比較する工程；
   ここで、サンプルの間の前記非蛋白質性基質に対する前記トランスフェラーゼの親和性における相違は、サンプルの間の前記トランスフェラーゼの活性の差を示している。
2. 前記サンプルが細胞溶解物である、請求項１記載の方法。
3. 以下を含む、ポリペプチドの混合物内の蛋白質トランスフェラーゼの生体内の基質を決定するための方法：
   （３−ｉ）第１の基質のｘの異なる濃度に蛋白質トランスフェラーゼを露出する工程、
   ここでｘは２または２より大きく、
   第２の基質の濃度を一定とし、
   第１および第２の基質の１つは前記トランスフェラーゼの非蛋白質性基質であり、他方がポリペプチドの混合物である；
   （３−ｉｉ）前記第１の基質のｘの異なる濃度のそれぞれで、前記ポリペプチドの混合物中のポリペプチドの修飾を定量化する工程；
   （３−ｉｉｉ）前記第１の基質に対する前記トランスフェラーゼの親和性を決定する工程；および
   （３−ｉｖ） 前記第１の基質に対する前記トランスフェラーゼの親和性に基づいて、前記ポリペプチドが前記トランスフェラーゼの生体内の基質であるかどうかを決定する工程；
   ここで、前記第１の基質に対する前記トランスフェラーゼの高い親和性が、前記ポリペプチドが前記トランスフェラーゼの生体内の基質であることを示す。
4. 前記ポリペプチドの混合物が、生物サンプル内の細胞を溶解して細胞溶解物を製造することにより生物サンプルから得られる未消化蛋白質の混合物である、請求項３記載の方法。
5. 工程（３−ｉ）を行う前に前記細胞溶解物内の蛋白質が、前記細胞溶解物内の他の成分から分離され、および／または工程（３−ｉ）を行う前に前記細胞溶解物が脱リン酸化される、請求項４記載の方法。
6. 工程（１−ｉｉ）又は工程（３−ｉｉ）の前にサンプル又は前記ポリペプチドの混合物から消化によりペプチドの混合物を得る、請求項１から５のいずれか１項記載の方法。
7. 前記ポリペプチドの混合物が、蛋白質の消化で得られたペプチドの混合物であり、消化がトリプシン、キモトリプシン、Ａｒｇ−Ｃ、ペプシン、Ｖ８、Ｌｙｓ−Ｃ、Ａｓｐ−Ｃ、およびＡｓｐ−Ｎから成る群から選択されるプロテアーゼを使用して行われる、請求項３記載の方法。
8. 該ペプチドの長さが５から３０アミノ酸である、請求項６または７記載の方法。
9. 前記ポリペプチドが工程（１−ｉｉ）または工程（３−ｉｉ）の前にクロマトグラフィーにより精製される、請求項１から８のいずれか１項記載の方法。
10. （ａ）前記蛋白質トランスフェラーゼはプロテインキナーゼであり、前記非蛋白質性基質はＡＴＰであるか、または
    （ｂ）前記蛋白質トランスフェラーゼは蛋白質アセチルトランスフェラーゼであり、前記非蛋白質性基質は、アセチル基を持っている化合物であるか、または
    （ｃ）蛋白質トランスフェラーゼが蛋白質グリコシルトランスフェラーゼであり、該非蛋白質性基質が活性化ヌクレオチド糖であるか、または
    （ｄ）前記蛋白質トランスフェラーゼは蛋白質メチルトランスフェラーゼであり、前記非蛋白質性基質はメチル基を有する化合物であるか、または
    （ｅ）前記蛋白質トランスフェラーゼは蛋白質パルミトイルトランスフェラーゼであり、前記非蛋白質性基質は脂質パルミトイルを含む化合物である、請求項１から９のいずれか１項記載の方法。
11. ｘが少なくとも３である、請求項１から１０のいずれか１項記載の方法。
12. 工程（１−ｉｉ）又は工程（３−ｉｉ）が、以下の工程を含む方法を使用して行われる、請求項１から１１のいずれか１項記載の方法：
    （１２−ａ）前記サンプルまたは前記ポリペプチドの混合物について質量分析（ＭＳ）を行い、サンプルまたは前記ポリペプチドの混合物内のポリペプチドに関するデータを得る工程；および
    （１２−ｂ）前記サンプルまたは前記ポリペプチドの混合物内のポリペプチドに関するデータと、修飾ポリペプチドに関するデータベース中のデータとを、コンピュータプログラムを使用して比較する工程；
    ここで、修飾ポリペプチドに関するデータベースが、以下を含む方法によってコンパイルされる；
    （１２−ｉ） サンプルからポリペプチドを得ること；
    （１２−ｉｉ） 工程（１２−ｉ）で得られたポリペプチドからの修飾ポリペプチドを富化すること；
    （１２−ｉｉｉ） 工程（１２−ｉｉ）で得られた富化された修飾ポリペプチドについて、液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）を行うこと；
    （１２−ｉｖ） 修飾ポリペプチドを同定するために、工程（１２−ｉｉｉ）で検出された修飾ポリペプチドを、公知のリファレンスデータベースと比較すること：および
    （１２−ｖ） 工程（１２−ｉｖ）で同定された修飾ポリペプチドに関連するデータを、データベースにコンパイルすること。
13. 工程（１２−ａ）が前記サンプルまたは前記ポリペプチドの混合物から修飾ポリペプチドを富化し、富化された修飾ポリペプチドの混合物を製造し、該富化された修飾ポリペプチドの混合物に質量分析法（ＭＳ）を行い、前記サンプルまたは前記ポリペプチドの混合物中の変性ポリペプチドに関連したデータを得ることを含む、請求項１２記載の方法。
14. （１４−ａ） 前記サンプルまたは前記ポリペプチドの混合物内のポリペプチドに関連するデータが、質量／電荷（ｍ／ｚ）比、電荷（ｚ）、およびポリペプチドの相対保持時間から選択される；および／または
    （１４−ｂ） 前記工程（１２−ａ）における前記質量分析法（ＭＳ）は液体クロマトグラフィー−質量分析法（ＬＣ−ＭＳ）である；および／または
    （１４−ｃ） 前記工程（１２−ｉｉ）が、多次元クロマトグラフィーを使用することで行われる；および／または
    （１４−ｄ） 前記工程（１２−ｉｖ）が、ＭＡＳＣＯＴサーチエンジンを使用することで行われる；および／または
    （１４−ｅ） 修飾ポリペプチドに関連するデータが、修飾ポリペプチドの同一性、質量／電荷（ｍ／ｚ）比、電荷（ｚ）、およびポリペプチドの相対保持時間から成る群から選択される、請求項１２または１３記載の方法。
15. 請求項１４記載の工程（１４−ｃ）において、多次元クロマトグラフィーが以下を使用して行われる請求項１４記載の方法；
    （１５−ａ）強カチオン交換高速液体クロマトグラフ（ＳＣＸ−ＨＰＬＣ）、固定された金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）、および二酸化チタン粉末（ＴｉＯ_２）クロマトグラフィーを使用することで行われる；または
    （１５−ｂ）強陰イオン交換高性能液体クロマトグラフ法（ＳＡＸ−ＨＰＬＣ）、固定された金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）、および二酸化チタン粉末（ＴｉＯ_２）クロマトグラフィーを使用することで行われる。