JP6001655B2 - 併用療法 - Google Patents

Description

本発明は、がん併用療法の分野に関する。

がんは、世界中の全てのコミュニティを苦しませている破壊的な疾患である。男性２人中１人及び女性３人中１人が、その生涯でなんらかの形のがんを発症すると推定されている。

興味深いことに、異なるがん型の間の表現型のばらつきに関係なく、限られた数の遺伝子エレメントの混乱が多くの異なるヒト細胞型で細胞の形質転換を誘導するのに十分であることが近年立証された（Ｚｈａｏら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｏｌ Ｍｅｄ、２００４、１０：３４４〜３５０で概説されている）。実験的には、Ｒａｓ及びテロメラーゼ（ＴＥＲＴ）の活性化が、腫瘍サプレッサータンパク質ｐ５３及び網膜芽細胞腫タンパク質（Ｒｂ）の不活性化と一緒に、様々なヒト細胞型を不死化させ、それらはタンパク質ホスファターゼ２Ａ（ＰＰ２Ａ）の阻害に応じて腫瘍形成状態にその後形質転換することができることが実証された（Ｍｕｍｂｙ、Ｃｅｌｌ、２００７、１３０（１）：２１〜２４；Ｗｅｓｔｅｒｍａｒｃｋ及びＨａｈｎ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．、２００８、１４（４）：１５２〜１６０；Ｚｈａｏら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｏｌ Ｍｅｄ、２００４、１０：３４４〜３５０）。したがって、これらの一般的な遺伝子エレメントは、がん発生のマスター調節因子とみなされよう（Ｚｈａｏら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｏｌ Ｍｅｄ、２００４、１０：３４４〜３５０）。

ＰＰ２Ａは、触媒サブユニット（ＰＰ２Ａｃ又はＣ）、足場サブユニット（ＰＲ６５又はＡ）及び代替調節Ｂサブユニットの１つからなる三量体タンパク質複合体として機能する、広く保存されたタンパク質セリン／トレオニンホスファターゼ（ＰＳＰ）である。上記の通り、近年の実験的証拠は、ＰＰ２Ａ活性の阻害がヒト細胞形質転換の必要条件であることを確実に立証した（Ｗｅｓｔｅｒｍａｒｃｋ及びＨａｈｎ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．、２００８、１４（４）：１５２〜１６０で概説されている）。それにもかかわらず、ｉｎ ｖｉｖｏでのＰＰ２Ａ複合体の組成及び／又は活性を調節する機構についてはほとんど知られていない。ＰＰ２Ａ阻害機構の同定は、ＰＰ２Ａの腫瘍サプレッサー活性を復活させるがん療法の新規クラスの開発の機会を提供する可能性がある。この考えは、Ｎｕｔｌｉｎ−３などの小分子によるｐ５３の腫瘍サプレッサー活性の再活性化を狙うがん療法アプローチに類似する（Ｖａｓｓｉｌｅｖら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００４、３０３：８４４〜４８）。

タンパク質ホスファターゼメチルエステラーゼ１（ＰＭＥ−１）は、がん関連のＰＰ２Ａ相互作用タンパク質と同定された（Ｐｕｕｓｔｉｎｅｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、２００９、６９：２８７０〜２８７７）。初期の生化学試験は、ＰＭＥ−１を、触媒ＰＰ２Ａｃサブユニットの上の保存されたロイシン３０９の脱メチル化のために必要とされるその酵素メチルエステラーゼ活性を通してＰＰ２Ａ活性を阻害するタンパク質として立証していた（Ｊａｎｓｓｅｎｓら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．、２００８、３３：１１３〜２１）。ＰＭＥ−１がＰＰ２Ａｃサブユニットの触媒開裂に直接結合することを実証するＰＭＥ−１−ＰＰ２Ａ複合体の構造解析によって、ＰＭＥ−１がＰＰ２Ａ活性を阻害する代替機構が提案された（Ｘｉｎｇら、Ｃｅｌｌ、２００８、１３３：１５４〜１６３）。しかし、ＰＭＥ−１の機能的関連性又は細胞シグナル伝達の調節におけるその役割は扱われていなかった。ＰＭＥ−１発現は、ヒトグリア芽細胞腫（ＧＢＭ）の進行及び増殖、並びに、ＧＢＭのヒト患者試料でＥＲＫ ＭＡＰＫ経路活性と相関することが報告されている。実験的に、ｓｉＲＮＡによるＰＭＥ−１の阻害がＥＲＫ経路の活性及び悪性細胞の成長を阻害することが示された（Ｐｕｕｓｔｉｎｅｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、２００９、６９：２８７０〜２８７７）。しかし、悪性細胞の成長の阻害に及ぼすその強い作用に関係なく、ＰＭＥ−１の減少は効果的な細胞死を誘導しなかった（Ｐｕｕｓｔｉｎｅｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、２００９、６９：２８７０〜２８７７）。

細胞致死及び／又はアポトーシスは、がん療法レジメンのための好ましいエンドポイントである。他方、内在性の又は後天的な抵抗性は、現在用いられている化学療法に関係がある主要な問題である。したがって、悪性腫瘍の根底にある機構の少なくとも一部は明らかにされているが、過剰増殖性疾患、特にがんのための医薬の開発の必要性が当技術分野に存在する。

本発明は、過剰増殖性細胞でのアポトーシスのレベルに及ぼす、ＰＭＥ−１遺伝子サイレンシング及び特定の小分子化学薬剤の驚くべき相乗作用に基づく。

したがって、一態様では、本発明は、ＰＭＥ−１サイレンシングと、一般式（Ｉ）

を有する化合物との組合せを医薬として提供し、

Ｒ’は、Ｈ又はアルキルであり；

Ｒ’’は、Ｈ又はアルコキシであり；

Ｒ１及びＲ２は、Ｈであるか一緒にオキソを形成し；

Ｒ３及びＲ４は、独立してＨ、ＯＨであるか一緒にオキソを形成し：

Ｒ５、Ｒ６、Ｒ６’、Ｒ７及びＲ８は、Ｈ、アルキル、アルコキシ、ヒドロキシ、ヒドロキシルアルキル、アルコキシカルボニル又はモノ−及びジアルキルアミノからなる群から独立して選択され；

Ｘは、ＣＨ_２又はＯであり；

ｎは０又は１である。

別の態様では、本発明は、配列番号３〜５からなる群から選択される核酸配列を含む二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）小分子を提供する。

さらなる態様では、本発明は、前述の組合せ又はｄｓＲＮＡを含む医薬組成物を提供する。

さらなる態様では、本発明は、そのような感作を必要とするヒト又は動物対象においてＰＭＥ−１遺伝子をサイレンシングすることによって化学療法剤に対して過剰増殖性細胞を感作させる方法を提供する。

さらに、本発明の一態様は、少なくとも１種類のＰＭＥ−１サイレンシング剤及び上記の式（Ｉ）の化合物を投与することによって、そのような処置を必要とするヒト又は動物対象において過剰増殖性疾患を処置する方法を提供する。

上記の態様の一部の実施形態では、前記ＰＭＥ−１サイレンシングは、ｓｉＲＮＡ分子、ＤｓｉＲＮＡ分子、人工ｍｉＲＮＡ前駆体、ｓｈＲＮＡ分子、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、ＰＰ２Ａｃに対するＰＭＥ−１機能を阻止する作用剤、及びその任意の組合せからなる群から選択される作用剤によって得られる。さらなる実施形態では、ＰＭＥ−１サイレンシング剤は、配列番号１〜３９からなる群から選択される核酸配列を含む。

上記の態様の一部の実施形態では、処置される過剰増殖性疾患は、乾癬、心筋肥大、良性腫瘍、固形がん及び血液がんからなる群から選択される。前記固形がんの非限定例には、頭頸部扁平上皮癌、結腸がん、胃がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、子宮頸がん、脳がん、神経膠腫、星状細胞腫及びグリア芽細胞腫が含まれる。

本発明の他の具体的な実施形態、目的、詳細及び利点は、従属請求項、以下の図、詳細な説明及び実施例に示される。

以下において、本発明は、添付された図面を参照して好ましい実施形態によってより詳細に記載される。

ヒトグリア芽細胞腫Ｔ９８Ｇ細胞でのスクランブルｄｓＲＮＡ（Ｓｃｒ．）及びＰＭＥ−１特異的ｄｓＲＮＡ（ＰＭＥ−１）のＰＭＥ−１サイレンシング活性を実証するウェスタンブロットである。

スクランブル又はＰＭＥ−１特異的ｄｓＲＮＡの４８時間のトランスフェクション、及び次に異なる薬剤／化学的阻害剤の指示された濃度によるさらに２４時間の処理によって誘導された、Ｔ９８Ｇグリア芽細胞腫細胞でのアポトーシスの核断片化の量を示す図である。略記号：Ｃｈｌ Ｃｌ−塩化ケレリトリン、ＴＭＺ−テモゾロマイド、ＳＴＳ−スタウロスポリン。

スクランブル又はＰＭＥ−１特異的ｄｓＲＮＡの４８時間のトランスフェクション、並びに次にスタウロスポリン（ＳＴＳ）又は細胞死誘導リガンド、組換え体ＦａｓＬ及びＴＲＡＩＬの指示された濃度によるさらに２４時間の処理によって誘導された、Ｔ９８Ｇグリア芽細胞腫細胞でのアポトーシスの核断片化の量を示す図である。

スクランブルｄｓＲＮＡをトランスフェクトさせた細胞と比較した、ＰＭＥ−１ ｄｓＲＮＡをトランスフェクトさせたＴ９８Ｇ細胞のアポトーシスの、増加させた濃度のスタウロスポリンによる用量依存的増加を示す図である。

スクランブルｄｓＲＮＡ又はＰＭＥ−１ ｄｓＲＮＡのトランスフェクション及び指示された濃度のスタウロスポリンによる２日間の処理の後の、Ｔ９８Ｇグリア芽細胞腫細胞のコロニー形成（ｃｏｌｏｎｏｇｅｎｉｃ）能を表す図である。 スクランブルｄｓＲＮＡ又はＰＭＥ−１ ｄｓＲＮＡのトランスフェクション及び指示された濃度のスタウロスポリンによる２日間の処理の後の、Ｕ１１８ＭＧグリア芽細胞腫細胞のコロニー形成（ｃｏｌｏｎｏｇｅｎｉｃ）能を表す図である。

スタウロスポリン処理と組み合わせた３つの異なるＰＭＥ−１ ｄｓＲＮＡ、ＰＭＥ−１．１（配列番号１）、ＰＭＥ−１．２（配列番号２）及びＰＭＥ−１．３（配列番号３）によるアポトーシスの核断片化の誘導を表す図である。

Ｔ９８Ｇ細胞でのスクランブルｄｓＲＮＡ（Ｓｃｒ．）及び３つの異なるＰＭＥ−１特異的ｄｓＲＮＡ（ＰＭＥ−１．１、すなわち配列番号１、ＰＭＥ−１．２、すなわち配列番号２及びＰＭＥ−１．３、すなわち配列番号３）のＰＭＥ−１サイレンシング活性を実証するウェスタンブロットである。

スクランブルｓｉＲＮＡでトランスフェクトさせた細胞と比較した、ＰＭＥ−１特異的ｄｓＲＮＡ（ＰＭＥ−１．１、すなわち配列番号１、ＰＭＥ−１．２、すなわち配列番号２及びＰＭＥ−１．３、すなわち配列番号３）でトランスフェクトさせたＴ９８Ｇ細胞での残留ＰＭＥ−１レベルを示す上述のウェスタンブロット画像の濃度測定分析である。

トランスフェクトされていない細胞と比較した、ＰＭＥ−１ ｄｓＲＮＡをトランスフェクトさせたＴ９８Ｇ細胞のアポトーシスの、増加させた濃度のスタウロスポリンによる用量依存的増加を示す図である。

Ｔ９８Ｇ細胞の生存力に及ぼすＰＭＥ−１ ｄｓＲＮＡのトランスフェクション及びスタウロスポリン処理の影響を示す図である。

Ｔ９８Ｇ細胞での活性カスパーゼ−３及び−７のレベルに及ぼすＰＭＥ−１ ｄｓＲＮＡのトランスフェクション及びスタウロスポリン処理の影響を示す図である。

核断片化の量として測定される、ＰＭＥ−１ ｄｓＲＮＡ及びスタウロスポリンによって媒介されるアポトーシスに及ぼす、汎カスパーゼ阻害剤、Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫ処理の影響を示す図である。

核断片化の量として測定される、ＰＭＥ−１ ｄｓＲＮＡ及びスタウロスポリンによって媒介されるアポトーシスに及ぼす、ＰＰ２Ａ阻害剤、オカダ酸によるＴ９８Ｇ細胞の前処理の影響を示す図である。

核断片化の量として測定される、ＰＭＥ−１特異的ｄｓＲＮＡ及びスタウロスポリンによって媒介されるＴ９８Ｇ細胞のアポトーシスに及ぼす、異なるＰＰ２Ａ ＢサブユニットのｄｓＲＮＡによって媒介される同時枯渇の影響を表す図である。

スクランブルｄｓＲＮＡをトランスフェクトさせた細胞と比較した、スタウロスポリン処理後のＰＭＥ−１特異的又はＣＩＰ２Ａ特異的ｄｓＲＮＡのアポトーシス誘導能の比較を示す図である。

ヒトグリア芽細胞腫Ｔ９８Ｇ細胞での、スクランブルｄｓＲＮＡ（Ｓｃｒ．）、ＰＭＥ−１特異的ｄｓＲＮＡ（ＰＭＥ−１）及びＣＩＰ２Ａ特異的ｄｓＲＮＡ（ＣＩＰ２Ａ）のＰＭＥ−１及びＣＩＰ２Ａサイレンシング活性を実証するウェスタンブロット画像である。

特異的ｄｓＲＮＡ（ＰＭＥ−１）及びＰＰ２Ａ、ＦＴＹ７２０、セレン酸塩又はキシルロース−５−ホスフェート（Ｘ５Ｐ）の異なる化学的活性化剤を用いてＰＭＥ−１を減少させたＴ９８Ｇ細胞での、スタウロスポリン処理によって媒介されたアポトーシスの比較を示す図である。

スクランブル又はＰＭＥ−１特異的ｄｓＲＮＡによる４８時間のトランスフェクション、及び異なるスタウロスポリン類似体／誘導体の指示された濃度によるさらに２４時間の処理の後の、Ｔ９８Ｇグリア芽細胞腫細胞でのアポトーシスの核断片化の量を示す図である。

スタウロスポリン類似体、ＰＫＣ４１２及びＫ２５２ａの指示された濃度による２日間の処理後の、スクランブル又はＰＭＥ−１特異的ｄｓＲＮＡをトランスフェクトさせたＴ９８Ｇグリア芽細胞腫細胞のコロニー形成能を表す図である。

スタウロスポリン（ＳＴＳ）、ＰＫＣ４１２及びＫ２５２ａの指示された濃度による２日間の処理後の、スクランブル又はＰＭＥ−１特異的ｄｓＲＮＡをトランスフェクトさせたＵ２５１ＭＧグリア芽細胞腫細胞のコロニー形成能を表す図である。 スタウロスポリン（ＳＴＳ）、ＰＫＣ４１２及びＫ２５２ａの指示された濃度による２日間の処理後の、スクランブル又はＰＭＥ−１特異的ｄｓＲＮＡをトランスフェクトさせたＵ８７ＭＧグリア芽細胞腫細胞のコロニー形成能を表す図である。

本発明は、ＰＭＥ−１遺伝子をサイレンシングすることが、特定の小分子化学療法剤のアポトーシス誘導活性にがん細胞を感作させるという驚くべき知見に基づく。ＰＭＥ−１遺伝子のサイレンシング及び前記化学療法剤の同時投与は、アポトーシスレベルの相乗的増加をもたらす。したがって、一態様では、本発明は、ＰＭＥ−１枯渇及び前記化学療法剤の併用療法を提供する。

ＰＭＥ−１遺伝子サイレンシングは、それに限定されずにＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を含む当技術分野で公知である任意の適する方法によって得ることができる。ＲＮＡｉに基づく遺伝子サイレンシングのための最も一般的なアプローチは、小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の使用である。

ｓｉＲＮＡの原理は、文献に広く提示されている。例として、米国特許出願公開第２００３／０１４３７３２号、第２００３／０１４８５０７号、第２００３／０１７５９５０号、第２００３／０１９０６３５号、第２００４／００１９００１号、第２００５／０００８６１７号及び第２００５／００４３２６６号を指摘することができる。ｓｉＲＮＡ二重鎖分子はアンチセンス領域及びセンス鎖を含み、そこで、前記アンチセンス鎖は特定のタンパク質をコードするｍＲＮＡ配列の標的領域に相補的な配列を含み、センス鎖は前記アンチセンス鎖に相補的な配列を含む。したがって、ｓｉＲＮＡ二重鎖分子は２つの核酸断片からアセンブルされ、そこで、１つの断片はアンチセンス鎖を含み、第２の断片は前記ｓｉＲＮＡ分子のセンス鎖を含む。言い換えると、ｓｉＲＮＡは小分子二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）である。センス鎖及びアンチセンス鎖は、ポリヌクレオチドリンカー又は非ヌクレオチドリンカーであってよいリンカー分子を通して共有結合することができる。アンチセンス及びセンス鎖の長さは異なることができ、各々一般的に約１９〜２１ヌクレオチドである。場合によっては、ｓｉＲＮＡは２２、２３又は２４ヌクレオチドを含むことができる。

ＲＮＡｉに基づくＰＭＥ−１サイレンシングのための別のアプローチは、より長い、一般的に２５〜３５ｎｔのダイサー基質ｓｉＲＮＡ（ＤｓｉＲＮＡ）を用いることであり、それは、一部の場合には対応する従来の２１量体ｓｉＲＮＡより強力であることが報告されている（Ｋｉｍら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｏｌ、２００５、２３：２２２〜２２６）。ＤｓｉＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｖｏでダイサーによって活性ｓｉＲＮＡに加工される。

細胞では、活性ｓｉＲＮＡアンチセンス鎖が形成されて、それは標的ｍＲＮＡの標的領域を認識する。このことは、次に、ＲＩＳＣエンドヌクレアーゼ複合体（ＲＩＳＣ＝ＲＮＡによって誘導されるサイレンシング複合体）による、及びＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲＰ）による追加のＲＮＡの合成においても、標的ＲＮＡの切断につながり、それはダイサーを活性化させ、追加のｓｉＲＮＡ二重鎖分子をもたらし、それによって応答を増幅することができる。

本明細書で用いるように、用語「ｄｓＲＮＡ」は、ｓｉＲＮＡ及びＤｓｉＲＮＡの両方を指す。

必然的ではないが一般的に、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖及びセンス鎖は、ともに、少数の、一般的に１〜３個のヌクレオチドの３’末端オーバーハングを含む。３’オーバーハングは、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドなどの１つ又は複数の改変ヌクレオチドを含むことができる。アンチセンスの５’末端は、一般的にリン酸基（Ｐ）である。末端リン酸基（Ｐ）を有するｄｓＲＮＡ二重鎖は、一本鎖アンチセンスよりも細胞に与えるのが容易である。場合によっては、センス鎖の、又はアンチセンス及びセンス鎖の両方の５’末端は、Ｐ基を含むことができる。

正常な改変されていないＲＮＡは、生細胞に存在するリボヌクレアーゼ酵素によるその分解のために、生理学的条件下で低い安定性を有する。オリゴヌクレオチドが外部から投与される場合には、化学的及び酵素的分解に対するその安定性を強化するように、公知の方法によってその分子を改変することが非常に望ましい。

ｉｎ ｖｉｖｏで外部から投与されるヌクレオチドの改変は、当技術分野で広く記載されている（例えばＵＳ２００５／０２５５４８７、参照により本明細書に組み込まれる）。主に、ヌクレオチドのいかなる部分も、すなわちリボース糖、塩基及び／又はヌクレオチド間のリン酸ジエステル鎖を改変することができる。例えば、２’−デオキシリボースヌクレオチドを与えるリボース単位からの２’−ＯＨ基の除去は、向上した安定性をもたらす。この基での他の改変も前に開示されている：アルキル、アルケニル、アリル、アルコキシアルキル、ハロゲン、アミノ、アジド又はスルフヒドリル基によるリボース２’−ＯＨ基の置換。リボース単位での他の改変も遂行することができる：より高い内在性の安定性を形成するために、リボースの２’位と４’位の間にメチレン結合を有するロック核酸（ＬＮＡ）を使用することができる。

さらに、ヌクレオチド間のホスホジエステル結合は、例えば、１つ又は複数の酸素が硫黄、アミノ、アルキル又はアルコキシ基によって置換されるように改変することができる。同じく、ヌクレオチドの塩基を改変することもできる。

好ましくは、オリゴヌクレオチドは、リボース糖で１つ若しくは複数の２’−ヒドロキシル基の改変、及び／又は１つ若しくは複数のヌクレオチド間のホスホジエステル結合の改変、及び／又はリボース糖の２’位と４’位との間の１つ若しくは複数のロック核酸（ＬＮＡ）の改変を含む。

特に好ましい改変は、例えば、２’−デオキシ、２’−Ｏ−メチル、２’−ハロゲン、例えばフルオロ又は２’−メトキシエチルによる２’−ＯＨ基の１つ又は複数の置換である。特に好ましいものは、ヌクレオチド間のホスホジエステル結合の一部も改変される、例えばホスホロチオエート結合にとって代わられるオリゴヌクレオチドである。

一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡがそれらのＰＭＥ−１サイレンシング能力を保持する限り、それらに限定されないがホスホロチオエート、ホスホロアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート及びペプチド核酸（ＰＮＡ）を含む１つ又は複数の合成であるか天然のヌクレオチド類似体をｄｓＲＮＡは含有することができる。

上記の改変は単に非限定例であることが強調されるべきである。

ＲＮＡｉに関する課題の１つは、対応するｍＲＮＡのための強力なｄｓＲＮＡの同定である。不完全な相補性を有する遺伝子は、ｄｓＲＮＡによって不注意に下方制御され、データ解読及び潜在毒性に関する問題につながることに注意すべきである。しかし、設計アルゴリズムで適当なｄｓＲＮＡを慎重に設計することによって、これは部分的に対処することができる。これらのコンピュータプログラムは、ｄｓＲＮＡのサイレンシング効果を強化する特徴である、ＧＣ含有量が低く、内部反復が欠如し、５末端がＡ／Ｕに富み、局所の遊離結合エネルギーが高い配列の伸びを見出すために、法則のセットで所与の標的配列をふるい分ける。

本発明で有益な作用剤を同定するために、市販及び非市販のアルゴリズムを用いて、いくつかの異なるＰＭＥ−１ ｓｉＲＮＡを設計した。この目的のために、ｓｉＲＮＡアルゴリズムプログラム（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ ＭＷＧ Ｏｐｅｒｏｎのオンライン設計ツール）及びＣｕｉａらによって開発されたスタンドアロンプログラム（Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ、２００４、７５：６７〜７３）に、ＰＭＥ−１の完全長ｃＤＮＡ配列を入れた。さらに、標的外れを逃れないｓｉＲＮＡを除去するために、アルゴリズムによって生成されたｓｉＲＮＡ配列を、次にゲノム全体のＤＮＡ配列アラインメント（ＢＬＡＳＴ）を通してスクリーニングした。言い換えると、標的遺伝子（ＰＭＥ−１）とは別の遺伝子と合致するさらに短い配列領域を有していたそれらの全てのｓｉＲＮＡは、さらなる使用のために非常に貴重であるとみなされた。

得られたｓｉＲＮＡを異なる細胞系に次にトランスフェクトさせ、ｍＲＮＡを分解し、さらにＰＭＥ−１の翻訳を減少させるそれらの能力は、ＰＭＥ−１特異抗体（表１）によるｓｉＲＮＡ処理の後にＰＭＥ−１タンパク質の量を測定することによって、タンパク質レベルで研究された。

本発明の様々な実施形態で使用するのに適するさらなるＰＭＥ−１特異的ｓｉＲＮＡがＵＳ２００９／１８２１３４に開示され、表２に掲載される。

適するｄｓＲＮＡには、それらが参照ｄｓＲＮＡと類似した結合特性及びＰＭＥ−１サイレンシング活性を有する限り、配列番号１〜３６と８０％を超える配列同一性、例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はさらに１００％の配列同一性を有するものが含まれる。

本発明の様々な実施形態で使用するのに適するさらなるＰＭＥ−１特異的ｄｓＲＮＡは、当技術分野で公知の方法によって設計、合成することができる。そのような単離されたいかなるｄｓＲＮＡも、ＰＭＥ−１遺伝子をサイレンシングするためにはＰＭＥ−１ ｃＤＮＡ配列に十分に相補的でなければならない。

人工マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）前駆体は、ＲＮＡｉを媒介するのに適する別のクラスの小分子ＲＮＡである。一般的に、人工ｍｉＲＮＡ前駆体は、長さが約２１〜２５ヌクレオチドであり、それらは１〜３個、一般的に２個のオーバーハンギング３’ヌクレオチドを有することができる。ＰＭＥ−１サイレンシング人工ｍｉＲＮＡ前駆体は、当技術分野で公知の方法によって設計、合成することができる。

ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）は、ＰＭＥ−１をサイレンシングするさらに別の方法である。ＳｈＲＮＡは、ｉ）標的遺伝子に由来する、一般的に１９〜２９ヌクレオチドの範囲内のショートヌクレオチド配列；ｉｉ）一般的に４〜２３ヌクレオチドの範囲内のループ；及びｉｉｉ）一般的に１９〜２９ヌクレオチドの範囲内の、最初の標的配列に逆相補的なショートヌクレオチド配列からなる。ＰＭＥ−１サイレンシングｓｈＲＮＡは、当業者に公知の手段及び方法によって設計、合成することができる。ＰＭＥ−１特異的ｓｈＲＮＡの非限定例には、表３に掲載のものが含まれる。

ＰＭＥ−１サイレンシングはアンチセンス療法によって得ることもでき、その場合、比較的短い（一般的に１３〜２５ヌクレオチド）合成一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡオリゴヌクレオチドが対応するｍＲＮＡに結合することによってＰＭＥ−１遺伝子を不活性化する。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、改変されなくても化学的に改変されてもよい。一部の実施形態では、リボースの２’位の水素は、メチルなどのＯ−アルキル基にとって代わられる。さらなる実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、それに限定されずにＰＮＡを含む１つ又は複数の合成又は天然のヌクレオチド類似体を含有することができる。

さらに、ＰＭＥ−１サイレンシングは、ＰＭＥ−１ ｍＲＮＡを切断するリボザイムによって得ることができる。リボザイム技術は、例えば、Ｌｉらによって、Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、２００７、９６：１０３〜４３に記載されている。

本明細書で用いるように、用語「ＰＭＥ−１サイレンシング」は、ＰＭＥ−１遺伝子発現の完全か部分的な低減を指す。一部の実施形態では、ＰＭＥ−１特異的ｄｓＲＮＡ、人工ｍｉＲＮＡ前駆体、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム又はその任意の組合せがヒト又は動物対象に導入されるとき、ＰＭＥ−１遺伝子発現は、少なくとも５０％、又は少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％低減される。

一部の実施形態では、ＰＭＥ−１サイレンシングは、ＰＭＥ−１とＰＰ２Ａ、特にＰＰ２Ａのｃサブユニットとの間の相互作用を妨害又は阻害し、このように、ＰＰ２Ａｃに対するＰＭＥ−１機能を、少なくとも５０％、又は少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％阻止することによって得ることができる。そのような妨害又はサイレンシング剤には、組換え又は化学的に生成された改変又は未改変のペプチド及び部分的ペプチド、並びに非ペプチド分子、例えば小分子化合物が含まれるが、これらに限定されない。そのような作用剤を同定する方法は、例えば、ＷＯ２００９／１００１７３及びＵＳ２００９／２３９２４４に開示されている。

本発明の様々な実施形態で使用するのに適する化合物には、表４に掲載されるもの、及びその任意の立体異性体、塩、溶媒和物又はプロドラッグが含まれる。一実施形態では、適する化合物は、一般式（Ｉ）

を有し、上式で、

Ｒ’は、Ｈ又はアルキルであり；

Ｒ’’は、Ｈ又はアルコキシであり；

Ｒ１及びＲ２は、Ｈであるか一緒にオキソを形成し；

Ｒ３及びＲ４は、独立してＨ又はＯＨであるか、一緒にオキソを形成し：

Ｒ５、Ｒ６、Ｒ６’、Ｒ７及びＲ８は、Ｈ、アルキル、アルコキシ、ヒドロキシ、ヒドロキシルアルキル、アルコキシカルボニル、モノアルキルアミノ及びジアルキルアミノからなる群から独立して選択され；

Ｘは、ＣＨ_２又はＯであり；

ｎは、０又は１である。

本明細書で用いるように、語句「式を有する」は、限定を意図せず、用語「含む」が一般的に用いられるのと同じ方法で用いられる。

上で言及される用語「アルキル」には、直鎖状及び分枝状の両方のＣ_１〜６アルキル基、例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシルなどが含まれる。一部の実施形態では、アルキル基は、１〜３個の炭素原子を含有するＣ_１〜３アルキル基である。

本明細書で用いるように、用語「アルコキシ」は、直鎖状及び分枝状の両方のＣ_１〜６アルコキシ基、例えばメトキシ、エトキシ、プロポキシなどを指す。一部の実施形態では、アルコキシ基は、１〜３個の炭素原子を含有するＣ_１〜３アルコキシ基である。

本明細書で用いるように、用語「ヒドロキシアルキル」は、−ＯＨによって置換される前述のＣ_１〜６アルキル基のいずれかを指す。

本明細書で用いるように、用語「アルコキシカルボニル」は、−ＣＯＯＨによって置換される前述のＣ_１〜６アルコキシ基のいずれかを指す。

用語「アミノ」は、−ＮＨ_２を指す。

用語「モノアルキルアミノ」には、アミノ基で置換された前述のアルキル基のいずれかを含む。

用語「ジアルキルアミノ」は、２つのアミノ基で置換された前述のアルキル基のいずれかを指す。

本明細書で用いるように、用語「立体異性体」は、空間でのそれらの原子の配向だけが異なる個々の分子の全ての異性体の一般用語である。それは、鏡像異性体及びお互いの鏡像でない１つを超えるキラル中心を有する化合物の異性体（ジアステレオマー）を含む。

本明細書で用いるように、用語「キラル中心」又は「不斉中心」は、４つの異なる基が結合している炭素原子を指す。

用語「鏡像異性体」は、その鏡像の上に重畳することができず、したがって光学的に活性である分子を指し、そこで、鏡像異性体は偏光面を一方向に回転させ、その鏡像は偏光面を反対側の方向に回転させる。

用語「ラセミ」は、光学的に不活性である、鏡像異性体の等分の混合物を指す。

開示された化合物のいずれも、薬学的に許容される塩に変換することができる。薬学的に許容される塩は、それが非毒性である限り特に限定されない。無機又は有機の塩基による塩の非限定例には、アルカリ金属塩（例えばナトリウム塩、カリウム塩など）、アルカリ土類金属塩（例えばカルシウム塩、マグネシウム塩など）、アンモニウム塩、アミン塩（例えばトリエチルアミン塩）などが含まれる。無機酸（例えば塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、リン酸、硝酸、硫酸など）に由来する酸付加塩、及び有機酸（例えば酒石酸、酢酸、クエン酸、リンゴ酸、乳酸、フマル酸、マレイン酸、安息香酸、グリコール酸、グルコン酸、コハク酸など）に由来する塩の非限定例。

開示された化合物のいずれも、後述の医薬組成物のためのプロドラッグとして用いることができる。本明細書で用いるように、用語「プロドラッグ」は、投与後に、例えば代謝によってｉｎ ｖｉｖｏで活性薬剤に変換することができる任意の化合物を指す。

式（Ｉ）を有する化合物の非限定例には、表４に掲載されるスタウロスポリン（ＳＴＳ）、ＰＫＣ４１２、Ｋ２５２ａ、ＵＣＮ−０１、ＣＥＰ−７０１及びＳＢ−２１８０７８が含まれる。
表４。スタウロスポリンの試験した類似体／誘導体の例。ＰＭＥ−１特異的ｄｓＲＮＡによるトランスフェクション、及び異なるスタウロスポリン類似体／誘導体の指示された濃度による処理の後の、Ｔ９８Ｇグリア芽細胞腫細胞でのアポトーシスの核断片化の量（増強％）を示す。

ＰＭＥ−１ ｄｓＲＮＡ及び式（Ｉ）の化合物の投与は、併用、同時又は逐次であってよい。

ＰＭＥ−１特異的ｄｓＲＮＡの送達は、２つの主に異なる方法で達成することができる：１）オリゴヌクレオチドをコードする、発現構築物に位置する核酸配列の内因性の転写又は２）オリゴヌクレオチドの外来性送達。

内因性の転写のためには、当技術分野で公知の方法を用いて、ＰＭＥ−１特異的ｄｓＲＮＡを適する発現系に挿入することができる。そのような発現系の非限定例には、当技術分野で公知の１つ又は複数の誘導可能なプロモーターが有るか無い、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、他のウイルスベクター、発現カセット及びプラスミド、例えばペグ化された免疫リポソーム（ＰＩＬ）にカプセル化されるものが含まれる。両方のｄｓＲＮＡ鎖は、同じか別々のプロモーターから単一の発現構築物で発現させることができるか、又は、鎖は別々の発現構築物で発現させることができる。

前述の発現系は、ＰＭＥ−１サイレンシング人工ｍｉＲＮＡ前駆体及びｓｈＲＮＡの送達のために用いることもできる。

一般的に、発現構築物は、ヒト又は動物対象（例えばイヌ対象）への投与の前に医薬組成物に製剤化される。投与は、全身及び局所の送達を含む、当技術分野で公知である任意の適する方法によって実施することができる。当分野の技術者に公知であるように、製剤は意図された投与経路次第である。例として、発現構築物は薬学的に許容される担体か希釈剤で送達することができ、又は、それは適する緩放出性組成物に包埋することができる。場合によっては、医薬組成物は、発現構築物を生成する１つ又は複数の細胞を含有することができる。ＲＮＡｉ送達のために細菌を用いることもできる。例えば、組換えで遺伝子操作された大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）は、ｉｎ ｖｉｖｏ送達の後に哺乳動物細胞に入り、ｓｈＲＮＡを移すことができる。関連したアプローチは、例えばサルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ）に由来するミニ細胞を用いることである。

外来性送達のためには、ｄｓＲＮＡ分子は、リポソーム又は脂質をベースとした担体、コレステロールコンジュゲート又はポリエチレンイミン（ＰＥＩ）と一般的に複合体形成する。有望な新しいアプローチは、ｄｓＲＮＡを安定した核酸脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）と複合体形成させることである。当分野の技術者に公知の通り、外来性送達のために適する投与経路には、前記複合体化の有無にかかわらず、非経口送達（例えば静脈内注射）、腸内送達（例えば経口）、限局投与、局所投与（例えば皮膚又は経皮）が含まれるが、これらに限定されない。通常、腫瘍の外科的切除が一次臨床介入であるので、ｄｓＲＮＡは切除された腫瘍腔へ直接投与することができる。

式（Ｉ）の化学療法剤は、それらに限定されないが、ＰＭＥ−１特異的ｄｓＲＮＡの投与のために掲載されるものを含む当技術分野で公知の任意の適する経路によって、ヒト又は動物対象に投与することができる。

本併用療法では、ｄｓＲＮＡ分子及び式（Ｉ）の化合物は、同じか別々の医薬組成物に製剤化することができる。別々の医薬組成物が用いられる場合は、投与は、併用、同時又は逐次であってよい。ｄｓＲＮＡ分子及び式（Ｉ）の化合物のための製剤及び／又は投与経路は、互いに独立して選択することができる。一部の実施形態では、医薬組成物は、１つ又は複数の異なるＰＭＥ−１サイレンシングｄｓＲＮＡ及び／又は式（Ｉ）の１つ又は複数の化学療法剤を含むことができる。

医薬組成物は、投与に適する任意の適当な薬理学的担体で投与することができる。それらは、ヒト又は動物の患者でがんなどの過剰増殖性疾患の予防的、姑息的、防止的又は治癒効果を有する任意の形で投与することができる。

非経口又は局所の投与のために、ｄｓＲＮＡ及び／又は式（Ｉ）の化合物は、例えば、液剤、懸濁液又は乳剤として製剤化することができる。必要に応じて、製剤は、水性か非水性の溶媒、共存溶媒、可溶化剤、分散若しくは湿潤剤、懸濁剤及び／又は粘度剤を含むことができる。非水性溶媒の非限定例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、魚油、及び注入用有機エステルである。水性担体は、例えば、水、水−アルコール溶液であり、それらは生理食塩水又は、塩化ナトリウム溶液、リンガーのブドウ糖溶液、ブドウ糖プラス塩化ナトリウム溶液、ラクトース含有リンガー液、又は固定油を含む緩衝医療用非経口ビヒクルを含む。静脈内ビヒクルの非限定例には、液及び栄養補液、電解質補液、例えばリンガーのブドウ糖液に基づくもの、などが含まれる。水性組成物は、目標のｐＨ範囲に応じて適する緩衝剤、例えばリン酸ナトリウム及びリン酸カリウム、クエン酸塩、酢酸塩、炭酸塩又はグリシン緩衝液を含むことができる。張性調整剤としての塩化ナトリウムの使用も、有益である。組成物は、他の賦形剤、例えば安定化剤又は保存料を含むこともできる。有益な安定化賦形剤には、界面活性剤（ポリソルベート２０＆８０、ポロキサマー４０７）、ポリマー（ポリエチレングリコール、ポビドン）、炭水化物（スクロース、マンニトール、グルコース、ラクトース）、アルコール（ソルビトール、グリセロールプロピレングリコール、エチレングリコール）、適するタンパク質（アルブミン）、適するアミノ酸（グリシン、グルタミン酸）、脂肪酸（エタノールアミン）、抗酸化物（アスコルビン酸、システインなど）、キレート化剤（ＥＤＴＡ塩、ヒスチジン、アスパラギン酸）又は金属イオン（Ｃａ、Ｎｉ、Ｍｇ、Ｍｎ）が含まれる。有益な保存剤には、ベンジルアルコール、クロルブタノール、塩化ベンザルコニウム及び、おそらくパラベンがある。

経口投与のための固体剤形には、カプセル剤、錠剤、丸薬、トローチ剤、ロゼンジ剤、散剤及び顆粒剤が含まれるが、これらに限定されない。そのような固体剤形では、ｄｓＲＮＡ及び／又は式（Ｉ）の化合物は、スクロース、ラクトース又はデンプンなどの少なくとも１つの不活性希釈剤と混合されてよい。そのような剤形は、慣例通り、医薬用アジュバント、例えばステアリン酸潤滑剤又は着香剤を含むこともできる。固形の経口製剤は、有効成分の放出を調整する腸溶性か他のコーティングで調製することもできる。

経口投与のための液状剤形の非限定例には、当技術分野で一般的に用いられる、水及びアルコールなどの不活性の非毒性希釈剤を含有する、薬学的に許容される乳剤、液剤、懸濁剤、シロップ剤及びエリキシル剤が含まれる。そのような組成物は、湿展剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、甘味料及び着香剤などのアジュバントを含むこともできる。

医薬組成物は、要求に応じて再構成される濃縮形又は粉末の形で提供することができる。凍結乾燥する場合には、ポリマー（ポビドン、ポリエチレングリコール、デキストラン）、糖（スクロース、グルコース、ラクトース）、アミノ酸（グリシン、アルギニン、グルタミン酸）及びアルブミンを含む、特定の凍結保護物質が好ましい。再構成のための溶液がパッケージに添付される場合は、それは、例えば滅菌された注射用水、又は塩化ナトリウム溶液、又はブドウ糖若しくはグルコース溶液からなることができる。

本医薬製剤を製剤化するための手段及び方法は当分野の技術者に公知であり、それ自体公知である方法、例えば、従来の混合、造粒、溶解、凍結乾燥又は類似した方法によって製造することができる。

本併用療法は、それらに限定されないが、乾癬、心筋肥大、良性腫瘍、例えばアデノーマ、過誤腫及び軟骨腫、並びに頭頸部扁平上皮癌、結腸がん、胃がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、子宮頸がん、脳がん（例えば神経膠腫、星状細胞腫及びグリア芽細胞腫）、及び血液がん（例えば慢性及び急性の骨髄性白血病）を含む、ヒト又は動物の過剰増殖性疾患を処置するために用いることができる。

本明細書で用いるように、用語「処置」又は「処置すること」は、疾患の完全治癒だけでなく、疾患又はそれに関連する症状の防止、軽減及び改善も指す。

ｄｓＲＮＡと式（Ｉ）の化合物との組合せの「効果的な量」は、腫瘍の有害作用が最低限で改善される量を意味する。本併用療法の投与のための量及びレジメンは、がん関連の障害の処置に関する臨床分野の技術者が容易に決定することができる。一般に、本併用療法の投薬量は、処置される患者の年齢、性及び健康状態；あるならば併行処置の種類；処置の頻度及び所望の効果の性質；組織傷害の程度；症状の継続期間；並びに個々の医師によって調整される他の変数などの考慮事項によって決まる。所望の結果を得るために、所望の用量を１回又は複数回の適用で投与することができる。本実施形態による医薬組成物は、単位剤形で提供することができる。

一実施形態では、ｄｓＲＮＡは、約０．０１μｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇ、又は約１．０μｇ／ｋｇから約１０μｇ／ｋｇの投薬量範囲内の有効量で投与することができる。ｄｓＲＮＡは単一の日用量で投与することができるか、又は、総日投薬量を、例えば１日に２回、３回又は４回の分割用量で投与することができる。

一実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、約０．１μｇ／ｋｇから約３００ｍｇ／ｋｇ、又は約１．０μｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇの投薬量範囲内の有効量で投与することができる。式（Ｉ）の化合物は単一の日用量で投与することができるか、又は、総日投薬量を、例えば１日に２回、３回又は４回の分割用量で投与することができる。投与スケジュールは、ｄｓＲＮＡの投与スケジュールと独立して選択することができる。

技術が進歩するに従って、発明の概念を様々な方法で実施することができることは、当分野の技術者に明らかになる。本発明及びその実施形態は、下記の実施例に限定されなく、請求項の範囲内で異なることができる。

材料及び方法
真核生物の細胞培養及び小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）のトランスフェクション：この試験のために、本発明者らはＴ９８Ｇ、Ｕ１１８ＭＧ、Ｕ２５１ＭＧ及びＵ８７ＭＧヒトグリア芽細胞腫細胞系を用いた。Ｔ９８Ｇ及びＵ２５１ＭＧ細胞はイーグルのＭＥＭ培地で、Ｕ１１８ＭＧはＤＭＥＭ培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で、Ｕ８７ＭＧはＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地（Ｇｉｂｃｏ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で、３７℃で５％ＣＯ２の加湿雰囲気内で培養し、培地には、１０％熱不活性化ＦＣＳ及びペニシリン（１００単位／ｍＬ）−ストレプトマイシン（１００Ａｇ／ｍＬ）を加えた。小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）のトランスフェクションは、製造業者の指示に従って、リポフェクトアミンＲＮＡｉＭＡＸ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で実施した。リバーストランスフェクションが９６ウェルプレートで実施されたＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−ｇｌｏ及びカスパーゼ−ｇｌｏアッセイを除いて、全ての実験でトランスフェクションはフォワードトランスフェクションプロトコルを用いて実施された。以下のｓｉＲＮＡ配列が用いられた：スクランブルされた（５’−ＧＵＡ ＡＣＡ ＡＵＧ ＡＧＡ ＧＣＡ ＣＧＧ Ｃ−３’；配列番号４０）、ＰＭＥ−１（５’−ＧＧＡ ＡＧＵ ＧＡＧ ＵＣＵ ＡＵＡ ＡＧＣ Ａ−３’；配列番号１）、ＰＭＥ−１（５’−ＵＣＡ ＵＡＧ ＡＧＧ ＡＡＧ ＡＡＧ ＡＡＧ Ａ−３’；配列番号２）又はＰＭＥ−１（５’−ＡＧＧ ＵＣＡ ＡＧＡ ＡＵＣ ＣＵＧ ＡＡＧ Ａ−３’；配列番号３）、ＣＩＰ２Ａ（５’−ＣＵＧ ＵＧＧ ＵＵＧ ＵＧＵ ＵＵＧ ＣＡＣ Ｕ−３’；配列番号４１）、ＰＰＰ２Ｒ２Ａ（５’−ＣＵＧ ＣＡＧ ＡＵＧ ＡＵＵ ＵＧＣ ＧＧＡ Ｕ−３’；配列番号４２）、ＰＰＰ２Ｒ２Ｃ（５’−ＡＣＣ ＧＣＵ ＣＡＵ ＵＣＵ ＵＣＵ ＣＧＧ ＡＡＡ −３’；配列番号４３）、ＰＰＰ２Ｒ３Ｂ（５’−ＣＡＣ ＧＵＧ ＵＣＵ ＣＵＧ ＵＣＡ ＣＧＵ Ｇ−３’；配列番号４４）、ＰＰＰ２Ｒ５Ａ（５’−ＣＵＧ ＵＡＵ ＣＡＵ ＧＧＣ ＣＡＵ ＡＧＵ Ａ−３’；配列番号４５）及びＰＰＰ２Ｒ５Ｂ（５’−ＣＣＧ ＣＡＵ ＧＡＵ ＣＵＣ ＡＧＵ ＧＡＡ Ｕ−３’；配列番号４６）。

化学的阻害剤及び薬剤：Ｈ−７、Ｈ−８、Ｈ−８９、塩化ケレリトリン（Ｃｈｌ Ｃｌ）、スニチニブ、タンデュチニブ、ラパチニブ、バンデタニブ、ＰＫＣ４１２及びＫ２５２ａを含有する小さな阻害剤スクリーニングセットを、Ｂｉａｆｆｉｎ ＧｍｂＨ ＆ Ｃｏ ＫＧから購入した。塩酸トポテカンは、Ｓｅｌｌｅｃｋ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから購入した。ＵＯ１２６、ＬＹ２９４００２、ＲＯ−３１−８２２０、ＧＯ６９７６及びＳＢ２１８０７８は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍから購入した。スタウロスポリン（ＳＴＳ）、ＣＥＰ−７０１、ＵＣＮ−０１は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから得られた；Ｔｏｃｒｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅからのテモゾロマイド（ＴＭＺ）、アルシリアフラビンＡ及びＫ２５２ｃ；Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓからのレベッカマイシン及びＬＣ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓからのエンザスタウリン。汎カスパーゼ阻害剤Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫ、ＰＰ２Ａ阻害剤オカダ酸、並びに活性化剤セレン酸ナトリウム及びキシルロース−５−ホスフェートは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから得られた。別のＰＰ２Ａ活性化剤ＦＴＹ７２０は、Ｃａｙｍａｎ ｃｈｅｍｉｃａｌｓから購入した。ヒト組換え体Ｆｃ−ＦａｓＬ融合タンパク質及びヒト組換え体イソロイシンジッパーＴＲＡＩＬ（ＴＲＡＩＬ）は、Ｊｏｈｎ Ｅｒｉｋｓｓｏｎ教授（Åｂｏ Ａｋａｄｅｍｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）から寄贈された。供給業者によって推奨される通りに、全ての化学物質は水又はＤＭＳＯのいずれかで再構成した。

ウェスタンブロット法及び抗体：培養及び処理された細胞を２×ＳＤＳ試料緩衝液／Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液に溶解し、沸騰させ、１０％アクリルアミドゲルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分解した。タンパク質をＰＶＤＦ膜に移した。膜をブロックし、５％ミルク−ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０中で一次抗体の必要な希釈溶液及び二次抗体の１：５０００希釈溶液と一緒に必要な時間インキュベートし、強化化学発光（ＥＣＬ）によって発光させた。抗ＰＭＥ−１（クローンＨ−２２６）及び抗ＣＩＰ２Ａ（クローン２Ｇ１０−３Ｂ５）抗体（１：１０００希釈溶液）は、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した。抗アクチン（クローンＡＣ−４０）抗体（１：１０，０００希釈溶液）は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。ウェスタンブロットの濃度測定分析は、ＭＣＩＤ画像アナライザーソフトウェアを用いて実施した。

細胞生存力アッセイ：細胞生存力は、代謝活性のある生存可能な細胞の指標として細胞性ＡＴＰレベルを測定する、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−ｇｌｏ（ＣＴＧ）アッセイで判定した。ＣＴＧ試薬キットをＰｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．から購入し、その推奨に従ってアッセイを実施した。アッセイは白色ポリスチレン９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）で実施し、発光はＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｖｉｃｔｏｒ２プレートリーダーで測定した。

カスパーゼ−３及び−７の活性の分析：カスパーゼ−３及び−７の活性は、カスパーゼ−Ｇｌｏ３／７アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．）と命名された、カスパーゼ−３及び−７標的ペプチドＤＥＶＤを含有する基質を利用する発光に基づく方法で測定した。アッセイは製造業者の指示に従って白色ポリスチレン９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）で実施し、発光はＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｖｉｃｔｏｒ２プレートリーダーで測定した。

サブＧ０／Ｇ１画分推定によるアポトーシスアッセイ：ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で染色された断片化核を含有するサブＧ０／Ｇ１画分の百分率を、アポトーシス細胞の目安としてとった。３．５〜４×１０^４個の細胞を２４ウェルプレートに平板培養し、ｓｉＲＮＡで４８時間トランスフェクトさせ、次に新鮮な培地で試験化合物の指示濃度で処理した。２４時間の処理の後、浮遊細胞及び付着細胞の両方を遠心分離によって収集した。細胞ペレットは、ＰＢＳに４０ｍＭの三ナトリウムシトレート（Ｍｅｒｃｋ）、０．３％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）及び５０μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有する、４００μｌの低張ＰＩ緩衝液に再懸濁させ、暗室で１０分の間室温でインキュベートした。ＰＩで染色した核のフローサイトメトリー分析を実施し、記録したデータは、ＦＡＣＳｃａｎのフローサイトメーター及びソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）をそれぞれ用いて分析した。

汎カスパーゼ阻害剤を用いる実験では、トランスフェクションの１８時間後からＰＩ染色まで、３０μＭのＺ−ＶＡＤ−ＦＭＫを含有する増殖培地に細胞を保った。ＰＰ２Ａ活性化剤ＦＴＹ７２０、セレン酸ナトリウム及びキシルロース−５−ホスフェートによる処理のために、トランスフェクションの２４時間後から実験の最後まで、細胞をそれぞれの薬剤に保った。ＰＰ２Ａ阻害剤、オカダ酸処理は、２４時間のトランスフェクションの後の２４時間与えた。

コロニー形成アッセイ：６ウェルプレートに超低密度（４〜６×１０^３）で平板培養された細胞を、それらが小さなコロニーをつくるまで約７日の間増殖させた。製造業者の指示に従ってリポフェクトアミンＲＮＡｉＭＡＸ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、次にこれらの細胞をスクランブル又はＰＭＥ−１のｓｉＲＮＡでトランスフェクトさせた。４８時間後に、化学薬剤の指示濃度による処理をさらに４８時間与えた。細胞コロニーをＰＢＳで洗浄し、３．７％ホルムアルデヒドで固定し、各々室温で１５分の間０．２％クリスタルバイオレット溶液（１０％エタノールで作製）で染色した。過剰な染色剤は、ＰＢＳによる反復洗浄によって除去した。プレートを乾燥させ、オリンパスＳＰ−６００ＵＺカメラ又はＥｐｓｏｎ ｐｅｒｆｅｃｔｉｏｎ Ｖ７００スキャナで撮影し、ＩｍａｇｅＪで分析した。

統計分析：試料平均の間の等しい分散を仮定する対応のないスチューデントのｔ検定を用いて、２群のデータの平均値間の差の有意水準を評価した。全てのｐ値は両側性であった。確率値ｐ＜０．０５のパラメータは統計的に有意なものとして表され、ｐ＜０．００１は非常に有意な差として表された。
結果

がん細胞の生存及び異なる化学薬剤への感受性に及ぼすＰＭＥ−１阻害の影響を研究するために、先ず、ＰＭＥ−１タンパク質レベルを有効に低減するために、ヒトグリア芽細胞腫Ｔ９８Ｇ細胞をＰＭＥ−１ ｓｉＲＮＡで７２時間、一時的にトランスフェクトさせた（図１Ａ）。正常レベル又は低減されたレベルのＰＭＥ−１を含有するＴ９８Ｇ細胞（配列番号３７に表すスクランブルｓｉＲＮＡ又は配列番号１に表すＰＭＥ−１ ｓｉＲＮＡでそれぞれトランスフェクトさせた細胞）を、セリン−トレオニンタンパク質キナーゼの広く特異的な阻害剤（Ｈ７、Ｈ８、Ｈ８９、塩化ケレリトリン、ＵＯ１２６、ＬＹ２９４００２、及びスタウロスポリン）、チロシンキナーゼ阻害剤（スニチニブ、タンデュチニブ、ラパチニブ及びバンデタニブ）、ＤＮＡトポイソメラーゼＩ阻害剤（トポテカン）、並びに多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）の処置のために現在用いられているＤＮＡメチル化薬剤、テモゾロマイドを含む異なる化学薬剤で処理した。

ｓｉＲＮＡで４８時間トランスフェクトさせたＴ９８Ｇ細胞に薬剤処理を２４時間与え、その後溶解し、それらの核は低張ヨウ化プロピジウム緩衝液を用いて染色した。溶解物は、断片化核のサブＧ０／Ｇ１画分の変化について、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって分析した（図１Ｂ）。核の凝縮及び断片化はアポトーシスの重要な生化学的特徴であり、サブＧ０／Ｇ１分析はアポトーシスの検出のために広く使われている（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．、１９８６、１９４（２）：３４７〜５０；Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ、１９９１、１２（４）：３２３〜３２９；Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、２００６、１：１４５８〜１４６１）。この技術を用いて、Ｈ７、スニチニブ及びＬＹ２９４００２は、ＰＭＥ−１減少細胞で中レベルのアポトーシスを示した。化学療法薬テモゾロマイドは、中レベルまでグリア芽細胞腫細胞の細胞死も誘導したが、ＰＭＥ−１ ｓｉＲＮＡとの併用ではあまり有益でなかった。全ての試験薬剤で最も目立った候補はスタウロスポリン（ＳＴＳ）であり、それは、単独で有意な核断片化を誘導しなかったＳＴＳ濃度で、ＰＭＥ−１減少グリア芽細胞腫Ｔ９８Ｇ細胞で非常に高いレベルのアポトーシスを誘導した。大部分の化学物質（図１Ｂ）、又は細胞死誘導リガンド、ＦａｓＬ（組換え体Ｆｃ−ＦａｓＬ融合タンパク質）及びＴＲＡＩＬ（図１Ｃ）による細胞の処理が同じ傾向を示さなかったので、ＰＭＥ−１減少の相乗効果はＳＴＳ特異的であることが見出された。

さらに、ＳＴＳは、スクランブルｓｉＲＮＡによるトランスフェクション細胞で細胞死を誘導しなかった濃度で、ＰＭＥ−１減少細胞で用量依存的にアポトーシスを誘導することが見出された（図１Ｄ）。しかし、５０ｎＭより高い濃度では、対照の（スクランブルｓｉＲＮＡでトランスフェクトさせた）Ｔ９８Ｇ細胞においてさえも、ＳＴＳは単独で細胞死を誘導し始めた。

この処理組合せの効力は、Ｔ９８Ｇグリア芽細胞腫細胞及び別のグリア芽細胞腫細胞系Ｕ１１８ＭＧでのコロニー形成アッセイによって次に試験した。この実験のために、これらの細胞を小さなコロニーの形成まで６ウェルプレートで増殖させ、それらのコロニーは、次にスクランブル又はＰＭＥ−１のｓｉＲＮＡで４８時間トランスフェクトさせ、続いて指示された濃度のＳＴＳでさらに４８時間処理した。コロニーをホルムアルデヒドで固定し、クリスタルバイオレットで染色し、画像をＩｍａｇｅ Ｊで分析した。両細胞系で、ＰＭＥ−１減少又はＳＴＳ処理単独のいずれもコロニー形成能力を中程度低減したが、これらの２つの処理の組合せはコロニーのほとんど完全な喪失をもたらした（図１Ｅ及び１Ｆ）。

配列番号１に表すＰＭＥ−１ ｓｉＲＮＡの配列特異的標的外作用の可能性を排除するために、３つの異なるＰＭＥ−１特異的ｓｉＲＮＡ配列（配列番号１〜３）をＴ９８Ｇ細胞にトランスフェクトさせ、ＳＴＳ処理の後にアポトーシスの核断片化を分析した（図２Ａ）。これらのＰＭＥ−１ ｓｉＲＮＡの効果をウェスタンブロット法で測定し（図２Ｂ）、バンド強度を定量化してベータアクチンに対して標準化した（図２Ｃ）。全てのＰＭＥ−１ ｓｉＲＮＡ配列は、グリア芽細胞腫Ｔ９８Ｇ細胞をＳＴＳ媒介アポトーシスに感作させることができた。スクランブルｓｉＲＮＡのトランスフェクションに起因するあらゆる可能なバックグラウンド効果を排除するために、トランスフェクションされなかったＴ９８Ｇ細胞をＳＴＳの漸増濃度で処理し、これらの細胞でのアポトーシスの核断片化をＰＭＥ−１ ｓｉＲＮＡ及び同じ濃度のＳＴＳを受けた細胞と比較した（図２Ｄ）。３０ｎＭより高い濃度のＳＴＳ単独で、限定量の細胞死が観察された。他方、ＰＭＥ−１が下方制御された細胞は、この実験で用いられた最も低い濃度でも、ＳＴＳ誘導細胞死に非常に感受性であった。

ＰＭＥ−１減少細胞でＳＴＳによって誘導される細胞致死の特徴を調べるために、グリア芽細胞腫Ｔ９８Ｇ細胞の生存力に及ぼすＰＭＥ−１ ｓｉＲＮＡとＳＴＳ処理とのこの二重組合せの影響を、細胞−力価−ｇｌｏ（ＣＴＧ）アッセイによって先ず分析した（図３Ａ）。ＰＭＥ−１減少は多少細胞生存力を低減するが、同じ細胞がＳＴＳ処理も受けたときには細胞生存力の急激な低減があったので、結果はサブＧ０／Ｇ１分析と強く相関する。アポトーシスの別の生化学的特徴は、エフェクターシステイン−アスパラギン酸プロテアーゼカスパーゼー３及び７の活性化である。ＰＭＥー１減少単独は、カスパーゼ３／７の活性を２倍を超えて増加させることが見出され、それは、ＳＴＳ処理と組み合わせると６倍以上上昇し（図３Ｂ）、カスパーゼがアポトーシス誘導に関与することを示唆する。さらにカスパーゼ誘導の役割をさらに検証するために、ＰＭＥ−１ ｓｉＲＮＡ及びＳＴＳ処理を受けた細胞を実験期間中汎カスパーゼ阻害剤、ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋで処理し、アポトーシスを核断片化アッセイによって分析した（図３Ｃ）。本発明者らは、ＰＭＥ−１減少細胞でのＳＴＳ媒介アポトーシスの、カスパーゼ活性の阻害による完全な逆転を見出し、このアポトーシスがカスパーゼの誘導に完全に依存することが示唆された。

次に、本発明者らが重視したのは、ＰＭＥ−１によって媒介される、ＳＴＳ誘導アポトーシスに対するグリア芽細胞腫細胞の抵抗性の背後にある可能な機構を調査することであった。ＰＭＥ−１の唯一の確立された直接標的はＰＰ２Ａであるので、それがＰＭＥ−１阻害の影響を元に戻し、したがって細胞生存を促進するはずであるとの推測により、ＰＰ２Ａの化学的阻害剤、オカダ酸（ＯＡ）を用いた。実際に、ＳＴＳ処理の前の２４時間のＯＡへのグリア芽細胞腫Ｔ９８Ｇ細胞の前処理は、ＰＭＥ−１ ｓｉＲＮＡ及びＳＴＳ媒介アポトーシスから細胞を用量依存的に救済するのに十分だった（図４Ａ）。これは、本発明者らがＰＰ２Ａの役割をさらに調べ、異なるＰＰ２Ａ三量体複合体のどれがＰＭＥ−１媒介アポトーシス作用に関与するのかを見出すことにつながった。ＰＭＥ−１はＰＰ２Ａ調節Ｂサブユニットのいくつかの結合を促進し、他のサブユニットの結合を阻害するので、どれがＰＭＥ−１媒介作用のために必要とされるかを試験するために、ｓｉＲＮＡによって媒介される特異的Ｂサブユニットの阻害をＰＭＥ−１阻害と共に用いた。９つの異なるＰＰ２Ａ ＢサブユニットｓｉＲＮＡを、ＰＭＥ−１ ｓｉＲＮＡと一緒にグリア芽細胞腫Ｔ９８Ｇ細胞に同時トランスフェクトさせ、その後ＳＴＳ処理及びアポトーシス分析が続いた。予想通りに、阻害されたとき、わずかなＰＰ２Ａ Ｂサブユニットだけが、ＰＭＥ−１減少細胞でアポトーシスを元に戻すことができた。代表図４Ｂは、ＰＰＰ２Ｒ２ａ、ＰＰＰ２Ｒ３ｂ、ＰＰＰ２Ｒ５ａ又はＰＰＰ２Ｒ５ｂ Ｂサブユニットのいずれかが同時減少させられた細胞が、ＰＭＥ−１減少細胞でＳＴＳ媒介アポトーシスを有意に元に戻すことが可能であることを示す。一方、ＰＰＰ２Ｒ２ｃ（図４Ｂ）又は他の試験Ｂサブユニット（データ示さず）のいずれかの同時減少は、ＰＭＥ−１ ｓｉＲＮＡ及びＳＴＳ処理を受けた細胞のアポトーシスに影響を及ぼすことができなかった。したがって、上の４つのＢサブユニットを含有するＰＰ２Ａ三量体の再活性化によって、ＰＭＥ−１阻害がＳＴＳ媒介アポトーシスを促進すると結論することができる。

これらのＰＰ２Ａ媒介アポトーシス作用がＰＭＥ−１に特異的であるか、他のＰＰ２Ａ阻害／調節タンパク質と共有されるかどうかを立証するために、ＳＴＳ処理に応じてグリア芽細胞腫細胞をアポトーシスに感作させるそれらの能力について、ＣＩＰ２Ａ及びＰＭＥ−１減少を比較した。ＣＩＰ２Ａ下方制御はアポトーシスを非常にわずかに増加させることを見出したので、それは、ＰＭＥ−１減少細胞（図４Ｃ）によって媒介されるような相乗作用とみなすことができず、これらの作用がＰＭＥ−１下方制御に特異的であるという考えを支えた。それらのそれぞれのｓｉＲＮＡによるＣＩＰ２Ａ及びＰＭＥ−１の有効な下方制御は、ウェスタンブロット法によって検証された（図４Ｄ）。

次に、ＳＴＳ処理に応じてアポトーシスを促進するそれらの能力について、ＰＰ２Ａ、ＦＴＹ７２０、セレン酸塩及びキシルロース−５−ホスフェートの近年同定された３つの化学活性化剤を試験した。ＰＭＥ−１ ｓｉＲＮＡトランスフェクション細胞と化学処理細胞との間の比較を容易にするために、Ｔ９８Ｇ細胞を先ずＳｃｒ．ｓｉＲＮＡでトランスフェクトし、続いて化学的ＰＰ２Ａ活性化剤で６時間前処理し、次にＳＴＳで２４時間処理し、その後ＦＡＣＳによりサブＧ０／Ｇ１を分析した（図４Ｄ）。これらの化学的ＰＰ２Ａ活性化剤のいずれも、ＳＴＳ処理によりグリア芽細胞腫細胞でアポトーシスを感作することができなかった。

全ての上記の結果は、ＳＴＳ媒介アポトーシスへのグリア芽細胞腫細胞の感作のために、ＰＭＥ−１発現の下方制御及び選択されたＰＰ２Ａ複合体の必然の活性化の必要条件を鮮明にする。

ＳＴＳはキナーゼの広く特異的な阻害剤であることが文献で実証されているので、それは、がん化学療法剤の分野でより重要でないとみなされる。しかし、はるかにより特異的で、より少ない副作用を有し、現在異なる疾患の処置のために臨床試験中である、いくつかのＳＴＳ誘導体が知られている。そこで、本発明者らは、本発明者らの実験セットアップで、ＳＴＳを異なる濃度のその誘導体、ＰＫＣ４１２、Ｋ２５２ａ、ＲＯ−３１−８２２０、ＧＯ６９７６、ＳＢ２１８０７８、アルシリアフラビンＡ、Ｋ２５２ｃ、レベッカマイシン、エンザスタウリン、ＵＣＮ−０１又はＣＥＰ−７０１に交換した（図５Ａ）。驚いたことに、ＰＫＣ−４１２、Ｋ２５２ａ、ＵＣＮ−０１及びＣＥＰ−７０１が、ＳＴＳ自体よりさらに高いレベルで、ＰＭＥ−１減少グリア芽細胞腫細胞でアポトーシスを誘導することが可能なことが見出された。ＳＢ２１８０７８は、より高い濃度で中レベルのアポトーシスを誘導した。一方、ＲＯ−３１−８２２０及び他の試験ＳＴＳ誘導体は、これらの細胞で活性でなかった。ＰＭＥ−１減少Ｔ９８Ｇ細胞での全てのこれらの薬剤の生化学的特徴、構造及びアポトーシス増強は、表４にも掲載される。

２つの活性薬剤、ＰＫＣ４１２及びＫ２５２ａを用いるＴ９８Ｇ細胞でのコロニー形成アッセイも、上記の知見を補強する（図５Ｂ）。細胞系特異的作用を避けるために、アポトーシス感作薬剤、ＳＴＳ、ＰＫＣ４１２及びＫ２５２ａの効力を、他のＰＭＥ−１減少グリア芽細胞腫細胞系Ｕ２５１ＭＧ及びＵ８７ＭＧでも試験した。全ての試験細胞系で、ＰＭＥ−１減少はＳＴＳ、ＰＫＣ４１２及びＫ２５２ａの細胞致死活性を強化したが、処理の組合せの効力には細胞型依存性の差があった（図５Ｃ及び５Ｄ）。

配列番号１ ＰＭＥ−１ ｓｉＲＮＡ
配列番号２ ＰＭＥ−１ ｓｉＲＮＡ
配列番号３ ＰＭＥ−１ ｓｉＲＮＡ
配列番号４ ＰＭＥ−１ ｓｉＲＮＡ
配列番号５ ＰＭＥ−１ ｓｉＲＮＡ
配列番号６ ＰＭＥ−１ ｓｉＲＮＡ
配列番号７ ＰＭＥ−１ ｓｉＲＮＡ
配列番号８ ＰＭＥ−１ ｓｉＲＮＡ
配列番号９ ＰＭＥ−１ ｓｉＲＮＡ
配列番号１０ ＰＭＥ−１ ｓｉＲＮＡ
配列番号１１ ＰＭＥ−１ ｓｉＲＮＡ
配列番号１２ ＰＭＥ−１ ｓｉＲＮＡ
配列番号１３ ＰＭＥ−１ ｓｉＲＮＡ
配列番号１４ ＰＭＥ−１ ｓｉＲＮＡ
配列番号１５ ＰＭＥ−１ ｓｉＲＮＡ
配列番号１６ ＰＭＥ−１ ｓｉＲＮＡ
配列番号１７ ＰＭＥ−１ ｓｉＲＮＡ
配列番号１８ ＰＭＥ−１ ｓｉＲＮＡ
配列番号１９ ＰＭＥ−１ ｓｉＲＮＡ
配列番号２０ ＰＭＥ−１ ｓｉＲＮＡ
配列番号２１ ＰＭＥ−１ ｓｉＲＮＡ
配列番号２２ ＰＭＥ−１ ｓｉＲＮＡ
配列番号２３ ＰＭＥ−１ ｓｉＲＮＡ
配列番号２４ ＰＭＥ−１ ｓｉＲＮＡ
配列番号２５ ＰＭＥ−１ ｓｉＲＮＡ
配列番号２６ ＰＭＥ−１ ｓｉＲＮＡ
配列番号２７ ＰＭＥ−１ ｓｉＲＮＡ
配列番号２８ ＰＭＥ−１ ｓｉＲＮＡ
配列番号２９ ＰＭＥ−１ ｓｉＲＮＡ
配列番号３０ ＰＭＥ−１ ｓｉＲＮＡ
配列番号３１ ＰＭＥ−１ ｓｉＲＮＡ
配列番号３２ ＰＭＥ−１ ｓｉＲＮＡ
配列番号３３ ＰＭＥ−１ ｓｉＲＮＡ
配列番号３４ ＰＭＥ−１ ｓｉＲＮＡ
配列番号３５ ＰＭＥ−１ ｓｉＲＮＡ
配列番号３６ ＰＭＥ−１ ｓｉＲＮＡ
配列番号３７ ＰＭＥ−１ ｓｈＲＮＡ
配列番号３８ ＰＭＥ−１ ｓｈＲＮＡ
配列番号３９ ＰＭＥ−１ ｓｈＲＮＡ
配列番号４０ Ｓｃｒａｍｂｌｅｄ ｓｉＲＮＡ
配列番号４１ ＣＩＰ２Ａ ｓｉＲＮＡ
配列番号４２ ＰＰＰ２Ｒ２Ａ ｓｉＲＮＡ
配列番号４３ ＰＰＰ２ＡＲ２Ｃ ｓｉＲＮＡ
配列番号４４ ＰＰＰ２Ｒ３Ｂ ｓｉＲＮＡ
配列番号４５ ＰＰＰ２Ｒ５Ａ ｓｉＲＮＡ
配列番号４６ ＰＰＰ２Ｒ５Ｂ ｓｉＲＮＡ

Claims (9)

1. 少なくとも１種類のＰＭＥ−１サイレンシング剤と、式（Ｉ）
   
   （式中、
   Ｒ’は、Ｈ又はアルキルであり；
   Ｒ’’は、Ｈ又はアルコキシであり；
   Ｒ１及びＲ２は、Ｈであるか一緒にオキソを形成し；
   Ｒ３及びＲ４は、独立してＨ、ＯＨであるか一緒にオキソを形成し：
   Ｒ５、Ｒ６、Ｒ６’、Ｒ７及びＲ８は、Ｈ、アルキル、アルコキシ、ヒドロキシ、ヒドロキシルアルキル、アルコキシカルボニル又はモノ−及びジアルキルアミノからなる群から独立して選択され；
   Ｘは、ＣＨ_２又はＯであり；
   ｎは、０又は１である）
   の化合物とを組合せて含む医薬。
2. 少なくとも１種類のＰＭＥ−１サイレンシング剤と、
   
   の化合物とを組合せて含む医薬。
3. ＰＭＥ−１サイレンシング剤が、ｓｉＲＮＡ分子、ＤｓｉＲＮＡ分子、人工ｍｉＲＮＡ前駆体、ｓｈＲＮＡ分子、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、及びＰＰ２Ａｃに対するＰＭＥ−１機能を阻止する作用剤からなる群から選択される、請求項１又は２に記載の医薬。
4. ＰＭＥ−１サイレンシング剤が、配列番号１〜３９からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項１又は２に記載の医薬。
5. 式（Ｉ）の化合物が、
   
   からなる群から選択される、請求項１に記載の医薬。
6. 過剰増殖性疾患の処置に用いるための、請求項１又は２に記載の医薬。
7. 前記過剰増殖性疾患が、乾癬、心筋肥大、良性腫瘍、固形がん及び血液がんからなる群から選択される、請求項６に記載の医薬。
8. 前記固形がんが、頭頸部扁平上皮癌、結腸がん、胃がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、子宮頸がん、脳がん、神経膠腫、星状細胞腫及びグリア芽細胞腫からなる群から選択される、請求項７に記載の医薬。
9. 請求項１から８までのいずれか一項に記載の医薬及び少なくとも１種の薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。