JP5951085B2 - Improved β-fructofuranosidase - Google Patents

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Description

本発明は、改良型β−フルクトフラノシダーゼに関し、特に、スクロースを特異的に分解することができる改良型β−フルクトフラノシダーゼ、そのアミノ酸配列を含むポリペプチド、改良型β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡ、当該ＤＮＡを含む組換えベクター、当該ＤＮＡまたは当該組換えベクターを宿主に導入して得られる形質転換体ならびにそれらを用いた糖アルコールの製造方法およびフラクトオリゴ糖高純度液の製造方法に関する。   The present invention relates to an improved β-fructofuranosidase, and in particular, an improved β-fructofuranosidase capable of specifically degrading sucrose, a polypeptide containing the amino acid sequence thereof, and an improved β-fructofuranosidase. DNA encoding a sidase, a recombinant vector containing the DNA, a transformant obtained by introducing the DNA or the recombinant vector into a host, a method for producing a sugar alcohol using them, and production of a high purity fructooligosaccharide solution Regarding the method.

β−フルクトフラノシダーゼは、末端にフルクトース残基を含む糖質のフルクトースを認識して、加水分解する酵素である。β−フルクトフラノシダーゼの中には、加水分解活性に加えて、加水分解によって生じたフルクトースを基質に転移させるフルクトース転移活性を有するものも存在する。従来、係る加水分解活性とフルクトース転移活性とを有するβ−フルクトフラノシダーゼをスクロースに作用させることにより、工業的にフラクトオリゴ糖が製造されている（特許文献１）。   β-fructofuranosidase is an enzyme that recognizes and hydrolyzes fructose, a carbohydrate containing fructose residues at the ends. Some β-fructofuranosidases have fructose transfer activity for transferring fructose generated by hydrolysis to a substrate in addition to the hydrolysis activity. Conventionally, fructooligosaccharides have been industrially produced by allowing β-fructofuranosidase having such hydrolysis activity and fructose transfer activity to act on sucrose (Patent Document 1).

特開２０１３−２５２０５６号公報JP 2013-252056 A

スクロースを基質とし、β−フルクトフラノシダーゼを用いてフラクトオリゴ糖を製造する際には、副生成物としてグルコースおよびフルクトースが生成するほか、基質であるスクロースも反応液中に残存する。これらの不純物はクロマトグラフィーによりフラクトオリゴ糖と分離して除去されるが、このうち、スクロースは２糖であるため、単糖であるグルコースやフルクトースと比較して、フラクトオリゴ糖との分離が困難である。   When producing fructooligosaccharides using sucrose as a substrate and β-fructofuranosidase, glucose and fructose are produced as by-products, and sucrose as a substrate also remains in the reaction solution. These impurities are removed by separation from fructooligosaccharides by chromatography. Among these, since sucrose is a disaccharide, it is difficult to separate it from fructooligosaccharides compared to monosaccharides such as glucose and fructose. .

この点、スクロースを特異的に単糖に分解することができれば、クロマトグラフィーによるフラクトオリゴ糖の分離精製の効率を大きく向上させることができるため、フラクトオリゴ糖は分解せずに、専らスクロースを分解する酵素が求められている。本発明は、このような課題を解決するためになされたものであって、フラクトオリゴ糖をほとんど分解せず、スクロースを特異的に分解することができる改良型β−フルクトフラノシダーゼ、そのアミノ酸配列を含むポリペプチド、改良型β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡ、当該ＤＮＡを含む組換えベクター、当該ＤＮＡまたは当該組換えベクターを宿主に導入して得られる形質転換体ならびにそれらを用いた糖アルコールの製造方法およびフラクトオリゴ糖高純度液の製造方法を提供することを目的とする。   In this regard, if sucrose can be specifically decomposed into monosaccharides, the efficiency of separation and purification of fructooligosaccharides by chromatography can be greatly improved. Therefore, an enzyme that exclusively decomposes sucrose without degrading fructooligosaccharides. Is required. The present invention has been made to solve such a problem, and is an improved β-fructofuranosidase capable of specifically degrading sucrose without substantially degrading fructooligosaccharides, and its amino acid sequence. , A DNA encoding an improved β-fructofuranosidase, a recombinant vector containing the DNA, a transformant obtained by introducing the DNA or the recombinant vector into a host, and a sugar using the same It aims at providing the manufacturing method of alcohol, and the manufacturing method of fructooligosaccharide high purity liquid.

本発明者らは、鋭意研究の結果、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｔｈａｉｌａｎｄｉｃｕｓ ＮＢＲＣ３２５５の野生型β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列（配列番号２）に対して、Ｎ末端から１０５番目のアスパラギン（Ｎ）をアスパラギン酸（Ｄ）に置換するアミノ酸変異を導入することにより、フラクトオリゴ糖の生成および分解を抑制して、スクロースを特異的に分解できることを見出した。また、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｔｈａｉｌａｎｄｉｃｕｓ ＮＢＲＣ３２５５の野生型β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列（配列番号２）に対して、Ｎ末端から１０５番目のアスパラギン（Ｎ）をアスパラギン酸（Ｄ）またはセリン（Ｓ）に置換するアミノ酸変異と、Ｎ末端から３２１番目のヒスチジン（Ｈ）をアルギニン（Ｒ）またはリシン（Ｋ）に置換するアミノ酸変異とを導入することにより、フラクトオリゴ糖の生成および分解を抑制して、スクロースを特異的に分解できることを見出した。そこで、これらの知見に基づいて、下記の各発明を完成した。   As a result of intensive studies, the present inventors have determined that aspartic acid (D) is the 105th asparagine (N) from the N-terminal to the amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) of wild-type β-fructofuranosidase of Gluconobacter thalidicus NBRC3255. It was found that sucrose can be specifically decomposed by introducing an amino acid mutation to be substituted into () to suppress generation and degradation of fructooligosaccharides. In addition, aspartic acid (D) or serine (S) is substituted for the 105th asparagine (N) from the N-terminus to the amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) of the wild-type β-fructofuranosidase of Gluconobacter thalidicus NBRC3255. By introducing an amino acid mutation and an amino acid mutation that replaces 321st histidine (H) from the N-terminus with arginine (R) or lysine (K), the production and degradation of fructooligosaccharides is suppressed, and sucrose is made specific It was found that it can be decomposed automatically. Accordingly, the following inventions have been completed based on these findings.

（１）本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼの一態様は、下記（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列からなる；（ａ）配列番号２に示す野生型β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列に対して、Ｎ末端から１０５番目のアスパラギン（Ｎ）をアスパラギン酸（Ｄ）に置換するアミノ酸変異を導入したアミノ酸配列、（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において、アミノ酸変異が導入されたアミノ酸を除く１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつスクロース分解活性を有するアミノ酸配列。 (1) One aspect of the improved β-fructofuranosidase according to the present invention comprises the following amino acid sequence (a) or (b): (a) the wild-type β-fructofuranosidase shown in SEQ ID NO: 2 An amino acid sequence in which an amino acid mutation that replaces the 105th asparagine (N) from the N-terminus with aspartic acid (D) was introduced, and an amino acid mutation was introduced in (b) amino acid sequence (a). An amino acid sequence comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids excluding amino acids are deleted, substituted, inserted or added, and having sucrose degradation activity.

（２）本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼのもう一つの態様は、下記（ｃ）または（ｄ）のアミノ酸配列からなる；（ｃ）配列番号２に示す野生型β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列に対して、以下のｉ）およびｉｉ）のアミノ酸変異を導入したアミノ酸配列；ｉ）Ｎ末端から１０５番目のアスパラギン（Ｎ）をアスパラギン酸（Ｄ）またはセリン（Ｓ）に置換するアミノ酸変異、ｉｉ）Ｎ末端から３２１番目のヒスチジン（Ｈ）をアルギニン（Ｒ）またはリシン（Ｋ）に置換するアミノ酸変異、（ｄ）アミノ酸配列（ｃ）において、アミノ酸変異が導入されたアミノ酸を除く１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつスクロース分解活性を有するアミノ酸配列。 (2) Another embodiment of the improved β-fructofuranosidase according to the present invention comprises the following amino acid sequence (c) or (d); (c) the wild-type β-fructo shown in SEQ ID NO: 2 An amino acid sequence in which amino acid mutations i) and ii) below are introduced to the amino acid sequence of furanosidase; i) asparagine (N) at position 105 from the N-terminus is replaced with aspartic acid (D) or serine (S) Ii) an amino acid mutation in which 321st histidine (H) from the N-terminus is replaced with arginine (R) or lysine (K), (d) an amino acid in which an amino acid mutation is introduced in amino acid sequence (c) An amino acid sequence comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids except for it are deleted, substituted, inserted or added, and having sucrose degradation activity.

（３）本発明に係るポリペプチドは、（１）または（２）に記載の改良型β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列を含む。 (3) The polypeptide according to the present invention comprises the amino acid sequence of the improved β-fructofuranosidase described in (1) or (2).

（４）本発明に係るＤＮＡは、（１）または（２）に記載の改良型β−フルクトフラノシダーゼをコードする。 (4) The DNA according to the present invention encodes the improved β-fructofuranosidase described in (1) or (2).

（５）本発明に係る組換えベクターは、（４）に記載のＤＮＡを含む。 (5) A recombinant vector according to the present invention comprises the DNA described in (4).

（６）本発明に係る形質転換体は、（４）に記載のＤＮＡまたは（５）に記載の組換えベクターを宿主に導入して得られる、形質転換体である。 (6) The transformant according to the present invention is a transformant obtained by introducing the DNA described in (4) or the recombinant vector described in (5) into a host.

（７）本発明に係る糖アルコールの製造方法は、（１）もしくは（２）に記載の改良型β−フルクトフラノシダーゼ、（６）に記載の形質転換体または（６）に記載の形質転換体を培養して得られる培養物とスクロースとを接触させて、前記スクロースを単糖に分解する工程を有する。 (7) The method for producing a sugar alcohol according to the present invention includes an improved β-fructofuranosidase according to (1) or (2), a transformant according to (6), or a trait according to (6). A step of bringing a culture obtained by culturing the transformant into contact with sucrose to decompose the sucrose into monosaccharides.

（８）本発明に係るフラクトオリゴ糖高純度液の製造方法は、（１）もしくは（２）に記載の改良型β−フルクトフラノシダーゼ、（６）に記載の形質転換体または（６）に記載の形質転換体を培養して得られる培養物とフラクトオリゴ糖溶液に含有されるスクロースとを接触させて、前記スクロースを単糖に分解する工程を有する。 (8) The method for producing a fructooligosaccharide high-purity solution according to the present invention includes the improved β-fructofuranosidase according to (1) or (2), the transformant according to (6), or (6) A step of decomposing the sucrose into monosaccharides by contacting a culture obtained by culturing the transformant described above with sucrose contained in the fructooligosaccharide solution;

本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼによれば、フラクトオリゴ糖をほとんど分解せず、スクロースを特異的に分解することができる。よって、これを用いて、スクロースを含むフラクトオリゴ糖溶液からの、クロマトグラフィーによるフラクトオリゴ糖の分離精製効率を向上させることができる。すなわち、これを用いて、フラクトオリゴ糖の高純度液を製造することができる。また、これを用いて、スクロースから糖アルコールを効率的に製造することができる。   According to the improved β-fructofuranosidase according to the present invention, sucrose can be specifically decomposed with almost no degradation of fructooligosaccharides. Therefore, using this, the separation and purification efficiency of fructooligosaccharides by chromatography from the fructooligosaccharide solution containing sucrose can be improved. That is, a high-purity solution of fructooligosaccharide can be produced using this. Moreover, sugar alcohol can be efficiently manufactured from this using sucrose.

また、本発明に係るポリペプチドや本発明に係るＤＮＡ、本発明に係る組換えベクター、本発明に係る形質転換体によれば、スクロースを特異的に分解することができる改良型β−フルクトフラノシダーゼを得ることができる。   Moreover, according to the polypeptide according to the present invention, the DNA according to the present invention, the recombinant vector according to the present invention, and the transformant according to the present invention, an improved β-fruct capable of specifically degrading sucrose. Furanosidase can be obtained.

以下、本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼ、ポリペプチド、ＤＮＡ、組換えベクター、形質転換体ならびにそれらを用いた糖アルコールの製造方法およびフラクトオリゴ糖高純度液の製造方法について詳細に説明する。   Hereinafter, the improved β-fructofuranosidase, polypeptide, DNA, recombinant vector, transformant, sugar alcohol production method using the same, and fructooligosaccharide high purity solution production method according to the present invention will be described in detail. To do.

本発明において、「β−フルクトフラノシダーゼ」は、「フルクトシルトランスフェラーゼ」、「サッカラーゼ」、「β−Ｄ−フルクトフラノシダーゼ」、「インベルターゼ」、「インバーターゼ」または「インベルチン」と交換可能に用いられる場合がある。また、本発明における「野生型β−フルクトフラノシダーゼ」とは、遺伝子工学の手法を用いてアミノ酸変異を導入していないアミノ酸配列からなるβ−フルクトフラノシダーゼをいい、「改良型β−フルクトフラノシダーゼ」とは、野生型β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列に対して、１または２以上のアミノ酸変異を導入したアミノ酸配列からなるβ−フルクトフラノシダーゼをいう。   In the present invention, “β-fructofuranosidase” can be replaced with “fructosyltransferase”, “saccharase”, “β-D-fructofuranosidase”, “invertase”, “invertase” or “invertin”. May be used. The “wild-type β-fructofuranosidase” in the present invention refers to β-fructofuranosidase consisting of an amino acid sequence into which no amino acid mutation has been introduced using a genetic engineering technique. “Fructofuranosidase” refers to β-fructofuranosidase consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acid mutations are introduced into the amino acid sequence of wild-type β-fructofuranosidase.

本発明において、「改良型β−フルクトフラノシダーゼがスクロースを特異的に分解する」とは、β−フルクトフラノシダーゼが有する「末端にフルクトース残基を含む糖質に対する加水分解活性」および「フルクトース転移活性」のうち、「スクロースに対する加水分解活性」が主となっている状態をいう。すなわち、「スクロースに対する加水分解活性」のみを呈する場合のほか、「スクロースに対する加水分解活性」を主としつつ「スクロース以外の末端にフルクトース残基を含む糖質に対する加水分解活性」や「フルクトース転移活性」をも呈する場合も含まれる。   In the present invention, “an improved β-fructofuranosidase specifically degrades sucrose” means that “hydrolysis activity for a carbohydrate containing a fructose residue at the terminal” possessed by β-fructofuranosidase and “ "Fructose transfer activity" refers to a state where "hydrolysis activity on sucrose" is mainly used. That is, in addition to exhibiting only “hydrolysis activity on sucrose”, “hydrolysis activity on carbohydrates containing fructose residues at the other end than sucrose” and “fructose transfer activity”, mainly “hydrolysis activity on sucrose” "Is also included.

本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼの一態様は、下記（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列からなる；
（ａ）配列番号２に示す野生型β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列に対して、Ｎ末端（アミノ末端）から１０５番目のアスパラギン（Ｎ）をアスパラギン酸（Ｄ）に置換するアミノ酸変異を導入したアミノ酸配列、
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において、アミノ酸変異が導入されたアミノ酸を除く１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつスクロース分解活性を有するアミノ酸配列。 One aspect of the improved β-fructofuranosidase according to the present invention consists of the following amino acid sequence (a) or (b):
(A) Introduction of an amino acid mutation that replaces the 105th asparagine (N) with aspartic acid (D) from the N-terminal (amino terminal) to the amino acid sequence of wild-type β-fructofuranosidase shown in SEQ ID NO: 2 Amino acid sequence,
(B) An amino acid sequence consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids except amino acid introduced with amino acid mutation are deleted, substituted, inserted or added in amino acid sequence (a) and having sucrose-degrading activity.

また、本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼのもう一つの態様は、下記（ｃ）または（ｄ）のアミノ酸配列からなる；
（ｃ）配列番号２に示す野生型β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列に対して、以下のｉ）およびｉｉ）のアミノ酸変異を導入したアミノ酸配列；
ｉ）Ｎ末端（アミノ末端）から１０５番目のアスパラギン（Ｎ）をアスパラギン酸（Ｄ）またはセリン（Ｓ）に置換するアミノ酸変異、
ｉｉ）Ｎ末端（アミノ末端）から３２１番目のヒスチジン（Ｈ）をアルギニン（Ｒ）またはリシン（Ｋ）に置換するアミノ酸変異、
（ｄ）アミノ酸配列（ｃ）において、アミノ酸変異が導入されたアミノ酸を除く１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつスクロース分解活性を有するアミノ酸配列。 Another embodiment of the improved β-fructofuranosidase according to the present invention consists of the following amino acid sequence (c) or (d):
(C) an amino acid sequence obtained by introducing the following amino acid mutations i) and ii) with respect to the amino acid sequence of wild-type β-fructofuranosidase shown in SEQ ID NO: 2;
i) an amino acid mutation for substituting aspartic acid (D) or serine (S) for asparagine (N) at position 105 from the N-terminus (amino terminus);
ii) an amino acid mutation that replaces 321st histidine (H) from the N-terminus (amino terminus) with arginine (R) or lysine (K);
(D) An amino acid sequence consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids except the amino acid into which an amino acid mutation has been introduced is deleted, substituted, inserted or added in the amino acid sequence (c) and having sucrose-degrading activity.

本発明において、「配列番号２に示す野生型β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列」は、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｔｈａｉｌａｎｄｉｃｕｓ ＮＢＲＣ３２５５の野生型β−フルクトフラノシダーゼ（以下、「Ｇ．ｔｈａｉ由来野生型β−フルクトフラノシダーゼ」と略記する。）のアミノ酸配列を指す。   In the present invention, the “amino acid sequence of wild-type β-fructofuranosidase shown in SEQ ID NO: 2” is a wild-type β-fructofuranosidase (hereinafter referred to as “G.thai-derived wild-type β-fructosidase” of Gluconobacter thalidicus NBRC3255). Abbreviated “furanosidase”)).

本発明において、「１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列」とは、例えば、１〜３０個、１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、よりさらに好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を意味する。   In the present invention, the “amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, inserted, or added” is, for example, 1 to 30, 1 to 20, preferably 1 to 15, more preferably. Means an amino acid sequence in which 1 to 10, more preferably 1 to 5 amino acids have been deleted, substituted, inserted or added.

本発明において、あるタンパク質がスクロース分解活性を有するか否かは、常法に従い確認することができ、例えば、後述する実施例２（１）に示すように、当該タンパク質をスクロースを含む反応液中でインキュベートし、または当該タンパク質を発現させた形質転換体をスクロースを含む反応液中で振盪した後、その反応液の含有物を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などにより確認する。その結果、グルコースやフルクトースなどのスクロースの加水分解により生じた物質の存在が確認されれば、当該タンパク質はスクロース分解活性を有すると判断することができる。   In the present invention, whether or not a certain protein has sucrose decomposition activity can be confirmed according to a conventional method. For example, as shown in Example 2 (1) described later, the protein is contained in a reaction solution containing sucrose. The transformant that expresses the protein is shaken in a reaction solution containing sucrose, and then the content of the reaction solution is confirmed by high performance liquid chromatography (HPLC) or the like. As a result, if the presence of a substance produced by hydrolysis of sucrose such as glucose or fructose is confirmed, it can be determined that the protein has sucrose-degrading activity.

本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼは常法に従って得ることができ、そのような方法としては、例えば、化学合成する方法や、遺伝子組換え技術による方法を挙げることができる。化学合成する方法としては、例えば、本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列情報に基づいて、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）などにより合成する方法の他、各種の市販のペプチド合成機を利用して合成する方法を挙げることができる。   The improved β-fructofuranosidase according to the present invention can be obtained according to a conventional method. Examples of such a method include a chemical synthesis method and a gene recombination method. Examples of the chemical synthesis method include Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method), tBoc method (t-butyloxycarbonyl method) based on the amino acid sequence information of the improved β-fructofuranosidase according to the present invention. In addition to the method of synthesizing by a), the method of synthesizing using various commercially available peptide synthesizers can be mentioned.

また、遺伝子組換え技術による方法としては、本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼを好適な発現系にて発現させる方法を挙げることができる。すなわち、本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡを適当な宿主に導入して形質転換体を得る。あるいは、後述する実施例１に示すように、本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡを、適当なベクターに挿入して組換えベクターを得た後、その組換えベクターを適当な宿主に導入して形質転換体を得る。そして、得られた形質転換体を培養して改良型β−フルクトフラノシダーゼを発現させることにより、本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼを得ることができる。   In addition, examples of the method using the gene recombination technique include a method of expressing the improved β-fructofuranosidase according to the present invention in a suitable expression system. That is, a transformant is obtained by introducing the DNA encoding the improved β-fructofuranosidase according to the present invention into a suitable host. Alternatively, as shown in Example 1 described later, after a DNA encoding the improved β-fructofuranosidase according to the present invention is inserted into an appropriate vector to obtain a recombinant vector, the recombinant vector is A transformant is obtained by introducing it into an appropriate host. And the improved beta-fructofuranosidase which concerns on this invention can be obtained by culture | cultivating the obtained transformant and expressing improved beta-fructofuranosidase.

ここで、本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡは、その塩基酸配列情報に基づいて、市販されている種々のＤＮＡ合成機を用いて合成することができるほか、野生型β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡや改良型β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡを鋳型として、ポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ；ＰＣＲ）を行うことにより得ることができる。   Here, the DNA encoding the improved β-fructofuranosidase according to the present invention can be synthesized using various commercially available DNA synthesizers based on the basic acid sequence information. It can be obtained by performing a polymerase chain reaction (PCR) using a DNA encoding type β-fructofuranosidase or a DNA encoding improved β-fructofuranosidase as a template.

例えば、改良型β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡを得る場合は、後述する実施例１に示すように、まず、導入するアミノ酸変異をコードするＤＮＡプライマーを設計し、そのＤＮＡプライマーを用いて、野生型β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行うことにより得ることができる。   For example, when obtaining DNA encoding improved β-fructofuranosidase, as shown in Example 1 described later, first, a DNA primer encoding the amino acid mutation to be introduced is designed, and the DNA primer is used. It can be obtained by performing PCR using DNA encoding wild-type β-fructofuranosidase as a template.

上記（ｂ）または（ｄ）の、「アミノ酸配列（ａ）または（ｃ）において、アミノ酸変異が導入されたアミノ酸を除く１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列」からなる改良型β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡもまた、ＰＣＲにより得ることができる。すなわち、まず、アミノ酸配列（ａ）または（ｃ）において、アミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加された箇所に相当するアミノ酸配列をコードするＤＮＡプライマーを設計し、次に、そのＤＮＡプライマーを用いて、アミノ酸配列（ａ）または（ｃ）をコードするＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行うことにより得ることができる。   In the above (b) or (d), “in the amino acid sequence (a) or (c), an amino acid sequence in which one or several amino acids excluding amino acids into which amino acid mutations have been introduced are deleted, substituted, inserted or added A DNA encoding an improved β-fructofuranosidase consisting of can also be obtained by PCR. That is, first, in the amino acid sequence (a) or (c), a DNA primer encoding an amino acid sequence corresponding to the amino acid sequence deleted, substituted, inserted or added is designed, and then the DNA primer is used. Thus, it can be obtained by performing PCR using a DNA encoding the amino acid sequence (a) or (c) as a template.

次に、本発明は、改良型β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。なお、本発明に係るポリペプチドにおいて、上述した本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼと同じまたは相当する構成については、再度の説明を省略する。   Next, the present invention provides a polypeptide comprising the amino acid sequence of an improved β-fructofuranosidase. In addition, in the polypeptide which concerns on this invention, about the structure which is the same as that of the improved beta-fructofuranosidase which concerns on this invention mentioned above, or the structure corresponding, it abbreviate | omits description.

本発明に係るポリペプチドは、改良型β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列を含む限り、その配列長は特に限定されず、改良型β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列のみからなるものでもよく、改良型β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列のＮ末端および／またはＣ末端（カルボキシル末端）に、１もしくは複数個のアミノ酸残基が付加されたアミノ酸配列からなるものでもよい。また、本発明に係るポリペプチドは、上述した改良型β−フルクトフラノシダーゼを得る方法と同様の方法により得ることができる。   As long as the polypeptide according to the present invention includes the amino acid sequence of the improved β-fructofuranosidase, the sequence length is not particularly limited, and the polypeptide may consist only of the amino acid sequence of the improved β-fructofuranosidase, It may consist of an amino acid sequence in which one or a plurality of amino acid residues are added to the N-terminal and / or C-terminal (carboxyl terminal) of the amino acid sequence of the improved β-fructofuranosidase. The polypeptide according to the present invention can be obtained by the same method as the method for obtaining the improved β-fructofuranosidase described above.

次に、本発明は、改良型β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡを提供する。本発明に係るＤＮＡにおいて、上述した本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼおよびポリペプチドと同じまたは相当する構成については、再度の説明を省略する。   Next, the present invention provides DNA encoding an improved β-fructofuranosidase. In the DNA according to the present invention, the description of the same or corresponding configuration as the above-described improved β-fructofuranosidase and polypeptide according to the present invention is omitted.

また、本発明は、改良型β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡを含む組換えベクターを提供する。なお、本発明に係る組換えベクターにおいて、上述した本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼ、ポリペプチドおよびＤＮＡと同じまたは相当する構成については、再度の説明を省略する。   The present invention also provides a recombinant vector comprising DNA encoding an improved β-fructofuranosidase. In the recombinant vector according to the present invention, the description of the same or corresponding configuration as the above-described improved β-fructofuranosidase, polypeptide and DNA according to the present invention is omitted.

本発明に係る組換えベクターは、例えば、本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡをベクターに挿入することにより得ることができる。ＤＮＡのベクターへの挿入は、常法に従って行うことができ、例えば、ＤＮＡと線状化したベクターのＤＮＡ断片とをライゲーションすることにより行うことができる。ここで、ベクターとしては、例えば、ファージベクターやプラスミドベクター、コスミド、ファージミドなどを挙げることができ、宿主や操作性などに応じて適宜選択することができる。また、本発明に係る組換えベクターは、本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡのほかに、薬剤耐性マーカー遺伝子や栄養要求マーカー遺伝子などの形質転換体の選択マーカー遺伝子、改良型β−フルクトフラノシダーゼの発現に必要なプロモーター、転写開始信号、リボゾーム結合部位、翻訳停止シグナル、転写終結信号などの転写調節信号や翻訳調節信号などを含むものであってもよい。   The recombinant vector according to the present invention can be obtained, for example, by inserting a DNA encoding the improved β-fructofuranosidase according to the present invention into the vector. Insertion of DNA into a vector can be performed according to a conventional method, for example, by ligating DNA with a DNA fragment of a linearized vector. Here, examples of the vector include a phage vector, a plasmid vector, a cosmid, and a phagemid, and can be appropriately selected depending on the host, operability, and the like. In addition to the DNA encoding the improved β-fructofuranosidase according to the present invention, the recombinant vector according to the present invention includes a selection marker gene for a transformant such as a drug resistance marker gene and an auxotrophic marker gene, It may contain a transcription regulatory signal such as a promoter necessary for the expression of improved β-fructofuranosidase, a transcription initiation signal, a ribosome binding site, a translation termination signal, a transcription termination signal, a translation regulation signal, and the like.

また、本発明は、形質転換体も提供する。なお、本発明に係る形質転換体において、上述した本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼ、ポリペプチド、ＤＮＡおよび組換えベクターと同じまたは相当する構成については、再度の説明を省略する。   The present invention also provides a transformant. In the transformant according to the present invention, the description of the same or equivalent configuration as the above-described improved β-fructofuranosidase, polypeptide, DNA and recombinant vector according to the present invention is omitted.

本発明に係る形質転換体は、本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡまたは当該ＤＮＡを含む組換えベクターを宿主に導入して得られる。ここで、宿主としては、例えば、大腸菌や枯草菌などの細菌、酵母、カビ、糸状菌などを挙げることができ、組換えベクターの種類や操作性などに応じて適宜選択することができる。ＤＮＡや組換えベクターの宿主への導入（形質転換）は常法に従って行うことができ、例えば、プラスミドを用いた組換えベクターを大腸菌に導入する場合であれば、大腸菌のコンピテントセルに組換えベクターを加えて氷上で３０分間静置し、続いて４２℃のウォーターバスに入れて４５秒間静置した後、氷上で２分間静置し、その後、培地を加えて、３７℃で１時間振とうすることにより行うことができる。また、宿主の染色体に直接目的のＤＮＡを導入する場合は、相同組換え法などを用いることができる。   The transformant according to the present invention can be obtained by introducing a DNA encoding the improved β-fructofuranosidase according to the present invention or a recombinant vector containing the DNA into a host. Here, examples of the host include bacteria such as Escherichia coli and Bacillus subtilis, yeasts, molds, filamentous fungi, and the like, which can be appropriately selected according to the type and operability of the recombinant vector. Introduction (transformation) of DNA or a recombinant vector into a host can be performed according to a conventional method. For example, when a recombinant vector using a plasmid is introduced into E. coli, it is recombined into a competent cell of E. coli. Add vector and let stand on ice for 30 minutes, then place in a water bath at 42 ° C for 45 seconds, let stand on ice for 2 minutes, then add medium and shake at 37 ° C for 1 hour. This can be done. Moreover, when introducing the target DNA directly into the host chromosome, a homologous recombination method or the like can be used.

次に、本発明は、糖アルコールの製造方法を提供する。本発明に係る糖アルコールの製造方法は、
（ア）本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼ、本発明に係る形質転換体または本発明に係る形質転換体を培養して得られる培養物とスクロースとを接触させて、前記スクロースを単糖に分解する工程
を有する。なお、本発明に係る糖アルコールの製造方法において、上述した本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼ、ポリペプチド、ＤＮＡ、組換えベクターおよび形質転換体と同じまたは相当する構成については、再度の説明を省略する。 Next, the present invention provides a method for producing a sugar alcohol. The method for producing a sugar alcohol according to the present invention comprises:
(A) Contacting the improved β-fructofuranosidase according to the present invention, the transformant according to the present invention or a culture obtained by culturing the transformant according to the present invention with sucrose, A step of breaking down into monosaccharides. In the method for producing a sugar alcohol according to the present invention, the same or equivalent structure as the above-described improved β-fructofuranosidase, polypeptide, DNA, recombinant vector and transformant according to the present invention is again used. The description of is omitted.

ここで、「糖アルコール」とは、アルドースやケトースのカルボニル基が還元されて生成する糖質である。よって、スクロースを原料として糖アルコールを製造する場合は、スクロースを単糖（フルクトースおよびグルコース）に分解した後、これらの単糖に水素を付加することにより、マンニトール（単糖がフルクトースである場合）やソルビトール（単糖がフルクトースまたはグルコースである場合）といった糖アルコールを製造することができる。   Here, the “sugar alcohol” is a carbohydrate produced by reduction of a carbonyl group of aldose or ketose. Therefore, when sugar alcohol is produced from sucrose as a raw material, sucrose is decomposed into monosaccharides (fructose and glucose), and then hydrogen is added to these monosaccharides to produce mannitol (when the monosaccharide is fructose). And sugar alcohols such as sorbitol (when the monosaccharide is fructose or glucose) can be produced.

すなわち、本発明に係る糖アルコールの製造方法は、上記（ア）のスクロースを単糖に分解する工程の後に、（イ）単糖に水素を付加する工程を有していてもよい。   That is, the method for producing a sugar alcohol according to the present invention may include (i) a step of adding hydrogen to a monosaccharide after the step (a) of decomposing sucrose into a monosaccharide.

（ア）の本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼとスクロースとを接触させる方法としては、例えば、改良型β−フルクトフラノシダーゼをスクロースを含む溶液に添加し、３７℃〜５０℃で２０時間程度静置する方法を挙げることができる。また、（ア）の本発明に係る形質転換体とスクロースとを接触させる方法としては、例えば、宿主が大腸菌の場合は、本発明に係る形質転換体をスクロースを含む溶液に添加し、５０℃で数日間振盪する方法を挙げることができる。   As a method of contacting the improved β-fructofuranosidase and sucrose according to the present invention of (a), for example, the improved β-fructofuranosidase is added to a solution containing sucrose, and 37 ° C. to 50 ° C. The method of leaving still for about 20 hours can be mentioned. In addition, as a method for contacting the transformant according to the present invention of (a) with sucrose, for example, when the host is Escherichia coli, the transformant according to the present invention is added to a solution containing sucrose and 50 ° C. Can be mentioned for several days.

また、（ア）の本発明に係る形質転換体を培養して得られる培養物とスクロースとを接触させる方法としては、例えば、本発明に係る形質転換体を培養して得られる培養物をスクロースを含む溶液に添加し、３０℃〜５０℃で２０時間程度静置あるいは振盪する方法を挙げることができる。ここで、培養物は、破砕、磨砕、緩衝液への懸濁、凍結融解、超音波処理、遠心分離、熱処理、塩沈澱、溶媒沈澱、透析、限外ろ過、ゲルろ過、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、等電点電気泳動などの何らかの処理に供したものでもよく、処理に供していないものでもよい。   Moreover, as a method of contacting the culture obtained by culturing the transformant according to the present invention of (a) with sucrose, for example, the culture obtained by culturing the transformant according to the present invention is sucrose. And a method in which the solution is allowed to stand at 30 ° C. to 50 ° C. for about 20 hours or shaken. Here, the culture is disrupted, ground, suspended in buffer, freeze-thawed, sonication, centrifugation, heat treatment, salt precipitation, solvent precipitation, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, SDS-polyacrylamide. It may be subjected to some treatment such as gel electrophoresis, ion exchange chromatography, affinity chromatography, hydrophobic chromatography, reverse phase chromatography, isoelectric focusing, etc., or may not be subjected to treatment.

（イ）の単糖に水素を付加する方法としては、例えば、高温高圧の水素雰囲気下にて、ニッケル等の金属触媒を用いて還元する方法（接触還元法）のほか、室温常圧の窒素雰囲気下にて、水素化ホウ素ナトリウム又は水素化アルミニウムリチウム等の還元剤を用いて還元する方法を挙げることができる。接触還元法の場合、より具体的には、単糖（グルコースまたはフルクトース）、適量の水およびニッケル等の金属触媒をオートクレーブに加えて懸濁し、そこに水素を加え、所定の反応温度および反応圧力で一定時間加熱撹拌する方法を挙げることができる。   As a method for adding hydrogen to the monosaccharide of (a), for example, in addition to a method using a metal catalyst such as nickel in a high-temperature and high-pressure hydrogen atmosphere (catalytic reduction method), nitrogen at room temperature and normal pressure Examples of the method include reduction using a reducing agent such as sodium borohydride or lithium aluminum hydride under an atmosphere. In the case of the catalytic reduction method, more specifically, a monosaccharide (glucose or fructose), an appropriate amount of water and a metal catalyst such as nickel are added to an autoclave, suspended, hydrogen is added thereto, and a predetermined reaction temperature and reaction pressure are added. And a method of heating and stirring for a certain time.

最後に、本発明は、フラクトオリゴ糖高純度液の製造方法を提供する。本発明に係るフラクトオリゴ糖高純度液の製造方法は、
（カ）本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼ、本発明に係る形質転換体または本発明に係る形質転換体を培養して得られる培養物とフラクトオリゴ糖溶液に含有されるスクロースとを接触させて、前記スクロースを単糖に分解する工程
を有する。なお、本発明に係るフラクトオリゴ糖高純度液の製造方法において、上述した本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼ、ポリペプチド、ＤＮＡ、組換えベクター、形質転換体および糖アルコールの製造方法と同じまたは相当する構成については、再度の説明を省略する。 Finally, the present invention provides a method for producing a fructooligosaccharide high-purity solution. The method for producing a fructooligosaccharide high-purity liquid according to the present invention is as follows.
(F) The improved β-fructofuranosidase according to the present invention, the transformant according to the present invention or a culture obtained by culturing the transformant according to the present invention and sucrose contained in the fructooligosaccharide solution. Contacting the sucrose into monosaccharides. In the method for producing a fructooligosaccharide high-purity solution according to the present invention, the improved β-fructofuranosidase, polypeptide, DNA, recombinant vector, transformant and sugar alcohol production method according to the present invention described above, The description of the same or corresponding configuration is omitted.

ここで、「フラクトオリゴ糖」とは、スクロースのフルクトース残基にフルクトースが１〜十数個結合してなる糖類をいう。また、本発明において、「フラクトオリゴ糖高純度液」とは、フラクトオリゴ糖の含有割合が、フラクトオリゴ糖以外の糖類の含有割合と比較して大きい糖類溶液をいう。   Here, the “fructo-oligosaccharide” refers to a saccharide obtained by binding 1 to 10 or more fructose residues to a fructose residue of sucrose. In the present invention, the “fructooligosaccharide high-purity solution” refers to a saccharide solution in which the content ratio of fructooligosaccharide is larger than the content ratio of saccharides other than fructooligosaccharide.

（カ）の本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼ、本発明に係る形質転換体または本発明に係る形質転換体を培養して得られる培養物とフラクトオリゴ糖溶液に含有されるスクロースとを接触させる方法は、上述の「糖アルコールの製造方法」の（ア）の工程におけるものと同様の方法を挙げることができる。   (I) the improved β-fructofuranosidase according to the present invention, the transformant according to the present invention or a culture obtained by culturing the transformant according to the present invention, and sucrose contained in the fructooligosaccharide solution; Examples of the method for contacting the same as mentioned above include the same methods as those in the step (a) of the above-mentioned “method for producing a sugar alcohol”.

ここで、（カ）のスクロースを含有する「フラクトオリゴ糖溶液」は、例えば、加水分解活性とフルクトース転移活性とを有するβ−フルクトフラノシダーゼをスクロースを含む溶液に添加し、３７℃〜５０℃で２０時間程度反応させることにより得ることができる。   Here, the “fructooligosaccharide solution” containing (f) sucrose is prepared by adding, for example, β-fructofuranosidase having hydrolysis activity and fructose transfer activity to a solution containing sucrose at 37 ° C. to 50 ° C. Can be obtained by reacting for about 20 hours.

本発明に係るフラクトオリゴ糖高純度液の製造方法は、（カ）のスクロースを単糖に分解する工程の後に、（キ）前記フラクトオリゴ糖溶液から単糖を除去する工程を有していてもよい。   The method for producing a fructooligosaccharide high-purity solution according to the present invention may include (f) removing a monosaccharide from the fructooligosaccharide solution after (f) decomposing sucrose into a monosaccharide. .

（キ）のフラクトオリゴ糖溶液から単糖を除去する方法としては、例えば、液体クロマトグラフィー法や膜分離法を挙げることができる。液体クロマトグラフィー法の場合は、単糖を含有するフラクトオリゴ糖溶液を原料液とし、イオン交換水を溶離液として、カラムに陽イオン交換樹脂を充填し、５０℃に加温して各液を供給し、液体クロマトグラフィーを行ってフラクトオリゴ糖と単糖とを分離して、フラクトオリゴ糖を高純度に含むフラクションを分取する方法を挙げることができる。また、膜分離法の場合は、単糖を含有するフラクトオリゴ糖溶液をナノろ過膜（ＮＦ膜；分画分子量２５００）に供して、単糖を高純度に含む透過液とフラクトオリゴ糖を高純度に含む保持液とに分離し、この保持液を回収する方法を挙げることができる。   Examples of the method for removing monosaccharides from the (f) fructooligosaccharide solution include a liquid chromatography method and a membrane separation method. In the case of the liquid chromatography method, a fructooligosaccharide solution containing a monosaccharide is used as a raw material liquid, ion exchange water is used as an eluent, a column is filled with a cation exchange resin, and each liquid is supplied by heating to 50 ° C. In addition, a method of separating a fructooligosaccharide and a monosaccharide by performing liquid chromatography and fractionating a fraction containing the fructooligosaccharide with high purity can be mentioned. In the case of membrane separation, a fructooligosaccharide solution containing a monosaccharide is applied to a nanofiltration membrane (NF membrane; fractional molecular weight 2500), and a permeate containing the monosaccharide with a high purity and a fructooligosaccharide with a high purity are used. A method for recovering the retentate by separating the retentate from the retentate is included.

本発明に係る糖アルコールの製造方法またはフラクトオリゴ糖高純度液の製造方法には、本発明に係る製造方法の特徴を損なわない限り、他の工程を有してもよく、例えば、結晶化工程、乾燥工程、洗浄工程、濾過工程、殺菌工程、食品添加物を添加する工程などを有してもよい。   The sugar alcohol production method or fructooligosaccharide high-purity liquid production method according to the present invention may have other steps as long as the characteristics of the production method according to the present invention are not impaired, for example, a crystallization step, You may have a process of adding a drying process, a washing process, a filtration process, a sterilization process, a food additive, etc.

以下、本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼ、ポリペプチド、ＤＮＡ、組換えベクター、形質転換体、糖アルコールの製造方法およびフラクトオリゴ糖高純度液の製造方法について、各実施例に基づいて説明する。なお、本発明の技術的範囲は、これらの実施例によって示される特徴に限定されない。   Hereinafter, the improved β-fructofuranosidase, polypeptide, DNA, recombinant vector, transformant, sugar alcohol production method and fructooligosaccharide high-purity production method according to the present invention are based on each example. explain. Note that the technical scope of the present invention is not limited to the features shown by these examples.

＜実施例１＞ Ｇ．ｔｈａｉ由来（Ｎ１０５Ｄ）改良型β−フルクトフラノシダーゼの作成
Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｔｈａｉｌａｎｄｉｃｕｓ ＮＢＲＣ３２５５（以下、「Ｇ．ｔｈａｉ」と略記する。）の野生型β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列（ＮＣＢＩ ＷＰ＿００７２８１７７４；配列番号２）に対して、Ｎ末から１０５番目のアスパラギン（Ｎ）を、アスパラギン酸（Ｄ）に置換するアミノ酸変異（以下、「Ｎ１０５Ｄ」と略記する。）を導入したアミノ酸配列からなる変異体のβ−フルクトフラノシダーゼを作成し、これをＧ．ｔｈａｉ由来（Ｎ１０５Ｄ）改良型β−フルクトフラノシダーゼとした。具体的な手順を以下に示す。 Example 1 Preparation of thai-derived (N105D) improved β-fructofuranosidase Gluconobacter thalidicus NBRC3255 (hereinafter abbreviated as “G.thai”) wild-type β-fructofuranosidase amino acid sequence (NCBI WP — 007281774; SEQ ID NO: 2 ), An amino acid mutation in which the 105th asparagine (N) from the N-terminus is substituted with aspartic acid (D) (hereinafter abbreviated as “N105D”) is a mutant β- Fructofuranosidase was prepared and This was derived from thai (N105D) improved β-fructofuranosidase. The specific procedure is shown below.

（１）Ｇ．ｔｈａｉ由来野生型β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡの取得
まず、Ｇ．ｔｈａｉのゲノムＤＮＡを常法に従って抽出した。続いて、Ｇ．ｔｈａｉ由来野生型β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡの全長の塩基配列（ＧＩ：４５９０１８８７７）（配列番号１）を基に、下記の配列番号３および配列番号４のプライマーを設計し、下記の条件でＰＣＲを行うことにより、Ｇ．ｔｈａｉ由来野生型β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡを増幅し、これをＤＮＡ断片１とした。 (1) G. Acquisition of DNA encoding wild type β-fructofuranosidase from thai The genomic DNA of thai was extracted according to a conventional method. Subsequently, G.M. Based on the full-length base sequence (GI: 459018877) (SEQ ID NO: 1) of DNA encoding wild type β-fructofuranosidase derived from thai, primers of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 below were designed, By performing PCR under conditions, G. A DNA encoding thai-derived wild-type β-fructofuranosidase was amplified and designated as DNA fragment 1.

《ＰＣＲの条件》
鋳型；Ｇ．ｔｈａｉのゲノムＤＮＡ
フォワードプライマー；５’−ＡＡＡＴＣＴＡＡＡＡＧＡＴＣＣＡＴＧＡＡＴＧＣＴＡＴＴＴＣＣＡＧＣＣＧ−３’（配列番号３）
リバースプライマー；５’−ＴＴＴＡＣＣＡＧＡＣＴＣＧＡＧＴＣＡＧＧＴＧＣＧＡＡＣＧＴＣＡＴＡＧ−３’（配列番号４）
ＰＣＲ用酵素；ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｎｅｏ（東洋紡社） << PCR conditions >>
A mold; thai genomic DNA
Forward primer; 5′-AAATCTAAAAGATCCATGAATGCTATTCCAGCCG-3 ′ (SEQ ID NO: 3)
Reverse primer; 5′-TTTACCAGATCCGAGTCAGGTGCAACGGTCATAG-3 ′ (SEQ ID NO: 4)
Enzyme for PCR; KOD-Plus-Neo (Toyobo)

（２）Ｇ．ｔｈａｉ由来野生型β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡが挿入された組換えベクターの作成
下記の条件でＰＣＲを行うことにより、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ＩＡＭ１０２６、ＡＴＣＣ９４６６）のＰｇｓＡタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＢ０１６２４５．１）をコードするＤＮＡを増幅した。得られたＰＣＲ産物を常法に従って制限酵素ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで消化し、これをＤＮＡ断片２とした。また、ＤＮＡ断片２について、常法に従ってシークエンスを行い、ＰｇｓＡタンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列を確認した。確認したＰｇｓＡタンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列を配列番号５に、それにコードされるＰｇｓＡタンパク質のアミノ酸配列を配列番号６にそれぞれ示す。 (2) G. Preparation of recombinant vector in which DNA encoding thai-derived wild-type β-fructofuranosidase was inserted By performing PCR under the following conditions, PgsA protein (GenBank: AB016245.1) of Bacillus subtilis (IAM1026, ATCC9466) The DNA encoding was amplified. The obtained PCR product was digested with restriction enzymes NdeI and XhoI according to a conventional method to obtain DNA fragment 2. Further, DNA fragment 2 was sequenced according to a conventional method, and the base sequence of DNA encoding PgsA protein was confirmed. The nucleotide sequence of the DNA encoding the confirmed PgsA protein is shown in SEQ ID NO: 5, and the amino acid sequence of the PgsA protein encoded thereby is shown in SEQ ID NO: 6, respectively.

《ＰＣＲの条件》
鋳型；Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ＩＡＭ１０２６、ＡＴＣＣ９４６６）のゲノムＤＮＡ
フォワードプライマー（下線はＮｄｅＩサイトを示す）５’−ＡＡＡＣＡＴＡＴＧＡＡＡＡＡＡＧＡＡＣＴＧＡＧＣＴＴＴＣＡＴＧ−３’（配列番号７）
リバースプライマー（下線はＸｈｏＩサイトを示す）；５’−ＡＡＡＣＴＣＧＡＧＴＴＴＡＧＡＴＴＴＴＡＧＴＴＴＧＴＣＡＣＴＡＴＧ−３’（配列番号８）
ＰＣＲ用酵素；ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡社） << PCR conditions >>
Template: Genomic DNA of Bacillus subtilis (IAM1026, ATCC 9466)
Forward primer (underline indicates NdeI site) 5′-AAA CATATG AAAAAAGAAACTGAGCTTTTCATG-3 ′ (SEQ ID NO: 7)
Reverse primer (underline indicates XhoI site); 5′-AAA CTCGAG TTTAGATTTTTAGTTGTTCACTATG-3 ′ (SEQ ID NO: 8)
Enzyme for PCR; KOD-Plus- (Toyobo)

続いて、ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで制限酵素処理を行ったｐＣＤＦＤｕｅｔ−１プラスミド（Ｍｅｒｃｋ社）に、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２．１（タカラバイオ社）を用いて添付の使用書に従いＤＮＡ断片２を挿入し、これをｐＣＤＦ−ｐｇｓＡ組換えベクターとした。その後、下記の条件でＰＣＲを行うことによりｐＣＤＦ−ｐｇｓＡ組換えベクターのＤＮＡを増幅し、これをＤＮＡ断片３とした。   Subsequently, DNA Ligation Kit Ver. Was added to pCDFDuet-1 plasmid (Merck) treated with restriction enzymes with NdeI and XhoI. 2.1 (Takara Bio Inc.) was used to insert DNA fragment 2 in accordance with the attached instructions, and this was used as a pCDF-pgsA recombinant vector. Thereafter, PCR was performed under the following conditions to amplify the DNA of the pCDF-pgsA recombinant vector, and this was designated as DNA fragment 3.

《ＰＣＲの条件》
鋳型；ｐＣＤＦ−ｐｇｓＡ組換えベクター
フォワードプライマー；５’−ＣＴＣＧＡＧＴＣＴＧＧＴＡＡＡＧＡＡＡＣＣＧＣＴＧＣＴＧＣＧＡＡＡ−３’(配列番号９)
リバースプライマー；５’− ＧＧＡＴＣＴＴＴＴＡＧＡＴＴＴＴＡＧＴＴＴＧＴＣＡＣＴＡＴＧＡＴＣＡＡ−３‘(配列番号１０)
ＰＣＲ用酵素；ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−Ｎｅｏ(東洋紡社) << PCR conditions >>
Template; pCDF-pgsA recombinant vector forward primer; 5′-CTCGAGTCTGGTAAAGAAACCGCTGCTGCGAAA-3 ′ (SEQ ID NO: 9)
Reverse primer; 5′-GGATCTTTTTAGATTTTTAGTTGTCACTATGATCAA-3 ′ (SEQ ID NO: 10)
Enzyme for PCR; KOD-plus-Neo (Toyobo)

次に、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ社）を用いてＤＮＡ断片１およびＤＮＡ断片３を連結することにより、Ｇ．ｔｈａｉ由来野生型β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡが挿入された組換えベクターを作成し、これをｔｈａｉ組換えベクターとした。   Next, DNA fragment 1 and DNA fragment 3 were ligated using In-Fusion HD Cloning Kit (Takara Bio Inc.) to A recombinant vector into which a DNA encoding a thai-derived wild-type β-fructofuranosidase was inserted was prepared and used as a thai recombinant vector.

（３）改良型β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡが挿入された組換えベクターの作成
本実施例１（２）のｔｈａｉ組換えベクターを鋳型として、下記の条件でＰＣＲを行うことにより、Ｇ．ｔｈａｉ由来（Ｎ１０５Ｄ）改良型β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡを増幅した。 (3) Preparation of recombinant vector into which DNA encoding improved β-fructofuranosidase was inserted By performing PCR under the following conditions using the thai recombinant vector of Example 1 (2) as a template, G. The DNA encoding the Thai-derived (N105D) improved β-fructofuranosidase was amplified.

《ＰＣＲの条件》
フォワードプライマー；５’−ＧＡＴＧＡＣＣＧＣＧＣＣＴＡＴＡＴＣＧＧＣＴＡＴＴＧＧＴＡＣＡ−３’（配列番号１１）
リバースプライマー；５’−ＧＣＧＧＧＡＡＴＧＣＣＡＴＴＣＡＴＣＡＴＡＡＡＴＣＴＴＧＧＣＡ−３’（配列番号１２）
ＰＣＲ用酵素；ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＮＥＯ << PCR conditions >>
Forward primer; 5′-GATGACCGCGCCTATATCCGCTATTGGTACA-3 ′ (SEQ ID NO: 11)
Reverse primer; 5′-GCGGGAATGCCATTTCATCATAAATTCTGGCA-3 ′ (SEQ ID NO: 12)
Enzyme for PCR; KOD-Plus-NEO

得られたＰＣＲ産物に制限酵素ＤｐｎＩを加えて３７℃で１時間消化した後、アガロースゲル電気泳動に供してゲルを切り出して、ＤＮＡ断片を精製した。これに、Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈｖｅｒ．２（東洋紡社）およびＴ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ（東洋紡社）を加えて１６℃で１時間静置することによりＤＮＡ断片のセルフ ライゲーションを行って、Ｇ．ｔｈａｉ由来（Ｎ１０５Ｄ）改良型β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡが挿入された組換えベクターを得た。得られた組換えベクターを、ｔｈａｉ（Ｎ１０５Ｄ）組換えベクターとした。   The restriction enzyme DpnI was added to the obtained PCR product and digested at 37 ° C. for 1 hour, and then subjected to agarose gel electrophoresis to cut out the gel and purify the DNA fragment. To this, Ligation highver. 2 (Toyobo Co., Ltd.) and T4 Polynucleotide Kinase (Toyobo Co., Ltd.) were added and allowed to stand at 16 ° C. for 1 hour to perform self-ligation of the DNA fragment. A recombinant vector into which a DNA encoding the Thai-derived (N105D) improved β-fructofuranosidase was inserted was obtained. The obtained recombinant vector was referred to as a thai (N105D) recombinant vector.

（４）形質転換および形質転換体の培養と回収
本実施例１（２）のｔｈａｉ組換えベクターおよび本実施例１（３）のｔｈａｉ（Ｎ１０５Ｄ）組換えベクターを、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９コンピテントセルに導入して、組換え大腸菌を回収した。続いて、組換え大腸菌から組換えベクターを回収し、これを、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントセル（コスモバイオ社）に導入して、形質転換体として組換え大腸菌を得た。これを３０℃で一晩プレート培養した後、組換え大腸菌のクローンをピックアップしてＭ９ ＳＥＥＤ培地０．５ｍＬに植菌し、３０℃、２２０ｒｐｍで２０時間振盪培養した。続いて、培養物のうち５μＬをＭ９ Ｍａｉｎ培地５ｍＬに植え継ぎ、２５℃、２００ｒｐｍで２４時間振盪培養した。その後、培養物を１２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することにより組換え大腸菌を集菌した。Ｍ９ ＳＥＥＤ培地およびＭ９ Ｍａｉｎ培地の組成を以下に示す。 (4) Transformation and culture and recovery of transformant The thai recombinant vector of Example 1 (2) and the thai (N105D) recombinant vector of Example 1 (3) were transformed into E. coli. The recombinant E. coli was recovered by introduction into E. coli JM109 competent cells. Subsequently, the recombinant vector was recovered from the recombinant E. coli. E. coli BL21 (DE3) competent cell (Cosmo Bio) was used to obtain recombinant E. coli as a transformant. The plate was cultured overnight at 30 ° C., and then a recombinant E. coli clone was picked up and inoculated into 0.5 mL of M9 SEED medium, followed by shaking culture at 30 ° C. and 220 rpm for 20 hours. Subsequently, 5 μL of the culture was transferred to 5 mL of M9 Main medium, and cultured with shaking at 25 ° C. and 200 rpm for 24 hours. Thereafter, the recombinant E. coli was collected by centrifuging the culture at 12000 rpm for 10 minutes. The compositions of M9 SEED medium and M9 Main medium are shown below.

Ｍ９ ＳＥＥＤ培地（計１００ｍＬ）；水 ７２ｍＬ、５×Ｍ９塩 ２０ｍＬ、２０％ カザミノ酸 ５ｍＬ、２０％ Ｄ−グルコース ２ｍＬ、２ｍｇ／ｍＬ チミン １ｍＬ、５０ｍＭ ＣａＣｌ２ ０．２ｍＬ、２．５Ｍ ＭｇＣｌ２ ４０μＬ、１００ｍｇ／ｍＬ ＦｅＳＯ４ ２８μＬ、抗生物質（終濃度５０μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン）。
Ｍ９ Ｍａｉｎ培地（計１００ｍＬ）；水 ６７ｍＬ、５×Ｍ９塩 ２０ｍＬ、２０％ カザミノ酸 ５ｍＬ、２ｍｇ／ｍＬ チミン １ｍＬ、５０ｍＭ ＣａＣｌ２ ０．２ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬ ＦｅＳＯ４ ２８μＬ、Ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ａｕｔｏｉｎｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ １（Ｏ．Ｎ．Ｅ．；Ｍｅｒｃｋ社）Ｓｏｌ．１ ２ｍＬ、Ｏ．Ｎ．Ｅ．Ｓｏｌ．２ ５ｍＬ、Ｏ．Ｎ．Ｅ．Ｓｏｌ．３ １００μＬ、抗生物質（終濃度５０μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン）。 M9 SEED medium (total 100 mL); water 72 mL, 5 × M9 salt 20 mL, 20% casamino acid 5 mL, 20% D-glucose 2 mL, 2 mg / mL thymine 1 mL, 50 mM CaCl 2 0.2 mL, 2.5 M MgCl 2 40 μL, 100 mg / mL FeSO 4 28 μL, antibiotic (final concentration 50 μg / mL streptomycin).
M9 Main medium (100 mL in total); water 67 mL, 5 × M9 salt 20 mL, 20% casamino acid 5 mL, 2 mg / mL thymine 1 mL, 50 mM CaCl 2 0.2 mL, 100 mg / mL FeSO 4 28 μL, Overnight Expression Automation 1 N.E .; Merck) Sol. 12 mL, O.I. N. E. Sol. 2 5 mL, O.D. N. E. Sol. 3 100 μL, antibiotic (final concentration 50 μg / mL streptomycin).

＜実施例２＞Ｇ．ｔｈａｉ由来（Ｎ１０５Ｄ）改良型β−フルクトフラノシダーゼの評価
（１）β−フルクトフラノシダーゼの酵素反応
実施例１（４）の組換え大腸菌の培養液０．５ｍＬの集菌体、および、市販の酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来インベルターゼ各４５０Ｕ（日本バイオコン社；１．６２ｍｇ、三菱フードケミカル社；７２ｍｇ）のそれぞれに、６０（ｗ／ｗ）％のスクロース水溶液およびケストース水溶液各３５０μＬならびにフラクトオリゴ糖水溶液５００μＬを加えて懸濁した。これらを３０℃（組換え大腸菌の場合）または６０℃（市販の酵母由来インベルターゼの場合）にて、２００ｒｐｍで３〜２４時間振盪することにより、スクロース、ケストースおよびフラクトオリゴ糖のそれぞれを基質としたβ−フルクトフラノシダーゼの酵素反応を行い、反応液を得た。すなわち、ｔｈａｉ組換えベクターを導入した組換え大腸菌の反応液においては、Ｇ．ｔｈａｉ由来野生型β−フルクトフラノシダーゼにより、ｔｈａｉ（Ｎ１０５Ｄ）組換えベクターを導入した組換え大腸菌の反応液においては、Ｇ．ｔｈａｉ由来（Ｎ１０５Ｄ）改良型β−フルクトフラノシダーゼにより、酵素反応を行った。 <Example 2> G. evaluation of thai-derived (N105D) improved β-fructofuranosidase (1) Enzymatic reaction of β-fructofuranosidase 0.5 mL of the culture of recombinant E. coli of Example 1 (4), and In each of 450 U of invertase derived from commercially available yeast (Saccharomyces cerevisiae) (Nippon Biocon; 1.62 mg, Mitsubishi Food Chemical; 72 mg), 350 μL each of a 60 (w / w)% sucrose aqueous solution and a kestose aqueous solution and a fructooligosaccharide aqueous solution 500 μL was added and suspended. These were shaken at 30 ° C. (in the case of recombinant Escherichia coli) or 60 ° C. (in the case of commercially available yeast-derived invertase) at 200 rpm for 3 to 24 hours, thereby making β each of sucrose, kestose and fructooligosaccharide as substrates. -An enzyme reaction of fructofuranosidase was performed to obtain a reaction solution. That is, in the reaction solution of recombinant Escherichia coli introduced with the thai recombinant vector, G. In the reaction solution of recombinant Escherichia coli into which the thai (N105D) recombinant vector has been introduced by the wild-type β-fructofuranosidase derived from thai, G. The enzymatic reaction was carried out using an improved β-fructofuranosidase derived from thai (N105D).

（２）酵素反応生成物の確認
本実施例２（１）の反応液５０μＬに水９５０μＬを加えることにより希釈し、１００℃で１０分間加熱した。これを４℃、１５０００×ｇで１０分間遠心分離に供して上清を回収した後、０．４５μｍ孔フィルターで濾過して、得られた濾液をＨＰＬＣサンプルとした。ＨＰＬＣサンプルを下記の条件で高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に供して、反応液に含まれる単糖（フルクトース、グルコース）、スクロース（２糖）およびフラクトオリゴ糖（３糖；ケストース、４糖；ニストース、５糖：フラクトシルニストース）の割合を確認した。各糖の割合は、検出された全ピークの面積の総和に対する各ピークの面積の割合として、面積百分率で算出した。スクロースを基質とした反応液の結果を表１に、ケストースを基質とした反応液の結果を表２に、フラクトオリゴ糖を基質とした反応液の結果を表３に、それぞれ示す。 (2) Confirmation of enzyme reaction product Diluted by adding 950 μL of water to 50 μL of the reaction solution of Example 2 (1), and heated at 100 ° C. for 10 minutes. This was subjected to centrifugation at 15000 × g for 10 minutes at 4 ° C., and the supernatant was collected. The HPLC sample was subjected to high performance liquid chromatography (HPLC) under the following conditions, and the monosaccharide (fructose, glucose), sucrose (disaccharide) and fructooligosaccharide (trisaccharide; kestose, tetrasaccharide; nystose, contained in the reaction solution, The ratio of pentasaccharide: fructosyl nystose was confirmed. The ratio of each sugar was calculated as an area percentage as the ratio of the area of each peak to the total area of all detected peaks. The results of the reaction solution using sucrose as the substrate are shown in Table 1, the results of the reaction solution using kestose as the substrate are shown in Table 2, and the results of the reaction solution using fructooligosaccharide as the substrate are shown in Table 3, respectively.

《ＨＰＬＣの条件》
カラム；ＳＨＯＤＥＸ ＫＳ ８０２(８.０φ×３００ｍｍ) ２本
移動相；水
流速 ；１．０ｍＬ／分
注入量；２０μＬ
温度 ；５０℃
検出 ；示差屈折率検出器（ＲＩＤ；昭和電工社）（ピーク面積を用いた面積百分率） << HPLC conditions >>
Column; SHODEX KS 802 (8.0φ × 300 mm) 2 mobile phases; water flow rate; 1.0 mL / min injection volume; 20 μL
Temperature: 50 ° C
Detection: Differential refractive index detector (RID; Showa Denko) (area percentage using peak area)

表１に示すように、スクロースを基質とした場合、反応時間が２４時間において、Ｇ．ｔｈａｉ由来野生型β−フルクトフラノシダーゼでは、フラクトオリゴ糖が２４．０％、スクロースが５９．３％、単糖が１５．９％であった。これに対して、Ｇ．ｔｈａｉ由来（Ｎ１０５Ｄ）改良型β−フルクトフラノシダーゼでは、フラクトオリゴ糖が９．４％、スクロースが１３．４％、単糖が７３．６％であった。また、市販の酵母由来インベルターゼ（日本バイオコン社）では、フラクトオリゴ糖が０．１％、スクロースが０．７％、単糖が９８．９％であった。市販の酵母由来インベルターゼ（三菱フードケミカル社）では、フラクトオリゴ糖が０．８％、スクロースが１．２％、単糖が９７．６％であった。   As shown in Table 1, when sucrose was used as a substrate, the reaction time was 24 hours and G. In Thai-derived wild-type β-fructofuranosidase, fructooligosaccharides were 24.0%, sucrose was 59.3%, and monosaccharides were 15.9%. In contrast, G. In the Thai-derived (N105D) improved β-fructofuranosidase, fructooligosaccharides were 9.4%, sucrose 13.4%, and monosaccharides 73.6%. In addition, in commercially available yeast-derived invertase (Nippon Biocon), fructooligosaccharide was 0.1%, sucrose was 0.7%, and monosaccharide was 98.9%. In commercially available yeast-derived invertase (Mitsubishi Food Chemical Co., Ltd.), fructooligosaccharides were 0.8%, sucrose was 1.2%, and monosaccharides were 97.6%.

すなわち、Ｇ．ｔｈａｉ由来（Ｎ１０５Ｄ）改良型β−フルクトフラノシダーゼでは、Ｇ．ｔｈａｉ由来野生型β−フルクトフラノシダーゼと比較して、フラクトオリゴ糖およびスクロースの割合が小さく、単糖の割合が顕著に大きかった。この結果から、Ｇ．ｔｈａｉ由来野生型β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列（配列番号２）に対して、Ｎ末から１０５番目のアスパラギン（Ｎ）を、アスパラギン酸（Ｄ）に置換するアミノ酸変異を導入することにより、フラクトオリゴ糖の生成を抑制して、スクロースの分解を促進できることが明らかになった。また、市販の酵母由来インベルターゼでは、フラクトオリゴ糖のおよびスクロースの割合が顕著に小さく、単糖の割合が顕著に大きかった。この結果から、市販の酵母由来インベルターゼは、フラクトオリゴ糖をほとんど生成せず、専らスクロースを分解することが明らかになった。   That is, G. For the thai-derived (N105D) improved β-fructofuranosidase, Compared with thai-derived wild-type β-fructofuranosidase, the proportions of fructooligosaccharide and sucrose were small, and the proportion of monosaccharides was remarkably large. From this result, G. By introducing an amino acid mutation that substitutes aspartic acid (D) for asparagine (N) at position 105 from the N-terminal to the amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) of wild-type β-fructofuranosidase derived from thai, It was revealed that the production of fructooligosaccharides can be suppressed and the decomposition of sucrose can be promoted. Moreover, in the commercially available yeast-derived invertase, the ratio of fructooligosaccharide and sucrose was remarkably small, and the ratio of monosaccharide was remarkably large. From this result, it was clarified that commercially available yeast-derived invertase hardly produces fructooligosaccharides and decomposes sucrose exclusively.

また、表２に示すように、ケストースを基質とした場合、反応時間が２４時間において、Ｇ．ｔｈａｉ由来野生型β−フルクトフラノシダーゼでは、４糖以上のフラクトオリゴ糖が１０．５％、ケストースが６６．９％、スクロースが１１．２％、単糖が１１．４％であった。これに対して、Ｇ．ｔｈａｉ由来（Ｎ１０５Ｄ）改良型β−フルクトフラノシダーゼでは、４糖以上のフラクトオリゴ糖が２．４％、ケストースが８４．５％、スクロースが１．１％、単糖が１１．８％であった。また、市販の酵母由来インベルターゼ（日本バイオコン社）では、４糖以上のフラクトオリゴ糖が０．０％、ケストースが０．０％、スクロースが０．８％、単糖が９８．６％であった。市販の酵母由来インベルターゼ（三菱フードケミカル社）では、４糖以上のフラクトオリゴ糖が３．１％、ケストースが７．３％、スクロースが４．２％、単糖が８４．３％であった。   Further, as shown in Table 2, when kestose was used as a substrate, the reaction time was 24 hours and G. In Thai-derived wild-type β-fructofuranosidase, 10.5% of fructooligosaccharides having 4 or more sugars, 66.9% of kestose, 11.2% of sucrose, and 11.4% of monosaccharides. In contrast, G. In the Thai-derived (N105D) improved β-fructofuranosidase, tetrasaccharide or higher fructooligosaccharide was 2.4%, kestose was 84.5%, sucrose was 1.1%, and monosaccharide was 11.8%. It was. In addition, in commercially available yeast-derived invertase (Nippon Biocon), tetrasaccharide or higher fructooligosaccharide was 0.0%, kestose was 0.0%, sucrose was 0.8%, and monosaccharide was 98.6%. . In a commercially available yeast-derived invertase (Mitsubishi Food Chemical Co., Ltd.), the fructooligosaccharides having 4 or more sugars were 3.1%, the kestose was 7.3%, the sucrose was 4.2%, and the monosaccharide was 84.3%.

すなわち、Ｇ．ｔｈａｉ由来（Ｎ１０５Ｄ）改良型β−フルクトフラノシダーゼでは、Ｇ．ｔｈａｉ由来野生型β−フルクトフラノシダーゼと比較して、ケストースの割合が顕著に大きく、４糖以上のフラクトオリゴ糖、スクロースおよび単糖の割合が小さかった。この結果から、Ｇ．ｔｈａｉ由来野生型β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列（配列番号２）に対して、Ｎ末から１０５番目のアスパラギン（Ｎ）を、アスパラギン酸（Ｄ）に置換するアミノ酸変異を導入することにより、フラクトオリゴ糖の生成およびケストースの分解を抑制できることが明らかになった。また、市販の酵母由来インベルターゼでは、４糖以上のフラクトオリゴ糖、ケストースおよびスクロースの割合が顕著に小さく、単糖の割合が顕著に大きかった。この結果から、市販の酵母由来インベルターゼは、ケストースを分解する活性が大きいことが明らかになった。   That is, G. For the thai-derived (N105D) improved β-fructofuranosidase, Compared with thai-derived wild-type β-fructofuranosidase, the ratio of kestose was remarkably large, and the ratios of fructooligosaccharides of 4 or more sugars, sucrose and monosaccharides were small. From this result, G. By introducing an amino acid mutation that substitutes aspartic acid (D) for asparagine (N) at position 105 from the N-terminal to the amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) of wild-type β-fructofuranosidase derived from thai, It was revealed that the production of fructooligosaccharides and the degradation of kestose can be suppressed. In addition, in the commercially available yeast-derived invertase, the ratio of tetrasaccharide or higher fructooligosaccharide, kestose and sucrose was remarkably small, and the ratio of monosaccharide was remarkably large. From this result, it was revealed that a commercially available yeast-derived invertase has a large activity of degrading kestose.

また、表３に示すように、フラクトオリゴ糖を基質とした場合、反応時間が２４時間において、Ｇ．ｔｈａｉ由来野生型β−フルクトフラノシダーゼでは、フラクトオリゴ糖が４９．５％、スクロースが９．９％、単糖が４０．６％であった。これに対して、Ｇ．ｔｈａｉ由来（Ｎ１０５Ｄ）改良型β−フルクトフラノシダーゼでは、フラクトオリゴ糖が５８．７％、スクロースが２．５％、単糖が３９．０％であった。また、市販の酵母由来インベルターゼ（日本バイオコン社）では、フラクトオリゴ糖が１８．９％、スクロースが４．２％、単糖が７６．９％であった。市販の酵母由来インベルターゼ（三菱フードケミカル社）では、フラクトオリゴ糖が０．０％、スクロースが０．４％、単糖が９９．５％であった。なお、反応時間０時間のフラクトオリゴ糖水溶液に、スクロースが１１．９％、単糖が３１．１％含まれるのは、基質として用いた「フラクトオリゴ糖」に混入していたことによると考えられた。   As shown in Table 3, when fructooligosaccharide was used as a substrate, the reaction time was 24 hours and G. In the Thai-derived wild-type β-fructofuranosidase, fructooligosaccharides were 49.5%, sucrose was 9.9%, and monosaccharides were 40.6%. In contrast, G. In the Thai-derived (N105D) improved β-fructofuranosidase, the fraction oligosaccharide was 58.7%, the sucrose was 2.5%, and the monosaccharide was 39.0%. In addition, in commercially available yeast-derived invertase (Nippon Biocon), fructooligosaccharides were 18.9%, sucrose was 4.2%, and monosaccharides were 76.9%. In commercially available yeast-derived invertase (Mitsubishi Food Chemical Co., Ltd.), fructooligosaccharides were 0.0%, sucrose was 0.4%, and monosaccharides were 99.5%. In addition, it was thought that the fact that 11.9% sucrose and 31.1% monosaccharide were contained in the fructooligosaccharide aqueous solution with a reaction time of 0 hours was included in the “fructooligosaccharide” used as a substrate. .

すなわち、Ｇ．ｔｈａｉ由来（Ｎ１０５Ｄ）改良型β−フルクトフラノシダーゼでは、Ｇ．ｔｈａｉ由来野生型β−フルクトフラノシダーゼと比較して、フラクトオリゴ糖の割合が大きく、スクロースおよび単糖の割合が小さかった。この結果から、Ｇ．ｔｈａｉ由来野生型β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列（配列番号２）に対して、Ｎ末から１０５番目のアスパラギン（Ｎ）を、アスパラギン酸（Ｄ）に置換するアミノ酸変異を導入することにより、フラクトオリゴ糖の分解を抑制できることが明らかになった。また、市販の酵母由来インベルターゼでは、フラクトオリゴ糖の割合が顕著に小さく、スクロースの割合が小さく、単糖の割合が顕著に大きかった。この結果から、市販の酵母由来インベルターゼは、フラクトオリゴ糖を分解する活性が大きいことが明らかになった。   That is, G. For the thai-derived (N105D) improved β-fructofuranosidase, Compared with thai-derived wild-type β-fructofuranosidase, the proportion of fructooligosaccharide was large and the proportion of sucrose and monosaccharide was small. From this result, G. By introducing an amino acid mutation that substitutes aspartic acid (D) for asparagine (N) at position 105 from the N-terminal to the amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) of wild-type β-fructofuranosidase derived from thai, It was revealed that degradation of fructooligosaccharides can be suppressed. Moreover, in the commercially available yeast-derived invertase, the proportion of fructooligosaccharide was remarkably small, the proportion of sucrose was small, and the proportion of monosaccharide was remarkably large. From this result, it was revealed that commercially available yeast-derived invertase has a large activity of degrading fructooligosaccharides.

以上の表１〜３の結果から、Ｇ．ｔｈａｉ由来野生型β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列（配列番号２）に対して、Ｎ末から１０５番目のアスパラギン（Ｎ）を、アスパラギン酸（Ｄ）に置換するアミノ酸変異を導入することにより、フラクトオリゴ糖の生成および分解を抑制して、スクロースを特異的に分解できることが明らかになった。また、市販の酵母由来インベルターゼはフラクトオリゴ糖をほとんど生成しないが、スクロースのみならずフラクトオリゴ糖も分解する点で、加水分解の基質特異性が小さいことが明らかになった。   From the results of Tables 1 to 3 above, G.G. By introducing an amino acid mutation that substitutes aspartic acid (D) for asparagine (N) at position 105 from the N-terminal to the amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) of wild-type β-fructofuranosidase derived from thai, It was revealed that sucrose can be specifically decomposed by suppressing the generation and degradation of fructooligosaccharides. In addition, it has been clarified that commercially available yeast invertase hardly produces fructooligosaccharides, but the substrate specificity of hydrolysis is small in that it decomposes not only sucrose but also fructooligosaccharides.

＜実施例３＞ 二重変異体の改良型β−フルクトフラノシダーゼの評価
Ｇ．ｔｈａｉ由来野生型β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列（配列番号２）に対して、Ｎ末から１０５番目のアスパラギン（Ｎ）を、アスパラギン酸（Ｄ）、セリン（Ｓ）またはヒスチジン（Ｈ）に置換するアミノ酸変異（以下、「Ｎ１０５Ｄ」、「Ｎ１０５Ｓ」、「Ｎ１０５Ｈ」と略記する。）と、Ｎ末から３２１番目のヒスチジン（Ｈ）を、アルギニン（Ｒ）またはリシン（Ｋ）に置換するアミノ酸変異（以下、「Ｈ３２１Ｒ」、「Ｈ３２１Ｋ」と略記する。）とを導入したアミノ酸配列からなる二重変異体のβ−フルクトフラノシダーゼを作成し、その酵素活性を評価した。具体的な手順を以下に示す。 <Example 3> Evaluation of improved β-fructofuranosidase of double mutant The asparagine (N) from the N-terminus to aspartic acid (D), serine (S) or histidine (H) with respect to the amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) of wild-type β-fructofuranosidase derived from thai Amino acid to be substituted (hereinafter abbreviated as “N105D”, “N105S”, “N105H”) and 321st histidine (H) from the N-terminus to arginine (R) or lysine (K) Double mutant β-fructofuranosidase having an amino acid sequence into which mutations (hereinafter abbreviated as “H321R” and “H321K”) were introduced was prepared, and the enzyme activity was evaluated. The specific procedure is shown below.

（１）二重変異体の改良型β−フルクトフラノシダーゼの作成
まず、実施例１（２）のｔｈａｉ組換えベクターを鋳型として、下記の条件でＰＣＲを行うことにより、「Ｈ３２１Ｒ」および「Ｈ３２１Ｋ」をそれぞれ導入したアミノ酸配列からなる変異体のβ−フルクトフラノシダーゼ（Ｇ．ｔｈａｉ由来（Ｈ３２１Ｒ）改良型β−フルクトフラノシダーゼおよびＧ．ｔｈａｉ由来（Ｈ３２１Ｋ）改良型β−フルクトフラノシダーゼ）をコードするＤＮＡを増幅した。 (1) Preparation of double mutant improved β-fructofuranosidase First, by performing PCR under the following conditions using the thai recombinant vector of Example 1 (2) as a template, “H321R” and “ A mutant β-fructofuranosidase (G.thai-derived (H321R) improved β-fructofuranosidase and G.thai-derived (H321K) -modified β-fructofurano DNA encoding (sidase) was amplified.

《ＰＣＲの条件》
「Ｈ３２１Ｒ」
フォワードプライマー；５’−ＣＧＴＣＡＴＴＣＣＡＣＣＴＡＴＡＣＧＧＧＣＡＡＧＡＧＣＡＣ−３’（配列番号１３）
リバースプライマー；５’−ＧＣＴＧＡＴＧＧＴＧＡＡＣＡＧＡＴＡＧＧＴＣＡＧＡＣ−３’（配列番号１４）
ＰＣＲ用酵素；ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＮＥＯ
「Ｈ３２１Ｋ」
フォワードプライマー；５’−ＡＡＡＣＡＴＴＣＣＡＣＣＴＡＴＡＣＧＧＧＣＡＡＧＡＧＣＡＣ−３’（配列番号１５）
リバースプライマー；５’−ＧＣＴＧＡＴＧＧＴＧＡＡＣＡＧＡＴＡＧＧＴＣＡＧＡＣ−３’（配列番号１４）
ＰＣＲ用酵素；ＫＡＰＡ ＨｉＦｉ Ｈｏｔｓｔａｒｔ ｒｅａｄｙ Ｍｉｘ << PCR conditions >>
"H321R"
Forward primer; 5′-CGTCATTCCACCTATACGGGCAGAGCAC-3 ′ (SEQ ID NO: 13)
Reverse primer; 5′-GCTGATGGTGAACAGATAGGTCAGAC-3 ′ (SEQ ID NO: 14)
Enzyme for PCR; KOD-Plus-NEO
"H321K"
Forward primer; 5′-AAACATTCCACCTATACGGGGCAAGAGCAC-3 ′ (SEQ ID NO: 15)
Reverse primer; 5′-GCTGATGGTGAACAGATAGGTCAGAC-3 ′ (SEQ ID NO: 14)
Enzyme for PCR; KAPA HiFi Hotstart ready Mix

得られたＰＣＲ産物に制限酵素ＤｐｎＩを加えて３７℃で１時間消化した後、アガロースゲル電気泳動に供してゲルを切り出して、ＤＮＡ断片を精製した。これに、Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈｖｅｒ．２（東洋紡社）およびＴ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ（東洋紡社）を加えて１６℃で１時間静置することによりＤＮＡ断片のセルフ ライゲーションを行って組換えベクターを作成し、それぞれｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｒ）組換えベクターおよびｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｋ）組換えベクターとした。   The restriction enzyme DpnI was added to the obtained PCR product and digested at 37 ° C. for 1 hour, and then subjected to agarose gel electrophoresis to cut out the gel and purify the DNA fragment. To this, Ligation highver. 2 (Toyobo Co., Ltd.) and T4 Polynucleotide Kinase (Toyobo Co., Ltd.) were added and allowed to stand at 16 ° C. for 1 hour to perform self-ligation of the DNA fragment to prepare recombinant vectors, respectively, thai (H321R) recombinant vector and This was a thai (H321K) recombinant vector.

続いて、下記の鋳型およびフォワードプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、二重変異体のβ−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡを含んだプラスミドベクターを増幅した。このＰＣＲにおいて、リバースプライマーは、５’−ＧＣＧＧＧＡＡＴＧＣＣＡＴＴＣＡＴＣＡＴＡＡＡＴＣＴＴＧＧＣＡ−３’（配列番号１６）を、ＰＣＲ用酵素はＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＮＥＯを用いた。以下、「Ｎ１０５Ｄ」および「Ｈ３２１Ｒ」、「Ｎ１０５Ｓ」および「Ｈ３２１Ｒ」、「Ｎ１０５Ｈ」および「Ｈ３２１Ｋ」ならびに「Ｎ１０５Ｓ」および「Ｈ３２１Ｋ」のアミノ酸変異を導入したアミノ酸配列からなる二重変異体のβ−フルクトフラノシダーゼを、それぞれ、Ｇ．ｔｈａｉ由来（Ｎ１０５Ｄ／Ｈ３２１Ｒ）改良型β−フルクトフラノシダーゼ、Ｇ．ｔｈａｉ由来（Ｎ１０５Ｓ／Ｈ３２１Ｒ）改良型β−フルクトフラノシダーゼＧ．ｔｈａｉ由来（（Ｎ１０５Ｈ／Ｈ３２１Ｋ））改良型β−フルクトフラノシダーゼおよびＧ．ｔｈａｉ由来（Ｎ１０５Ｓ／Ｈ３２１Ｋ）改良型β−フルクトフラノシダーゼと表記する。   Subsequently, a plasmid vector containing DNA encoding the double mutant β-fructofuranosidase was amplified by performing PCR using the following template and forward primer. In this PCR, 5'-GCGGGAATGCCATTCCATATAAATCTTGGCA-3 '(SEQ ID NO: 16) was used as the reverse primer, and KOD-Plus-NEO was used as the PCR enzyme. The double mutant β- consisting of amino acid sequences introduced with amino acid mutations of “N105D” and “H321R”, “N105S” and “H321R”, “N105H” and “H321K” and “N105S” and “H321K” Fructofuranosidase, G. thai-derived (N105D / H321R) improved β-fructofuranosidase, thai-derived (N105S / H321R) improved β-fructofuranosidase thai ((N105H / H321K)) improved β-fructofuranosidase and G. thai. It is expressed as thai-derived (N105S / H321K) improved β-fructofuranosidase.

《ＰＣＲの条件》
「Ｎ１０５Ｄ／Ｈ３２１Ｒ」
鋳型；ｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｒ）組換えベクター
フォワードプライマー；５’−ＧＡＴＧＡＣＣＧＣＧＣＣＴＡＴＡＴＣＧＧＣＴＡＴＴＧＧＴＡＣＡ−３’（配列番号１１）
「Ｎ１０５Ｓ／Ｈ３２１Ｒ」
鋳型；ｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｒ）組換えベクター
フォワードプライマー；５’−ＴＣＴＧＡＣＣＧＣＧＣＣＴＡＴＡＴＣＧＧＣＴＡＴＴＧＧＴＡＣＡ−３’（配列番号１７）
「Ｎ１０５Ｈ／Ｈ３２１Ｋ」
鋳型；ｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｋ）組換えベクター
フォワードプライマー；５’−ＣＡＴＧＡＣＣＧＣＧＣＣＴＡＴＡＴＣＧＧＣＴＡＴＴＧＧＴＡＣＡ−３’（配列番号１８）
「Ｎ１０５Ｓ／Ｈ３２１Ｋ」
鋳型；ｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｋ）組換えベクター
フォワードプライマー；５’−ＴＣＴＧＡＣＣＧＣＧＣＣＴＡＴＡＴＣＧＧＣＴＡＴＴＧＧＴＡＣＡ−３’（配列番号１７） << PCR conditions >>
"N105D / H321R"
Template; thai (H321R) recombinant vector forward primer; 5′-GATGACCGCCGCTATATCGGCTATTGGTACA-3 ′ (SEQ ID NO: 11)
"N105S / H321R"
Template: thai (H321R) recombinant vector forward primer; 5'-TCTGACCGCCGCCTATCCGCTATTGGTACA-3 '(SEQ ID NO: 17)
"N105H / H321K"
Template; thai (H321K) recombinant vector forward primer; 5′-CATGACCGCCGCCTATCCGCTATTGGTACA-3 ′ (SEQ ID NO: 18)
"N105S / H321K"
Template; thai (H321K) recombinant vector forward primer; 5′-TCTGACCCGCGCTATATCGGCTATTGGTACA-3 ′ (SEQ ID NO: 17)

得られたＰＣＲ産物に制限酵素ＤｐｎＩを加えて３７℃で１時間消化した後、アガロースゲル電気泳動に供してゲルを切り出して、ＤＮＡ断片を精製した。これに、Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ（東洋紡社）およびＴ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ（東洋紡社）を加えて１６℃で１時間静置することによりＤＮＡ断片のセルフライゲーションを行い、二重変異体のβ−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡが挿入された組換えベクターを作成した。これらの組換えベクターを実施例１（４）に記載の方法により大腸菌に導入し、組換え大腸菌の培養と回収を行った。   The restriction enzyme DpnI was added to the obtained PCR product and digested at 37 ° C. for 1 hour, and then subjected to agarose gel electrophoresis to cut out the gel and purify the DNA fragment. Ligation high (Toyobo Co., Ltd.) and T4 Polynucleotide Kinase (Toyobo Co., Ltd.) were added thereto, and the mixture was allowed to stand at 16 ° C. for 1 hour to perform self-ligation of the DNA fragment, and double mutant β-fructofuranosidase was obtained. A recombinant vector into which the encoding DNA was inserted was prepared. These recombinant vectors were introduced into E. coli by the method described in Example 1 (4), and the recombinant E. coli was cultured and recovered.

（２）評価
本実施例３（１）の組換え大腸菌の集菌体について、実施例２に記載の方法により酵素反応を行った後、反応液に含まれる各糖の割合を確認した。スクロースを基質とした反応液の結果を表４に、ケストースを基質とした反応液の結果を表５に、フラクトオリゴ糖を基質とした反応液の結果を表６に、それぞれ示す。 (2) Evaluation The recombinant Escherichia coli collected in Example 3 (1) was subjected to an enzymatic reaction according to the method described in Example 2, and then the ratio of each saccharide contained in the reaction solution was confirmed. The results of the reaction solution using sucrose as a substrate are shown in Table 4, the results of the reaction solution using kestose as a substrate are shown in Table 5, and the results of the reaction solution using fructooligosaccharide as a substrate are shown in Table 6, respectively.

表４に示すように、スクロースを基質とした場合、反応時間が２４時間において、Ｇ．ｔｈａｉ由来野生型β−フルクトフラノシダーゼでは、フラクトオリゴ糖が２４．０％、スクロースが５９．３％、単糖が１５．９％であった。これに対して、Ｇ．ｔｈａｉ由来（Ｎ１０５Ｄ／Ｈ３２１Ｒ）改良型β−フルクトフラノシダーゼでは、フラクトオリゴ糖が２．６％、スクロースが１０．２％、単糖が８０．３％であった。Ｇ．ｔｈａｉ由来（Ｎ１０５Ｓ／Ｈ３２１Ｒ）改良型β−フルクトフラノシダーゼでは、フラクトオリゴ糖が１７．１％、スクロースが１１．９％、単糖が６９．４％であった。Ｇ．ｔｈａｉ由来（Ｎ１０５Ｈ／Ｈ３２１Ｋ）改良型β−フルクトフラノシダーゼでは、フラクトオリゴ糖が３０．６％、スクロースが１１．５％、単糖が５６．７％であった。Ｇ．ｔｈａｉ由来（Ｎ１０５Ｓ／Ｈ３２１Ｋ）改良型β−フルクトフラノシダーゼでは、フラクトオリゴ糖が２１．３％、スクロースが２５．４％、単糖が５３．３％であった。   As shown in Table 4, when sucrose was used as a substrate, the reaction time was 24 hours and G. In Thai-derived wild-type β-fructofuranosidase, fructooligosaccharides were 24.0%, sucrose was 59.3%, and monosaccharides were 15.9%. In contrast, G. In the Thai-derived (N105D / H321R) improved β-fructofuranosidase, fructooligosaccharides were 2.6%, sucrose was 10.2%, and monosaccharides were 80.3%. G. In the Thai-derived (N105S / H321R) improved β-fructofuranosidase, fructooligosaccharides were 17.1%, sucrose was 11.9%, and monosaccharides were 69.4%. G. In Thai-derived (N105H / H321K) improved β-fructofuranosidase, fructooligosaccharides were 30.6%, sucrose was 11.5%, and monosaccharides were 56.7%. G. In the Thai-derived (N105S / H321K) improved β-fructofuranosidase, fructooligosaccharides were 21.3%, sucrose was 25.4%, and monosaccharides were 53.3%.

すなわち、Ｇ．ｔｈａｉ由来（Ｎ１０５Ｄ／Ｈ３２１Ｒ）改良型β−フルクトフラノシダーゼ、Ｇ．ｔｈａｉ由来（Ｎ１０５Ｓ／Ｈ３２１Ｒ）改良型β−フルクトフラノシダーゼおよびＧ．ｔｈａｉ由来（Ｎ１０５Ｓ／Ｈ３２１Ｋ）改良型β−フルクトフラノシダーゼでは、Ｇ．ｔｈａｉ由来野生型β−フルクトフラノシダーゼと比較して、フラクトオリゴ糖およびスクロースの割合が小さく、単糖の割合が大きかった。この結果から、Ｇ．ｔｈａｉ由来野生型β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列（配列番号２）に対して、Ｎ末端から１０５番目のアスパラギン（Ｎ）をアスパラギン酸（Ｄ）またはセリン（Ｓ）に置換するアミノ酸変異およびＮ末端から３２１番目のヒスチジン（Ｈ）をアルギニン（Ｒ）またはリシン（Ｋ）に置換するアミノ酸変異を導入することにより、フラクトオリゴ糖の生成を抑制して、スクロースの分解を促進できることが明らかになった。   That is, G. thai-derived (N105D / H321R) improved β-fructofuranosidase, thai-derived (N105S / H321R) improved β-fructofuranosidase and The improved β-fructofuranosidase derived from thai (N105S / H321K) Compared with thai-derived wild-type β-fructofuranosidase, the proportions of fructooligosaccharide and sucrose were small, and the proportion of monosaccharides was large. From this result, G. an amino acid mutation that substitutes aspartic acid (D) or serine (S) for asparagine (N) at position 105 from the N-terminal with respect to the amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) of wild-type β-fructofuranosidase derived from thai; It was revealed that by introducing an amino acid mutation that replaces 321st histidine (H) from the terminal with arginine (R) or lysine (K), the production of fructooligosaccharides can be suppressed and sucrose degradation can be promoted. .

また、表５に示すように、ケストースを基質とした場合、反応時間が２４時間において、Ｇ．ｔｈａｉ由来野生型β−フルクトフラノシダーゼでは、４糖以上のフラクトオリゴ糖が１０．５％、ケストースが６６．９％、スクロースが１１．２％、単糖が１１．４％であった。これに対して、Ｇ．ｔｈａｉ由来（Ｎ１０５Ｄ／Ｈ３２１Ｒ）改良型β−フルクトフラノシダーゼでは、４糖以上のフラクトオリゴ糖が１．１％、ケストースが９５．９％、スクロースが１．０％、単糖が２．０％であった。Ｇ．ｔｈａｉ由来（Ｎ１０５Ｓ／Ｈ３２１Ｒ）改良型β−フルクトフラノシダーゼでは、４糖以上のフラクトオリゴ糖が２．７％、ケストースが９０．２％、スクロースが１．１％、単糖が６．０％であった。Ｇ．ｔｈａｉ由来（Ｎ１０５Ｈ／Ｈ３２１Ｋ）改良型β−フルクトフラノシダーゼでは、４糖以上のフラクトオリゴ糖が４．８％、ケストースが７５．８％、スクロースが２．９％、単糖が１６．１％であった。Ｇ．ｔｈａｉ由来（Ｎ１０５Ｓ／Ｈ３２１Ｋ）改良型β−フルクトフラノシダーゼでは、４糖以上のフラクトオリゴ糖が２．４％、ケストースが８９．３％、スクロースが１．７％、単糖が６．７％であった。   Further, as shown in Table 5, when kestose was used as a substrate, the reaction time was 24 hours and G. In Thai-derived wild-type β-fructofuranosidase, 10.5% of fructooligosaccharides having 4 or more sugars, 66.9% of kestose, 11.2% of sucrose, and 11.4% of monosaccharides. In contrast, G. Thai-derived (N105D / H321R) improved β-fructofuranosidase is 1.1% of fructooligosaccharides of 4 or more sugars, 95.9% of kestose, 1.0% of sucrose, 2.0% of monosaccharides Met. G. In Thai-derived (N105S / H321R) improved β-fructofuranosidase, 2.7% fructooligosaccharides of 4 or more sugars, 90.2% kestose, 1.1% sucrose, 6.0% monosaccharides Met. G. In Thai-derived (N105H / H321K) improved β-fructofuranosidase, 4.8% fructooligosaccharides of 4 or more sugars, 75.8% kestose, 2.9% sucrose, 16.1% monosaccharides Met. G. In Thai-derived (N105S / H321K) improved β-fructofuranosidase, 2.4 or more fructooligosaccharides are 2.4%, kestose is 89.3%, sucrose is 1.7%, and monosaccharide is 6.7%. Met.

すなわち、Ｇ．ｔｈａｉ由来（Ｎ１０５Ｄ／Ｈ３２１Ｒ）改良型β−フルクトフラノシダーゼ、Ｇ．ｔｈａｉ由来（Ｎ１０５Ｓ／Ｈ３２１Ｒ）改良型β−フルクトフラノシダーゼおよびＧ．ｔｈａｉ由来（Ｎ１０５Ｓ／Ｈ３２１Ｋ）改良型β−フルクトフラノシダーゼでは、Ｇ．ｔｈａｉ由来野生型β−フルクトフラノシダーゼと比較して、４糖以上のフラクトオリゴ糖の割合が顕著に小さく、ケストースの割合が顕著に大きく、スクロースおよび単糖の割合が小さかった。この結果から、Ｇ．ｔｈａｉ由来野生型β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列（配列番号２）に対して、Ｎ末端から１０５番目のアスパラギン（Ｎ）をアスパラギン酸（Ｄ）またはセリン（Ｓ）に置換するアミノ酸変異とＮ末端から３２１番目のヒスチジン（Ｈ）をアルギニン（Ｒ）またはリシン（Ｋ）に置換するアミノ酸変異とを導入することにより、ケストースの分解を抑制できることが明らかになった。   That is, G. thai-derived (N105D / H321R) improved β-fructofuranosidase, thai-derived (N105S / H321R) improved β-fructofuranosidase and The improved β-fructofuranosidase derived from thai (N105S / H321K) Compared with that of wild type β-fructofuranosidase derived from thai, the proportion of fructooligosaccharides of 4 or more sugars was remarkably small, the proportion of kestose was remarkably large, and the proportions of sucrose and monosaccharides were small. From this result, G. An amino acid mutation for substituting aspartic acid (D) or serine (S) for asparagine (N) at position 105 from the N-terminal with respect to the amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) of the wild-type β-fructofuranosidase derived from thai and N It was revealed that the degradation of kestose can be suppressed by introducing an amino acid mutation that replaces 321st histidine (H) from the terminal with arginine (R) or lysine (K).

また、表６に示すように、フラクトオリゴ糖を基質とした場合、反応時間が２４時間において、Ｇ．ｔｈａｉ由来野生型β−フルクトフラノシダーゼでは、フラクトオリゴ糖が４９．５％、スクロースが９．９％、単糖が４０．６％であった。これに対して、Ｇ．ｔｈａｉ由来（Ｎ１０５Ｄ／Ｈ３２１Ｒ）改良型β−フルクトフラノシダーゼでは、フラクトオリゴ糖が６１．２％、スクロースが１．５％、単糖が３６．９％であった。Ｇ．ｔｈａｉ由来（Ｎ１０５Ｓ／Ｈ３２１Ｒ）改良型β−フルクトフラノシダーゼでは、フラクトオリゴ糖が５７．４％、スクロースが２．２％、単糖が４０．５％であった。Ｇ．ｔｈａｉ由来（Ｎ１０５Ｈ／Ｈ３２１Ｋ）改良型β−フルクトフラノシダーゼでは、フラクトオリゴ糖が５３．０％、スクロースが３．９％、単糖が４３．１％であった。Ｇ．ｔｈａｉ由来（Ｎ１０５Ｓ／Ｈ３２１Ｋ）改良型β−フルクトフラノシダーゼでは、フラクトオリゴ糖が５５．３％、スクロースが２．４％、単糖が４２．３％であった。   Further, as shown in Table 6, when fructooligosaccharide was used as a substrate, the reaction time was 24 hours and G. In the Thai-derived wild-type β-fructofuranosidase, fructooligosaccharides were 49.5%, sucrose was 9.9%, and monosaccharides were 40.6%. In contrast, G. In the Thai-derived (N105D / H321R) improved β-fructofuranosidase, fructooligosaccharide was 61.2%, sucrose was 1.5%, and monosaccharide was 36.9%. G. In the Thai-derived (N105S / H321R) improved β-fructofuranosidase, the fructooligosaccharide was 57.4%, the sucrose was 2.2%, and the monosaccharide was 40.5%. G. In the Thai-derived (N105H / H321K) improved β-fructofuranosidase, fructooligosaccharides were 53.0%, sucrose was 3.9%, and monosaccharides were 43.1%. G. In Thai-derived (N105S / H321K) improved β-fructofuranosidase, fructooligosaccharides were 55.3%, sucrose was 2.4%, and monosaccharides were 42.3%.

すなわち、Ｇ．ｔｈａｉ由来（Ｎ１０５Ｄ／Ｈ３２１Ｒ）改良型β−フルクトフラノシダーゼ、Ｇ．ｔｈａｉ由来（Ｎ１０５Ｓ／Ｈ３２１Ｒ）改良型β−フルクトフラノシダーゼおよびＧ．ｔｈａｉ由来（Ｎ１０５Ｓ／Ｈ３２１Ｋ）改良型β−フルクトフラノシダーゼでは、Ｇ．ｔｈａｉ由来野生型β−フルクトフラノシダーゼと比較して、フラクトオリゴ糖の割合が顕著に大きく、スクロースの割合が小さかった。この結果から、Ｇ．ｔｈａｉ由来野生型β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列（配列番号２）に対して、Ｎ末端から１０５番目のアスパラギン（Ｎ）をアスパラギン酸（Ｄ）またはセリン（Ｓ）に置換するアミノ酸変異およびＮ末端から３２１番目のヒスチジン（Ｈ）をアルギニン（Ｒ）またはリシン（Ｋ）に置換するアミノ酸変異を導入することにより、フラクトオリゴ糖の分解を抑制できることが明らかになった。   That is, G. thai-derived (N105D / H321R) improved β-fructofuranosidase, thai-derived (N105S / H321R) improved β-fructofuranosidase and The improved β-fructofuranosidase derived from thai (N105S / H321K) Compared with thai-derived wild-type β-fructofuranosidase, the proportion of fructooligosaccharide was remarkably large and the proportion of sucrose was small. From this result, G. an amino acid mutation that substitutes aspartic acid (D) or serine (S) for asparagine (N) at position 105 from the N-terminal with respect to the amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) of wild-type β-fructofuranosidase derived from thai; It was revealed that degradation of fructooligosaccharides can be suppressed by introducing an amino acid mutation that replaces 321st histidine (H) from the terminal with arginine (R) or lysine (K).

以上の表４〜６の結果から、Ｇ．ｔｈａｉ由来野生型β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列（配列番号２）に対して、Ｎ末端から１０５番目のアスパラギン（Ｎ）をアスパラギン酸（Ｄ）またはセリン（Ｓ）に置換するアミノ酸変異およびＮ末端から３２１番目のヒスチジン（Ｈ）をアルギニン（Ｒ）またはリシン（Ｋ）に置換するアミノ酸変異を導入することにより、フラクトオリゴ糖の生成および分解を抑制して、スクロースを特異的に分解できることが明らかになった。   From the results of Tables 4-6 above, G.G. an amino acid mutation that substitutes aspartic acid (D) or serine (S) for asparagine (N) at position 105 from the N-terminal with respect to the amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) of wild-type β-fructofuranosidase derived from thai; It is clear that sucrose can be specifically decomposed by inhibiting the generation and degradation of fructooligosaccharides by introducing an amino acid mutation that replaces 321st histidine (H) with arginine (R) or lysine (K). Became.

Claims (8)

下記（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列からなる改良型β−フルクトフラノシダーゼ；
（ａ）配列番号２に示す野生型β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列に対して、Ｎ末端から１０５番目のアスパラギン（Ｎ）をアスパラギン酸（Ｄ）に置換するアミノ酸変異を導入したアミノ酸配列、
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において、アミノ酸変異が導入されたアミノ酸を除く１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつスクロース分解活性を有するアミノ酸配列。 An improved β-fructofuranosidase consisting of the following amino acid sequence (a) or (b);
(A) an amino acid sequence obtained by introducing an amino acid mutation for substituting aspartic acid (D) for asparagine (N) at position 105 from the N-terminal with respect to the amino acid sequence of wild-type β-fructofuranosidase shown in SEQ ID NO: 2;
(B) An amino acid sequence consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids except amino acid introduced with amino acid mutation are deleted, substituted, inserted or added in amino acid sequence (a) and having sucrose-degrading activity. 下記（ｃ）または（ｄ）のアミノ酸配列からなる改良型β−フルクトフラノシダーゼ；
（ｃ）配列番号２に示す野生型β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列に対して、以下のｉ）およびｉｉ）のアミノ酸変異を導入したアミノ酸配列；
ｉ）Ｎ末端から１０５番目のアスパラギン（Ｎ）をアスパラギン酸（Ｄ）またはセリン（Ｓ）に置換するアミノ酸変異、
ｉｉ）Ｎ末端から３２１番目のヒスチジン（Ｈ）をアルギニン（Ｒ）またはリシン（Ｋ）に置換するアミノ酸変異、
（ｄ）アミノ酸配列（ｃ）において、アミノ酸変異が導入されたアミノ酸を除く１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつスクロース分解活性を有するアミノ酸配列。 An improved β-fructofuranosidase consisting of the following amino acid sequence (c) or (d);
(C) an amino acid sequence obtained by introducing the following amino acid mutations i) and ii) with respect to the amino acid sequence of wild-type β-fructofuranosidase shown in SEQ ID NO: 2;
i) an amino acid mutation that replaces the 105th asparagine (N) from the N-terminus with aspartic acid (D) or serine (S);
ii) an amino acid mutation that replaces 321st histidine (H) from the N-terminus with arginine (R) or lysine (K);
(D) An amino acid sequence consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids except the amino acid into which an amino acid mutation has been introduced is deleted, substituted, inserted or added in the amino acid sequence (c) and having sucrose-degrading activity. 請求項１または請求項２に記載の改良型β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列を含むポリペプチド。   A polypeptide comprising the amino acid sequence of the improved β-fructofuranosidase according to claim 1 or 2. 請求項１または請求項２に記載の改良型β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡ。   A DNA encoding the improved β-fructofuranosidase according to claim 1 or 2. 請求項４に記載のＤＮＡを含む組換えベクター。   A recombinant vector comprising the DNA according to claim 4. 請求項４に記載のＤＮＡまたは請求項５に記載の組換えベクターを宿主に導入して得られる、形質転換体。   A transformant obtained by introducing the DNA according to claim 4 or the recombinant vector according to claim 5 into a host. 請求項１もしくは請求項２に記載の改良型β−フルクトフラノシダーゼ、請求項６に記載の形質転換体または請求項６に記載の形質転換体を培養して得られる培養物とスクロースとを接触させて、前記スクロースを単糖に分解する工程を有する糖アルコールの製造方法。   A modified β-fructofuranosidase according to claim 1 or claim 2, a transformant according to claim 6, or a culture obtained by culturing the transformant according to claim 6 and sucrose. A method for producing a sugar alcohol, comprising a step of bringing the sucrose into a monosaccharide by contact. 請求項１もしくは請求項２に記載の改良型β−フルクトフラノシダーゼ、請求項６に記載の形質転換体または請求項６に記載の形質転換体を培養して得られる培養物とフラクトオリゴ糖溶液に含有されるスクロースとを接触させて、前記スクロースを単糖に分解する工程を有するフラクトオリゴ糖高純度液の製造方法。   A modified β-fructofuranosidase according to claim 1 or claim 2, a transformant according to claim 6, or a culture obtained by culturing the transformant according to claim 6 and a fructooligosaccharide solution A method for producing a fructooligosaccharide high-purity solution, which comprises a step of bringing the sucrose into contact with sucrose contained in the product to decompose the sucrose into monosaccharides.
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