JP5994132B2 - Behavioral disorder model animal and screening method - Google Patents
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Description
本発明は、注意欠陥／多動性障害（ＡＤＨＤ）等の行動障害モデルとなるモデル動物およびこのモデル動物を利用する行動障害の予防、改善又は治療に有用な物質のスクリーニング方法に関する。 The present invention relates to a model animal that becomes a behavioral disorder model such as attention deficit / hyperactivity disorder (ADHD) and a method for screening a substance useful for the prevention, amelioration, or treatment of behavioral disorder using the model animal.
注意欠陥／多動性障害（ＡＤＨＤ）は、児童にもっとも多く見られる精神神経疾患であり、児童の約５％が発症すると言われている。ＡＤＨＤの主な症状は注意欠陥、衝動性そして多動性であり、それらの症状が共存した状態で現れることもある。
また、ＡＤＨＤと診断された児童の３０〜５０％は、成人になっても症状が持続することが知られ、成人期のＡＤＨＤは成人期ＡＤＨＤ（Ａｄｕｌｔ ＡＤＨＤ）と呼ばれている。Ａｄｕｌｔ ＡＤＨＤの症状としては、注意欠陥の他に気分障害、不安感亢進などの合併症が報告されており、これらの症状が社会生活を困難にすることがある。
ＡＤＨＤ患者に使用される薬としてアトモキセチンやメチルフェニデートが知られているが、特に後者は依存性などの副作用が懸念されており、ＡＤＨＤの症状の改善に有効な治療法や、更なる薬の開発が求められている。
Attention deficit / hyperactivity disorder (ADHD) is the most common neuropsychiatric disorder in children, and it is said that about 5% of children will develop. The main symptoms of ADHD are attention deficit, impulsivity, and hyperactivity, and these symptoms may appear together.
In addition, 30-50% of children diagnosed with ADHD are known to maintain symptoms even when they become adults. ADHD in adulthood is called adult ADHD (Adult ADHD). As symptoms of Adult ADHD, complications such as mood disorder and increased anxiety are reported in addition to attention deficits, and these symptoms may make social life difficult.
Atomoxetine and methylphenidate are known as drugs used in ADHD patients, but the latter is particularly concerned about side effects such as addiction. Development is required.
ＡＤＨＤの原因は不明だが、遺伝的要因があることが知られている（非特許文献１）。したがって、遺伝的要因に沿ったＡＤＨＤの発症機構の解明や、有効な薬物の探索を行う必要がある。
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、ＡＤＨＤ等の行動障害モデルとなるモデル動物の提供、及びこのモデル動物を利用する行動障害の予防、改善又は治療に有用な物質のスクリーニング方法の提供を課題とする。
Although the cause of ADHD is unknown, it is known that there is a genetic factor (Non-patent Document 1). Therefore, it is necessary to elucidate the pathogenesis of ADHD according to genetic factors and search for effective drugs.
The present invention has been made in view of the above circumstances, and provides a model animal that becomes a behavioral disorder model such as ADHD, and a method for screening a substance useful for the prevention, improvement, or treatment of behavioral disorder using the model animal. Offering is an issue.
本発明者らは、Ｓｐｏｃｋ３遺伝子がトランスジェニックベクターの挿入により破壊されたＳｐｏｃｋ３のノックアウトマウスが、多動性の症状を示すことを見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は以下のとおりである。 The inventors of the present invention have found that a Spock3 knockout mouse in which the Spock3 gene is disrupted by insertion of a transgenic vector exhibits hyperactive symptoms, and completed the present invention. That is, the present invention is as follows.
（１）Ｓｐｏｃｋ３遺伝子の発現が抑制若しくは喪失している、又は前記Ｓｐｏｃｋ３遺伝子がコードするＳＰＯＣＫ３タンパク質の機能が抑制若しくは喪失しており、
前記Ｓｐｏｃｋ３遺伝子又は前記Ｓｐｏｃｋ３遺伝子の発現調節領域に変異が導入された非ヒト動物であり、
前記非ヒト動物がマウスであり、前記マウスの遺伝的背景が、Ｃ３Ｈ、Ｃ３Ｈコンジェニック系統、Ｃ５７ＢＬ/６ × Ｃ３Ｈの雑種、及びＣ５７ＢＬ/６ × Ｃ３Ｈの雑種に由来する交雑型近交系からなる群から選ばれ、多動性の行動障害の症状を示すことを特徴とする多動性障害モデル動物。
（２）前記Ｓｐｏｃｋ３遺伝子の対立遺伝子の両方が破壊されてなる前記（１）に記載の多動性障害モデル動物。
（３）更に、Ａｎｘａ１０遺伝子の発現が抑制若しくは喪失している、又は前記Ａｎｘａ１０遺伝子がコードするＡＮＸＡ１０タンパク質の機能が抑制若しくは喪失している非ヒト動物である前記（１）又は（２）に記載の多動性障害モデル動物。
（４）前記（１）〜（３）のいずれか一つに記載の多動性障害モデル動物に被験物質を投与することを特徴とする、多動性障害の予防、改善又は治療に有用な物質のスクリーニング方法。
（５）前記被験物質が投与されたときと投与されていないときとを比較して、前記被験物質が投与されたときの前記非ヒト哺乳動物における多動性障害の発症、促進、予防、抑制又は治癒を指標にして、前記被験物質を多動性障害の予防、改善又は治療に有用な物質の候補物質として選択する前記（４）に記載の多動性障害の予防、改善又は治療に有用な物質のスクリーニング方法。
（６）Ｓｐｏｃｋ３遺伝子の発現が抑制若しくは喪失している、又は前記Ｓｐｏｃｋ３遺伝子がコードするＳＰＯＣＫ３タンパク質の機能が抑制若しくは喪失しており、
前記Ｓｐｏｃｋ３遺伝子又は前記Ｓｐｏｃｋ３遺伝子の発現調節領域に変異が導入されたマウスであり、
前記マウスの遺伝的背景が、Ｃ３Ｈ、Ｃ３Ｈコンジェニック系統、Ｃ５７ＢＬ/６ × Ｃ３Ｈの雑種、及びＣ５７ＢＬ/６ × Ｃ３Ｈの雑種に由来する交雑型近交系からなる群から選ばれ、多動性の行動障害の症状を示す前記マウスを、多動性モデル動物として使用する方法。
（７）前記マウスにおいて、前記Ｓｐｏｃｋ３遺伝子の対立遺伝子の両方が破壊されている前記（６）に記載の方法。
（８）前記マウスにおいて、更に、Ａｎｘａ１０遺伝子の発現が抑制若しくは喪失している、又は前記Ａｎｘａ１０遺伝子がコードするＡＮＸＡ１０タンパク質の機能が抑制若しくは喪失している前記（６）又は（７）に記載の方法。
(1) The expression of the Spock3 gene is suppressed or lost, or the function of the SPOCK3 protein encoded by the Spock3 gene is suppressed or lost ,
A non-human animal having a mutation introduced into the Spock3 gene or the expression regulatory region of the Spock3 gene;
The non-human animal is a mouse, and the genetic background of the mouse consists of a C3H, C3H congenic strain, a C57BL / 6 × C3H hybrid, and a hybrid inbred line derived from a C57BL / 6 × C3H hybrid A model animal for hyperactivity disorder, which is selected from the group and exhibits symptoms of hyperactivity behavioral disorder .
(2) The hyperactivity disorder model animal according to ( 1 ), wherein both alleles of the Spock3 gene are disrupted.
(3) Further, the expression of Anxa10 gene is suppressed or loss, or the in Anxa10 gene Ru non-human animal der function of ANXA10 protein encoded is inhibited or lost (1) or (2) The hyperactivity disorder model animal as described.
(4) Useful for the prevention, improvement or treatment of hyperactivity disorder characterized by administering a test substance to the hyperactivity disorder model animal according to any one of (1) to ( 3 ) Substance screening method.
(5) Onset, promotion, prevention, suppression of hyperactivity disorder in the non-human mammal when the test substance is administered by comparing when the test substance is administered and when it is not administered Alternatively, the test substance is selected as a candidate substance useful for the prevention, improvement or treatment of hyperactivity disorder using healing as an index, and is useful for the prevention, improvement or treatment of hyperactivity disorder according to ( 4 ) above Screening method for various substances.
(6) The expression of the Spock3 gene is suppressed or lost, or the function of the SPOCK3 protein encoded by the Spock3 gene is suppressed or lost,
A mouse having a mutation introduced into the Spock3 gene or the expression regulatory region of the Spock3 gene;
The mouse genetic background is selected from the group consisting of C3H, C3H congenic strains, C57BL / 6 × C3H hybrids, and hybrid inbred lines derived from C57BL / 6 × C3H hybrids, which are hyperactive A method of using the mouse exhibiting a symptom of behavioral disorder as a hyperactivity model animal.
(7) The method according to (6), wherein both the alleles of the Spock3 gene are disrupted in the mouse.
(8) The mouse according to (6) or (7), wherein the Anxa10 gene expression is further suppressed or lost, or the function of the ANXA10 protein encoded by the Anxa10 gene is suppressed or lost in the mouse. Method.
本発明によれば、ＡＤＨＤ等の行動障害モデルとなるモデル動物を提供することができる。またこのモデル動物を利用する行動障害の予防、改善又は治療に有用な物質のスクリーニング方法を提供することができる。 ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the model animal used as behavior disorder models, such as ADHD, can be provided. Moreover, the screening method of the substance useful for the prevention, improvement, or treatment of the behavioral disorder using this model animal can be provided.
≪モデル動物≫
本発明の行動障害モデル動物は、Ｓｐｏｃｋ３遺伝子の発現が抑制若しくは喪失している、又は前記Ｓｐｏｃｋ３遺伝子がコードするＳＰＯＣＫ３タンパク質の機能が抑制若しくは喪失している非ヒト哺乳動物である。
≪Model animal≫
The behavioral disorder model animal of the present invention is a non-human mammal in which the expression of the Spock3 gene is suppressed or lost, or the function of the SPOCK3 protein encoded by the Spock3 gene is suppressed or lost.
ＳＰＯＣＫ３の属するＳｐｏｃｋ／Ｔｅｓｔｉｃａｎファミリー蛋白質は、コンドロイチン硫酸やヘパラン硫酸などのグリコサミノグリカンを有するプロテオグリカンであり、神経系組織において細胞外マトリックス分子として存在している。
マウスゲノム上では、Ｓｐｏｃｋ３遺伝子の他に、Ｓｐｏｃｋ１及びＳｐｏｃｋ２遺伝子が存在している。Ｓｐｏｃｋ１、Ｓｐｏｃｋ２及びＳｐｏｃｋ３は、マルチドメインから構成される蛋白質であり、プロテアーゼの阻害因子として細胞外基質の統合や再構築の制御に関与することが示唆されている。マウス（Mus musculus）のＳＰＯＣＫ３タンパク質のアミノ酸配列が開示されている（Gene ID: 72902、 RefSeq accession number: XP_006509579, XP_006509580, NP_076178, NP_001239549, XP_006509581, NP_001239550）。マウスのＳｐｏｃｋ３遺伝子の塩基配列が開示されている（NM_023689, XM_006509518, XM_006509516, XM_006509517, NM_001252620, NM_001252621）。なお、本明細書において、Gene IDとは、Geneデータベース（URL：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/）の登録番号を表わす。
The Spock / Testican family protein to which SPOCK3 belongs is a proteoglycan having glycosaminoglycans such as chondroitin sulfate and heparan sulfate, and exists as an extracellular matrix molecule in nervous system tissues.
On the mouse genome, there are Spock1 and Spock2 genes in addition to the Spock3 gene. Spock1, Spock2 and Spock3 are proteins composed of multidomains, and are suggested to be involved in the control of extracellular matrix integration and remodeling as protease inhibitors. The amino acid sequence of the mouse (Mus musculus) SPOCK3 protein has been disclosed (Gene ID: 72902, RefSeq accession number: XP_006509579, XP_006509580, NP_076178, NP_001239549, XP_006509581, NP_001239550). The nucleotide sequence of the mouse Spock3 gene has been disclosed (NM_023689, XM_006509518, XM_006509516, XM_006509517, NM_001252620, NM_001252621). In addition, in this specification, Gene ID represents the registration number of Gene database (URL: http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/).
Ｓｐｏｃｋ３遺伝子としては、例えば、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれか一つのアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されているアミノ酸配列、或いは、
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と同一性が８０％以上であるアミノ酸配列
Examples of the Spock3 gene include a gene encoding a protein having any one of the following amino acid sequences (a) to (c).
(A) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (b) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, wherein one to several amino acids are deleted, substituted or added, or
(C) an amino acid sequence having 80% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1
ここで、欠失、置換、又は付加されていてもよいアミノ酸の数としては、１〜３０個が好ましく、１〜２０個が好ましく、１〜１０個が好ましく、１〜７個がより好ましく、１〜５個がさらに好ましく、１〜３個が特に好ましく、１〜２個が最も好ましい。
ここで、配列番号１で表されるアミノ酸配列との同一性としては、８０％以上が好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がさらに好ましく、９５％以上が特に好ましく、９８％以上が最も好ましい。アミノ酸配列の同一性は、例えば、ＢＬＡＳＴ（参照URL：http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）により求めることができる。
Here, the number of amino acids that may be deleted, substituted, or added is preferably 1 to 30, preferably 1 to 20, preferably 1 to 10, more preferably 1 to 7, 1 to 5 is more preferable, 1 to 3 is particularly preferable, and 1 to 2 is most preferable.
Here, the identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is preferably 80% or more, more preferably 85% or more, further preferably 90% or more, particularly preferably 95% or more, and 98% or more. Most preferred. The identity of amino acid sequences can be determined by, for example, BLAST (reference URL: http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
本発明のモデル動物となる任意の非ヒト哺乳動物が有するＳｐｏｃｋ３遺伝子が公知である場合は、その情報に基づき本発明のモデル動物となる非ヒト哺乳動物のＳｐｏｃｋ３の配列を選択することができる。例えばラットのＳｐｏｃｋ３遺伝子ホモログの配列は公知である（RefSeq accession number: XM_008771117.1, NM_001107310.1, XP_008769339.1, NP_001100780.1）。本発明のモデル動物となる任意の非ヒト哺乳動物が有するＳｐｏｃｋ３遺伝子が公知ない場合であっても、当業者であれば、対象の非ヒト哺乳動物のＳｐｏｃｋ３の配列を選択することができる。 When the Spock3 gene possessed by any non-human mammal that is a model animal of the present invention is known, the sequence of Spock3 of the non-human mammal that is the model animal of the present invention can be selected based on that information. For example, the sequence of rat Spock3 gene homolog is known (RefSeq accession number: XM_008771117.1, NM_001107310.1, XP_008769339.1, NP_001100780.1). Even if the Spock3 gene possessed by any non-human mammal that is a model animal of the present invention is not known, those skilled in the art can select the sequence of Spock 3 of the subject non-human mammal.
ＳＰＯＣＫ３タンパク質の機能が喪失しているとは、ＳＰＯＣＫ３タンパク質が本来有する機能が完全に失われている状態のことをいう。ＳＰＯＣＫ３タンパク質の機能が抑制されているとは、ＳＰＯＣＫ３タンパク質が本来有する機能が部分的に失われている状態のことをいう。ＳＰＯＣＫ３タンパク質が本来有する機能が部分的に失われている場合には、ＳＰＯＣＫ３タンパク質の機能の抑制の程度は、モデル動物と、モデル動物となる動物の野生型の動物等のコントロールとなる動物とを比較して、モデル動物に行動障害と認められる状態（コントロールとの差異）が表れる程度であればよい。 The loss of the function of the SPOCK3 protein means a state in which the function inherent to the SPOCK3 protein is completely lost. The function of the SPOCK3 protein being suppressed refers to a state in which the function inherent to the SPOCK3 protein is partially lost. When the function inherent to the SPOCK3 protein is partially lost, the degree of suppression of the function of the SPOCK3 protein is determined by comparing a model animal and a control animal such as a wild-type animal of a model animal. In comparison, it is sufficient that the model animal exhibits a state that is recognized as a behavioral disorder (difference from the control).
行動障害と認められる状態の指標としては、注意欠陥、衝動性、多動性が挙げられ、なかでも多動性を行動障害と認められる状態の指標とすることが好ましい。モデル動物となる動物が多動性を有するかについては、例えば、同一条件下で動物を飼育して行動を観察して調べることができる。多動性の指標としては、例えば、モデル動物となる動物が一定期間内にジャンピングした（飛び跳ねた）回数、一定期間内にジャンピングを継続した平均時間、若しくは一定期間内にジャンピングに費やした合計時間、又は、一定期間内に飼育ケージ内を移動した回数、一定期間内に飼育ケージ内の移動を継続した平均時間、若しくは一定期間内に飼育ケージ内の移動に費やした合計時間、或いはそれらの組み合わせが挙げられ、一定期間内にジャンピングに費やした合計時間が好ましい。また、多動性は概日リズムに連動しており、夜間に著しく、昼間は減衰する傾向があるため、夜間における行動観察の結果に基づいて多動性を評価することが好ましい。ただし、多動性を強く誘導あるいは強く促進する物質をスクリーニングする場合には、多動性の低下した昼間における行動観察の結果に基づいて多動性を評価してもよい。飼育ケージを叩くなど、外界刺激に代表される誘発因子を与るなど、任意の条件を付加して行動評価を行ってもよい。 As an index of a state recognized as a behavioral disorder, attention deficit, impulsivity, and hyperactivity may be mentioned, and among them, hyperactivity is preferably used as an index of a state recognized as a behavioral disorder. Whether or not a model animal has hyperactivity can be examined, for example, by raising an animal under the same conditions and observing the behavior. Examples of the hyperactivity index include, for example, the number of jumps (jumps) within a certain period of time, the average time during which jumping was continued within a certain period, or the total time spent jumping within a certain period. Or, the number of times the animal has moved in the cage within a certain period, the average time during which the animal has moved within the cage, or the total time spent in the cage within the certain period, or a combination thereof The total time spent jumping within a certain period is preferable. Moreover, since hyperactivity is linked to circadian rhythm, and tends to attenuate during the daytime and during the daytime, it is preferable to evaluate the hyperactivity based on the result of behavior observation at night. However, when screening for a substance that strongly induces or strongly promotes hyperactivity, the hyperactivity may be evaluated based on the results of behavior observation in the daytime when the hyperactivity is reduced. Behavior evaluation may be performed by adding arbitrary conditions, such as giving an inducing factor typified by external stimuli such as hitting a breeding cage.
ＳＰＯＣＫ３タンパク質の機能の抑制又は喪失は、Ｓｐｏｃｋ３遺伝子の発現能が抑制もしくは喪失することによっても生じ得る。Ｓｐｏｃｋ３遺伝子の発現能が喪失しているとは、モデル動物となる動物において、Ｓｐｏｃｋ３遺伝子産物が喪失していることをいう。Ｓｐｏｃｋ３遺伝子の発現能が抑制しているとは、モデル動物となる動物の野生型の動物等のコントロールとなる動物と比較して、Ｓｐｏｃｋ３遺伝子産物の量が抑制されていることをいう。Ｓｐｏｃｋ３遺伝子産物の量が抑制されている場合には、抑制の程度は、モデル動物となる動物の野生型の動物等のコントロールとなる動物と比較して、上記に示すようなジャンピング等の行動異常が表れる程度であればよい。Ｓｐｏｃｋ３遺伝子の発現の抑制は、Ｓｐｏｃｋ３伝子に対するＲＮＡｉ誘導性核酸、アンチセンス核酸、アプタマー若しくはリボザイムなどの発現を生じさせる核酸配列をモデル動物に導入し、遺伝子ノックダウンにより生じさせることができる。 Suppression or loss of the function of the SPOCK3 protein can also be caused by suppression or loss of the ability to express the Spock3 gene. The loss of the expression ability of the Spock3 gene means that the Spock3 gene product is lost in the animal to be a model animal. The expression of the Spock3 gene being suppressed means that the amount of the Spock3 gene product is suppressed as compared to a control animal such as a wild-type animal of a model animal. When the amount of the Spock3 gene product is suppressed, the degree of suppression is higher in behavioral abnormalities such as jumping as described above compared to control animals such as wild-type animals as model animals. It is sufficient that the value appears. Suppression of the expression of the Spock3 gene can be caused by gene knockdown by introducing a nucleic acid sequence that causes the expression of an RNAi-inducible nucleic acid, antisense nucleic acid, aptamer or ribozyme to the Spock3 gene into a model animal.
本発明のモデル動物は、Ｓｐｏｃｋ３遺伝子又はＳｐｏｃｋ３遺伝子の発現調節領域に変異が導入されてなることが好ましい。
導入される変異は、Ｓｐｏｃｋ３遺伝子の発現を抑制若しくは喪失させる、又は前記Ｓｐｏｃｋ３遺伝子がコードするＳＰＯＣＫ３タンパク質の機能を抑制若しくは喪失させるものであればよい。
The model animal of the present invention preferably has a mutation introduced into the Spock3 gene or the expression regulatory region of the Spock3 gene.
The introduced mutation may be any mutation that suppresses or loses the expression of the Spock3 gene, or suppresses or loses the function of the SPOCK3 protein encoded by the Spock3 gene.
上記Ｓｐｏｃｋ３遺伝子とは、ＳＰＯＣＫ３タンパク質をコードする領域であるエクソンのほか、Ｓｐｏｃｋ３遺伝子の発現を抑制若しくは喪失させる、又は前記Ｓｐｏｃｋ３遺伝子がコードするＳＰＯＣＫ３タンパク質の機能を抑制若しくは喪失させることができる場合にはイントロンも含まれる。
Ｓｐｏｃｋ３遺伝子の発現調節領域とは、Ｓｐｏｃｋ３遺伝子の発現を調節する領域であって、例えば、プロモーター、サイレンサー、エンハンサー、応答配列である。
The Spock3 gene is an exon that is a region encoding the SPOCK3 protein, and can suppress or lose the expression of the Spock3 gene or can suppress or lose the function of the SPOCK3 protein encoded by the Spock3 gene. Introns are also included.
The expression control region of the Spock3 gene is a region that regulates the expression of the Spock3 gene, and is, for example, a promoter, a silencer, an enhancer, or a response element.
ＳＰＯＣＫ３タンパク質の機能の喪失は、例えばＳｐｏｃｋ３遺伝子に変異を導入し、Ｓｐｏｃｋ３遺伝子を破壊することにより生じさせることができる。Ｓｐｏｃｋ３遺伝子の発現能の抑制又は喪失は、例えば、Ｓｐｏｃｋ３遺伝子の発現調節領域に変異を導入するすることにより生じさせることができる。
Ｓｐｏｃｋ３遺伝子又はＳｐｏｃｋ３遺伝子の発現調節領域に変異を導入する方法は、公知の遺伝子工学的手法である遺伝子改変により行うことができる。変異は、Ｓｐｏｃｋ３遺伝子又はＳｐｏｃｋ３遺伝子の発現調節領域における一部又は全部の欠失、置換、任意の配列の挿入等により生じさせることができる。Ｓｐｏｃｋ３遺伝子の一部が欠失している場合、欠失は１つ以上のエクソンの欠失であることが好ましい。これらの変異を導入することは、例えば、変異原性物質（Mutagen）による処理、紫外線照射、相同組み換え技術等による遺伝子ターゲッティング、遺伝子ノックアウト、遺伝子ノックダウン、Cre-loxP系等による条件的ノックアウト等の手法を用いて行うことができる。
The loss of the function of the SPOCK3 protein can be caused by, for example, introducing a mutation into the Spock3 gene and destroying the Spock3 gene. The suppression or loss of the expression ability of the Spock3 gene can be caused, for example, by introducing a mutation into the expression regulatory region of the Spock3 gene.
The method for introducing a mutation into the Spock3 gene or the expression regulatory region of the Spock3 gene can be performed by genetic modification, which is a known genetic engineering technique. The mutation can be caused by partial or complete deletion, substitution, insertion of an arbitrary sequence, or the like in the Spock3 gene or the expression regulatory region of the Spock3 gene. When a part of the Spock3 gene is deleted, the deletion is preferably a deletion of one or more exons. Introduction of these mutations includes, for example, treatment with mutagens (Mutagen), UV irradiation, gene targeting by homologous recombination technology, gene knockout, gene knockdown, conditional knockout by Cre-loxP system, etc. This can be done using techniques.
本発明に係るモデル動物は、行動障害の現れやすさの観点から、Ｓｐｏｃｋ３遺伝子又はＳｐｏｃｋ３遺伝子の発現調節領域に変異が導入されて、対立遺伝子の両方が破壊されたホモ接合体であることが好ましい。
本発明に係るモデル動物は、より軽微な行動障害を扱えるとの利点からは、Ｓｐｏｃｋ３遺伝子又はＳｐｏｃｋ３遺伝子の発現調節領域に変異が導入されて、対立遺伝子の片方が破壊されたヘテロ接合体であることが好ましい。
The model animal according to the present invention is preferably a homozygote in which a mutation is introduced into the expression region of the Spock3 gene or the Spock3 gene and both alleles are disrupted from the viewpoint of the appearance of behavioral disorders. .
The model animal according to the present invention is a heterozygote in which a mutation is introduced into the expression region of the Spock3 gene or the Spock3 gene and one of the alleles is destroyed because of the advantage that it can handle a slight behavioral disorder. It is preferable.
変異により、Ｓｐｏｃｋ３遺伝子の発現を抑制若しくは喪失したか、又は前記Ｓｐｏｃｋ３遺伝子がコードするＳＰＯＣＫ３タンパク質の機能を抑制若しくは喪失したかどうかは、例えば、本発明に係るモデル動物を、Ｓｐｏｃｋ３遺伝子における全部の欠失をホモで有するモデル生物と、及び野生型などのコントロールとなる動物と、表現型やＳｐｏｃｋ３の発現量を比較することを、ひとつの指標とすることができる。 Whether or not the expression of the Spock3 gene was suppressed or lost by the mutation, or whether the function of the SPOCK3 protein encoded by the Spock3 gene was suppressed or lost, for example, the model animal according to the present invention can be treated as a whole in the Spock3 gene. Comparing a model organism having a homozygous loss with a control animal such as a wild type with a phenotype or the expression level of Spock3 can be used as one index.
後述する実施例において示すように、多動性の症状を示すＳｐｏｃｋ３のノックアウトマウスでは、トランスジェニックベクターの挿入により、Ｓｐｏｃｋ３遺伝子に加えて更にＡｎｘａ１０遺伝子も破壊されていた。 As shown in the examples described later, in the knockout mouse of Spock3 showing hyperactive symptoms, the Anxa10 gene was further destroyed in addition to the Spock3 gene by the insertion of the transgenic vector.
したがって、本発明の行動障害モデル動物は、Ｓｐｏｃｋ３遺伝子の発現が抑制若しくは喪失している、又は前記Ｓｐｏｃｋ３遺伝子がコードするＳＰＯＣＫ３タンパク質の機能が抑制若しくは喪失し、更に、Ａｎｘａ１０遺伝子の発現が抑制若しくは喪失している、又は前記Ａｎｘａ１０遺伝子がコードするＡＮＸＡ１０タンパク質の機能が抑制若しくは喪失している非ヒト哺乳動物であることが好ましい。ただし、Ａｎｘａ１０遺伝子は胃粘膜に発現するため、多動性発症に関与する可能性は低いものと考えられる。 Therefore, in the behavioral disorder model animal of the present invention, the expression of the Spock3 gene is suppressed or lost, or the function of the SPOCK3 protein encoded by the Spock3 gene is suppressed or lost, and further, the expression of the Anxa10 gene is suppressed or lost. Or a non-human mammal in which the function of the ANXA10 protein encoded by the Anxa10 gene is suppressed or lost. However, since the Anxa10 gene is expressed in the gastric mucosa, it is unlikely to be involved in the onset of hyperactivity.
Ａｎｘａ１０はアネキシンファミリーのタンパク質をコードしており、アネキシンファミリーのタンパク質はカルシウムおよびリン脂質に結合することが知られており、細胞増殖の制御や、細胞内のシグナル伝達に関与することが分かっている。また、近年では腫瘍細胞との関係が明らかにされており、胃がん、肝細胞癌、膀胱癌ではAnxa10は発現が顕著に減少し（参考文献：Munksgaard, P.P., Mansilla, F., Brems Eskildsen, A.S., Fristrup, N., Birkenkamp-Demtroder, K., Ulhoi, B.P., Borre, M., Agerbaek, M., Hermann, G.G., Orntoft, T.F. & Dyrskjot, L. 2011. Low ANXA10 expression is associated with disease aggressiveness in bladder cancer. Br J Cancer. 105, 1379-1387. Kim, J.K., Kim, P.J., Jung, K.H., Noh, J.H., Eun, J.W., Bae, H.J., Xie, H.J., Shan, J.M., Ping, W.Y., Park, W.S., Lee, J.Y. & Nam, S.W. 2010. Decreased expression of annexin A10 in gastric cancer and its overexpression in tumor cell growth suppression. Oncol Rep. 24, 607-612.
）、逆に、鋸歯状腺腫（結腸直腸腺腫のサブタイプ）や上部消化器官に関連する腺腫では腫瘍細胞のバイオマーカーになり得ることが報告されている（参考文献：Sajanti, S.A., Vayrynen, J.P., Sirnio, P., Klintrup, K., Makela, J., Tuomisto, A. & Makinen, M.J. 2014. Annexin A10 is a marker for the serrated pathway of colorectal carcinoma. Virchows Arch. Tsai, J.H., Lin, Y.L., Cheng, Y.C., Chen, C.C., Lin, L.I., Tseng, L.H., Cheng, M.L., Liau, J.Y. & Jeng, Y.M. 2014. Aberrant expression of annexin A10 is closely related to gastric phenotype in serrated pathway to colorectal carcinoma. Mod Pathol.）。しかし、Ａｎｘａ１０遺伝子の機能についての詳細は解明されていない。
Anxa10 encodes an annexin family protein, and the annexin family protein is known to bind to calcium and phospholipid, and is known to be involved in cell growth control and intracellular signal transduction. . In recent years, the relationship with tumor cells has been clarified, and the expression of Anxa10 is markedly decreased in gastric cancer, hepatocellular carcinoma, and bladder cancer (Reference: Munksgaard, PP, Mansilla, F., Brems Eskildsen, AS , Fristrup, N., Birkenkamp-Demtroder, K., Ulhoi, BP, Borre, M., Agerbaek, M., Hermann, GG, Orntoft, TF & Dyrskjot, L. 2011. Low ANXA10 expression is associated with disease aggressiveness in Br J Cancer. 105, 1379-1387. Kim, JK, Kim, PJ, Jung, KH, Noh, JH, Eun, JW, Bae, HJ, Xie, HJ, Shan, JM, Ping, WY, Park , WS, Lee, JY & Nam, SW 2010. Decreased expression of annexin A10 in gastric cancer and its overexpression in tumor cell growth suppression.Oncol Rep. 24, 607-612.
) Conversely, serrated adenoma (a subtype of colorectal adenoma) and adenoma related to the upper digestive tract have been reported to be biomarkers of tumor cells (reference: Sajanti, SA, Vayrynen, JP) , Sirnio, P., Klintrup, K., Makela, J., Tuomisto, A. & Makinen, MJ 2014. Annexin A10 is a marker for the serrated pathway of colorectal carcinoma.Virchows Arch. Tsai, JH, Lin, YL, Cheng, YC, Chen, CC, Lin, LI, Tseng, LH, Cheng, ML, Liau, JY & Jeng, YM 2014.Aberrant expression of annexin A10 is closely related to gastric phenotype in serrated pathway to colorectal carcinoma.Mod Pathol. ). However, details about the function of the Anxa10 gene have not been elucidated.
マウス（Mus musculus）のＡＮＸＡ１０タンパク質のアミノ酸配列が開示されている（Gene ID: 26359、RefSeq accession number： NP_001129561.1, NP_036052.2）。マウスのＡｎｘａ１０遺伝子の塩基配列が開示されている（RefSeq accession number：NM_011922.3, NM_001136089.2）。 The amino acid sequence of the ANXA10 protein of mouse (Mus musculus) has been disclosed (Gene ID: 26359, RefSeq accession number: NP_001129561.1, NP_036052.2). The nucleotide sequence of mouse Anxa10 gene has been disclosed (RefSeq accession number: NM_011922.3, NM_001136089.2).
Ａｎｘａ１０遺伝子としては、例えば、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれか一つのアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。
（ａ）配列番号３で表されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号３で表されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されているアミノ酸配列、或いは、
（ｃ）配列番号３で表されるアミノ酸配列と同一性が８０％以上であるアミノ酸配列
Examples of the Anxa10 gene include a gene encoding a protein having any one of the following amino acid sequences (a) to (c).
(A) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 (b) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, wherein 1 to several amino acids are deleted, substituted or added, or
(C) an amino acid sequence having 80% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3
ここで、欠失、置換、又は付加されていてもよいアミノ酸の数としては、１〜３０個が好ましく、１〜２０個が好ましく、１〜１０個が好ましく、１〜７個がより好ましく、１〜５個がさらに好ましく、１〜３個が特に好ましく、１〜２個が最も好ましい。
ここで、配列番号１で表されるアミノ酸配列との同一性としては、８０％以上が好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がさらに好ましく、９５％以上が特に好ましく、９８％以上が最も好ましい。アミノ酸配列の同一性は、例えば、ＢＬＡＳＴ（参照URL：http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）により求めることができる。
Here, the number of amino acids that may be deleted, substituted, or added is preferably 1 to 30, preferably 1 to 20, preferably 1 to 10, more preferably 1 to 7, 1 to 5 is more preferable, 1 to 3 is particularly preferable, and 1 to 2 is most preferable.
Here, the identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is preferably 80% or more, more preferably 85% or more, further preferably 90% or more, particularly preferably 95% or more, and 98% or more. Most preferred. The identity of amino acid sequences can be determined by, for example, BLAST (reference URL: http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
本発明のモデル動物となる任意の非ヒト哺乳動物が有するＡｎｘａ１０遺伝子が公知である場合は、その情報に基づき本発明のモデル動物となる非ヒト哺乳動物のＡｎｘａ１０の配列を選択することができる。例えばラットのＡｎｘａ１０遺伝子ホモログの配列は公知である（RefSeq accession number： XR_596427.1, XM_008771200.1, NM_001109110.1, NP_001102580.1）。本発明のモデル動物となる任意の非ヒト哺乳動物が有するＡｎｘａ１０遺伝子が公知ない場合であっても、当業者であれば、対象の非ヒト哺乳動物のＡｎｘａ１０の配列を選択することができる。 When the Anxa10 gene possessed by any non-human mammal that is a model animal of the present invention is known, the sequence of Anxa10 of the non-human mammal that is the model animal of the present invention can be selected based on that information. For example, the sequence of the rat Anxa10 gene homolog is known (RefSeq accession number: XR_596427.1, XM_008771200.1, NM_001109110.1, NP_001102580.1). Even if the Anxa10 gene possessed by any non-human mammal that is a model animal of the present invention is not known, those skilled in the art can select the sequence of Anxa10 of the subject non-human mammal.
ＡＮＸＡ１０タンパク質の機能が喪失しているとは、ＡＮＸＡ１０タンパク質が本来有する機能が完全に失われている状態のことをいう。ＡＮＸＡ１０タンパク質の機能が抑制されているとは、ＡＮＸＡ１０タンパク質が本来有する機能が部分的に失われている状態のことをいう。ＡＮＸＡ１０タンパク質が本来有する機能が部分的に失われている場合には、ＡＮＸＡ１０タンパク質の機能の抑制の程度は、モデル動物と、モデル動物となる動物の野生型の動物等のコントロールとなる動物とを比較して、モデル動物に行動障害と認められる状態（コントロールとの差異）が表れる程度であればよい。 The loss of the function of the ANXA10 protein means a state in which the function inherent to the ANXA10 protein is completely lost. The function of the ANXA10 protein being suppressed refers to a state in which the function inherent to the ANXA10 protein is partially lost. When the function inherent to the ANXA10 protein is partially lost, the degree of suppression of the function of the ANXA10 protein is determined between the model animal and an animal serving as a control, such as a wild-type animal. In comparison, it is sufficient that the model animal exhibits a state that is recognized as a behavioral disorder (difference from the control).
行動障害と認められる状態の指標としては、注意欠陥、衝動性、多動性が挙げられ、なかでも多動性を行動障害と認められる状態の指標とすることが好ましい。多動性の確認は、上述のＳＰＯＣＫ３タンパク質について説明したものと同様の方法で行うことができる。 As an index of a state recognized as a behavioral disorder, attention deficit, impulsivity, and hyperactivity may be mentioned, and among them, hyperactivity is preferably used as an index of a state recognized as a behavioral disorder. The confirmation of hyperactivity can be performed by the same method as described for the SPOCK3 protein.
ＡＮＸＡ１０タンパク質の機能の抑制又は喪失は、Ａｎｘａ１０遺伝子の発現能が抑制もしくは喪失することによっても生じ得る。Ａｎｘａ１０遺伝子の発現能が喪失しているとは、モデル動物となる動物において、Ａｎｘａ１０遺伝子産物が喪失していることをいう。Ａｎｘａ１０遺伝子の発現能が抑制しているとは、モデル動物となる動物の野生型の動物等のコントロールとなる動物と比較して、Ａｎｘａ１０遺伝子産物の量が抑制されていることをいう。Ａｎｘａ１０遺伝子産物の量が抑制されている場合には、抑制の程度は、モデル動物となる動物の野生型の動物等のコントロールとなる動物と比較して、上記に示すようなジャンピング等の行動異常が表れる程度であればよい。Ａｎｘａ１０遺伝子の発現の抑制は、Ａｎｘａ１０伝子に対するＲＮＡｉ誘導性核酸、アンチセンス核酸、アプタマー若しくはリボザイムなどの発現を生じさせる核酸配列をモデル動物に導入し、遺伝子ノックダウンにより生じさせることができる。 Suppression or loss of the function of ANXA10 protein can also be caused by suppression or loss of the ability to express the Anxa10 gene. The loss of the expression ability of the Anxa10 gene means that the Anxa10 gene product has been lost in the animal to be a model animal. The expression of the Anxa10 gene being suppressed means that the amount of the Anxa10 gene product is suppressed as compared to a control animal such as a wild-type animal of a model animal. In the case where the amount of the Anxa10 gene product is suppressed, the degree of suppression is a behavioral abnormality such as jumping as described above compared to a control animal such as a wild type animal of a model animal. It is sufficient that the value appears. The suppression of the expression of the Anxa10 gene can be caused by gene knockdown by introducing a nucleic acid sequence that causes the expression of an RNAi-inducible nucleic acid, antisense nucleic acid, aptamer or ribozyme to the Anxa10 gene into a model animal.
Ａｎｘａ１０遺伝子の発現が抑制若しくは喪失している、又は前記Ａｎｘａ１０遺伝子がコードするＡＮＸＡ１０タンパク質の機能が抑制若しくは喪失は、Ａｎｘａ１０遺伝子又はＡｎｘａ１０遺伝子の発現調節領域に変異が導入されたことによるものであることが好ましい。 The Anxa10 gene expression is suppressed or lost, or the function of the ANXA10 protein encoded by the Anxa10 gene is suppressed or lost due to the introduction of a mutation in the Anxa10 gene or the Anxa10 gene expression regulatory region. Is preferred.
上記Ａｎｘａ１０遺伝子とは、ＡＮＸＡ１０タンパク質をコードする領域であるエクソンのほか、Ａｎｘａ１０遺伝子の発現を抑制若しくは喪失させる、又は前記Ａｎｘａ１０遺伝子がコードするＡＮＸＡ１０タンパク質の機能を抑制若しくは喪失させることができる場合にはイントロンも含まれる。
Ａｎｘａ１０遺伝子の発現調節領域とは、Ａｎｘａ１０遺伝子の発現を調節する領域であって、例えば、プロモーター、サイレンサー、エンハンサー、応答配列である。
The above Anxa10 gene is an exon that is a region encoding the ANXA10 protein, and can suppress or lose the expression of the Anxa10 gene, or can suppress or lose the function of the ANXA10 protein encoded by the Anxa10 gene. Introns are also included.
The expression control region of the Anxa10 gene is a region that regulates the expression of the Anxa10 gene, and is, for example, a promoter, a silencer, an enhancer, or a response element.
ＡＮＸＡ１０タンパク質の機能の喪失は、例えばＡｎｘａ１０遺伝子に変異を導入し、Ａｎｘａ１０遺伝子を破壊することにより生じさせることができる。Ａｎｘａ１０遺伝子の発現能の抑制又は喪失は、例えば、Ａｎｘａ１０遺伝子の発現調節領域に変異を導入するすることにより生じさせることができる。
Ａｎｘａ１０遺伝子又はＡｎｘａ１０遺伝子の発現調節領域に変異を導入する方法は、公知の遺伝子工学的手法である遺伝子改変により行うことができる。変異は、Ａｎｘａ１０遺伝子又はＡｎｘａ１０遺伝子の発現調節領域における一部又は全部の欠失、置換、任意の配列の挿入等により生じさせることができる。これらの変異を導入することは、例えば、変異原性物質（Mutagen）による処理、紫外線照射、相同組み換え技術等による遺伝子ターゲッティング、遺伝子ノックアウト、遺伝子ノックダウン、Cre-loxP系等による条件的ノックアウト等の手法を用いて行うことができる。
The loss of the function of the ANXA10 protein can be caused by, for example, introducing a mutation into the Anxa10 gene and destroying the Anxa10 gene. The suppression or loss of the expression ability of the Anxa10 gene can be caused, for example, by introducing a mutation into the expression regulatory region of the Anxa10 gene.
The method for introducing mutation into the Anxa10 gene or the expression regulatory region of the Anxa10 gene can be performed by genetic modification, which is a known genetic engineering technique. The mutation can be caused by partial or complete deletion, substitution, insertion of an arbitrary sequence, or the like in the Anxa10 gene or the expression control region of the Anxa10 gene. Introduction of these mutations includes, for example, treatment with mutagens (Mutagen), UV irradiation, gene targeting by homologous recombination technology, gene knockout, gene knockdown, conditional knockout by Cre-loxP system, etc. This can be done using techniques.
変異により、Ａｎｘａ１０遺伝子の発現を抑制若しくは喪失したか、又は前記Ｓｐｏｃｋ３遺伝子がコードするＡＮＸＡ１０タンパク質の機能を抑制若しくは喪失したかどうかは、例えば、本発明に係るモデル動物を、Ａｎｘａ１０遺伝子における全部の欠失をホモで有するモデル生物と、及び野生型などのコントロールとなる動物と、表現型やＡｎｘａ１０の発現量を比較することを、ひとつの指標とすることができる。 Whether the expression of the Anxa10 gene was suppressed or lost due to the mutation, or whether the function of the ANXA10 protein encoded by the Spock3 gene was suppressed or lost, for example, the model animal according to the present invention can be treated as a whole in the Anxa10 gene. Comparing the model organism having the homozygous homology with the control animal such as the wild type with the expression level of phenotype and Anxa10 can be used as one index.
非ヒト哺乳動物としては、特に制限されないが、げっ歯類に分類される動物であることが好ましい。非ヒト哺乳動物としては、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ヤギ、ブタ、イヌ、ネコが挙げられる。
非ヒト哺乳動物がマウスである場合、多動性の観点から、後述する実施例に示すように、本発明のモデル動物となる動物はＣ３Ｈ系統のマウス又はＣ３Ｈ系統から作出されたマウスであることが特に好ましい。Ｃ３Ｈ系統の他にも、Ｃ３Ｈ系統の親系統であるＢＡＬＢ/ｃ系統とＤＢＡ系統、そしてＣ３Ｈ系統と同じ親系統から作出されたＣＢＡ系統、さらにオープンフィールド内で高頻度に動き回る行動傾向を示す１２９Ｔ１/ＳｖＪ系統、ＦＶＢ/ＮＪ系統のマウス、又はこれらの系統から作出されたマウスでも多動性行動を示しやすい傾向が予測されるので（参考文献、Crawley, J.N. (2007) What’s wrong withmy mouse? : behavioral phenotyping of transgenic and knockout mice. Chapter 4. Motor Functions. p63-84. John Wiley, Hoboken, N.J.）、これらの系統のマウスも、Ｃ３Ｈ系統のマウスと同様に、本発明のモデル動物となる好ましい動物として例示できる。
上記Ｃ３Ｈ系統、ＢＡＬＢ/ｃ系統、ＤＢＡ系統、ＣＢＡ系統、１２９Ｔ１/ＳｖＪ系統、又はＦＶＢ/ＮＪ系統のマウスから作出されたマウスとしては、上記系統のマウスと別の系統マウスとの雑種マウス、戻し交配等により変異アリルが導入された上記系統のマウスがレシピエントのコンジェニック系統マウス、上記系統のマウスと他の系統を交配させて得られた雑種兄妹同士のハイブリッドレコンビナント近交系マウスを好ましいものとして例示できる。
なかでも、Ｃ３Ｈ系統マウスと別の系統マウスとの雑種マウス、変異アリルをＣ３Ｈ系統に戻し交配により導入したＣ３Ｈコンジェニック系統マウス、Ｃ３Ｈ系統と他の系統を交配させて得られた雑種兄妹どうしのハイブリッドレコンビナント近交系マウス、又はＣ３Ｈ系統と上記の系統を交配させて得られた雑種兄妹どうしのハイブリッドレコンビナント近交系マウスであることがより好ましい。他の系統としては、発生工学的手法を用いてモデル動物を作出する制約上、適切な系統を適宜選択すればよいが、例えば、後述する実施例に示すように、Ｃ５７ＢＬ／６系統が挙げられ、Ｃ３Ｈ系統マウスとＣ５７ＢＬ／６系統のマウスとの雑種マウス、及び上記系統のマウスとＣ５７ＢＬ／６系統のマウスを交配させて得られた雑種兄妹同士のハイブリッドレコンビナント近交系マウスであることが更に好ましい。
上記コンジェニック系統のマウスとしては、変異アリル導入のための戻し交配を１〜３０世代以上行ったものが好ましく、８〜３０世代繰り返したものがより好ましい。また、上記雑種兄妹どうしのハイブリッドレコンビナント近交系のマウスとしては、兄妹交配を６世代以上くり返したのものが好ましく、８〜３０世代繰り返したものがより好ましい。
Although it does not restrict | limit especially as a non-human mammal, It is preferable that it is an animal classified into a rodent. Non-human mammals include mice, rats, guinea pigs, hamsters, rabbits, goats, pigs, dogs and cats.
When the non-human mammal is a mouse, from the viewpoint of hyperactivity, the animal to be a model animal of the present invention is a C3H strain mouse or a mouse produced from the C3H strain, as shown in the examples described later. Is particularly preferred. In addition to the C3H line, BALB / c line and DBA line, which are the parent lines of the C3H line, CBA line produced from the same parent line as the C3H line, and 129T1 showing behavior tendency that moves frequently in the open field / SvJ strain, FVB / NJ strain mice, or mice generated from these strains are predicted to tend to exhibit hyperactive behavior (Reference, Crawley, JN (2007) What's wrong withmy mouse?
As a mouse generated from the mouse of the C3H strain, BALB / c strain, DBA strain, CBA strain, 129T1 / SvJ strain, or FVB / NJ strain, a hybrid mouse between a mouse of the strain and another strain, Mice with the above-mentioned strain introduced with mutant alleles by mating etc. are recipient congenic mice, hybrid recombinant inbred mice between hybrid siblings obtained by mating mice with other strains and other strains It can illustrate as a preferable thing.
Among them, hybrid mice of the C3H strain mice and other strains of mice, C3H congenic mouse strain introduced by backcrossed mutant alleles in C3H strains, C3H strains and hybrids siblings each other, obtained by mating the other strains More preferably, it is a hybrid recombinant inbred mouse or a hybrid recombinant inbred mouse of hybrid siblings obtained by crossing a C3H strain with the above strain. As other strains, an appropriate strain may be appropriately selected due to the restriction of creating a model animal using a developmental engineering technique. For example, the C57BL / 6 strain may be mentioned as shown in Examples described later. , Hybrid mice of C3H strain mice and C57BL / 6 strain mice, and hybrid recombinant inbred mice between hybrid siblings obtained by crossing mice of the above strains with C57BL / 6 strain mice Is more preferable.
As the mouse of the congenic strain, those obtained by performing backcrossing for introducing mutant alleles for 1 to 30 generations or more are preferable, and those obtained by repeating 8 to 30 generations are more preferable. Moreover, as a hybrid recombinant inbred mouse | mouth of the said hybrid siblings, the thing which repeated
本発明に係るモデル動物は、少なくとも多動性の行動障害の症状を示す。そのため多動性を特徴的な症状とする病気のメカニズムの解明や、その治療等に有用な物質の探索、治療方法などの開発に用いることができる。多動性はＡＤＨＤに特徴的な症状であるため、ＡＤＨＤのメカニズムの解明や、その治療等に有用な物質の探索、治療方法などの開発に用いることができる。 The model animal according to the present invention exhibits at least symptoms of hyperactive behavioral disorder. Therefore, it can be used for the elucidation of the mechanism of a disease having hyperactivity as a characteristic symptom, the search for a substance useful for the treatment, and the development of a treatment method. Since hyperactivity is a characteristic symptom of ADHD, it can be used to elucidate the mechanism of ADHD, search for substances useful for the treatment, and develop therapeutic methods.
≪スクリーニング方法≫
本発明の行動障害の予防、改善又は治療に有用な物質のスクリーニング方法は、本発明の行動障害モデル動物に被験物質を投与するものである。前記行動障害としては注意欠陥、衝動性、多動性が挙げられ、多動性が好ましい。前記行動障害はＡＤＨＤであることが好ましい。
≪Screening method≫
The method for screening a substance useful for the prevention, amelioration or treatment of behavioral disorder of the present invention is to administer a test substance to the behavioral disorder model animal of the present invention. Examples of the behavioral disorder include attention deficit, impulsivity, and hyperactivity, and hyperactivity is preferable. The behavior disorder is preferably ADHD.
発明者らは、後述する実施例において示すようにＳｐｏｃｋ３遺伝子及びＡｎｘａ１０遺伝子のノックアウトマウスが、少なくとも多動性の行動障害の症状を示すことを見出した。したがって、本発明のモデル動物は、多動性の行動障害に対する薬物効果などの個体レベルでのスクリーニングに使用することができる。 The inventors have found that the knockout mice of the Spock3 gene and the Anxa10 gene show at least symptoms of hyperactivity behavioral disorder as shown in the Examples described later. Therefore, the model animal of the present invention can be used for screening at the individual level such as drug effects on hyperactive behavioral disorders.
本発明の行動障害の予防、改善又は治療に有用な物質のスクリーニング方法は、例えば、本発明のモデル動物に被験物質を接触させ、前記被験物質が投与されたときと投与されていないときとを比較して、前記被験物質が投与されたときの前記非ヒト哺乳動物における行動障害の発症、促進、予防、抑制又は治癒を指標にして、前記被験物質を行動障害の予防、改善又は治療に有用な物質の候補物質として選択することを行ってもよい。 The method for screening a substance useful for the prevention, amelioration or treatment of the behavioral disorder of the present invention includes, for example, bringing a test substance into contact with the model animal of the present invention, and when the test substance is administered and when it is not administered. In comparison, the test substance is useful for the prevention, improvement or treatment of behavioral disorders with the onset, promotion, prevention, suppression or healing of behavioral disorders in the non-human mammal when the test substance is administered as an index May be selected as a candidate substance.
被験物質としては、特に制限はなく、例えば、ペプチド、タンパク質、低分子化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液等が挙げられる。 There is no restriction | limiting in particular as a test substance, For example, a peptide, protein, a low molecular weight compound, a synthetic compound, a fermentation product, a cell extract etc. are mentioned.
多動性は、例えば、同一条件下でモデル動物を飼育して、一定期間内にジャンピングに費やした合計時間を計測することで、評価することができる。飼育条件及びデータ取得方法は、後述する実施例と同様のものとすることができる。
飼育ケージを叩くなど、外界刺激に代表される誘発因子を与えるなど、任意の条件を付加して行動評価を行ってもよい。
Hyperactivity can be evaluated by, for example, raising a model animal under the same conditions and measuring the total time spent jumping within a certain period. Breeding conditions and data acquisition methods can be the same as in the examples described later.
The behavioral evaluation may be performed by adding arbitrary conditions such as giving an inducer typified by external stimuli such as hitting a breeding cage.
評価対象がマウスである場合、評価対象のマウスは、例えば、本発明に係るモデル動物のマウス（モデルマウス）の系統の野生型マウスであって被験物質を接触させていない野生型マウス、被験物質を接触させた野生型マウス、被験物質を接触させていないモデルマウス、被験物質を接触させたモデルマウスとすることができる。これら評価対象のマウスについて多動性を測定し、多動性の程度を比較する。 When the evaluation target is a mouse, the evaluation target mouse is, for example, a wild-type mouse of the strain of the model animal according to the present invention (model mouse), which is not contacted with a test substance, a test substance Can be a wild-type mouse that has been contacted with a mouse, a model mouse that has not been contacted with a test substance, or a model mouse that has been contacted with a test substance. Hyperactivity is measured for these mice to be evaluated, and the degree of hyperactivity is compared.
例えば、被験物質を接触させていないモデルマウスと被験物質を接触させたモデルマウスの多動性の程度を比較して、被験物質を接触させたモデルマウスの多動性が被験物質を接触させていないモデルマウスの多動性よりも抑制されていることが認められた場合、当該被験物質を多動性の予防、改善又は治療に有用な物質の候補物質として選択することができる。 For example, comparing the degree of hyperactivity in a model mouse that has not been contacted with the test substance and a model mouse that has been in contact with the test substance, the hyperactivity of the model mouse that has been in contact with the test substance is in contact with the test substance. When it is observed that the hyperactivity of the model mouse is not suppressed, the test substance can be selected as a candidate substance of a substance useful for the prevention, improvement or treatment of hyperactivity.
また例えば、被験物質を接触させていないモデルマウスと被験物質を接触させたモデルマウスの多動性の程度を比較して、被験物質を接触させたモデルマウスの多動性が被験物質を接触させていないモデルマウスの多動性よりも促進されていることが認められた場合、当該被験物質を多動性の行動異常を促進させる物質の候補物質として選択することができる。 Also, for example, comparing the degree of hyperactivity of a model mouse that is not in contact with the test substance and a model mouse that is in contact with the test substance, the hyperactivity of the model mouse that is in contact with the test substance is In the case where it is recognized that the hyperactivity of the model mouse is not accelerated, the test substance can be selected as a candidate substance for the substance that promotes hyperactivity behavioral abnormality.
本発明の行動障害の予防、改善又は治療に有用な物質のスクリーニング方法により選択された物質は、行動障害の予防、改善又は治療に有用な物質の候補物質として利用できる。 Substances selected by the screening method for substances useful for the prevention, improvement or treatment of behavioral disorders of the present invention can be used as candidate substances for substances useful for the prevention, improvement or treatment of behavioral disorders.
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES Next, although an Example is shown and this invention is demonstrated further in detail, this invention is not limited to a following example.
＜Ｓｐｏｃｋ３遺伝子欠損マウスの作出＞
以下の文献（Yamamoto, A., Uchiyama, K., Nara, T., Nishimura, N., Hayasaka, M., Hanaoka, K. and Yamamoto, T. (2014). Structural abnormalities of corpus callosum and cortical axonal tracts accompanied by decreased anxiety-like behavior and lowered sociability in Spock3-mutant mice. Dev Neurosci. 及びUchiyama, K., Watanabe, D., Hayasaka, M. and Hanaoka, K. (2014). A novel imprinted transgene located near a repetitive element that exhibits allelic imbalance in DNA methylation during early development. Dev Growth Differ.）に記載の方法により、Ｃ５７ＢＬ/６ × Ｃ３Ｈのハイブリッドの受精卵にトランスジーンを導入し、複数のトランスジェニックマウスを得た。この中からトランスジーンを発現するものを選抜したところ1個体だけであった。この個体をＣ５７ＢＬ/６ × Ｃ３Ｈのハイブリッドと交配し、これにより得られたトランスジーンヘテロ接合型兄妹どうしを交配して、トランスジーンホモ接合型の個体を得た。さらに、ホモ接合型個体どうしを少なくとも１０世代以上兄妹交配してC57BL/6 × C3H のハイブリッドレコンビナント系統を作出した。このハイブリッドレコンビナント系統のゲノムにおいて、トランスジーンが組み込まれた領域の塩基配列を明らかにしたところ、８番染色体上で隣接しているＳｐｏｃｋ３遺伝子及びＡｎｘａ１０遺伝子が、トランスジーンの組み込みにより同時にノックアウトされた二重ノックアウトホモ接合体であることが判明した。したがって、上記ホモ接合型のマウス及び上記ヘテロ接合型のマウスの遺伝的背景はＣ５７ＢＬ/６ × Ｃ３Ｈ のハイブリッドに由来する交雑型近交系の遺伝的背景である。
<Production of Spock3 gene-deficient mice>
The following references (Yamamoto, A., Uchiyama, K., Nara, T., Nishimura, N., Hayasaka, M., Hanaoka, K. and Yamamoto, T. (2014). Structural abnormalities of corpus callosum and cortical axonal tracts accompanied by decreased anxiety-like behavior and lowered sociability in Spock3-mutant mice.Dev Neurosci. and Uchiyama, K., Watanabe, D., Hayasaka, M. and Hanaoka, K. (2014) .A novel imprinted transgene located near a repetitive element that exhibits allele imbalance in DNA methylation during early development. Dev Growth Differ.), a transgene was introduced into a fertilized egg of a C57BL / 6 × C3H hybrid to obtain a plurality of transgenic mice. . Of these, only one individual was selected from those expressing the transgene. This individual was crossed with a C57BL / 6 × C3H hybrid, and the resulting transgene heterozygous siblings were mated to obtain a transgene homozygous individual. In addition, at least 10 generations of siblings were crossed with homozygous individuals to create a C57BL / 6 x C3H hybrid recombinant line. In the genome of this hybrid recombinant strain, the nucleotide sequence of the region into which the transgene was integrated was clarified. As a result, the adjacent Spock3 gene and Anxa10 gene on
図１は、マウスゲノム上のトランスジーンの導入部分と、それに伴う欠失部分を模式的に示す図である。図１に示すように、トランスジーンの導入により、Ａｎｘａ１０のＥｘｏｎ１と制御領域、Ｓｐｏｃｋ３のＥｘｏｎ１〜４及び制御領域が欠失していた。ＳＰＯＣＫ３のアミノ酸配列を配列番号１に示し、Ｓｐｏｃｋ３のｃＤＮＡの塩基配列を配列番号２に示す。マウスのＳｐｏｃｋ３にはNM_001252620.1とNM_001252621.1で登録されている２種のアイソフォームがあることが知られており、上記に示す配列番号１は、NM_001252620.1の配列である。ＡＮＸＡ１０のアミノ酸配列を配列番号３に示し、Ａｎｘａ１０のｃＤＮＡの塩基配列を配列番号４に示す。なお、転写調節領域を含むＳｐｏｃｋ１及びＳｐｏｃｋ２のローカスには、変異は導入されていなかった。 FIG. 1 is a diagram schematically showing a transgene introduction portion and a deletion portion associated therewith on a mouse genome. As shown in FIG. 1, the Exon1 and control region of Anxa10 and Exon1 to 4 and control region of Spock3 were deleted by the introduction of the transgene. The amino acid sequence of SPOCK3 is shown in SEQ ID NO: 1, and the base sequence of the Spock3 cDNA is shown in SEQ ID NO: 2. It is known that mouse Spock3 has two isoforms registered under NM_001252620.1 and NM_001252621.1. SEQ ID NO: 1 shown above is the sequence of NM_001252620.1. The amino acid sequence of ANXA10 is shown in SEQ ID NO: 3, and the nucleotide sequence of Anxa10 cDNA is shown in SEQ ID NO: 4. Note that no mutation was introduced into the locus of Spock1 and Spock2 including the transcriptional regulatory region.
（試験例１）
得られたホモ接合型マウスについて、以下の条件にて行動実験を行った。
・週齢：６週齢
・飼育条件（離乳後〜６週齢）：室温２３度、湿度５０％、明期８：００〜２０：００（上記時間以外は暗期）
・観察条件：夜間（暗期）、室温２３度、湿度５０％、同一のケージに５〜８個体を共存させてビデオ撮影を行った。
・多動性評価方法：３分間の観察中にジャンピングをしていた時間の割合。ここでジャンピングとは、マウスが後肢だけで直立した状態から、後肢を使って床敷を蹴って上方に向かって跳び上がる行動とした。
(Test Example 1)
The obtained homozygous mice were subjected to behavioral experiments under the following conditions.
-Week age: 6 weeks-Breeding conditions (after weaning to 6 weeks old): room temperature 23 degrees, humidity 50%, light period 8:00 to 20:00 (dark period other than the above time)
Observation conditions: Night (dark period), room temperature 23 degrees, humidity 50%, 5-8 individuals were allowed to coexist in the same cage, and video shooting was performed.
・ Hyperactivity evaluation method: Ratio of time during which jumping was performed during observation for 3 minutes. Here, jumping is defined as an action in which the mouse jumps upward by kicking the floor with the hind limbs from a state where the mouse is upright only.
（試験例２）
得られたヘテロ接合型マウスについて、以下の条件にて行動実験を行った。
・週齢：５週齢
・飼育条件（離乳後〜５週齢）：上記ホモ接合型マウスでの行動実験と同様
・観察条件：上記ホモ接合型マウスでの行動実験と同様
・多動性評価方法：１５分間の観察中にジャンピングをしていた時間の割合。ここでジャンピングとは、マウスが後肢だけで直立した状態から、後肢を使って床敷を蹴って上方に向かって跳び上がる行動とした。
(Test Example 2)
The obtained heterozygous mice were subjected to behavioral experiments under the following conditions.
-Week age: 5 weeks old-Breeding conditions (after weaning to 5 weeks old): Same as behavioral experiment in the homozygous mouse-Observation conditions: Same as behavioral experiment in the homozygous mouse-Evaluation of hyperactivity Method: Percentage of time jumping during 15 minutes of observation. Here, jumping is defined as an action in which the mouse jumps upward by kicking the floor with the hind limbs from a state where the mouse is upright only.
（試験例３）
得られたホモ接合型マウス（上記試験例１とは別個体のマウス）について、週齢を７週齢とした以外は、上記試験例１と同様にして、行動実験を行った。
(Test Example 3)
About the obtained homozygous mouse | mouth (a mouse | mouth different from the said test example 1), the behavioral experiment was done like the said test example 1 except the age of the week having been 7 weeks old.
（試験例４）
得られたヘテロ接合型マウス（上記試験例２とは別個体のマウス）について、週齢を９週齢とした以外は、上記試験例２と同様にして、行動実験を行った。
(Test Example 4)
About the obtained heterozygous mouse | mouth (a mouse | mouth different from the said test example 2), the behavioral experiment was done like the said test example 2 except having made the week age 9 weeks old.
（比較試験例１）
野生型マウスとして、Ｃ５７ＢＬ／６系統のマウスについて行動実験を行った。週齢を１２週齢とした以外は、上記試験例２と同様にして行動実験を行った。
(Comparative Test Example 1)
As wild type mice, behavioral experiments were conducted on C57BL / 6 strain mice. A behavioral experiment was performed in the same manner as in Test Example 2 except that the age was 12 weeks.
（比較試験例２）
野生型マウスとして、１２９Ｔ１／ＳｖＪ系統のマウスについて行動実験を行った。週齢を１３週齢とした以外は、上記試験例２と同様にして行動実験を行った。
(Comparative Test Example 2)
As wild type mice, behavioral experiments were conducted on mice of the 129T1 / SvJ strain. A behavioral experiment was performed in the same manner as in Test Example 2 except that the age was 13 weeks.
結果を図２〜図４に示す。
図２（ａ）は、試験例１のホモ接合型マウスのジャンピング時間の割合を示すグラフである。図３（ａ）は、試験例３のホモ接合型マウスのジャンピング時間の割合を示すグラフである。
ホモ接合型マウスの半数以上が著しい多動性を示すことが単純な目視だけで確認できた。ホモ接合型マウスのうち、多動性を示さない個体においても落ち着きのない性急な様子が観察され、これらの個体では、軽度の誘発因子を与えるだけで多動性を引き起こすことが可能であると推測される。
The results are shown in FIGS.
FIG. 2A is a graph showing the jumping time ratio of the homozygous mouse of Test Example 1. FIG. FIG. 3A is a graph showing the jumping time ratio of the homozygous mouse of Test Example 3. FIG.
It was confirmed by simple visual observation that more than half of the homozygous mice showed marked hyperactivity. Among the homozygous mice, even in individuals that do not exhibit hyperactivity, a steep and steady state is observed, and in these individuals it is possible to cause hyperactivity only by giving a mild inducer Guessed.
図２（ｂ）は、試験例２のヘテロ接合型マウスのジャンピング時間の割合を示すグラフである。図３（ｂ）は、試験例４のヘテロ接合型マウスのジャンピング時間の割合を示すグラフである。
試験例２のヘテロ接合型マウスにおいて、７個体のうち２個体がジャンピングを行ったことが確認できた。試験例４のヘテロ接合型マウスにおいても、６個体のうち３個体がジャンピングを行ったことが確認できた。ジャンピングは通常野生型では観察されない行動であることから、ヘテロ接合型マウスでも、僅かながら多動性を示すことが確認できた。ただし、それは上記のホモ接合型マウスであるＳｐｏｃｋ３ノックアウトマウスで見られたように、連続してジャンピングするものではなかった。
FIG. 2B is a graph showing the jumping time ratio of the heterozygous mouse of Test Example 2. FIG. 3B is a graph showing the jumping time ratio of the heterozygous mouse of Test Example 4.
In the heterozygous mouse of Test Example 2, it was confirmed that 2 out of 7 individuals jumped. In the heterozygous mouse of Test Example 4, it was confirmed that 3 out of 6 individuals jumped. Since jumping is a behavior that is not normally observed in the wild type, it was confirmed that even in the heterozygous mouse, hyperactivity was slightly exhibited. However, it did not jump continuously as seen in the Spock3 knockout mouse, which is a homozygous mouse as described above.
図４（ａ）は、比較試験例１の野生型マウスのジャンピング時間の割合を示すグラフである。図４（ｂ）は、比較試験例２の野生型マウスのジャンピング時間の割合を示すグラフである。
図４（ａ）及び図４（ｂ）のグラフに示すように、野生型マウスではジャンピングが観察されなかった。
FIG. 4A is a graph showing the jumping time ratio of the wild-type mouse of Comparative Test Example 1. FIG. 4B is a graph showing the jumping time ratio of the wild-type mouse of Comparative Test Example 2. FIG.
As shown in the graphs of FIGS. 4 (a) and 4 (b), no jumping was observed in the wild type mice.
現在行われているマウス行動実験は、目視による単純な観察だけでは気づくことのできない行動異常を検出できる点で優れたものである。しかしながら、その優れた感度を得るためには、被験マウスを、試験者をも含めた実験環境に馴らすために時間と用意周到な手間のかかる準備が必要である(Crawley, 2007)。したがって様々な構造を持つ化合物群の神経薬理的な効果を大規模スクリーニングするなどの評価実験に組み込むには不向きな解析方法である。 Current mouse behavior experiments are excellent in that they can detect behavioral abnormalities that cannot be noticed by simple visual observation. However, in order to obtain the excellent sensitivity, time and preparation are required to adjust the test mouse to the experimental environment including the tester (Crawley, 2007). Therefore, this analysis method is unsuitable for incorporation into evaluation experiments such as large-scale screening of neuropharmacological effects of compound groups having various structures.
対して、本発明に係る行動障害モデル動物を被験マウスに使用することで、目視だけで薬理効果を評価できる行動実験が可能となった。上記のトランスジェニックマウス系統では、繁殖維持が簡単な上に、ホモ個体の半数以上が著しい多動性を示すことが単純な目視だけで確認できる。
したがって、本発明に係るスクリーニング方法は、一つの化合物につき少数の個体に投与するだけで多動性行動に影響を与えるかどうかを評価可能な、大変に優れた方法である。
On the other hand, by using the behavioral disorder model animal according to the present invention as a test mouse, a behavioral experiment that can evaluate a pharmacological effect only by visual observation becomes possible. In the above-described transgenic mouse strain, it is easy to maintain the breeding, and it can be confirmed by simple visual observation that more than half of the homo individuals show remarkable hyperactivity.
Therefore, the screening method according to the present invention is a very excellent method capable of evaluating whether or not the hyperactivity behavior is affected only by administering one compound to a small number of individuals.
また、上記試験例２及び試験例４のヘテロ変異マウスは、野生型と比較して明らかな多動性を示すことが判明した。当該ヘテロ変異マウスは、ホモ変異マウスの個体に比べて脳組織がより野生型に近い状態であると考えられる。ヘテロ変異マウスを使用する本発明に係るスクリーニング方法は、そのような脳に対しても多動性行動に影響を与える物質を検索可能な、非常に有用な方法である。 Moreover, it turned out that the heterozygous mutant mouse | mouth of the said test example 2 and the test example 4 shows clear hyperactivity compared with a wild type. Such heterozygous mutant mice are considered to have a brain tissue closer to the wild type than homozygous mutant mice. The screening method according to the present invention using heterozygous mutant mice is a very useful method capable of searching for substances that affect hyperactive behavior even in such a brain.
以上で説明した各実施形態における各構成及びそれらの組み合わせ等は一例であり、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で、構成の付加、省略、置換、およびその他の変更が可能である。 The configurations and combinations thereof in the embodiments described above are examples, and the addition, omission, replacement, and other modifications of the configurations can be made without departing from the spirit of the present invention.
Claims (8)
前記Ｓｐｏｃｋ３遺伝子又は前記Ｓｐｏｃｋ３遺伝子の発現調節領域に変異が導入された非ヒト動物であり、
前記非ヒト動物がマウスであり、前記マウスの遺伝的背景が、Ｃ３Ｈ、Ｃ３Ｈコンジェニック系統、Ｃ５７ＢＬ/６ × Ｃ３Ｈの雑種、及びＣ５７ＢＬ/６ × Ｃ３Ｈの雑種に由来する交雑型近交系からなる群から選ばれ、多動性の行動障害の症状を示すことを特徴とする多動性障害モデル動物。 The expression of the Spock3 gene is suppressed or lost, or the function of the SPOCK3 protein encoded by the Spock3 gene is suppressed or lost ,
A non-human animal having a mutation introduced into the Spock3 gene or the expression regulatory region of the Spock3 gene;
The non-human animal is a mouse, and the genetic background of the mouse consists of a C3H, C3H congenic strain, a C57BL / 6 × C3H hybrid, and a hybrid inbred line derived from a C57BL / 6 × C3H hybrid A model animal for hyperactivity disorder, which is selected from the group and exhibits symptoms of hyperactivity behavioral disorder .
前記Ｓｐｏｃｋ３遺伝子又は前記Ｓｐｏｃｋ３遺伝子の発現調節領域に変異が導入されたマウスであり、A mouse having a mutation introduced into the Spock3 gene or the expression regulatory region of the Spock3 gene;
前記マウスの遺伝的背景が、Ｃ３Ｈ、Ｃ３Ｈコンジェニック系統、Ｃ５７ＢＬ/６ × Ｃ３Ｈの雑種、及びＣ５７ＢＬ/６ × Ｃ３Ｈ の雑種に由来する交雑型近交系からなる群から選ばれ、多動性の行動障害の症状を示す前記マウスを、多動性モデル動物として使用する方法。The genetic background of the mice is selected from the group consisting of C3H, C3H congenic strains, C57BL / 6 × C3H hybrids, and hybrid inbred lines derived from C57BL / 6 × C3H hybrids, A method of using the mouse exhibiting a symptom of behavioral disorder as a hyperactivity model animal.
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