JP5978175B2 - Method for solubilizing plant tissue and mixed enzyme preparation - Google Patents
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Description
本発明は、植物組織の可溶化方法及び混合酵素製剤に関する。 The present invention relates to a plant tissue solubilization method and a mixed enzyme preparation.
植物にセルラーゼ等の酵素を作用させて植物組織を可溶化することにより、植物の食味
の改善（例えば渋みや苦みの低減等）や植物繊維の有効利用が図られている（例えば、特
許文献１、特許文献２参照）。
セルラーゼ製剤で植物組織を可溶化する際、植物組織の可溶化の難易は、植物組織の種
類、生育状況等で異なるが、実際には困難な場合が多い。その主な要因は、植物の構成成
分に起因する。
Improvement of plant taste (for example, reduction of astringency and bitterness) and effective utilization of plant fibers have been attempted by solubilizing plant tissues by causing enzymes such as cellulase to act on plants (for example, Patent Document 1). , See Patent Document 2).
When solubilizing a plant tissue with a cellulase preparation, the difficulty of solubilizing the plant tissue varies depending on the type of plant tissue, the growth state, etc., but it is often difficult in practice. The main factor is attributed to the components of the plant.
セルラーゼ製剤で植物組織の崩壊、可溶化を行う場合、まず、細胞を相互に接着してい
るプロトペクチン、ヘミセルロース等を細胞分離酵素（ペクチナーゼ、ヘミセルラーゼな
ど）で分解し単細胞化する。その細胞壁の全表面を露出させた後、セルロース等で構成さ
れた細胞壁をセルラーゼ製剤で分解し、内容物を溶出させる方法が基本的な可溶化方法で
ある。この可溶化方法で比較的容易に可溶化できるのは、軟質の植物繊維に限られる。多
くの植物繊維は可溶化しにくい。固い植物組織は、セルラーゼ製剤に対し抵抗性を示す。
その主な理由は、セルロースやヘミセルロースで構成される細胞壁や細胞間物質がプロト
リグニン等の芳香族化合物で包埋されて難分解性化合物になっていて、酵素作用を阻害す
るためである。
When disintegrating or solubilizing plant tissues with cellulase preparations, first, protopectin, hemicellulose, etc., which adhere cells to each other, are degraded by cell separation enzymes (pectinase, hemicellulase, etc.) to become single cells. The basic solubilization method is to expose the entire surface of the cell wall, then decompose the cell wall composed of cellulose or the like with a cellulase preparation and elute the contents. Only soft plant fibers can be solubilized relatively easily by this solubilization method. Many plant fibers are difficult to solubilize. Hard plant tissue is resistant to cellulase preparations.
The main reason is that cell walls and intercellular substances composed of cellulose and hemicellulose are embedded with an aromatic compound such as protolignin to become a hardly decomposable compound, and inhibit the enzyme action.
また、セルラーゼ製剤で木材等のセルロース系原料を糖化する際、リグニン等により酵
素作用が阻害される要因を除去するため、前処理が行われる（例えば、非特許文献１、非
特許文献２参照）。前処理の方法は化学的方法や物理的方法あるいは微生物的方法が利用
されるが、いずれの方法も一長一短があり有効な方法はまだ確立されていない。また前処
理にコストがかかるのも問題となっている。
Moreover, when saccharifying a cellulosic raw material such as wood with a cellulase preparation, pretreatment is performed in order to remove the factor that inhibits the enzyme action by lignin or the like (see, for example, Non-Patent Document 1 and Non-Patent Document 2). . As a pretreatment method, a chemical method, a physical method, or a microbial method is used. However, each method has advantages and disadvantages, and an effective method has not been established yet. Another problem is that the pre-processing costs are high.
本発明の目的は、セルラーゼを用いた植物組織の可溶化方法において、前処理にコスト
をかけることなく、セルラーゼの分解力を高めることによって植物組織を効率的に可溶化
できる方法を提供することにある。また、植物組織に作用させて植物組織を可溶化するた
めの混合酵素製剤であって、前処理にコストをかけることなく、セルラーゼの分解力を高
めることによって植物組織を効率的に可溶化できる混合酵素製剤を提供することにある。
An object of the present invention is to provide a method for efficiently solubilizing plant tissue by increasing the degradability of cellulase without costing pretreatment in a method for solubilizing plant tissue using cellulase. is there. In addition, it is a mixed enzyme preparation for solubilizing plant tissue by acting on the plant tissue, which can efficiently solubilize the plant tissue by increasing the degradability of cellulase without costing pretreatment It is to provide an enzyme preparation.
本発明者は、上記目的を達成するため、植物組織の多様な構造を理解し、まず天然芳香
族化合物に特異性をもつ酵素製剤の検討を行った。
植物組織の基幹部分は、セルロース、ヘミセルロース、リグニンで構成され、これにタ
ンパク質、澱粉、脂質等が結合している。リグニンは、細胞間や細胞壁に沈着し、セルロ
ースやヘミセルロースと化学的に結合し物理的な強度を与えている。
ヘミセルロースは、種々の糖残基が多様な結合をしたヘテロポリマーである。セルロー
スのように規則性がなく、複雑な結合様式をしている。このセルロースやヘミセルロース
にリグニンが結合し、植物の基幹構造が形成されている。
In order to achieve the above-mentioned object, the present inventor understood various structures of plant tissues and first examined enzyme preparations having specificity for natural aromatic compounds.
The basic part of the plant tissue is composed of cellulose, hemicellulose, and lignin, to which proteins, starch, lipids, and the like are bound. Lignin is deposited between cells and cell walls, and chemically binds to cellulose and hemicellulose to give physical strength.
Hemicellulose is a heteropolymer in which various sugar residues have various bonds. There is no regularity like cellulose, and it has a complicated bonding mode. Lignin is bonded to cellulose or hemicellulose to form a basic plant structure.
リグニンとは、その前駆体（モノリグノール）である桂皮アルコールが酵素的に脱水素
されたフェノキシラジカルが非酵素的に重合したものである。その結合様式は規則性のな
い複雑な構造であり、三次元網目構造を形成した、巨大な生体高分子である。
しかし、基本的な分子の結合のすべてがＣ６−Ｃ３単位ではなく、その結合様式もβ−
Ｏ−４型だけではなく、他の結合方法も種々存在する。この基質の多様性から、今後、色
々な基質特異性を持った酵素製剤の検討が非常に重要になる。
植物組織に広く分布するリグニン以外の天然芳香族化合物のなかで、低分子のフェノー
ル酸類は、セルロース、ヘミセルロース、ペクチン等とエステル結合をして存在するもの
も多い。これらの存在様式の詳細は不明だが、本発明者は、これをフェルラ酸エステラーゼ等のエステラーゼで加水分解することで、難分解性化合物の一角を崩し、セルラーゼ、ヘミセルラーゼの反応性が高まることを見出し、本発明を完成する
にいたった。
Lignin is a non-enzymatic polymerization of a phenoxy radical obtained by enzymatically dehydrogenating cinnamon alcohol, which is a precursor (monolignol). The binding mode is a complex structure with no regularity, and is a huge biopolymer that forms a three-dimensional network structure.
However, not all basic molecular bonds are C6-C3 units, and the mode of binding is β-
There are various other bonding methods in addition to the O-4 type. From this diversity of substrates, it will be very important to study enzyme preparations with various substrate specificities in the future.
Among natural aromatic compounds other than lignin that are widely distributed in plant tissues, many low-molecular phenolic acids exist in ester bonds with cellulose, hemicellulose, pectin, and the like. While it is unclear details of these existing modalities, the present inventors have, by hydrolyzing Re this esterase such as Fe Lula acid esterase, destroy the corner of persistent compounds, cellulase, reactive hemicellulase increases As a result, the present invention has been completed.
すなわち、本発明に係る植物組織の可溶化方法は、セルラーゼ、フェルラ酸エステラーゼ、及び、タンナーゼを順不同で順次又は同時に植物組織に作用させる植物組織の可溶化方法であって、植物組織１ｇに対し、セルラーゼを 0.126〜 126単位、フェルラ酸エステラーゼを 0.00006〜0.06単位、及び、タンナーゼを 0.002〜２単位作用させる方法である。 That is, solubilization how the plant tissue according to the present invention, cellulase, ferulic acid esterase, and a method of solubilizing a plant tissue to act sequentially or simultaneously plant tissue tannase in no particular order, the plant tissue 1g On the other hand, cellulase is 0.126 to 126 units, ferulic acid esterase is 0.00006 to 0.06 units, and tannase is 0.002 to 2 units .
また、本発明に係る混合酵素製剤は、植物組織に作用させて植物組織を可溶化するための混合酵素製剤であって、セルラーゼ、フェルラ酸エステラーゼ、及び、タンナーゼを含有し、セルラーゼ、フェルラ酸エステラーゼ、及び、タンナーゼの配合割合が、セルラーゼ 100質量部に対し、フェルラ酸エステラーゼが20〜30質量部、かつ、タンナーゼが20〜30質量部である。 The mixing enzyme preparation according to the present invention, mixed enzyme preparation der to solubilize the plant tissue to act on plant tissue, cellulase, ferulic acid esterase, and containing tannase, cellulase, ferulic The mixing ratio of acid esterase and tannase is 20-30 parts by mass of ferulic acid esterase and 20-30 parts by mass of tannase with respect to 100 parts by mass of cellulase .
本発明の植物組織の可溶化方法によれば、前処理にコストをかけることなく、植物組織を効率的に可溶化することができる。また、本発明の混合酵素製剤によれば、前処理にコストをかけることなく、植物組織を効率的に可溶化することができる。 According to the plant tissue solubilization method of the present invention, plant tissue can be efficiently solubilized without costing pretreatment. Further, according to a mixed enzyme preparation of the present invention, pre-treatment without incurring the cost, the as possible out to efficiently solubilize the plant tissue.
本発明で使用されるセルラーゼとしては、セルロースに作用するものであれば特に限定されない。微生物起源としては、バチルス サブティリス（Bacillus subtilis ）、アスペルギルス ニガー（Aspergillus niger ）、イルぺクス ラクトース（Irpex lacteus）、ヒュミクラ インソレンス（Humicura insorens ）、トリコデルマ バリデ（Trichoderma viride）、トリコデルマ リーセイ（Trichoderm reesei ）等が代表的なものである。このなかでも特に、トリコデルマ属由来のものが最適である。
通常、セルラーゼは、上記生産菌を使用して、固形培養法又は液体培養法で製造されるが、セルラーゼとしては、麹、培養液、これを精製した濃縮液又は粉末等あらゆる態様で使用することが可能である。また、市販されているセルラーゼ製剤、例えば、協和化成株式会社製セルラーゼ製剤「ＴＰ２−協和」等を使用することもできる。
The cellulase used in the present invention is not particularly limited as long as it acts on cellulose. Microbial origins include Bacillus subtilis, Aspergillus niger, Irpex lacteus, Humicra insorens, Trichoderma viride, Trichoderma ree, Trichoderma ree, etc. Is a typical one. Of these, those derived from the genus Trichoderma are particularly suitable.
Normally, cellulase is produced by the solid culture method or liquid culture method using the above-mentioned producing bacteria. Cellulase can be used in all forms such as sputum, culture solution, concentrated solution or powder obtained by purifying it. Is possible. Commercially available cellulase preparations such as cellulase preparation “TP2-Kyowa” manufactured by Kyowa Kasei Co., Ltd. can also be used.
本発明で使用されるフェルラ酸エステラーゼは、酵素の反応形式に基づくＥＣ分類では、加水分解酵素（ヒドロラーゼ）に属しエステル結合に作用する公知の酵素である。フェルラ酸エチル等に基質特異性を示す。
本発明と関係が深い参考例で使用される桂皮酸エステラーゼは、フェルラ酸エステラーゼと同じくＥＣ分類で加水分解酵素に属しエステル結合に作用する公知の酵素である。桂皮酸エチル等に基質特異性を示す。桂皮酸エチルを分解すると桂皮酸とエタノールになる。
The ferulic acid esterase used in the present invention is a known enzyme that belongs to a hydrolase (hydrolase) and acts on an ester bond in the EC classification based on the reaction form of the enzyme. Substrate specificity is shown for ethyl ferulate and the like.
Cinnamic acid esterase used in Reference Examples closely related to the present invention is a known enzyme that belongs to a hydrolase and acts on an ester bond in the EC classification like ferulic acid esterase. Shows substrate specificity to ethyl cinnamate and the like. Decomposing ethyl cinnamate becomes cinnamic acid and ethanol.
フェルラ酸エステラーゼあるいは桂皮酸エステラーゼとしては、エステル結合を有する基質に対しエステラーゼ活性を有するものであればよく、例えば、アスペルギルス属やボトリシス属等に属し、フェルラ酸エステラーゼや桂皮酸エステラーゼ生産能を有する微生物を培養に用いる培地を用い、常法にしたがって固形培養又は液体培養して得られた培養物又はその処理物があげられる。処理物としては、（１）該培養物の水抽出液、（２）液体培養濾液、（３）該水抽出液又は該液体培養液から硫安等を用いる塩析法又はアルコール等を用いる沈澱法により沈殿物を得、これを乾燥した粗酵素粉末、（４）必要によりこの粗酵素粉末から調整した精製酵素、及び、市販されるフェルラ酸エステラーゼ、桂皮酸エステラーゼ等が挙げられる。 The ferulic acid esterase or cinnamic acid esterase may be any substance that has esterase activity with respect to a substrate having an ester bond. For example, a microorganism belonging to the genus Aspergillus or Botrysis, etc. And a culture product obtained by solid culture or liquid culture according to a conventional method or a treated product thereof. The treated product includes (1) an aqueous extract of the culture, (2) a liquid culture filtrate, (3) a salting out method using ammonium sulfate or the like from the aqueous extract or the liquid culture solution, or a precipitation method using alcohol or the like. (4) A purified enzyme prepared from this crude enzyme powder if necessary, commercially available ferulic acid esterase, cinnamic acid esterase, and the like.
本発明で使用されるタンナーゼとしては、通常のタンナーゼ、例えば、没食子酸エステルを加水分解する活性を有するタンナーゼが挙げられる。具体的には、アスペルギルス属、ペニシリウム属、リゾプス属、ムコール属等に属しタンナーゼ生産能を有する微生物をこれら微生物の培養に用いられる培地を用い、常法にしたがって固体培養又は液体培養して得られた、培養物又はその処理物が挙げられる。処理物としては、（１）該培養物の水抽出液、（２）液体培養濾液、（３）該水抽出液又は該液体培養濾液から硫安等を用いる塩析法又はアルコール等を用いる沈殿法等により沈殿物を得、これを乾燥した粗酵素粉末、及び、（４）市販されているタンナーゼ製剤、例えば、キッコーマン株式会社製タンナーゼ等が挙げられる。 Examples of tannase used in the present invention include ordinary tannase, for example, tannase having an activity of hydrolyzing gallate. Specifically, a microorganism belonging to the genus Aspergillus, Penicillium, Rhizopus, Mucor, etc. and capable of producing tannase is obtained by solid culture or liquid culture according to a conventional method using a medium used for culturing these microorganisms. In addition, a culture or a processed product thereof can be mentioned. The treated product includes (1) an aqueous extract of the culture, (2) a liquid culture filtrate, (3) a salting-out method using ammonium sulfate or the like from the aqueous extract or the liquid culture filtrate, or a precipitation method using alcohol or the like. And the like, and crude enzyme powder obtained by drying the precipitate, and (4) a commercially available tannase preparation, such as tannase manufactured by Kikkoman Corporation.
上記酵素により処理される植物としては、セルロースを主体成分とする植物であればよく、例えば、茶葉、ユーカリ、ポプラ等の木の葉、根及び枝等、サツマイモ、トウモロコシ、稲、麦、豆等の蔓、茎、葉、及び、刈草等、リンゴ、ユズ、ブドウなどの果実類等が挙げられる。
これらの植物は、そのままでもよく、必要に応じて乾燥、粉砕、加熱等の前処理を施してもよい。
The plant treated with the enzyme may be a plant mainly composed of cellulose, such as tea leaves, eucalyptus, poplar leaves, roots and branches, vines such as sweet potato, corn, rice, wheat and beans. And fruits such as apples, yuzu, and grapes.
These plants may be used as they are, and may be subjected to pretreatment such as drying, pulverization, and heating as necessary.
本発明と関係が深い参考例１について説明する。上記植物に上記のセルラーゼ、フェルラ酸エステラーゼ、及び、桂皮酸エステラーゼを添加し、これら３種類の酵素を植物組織に作用させる。
これら３種類の酵素は、植物組織に別々に順次添加して作用させてもよいが、植物組織に同時に添加して作用させる方が好ましい。順次添加する場合、３種類の酵素の添加順序は順不同でよく、特に限定されないが、セルラーゼ、フェルラ酸エステラーゼ、桂皮酸エステラーゼの順で添加するのが好ましい。
Reference Example 1 that is closely related to the present invention will be described. The cellulase, ferulic acid esterase, and cinnamic acid esterase are added to the plant, and these three types of enzymes are allowed to act on the plant tissue.
These three types of enzymes may be separately added to the plant tissue and allowed to act, but it is preferable to add and act on the plant tissue simultaneously. When adding sequentially, the order of addition of the three types of enzymes may be in any order, and is not particularly limited, but it is preferable to add cellulase, ferulic acid esterase, and cinnamic acid esterase in this order.
上記の３種類の酵素を同時に添加して作用させる場合、各酵素の添加量及び酵素反応条件は、処理対象の植物の種類や酵素の形態等によっても異なるが、通常、次のようにするとよい。 When the above three types of enzymes are added and acted simultaneously, the amount of each enzyme added and the enzyme reaction conditions vary depending on the type of plant to be treated, the form of the enzyme, etc. .
セルラーゼの添加量は、植物組織１ｇに対し、 0.126〜 126単位、好ましくは、 7.2〜18単位（１単位はＣＭＣ溶液中で40℃、30分反応させたとき、１分間に１マイクロモルのグルコースを生成する酵素量）であることが好ましい。
フェルラ酸エステラーゼの添加量は、植物組織１ｇに対し、 0.00006〜0.06単位、好ましくは、 0.006〜0.0015単位（１単位は37℃の水中において１分間に１マイクロモルのフェルラ酸を生成する酵素量）であることが好ましい。
桂皮酸エステラーゼの添加量は、植物組織１ｇに対し、0.000075〜 0.075単位、好ましくは、0.0075〜 0.018単位（１単位は30℃で20分間反応させたとき、１分間に１マイクロモルの桂皮酸を生成する酵素量）であることが好ましい。
The amount of cellulase added is 0.126 to 126 units, preferably 7.2 to 18 units per 1 g of plant tissue (one unit is 1 micromole of glucose per minute when reacted at 40 ° C. for 30 minutes in a CMC solution). The amount of the enzyme that produces
The amount of ferulic acid esterase added is 0.00006 to 0.06 units, preferably 0.006 to 0.0015 units (1 unit is the amount of enzyme that produces 1 micromole of ferulic acid per minute in water at 37 ° C.) per 1 g of plant tissue. It is preferable that
The amount of cinnamic acid esterase added is 0.000075 to 0.075 units, preferably 0.0075 to 0.018 units per 1 g of plant tissue (when 1 unit is reacted at 30 ° C. for 20 minutes, 1 micromole of cinnamic acid is added per minute. The amount of enzyme produced) is preferred.
上記の３種類の酵素を同時に添加して作用させる場合の酵素反応は、従来より行われている方法に準じて行うことができ、例えば、植物に水又は水溶液を加え、そこに上記の３種類の酵素を同時に添加する方法、或いは３種類の酵素を予め混合しておき、この混合酵素と植物とを水又は水溶液に加える方法等により行うことができる。
この際の酵素反応条件は、反応温度が30〜50℃、特に40〜43℃で、反応時間が２〜50時間、特に３〜６時間であることが好ましい。水又は水溶液のｐＨは、調整しても調整しなくてもよいが、 3.0〜 7.0、特に 4.0〜 6.0に調整することが好ましい。また、反応中、攪拌しても攪拌しなくてもよい。
The enzyme reaction in the case of adding and acting on the above three types of enzymes at the same time can be carried out according to a conventional method. For example, water or an aqueous solution is added to a plant, and the above three types are added thereto. These enzymes can be added simultaneously, or three kinds of enzymes can be mixed in advance, and the mixed enzyme and plant can be added to water or an aqueous solution.
The enzyme reaction conditions in this case are preferably a reaction temperature of 30 to 50 ° C., particularly 40 to 43 ° C., and a reaction time of 2 to 50 hours, particularly 3 to 6 hours. The pH of water or an aqueous solution may or may not be adjusted, but is preferably adjusted to 3.0 to 7.0, particularly 4.0 to 6.0. Moreover, it is not necessary to stir during the reaction.
また、上記の３種類の酵素を別々に順次添加して作用させる場合は、植物に水又は水溶液を加え、そこに上記の３種類の酵素を順次添加して反応させればよく、その際の各酵素の添加量及び各酵素反応条件は次のようにするとよい。 In addition, when the above three types of enzymes are separately added and allowed to act separately, water or an aqueous solution may be added to the plant, and the above three types of enzymes may be added and reacted sequentially. The addition amount of each enzyme and each enzyme reaction condition may be as follows.
セルラーゼの添加量は、植物組織１ｇに対し、 0.126〜 126単位、好ましくは 7.2〜18単位であることが好ましい。
セルラーゼ処理に当り、反応温度は30〜50℃、特に、40〜50℃に調整することが好ましい。反応時間は２〜50時間、好ましくは３〜６時間である。また、上記水又は水溶液のｐＨは、調整しても調整しなくてもよいが、 3.0〜 7.0、特に、 4.0〜 6.0に調整することが好ましい。また、反応中、攪拌しても攪拌しなくてもよい。
The amount of cellulase added is 0.126 to 126 units, preferably 7.2 to 18 units, per 1 g of plant tissue.
In the cellulase treatment, the reaction temperature is preferably adjusted to 30 to 50 ° C, particularly 40 to 50 ° C. The reaction time is 2 to 50 hours, preferably 3 to 6 hours. The pH of the water or aqueous solution may be adjusted or not adjusted, but is preferably adjusted to 3.0 to 7.0, particularly 4.0 to 6.0. Moreover, it is not necessary to stir during the reaction.
フェルラ酸エステラーゼの添加量は、植物組織に含まれるフェルラ酸を殆ど、ないし完全に遊離するのに十分な量、例えば、植物組織１ｇに対し、 0.00006〜0.06単位、好ましくは、 0.006〜 0.015単位であることが好ましい。フェルラ酸エステラーゼ処理にあたり、反応温度は25〜60℃、特に、50〜55℃に調整することが好ましい。反応時間は１〜10時間、好ましくは２〜６時間である。また、上記水又は水溶液のｐＨは、調整しても調整しなくてもよいが、 5.0〜 8.0、特に 6.0〜 7.0に調整することが好ましい。また、反応中、攪拌しても攪拌しなくてもよい。 The amount of ferulic acid esterase added is 0.00006 to 0.06 unit, preferably 0.006 to 0.015 unit per 1 g of plant tissue, for example, an amount sufficient to completely or completely release ferulic acid contained in the plant tissue. Preferably there is. In the ferulic acid esterase treatment, the reaction temperature is preferably adjusted to 25 to 60 ° C, particularly 50 to 55 ° C. The reaction time is 1 to 10 hours, preferably 2 to 6 hours. The pH of the water or aqueous solution may be adjusted or not, but is preferably adjusted to 5.0 to 8.0, particularly 6.0 to 7.0. Moreover, it is not necessary to stir during the reaction.
桂皮酸エステラーゼの添加量は、植物組織１ｇに対し、0.000075〜 0.075単位好ましくは0.0075〜 0.018単位であることが好ましい。桂皮酸エステラーゼ処理にあたり、反応温度は30〜50℃、特に35℃〜40℃に調整することが好ましい。反応時間は１〜10時間、好ま
しくは２〜６時間である。また、ｐＨは調整しても調整しなくてもよいが、 4.5〜 6.0、特に 5.0〜 5.5に調整することが好ましい。また、反応中、攪拌しても攪拌しなくても良い。
The amount of cinnamic acid esterase added is 0.000075 to 0.075 units, preferably 0.0075 to 0.018 units, per 1 g of plant tissue. In the treatment with cinnamic acid esterase, the reaction temperature is preferably adjusted to 30 to 50 ° C, particularly 35 to 40 ° C. The reaction time is 1 to 10 hours, preferably 2 to 6 hours. The pH may or may not be adjusted, but is preferably adjusted to 4.5 to 6.0, particularly 5.0 to 5.5. Moreover, it is not necessary to stir or not during the reaction.
上記の３種類の酵素を別々に順次添加して作用させる場合、前に添加した酵素を失活させてから次の酵素を添加してもよく、前に添加した酵素を失活させずに次の酵素を添加してもよい。 When the above three types of enzymes are separately added and acted on separately, the previously added enzyme may be deactivated and then the next enzyme may be added, or the previously added enzyme may not be deactivated. The enzyme may be added.
次に、本発明と関係が深い参考例２について説明する。セルラーゼ及びフェルラ酸エステラーゼを順不同で順次又は同時に植物組織に作用させる。その他の構成は、参考例１と同様である。 Next, Reference Example 2 that is closely related to the present invention will be described. Cellulase and ferulic acid esterase are allowed to act on plant tissues sequentially or simultaneously in any order. Other configurations are the same as those in Reference Example 1 .
次に、本発明と関係が深い参考例３について説明する。セルラーゼ及び桂皮酸エステラーゼを順不同で順次又は同時に植物組織に作用させる。その他の構成は、参考例１と同様である。 Next, Reference Example 3 that is closely related to the present invention will be described. Cellulase and cinnamic esterase are allowed to act on plant tissues sequentially or simultaneously in any order. Other configurations are the same as those in Reference Example 1 .
次に、本発明の実施の一形態について説明する。セルラーゼ、フェルラ酸エステラーゼ、及び、タンナーゼを順不同で順次又は同時に植物組織に作用させる。
タンナーゼの添加量は、植物１ｇに対し、 0.002〜２単位、好ましくは、 0.2〜 0.5単位であることが好ましい。タンナーゼ処理に当たり、反応温度は30℃〜46℃、特に40℃〜42℃に調整することが好ましい。反応時間は１〜10時間、好ましくは２〜６時間である。また、ｐＨは、調整しても調整しなくてもよいが、 4.5〜 6.0、特に 5.0〜 5.5に調整することが好ましい。また、反応中、攪拌しても攪拌しなくてもよい。
その他の構成は、参考例１と同様である。
Next, an embodiment of the present invention will be described. Cellulase, ferulic acid esterase, and tannase are allowed to act on plant tissues sequentially or simultaneously in any order.
The amount of tannase added is 0.002 to 2 units, preferably 0.2 to 0.5 units, per 1 g of plant. In the tannase treatment, the reaction temperature is preferably adjusted to 30 to 46 ° C, particularly 40 to 42 ° C. The reaction time is 1 to 10 hours, preferably 2 to 6 hours. The pH may or may not be adjusted, but is preferably adjusted to 4.5 to 6.0, particularly 5.0 to 5.5. Moreover, it is not necessary to stir during the reaction.
Other configurations are the same as those in Reference Example 1 .
次に、本発明と関係が深い参考例４について説明する。セルラーゼ、桂皮酸エステラーゼ、及び、タンナーゼを順不同で順次又は同時に植物組織に作用させる。その他の構成は、上記本発明の実施の一形態と同様である。 Next, Reference Example 4 that is closely related to the present invention will be described. Cellulase, cinnamic esterase, and tannase are allowed to act on plant tissues sequentially or simultaneously in any order. Other configurations are the same as those of the embodiment of the present invention .
次に、参考例１の植物組織の可溶化方法に用いられる混合酵素製剤について説明する。
すなわち、参考例１に用いられる混合酵素製剤は、上述した３種類の酵素（セルラーゼ、フェルラ酸エステラーゼ、桂皮酸エステラーゼ）及び必要に応じてこの種の酵素製剤の製造に従来より用いられている種々の担体、賦形剤、その他の添加剤を配合して製剤化したものである。剤型は、錠剤、散剤、顆粒剤、液剤等であり、常法により製剤化することができる。
Next, a description will be given mixed enzyme preparation et al is used in method of solubilizing a plant tissue of Reference Example 1.
That is, mixed enzyme preparation is found using in Reference Example 1, three kinds of enzymes described above (cellulase, ferulic acid esterase, cinnamic acid esterase) and optionally conventionally used in the manufacture of this type of enzyme preparation It is formulated by blending various carriers, excipients and other additives. The dosage forms are tablets, powders, granules, liquids, etc., and can be formulated by conventional methods.
参考例１に用いられる混合酵素製剤において、セルラーゼ、フェルラ酸エステラーゼ及び桂皮酸エステラーゼの配合割合は、セルラーゼ 100質量部に対し、フェルラ酸エステラーゼを20〜30質量部、特に25〜27質量部とし、桂皮酸エステラーゼを20〜30質量
部、特に25〜27質量部とすることが好ましい。また、本発明の混合酵素製剤は、セルラーゼ活性が 100〜 10000単位、特に 500〜5000単位、フェルラ酸エステラーゼ活性が１〜 100単位、特に５〜50単位、及び、桂皮酸エステラーゼ活性が 1.2〜 120単位、特に６〜60
単位であることが好ましい。本発明混合製剤には、例えば、アミラーゼ、プロテアーゼ等を適宜配合してもよい。
In the mixed enzyme preparation used in Reference Example 1 , the blending ratio of cellulase, ferulic acid esterase and cinnamic acid esterase is 20 to 30 parts by weight, particularly 25 to 27 parts by weight of ferulic acid esterase with respect to 100 parts by weight of cellulase. The cinnamic acid esterase is preferably 20 to 30 parts by mass, particularly 25 to 27 parts by mass. The mixed enzyme preparation of the present invention has a cellulase activity of 100 to 10,000 units, particularly 500 to 5000 units, a ferulic acid esterase activity of 1 to 100 units, particularly 5 to 50 units, and a cinnamic acid esterase activity of 1.2 to 120. Unit, especially 6-60
Preferably it is a unit. In the mixed preparation of the present invention, for example, amylase, protease and the like may be appropriately mixed.
次に、本発明と関係が深い参考例２に用いられる混合酵素製剤について説明する。植物組織に作用させて植物組織を可溶化するための混合酵素製剤であって、セルラーゼ及びフェルラ酸エステラーゼを含有する。その他の構成は、参考例１に用いられる混合酵素製剤と同様である。 Next, the mixed enzyme preparation used in Reference Example 2 that is closely related to the present invention will be described. A mixed enzyme preparation for acting on a plant tissue to solubilize the plant tissue, which contains cellulase and ferulic acid esterase. Other configurations are the same as those of the mixed enzyme preparation used in Reference Example 1 .
次に、本発明と関係が深い参考例３に用いられる混合酵素製剤について説明する。植物組織に作用させて植物組織を可溶化するための混合酵素製剤であって、セルラーゼ及び桂皮酸エステラーゼを含有する。その他の構成は、参考例１に用いられる混合酵素製剤と同様である。 Next, the mixed enzyme preparation used in Reference Example 3 that is closely related to the present invention will be described. A mixed enzyme preparation for solubilizing a plant tissue by acting on the plant tissue, comprising cellulase and cinnamic acid esterase. Other configurations are the same as those of the mixed enzyme preparation used in Reference Example 1 .
次に、本発明の実施の一形態に用いられる混合酵素製剤について説明する。植物組織に作用させて植物組織を可溶化するための混合酵素製剤であって、セルラーゼ、フェルラ酸エステラーゼ、及び、タンナーゼを含有する。
上記本発明の実施の一形態に用いられる混合酵素製剤において、タンナーゼの配合割合は、セルラーゼ 100質量部に対し、20〜30質量部、特に25〜27質量部とすることが好ましい。
その他の構成は、参考例１に用いられる混合酵素製剤と同様である。
Next, the mixed enzyme preparation used in one embodiment of the present invention will be described. A mixed enzyme preparation for acting on a plant tissue to solubilize the plant tissue, which contains cellulase, ferulic acid esterase and tannase.
In the mixed enzyme preparation used in the embodiment of the present invention, the blending ratio of tannase is preferably 20 to 30 parts by mass, particularly 25 to 27 parts by mass with respect to 100 parts by mass of cellulase.
Other configurations are the same as those of the mixed enzyme preparation used in Reference Example 1 .
次に、参考例４に用いられる混合酵素製剤について説明する。植物組織に作用させて植物組織を可溶化するための混合酵素製剤であって、セルラーゼ、桂皮酸エステラーゼ、及び、タンナーゼを含有する。その他の構成は、第１の実施の形態に用いられる混合酵素製剤と同様である。 Next, the mixed enzyme preparation used in Reference Example 4 will be described. A mixed enzyme preparation for solubilizing a plant tissue by acting on the plant tissue, comprising cellulase, cinnamic acid esterase, and tannase. Other configurations are the same as the mixed enzyme preparation used in the first embodiment.
以下、実施例を示し、本発明を具体的に説明する。 Hereinafter, the present invention will be specifically described with reference to examples.
実施例１
（１）茶葉の分解−１
茶葉（生）１ｇに対し純水30mlを加えた。これに、次の１）〜４）の製剤を添加した。
１）セルラーゼ製剤（ＴＰ２−協和、協和化成社製）10ｍｇ（60単位）単独
２）セルラーゼ製剤（ＴＰ２−協和、協和化成社製）10ｍｇ（60単位）にフェルラ酸エステラーゼ（協和化成社製）３ｍｇ（ 0.009単位）を併用
３）セルラーゼ製剤（ＴＰ２−協和、協和化成社製）10ｍｇ（60単位）にタンナーゼ製剤（キッコーマン社製）３ｍｇ（ 0.3単位）を併用
４）セルラーゼ製剤（ＴＰ２−協和、協和化成社製）10ｍｇ（60単位）にフェルラ酸エステラーゼ（協和化成社製）３ｍｇ（ 0.009単位）及びタンナーゼ製剤（キッコーマン社製）３ｍｇ（ 0.3単位）を併用
以上４区について比較試験を行った。酵素反応は、40℃で43時間行い、反応終了後、分解液の生成還元糖を定量した。その結果を下記に示す。
１）セルラーゼ製剤単独： 125ｍｇ
２）セルラーゼ製剤にフェルラ酸エステラーゼ製剤を併用： 185ｍｇ
３）セルラーゼ製剤にタンナーゼ製剤を併用： 160ｍｇ
４）セルラーゼ製剤にフェルラ酸エステラーゼ製剤及びタンナーゼ製剤を併用： 251ｍｇ この結果から、セルラーゼ製剤にエステラーゼを併用することで、セルラーゼの反応性が高まることがわかる。特に、３種類の酵素を併用した上記本発明の実施の一形態の４）区は生成還元糖量がセルラーゼ製剤単独処理の１）区の約２倍である。また、この４）区は、分解液の全体的な低分子化が進み濾紙濾過時の濾過速度も速く、完全な透明液が得られた。
Example 1
(1) Tea leaf decomposition- 1
30 ml of pure water was added to 1 g of tea leaves (raw). The following preparations 1) to 4) were added thereto.
1) Cellulase preparation (TP2-Kyowa, Kyowa Kasei) 10 mg (60 units) alone 2) Cellulase preparation (TP2-Kyowa, Kyowa Kasei) 10 mg (60 units) ferulic acid esterase (Kyowa Kasei) 3 mg 3) Cellulase preparation (TP2-Kyowa, manufactured by Kyowa Kasei Co., Ltd.) 10 mg (60 units) and tannase preparation (Kikkoman), 3 mg (0.3 units) combined 4) Cellulase preparation (TP2-Kyowa, Kyowa) 10 mg (60 units) of Kasei Co., Ltd. and 3 mg (0.009 units) of ferulic acid esterase (manufactured by Kyowa Kasei Co., Ltd.) and 3 mg (0.3 units) of tannase preparation (manufactured by Kikkoman Corp.) were used. The enzymatic reaction was carried out at 40 ° C. for 43 hours. After the reaction was completed, the reducing sugar produced in the decomposition solution was quantified. The results are shown below.
1) Cellulase preparation alone: 125mg
2) Ferulic acid esterase preparation in combination with cellulase preparation: 185mg
3) Cellulase preparation combined with tannase preparation: 160mg
4) Combined use of ferulic acid esterase preparation and tannase preparation in cellulase preparation: 251 mg From this result, it is understood that the reactivity of cellulase is increased by using esterase in combination with the cellulase preparation. In particular, in the 4) section of the embodiment of the present invention in which three kinds of enzymes are used in combination, the amount of produced reducing sugar is about twice that of the 1) section of the cellulase preparation alone treatment. In addition, in the section 4), the overall decomposition of the decomposition liquid progressed, and the filtration speed at the time of filter paper filtration was high, and a complete transparent liquid was obtained.
実施例２
（２）茶葉の分解−２
３種類の茶葉（生）（茶葉−１、茶葉−２、茶葉−３）を用いた。この茶葉１ｇに対し純水30ｍｌを加え、これにセルラーゼ６ｍｇ（36単位）、フェルラ酸エステラーゼ２ｍｇ（ 0.006単位）及びタンナーゼ２ｍｇ（ 0.2単位）を含む混合製剤10ｍｇを添加し、反応させた。コントロールとして、セルラーゼ製剤（ＴＰ２−協和）10ｍｇ（60単位）を単用した。40℃で保温して反応させ、24時間経過後にサンプリングし、ポアサイズ 0.2μｍのメンブランフィルターで濾過して、濾過液の総ポリフェノール量を測定した。その結果を表１に示す。
Example 2
(2) Tea leaf decomposition- 2
Three types of tea leaves (raw) (tea leaves-1, tea leaves-2, tea leaves-3) were used. 30 ml of pure water was added to 1 g of this tea leaf, and 10 mg of a mixed preparation containing 6 mg (36 units) of cellulase, 2 mg (0.006 units) of ferulic acid esterase and 2 mg (0.2 units) of tannase was added thereto and reacted. As a control, 10 mg (60 units) of cellulase preparation (TP2-Kyowa) was used alone. The mixture was incubated at 40 ° C. for reaction, sampled after 24 hours, filtered through a membrane filter having a pore size of 0.2 μm, and the total amount of polyphenols in the filtrate was measured. The results are shown in Table 1 .
本発明の上記本発明の実施の一形態に用いられる混合酵素製剤使用区は、総ポリフェノール量がコントロール（単用区）に比べて大きく上回っている。茶葉の種類によって酵素作用に違いはあるが、３種類の酵素の併用効果が各葉で認められた。 In the mixed enzyme preparation use group used in one embodiment of the present invention of the present invention , the total amount of polyphenols is significantly higher than that of the control (single use group). Although the enzyme action varies depending on the type of tea leaf, the combined effect of the three types of enzymes was observed in each leaf .
以上のように、本発明は、セルラーゼ、フェルラ酸エステラーゼ、及び、タンナーゼを順不同で順次又は同時に植物組織に作用させるので、セルラーゼを用いた植物組織の可溶化方法において、前処理にコストをかけることなく、セルラーゼの分解力を高めることによって植物組織を効率的に可溶化できる。 As described above, the present invention causes cellulase, ferulic acid esterase, and tannase to act on plant tissues in any order, either sequentially or simultaneously, and therefore, in the method for solubilizing plant tissues using cellulase, the pretreatment is costly. rather, kill efficiently solubilize plant tissue by increasing the resolving power of the cellulase.
また、植物組織に作用させて植物組織を可溶化するための混合酵素製剤であって、セルラーゼ、フェルラ酸エステラーゼ、及び、タンナーゼを含有するので、前処理にコストをかけることなく、セルラーゼの分解力を高めることによって植物組織を効率的に可溶化できる。 Moreover, it is a mixed enzyme preparation for acting on plant tissue to solubilize plant tissue, and it contains cellulase, ferulic acid esterase, and tannase, so that it can decompose cellulase without costing pretreatment. efficiently kills with solubilizing plant tissue by increasing the.
Claims (2)
植物組織１ｇに対し、セルラーゼを0.126〜 126単位、フェルラ酸エステラーゼを0.00006〜0.06単位、及び、タンナーゼを0.002〜２単位作用させることを特徴とする植物組織の可溶化方法。 A method for solubilizing plant tissue in which cellulase , ferulic acid esterase, and tannase act on plant tissue sequentially or simultaneously in any order ,
A method for solubilizing a plant tissue, comprising subjecting cellulase to 0.126 to 126 units, ferulic acid esterase to 0.00006 to 0.06 units, and tannase to 0.002 to 2 units per 1 g of plant tissue .
セルラーゼ、フェルラ酸エステラーゼ、及び、タンナーゼの配合割合が、セルラーゼ 100質量部に対し、フェルラ酸エステラーゼが20〜30質量部、かつ、タンナーゼが20〜30質量部であることを特徴とする混合酵素製剤。 A mixed enzyme preparation for solubilizing plant tissue by acting on the plant tissue, comprising cellulase, ferulic acid esterase and tannase ,
Cellulase, ferulic acid esterase, and tannase are mixed in an amount of 20-30 parts by mass of ferulic acid esterase and 20-30 parts by mass of tannase with respect to 100 parts by mass of cellulase. .
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