JP5953108B2 - Screening method - Google Patents
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Description
本発明は、アドレノメジュリン（ＡＤＭ：Ａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ）情報伝達系の活性化を阻害する成分のスクリーニング方法、ＡＤＭ情報伝達系を活性化する成分のスクリーニング方法、当該成分を含有する組成物、並びに該組成物の製造方法に関するものである。 The present invention relates to a screening method for a component that inhibits activation of an adrenomedullin (ADM) information transmission system, a screening method for a component that activates an ADM information transmission system, a composition containing the component, and the composition The present invention relates to a method for manufacturing a product.
皮膚における日焼け後の色素沈着、シミ、肝斑、老人性色素斑等は、皮膚に存在する色素細胞（メラノサイト）の活性化によりメラニン生成が著しく亢進した状態である。これらの皮膚色素沈着に関連するトラブルの発生・悪化を防止又は改善する作用を有する成分（美白剤）に関する研究は、今尚、盛んに行われている。また、現在に至るまで様々な作用機序に基づいた美白剤が創出されており、例えばアスコルビン酸類、過酸化水素、コロイド硫黄、グルタチオン、ハイドロキノン、カテコール等（非特許文献１参照）がよく知られている。さらに近年、新たな作用機序に基づいた美白剤として、チロシナーゼ関連蛋白阻害剤（特許文献１参照）、エンドセリン作用抑制剤（特許文献２参照）、メラノサイトのデンドライト伸張抑制剤（特許文献３参照）、メラニン移送又は放出抑制剤（特許文献４参照）、プロトンポンプ阻害剤（特許文献５参照）、インテグリン産生促進剤（特許文献６参照）、ステムファクターセル結合阻害剤（特許文献７参照）等が報告されている。加えて、美白剤を単独で配合する化粧料のほか、複数の美白剤を組合せて配合する化粧料も開発されている。しかしながら、既知の作用機序に基づいた美白剤では、ある程度の美白効果は認められるものの、十分に満足のいく効果が得られているとは言い難い。このため、今尚、新たな作用機序に基づいた美白剤の開発が望まれている。 Pigmentation, blemishes, liver spots, senile pigment spots, etc. after sunburn in the skin are states in which melanin production is significantly enhanced by activation of pigment cells (melanocytes) present in the skin. Research on ingredients (whitening agents) having an action to prevent or improve the occurrence and deterioration of troubles related to skin pigmentation is still actively conducted. In addition, whitening agents based on various mechanisms of action have been created up to now, for example, ascorbic acids, hydrogen peroxide, colloidal sulfur, glutathione, hydroquinone, catechol and the like (see Non-Patent Document 1) are well known. ing. Furthermore, in recent years, as whitening agents based on a new mechanism of action, tyrosinase-related protein inhibitors (see Patent Document 1), endothelin action inhibitors (see Patent Document 2), and melanocyte dendrite elongation inhibitors (see Patent Document 3). , A melanin transfer or release inhibitor (see Patent Document 4), a proton pump inhibitor (see Patent Document 5), an integrin production promoter (see Patent Document 6), a stem factor cell binding inhibitor (see Patent Document 7), and the like. It has been reported. In addition to cosmetics that contain a whitening agent alone, cosmetics that contain a combination of multiple whitening agents have been developed. However, it is difficult to say that a whitening agent based on a known mechanism of action has a sufficiently satisfactory effect, although a certain amount of whitening effect is recognized. For this reason, it is still desired to develop a whitening agent based on a new mechanism of action.
１９９３年、寒川、北村等によりヒト褐色細胞腫より同定されたアドレノメジュリン（ＡＤＭ：Ａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ）は、アミノ酸プレプロホルモンから連続的な酵素分解及びアミド化反応を経由し精製される５２個のアミノ酸よりなる生理活性ペプチドである（非特許文献２参照）。ＡＤＭは、カルシトニン受容体様受容体（ＣＲＬＲ：ｃａｌｓｉｔｏｎｉｎ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）及び受容体活性化調節蛋白質（ＲＡＭＰ１〜３：ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ−ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ１〜３）により形成される複合体（受容体）を介して、様々な生物活性を発現する。また、かかる結合受容体は、その生体分布、ＡＤＭに対する結合親和性等がそれぞれ違うため、生体における役割、病態への関与等も異なる。ＡＤＭに対し高い結合親和性を有するＣＲＬＲ及びＲＡＭＰ２、ＲＡＭＰ３により形成される２種類の結合受容体は、酸化ストレス、動脈硬化、血管・リンパ管新生への関与が報告されている。一方、かかる２種類の受容体に対しＡＤＭ結合親和性が相対的に低いとされるＣＲＬＲ及びＲＡＭＰ１により形成される受容体は、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ：ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ ｇｅｎｅ−ｒｅｌａｔｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ）に対し高い結合親和性を示し、血圧調節、偏頭痛等の症状と深く関与する。この様にＡＤＭは、ＣＲＬＲ及びＲＡＭＰ１〜３により形成される受容体に対し親和性を有し、かかる受容体を介する情報伝達系を活性化することにより多様な生体反応及び症状と深く関連する。
また、ＡＤＭと関連性の高い生理活性ペプチドとしては、ＡＤＭと共通の前駆体であるアミノ酸プレプロホルモンより生成するプロアドレノメジュリンＮ−末端２０ペプチド（ＰＡＭＰ：Ｐｒｏａｄｅｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ２０ ｐｅｐｔｉｄｅ）、更にはＡＤＭと同様のカルシトニン遺伝子関連ペプチドファミリーに属し、類似性の高い構造を有するアドレノメジュリン２／インテルメジン（ＡＤＭ２／ＩＭＤ：Ａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ２／Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｎ）等が報告されている。ＰＡＭＰは、ＡＤＭと同様に降圧作用を有するため、その生物活性に注目が集まり研究が盛ん
に行われている。
In 1993, Adrenomedullin (ADM) was identified from human pheochromocytoma by Samukawa, Kitamura, etc., from 52 amino acids purified from amino acid preprohormone via continuous enzymatic degradation and amidation reactions. (See Non-Patent Document 2). ADM is a complex (receptor) formed by a calcitonin receptor-like receptor (CRLR) and a receptor activation-regulating protein (RAMP1-3: receptor activity-modifying proteins 1-3). It expresses various biological activities. In addition, such a binding receptor has different biological distribution, binding affinity for ADM, and the like, and therefore has different roles in the living body, involvement in pathological conditions, and the like. Two types of binding receptors formed by CRLR, RAMP2, and RAMP3, which have high binding affinity for ADM, have been reported to be involved in oxidative stress, arteriosclerosis, and vascular / lymphangiogenesis. On the other hand, the receptor formed by CRLR and RAMP1, which has a relatively low ADM binding affinity for these two types of receptors, has high binding to calcitonin gene-related peptide (CGRP). It shows affinity and is deeply involved in symptoms such as blood pressure regulation and migraine. Thus, ADM has an affinity for the receptor formed by CRLR and RAMP1 to 3, and is deeply related to various biological reactions and symptoms by activating the information transmission system via such receptor.
In addition, as a bioactive peptide highly related to ADM, proadrenomedullin N-terminal 20 peptide (PAMP) produced from amino acid preprohormone which is a common precursor with ADM (PAMP: Proderenomedullin N-terminal 20 peptide), Adrenomedullin 2 / Intermedin (ADM2 / IMD), which belongs to the same calcitonin gene-related peptide family as ADM and has a highly similar structure, has been reported. Since PAMP has an antihypertensive action similar to ADM, attention has been focused on its biological activity and research has been actively conducted.
ＡＤＭは、当初、血管拡張作用を有する物質として注目を集め、その後、血管以外の組織、副腎髄質、心臓、肺、脳、腎臓等の組織に存在することが確認されている（非特許文献３参照）。さらにＡＤＭは、細胞遊走、分化制御、内皮細胞再生、抗炎症作用、気管支拡張作用、中枢神経脳活動の調整作用、アルドステロン及びアドレノコルチコトロピン放出抑制作用、体液量調節、強心作用、抗菌又は抗真菌作用による擦り傷、皮疹又は皮膚損傷を治癒する作用等に関連があることが報告されている。このような生物活性との関連性の解明により、ＡＤＭ結合受容体を介する情報伝達系に作用する成分の応用展開が図られ、脳梗塞、心筋梗塞、狭心症、高血圧等の血管系疾患、腫瘍（特許文献８参照）、網膜症、関節炎、乾癬の治療薬、診断薬としての開発が進められている。
しかしながら、このようなＡＤＭ情報伝達系に作用する成分に関する研究は、ＣＲＬＲ及びＲＡＭＰ１より形成される受容体を中心に行われている。さらに、ＡＤＭ情報伝達系に作用する成分のほとんどが、ＡＤＭ及び関連蛋白質のフラグメント構造を有するペプチド誘導体、抗体等の分子量が大きい物質である。これは、ＡＤＭ及び関連蛋白質の三次元構造解析等が十分に進んでおらず、構造活性相関及び化合物設計等の技術導入がなされていないためである。また、ＡＤＭ及び関連蛋白質の活性及び機能を評価する方法としては、市販のＡＤＭ抗体等を用いＡＤＭ産生量を測定することにより被験物質のＡＤＭ情報伝達系への作用を評価する方法、被験物質のＡＤＭ産生に関与する遺伝子又は酵素活性に対する影響を評価する方法、アドレノメジュリン受容体を宿主細胞に発現させアゴニスト及びアンタゴニスト活性を評価する方法（特許文献９参照）等が報告されている。
ADM initially attracted attention as a substance having a vasodilatory effect, and thereafter has been confirmed to be present in tissues other than blood vessels, adrenal medulla, heart, lung, brain, kidney and the like (Non-patent Document 3). reference). Furthermore, ADM is cell migration, differentiation control, endothelial cell regeneration, anti-inflammatory action, bronchodilation action, regulating action of central nervous brain activity, aldosterone and adrenocorticotropin release inhibitory action, body fluid volume regulation, cardiotonic action, antibacterial or antifungal It has been reported that it is related to the effect of healing of scratches, skin rashes or skin damage caused by action. By elucidating the relationship with such biological activity, application development of components acting on the information transmission system via the ADM-coupled receptor is attempted, and vascular diseases such as cerebral infarction, myocardial infarction, angina pectoris, hypertension, Development as a therapeutic agent and diagnostic agent for tumors (see Patent Document 8), retinopathy, arthritis, and psoriasis is in progress.
However, research on components acting on such an ADM information transmission system has been conducted mainly on receptors formed from CRLR and RAMP1. Furthermore, most of the components that act on the ADM information transmission system are substances having a large molecular weight such as peptide derivatives and antibodies having fragment structures of ADM and related proteins. This is because three-dimensional structural analysis of ADM and related proteins has not progressed sufficiently, and techniques such as structure-activity relationship and compound design have not been introduced. In addition, as a method for evaluating the activity and function of ADM and related proteins, a method for evaluating the effect of a test substance on the ADM information transmission system by measuring the amount of ADM produced using a commercially available ADM antibody or the like, A method for evaluating the effect on the gene or enzyme activity involved in ADM production, a method for expressing an adrenomedullin receptor in a host cell and evaluating agonist and antagonist activity (see Patent Document 9), and the like have been reported.
前述のようにＡＤＭ情報伝達系に作用する成分は、脳梗塞、心筋梗塞、狭心症、高血圧等の疾病の治療薬として応用展開が図られているが、これらの治療薬の開発を促進するためには、ＡＤＭ情報伝達系に対する作用を正確かつ効率的に判別することができる技術が必要である。ＡＤＭ情報伝達系への作用については、ＡＤＭ情報伝達系に関与する受容体に対する結合親和性、並びにその機能を評価することによって把握することもできるが、このような評価方法は生化学的な専門知識を必要とするとともに、測定操作が簡便である
とは言い難いものであった。
即ち、本発明は、ＡＤＭ情報伝達系に作用する成分を正確かつ効率的に判別することができるスクリーニング方法を提供することを課題とする。
As described above, components that act on the ADM information transmission system are being applied as therapeutic agents for diseases such as cerebral infarction, myocardial infarction, angina pectoris, and hypertension, but the development of these therapeutic agents is promoted. For this purpose, a technique capable of accurately and efficiently discriminating the action on the ADM information transmission system is required. The action on the ADM signal transduction system can be grasped by evaluating the binding affinity to the receptor involved in the ADM signal transduction system and its function. Such an evaluation method is a biochemical specialty. It requires knowledge and is difficult to say that the measurement operation is simple.
That is, an object of the present invention is to provide a screening method capable of accurately and efficiently discriminating components that act on the ADM information transmission system.
本発明者は、上記の課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、ＡＤＭ情報伝達系を活性化することによって、細胞の形態が特異的に変化すること、例えば色素細胞（メラノサイト）にＡＤＭを添加することによって、デンドライト（メラノサイトの触手）が増加することを見出した。そして、かかる現象を利用して、ＡＤＭ情報伝達系が活性化される条件に置く細胞に被験物質を添加し、その形態変化を観察することによって、被験物質にＡＤＭ情報伝達系の活性化を阻害する作用があるか否かを正確かつ効率的に判別することができることを見出した。また、ＡＤＭ情報伝達系が活性化されていない条件下に置く細胞に被験物質を添加し、その形態変化を観察することによって、被験物質にＡＤＭ情報伝達系を活性化する作用があるか否かを正確かつ効率的に判別することができることも見出した。
即ち本発明は、以下に示す通りである。
＜１＞ アドレノメジュリン（ＡＤＭ：Ａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ）情報伝達系の活
性化を阻害する成分のスクリーニング方法であって、被験物質を添加し、さらにＡＤＭ情報伝達系の活性化因子を付与した細胞の形態を、被験物質を添加せずにＡＤＭ情報伝達系の活性化因子を付与した細胞の形態と比較して、ＡＤＭ情報伝達系の活性化因子を付与したことによって生じる細胞の形態変化が、前記被験物質によって抑制されていた場合に、前記被験物質にはＡＤＭ情報伝達系の活性化を阻害する作用があると判別することを特徴とする、スクリーニング方法。
＜２＞ 前記形態変化が、色素細胞（メラノサイト）の形態変化である、＜１＞に記載の
スクリーニング方法。
＜３＞ 前記形態変化が、デンドライトの総数及び／又はデンドライトの分岐総数の増加
である、＜１＞又は＜２＞に記載のスクリーニング方法。
＜４＞ 前記ＡＤＭ情報伝達系の活性化因子の付与がＡＤＭの添加である、＜１＞〜＜３
＞の何れかに記載のスクリーニング方法。
＜５＞ 前記形態変化の抑制効果が大きい被験物質ほど、ＡＤＭ情報伝達系の活性化を阻
害する作用が強いと判別する、＜１＞〜＜４＞の何れかに記載のスクリーニング方法。
＜６＞ 美白剤を判別するものである、＜１＞〜＜５＞の何れかに記載のスクリーニング
方法。
＜７＞ アドレノメジュリン（ＡＤＭ：Ａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ）情報伝達系を活
性化する成分のスクリーニング方法であって、被験物質を色素細胞（メラノサイト）に添加することによって、前記色素細胞（メラノサイト）のデンドライトの総数及び／又はデンドライトの分岐総数が増加した場合に、前記被験物質にはＡＤＭ情報伝達系を活性化する作用があると判別することを特徴とする、スクリーニング方法。
＜８＞ ＜１＞〜＜７＞の何れかに記載のスクリーニング方法により判別されたＡＤＭ情
報伝達系の活性化を阻害する成分又はＡＤＭ情報伝達系を活性化する成分を含有することを特徴とする組成物。
＜９＞ 皮膚外用剤である、＜８＞に記載の組成物。
＜１０＞ 化粧料（但し、医薬部外品を含む）である、＜８＞又は＜９＞に記載の組成物
。
＜１１＞ ＜１＞〜＜７＞の何れかに記載のスクリーニング方法により判別されたＡＤＭ
情報伝達系の活性化を阻害する成分又はＡＤＭ情報伝達系を活性化する成分を組成物に配合する工程を含むことを特徴とする組成物の製造方法。
As a result of intensive studies to solve the above-mentioned problems, the present inventor has confirmed that the cell morphology is specifically changed by activating the ADM signal transduction system, for example, ADM is applied to pigment cells (melanocytes). It has been found that the dendrite (melanocyte tentacle) is increased by the addition. Then, using this phenomenon, the test substance is added to the cells placed under conditions that activate the ADM signal transduction system, and the morphological change is observed to inhibit the test substance from activating the ADM signal transduction system. It has been found that it is possible to accurately and efficiently determine whether or not there is an action to be performed. Whether or not the test substance has an effect of activating the ADM information transmission system by adding the test substance to cells placed under conditions where the ADM information transmission system is not activated, and observing the morphological change. It was also found that can be accurately and efficiently discriminated.
That is, the present invention is as follows.
<1> A screening method for a component that inhibits the activation of an adrenomedullin (ADM: Adrenomedullin) information transmission system, comprising adding a test substance and further adding an activator of the ADM information transmission system The morphological change of the cells caused by the addition of the activator of the ADM signal transduction system compared to the form of the cell to which the activator of the ADM signal transduction system is added without adding the test substance is the test substance A screening method characterized by discriminating that the test substance has an action of inhibiting the activation of the ADM information transmission system when it is suppressed by.
<2> The screening method according to <1>, wherein the morphological change is a morphological change of a pigment cell (melanocyte).
<3> The screening method according to <1> or <2>, wherein the morphological change is an increase in the total number of dendrites and / or the total number of branched dendrites.
<4> The addition of an activator of the ADM information transmission system is addition of ADM, <1> to <3
> The screening method according to any one of the above.
<5> The screening method according to any one of <1> to <4>, wherein the test substance having a greater effect of suppressing the morphological change is determined to have a stronger effect of inhibiting the activation of the ADM information transmission system.
<6> The screening method according to any one of <1> to <5>, wherein the whitening agent is discriminated.
<7> A screening method for a component that activates an adrenomedullin (ADM) information transmission system, the total number of dendrites of the pigment cells (melanocytes) by adding a test substance to the pigment cells (melanocytes) And / or when the total number of branching dendrites increases, the test substance is determined to have an action of activating the ADM information transmission system.
<8> A component that inhibits activation of the ADM information transmission system or a component that activates the ADM information transmission system, which is discriminated by the screening method according to any one of <1> to <7>. Composition.
<9> The composition according to <8>, which is an external preparation for skin.
<10> The composition according to <8> or <9>, which is a cosmetic (including a quasi-drug).
<11> ADM discriminated by the screening method according to any one of <1> to <7>
The manufacturing method of the composition characterized by including the process of mix | blending the component which inhibits activation of an information transmission system, or the component which activates an ADM information transmission system with a composition.
本発明によれば、ＡＤＭ情報伝達系に作用する成分を正確かつ効率的に判別することが
できる。
According to the present invention, components acting on the ADM information transmission system can be accurately and efficiently discriminated.
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明するが、本発明はこれらの内容に限定されるものではない。 Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail, but the present invention is not limited to these contents.
＜ＡＤＭ情報伝達系の活性化を阻害する成分のスクリーニング方法＞
本発明は、アドレノメジュリン（ＡＤＭ：Ａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ）情報伝達系の活性化を阻害する成分を判別するためのスクリーニング方法（以下、「本発明のスクリーニング方法」と略す場合がある。）である。より具体的には、被験物質を添加し、さらにＡＤＭ情報伝達系の活性化因子を付与した細胞の形態を、被験物質を添加せずにＡＤＭ情報伝達系の活性化因子を付与した細胞の形態と比較して、ＡＤＭ情報伝達系の活性化因子を付与したことによって生じる細胞の形態変化が、被験物質によって抑制されていた場合に、かかる被験物質にはＡＤＭ情報伝達系の活性化を阻害する作用があると判別することを特徴とするスクリーニング方法である。
本発明者は、ＡＤＭ情報伝達系を活性化することによって、細胞の形態が特異的に変化すること、例えば色素細胞（メラノサイト）にＡＤＭを添加することによって、図１（図１の１ａはＡＤＭ非添加の色素細胞、１ｂはＡＤＭ添加の色素細胞、１ｃはＡＤＭとシソ科ハナハッカ属マジョラムより得られる植物抽出物を添加した色素細胞である。）に示されるようにデンドライト（メラノサイトの触手）が増加することを見出している。ＡＤＭ情報伝達系が活性化しているか否かについては、ＡＤＭ情報伝達系に関与する受容体に対する結合親和性、並びにその機能を評価することによって把握することもできるが、このような評価方法は生化学的な専門知識を必要とするとともに、測定操作が簡便であるとは言い難いものであった。即ち、細胞の形態変化を観察することによって、ＡＤＭ情報伝達系の活性化をより簡易的に判断することが可能となったと言える。そして、かかる現象を利用して、ＡＤＭ情報伝達系が活性化される条件下に設定する細胞に被験物質を添加し、その形態変化を観察することによって、被験物質にＡＤＭ情報伝達系の活性化を阻害する作用があるか否かを正確かつ効率的に判別することができることを見出したのである。
また、色素細胞（メラノサイト）のデンドライトは、色素細胞において産生されたメラニンを角化細胞等に移送するための重要な役割を果たしているため、デンドライトの総数やデンドライトの分岐総数が増加する形態変化を起こした場合、皮膚における色素沈着は促進されるものと考えられる。さらに、本発明者は、色素細胞に前述のＣＲＬＲ及びＲＡＭＰ１〜３により形成される３種類の結合受容体が存在することも確認している。実際、後述する試験例２に記載の通り、色素細胞のＡＤＭ情報伝達系の活性化（ＡＤＭ添加）によりメラニン産生量が増加することが確認されている。従って、同様にＡＤＭ情報伝達系が活性化される条件に置く色素細胞に被験物質を添加し、デンドライトの総数やデンドライトの分岐総数の増加が抑制されているか否かを観測することによって、かかる被験物質に色素沈着予防効果、即ち美白効果があるか否かを判別することができるのである。なお、従来の美白剤の中にも、デンドライトの伸張を抑制する作用のあるものは報告されているが、本発明者の知る限り、デンドライトの総数やデンドライトの分岐総数の増加を抑制
することによって美白効果を発揮する成分は具体的に報告されておらず、色素細胞のＡＤＭ情報伝達系の活性化を阻害する作用に基づいた美白剤は知られていないものと言える。
ここで、ＡＤＭ情報伝達系の活性化を阻害する成分とは、例えばＡＤＭ産生量を減少させる成分、ＡＤＭ結合受容体を介する情報伝達系を不活性化させる成分（直接又は間接的なＡＤＭ結合受容体不活性化作用を有する成分）、ＡＤＭ結合受容体蛋白発現量を減少させる成分、ＡＤＭ情報伝達系を介するｃ−ＡＭＰ等の二次的情報伝達物質を減少させる成分等が挙げられるが、結果的にＡＤＭ情報伝達系の活性化の阻害に結びつくものであれば、本発明においてその原理は特に限定されないものとする。
また、ＡＤＭ情報伝達系とは、ＡＤＭが結合することができる受容体、具体的にはＣＲＬＲとＲＡＭＰ２若しくはＲＡＭＰ３により形成される受容体、又はＣＲＬＲとＲＡＭＰ１により形成される受容体等を介して情報を伝達する細胞内情報伝達機構を意味するものとする。
<Screening method of components that inhibit activation of ADM information transmission system>
The present invention is a screening method (hereinafter sometimes abbreviated as “the screening method of the present invention”) for discriminating a component that inhibits the activation of an adrenomedullin (ADM) information transmission system. More specifically, the form of the cell to which the activator of the ADM information transmission system was added without adding the test substance, and the form of the cell to which the activator of the ADM information transmission system was added without adding the test substance In contrast, when the morphological change of the cells caused by applying the activator of the ADM signaling system is suppressed by the test substance, the test substance inhibits the activation of the ADM signaling system It is a screening method characterized by determining that there is an action.
The inventor activates the ADM signaling system to specifically change the cell morphology, for example, by adding ADM to pigment cells (melanocytes), FIG. Non-added pigment cell, 1b is a pigment cell with ADM added, and 1c is a pigment cell to which ADM and a plant extract obtained from Labiatae marjoram have been added.) As shown in FIG. It has been found to increase. Whether or not the ADM signaling system is activated can be grasped by evaluating the binding affinity to the receptor involved in the ADM signaling system and its function. In addition to requiring chemical expertise, it was difficult to say that the measurement operation was simple. In other words, it can be said that the activation of the ADM information transmission system can be more easily determined by observing the change in cell morphology. Then, by utilizing such a phenomenon, the test substance is added to the cells set under the condition that the ADM information transmission system is activated, and the morphological change is observed to activate the ADM information transmission system to the test substance. It has been found that it is possible to accurately and efficiently determine whether or not there is an action of inhibiting the above.
In addition, the dendrite of pigment cells (melanocytes) plays an important role in transporting melanin produced in pigment cells to keratinocytes, etc., and therefore the morphological change that increases the total number of dendrite and the total number of branching dendrites. When it occurs, pigmentation in the skin is thought to be accelerated. Furthermore, the present inventor has also confirmed that there are three types of binding receptors formed by the aforementioned CRLR and RAMP1 to RAMP1 in pigment cells. In fact, as described in Test Example 2 to be described later, it has been confirmed that the amount of melanin produced increases by activating the ADM information transmission system (adding ADM) of pigment cells. Therefore, by adding a test substance to a pigment cell that is similarly placed under a condition that activates the ADM signaling system and observing whether the increase in the total number of dendrite and the total number of branched dendrites is suppressed, It is possible to determine whether the substance has a pigmentation preventing effect, that is, a whitening effect. Although some of the conventional whitening agents have been reported to have an action of suppressing the extension of dendrites, as far as the present inventors know, by suppressing an increase in the total number of dendrites and the total number of branching dendrites. A component that exhibits a whitening effect has not been specifically reported, and it can be said that a whitening agent based on the action of inhibiting the activation of the ADM information transmission system of pigment cells is not known.
Here, the component that inhibits the activation of the ADM information transmission system includes, for example, a component that decreases the amount of ADM production, a component that inactivates the information transmission system via the ADM-coupled receptor (direct or indirect ADM-coupled receptor). Components that have a body inactivating action), components that reduce the expression level of ADM-coupled receptor protein, components that reduce secondary signal transmitters such as c-AMP through the ADM signal transduction system, etc. In particular, the principle of the present invention is not particularly limited as long as it leads to inhibition of activation of the ADM information transmission system.
The ADM information transmission system is a receptor to which ADM can bind, specifically, a receptor formed by CRLR and RAMP2 or RAMP3, or a receptor formed by CRLR and RAMP1. It is intended to mean an intracellular information transmission mechanism that transmits information.
本発明のスクリーニング方法は、スクリーニングに使用する細胞に「被験物質を添加し、さらにＡＤＭ情報伝達系の活性化因子を付与」することを特徴としているが、スクリーニングに使用する細胞の種類は、ＡＤＭ情報伝達系を有する細胞であれば特に限定されない。具体的な細胞としては、色素細胞（メラノサイト）、神経細胞（プルキンエ細胞）等が挙げられるが、色素細胞（メラノサイト）が好適なものとして例示できる。また、細胞の培養系としては、単独培養であっても共培養であってもよく、例えばメラノサイトの単独培養系、メラノサイト及びケラチノサイトの共培養系が好適なものとして例示できる。また、細胞の培養条件としては、通常の色素細胞培養条件、例えば市販のメラニン細胞基礎培地（Ｍｅｄｉｕｍ２５４、倉敷紡績株式会社）等による培養のほか、ＡＤＭ情報伝達系の活性化による細胞の特異的な形態変化の発生又は確認を妨げない培養条件であれば特段の限定なく適用することができる。 The screening method of the present invention is characterized by “adding a test substance and further imparting an activator of the ADM signaling system” to cells used for screening. The type of cells used for screening is ADM Any cell having an information transmission system is not particularly limited. Specific examples of the cells include pigment cells (melanocytes), nerve cells (Purkinje cells), and the like, and pigment cells (melanocytes) can be exemplified as preferable ones. The cell culture system may be a single culture or a co-culture. For example, a melanocyte single culture system and a melanocyte and keratinocyte co-culture system are preferable. Cell culture conditions include normal pigment cell culture conditions, such as culturing in commercially available melanocyte basal medium (Medium 254, Kurashiki Boseki Co., Ltd.) and the like, as well as cell-specific activation by activation of the ADM signaling system. Any culture condition that does not hinder the occurrence or confirmation of morphological change can be applied without particular limitation.
本発明のスクリーニング方法は、スクリーニングに使用する細胞に「ＡＤＭ情報伝達系の活性化因子を付与」することを特徴としているが、「ＡＤＭ情報伝達系の活性化因子を付与」とは、ＡＤＭ情報伝達系を活性化することができるものであれば具体的な操作は特に限定されないものとする。例えば、アドレノメジュリン（ＡＤＭ：Ａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ）、プロアドレノメジュリンＮ−末端２０ペプチド（ＰＡＭＰ：Ｐｒｏａｄｅｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ２０ ｐｅｐｔｉｄｅ）、アドレノメジュリン２／インテルメジン（ＡＤＭ２／ＩＭＤ：Ａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ２／Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｎ）等を添加する操作、紫外線の照射等が挙げられる。これらの中でも、ＡＤＭを添加する操作が好適なものとして例示できる。また、ＡＤＭ等の添加量や紫外線の照射条件は、スクリーニングに使用する細胞の種類等に応じて適宜設定されるべきものであるが、例えばＡＤＭの添加量（複数回添加する場合には総量）として、通常０．０００１μＭ以上、好ましくは０．００１μＭ以上、より好ましくは０．０１μＭ以上であり、通常１０００μＭ以下、好ましくは１００μＭ以下、より好ましくは１０μＭ以下である。上記範囲であれば、ＡＤＭ情報伝達系を適度に活性化することができる。 The screening method of the present invention is characterized by “adding an activator of an ADM signal transduction system” to a cell used for screening. A specific operation is not particularly limited as long as the transmission system can be activated. For example, adrenomedullin (ADM: Adrenomedullin), proadrenomedullin N-terminal 20 peptide (PAMP), adrenomedullin 2 / intermedin (ADM2 / IMD: Adrenedmedulin 2 / IMD, etc.) Addition operation, ultraviolet irradiation and the like can be mentioned. Among these, the operation of adding ADM can be exemplified as a preferable one. The addition amount of ADM and the like and the irradiation condition of ultraviolet rays should be appropriately set according to the type of cells used for screening. For example, the addition amount of ADM (total amount when added multiple times) Is usually 0.0001 μM or more, preferably 0.001 μM or more, more preferably 0.01 μM or more, and usually 1000 μM or less, preferably 100 μM or less, more preferably 10 μM or less. If it is the said range, an ADM information transmission system can be activated moderately.
本発明のスクリーニング方法は、スクリーニングに使用する細胞に「被験物質を添加し、さらにＡＤＭ情報伝達系の活性化因子を付与」することを特徴としているが、被験物質の添加とＡＤＭ情報伝達系の活性化因子の付与についての順番やその回数は特に限定されず、被験物質を添加した後にＡＤＭ情報伝達系の活性化因子を付与するものであっても、ＡＤＭ情報伝達系の活性化因子を付与した後に被験物質を添加するものであっても、或いは被験物質の添加とＡＤＭ情報伝達系の活性化因子の付与を同時に行うものであってもよい。また、被験物質の添加量（複数回添加する場合には総量）は、スクリーニングに使用する細胞の種類等に応じて適宜設定されるべきものであるが、例えば培地中の濃度として通常０．０００１質量％以上、好ましくは０．００５質量％以上、より好ましくは０．０１質量％以上になるように添加するものであり、通常５０質量％以下、好ましくは３０質
量％以下、より好ましくは２０質量％以下になるように添加するものである。
本発明のスクリーニング方法が対象とする被験物質は、純物質又は動植物由来の抽出物等の混合物等の何れであってもよい。動植物由来の抽出物は、動物又は植物由来の抽出物自体のみならず、抽出物の画分、精製した画分、抽出物乃至は画分、精製物の溶媒除去物の総称を意味するものとし、植物由来の抽出物は、自生若しくは生育された植物、漢方生薬原料等として販売されるものを用いた抽出物、市販されている抽出物等が挙げられる。
抽出操作は、植物部位の全草を用いるほか、植物体、地上部、根茎部、木幹部、葉部、茎部、花穂、花蕾等の部位を使用することできるが、予めこれらを粉砕或いは細切して抽出効率を向上させることが好ましい。抽出溶媒としては、水、エタノール、イソプロピルアルコール、ブタノールなどのアルコール類、１，３−ブタンジオール、ポリプロピレングリコールなどの多価アルコール類、アセトン、メチルエチルケトンなどのケトン類、ジエチルエーテル、テトラヒドロフランなどのエーテル類等の極性溶媒から選択される１種乃至は２種以上が好適なものとして例示することができる。具体的な抽出方法としては、例えば、植物体等の抽出に用いる部位乃至はその乾燥物１質量に対して、溶媒を１〜３０質量部加え、室温であれば数日間、沸点付近の温度であれば数時間浸漬し、室温まで冷却し後、所望により不溶物及び／又は溶媒除去し、カラムクロマトグラフィー等で分画精製する方法が挙げられる。
The screening method of the present invention is characterized by “adding a test substance and further adding an activator of the ADM information transmission system” to the cells used for screening. The order and number of activation factors are not particularly limited, and even if an activator for the ADM signaling system is added after adding the test substance, the activator for the ADM signaling system is given. After that, the test substance may be added, or the addition of the test substance and the provision of the activator of the ADM information transmission system may be performed simultaneously. Further, the amount of the test substance to be added (the total amount when added multiple times) should be appropriately set according to the type of cells used for screening, etc. It is added so as to be not less than mass%, preferably not less than 0.005 mass%, more preferably not less than 0.01 mass%, and is usually not more than 50 mass%, preferably not more than 30 mass%, more preferably 20 mass%. % To be added.
The test substance targeted by the screening method of the present invention may be a pure substance or a mixture of extracts derived from animals and plants. The extracts derived from animals and plants mean not only animal or plant-derived extracts themselves, but also generic names of extract fractions, purified fractions, extracts or fractions, and solvent-removed products of purified products. Examples of plant-derived extracts include native or grown plants, extracts using products sold as herbal medicine ingredients, and commercially available extracts.
For the extraction operation, the whole plant part can be used, and other parts such as the plant body, the above-ground part, the rhizome part, the tree trunk part, the leaf part, the stem part, the flower spike, and the flower bud can be used. It is preferable to improve the extraction efficiency by cutting. Extraction solvents include water, alcohols such as ethanol, isopropyl alcohol and butanol, polyhydric alcohols such as 1,3-butanediol and polypropylene glycol, ketones such as acetone and methyl ethyl ketone, ethers such as diethyl ether and tetrahydrofuran. 1 type or 2 types or more selected from polar solvents, such as these, can be illustrated as a suitable thing. As a specific extraction method, for example, 1 to 30 parts by mass of a solvent is added to 1 part by mass of a plant or the like used for extraction of a plant or the like. If so, there may be mentioned a method of immersing for several hours, cooling to room temperature, removing insoluble matters and / or solvents if desired, and fractionating and purifying by column chromatography or the like.
本発明のスクリーニング方法は、「被験物質を添加し、さらにＡＤＭ情報伝達系の活性化因子を付与した細胞の形態を、被験物質を添加せずにＡＤＭ情報伝達系の活性化因子を付与した細胞の形態と比較」することを特徴としているが、「細胞の形態」の具体的な比較方法は特に限定されない。「細胞の形態」を比較する方法としては、例えば、光学顕微鏡（明視野顕微鏡、蛍光顕微鏡、位相差顕微法、微分干渉顕微法、レーザー顕微鏡等、共焦点レーザー顕微鏡、ｉｎｖｉｖｏ共焦点顕微鏡、ラマン顕微鏡）、電子顕微鏡、原子間力顕微鏡の公知の顕微鏡を用いて細胞を観察、もしくは画像を取得し、細胞全体又は細胞の一部分の形状、寸法を測定して、その値を比較する方法が挙げられる。操作が簡易的であることから、光学顕微鏡による観察もしくは画像結果を比較することが好ましい。また、細胞の形態をより観察しやすくするために、抗体染色（例えば抗メラノサイト抗体等）や、細胞染色（例えば細胞に取り込まれ蛍光を発するＣＦＤＡ染色等）を用いてもよい。 The screening method of the present invention is described as “cells added with a test substance and further provided with an activator of the ADM signal transduction system in the form of a cell provided with an activator of the ADM signal transduction system without adding the test substance. However, the specific comparison method of “cell morphology” is not particularly limited. Examples of methods for comparing “cell morphology” include optical microscopes (bright field microscope, fluorescence microscope, phase contrast microscope, differential interference microscope, laser microscope, confocal laser microscope, in vivo confocal microscope, Raman microscope, etc. ), A method of observing cells using a known microscope such as an electron microscope or an atomic force microscope, or acquiring an image, measuring the shape and size of the whole cell or a part of the cell, and comparing the values. . Since the operation is simple, it is preferable to compare observations or image results with an optical microscope. In order to make the morphology of cells easier to observe, antibody staining (for example, anti-melanocyte antibody) or cell staining (for example, CFDA staining that is taken into cells and emits fluorescence) may be used.
本発明のスクリーニング方法は、「ＡＤＭ情報伝達系の活性化因子を付与したことによって生じる細胞の形態変化が、前記被験物質によって抑制されていた場合に、前記被験物質にはＡＤＭ情報伝達系の活性化を阻害する作用があると判別すること」ことを特徴としているが、「細胞の形態変化」は、細胞全体の形状、寸法等の変化であっても、或いは細胞の一部分の形状、寸法等の変化であってもよく、スクリーニングに使用する細胞の特徴等に応じて適宜選択することができる。但し、「細胞の形態変化が抑制」されているか否かを判断し易くする観点から、変化が比較的大きい形状、寸法等に着目し、さらにその変化を定量的な数値として捉えることが好ましい。例えば、スクリーニングに使用する細胞が色素細胞（メラノサイト）である場合、ＡＤＭ情報伝達系を活性化するとデンドライトの総数やデンドライトの分岐総数は顕著に増加する。従って、「細胞の形態変化」としてデンドライトの総数及び／又はデンドライトの分岐総数を測定すると、客観的な数値として「細胞の形態変化」を捉えることができ、さらに正確にＡＤＭ情報伝達系の活性化を阻害する作用を判別することができる。なお、「デンドライトの総数」とは、細胞本体より派生するデンドライトの本数の合計を意味し、「デンドライトの分岐総数」とは、細胞本体より派生したデンドライトが伸張するに伴って増加する分岐総数を意味するものとする。また、デンドライトの総数及び／又はデンドライトの分岐総数を測定する場合は、複数の色素細胞のデンドライトの総数及び／又はデンドライトの分岐総数を測定しても、或いは１細胞当たりのデンドライトの総数及び／又はデンドライトの分岐総数を測定してもよい。
より正確にＡＤＭ情報伝達系の活性化を阻害する作用を判別するために、より高い基準
を設けて判別してもよい。例えば、デンドライトの総数やデンドライトの分岐総数によって判別する場合、デンドライトの総数及びデンドライトの分岐総数の両方の増加が抑制されているとき、その被験物質にはＡＤＭ情報伝達系の活性化を阻害する作用があると判別してもよい。また、デンドライトの総数（又はデンドライトの分岐総数）の増加量の何％が抑制されている場合、その被験物質にはＡＤＭ情報伝達系の活性化を阻害する作用があると判別する等、定量的な基準を設けて判別してもよい。デンドライトの総数を基準とする場合、ＡＤＭ添加のみを行った時のデンドライトの総数の増加量に対し、好ましくは５％以上、より好ましくは１０％以上、さらに好ましくは１５％以上抑制される場合、その被験物質にはＡＤＭ情報伝達系の活性化を阻害する作用があると判別することが挙げられる。また、デンドライトの分岐総数を基準とする場合、ＡＤＭ添加のみを行った時のデンドライトの分岐総数の増加量に対し、好ましくは５％以上、より好ましくは１０％以上、さらに好ましくは１５％以上抑制される場合、その被験物質にはＡＤＭ情報伝達系の活性化を阻害する作用があると判別することができる。上記基準であると、より正確にＡＤＭ情報伝達系の活性化を阻害する作用を判別することができる。
According to the screening method of the present invention, “when the morphological change of the cell caused by the addition of the activator of the ADM information transmission system is suppressed by the test substance, the test substance contains the activity of the ADM information transmission system. It is characterized by the fact that it has an action that inhibits cell formation ", but" cell shape change "is a change in the shape and size of the whole cell, or the shape and size of a part of the cell, etc. And can be selected as appropriate according to the characteristics of the cells used for screening. However, from the viewpoint of facilitating determination of whether or not “cell shape change is suppressed”, it is preferable to pay attention to shapes, dimensions and the like that have relatively large changes, and to capture the changes as quantitative numerical values. For example, when the cells used for screening are pigment cells (melanocytes), activation of the ADM signaling system significantly increases the total number of dendrites and the total number of branched dendrites. Therefore, if the total number of dendrites and / or the total number of branched dendrites is measured as “cell shape change”, “cell shape change” can be grasped as an objective numerical value, and the activation of the ADM signaling system can be more accurately performed. Can be determined. The “total number of dendrites” means the total number of dendrites derived from the cell body, and the “total number of branch dendrites” means the total number of branches that increases as the dendrites derived from the cell body expand. Shall mean. When measuring the total number of dendrites and / or the total number of dendritic branches, the total number of dendrites and / or the total number of dendritic branches of a plurality of pigment cells may be measured, or the total number of dendrites per cell and / or The total number of dendritic branches may be measured.
In order to more accurately determine the action that inhibits the activation of the ADM information transmission system, a higher reference may be provided for the determination. For example, when discriminating by the total number of dendrite and the total number of branch of dendrite, when the increase in both the total number of dendrite and the total number of branch of dendrite is suppressed, the test substance has an effect of inhibiting the activation of ADM information transmission system. It may be determined that there is. Moreover, when what percentage of the increase in the total number of dendrite (or the total number of branched dendrite) is suppressed, the test substance is quantitatively determined to have an effect of inhibiting the activation of the ADM information transmission system. A different reference may be provided for determination. When based on the total number of dendrites, preferably 5% or more, more preferably 10% or more, even more preferably 15% or more with respect to the increase in the total number of dendrites when only ADM is added, The test substance may be identified as having an action of inhibiting the activation of the ADM information transmission system. In addition, when the total number of branches of dendrite is used as a reference, the increase in the total number of branches of dendrite when only ADM is added is preferably 5% or more, more preferably 10% or more, and further preferably 15% or more. In this case, it can be determined that the test substance has an action of inhibiting the activation of the ADM information transmission system. With the above criteria, it is possible to more accurately determine the action that inhibits the activation of the ADM information transmission system.
本発明のスクリーニング方法は、「ＡＤＭ情報伝達系の活性化を阻害する成分」を判別するスクリーニング方法であるが、被験物質に「ＡＤＭ情報伝達系の活性化を阻害する作用がある」か否かを判別するのみならず、被験物質のＡＤＭ情報伝達系の活性化を阻害する作用の強さを相対的に判別するために活用することができる。例えば、本発明において「細胞の形態変化」を定量的な数値として捉えることが好ましいことを前述したが、これによって「細胞の形態変化」の抑制効果についても定量的な数値として捉えることができる。即ち、「細胞の形態変化」の抑制効果を被験物質同士相対的に比較することができ、「ＡＤＭ情報伝達系の活性化」と「細胞の形態変化」の相関性から、形態変化の抑制効果が大きい被験物質ほど、ＡＤＭ情報伝達系の活性化を阻害する作用が強いと判別することができる。 The screening method of the present invention is a screening method for discriminating “a component that inhibits the activation of the ADM information transmission system”, but whether or not the test substance has “the action of inhibiting the activation of the ADM information transmission system”. As well as the relative strength of the action of the test substance inhibiting the activation of the ADM information transmission system. For example, in the present invention, it has been described above that “cell morphological change” is preferably regarded as a quantitative numerical value. However, the effect of suppressing “cell morphological change” can also be understood as a quantitative numerical value. That is, the inhibitory effect of “cell morphological change” can be compared with each other, and the morphological change inhibitory effect can be compared from the correlation between “activation of ADM signaling system” and “cell morphological change”. It can be determined that the test substance having a larger value has a stronger effect of inhibiting the activation of the ADM information transmission system.
本発明のスクリーニング方法は、「ＡＤＭ情報伝達系の活性化を阻害する成分」を判別するスクリーニング方法であるが、美白剤を判別するために活用することができる。前述のように、色素細胞（メラノサイト）のデンドライトは、色素細胞において産生されたメラニンを角化細胞等に移送するための重要な役割を果たしているため、デンドライトの総数やデンドライトの分岐総数が増加する形態変化を起こした場合、皮膚における色素沈着は促進されるものと考えられる。従って、ＡＤＭ情報伝達系が活性化される条件に置く色素細胞に被験物質を添加し、デンドライトの総数やデンドライトの分岐総数の増加が抑制されていた場合、かかる被験物質に色素沈着予防効果、即ち美白効果があるか否かを判別することができる。 The screening method of the present invention is a screening method for discriminating “components that inhibit the activation of the ADM information transmission system”, but can be utilized for discriminating whitening agents. As mentioned above, the dendrite of pigment cells (melanocytes) plays an important role in transferring melanin produced in pigment cells to keratinocytes, etc., so the total number of dendrites and the total number of dendritic branches increase. When morphological changes occur, pigmentation in the skin is considered to be accelerated. Therefore, when a test substance is added to pigment cells placed under conditions that activate the ADM signaling system, and the increase in the total number of dendrites and the total number of branched dendrites is suppressed, the test substance has a pigmentation preventing effect, that is, It can be determined whether or not there is a whitening effect.
本発明のスクリーニング方法における手順（工程）の具体例を以下に挙げるが、本発明の趣旨を逸脱しない限り以下の内容に限定されるものではなく、適宜変更して実施することができる。
（１）スクリーニングに使用する細胞の初期の形態を把握するため、顕微鏡等によってその形態を観察する（細胞全体及び／又は一部分の寸法、デンドライトの総数及び／又はデンドライトの分岐総数等の定量的な数値を測定する。）。
（２）細胞に被験物質を添加する。
（３）ＡＤＭ情報伝達系の活性化因子を細胞に付与する（例えばＡＤＭを細胞に添加する）。なお、コントロールとして被験物質を添加せずＡＤＭ情報伝達系の活性化因子を付与した同種の細胞も用意する。
（４）被験物質を添加した細胞及び被験物質を添加していない細胞の形態をそれぞれ顕微鏡等によって観察する（細胞全体及び／又は一部分の寸法、デンドライトの総数及び／又はデンドライトの分岐総数等の定量的な数値を測定する）。
（５）細胞の初期の形態をもとに、被験物質を添加した細胞及び被験物質を添加していな
い細胞の形態変化をそれぞれ定量的な数値として捉える（細胞全体及び／又は一部分の寸法変化量、デンドライトの総数及び／又はデンドライトの分岐総数の増加量等）。
（６）被験物質を添加した細胞及び被験物質を添加していない細胞の形態変化を比較し、被験物質を添加したことによって細胞の形態変化が抑制されていた場合、その被験物質にはＡＤＭ情報伝達系の活性化を阻害する作用があると判別する。
Specific examples of procedures (steps) in the screening method of the present invention are listed below, but are not limited to the following contents without departing from the gist of the present invention, and can be implemented with appropriate modifications.
(1) In order to grasp the initial morphology of cells used for screening, the morphology is observed with a microscope or the like (quantitative measurement such as the size of the whole cell and / or part, the total number of dendrites and / or the total number of dendritic branches) Measure the number.)
(2) Add a test substance to the cells.
(3) Applying an activator of the ADM information transmission system to the cell (for example, adding ADM to the cell). In addition, the same type of cells to which an activator of the ADM information transmission system is added without adding a test substance as a control are also prepared.
(4) The morphology of the cells to which the test substance has been added and the cells to which the test substance has not been added is observed with a microscope or the like (quantification of the whole cell and / or partial size, the total number of dendrites and / or the total number of branch dendrites, etc.) Measure typical numbers).
(5) Based on the initial morphology of the cells, the morphological changes of the cells to which the test substance has been added and the cells to which the test substance has not been added are each regarded as a quantitative value (the amount of dimensional change of the whole cell and / or part of the cell , The total number of dendrites and / or the increase in the total number of branch dendrites).
(6) The morphological changes of the cells to which the test substance is added and the cells to which the test substance is not added are compared and the morphological change of the cells is suppressed by adding the test substance. It is determined that there is an action that inhibits activation of the transmission system.
＜試験例１： 各種因子の添加による色素細胞の形態変化の検討＞
以下に記載の手順に従い試験を実施した。１２穴プレートに正常ヒトメラノサイト（ＮＨＥＭ）（倉敷紡績株式会社）１．０×１０８（ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）の密度で播種し、播種２４時間後、合成ＡＤＭ（ペプチド゛研究所４２７８−ｓ）、α−メラニン細胞刺激ホルモン（α−ＭＳＨ、シグマアルドリッチジャパン）、エンドセリン（ＥＮＤ、和光純薬工業株式会社）を１μＭ添加、プロスタグランジン（ＰＧＥ２）（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ １４０１０）を０．１μＭ添加（ＰＧＥ２は１μＭ添加では細胞が死滅したため）し、添加１２時間後の細胞の形態を光学顕微鏡で観察し、ランダムに撮影部位を設定、１０枚の写真を撮影し画像に取り込んだ。そして１０枚の画像中の＜１＞細胞全体が写っている細胞、＜２＞鮮明に形態が観察されている細胞をすべて選択し、デンドライトの総数及びデンドライトの分岐総数を計測、細胞数あたりの値に換算した。結果を図２に示す。
<Test Example 1: Examination of morphological change of pigment cells by addition of various factors>
The test was performed according to the procedure described below. A 12-well plate was seeded with normal human melanocytes (NHEM) (Kurashiki Boseki Co., Ltd.) at a density of 1.0 × 10 8 (cells / well), and 24 hours after sowing, synthetic ADM (Peptide Institute 4278-s), α-melanocyte stimulating hormone (α-MSH, Sigma-Aldrich Japan), endothelin (END, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 1 μM added, prostaglandin (PGE2) (Cayman Chemical 14010) added 0.1 μM (PGE2 is The cells were killed when 1 μM was added), and the morphology of the cells 12 hours after the addition was observed with an optical microscope. The imaging sites were set at random, and 10 photographs were taken and captured. Then, <1> cells in which the whole cell is shown in 10 images, <2> all cells whose morphology is clearly observed are selected, and the total number of dendrites and the total number of branches of dendrites are measured. Converted to value. The results are shown in FIG.
図２の結果より、ＡＤＭ情報伝達系の活性化因子の付与（ＡＤＭ添加）によりデンドライトの総数及びデンドライトの分岐総数の増加が観察された。また、ＡＤＭ情報伝達系の活性化による形態変化は、色素細胞のＧ蛋白型受容体を介するその他の情報伝達系を活性化した場合と比較し、その形態変化の程度は顕著であった。 From the results shown in FIG. 2, it was observed that the total number of dendrites and the total number of branches of dendrites were increased by applying an activator of the ADM information transmission system (adding ADM). In addition, the morphological change due to the activation of the ADM information transmission system was remarkable compared with the case where the other information transmission system via the G protein type receptor of the pigment cell was activated.
＜試験例２： 正常ヒトメラノサイトにおけるＡＤＭ添加によるメラニン産生量及び細胞数に関する検討＞
以下の手順に従い、正常ヒトメラノサイトにおけるＡＤＭ添加によるメラニン産生量及び細胞数への影響を検討した。４８穴プレートに正常ヒトメラノサイト（ＮＨＥＭ）（倉敷紡績株式会社）１．５×１０４（ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）の密度で播種し、播種２４時間後、合成ＡＤＭ（ペプチド研究所４２７８−ｓ）を２（μＭ）になる様に添加し、さらに０．２５（μＣｉ／ｗｅｌｌ）の［１４Ｃ］−２−Ｔｈｉｏｕｒａｃｉｌを添加した。ＣＯ２インキュベーターにて７２時間培養後、Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ−８（株式会社 同仁研究所）を用い、細胞数を測定後、液体シンチレーションカウンター（アロカ株式会社）により［１４Ｃ］−２−Ｔｈｉｏｕｒａｃｉｌの取り込みを測定した。結果を図３に示す。図３において、縦軸はメラニン産生量又は細胞数を表す。また、メラニン産生量又は細胞数は、ＡＤＭ非添加群におけるメラニン産生量又は細胞数を１００％とした場合の百分率で表示した。
<Test Example 2: Study on melanin production amount and cell number by addition of ADM in normal human melanocytes>
According to the following procedure, the influence of ADM addition on normal human melanocytes on the amount of melanin production and the number of cells was examined. A 48-well plate was seeded at a density of normal human melanocytes (NHEM) (Kurashiki Boseki Co., Ltd.) 1.5 × 10 4 (cells / well), and 24 hours after sowing, 2 synthetic ADMs (Peptide Research Institute 4278-s) were seeded. ([Mu] M) was added, and [ 14C ] -2-Thiouracil of 0.25 ([mu] Ci / well) was further added. After culturing in a CO 2 incubator for 72 hours, the number of cells was measured using Cell Counting Kit-8 (Dojin Laboratories Co., Ltd.), and then [ 14 C] -2-Thiouracil was taken up by a liquid scintillation counter (Aloka Co., Ltd.). Was measured. The results are shown in FIG. In FIG. 3, the vertical axis represents the amount of melanin production or the number of cells. The melanin production amount or the number of cells was expressed as a percentage when the melanin production amount or the number of cells in the ADM non-added group was 100%.
図３の結果より、ＡＤＭ添加により正常ヒトメラノサイトにおけるメラニン産生量が増加することが確認された。この際、メラノサイト細胞数の増加は認められなかった。即ち、ＡＤＭ結合受容体を介する情報伝達系が活性化されることにより、メラニン産生量が増加することが明らかである。 From the results shown in FIG. 3, it was confirmed that the amount of melanin produced in normal human melanocytes was increased by the addition of ADM. At this time, no increase in the number of melanocyte cells was observed. That is, it is clear that the amount of melanin production increases when the information transmission system via the ADM-coupled receptor is activated.
色素細胞には、ＡＤＭ情報伝達系と同様に、Ｇ蛋白結合型受容体を介しｃ−ＡＭＰ等の二次情報伝達物質を制御することにより細胞内情報を伝達する情報伝達系が存在する。かかる情報伝達物質としては、メラニン細胞刺激ホルモン（α−ＭＳＨ：α−Ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ）、エンドセリン（ＥＮＤ：ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎｅ）、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２：Ｐｒｏｓｔａｇｒａｎｄｉｎ
Ｅ２）等が知られており、何れの因子もメラニン産生及び色素沈着と深く関連する。前記の試験結果によれば、ＡＤＭ以外の前記細胞情報伝達系を活性化した場合、デンドライ
トの総数やデンドライトの分岐総数の増加が認められるものの、その増加効果は、ＡＤＭ情報伝達系の活性化に比較し非常に弱いものであった。このことは、色素細胞のデンドライトの総数やデンドライトの分岐総数の増加（細胞の形態変化）は、ＡＤＭ情報伝達系の活性化のよる寄与度が非常に大きいと言える。即ち、色素細胞におけるデンドライトの総数、デンドライトの分岐総数の変化を調べることにより容易にＡＤＭ情報伝達系への作用を評価することができる。また、色素沈着との関連性が高い色素細胞におけるデンドライトの総数、デンドライトの分岐総数の変化は、ＡＤＭ情報伝達系による寄与度が極めて大きいため、ＡＤＭ情報伝達系の活性化を阻害することにより、高い色素沈着抑制作用を有する新たな美白剤を判別することができる。
Similar to the ADM information transmission system, pigment cells have an information transmission system that transmits intracellular information by controlling secondary information transmission substances such as c-AMP via a G protein-coupled receptor. Examples of such information transmission substances include melanocyte stimulating hormone (α-MSH), endothelin (END), prostaglandin E2 (PGE2: Prostaglandin).
E2) etc. are known, and all factors are closely related to melanin production and pigmentation. According to the above test results, when the cellular information transmission system other than ADM is activated, an increase in the total number of dendrites and the total number of branching dendrites is observed, but the increase effect is due to the activation of the ADM information transmission system. It was very weak compared. It can be said that the increase in the total number of dendrite pigments and the total number of dendrite branches (cell morphological changes) contributes greatly to the activation of the ADM signaling system. That is, the effect on the ADM information transmission system can be easily evaluated by examining changes in the total number of dendrites and the total number of branched dendrites in pigment cells. In addition, the change in the total number of dendrites and the total number of branching dendrites in pigment cells that are highly related to pigmentation, because the contribution by the ADM information transmission system is extremely large, by inhibiting the activation of the ADM information transmission system, A new whitening agent having a high pigmentation inhibitory action can be identified.
＜ＡＤＭ情報伝達系を活性化する成分のスクリーニング方法＞
前述のように、本発明者はＡＤＭ情報伝達系を活性化することによって、色素細胞（メラノサイト）のデンドライトの総数やデンドライトの分岐総数が増加することを見出している。一方、色素細胞には、ＡＤＭ情報伝達系と同様に、結合受容体を介しｃ−ＡＭＰ等の細胞内の二次情報伝達物質を経由して情報を伝達するＧ蛋白結合型の細胞情報伝達系が存在するが、本発明者によると、色素細胞におけるメラニン細胞刺激ホルモン（α−ＭＳＨ：α−Ｍｅｌａｎｏｃｕｔｅ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ）、エンドセリン（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎｅ）等のＧ蛋白結合型受容体を介する情報伝達系を活性化しても、色素細胞（メラノサイト）のデンドライトの総数やデンドライトの分岐総数の増加は非常に小さいことを明らかとしている。従って、色素細胞（メラノサイト）のデンドライトの総数やデンドライトの分岐総数が増加する現象は、ＡＤＭ情報伝達系が活性化したことによる影響が極めて強く、色素細胞（メラノサイト）のデンドライトの総数やデンドライトの分岐総数を増加させる成分について、ＡＤＭ情報伝達系を活性化する作用があると推定することができることを見出したのである。
即ち、被験物質を色素細胞（メラノサイト）に添加することによって、デンドライトの総数及び／又はデンドライトの分岐総数が増加した場合に、かかる被験物質にはＡＤＭ情報伝達系を活性化する作用があると判別することができる。そして、かかる判別を行うスクリーニング方法も本発明の一態様である。
なお、ＡＤＭ情報伝達系を活性化する作用のある成分とは、例えばＡＤＭ産生量を増加させる成分、ＡＤＭ結合受容体を介する情報伝達系を活性化させる成分（直接又は間接的なＡＤＭ結合受容体活性化作用を有する成分）、ＡＤＭ結合受容体蛋白発現量を増加させる成分、ＡＤＭ情報伝達系を介するｃ−ＡＭＰ等の二次的情報伝達物質を増加させる成分等が挙げられるが、結果的にＡＤＭ情報伝達系の活性化に結びつくものであれば、本発明においてその原理は特に限定されないものとする。
<Screening method for components that activate ADM information transmission system>
As described above, the present inventor has found that activation of the ADM information transmission system increases the total number of dendrites of pigment cells (melanocytes) and the total number of branches of dendrites. On the other hand, as in the case of the ADM information transmission system, the G cell-coupled cell information transmission system that transmits information via a binding receptor and a secondary information transmission substance in the cell such as c-AMP is transmitted to the pigment cell. According to the present inventors, however, the present inventors have activated a signal transduction system via G protein-coupled receptors such as melanocyte-stimulating hormone (α-MSH: α-MSH) and endothelin in pigment cells. However, the increase in the total number of dendrites of pigment cells (melanocytes) and the total number of branches of dendrites is revealed to be very small. Therefore, the phenomenon in which the total number of dendrites in the pigment cells (melanocytes) and the total number of branches in the dendrites is greatly influenced by the activation of the ADM signal transmission system, and the total number of dendrites in the pigment cells (melanocytes) and the branching of dendrites. It has been found that the component that increases the total number can be estimated to have an effect of activating the ADM information transmission system.
That is, when the total number of dendrites and / or the total number of branched dendrites is increased by adding the test substance to pigment cells (melanocytes), it is determined that the test substance has an effect of activating the ADM information transmission system. can do. A screening method for performing such discrimination is also one embodiment of the present invention.
In addition, the component having the action of activating the ADM information transmission system includes, for example, a component that increases the ADM production amount, a component that activates the information transmission system via the ADM-coupled receptor (direct or indirect ADM-coupled receptor) Ingredients having an activating action), components that increase the expression level of ADM-coupled receptor protein, components that increase secondary information transmitters such as c-AMP via the ADM signal transduction system, etc. The principle of the present invention is not particularly limited as long as it is associated with the activation of the ADM information transmission system.
本発明のＡＤＭ情報伝達系の活性化する成分のスクリーニング方法は、「被験物質を色素細胞（メラノサイト）に添加する」ことを特徴としているが、スクリーニングに使用する色素細胞（メラノサイト）は、単独培養であっても共培養であってもよく、例えばメラノサイトの単独培養系、メラノサイト及びケラチノサイトの共培養系が好適なものとして例示できる。また、細胞の培養条件としては、通常の色素細胞培養条件、例えば市販のメラニン細胞基礎培地（Ｍｅｄｉｕｍ２５４、倉敷紡績株式会社）等による培養のほか、ＡＤＭ情報伝達系の活性化による色素細胞（メラノサイト）の特異的な形態変化の発生又は確認を妨げない培養条件であれば特段の限定なく適用することができる。 The screening method for the activating component of the ADM information transmission system of the present invention is characterized by “adding a test substance to a pigment cell (melanocyte)”, but the pigment cell (melanocyte) used for screening is cultured alone. Or a co-culture system, for example, a melanocyte single culture system or a melanocyte and keratinocyte co-culture system can be exemplified as preferable ones. Cell culture conditions include normal pigment cell culture conditions, such as culturing in commercially available melanocyte basic medium (Medium 254, Kurashiki Boseki Co., Ltd.), etc., and pigment cells (melanocytes) by activating the ADM information transmission system. As long as the culture conditions do not hinder the occurrence or confirmation of specific morphological changes, it can be applied without particular limitation.
本発明のＡＤＭ情報伝達系の活性化する成分のスクリーニング方法は、「被験物質を色素細胞（メラノサイト）に添加する」ことを特徴としているが、被験物質の添加量は特に限定されず、その濃度として通常０．０００１質量％以上、好ましくは０．００５質量％以上、より好ましくは０．０１質量％以上になるように添加するものであり、通常５０質量％以下、好ましくは３０質量％以下、より好ましくは２０質量％以下になるように添加するものである。
本発明のＡＤＭ情報伝達系の活性化する成分のスクリーニング方法が対象とする被験物質は、純物質又は動植物由来の抽出物等の混合組成物等の何れであってもよい。動植物由来の抽出物は、動物又は植物由来の抽出物自体のみならず、抽出物の画分、精製した画分、抽出物乃至は画分、精製物の溶媒除去物の総称を意味する。植物由来の抽出物は、自生若しくは生育された植物、漢方生薬原料等として販売されるものを用いた抽出物、市販（丸善製薬株式会社等）されている抽出物等が挙げられる。
抽出操作は、植物部位の全草を用いるほか、植物体、地上部、根茎部、木幹部、葉部、茎部、花穂、花蕾等の部位を使用することできるが、予めこれらを粉砕或いは細切して抽出効率を向上させることが好ましい。抽出溶媒としては、水、エタノール、イソプロピルアルコール、ブタノールなどのアルコール類、１，３−ブタンジオール、ポリプロピレングリコールなどの多価アルコール類、アセトン、メチルエチルケトンなどのケトン類、ジエチルエーテル、テトラヒドロフランなどのエーテル類等の極性溶媒から選択される１種乃至は２種以上が好適なものとして例示出来る。具体的な抽出方法としては、例えば、植物体等の抽出に用いる部位乃至はその乾燥物１質量に対して、溶媒を１〜３０質量部加え、室温であれば数日間、沸点付近の温度であれば数時間浸漬し、室温まで冷却し後、所望により不溶物及び／又は溶媒除去し、カラムクロマトグラフィー等で分画精製する方法が挙げられる。
The screening method for the activating component of the ADM information transmission system of the present invention is characterized by “adding a test substance to a pigment cell (melanocyte)”, but the addition amount of the test substance is not particularly limited, and its concentration As 0.0001% by mass or more, preferably 0.005% by mass or more, more preferably 0.01% by mass or more, and usually 50% by mass or less, preferably 30% by mass or less, More preferably, it is added so as to be 20% by mass or less.
The test substance targeted by the screening method for the activating component of the ADM information transmission system of the present invention may be a pure substance or a mixed composition such as an extract derived from animals and plants. The extracts derived from animals and plants mean not only extracts derived from animals or plants per se, but also a generic name of a fraction of the extract, a purified fraction, an extract or a fraction, and a solvent-free product of the purified product. Examples of plant-derived extracts include plants that are grown or grown, extracts that are sold as raw materials for herbal medicines, and extracts that are commercially available (such as Maruzen Pharmaceutical Co., Ltd.).
For the extraction operation, the whole plant part can be used, and other parts such as the plant body, the above-ground part, the rhizome part, the tree trunk part, the leaf part, the stem part, the flower spike, and the flower bud can be used. It is preferable to improve the extraction efficiency by cutting. Extraction solvents include water, alcohols such as ethanol, isopropyl alcohol and butanol, polyhydric alcohols such as 1,3-butanediol and polypropylene glycol, ketones such as acetone and methyl ethyl ketone, ethers such as diethyl ether and tetrahydrofuran. One type or two or more types selected from polar solvents such as the above can be exemplified as preferable examples. As a specific extraction method, for example, 1 to 30 parts by mass of a solvent is added to 1 part by mass of a plant or the like used for extraction of a plant or the like. If so, there may be mentioned a method of immersing for several hours, cooling to room temperature, removing insoluble matters and / or solvents if desired, and fractionating and purifying by column chromatography or the like.
本発明のスクリーニング方法は、「色素細胞（メラノサイト）のデンドライトの総数及び／又はデンドライトの分岐総数が増加した場合に、前記被験物質にはＡＤＭ情報伝達系を活性化する作用があると判別する」ことを特徴としているが、正確にＡＤＭ情報伝達系を活性化する作用を判別する観点から、デンドライトの総数及びデンドライトの分岐総数の両方が増加する場合に、被験物質にはＡＤＭ情報伝達系を活性化する作用があると判別することが好ましい。また、デンドライトの総数又はデンドライトの分岐総数の具体的増加量は特に限定されないが、１細胞当たりのデンドライトの総数の平均増加量としては、通常０．３以上、好ましくは０．５以上、より好ましくは０．７以上であり、通常７以下である。１細胞当たりのデンドライトの分岐総数の平均増加量としては、通常０．５以上、好ましくは０．８以上、より好ましくは１以上であり、通常１０以下である。上記基準であると、より正確にＡＤＭ情報伝達系の活性化を阻害する作用を判別することができる。 According to the screening method of the present invention, “when the total number of dendrites and / or the total number of branched dendrites of pigment cells (melanocytes) increases, it is determined that the test substance has an effect of activating the ADM information transmission system”. However, from the viewpoint of accurately determining the action of activating the ADM information transmission system, when both the total number of dendrites and the total number of branching dendrites increase, the test substance activates the ADM information transmission system. It is preferable to discriminate that there is an action to be converted. The specific increase in the total number of dendrites or the total number of branching dendrites is not particularly limited, but the average increase in the total number of dendrites per cell is usually 0.3 or more, preferably 0.5 or more, more preferably Is 0.7 or more and usually 7 or less. The average increase in the total number of branched dendrites per cell is usually 0.5 or more, preferably 0.8 or more, more preferably 1 or more, and usually 10 or less. With the above criteria, it is possible to more accurately determine the action that inhibits activation of the ADM information transmission system.
前述のように、ＡＤＭは様々な細胞及び組織に存在することが確認されている。このため、本発明のＡＤＭ情報伝達系を活性化する成分のスクリーニング方法により選択されたＡＤＭ情報伝達系を活性化する成分は、ＡＤＭ情報伝達系の不活性化により生じる様々な症状及び疾患の予防又は改善、診断等に用いることができる。本発明に係るＡＤＭ情報伝達系を活性化する成分は、ADM情報伝達系の不活性化により生じる疾患、症状等の予防又
は改善、診断等であれば特段の限定なく適用することができるが、特に、脳梗塞、心筋梗塞、狭心症、高血圧等の血管系疾患、腫瘍、網膜症、関節炎、乾癬の治療薬、診断薬、色素沈着の予防又は改善用に用いることが好ましい。
As described above, ADM has been confirmed to exist in various cells and tissues. Therefore, the component that activates the ADM information transmission system selected by the screening method for the component that activates the ADM information transmission system of the present invention is used to prevent various symptoms and diseases caused by inactivation of the ADM information transmission system. Alternatively, it can be used for improvement, diagnosis and the like. The component that activates the ADM information transmission system according to the present invention can be applied without any particular limitation as long as it prevents or improves diseases, symptoms, etc. caused by inactivation of the ADM information transmission system, diagnosis, etc. In particular, it is preferably used for the prevention or improvement of cerebral infarction, myocardial infarction, vascular diseases such as angina pectoris, hypertension, tumors, retinopathy, arthritis, psoriasis, diagnostic agents, and pigmentation.
本発明のＡＤＭ情報伝達系の活性化する成分のスクリーニング方法における手順（工程）の具体例を以下に挙げるが、本発明の趣旨を逸脱しない限り以下の内容に限定されるものではなく、適宜変更して実施することができる。
（１）スクリーニングに使用する細胞に被験物質を添加する。なお、コントロールとして被験物質を添加していない同種の細胞も用意する。（また、コントロールとして、スクリーニングに使用する細胞の初期のデンドライトの総数及び／又はデンドライトの分岐総数を測定しておいてもよい。）
（２）被験物質を添加した細胞及び被験物質を添加していない細胞の形態をそれぞれ顕微鏡等によって観察する（デンドライトの総数及び／又はデンドライトの分岐総数を測定する）。
（３）被験物質を添加したことによって、デンドライトの総数及び／又はデンドライトの分岐総数が増加した場合に、前記被験物質にはＡＤＭ情報伝達系を活性化する作用があると判別する。
Specific examples of procedures (steps) in the screening method for the activating component of the ADM information transmission system of the present invention are given below, but are not limited to the following contents without departing from the gist of the present invention, and are appropriately changed. Can be implemented.
(1) A test substance is added to cells used for screening. As a control, prepare the same type of cells to which no test substance is added. (In addition, as a control, the total number of initial dendrites and / or the total number of branched dendrites of cells used for screening may be measured.)
(2) The morphology of the cells to which the test substance has been added and the cells to which the test substance has not been added is observed with a microscope or the like (the total number of dendrites and / or the total number of branched dendrites is measured).
(3) When the total number of dendrites and / or the total number of branched dendrites is increased by adding the test substance, it is determined that the test substance has an effect of activating the ADM information transmission system.
＜組成物及び組成物の製造方法＞
前述したように本発明のスクリーニング方法によって、ＡＤＭ情報伝達系の活性化を阻害する成分又はＡＤＭ情報伝達系を活性化する成分を正確かつ効率的に判別することができる。特にＡＤＭ情報伝達系の活性化を阻害する成分は、色素沈着予防効果を発揮するため、優れた美白剤を判別するために活用することができる。本発明のスクリーニング方法によって判別されたＡＤＭ情報伝達系の活性化を阻害する成分又はＡＤＭ情報伝達系を活性化する成分を含有する組成物（以下、「本発明の組成物」と略す場合がある。）、及び本発明のスクリーニング方法により判別されたＡＤＭ情報伝達系の活性化を阻害する成分又はＡＤＭ情報伝達系を活性化する成分を組成物に配合する工程を含む組成物の製造方法（以下、「本発明の組成物の製造方法」と略す場合がある。）も、本発明の一態様である。以下、本発明の組成物及び本発明の組成物の製造方法について詳細に説明する。
<Composition and method for producing the composition>
As described above, the screening method of the present invention can accurately and efficiently discriminate components that inhibit the activation of the ADM information transmission system or components that activate the ADM information transmission system. In particular, a component that inhibits activation of the ADM information transmission system exhibits an effect of preventing pigmentation, and thus can be used to discriminate an excellent whitening agent. A composition containing a component that inhibits activation of the ADM information transmission system or a component that activates the ADM information transmission system determined by the screening method of the present invention (hereinafter sometimes abbreviated as “composition of the present invention”). )), And a method for producing a composition comprising a step of blending a component that inhibits activation of the ADM information transmission system or a component that activates the ADM information transmission system determined by the screening method of the present invention (hereinafter referred to as a composition) , May be abbreviated as “a method for producing the composition of the present invention”.) Is also an embodiment of the present invention. Hereinafter, the composition of the present invention and the method for producing the composition of the present invention will be described in detail.
本発明の組成物及び本発明の組成物の製造方法は、前述した本発明のスクリーニング方法によって判別されたＡＤＭ情報伝達系の活性化を阻害する成分又はＡＤＭ情報伝達系を活性化する成分を含有する（配合する）ものであれば、ＡＤＭ情報伝達系の活性化を阻害する成分又はＡＤＭ情報伝達系を活性化する成分の含有量（配合量）やその他の構成については特に限定されず、調製方法も特に限定されない。但し、組成物におけるＡＤＭ情報伝達系の活性化を阻害する成分又はＡＤＭ情報伝達系を活性化する成分の含有量（配合量）は、通常０．００００１質量％以上、好ましくは０．０００１質量％以上、より好ましくは０．００１質量以上であり、通常１５質量％以下、好ましくは１０質量％以下、より好ましくは５量％である。ＡＤＭ情報伝達系の活性化を阻害する成分又はＡＤＭ情報伝達系を活性化する成分の含有量（配合量）が少なすぎると、目的とする効果が低下する傾向にあり、多すぎても効果が頭打ちになる傾向があり、この系の自由度を損なう場合がある。
また、組成物に含有させるＡＤＭ情報伝達系の活性化を阻害する成分又はＡＤＭ情報伝達系を活性化する成分の種類は、１種類に限定されず、２種類以上を含有させてもよい。
The composition of the present invention and the method for producing the composition of the present invention contain a component that inhibits activation of the ADM information transmission system or a component that activates the ADM information transmission system, which is determined by the screening method of the present invention described above. As long as it is (mixed), the content (mixing amount) of the component that inhibits the activation of the ADM information transmission system or the component that activates the ADM information transmission system and other configurations are not particularly limited. The method is not particularly limited. However, the content (blending amount) of the component inhibiting the activation of the ADM information transmission system or the component activating the ADM information transmission system in the composition is usually 0.00001% by mass or more, preferably 0.0001% by mass. As described above, it is more preferably 0.001 mass or more, and usually 15 mass% or less, preferably 10 mass% or less, and more preferably 5 mass%. If the content (blending amount) of the component that inhibits the activation of the ADM information transmission system or the component that activates the ADM information transmission system is too small, the intended effect tends to decrease, and if it is too large, the effect is exhibited. There is a tendency to reach a peak, and this system may lose the degree of freedom.
Moreover, the kind of the component which inhibits activation of the ADM information transmission system contained in a composition or the component which activates an ADM information transmission system is not limited to one type, You may contain two or more types.
本発明の組成物の製剤化にあたっては、通常の食品、医薬品、化粧料などの製剤化で使用される任意成分を含有することが出来る。この様な任意成分としては、経口投与組成物であれば、例えば、乳糖や白糖などの賦形剤、デンプン、セルロ−ス、アラビアゴム、ヒドロキシプロピルセルロ−スなどの結合剤、カルボキシメチルセルロ−スナトリウム、カルボキシメチルセルロ−スカルシウムなどの崩壊剤、大豆レシチン、ショ糖脂肪酸エステルなどの界面活性剤、マルチト−ルやソルビト−ルなどの甘味剤、クエン酸などの酸味剤、リン酸塩などの緩衝剤、シェラックやツェインなどの皮膜形成剤、タルク、ロウ類などの滑沢剤、軽質無水ケイ酸、乾燥水酸化アルミニウムゲルなどの流動促進剤、生理食塩水、ブドウ糖水溶液などの希釈剤、矯味矯臭剤、着色剤、殺菌剤、防腐剤、香料など好適に例示出来る。経皮投与組成物であれば、スクワラン、ワセリン、マイクロクリスタリンワックスなどの炭化水素類、ホホバ油、カルナウバワックス、オレイン酸オクチルドデシルなどのエステル類、オリ−ブ油、牛脂、椰子油などのトリグリセライド類、ステアリン酸、オレイン酸、レチノイン酸などの脂肪酸、オレイルアルコ−ル、ステアリルアルコ−ル、オクチルドデカノ−ル等の高級アルコ−ル、スルホコハク酸エステルやポリオキシエチレンアルキル硫酸ナトリウム等のアニオン界面活性剤類、アルキルベタイン塩等の両性界面活性剤類、ジアルキルアンモニウム塩等のカチオン界面活性剤類、ソルビタン脂肪酸エステル、脂肪酸モノグリセライド、これらのポリオキシエチレン付加物、ポリオキシエチレンアルキルエ−テル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル等の非イオン界面活性剤類、ポリエチレングリコ−ル、グリセリン、１，３−ブタンジオ−ル等の多価アルコ−ル類、
増粘・ゲル化剤、酸化防止剤、紫外線吸収剤、色剤、防腐剤、粉体等を含有することができる。製造は、常法に従い、これらの成分を処理することにより、困難なく、為しうる。
In formulating the composition of the present invention, optional components used in formulating normal foods, pharmaceuticals, cosmetics and the like can be contained. Examples of such optional components include oral excipients such as excipients such as lactose and white sugar, binders such as starch, cellulose, gum arabic, and hydroxypropyl cellulose, carboxymethyl cellulose, Disintegrants such as sodium and carboxymethylcellulose calcium, surfactants such as soy lecithin and sucrose fatty acid ester, sweeteners such as malt and sorbitol, sour agents such as citric acid, phosphates, etc. Buffering agents, film forming agents such as shellac and zein, lubricants such as talc and wax, glidants such as light anhydrous silicic acid and dry aluminum hydroxide gel, diluents such as physiological saline and aqueous glucose solution, Suitable examples include flavoring agents, coloring agents, bactericides, preservatives, and fragrances. If it is a composition for transdermal administration, hydrocarbons such as squalane, petrolatum and microcrystalline wax, esters such as jojoba oil, carnauba wax, octyldodecyl oleate, triglycerides such as olive oil, beef tallow and coconut oil , Fatty acids such as stearic acid, oleic acid, retinoic acid, higher alcohols such as oleyl alcohol, stearyl alcohol, octyl decanol, anionic interfaces such as sulfosuccinic acid ester and sodium polyoxyethylene alkyl sulfate Activators, amphoteric surfactants such as alkylbetaine salts, cationic surfactants such as dialkylammonium salts, sorbitan fatty acid esters, fatty acid monoglycerides, their polyoxyethylene adducts, polyoxyethylene alkyl ethers, poly Oxyethylene Nonionic surfactants such as fatty acid esters, polyethylene glycol - le, glycerin, 1,3-butanediol - Le acids, - polyhydric alcohols, such as Le
Thickening / gelling agents, antioxidants, ultraviolet absorbers, colorants, preservatives, powders and the like can be contained. Manufacture can be done without difficulty by treating these components according to conventional methods.
本発明の組成物としては、医薬品、化粧品、食品、飲料などが好適に例示でき、日常的に摂取できることから、食品、化粧品等に適応することが好ましい。その投与経路も、経口投与、経皮投与の何れもが可能であるが、皮膚における色素沈着予防又は改善作用を発揮するためには、皮膚への貯留性、標的部位への到達効率等を考慮し、経皮投与を採用することが好ましい。 As the composition of the present invention, pharmaceuticals, cosmetics, foods, beverages and the like can be suitably exemplified, and since they can be taken on a daily basis, it is preferable to apply to foods, cosmetics and the like. The administration route can be either oral or transdermal, but in order to prevent or improve pigmentation in the skin, consider the retention in the skin, the efficiency of reaching the target site, etc. However, it is preferable to adopt transdermal administration.
前述のように本発明のスクリーニング方法によって判別されたＡＤＭ情報伝達系の活性化を阻害する成分は、美白剤として活用することができ、ＡＤＭ情報伝達系を活性化する成分は、脳梗塞、心筋梗塞、狭心症、高血圧等の血管系疾患、腫瘍、網膜症、関節炎、乾癬の治療薬、診断薬、色素沈着の予防又は改善剤として活用することができる。即ち、本発明の組成物もこれらの用途のとして好適に利用することができる。 As described above, the component that inhibits activation of the ADM information transmission system determined by the screening method of the present invention can be used as a whitening agent, and the component that activates the ADM information transmission system includes cerebral infarction and myocardium. It can be used as a remedy for vascular diseases such as infarction, angina pectoris, hypertension, tumor, retinopathy, arthritis, psoriasis, diagnostic agent, or prevention or amelioration of pigmentation. That is, the composition of the present invention can also be suitably used for these applications.
また、後述する実施例に記載されているシソ科ハナハッカ属マジョラムより得られる植物抽出物は、丸善製薬株式会社より購入した植物抽出物を使用した。シソ科ハナハッカ属マジョラムは、地中海、エジプト、北アフリカを原産地とする多年草であり、料理等に使用されている。また、前記の精油や植物抽出物には、消火促進作用、抗菌作用、抗炎症作用等の作用が存することが知られている。 Moreover, the plant extract purchased from Maruzen Pharmaceutical Co., Ltd. was used for the plant extract obtained from the Labiatae genus Marjoram described in the Example mentioned later. Lamiaceae genus marjoram is a perennial plant that originates in the Mediterranean, Egypt, and North Africa, and is used for cooking and other purposes. In addition, it is known that the essential oils and plant extracts have actions such as fire-extinguishing promoting action, antibacterial action, and anti-inflammatory action.
以下に、本発明に付いて、実施例を挙げて更に詳しく説明を加えるが、本発明がかかる実施例のみに限定されないことは言うまでもない。 In the following, the present invention will be described in more detail with reference to examples, but it goes without saying that the present invention is not limited to such examples.
＜試験例３：ＡＤＭ情報伝達系の活性化を阻害する成分のスクリーニング方法＞
以下に記載の手順に従い、ＡＤＭ情報伝達系の活性化を阻害する成分のスクリーニングを実施した。
１２穴プレートに正常ヒトメラノサイト（ＮＨＥＭ）（倉敷紡績株式会社）１．０×１０３（ｃｅｌｌｓｓ／ｗｅｌｌ）の密度で播種し、播種２４時間後、合成ＡＤＭ（ペプチド研究所４２７８−ｓ）１μＭとなるよう添加、同時に被験物質（植物抽出液）を培地中に１質量％となるように添加した。添加１２時間後の細胞の形態を光学顕微鏡で観察し、ランダムに撮影部位を設定、１０枚の写真を撮影し画像に取り込んだ。そして１０枚の画像中の＜１＞細胞全体が写っている細胞、＜２＞鮮明に形態が観察されている細胞をすべて選択し、デンドライトの総数及びデンドライトの分岐総数を計測、細胞数あたりの値に換算した。評価のため、ＡＤＭ無添加群を準備し、ＡＤＭ添加による増加量」と、ＡＤＭと被験物質添加時の増加量の値を算出し、被験物質による抑制率を算出した。結果を表１に示す。
<Test Example 3: Screening method for components that inhibit activation of ADM information transmission system>
According to the procedure described below, screening for components that inhibit the activation of the ADM signaling system was performed.
A 12-well plate was seeded with normal human melanocytes (NHEM) (Kurashiki Boseki Co., Ltd.) at a density of 1.0 × 10 3 (cells / well), 24 hours after sowing, 1 μM of synthetic ADM (Peptide Research Institute 4278-s) At the same time, the test substance (plant extract) was added to the medium so as to be 1% by mass. The morphology of the cells 12 hours after the addition was observed with an optical microscope, imaging sites were set at random, 10 photos were taken and captured in the images. Then, <1> cells in which the whole cell is shown in 10 images, <2> all cells whose morphology is clearly observed are selected, and the total number of dendrites and the total number of branches of dendrites are measured. Converted to value. For evaluation, an ADM non-addition group was prepared, and the value of “increase amount due to addition of ADM” and the increase amount when ADM and test substance were added were calculated, and the inhibition rate due to test substance was calculated. The results are shown in Table 1.
表１の結果より、シソ科ハナハッカ属マジョラムより得られる植物抽出物は、ＡＤＭ添加による各本数に対しデンドライトの総数では３２．４％、デンドライトの分岐総数では４０．４％の増加を抑制する効果があることが判明した。 From the results of Table 1, the plant extract obtained from Lamiaceae marjoram suppresses the increase of 32.4% in the total number of dendrites and 40.4% in the total number of branched dendrites with respect to the number of each ADM addition. Turned out to be.
＜製造例１：ＡＤＭ情報伝達系の活性化を阻害する成分を含有する組成物＞
以下の手順に従い、本発明のスクリーニング方法により選択されたＡＤＭ情報伝達系の活性化を阻害する成分を含有する組成物（皮膚外用剤）を作製した。即ち、表２の処方成分（Ａ）に記載の各成分を合わせ、室温下に溶解した。一方、処方成分（Ｂ）に記載された各成分を室温下に溶解し、これを（Ａ）に記載された処方の混合物に加え可溶化し、ＡＤＭ情報伝達系の活性化を阻害する成分を含有する組成物（皮膚外用剤１）を得た。
<Production Example 1: Composition containing a component that inhibits activation of ADM information transmission system>
According to the following procedure, a composition (external preparation for skin) containing a component that inhibits activation of the ADM information transmission system selected by the screening method of the present invention was prepared. That is, each component described in the formulation component (A) in Table 2 was combined and dissolved at room temperature. On the other hand, each component described in the prescription component (B) is dissolved at room temperature, and this is added to the mixture of the prescription described in (A) to solubilize the component that inhibits activation of the ADM information transmission system. The containing composition (skin external preparation 1) was obtained.
＜製造例２：ＡＤＭ情報伝達系の活性化を阻害する成分を含有する組成物＞
以下の手順に従い、本発明のスクリーニング方法により選択されたＡＤＭ情報伝達系の活性化を阻害する成分を含有する組成物（食品）を作製した。即ち、表３に記載の処方成分を１０質量部の水と共に転動相造粒（不二パウダニル株式会社製「ニューマルメライザー」）し、打錠して錠剤状の健康食品を得た。尚、表中の数値の単位は質量部を表す。
<Production Example 2: Composition containing a component that inhibits activation of ADM information transmission system>
According to the following procedure, a composition (food) containing a component that inhibits activation of the ADM information transmission system selected by the screening method of the present invention was prepared. That is, the prescription ingredients listed in Table 3 were tumbled in phase with 10 parts by weight of water ("Numarumerizer" manufactured by Fuji Paudanil Co., Ltd.) and tableted to obtain tablet-like health foods. In addition, the unit of the numerical value in a table | surface represents a mass part.
本発明は、食品、医薬品、化粧品（但し、医薬部外品を含む）等に応用することができる。 The present invention can be applied to foods, pharmaceuticals, cosmetics (including quasi-drugs) and the like.
Claims (8)
被験物質を添加し、さらにＡＤＭ情報伝達系の活性化因子を付与した細胞の形態を、被験物質を添加せずにＡＤＭ情報伝達系の活性化因子を付与した細胞の形態と比較して、ＡＤＭ情報伝達系の活性化因子を付与したことによって生じる細胞の形態変化が、前記被験物質によって抑制されていた場合に、前記被験物質にはＡＤＭ情報伝達系の活性化を阻害する作用があると判別することを特徴とする、スクリーニング方法。 A screening method for a component that inhibits activation of an adrenomedullin (ADM) signaling system, comprising:
Compare the morphology of the cells to which the activator of the ADM information transmission system was added with the test substance and the morphology of the cells to which the activator of the ADM information transmission system was added without adding the test substance. When a change in cell morphology caused by applying an activator of information transmission system is suppressed by the test substance, it is determined that the test substance has an action of inhibiting activation of the ADM information transmission system A screening method characterized by comprising:
被験物質を添加した色素細胞（メラノサイト）において、被験物質を添加しなかった色素細胞と比較して、デンドライトの総数及び／又はデンドライトの分岐総数が増加した場合に、前記被験物質にはＡＤＭ情報伝達系を活性化する作用があると推定することを特徴とする、スクリーニング方法。 A method for screening a candidate substance for a component that activates an adrenomedullin (ADM) signaling system, comprising:
At the pigment cells with the addition of test substance (melanocytes), as compared to the pigment cells without added test substance, if the branch total number of the total number and / or dendrite dendrite is increased, the said test substance ADM A screening method characterized by presuming that there is an effect of activating an information transmission system.
Candidate materials of component activating step, and the component or ADM signal transduction system to inhibit activation of ADM information transmission system is determined by the process performing the screening method according to any one of claims 1-7 The manufacturing method of the composition characterized by including the process of mix | blending with a composition.
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