JP5936829B2 - Primer preparation method, primer usage method, primer set, PCR reaction solution, and primer design method - Google Patents
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Description
本発明は、ＰＣＲ用プライマーの作製方法に関し、特に複数の増幅対象生物を特異的に検出可能なマルチプレックスＰＣＲ用プライマーセットの作製に用いることができるプライマーの作製方法に関する。 The present invention relates to a method for producing PCR primers, and more particularly to a method for producing primers that can be used to produce a primer set for multiplex PCR capable of specifically detecting a plurality of amplification target organisms.
ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応，Polymerase Chain Reaction）法は微生物の検出や微生物の分類などの研究や産業に幅広く利用されており、様々な点で世間に貢献している。ＰＣＲ法が産業界に利用されている例として、食品製造現場や臨床現場において、日常的に危害菌などの有無が判定できる微生物検査が行われている。
ＰＣＲを行うにあたっては、対象微生物を特異的に増幅することが可能なプライマーを設計することが重要である。
しかしながら、異なる微生物でも同じ機能を持つ遺伝子では配列が類似している場合が多いことや対象領域が非対象領域と類似している可能性があることから、増幅の干渉や特異性が高いプライマーを設計するのは容易ではなかった。またＰＣＲ条件が最適化されていないため、ＰＣＲ条件を検討する手間も大変だった。
特にマルチプレックスＰＣＲにおける検証試験は、従来のＰＣＲよりもプライマー数や対象微生物数が増えるため検証数の増加につながり、プライマー設計には特異性の付与が重要であった。
The PCR (Polymerase Chain Reaction) method is widely used in research and industry such as detection of microorganisms and classification of microorganisms, and contributes to the world in various ways. As an example in which the PCR method is used in the industrial world, microbiological tests that can routinely determine the presence or absence of harmful bacteria are performed in food production sites and clinical sites.
In performing PCR, it is important to design a primer capable of specifically amplifying the target microorganism.
However, since genes with the same function in different microorganisms often have similar sequences and target regions may be similar to non-target regions, primers with high amplification interference and specificity should be used. It was not easy to design. In addition, since the PCR conditions are not optimized, it is difficult to study the PCR conditions.
In particular, the verification test in multiplex PCR leads to an increase in the number of verifications because the number of primers and the number of target microorganisms increase compared to conventional PCR, and it is important to provide specificity for primer design.
また、微生物検査を簡単かつ迅速に行うためには、複数の微生物を同時に特異的に増幅するマルチプレックスＰＣＲを行うことが望ましい。
しかし、このように複数の微生物を同時に増幅する場合には、プライマー同士の競合、あるいはダイマー形成などが起こり、さらに増幅が干渉するため、結果として感度の低下や非特異増幅に影響する。
このため、同時検出する対象微生物の数が多くなるに従って、特異性の高いプライマーの設計は非常に難しくなるという問題があった。
In addition, in order to perform a microorganism test simply and quickly, it is desirable to perform multiplex PCR that specifically amplifies a plurality of microorganisms simultaneously.
However, when a plurality of microorganisms are amplified simultaneously in this way, competition between primers or dimer formation occurs, and further amplification interferes, resulting in a decrease in sensitivity and nonspecific amplification.
For this reason, there is a problem that the design of highly specific primers becomes very difficult as the number of target microorganisms to be detected simultaneously increases.
ここで、マルチプレックスＰＣＲにおけるプライマーに関連する発明としては、特許文献１に記載のプライマーキットを挙げることができる。
このプライマーキットによれば、検体ごとに必要なプライマーを自由に組み換えて使用できるとされている。また、検体ごとにそれぞれ異なる検査項目が要求される遺伝子検査等においても、不要な遺伝情報の検出を回避しつつ、必要な標的塩基配列のみを過不足なく増幅することができ、また各プライマーの反応条件が標準化されているため、いずれの組み合わせのプライマーを用いた場合であっても、同一の反応条件で、それぞれの標的塩基配列を効率よく増幅することができるとされている。
Here, as an invention related to primers in multiplex PCR, the primer kit described in Patent Document 1 can be mentioned.
According to this primer kit, it is said that necessary primers can be freely recombined for each specimen. In addition, even in genetic tests where different test items are required for each specimen, it is possible to amplify only the necessary target base sequence without excess or deficiency while avoiding detection of unnecessary genetic information. Since the reaction conditions are standardized, it is said that each target base sequence can be efficiently amplified under the same reaction conditions even when any combination of primers is used.
また、特許文献２には、分離データからの解釈がしやすいように設計されたマルチプレックスＰＣＲ用プライマーセットが開示されている。
さらに、特許文献３には、検出対象とする複数の食中毒菌を検出するためのマルチプレックスＰＣＲ用プライマーセットが開示されている。
また、特許文献４には、長さが３０塩基以上のプライマーを使用し、プライマーのハイブリダイゼーション効率が９０％以上である温度のうち、最も高い温度でアニーリングさせ、３分〜１０分間の長時間アニーリング・伸長反応を行うことにより、マルチプレックスＰＣＲを行う方法が開示されている。
Patent Document 2 discloses a primer set for multiplex PCR designed so that it can be easily interpreted from separation data.
Furthermore, Patent Document 3 discloses a multiplex PCR primer set for detecting a plurality of food poisoning bacteria to be detected.
In Patent Document 4, a primer having a length of 30 bases or more is used, and annealing is performed at the highest temperature among the temperatures at which the primer hybridization efficiency is 90% or more. A method of performing multiplex PCR by performing an annealing / extension reaction is disclosed.
しかしながら、これらの文献には、プライマー設計条件やＰＣＲの条件設定を網羅したような記載がなく、さらに特異性の高いプライマーを得るための手法については未だ十分な検討がなされておらず、高い特異性を有するプライマーセットの開発が求められていた。
ここで、プライマーの設計方法に関連する発明としては、特許文献５〜８に記載のものを挙げることができる。
However, these documents do not include a comprehensive description of primer design conditions and PCR condition settings, and methods for obtaining primers with higher specificity have not yet been fully studied. There has been a demand for the development of a primer set having the property.
Here, examples of the invention related to the primer designing method include those described in Patent Documents 5 to 8.
特許文献５には、複雑な温度制御を必要としない遺伝子増幅法であるＬＡＭＰ（Loop-mediated isothermal amplification）法に適するプライマーの設計方法が開示されている。
また、特許文献６には、遺伝子を恒温増幅するＮＡＳＢＡ法、ＴＭＡ法、３ＳＲ法などに適するプライマーの設計方法が開示されている。
Patent Document 5 discloses a primer design method suitable for a LAMP (Loop-mediated isothermal amplification) method, which is a gene amplification method that does not require complicated temperature control.
Patent Document 6 discloses a primer design method suitable for NASBA method, TMA method, 3SR method and the like for isothermal amplification of a gene.
また、特許文献７には、遺伝子発現の定量方法において、増幅したい部分の片側に共通のアダプターが付加されるが、従来の遺伝子発現用プライマー設計方法では、このアダプター部分のプライマー情報を１つ１つ入力しているため時間がかかるという問題を解消すべく、そのプライマー配列を保持して逐次入力の手間を省き、またプライマー候補の絞り込みを自動的に行うプライマーの設計方法が開示されている。
さらに、特許文献８には、互いに異なるＤＮＡに、それぞれ特異的にハイブリダイズする複数のプライマーを効率よく設計するためのプライマーの設計方法が開示されている。
In Patent Document 7, a common adapter is added to one side of a portion to be amplified in the gene expression quantification method. In the conventional gene expression primer design method, the primer information of this adapter portion is one by one. In order to solve the problem that it takes a long time to input one, a primer design method is disclosed in which the primer sequence is retained to save the trouble of sequential input and the candidate candidates are automatically narrowed down.
Furthermore, Patent Document 8 discloses a primer design method for efficiently designing a plurality of primers that specifically hybridize to different DNAs.
しかしながら、特許文献５，６に記載のプライマーの設計方法は、上記の通り、ＬＡＭＰ法やＮＡＳＢＡ法等など恒温反応による遺伝子増幅法に関するものであり、また特許文献７に記載のプライマーの設計方法は、遺伝子発現の定量のために常に片側のプライマーを固定する手法に関するものであり、一般的なＰＣＲ法において特異性の高いプライマーを作製する場合に有効なものではなかった。
また、特許文献８には、プライマーを設計するにあたっての塩基長やＧＣ含有量、融解温度（Ｔｍ値）などについての一般的な手法が開示されているが、ＰＣＲ条件などに関する記載は無く、プライマーの特異性を十分に向上するためには、さらに改良する余地があった。
However, the primer design methods described in Patent Documents 5 and 6 relate to gene amplification methods by isothermal reactions such as the LAMP method and NASBA method as described above, and the primer design methods described in Patent Document 7 are This method relates to a technique for always immobilizing a primer on one side for quantification of gene expression, and is not effective when a highly specific primer is prepared in a general PCR method.
Further, Patent Document 8 discloses a general method for base length, GC content, melting temperature (Tm value), etc. in designing a primer, but there is no description regarding PCR conditions and the like. In order to sufficiently improve the specificity, there was room for further improvement.
そこで、本発明者らは、複数の検出対象生物が存在する場合に、どのような条件でプライマーを設計すれば、プライマーの競合やダイマーの形成を抑止して、特異的な増幅を行い得るプライマーセットを得ることができるかにつき鋭意研究した結果、その条件を見いだすことに成功し、本発明を完成させた。
本発明によれば、一回の試験で検出対象生物を検出することができるため、検査コストを大幅に削減することができる。また、特異性の高いプライマーの設計が容易にできるため、従来の検証数を削減することができ検証に掛かるコストの削減にもなる。
すなわち、本発明は、複数の検出対象生物を、同時かつそれぞれ特異的に増幅することが可能なプライマーの作製方法、プライマーの使用方法、プライマーセット、ＰＣＲ用反応液、及びプライマーの設計方法の提供を目的とする。
Therefore, the present inventors have designed a primer that can perform specific amplification by suppressing primer competition and dimer formation under any conditions when a plurality of organisms to be detected exist. As a result of earnest research as to whether a set can be obtained, the inventors have succeeded in finding out the conditions and completed the present invention.
According to the present invention, since the detection target organism can be detected by a single test, the inspection cost can be greatly reduced. In addition, since a highly specific primer can be easily designed, the number of conventional verifications can be reduced and the cost for verification can be reduced.
That is, the present invention provides a primer preparation method, a primer use method, a primer set, a PCR reaction solution, and a primer design method capable of simultaneously and specifically amplifying a plurality of organisms to be detected. With the goal.
本発明のプライマーの作製方法は、上記目的を達成するために、ＰＣＲ法によってＤＮＡの塩基配列（核酸断片）を増幅できるプライマーセットを、増幅対象生物のＤＮＡにおける増幅対象領域を増幅させるためのフォワードプライマー及びリバースプライマーの少なくとも一方の塩基配列が、非増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列と、１２塩基以上連続で重ならないように、作製する方法としてある。
なお、非増幅対象生物（又は増幅対象生物）のＤＮＡの塩基配列とは、非増幅対象生物（又は増幅対象生物）のゲノムＤＮＡの全部又は一部の塩基配列を意味する。
また、本発明のプライマーの作製方法は、プライマーセットを、フォワードプライマー及びリバースプライマーの融解温度の差が５℃未満となるように作製することが好ましい。
In order to achieve the above object, the primer preparation method of the present invention uses a primer set that can amplify a base sequence (nucleic acid fragment) of DNA by PCR, and forwards the amplification target region in the DNA of the amplification target organism. In this method, at least one base sequence of the primer and the reverse primer is not overlapped with the base sequence of the non-amplification target organism DNA by 12 bases or more.
The base sequence of the DNA of the non-amplification target organism (or the amplification target organism) means the whole or a part of the base sequence of the genomic DNA of the non-amplification target organism (or the amplification target organism).
Moreover, it is preferable that the preparation method of the primer of this invention produces a primer set so that the difference of the melting temperature of a forward primer and a reverse primer may be less than 5 degreeC.
また、本発明のプライマーの作製方法は、プライマーセットを、フォワードプライマー及びリバースプライマーの長さが２３〜４１ｍｅｒであり、かつ融解温度が７０〜７８℃となるように作製することが好ましい。
また、本発明のプライマーの作製方法は、ＰＣＲ法が、複数の生物のＤＮＡの塩基配列を同時に増幅させるマルチプレックスＰＣＲ法であり、各増幅対象生物のＤＮＡにおける増幅対象領域を増幅させるためのフォワードプライマー及びリバースプライマーの少なくとも一方の塩基配列が、他の増幅対象生物及び所定の非増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列と、１２塩基以上連続で重ならないように作製することが好ましい。
また、本発明のプライマーの使用方法は、ＰＣＲのアニーリング温度を、上記プライマーの作製方法を用いて得られたプライマーセットにおけるフォワードプライマーとリバースプライマーの中で、融解温度が低いプライマーの融解温度よりも０〜５℃低い温度に設定して、ＰＣＲを行う方法としてある。
In the primer production method of the present invention, the primer set is preferably produced such that the lengths of the forward primer and the reverse primer are 23 to 41 mer and the melting temperature is 70 to 78 ° C.
The primer production method of the present invention is a multiplex PCR method in which the PCR method simultaneously amplifies the DNA base sequences of a plurality of organisms, and a forward for amplifying the amplification target region in the DNA of each amplification target organism. It is preferable that at least one base sequence of the primer and the reverse primer is prepared so that it does not overlap with the base sequence of the DNA of another amplification target organism and a predetermined non-amplification target organism for 12 bases or more.
In addition, the method of using the primer of the present invention is such that the annealing temperature of PCR is set to be higher than the melting temperature of the primer having a lower melting temperature among the forward primer and the reverse primer in the primer set obtained by using the above-described primer production method. This is a method of performing PCR by setting the temperature to 0 to 5 ° C lower.
また、本発明のプライマーセットは、上記のプライマーの作製方法を用いて得られるものとしてある。
また、本発明のＰＣＲ用反応液は、上記のプライマーの作製方法を用いて得られたプライマーセットを含有するものとしてある。
In addition, the primer set of the present invention is obtained by using the above-described primer production method.
Further, the PCR reaction solution of the present invention contains a primer set obtained by using the above-described primer production method.
また、本発明のプライマーの設計方法は、ＰＣＲ法によってＤＮＡの塩基配列を増幅するために用いるプライマーの設計方法であって、ＤＮＡの塩基配列を増幅する対象の一又は二以上の増幅対象生物を選択するステップと、ＤＮＡの塩基配列を増幅しない対象の一又は二以上の非増幅対象生物を選択するステップと、選択された増幅対象生物のＤＮＡからフォワードプライマーとリバースプライマーの候補を選択するステップと、フォワードプライマー及びリバースプライマーの候補の塩基配列が、選択された他の増幅対象生物又は非増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列と１２塩基以上連続で重なるか否かを判定するステップと、判定の結果、フォワードプライマー及びリバースプライマーの候補の両方の塩基配列が、選択された他の増幅対象生物又は非増幅対象生物のいずれかのＤＮＡの塩基配列と１２塩基以上連続で重なる場合、再度選択された増幅対象生物からフォワードプライマーとリバースプライマーの候補を選択し直して１２塩基以上連続で重なるか否かの判定を行うステップと、判定の結果、フォワードプライマー及びリバースプライマーの候補の少なくとも一方の塩基配列が、選択された他の増幅対象生物又は非増幅対象生物の全てのＤＮＡの塩基配列と１２塩基以上連続で重ならない場合、フォワードプライマーとリバースプライマーの候補をＰＣＲ法によってＤＮＡの塩基配列を増幅するために用いるプライマーセットとして決定するステップを有する方法である。 The primer designing method of the present invention is a primer designing method used for amplifying a DNA base sequence by a PCR method, wherein one or two or more target organisms to be amplified are amplified. Selecting, one or more non-amplification target organisms to be amplified that do not amplify the DNA base sequence, and selecting forward primer and reverse primer candidates from the DNA of the selected amplification target organisms; A step of determining whether the candidate base sequences of the forward primer and the reverse primer overlap with the base sequence of the DNA of another selected amplification target organism or the non-amplification target organism continuously for 12 bases or more, and the result of the determination , Both forward primer and reverse primer candidate base sequences are selected from other selected amplification pairs. If the base sequence of the DNA of either the organism or non-amplification target organism overlaps continuously for 12 bases or more, is it possible to select the candidate forward primer and reverse primer again from the amplification target organism selected again and overlap 12 bases or more consecutively? A step of determining whether or not, and as a result of the determination, at least one base sequence of the candidate for the forward primer and the reverse primer is the base sequence of all the DNAs of the other selected amplification target organism or non-amplification target organism. In the case where the bases do not overlap with each other continuously, the method includes a step of determining a candidate for the forward primer and the reverse primer as a primer set used for amplifying the DNA base sequence by the PCR method.
本発明によれば、マルチプレックスＰＣＲ法においても検出対象生物を適切に増幅し得る、特異性の高いプライマーセットを作製することが可能となる。 According to the present invention, it is possible to produce a highly specific primer set that can appropriately amplify a detection target organism even in a multiplex PCR method.
以下、本発明のプライマーの作製方法、プライマーの使用方法、プライマーセット、ＰＣＲ用反応液、及びプライマーの設計方法の実施形態について、詳細に説明する。 Hereinafter, embodiments of a method for preparing a primer, a method for using a primer, a primer set, a reaction solution for PCR, and a method for designing a primer of the present invention will be described in detail.
まず、本発明のプライマーの作製方法の一実施形態について、詳細に説明する。なお、本発明のプライマーの作製方法は、ＰＣＲ法によってＤＮＡの塩基配列を増幅するために用いるプライマーセットを、対象生物のＤＮＡにおける対象領域を増幅させるためのフォワードプライマー及びリバースプライマーの少なくとも一方の塩基配列が非増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列と１２塩基以上連続で重ならないように、作製するものであれば良く、以下の具体的な内容に限定されるものではない。 First, an embodiment of a method for producing a primer of the present invention will be described in detail. The primer preparation method of the present invention uses a primer set used for amplifying a DNA base sequence by PCR, and at least one base of a forward primer and a reverse primer for amplifying a target region in the DNA of the target organism. Any sequence can be used so long as it does not overlap with the base sequence of the DNA of the non-amplification target organism for 12 bases or more, and the present invention is not limited to the following specific contents.
［プライマーの作製方法］
（１）プライマーの設計
マルチプレックスＰＣＲ用のプライマーセットの設計にあたっては、同時に使用する他のプライマーセットと競合しないように設計する必要がある。また特異性が高いプライマーに求められる機能として、増幅対象生物のＤＮＡでは増幅対象領域以外が増幅しないこと、及び非増幅対象生物のＤＮＡが増幅しないことが求められる。
[Preparation method of primer]
(1) Primer design When designing a primer set for multiplex PCR, it is necessary to design it so as not to compete with other primer sets used simultaneously. In addition, as functions required for primers having high specificity, it is required that the DNA of the amplification target organism does not amplify the region other than the amplification target region and that the DNA of the non-amplification target organism does not amplify.
（条件Ａ）
このようなマルチプレックスＰＣＲ用プライマーセットに求められる機能を向上させ得るプライマーの条件として、本発明者らはプライマーセットにおけるフォワードプライマー及びリバースプライマーの少なくとも一方の塩基配列が、所定の非増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列と、１２塩基以上連続で重ならないという条件を見いだした。すなわち、このような条件のプライマーセットによれば、その他の環境や各種条件に問題がなければ、増幅対象遺伝子領域を特異的に増幅させることが可能であることがわかった。
(Condition A)
As primer conditions that can improve the functions required for such a primer set for multiplex PCR, the present inventors have determined that the base sequence of at least one of the forward primer and the reverse primer in the primer set is a predetermined non-amplification target organism. We have found that DNA base sequence does not overlap with 12 bases or more. That is, according to the primer set under such conditions, it was found that the gene region to be amplified can be specifically amplified if there is no problem in other environments and various conditions.
また、プライマーセットにおけるフォワードプライマー及びリバースプライマーの少なくとも一方の塩基配列が、他の増幅対象生物及び所定の非増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列と、１２塩基以上連続で重ならないものとすることがより好ましい。
さらに、プライマーセットにおけるフォワードプライマー及びリバースプライマーの少なくとも一方の塩基配列が、当該増幅対象生物のＤＮＡにおける非増幅対象領域の塩基配列、並びに、他の増幅対象生物及び所定の非増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列と、１２塩基以上連続で重ならないものとすることがより好ましい。このような条件のプライマーセットによれば、その他の環境や各種条件に問題がなければ、増幅対象遺伝子領域のみを好適に増幅させることが可能である。
なお、当該増幅対象生物とは、プライマーセット候補の選択元の増幅対象生物であり、そのフォワードプライマー及びリバースプライマーにより検出する対象の増幅対象生物を意味する。
In addition, it is preferable that at least one base sequence of the forward primer and the reverse primer in the primer set does not overlap with the base sequence of the DNA of another amplification target organism and a predetermined non-amplification target organism for 12 bases or more in succession. preferable.
Furthermore, the base sequence of at least one of the forward primer and the reverse primer in the primer set is the base sequence of the non-amplification target region in the DNA of the amplification target organism, and the DNA of the other amplification target organism and the predetermined non-amplification target organism DNA. It is more preferable that the base sequence does not overlap with 12 bases or more. According to the primer set under such conditions, it is possible to suitably amplify only the gene region to be amplified if there is no problem in other environments and various conditions.
The amplification target organism is an amplification target organism from which a primer set candidate is selected, and means a target amplification target organism to be detected by the forward primer and the reverse primer.
ここで、「重ならない」とは、塩基が重複しないことを意味し、同じ塩基の配列ではないことを意味する。また「重なる」とは、塩基が重複することを意味し、同じ塩基の配列であることを意味する。プライマーの塩基配列が比較対象の塩基配列と「１２塩基以上連続で重ならない」とは、プライマーの塩基配列と、比較対象の塩基配列を比較した場合に、プライマーの塩基配列が、１２塩基以上連続してプライマーの塩基配列に存在しないことを意味する。 Here, “does not overlap” means that the bases do not overlap, and means that they are not sequences of the same base. Further, “overlapping” means that the bases are duplicated, and means that the sequences are the same bases. The base sequence of a primer is “12 or more consecutive base sequences that do not overlap” when the primer base sequence and the base sequence of the comparison target are compared, and the base sequence of the primer is 12 or more consecutive base sequences. This means that it does not exist in the base sequence of the primer.
このようなプライマーセットを設計するにあたっては、増幅対象生物における増幅対象領域を決定し、その領域を増幅させるためのプライマー候補を選択する。そして、選択したプライマー候補の塩基配列が、当該増幅対象生物のＤＮＡにおける非増幅対象領域の塩基配列、並びに、他の増幅対象生物及び所定の非増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列と、１２塩基以上連続で重ならないか否かを確認する。このとき、他の増幅対象生物及び所定の非増幅対象生物を予め選択して、その塩基配列と選択したプライマー候補の塩基配列との比較を行い、１２塩基以上連続で重ならないか否かを判定することができる。 In designing such a primer set, an amplification target region in an amplification target organism is determined, and primer candidates for amplifying the region are selected. And the base sequence of the selected candidate primer is 12 bases or more of the base sequence of the non-amplification target region in the DNA of the amplification target organism, the base sequence of the other amplification target organism and the DNA of the predetermined non-amplification target organism Check if there is no overlap. At this time, another amplification target organism and a predetermined non-amplification target organism are selected in advance, and the base sequence is compared with the selected primer candidate base sequence to determine whether or not 12 bases or more do not overlap continuously. can do.
フォワードプライマー及びリバースプライマーの両方の塩基配列が、当該増幅対象生物のＤＮＡにおける非増幅対象領域の塩基配列、他の増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列、又は所定の非増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列と、１２塩基以上連続で重なる場合は、再度プライマー候補を選択し直す。そして、フォワードプライマー及びリバースプライマーの少なくともいずれかの塩基配列が、当該増幅対象生物のＤＮＡにおける非増幅対象領域の塩基配列、並びに、他の増幅対象生物及び所定の非増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列と、１２塩基以上連続で重ならないプライマーセットが見つかるまで、プライマー候補の選択をし直し、及び１２塩基以上連続で重ならないか否かの判定を繰り返し実行する。
そして、１２塩基以上連続で重ならないプライマー候補が見つかった場合、そのプライマー候補を含むプライマーセットを、実際に作製するプライマーセットとして決定する。
The base sequence of both the forward primer and the reverse primer is the base sequence of the non-amplification target region in the DNA of the amplification target organism, the base sequence of the DNA of another amplification target organism, or the base sequence of the DNA of the predetermined non-amplification target organism If more than 12 bases overlap continuously, the candidate primer is selected again. And the base sequence of at least one of the forward primer and the reverse primer is the base sequence of the non-amplification target region in the DNA of the amplification target organism, and the base sequence of the other amplification target organism and the DNA of the predetermined non-amplification target organism Then, until a primer set that does not overlap continuously for 12 bases or more is found, the selection of candidate primers is repeated, and the determination of whether or not they overlap continuously for 12 bases or more is repeatedly executed.
When a candidate primer that does not overlap continuously for 12 bases or more is found, a primer set including the primer candidate is determined as a primer set to be actually produced.
また、このようなプライマーセットが、以下の条件Ｂ〜条件Ｅの条件を満たすか否かを判定し、条件Ａに加えて、さらにこれらの条件のうちの一又は二以上を満たすものをプライマーセットとして用いることも好ましい。プライマーセットが条件Ｂ〜条件Ｅを満たせば、その増幅の特異性を一層向上させることが可能となる。 Further, it is determined whether or not such a primer set satisfies the following conditions B to E, and in addition to the condition A, a primer set that satisfies one or more of these conditions It is also preferable to use as. If the primer set satisfies the conditions B to E, the amplification specificity can be further improved.
（条件Ｂ）
フォワードプライマー及びリバースプライマーの少なくとも一方の塩基配列が、３’末端側半分において、Ｇ又はＣを連続で３塩基以上備える配列を有することが好ましい。なお、Ｇはグアニン、Ｃはシトシンを意味し、Ａはアデニン、Ｔはチミンを意味する。ＤＮＡ分子は、これらいずれかの塩基を備えたヌクレオチドが鎖状に結合して構成されている。
(Condition B)
It is preferable that the base sequence of at least one of the forward primer and the reverse primer has a sequence having 3 or more bases of G or C continuously in the 3 ′ terminal half. G represents guanine, C represents cytosine, A represents adenine, and T represents thymine. A DNA molecule is constituted by combining nucleotides having any of these bases in a chain form.
（条件Ｃ）
フォワードプライマー及びリバースプライマーの少なくとも一方の塩基配列が、それぞれのプライマーの配列の中心から３’末端側及び５’末端側の両方向に向かってプライマーの全長の四分の１の範囲を含む領域に、Ａ又はＴを連続で４塩基以上備える配列を有することが好ましい。
(Condition C)
At least one base sequence of the forward primer and the reverse primer is in a region including a range of a quarter of the total length of the primer in both the 3 ′ end side and the 5 ′ end side from the center of the sequence of each primer. It preferably has a sequence comprising 4 or more bases of A or T in succession.
（条件Ｄ）
フォワードプライマー及びリバースプライマーの融解温度（Ｔｍ値）の差が５℃未満であることが好ましい。
(Condition D)
The difference in melting temperature (Tm value) between the forward primer and the reverse primer is preferably less than 5 ° C.
（条件Ｅ）
フォワードプライマー及びリバースプライマーの長さが２３〜４１ｍｅｒであり、かつ融解温度が７０〜７８℃であることが好ましく、融解温度が７３〜７８℃であることがさらに好ましい。
(Condition E)
The lengths of the forward primer and the reverse primer are 23 to 41 mer, the melting temperature is preferably 70 to 78 ° C, and the melting temperature is more preferably 73 to 78 ° C.
（２）プライマーの作製工程
以上のようにして決定されたプライマーセットの塩基配列にもとづいて、フォワードプライマー及びリバースプライマーを作製する。これらのプライマーの作製は、一般的な方法で行うことができ、ＤＮＡ合成装置を使用して、人工的に作製することができる。
(2) Primer preparation step Based on the base sequence of the primer set determined as described above, a forward primer and a reverse primer are prepared. These primers can be produced by a general method, and can be artificially produced using a DNA synthesizer.
［プライマーの使用方法］
次に、本発明のプライマーの使用方法の一実施形態について、詳細に説明する。
上述した本実施形態のプライマーの作製方法によって作製されたプライマーセット、及び後述するプライマーの設計方法にもとづき作製されたプライマーセットは、ＰＣＲに用いることができ、特にマルチプレックスＰＣＲ用のプライマーセットとして好適に使用することが可能である。
[How to use primer]
Next, an embodiment of a method for using the primer of the present invention will be described in detail.
The primer set prepared by the above-described primer preparation method of the present embodiment and the primer set prepared based on the primer design method described later can be used for PCR, and particularly suitable as a primer set for multiplex PCR. Can be used.
まず、本実施形態のプライマーの作製方法又はプライマーの設計方法にもとづいて、増幅対象生物のＤＮＡにおける増幅対象領域を増幅するためのＰＣＲ用プライマーセットを作製する。
作製されたプライマーセットは、少なくとも条件Ａを満たすもの、すなわち、フォワードプライマー及びリバースプライマーの少なくとも一方の塩基配列が、非増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列と、１２塩基以上連続で重ならないものである。また、条件Ｂ〜Ｅの少なくともいずれかをさらに満たすものであることがより好ましい。
First, based on the primer preparation method or primer design method of this embodiment, a PCR primer set for amplifying an amplification target region in DNA of an amplification target organism is prepared.
The prepared primer set satisfies at least the condition A, that is, the base sequence of at least one of the forward primer and the reverse primer does not overlap with the base sequence of the DNA of the non-amplification target organism for 12 bases or more. . Moreover, it is more preferable to satisfy at least one of the conditions B to E.
次いで、このプライマーセットを含有するＰＣＲ用反応液を作製する。
ＰＣＲ用反応液としては、例えば以下のような組成のものを用いることができる。
・緩衝液
・核酸合成基質（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）
・フォワードプライマー
・リバースプライマー
・核酸合成酵素
・増幅対象生物のＤＮＡ
・水
Next, a PCR reaction solution containing this primer set is prepared.
As a reaction solution for PCR, for example, one having the following composition can be used.
・ Buffers ・ Nucleic acid synthesis substrates (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
・ Forward primer ・ Reverse primer ・ Nucleic acid synthase ・ DNA of target organism
·water
ここで、複数菌種を一括検出の場合する場合には、ＰＣＲ用反応液におけるプライマー濃度を菌種毎に適した値にすることが好ましい。
すなわち、検出対象菌種毎にプライマー量を調整して、ＰＣＲ用反応液を作成することが好ましい。
例えば、セレウス、カンピロバクター、大腸菌、リステリア、サルモネラ、黄色ブドウ球菌、及びビブリオを同時に検出する場合は、ビブリオ以外の菌種のフォワードプライマー及びリバースプライマーの濃度を同一にすると共に、ビブリオ検出用のフォワードプライマー及びリバースプライマーの濃度を、その他の各菌種の２倍にすることが好ましい。
Here, when a plurality of bacterial species are collectively detected, the primer concentration in the PCR reaction solution is preferably set to a value suitable for each bacterial species.
That is, it is preferable to prepare a PCR reaction solution by adjusting the amount of primer for each species to be detected.
For example, when simultaneously detecting Cereus, Campylobacter, Escherichia coli, Listeria, Salmonella, Staphylococcus aureus, and Vibrio, the concentration of the forward primer and reverse primer of the species other than Vibrio should be the same, and the forward primer for detecting Vibrio The reverse primer concentration is preferably double that of the other bacterial species.
ＰＣＲ法による遺伝子の増幅は、サーマルサイクラーなどのＰＣＲ装置を用いて行うことができる。
また、ＰＣＲの反応条件は、例えば次の条件で行うことができる。
（１）９５℃ ２分
（２）９５℃ １０秒（ＤＮＡ鎖の乖離工程）
（３）６８℃ ３０秒（アニーリング工程）
（４）７２℃ ３０秒（ＤＮＡ合成工程）
（５）７２℃ ２分
（２）〜（４）を４０サイクル
Gene amplification by the PCR method can be performed using a PCR apparatus such as a thermal cycler.
PCR reaction conditions can be performed, for example, under the following conditions.
(1) 95 ° C for 2 minutes (2) 95 ° C for 10 seconds (DNA strand dissociation step)
(3) 68 ° C. 30 seconds (annealing process)
(4) 72 ° C. for 30 seconds (DNA synthesis step)
(5) 72 ° C. 2 minutes (2) to (4) 40 cycles
このとき、アニーリング温度（アニーリング工程における温度）設定は、プライマーセットにおけるフォワードプライマー及びリバースプライマーの融解温度のうち、低い方の温度からさらに０〜５℃低い温度とすることが好ましい。
また、増幅対象生物が複数の場合や、増幅対象領域が複数存在する場合は、複数のプライマーセットにおける全てのプライマーの融解温度のうち、最も低い温度からさらに０〜５℃低い温度とすることが好ましい。
At this time, the annealing temperature (temperature in the annealing step) is preferably set to a temperature lower by 0 to 5 ° C. from the lower one of the melting temperatures of the forward primer and the reverse primer in the primer set.
Moreover, when there are a plurality of amplification target organisms or there are a plurality of amplification target regions, the melting temperature of all the primers in the plurality of primer sets may be further lowered by 0 to 5 ° C from the lowest temperature. preferable.
具体的には、アニーリング温度を６５〜７３℃とすることが好ましく、６８〜７３℃とすることがより好ましく、６８℃とすることが最も好ましい。なお、これらに対応して、プライマーの融解温度の最小が、７０〜７８℃となるようにプライマーを設計することが好ましく、７３〜７８℃となるようにすることがより好ましい。特に、プライマーの融解温度の最小は、７３℃となるようにすることが最も好ましい。
このように、上記のアニーリング条件を適用することにより、増幅効率の不安定や増幅の干渉を防止することが可能となる。
Specifically, the annealing temperature is preferably 65 to 73 ° C, more preferably 68 to 73 ° C, and most preferably 68 ° C. Corresponding to these, the primer is preferably designed so that the minimum melting temperature of the primer is 70 to 78 ° C, more preferably 73 to 78 ° C. In particular, the minimum melting temperature of the primer is most preferably 73 ° C.
Thus, by applying the above annealing conditions, it becomes possible to prevent unstable amplification efficiency and amplification interference.
ここで、ＰＣＲのアニーリング工程において、鋳型ＤＮＡとプライマーが結合するためには耐熱性菌由来のＤＮＡポリメラーゼの働きが必要である。すなわち、このＤＮＡポリメラーゼは、７０〜８０℃周辺の温度で高い活性を示す。一方、アニーリング温度が高すぎると塩基同士の結合において、熱エネルギーが過大となって結合が阻害され、増幅産物量が減少する。
また、増幅産物を電気泳動ではなく、ＤＮＡチップやＤＮＡマイクロアレイで検出する際に、核酸合成物質へ蛍光色素を付与した場合、アニーリング温度が７０℃以上になると蛍光が増幅産物に取り込まれないことがある一方、アニーリング温度が６８℃では高い蛍光強度が得られる。
Here, in the PCR annealing step, the function of a DNA polymerase derived from a thermostable bacterium is required in order to bind the template DNA and the primer. That is, this DNA polymerase exhibits high activity at a temperature around 70 to 80 ° C. On the other hand, if the annealing temperature is too high, in the binding between bases, the thermal energy becomes excessive and the binding is inhibited, and the amount of amplified product is reduced.
In addition, when an amplification product is detected not by electrophoresis but by a DNA chip or DNA microarray, when a fluorescent dye is added to a nucleic acid synthesis substance, fluorescence may not be incorporated into the amplification product when the annealing temperature is 70 ° C. or higher. On the other hand, high fluorescence intensity can be obtained at an annealing temperature of 68 ° C.
以上のことから、上述したように、アニーリング温度を６５〜７３℃とすることが好ましく、６８〜７３℃とすることがより好ましく、６８℃とすることが最も好ましい。また、以下の実施例において示されるように、プライマーの融解温度の最小は、アニーリング温度に０〜５℃を加えた温度が適している。このため、プライマーの融解温度のうち最小は、７３〜７８℃に設定することが好ましい。 From the above, as described above, the annealing temperature is preferably 65 to 73 ° C, more preferably 68 to 73 ° C, and most preferably 68 ° C. Further, as shown in the following examples, the minimum melting temperature of the primer is suitably a temperature obtained by adding 0 to 5 ° C. to the annealing temperature. For this reason, it is preferable to set the minimum of the melting temperature of a primer to 73-78 degreeC.
次に、ＰＣＲ法による産物を、マイクロキャピラリーなどの電気泳動により増幅対象領域ごとに泳動させ、正しい増幅産物が得られているか否かを確認する。また、電気泳動に代えて、ＤＮＡチップやＤＮＡマイクロアレイなどを用いて、正しい増幅産物が得られているか否かを確認することも好ましい。これらは通常の方法により行うことが可能である。 Next, the PCR product is migrated for each amplification target region by electrophoresis such as a microcapillary, and it is confirmed whether or not a correct amplification product is obtained. It is also preferable to confirm whether or not a correct amplification product is obtained using a DNA chip or a DNA microarray instead of electrophoresis. These can be performed by a usual method.
［プライマーの設計方法］
次に、本発明のプライマーの設計方法の実施形態について、詳細に説明する。
[Design method of primer]
Next, an embodiment of the primer designing method of the present invention will be described in detail.
［プライマーの設計方法の第一実施形態］
まず、図１及び図２を参照して、本発明のプライマーの設計方法の第一実施形態について説明する。図１は、本実施形態におけるプライマー設計装置の構成を示すブロック図であり、図２は、本実施形態におけるプライマーの設計方法を示すフローチャートである。
[First Embodiment of Primer Design Method]
First, with reference to FIG.1 and FIG.2, 1st embodiment of the design method of the primer of this invention is described. FIG. 1 is a block diagram illustrating a configuration of a primer design apparatus according to the present embodiment, and FIG. 2 is a flowchart illustrating a primer design method according to the present embodiment.
ＰＣＲを行うにあたっては、上述したように、増幅対象生物を特異的に増幅することが可能なプライマーを設計することが重要であり、特に複数の微生物を同時に特異的に増幅するマルチプレックスＰＣＲを行う場合には、プライマーの競合やダイマーの形成がなく、増幅の干渉が少ないプライマーを設計することが必要である。
特に、マルチプレックスＰＣＲを用いての同時増幅および検出の場合においては、同じような機能を持つ遺伝子では塩基配列が類似していることが多い。このため、複数の微生物をそれぞれ増幅するためのプライマーを作製して、これらの微生物を同時に増幅する場合、増幅が干渉し合うことで、検出感度の低下につながることが多い。
In performing PCR, as described above, it is important to design a primer capable of specifically amplifying an organism to be amplified, and in particular, performing multiplex PCR that specifically amplifies a plurality of microorganisms simultaneously. In some cases, it is necessary to design a primer that does not have primer competition or dimer formation and has little interference with amplification.
In particular, in the case of simultaneous amplification and detection using multiplex PCR, genes having similar functions often have similar base sequences. For this reason, when primers for amplifying a plurality of microorganisms are prepared and these microorganisms are amplified simultaneously, the amplification often interferes with each other, leading to a decrease in detection sensitivity.
本実施形態は、このようなプライマーの設計条件として、各増幅対象生物の遺伝子における増幅対象領域を増幅させるためフォワードプライマー及びリバースプライマーの少なくとも一方の塩基配列が、所定の非増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列と、１２塩基以上連続で重ならないように作製するものである（条件Ａ−１）。また、このとき、プライマーセットにおけるフォワードプライマー及びリバースプライマーの少なくとも一方の塩基配列を、他の増幅対象生物及び所定の非増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列と、１２塩基以上連続で重ならないものとすることがより好ましく（条件Ａ−２）、当該増幅対象生物のＤＮＡにおける非増幅対象領域の塩基配列、並びに、他の増幅対象生物及び所定の非増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列と、１２塩基以上連続で重ならないものとすることがさらに好ましい（条件Ａ−３）。本実施形態では、条件Ａとして、Ａ−１〜３のいずれかを用いることができる。
このような条件でプライマーを設計すれば、後述する実施例に示すように増幅反応が干渉しにくいプライマーを作製することができる。
In the present embodiment, as a design condition for such a primer, in order to amplify the amplification target region in the gene of each amplification target organism, at least one base sequence of the forward primer and the reverse primer is the DNA of the predetermined non-amplification target organism. It is prepared so as not to overlap with the base sequence continuously for 12 bases or more (Condition A-1). At this time, at least one base sequence of the forward primer and the reverse primer in the primer set shall not overlap with the base sequence of the DNA of another amplification target organism and a predetermined non-amplification target organism for 12 bases or more. More preferably (Condition A-2), the base sequence of the non-amplification target region in the DNA of the amplification target organism, the base sequence of the other amplification target organism and the DNA of the predetermined non-amplification target organism, and 12 bases or more More preferably, they do not overlap continuously (Condition A-3). In the present embodiment, any one of A-1 to A-3 can be used as the condition A.
If the primer is designed under such conditions, a primer that is unlikely to interfere with the amplification reaction can be prepared as shown in the Examples described later.
本実施形態のプライマーの設計方法は、図１に示すプライマー設計装置１０により行うことができる。
プライマー設計装置１０としては、パーソナルコンピュータやサーバ、タブレット型コンピュータ、携帯端末などの情報処理装置を用いることができる。このプライマー設計装置１０は、図１に示すように、塩基配列記憶手段１１、増幅対象生物選択手段１２、非増幅対象生物選択手段１３、プライマー候補選択手段１４、十二塩基連続重複判定手段１５、及びプライマーセット記憶手段１６を備えている。
The primer designing method of this embodiment can be performed by the primer designing apparatus 10 shown in FIG.
As the primer designing apparatus 10, an information processing apparatus such as a personal computer, a server, a tablet computer, or a portable terminal can be used. As shown in FIG. 1, the primer designing apparatus 10 includes a base sequence storage unit 11, an amplification target organism selection unit 12, a non-amplification target organism selection unit 13, a primer candidate selection unit 14, a twelve base continuous duplication determination unit 15, And a primer set storage means 16.
なお、プライマー設計装置１０におけるこれらの構成は、利用者が使用する情報処理装置内に備えられる必要はなく、これらの全部又は一部を他の情報処理装置に備え、ネットワークを通じて接続することによって構成することもできる。また、プライマー設計装置１０は、独立した情報処理装置により構成することができるほか、ＡＳＰ（Application Service Provider）や、ＳａａＳ（software as a service）などや、二以上の情報処理装置によって構成することができ、クライアント端末からアクセス可能なものにすることもできる。これは以下の実施形態における各種プライマー設計装置についても同様である。 Note that these configurations in the primer design device 10 do not need to be provided in the information processing device used by the user, but are configured by providing all or part of them in another information processing device and connecting them through a network. You can also The primer designing apparatus 10 can be configured by an independent information processing apparatus, and can also be configured by two or more information processing apparatuses such as ASP (Application Service Provider), SaaS (software as a service), and the like. It can also be made accessible from the client terminal. The same applies to various primer designing apparatuses in the following embodiments.
塩基配列記憶手段１１は、増幅対象生物及び非増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列を記憶するデータベースなどの記憶装置である。この塩基配列記憶手段１１は、増幅対象生物及び非増幅対象生物の識別情報ごとにＤＮＡの塩基配列、各生物名称や分類等の各種属性情報を記憶する。これらの増幅対象生物及び非増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列としては、それぞれの生物における全塩基配列（全ゲノムＤＮＡ配列）とすることが好ましい。なお、全塩基配列ではなく、一部の領域を欠くものや一部の塩基配列のみを用いても良い。 The base sequence storage means 11 is a storage device such as a database that stores the base sequences of DNA of amplification target organisms and non-amplification target organisms. The base sequence storage means 11 stores various attribute information such as the DNA base sequence, the name of each organism and the classification for each identification information of the amplification target organism and the non-amplification target organism. The base sequences of the DNAs of these amplification target organisms and non-amplification target organisms are preferably all base sequences (total genomic DNA sequences) in the respective organisms. Note that, instead of the entire base sequence, a part lacking a part of the region or only a part of the base sequence may be used.
増幅対象生物選択手段１２は、塩基配列記憶手段１１から増幅対象生物を選択して記憶する。このとき、増幅対象生物選択手段１２は、例えば塩基配列記憶手段１１から記憶されている生物名称を一覧表示し、選択された一又は二以上の生物の名称とその識別情報を、増幅対象生物として記憶することができる。 The amplification target organism selection means 12 selects and stores the amplification target organism from the base sequence storage means 11. At this time, the amplification target organism selection unit 12 displays, for example, a list of organism names stored from the base sequence storage unit 11, and uses the names of one or more selected organisms and their identification information as amplification target organisms. Can be remembered.
非増幅対象生物選択手段１３は、塩基配列記憶手段１１から非増幅対象生物を選択して記憶する。このとき、非増幅対象生物選択手段１３は、例えば塩基配列記憶手段１１から記憶されている生物名称を一覧表示し、選択された一又は二以上の生物の名称とその識別情報を、非増幅対象生物として記憶することができる。
なお、先に増幅対象領域を決定した後に、相同性検索を行って、増幅対象生物における当該領域と類似する配列を備えた非増幅対象生物を選択することも好ましい。
The non-amplification target organism selection means 13 selects and stores the non-amplification target organism from the base sequence storage means 11. At this time, the non-amplification target organism selection means 13 displays, for example, a list of organism names stored from the base sequence storage means 11, and displays the names of one or more selected organisms and their identification information as non-amplification targets. It can be memorized as a living thing.
In addition, it is also preferable to select a non-amplification target organism having a sequence similar to the region in the amplification target organism by performing a homology search after determining the amplification target region first.
プライマー候補選択手段１４は、増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列からプライマーセットの候補となる塩基配列を選択し、これを当該増幅対象生物の識別情報に対応付けて一時的に記憶する。なお、このときプライマー候補選択手段１４に、増幅対象領域の両端付近の領域から２３ｍｅｒ〜４１ｍｅｒ程度の長さのフォワードプライマー及びリバースプライマーを選択させることが好ましい。 The candidate primer selecting means 14 selects a base sequence that is a candidate for the primer set from the base sequence of the DNA of the organism to be amplified, and temporarily stores it in association with the identification information of the organism to be amplified. At this time, it is preferable that the primer candidate selection unit 14 selects a forward primer and a reverse primer having a length of about 23 mer to 41 mer from a region near both ends of the amplification target region.
十二塩基連続重複判定手段１５は、プライマー候補選択手段１４により選択されたプライマーセットにおけるフォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列が、非増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列と、１２塩基以上連続で重複するか否かを判定する。
また、プライマーセットにおけるフォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列が、他の増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列又は所定の非増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列と、１２塩基以上連続で重複するか否かを判定することがより好ましく、当該増幅対象生物のＤＮＡにおける非増幅対象領域の塩基配列、当該増幅対象生物以外の他の増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列、又は所定の非増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列と、１２塩基以上連続で重複するか否かを判定することがさらに好ましい。
The twelve-base continuous duplication determination means 15 has a base sequence of the forward primer and reverse primer in the primer set selected by the primer candidate selection means 14 that overlaps with the base sequence of the DNA of the non-amplification target organism continuously for 12 bases or more. It is determined whether or not.
Whether the base sequence of the forward primer and reverse primer in the primer set overlaps with the base sequence of the DNA of another amplification target organism or the base sequence of the DNA of a predetermined non-amplification target organism continuously by 12 bases or more. More preferably, the base sequence of the non-amplification target region in the DNA of the amplification target organism, the base sequence of the DNA of the amplification target organism other than the amplification target organism, or the base of the DNA of the predetermined non-amplification target organism It is more preferable to determine whether or not the sequence overlaps with 12 bases or more in succession.
このとき、十二塩基連続重複判定手段１５は、非増幅対象生物選択手段１３により選択された一又は二以上の非増幅対象生物について、塩基配列記憶手段１１における非増幅対象生物の識別情報に対応する塩基配列に、上記フォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列と１２塩基以上連続で重複する領域が存在するか否かを判定する。 At this time, the twelve base continuous duplication determination unit 15 corresponds to the identification information of the non-amplification target organism in the base sequence storage unit 11 for one or more non-amplification target organisms selected by the non-amplification target organism selection unit 13. It is determined whether or not there is a region that continuously overlaps the base sequence of the forward primer and the reverse primer by 12 bases or more.
また、増幅対象生物選択手段１２により選択された増幅対象生物について、プライマーセットの候補が選択された当該増幅対象生物以外の一又は二以上の他の増幅対象生物が存在する場合、十二塩基連続重複判定手段１５は、塩基配列記憶手段１１におけるこれら他の増幅対象生物の識別情報に対応する塩基配列に、上記フォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列と１２塩基以上連続で重複する領域が存在するか否かを判定する。 When there is one or two or more other amplification target organisms other than the amplification target organism for which the primer set candidate has been selected for the amplification target organism selected by the amplification target organism selection means 12, twelve base sequences The duplication determination means 15 has a base sequence corresponding to the identification information of these other organisms to be amplified in the base sequence storage means 11 having a region that overlaps with the base sequence of the forward primer and the reverse primer continuously for 12 bases or more. Determine whether or not.
さらに、プライマーセットの候補が選択された当該増幅対象生物について、十二塩基連続重複判定手段１５は、塩基配列記憶手段１１における当該増幅対象生物の識別情報に対応する塩基配列の非増幅対象領域に、上記フォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列と１２塩基以上連続で重複する領域が存在するか否かを判定する。 Further, for the amplification target organism for which the primer set candidate has been selected, the twelve-base continuous duplication determination unit 15 adds the non-amplification target region of the base sequence corresponding to the identification information of the amplification target organism in the base sequence storage unit 11. Then, it is determined whether or not there is a region that continuously overlaps 12 or more base sequences with the base sequences of the forward primer and the reverse primer.
十二塩基連続重複判定手段１５による判定の結果、非増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列について、上記フォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列の少なくともいずれかが、１２塩基以上連続で重複しない場合、当該プライマーセットを、作製に用いるプライマーセットとして決定することができる。また、このとき、上記その他の増幅対象生物及び非増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列について、上記フォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列の少なくともいずれかが、１２塩基以上連続で重複しない場合、当該プライマーセットを、作製に用いるプライマーセットとして決定することが好ましい。さらに、このとき、当該増幅対象生物とその他の増幅対象生物及び非増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列について、上記フォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列の少なくともいずれかが、１２塩基以上連続で重複しない場合、当該プライマーセットを、作製に用いるプライマーセットとして決定することがより好ましい。 As a result of the determination by the twelve-base continuous duplication determination means 15, when at least one of the base sequences of the forward primer and the reverse primer does not overlap continuously for the base sequence of the DNA of the non-amplification target organism, the primer The set can be determined as a primer set used for production. Further, at this time, when at least one of the base sequences of the forward primer and the reverse primer does not overlap continuously for 12 or more base sequences of the other amplification target organism and non-amplification target organism DNA, the primer set Is preferably determined as a primer set used for production. Furthermore, at this time, when the base sequence of the DNA of the amplification target organism and other amplification target organisms and non-amplification target organisms, at least one of the base sequences of the forward primer and the reverse primer does not overlap continuously for 12 bases or more More preferably, the primer set is determined as a primer set used for production.
十二塩基連続重複判定手段１５による判定の結果、それぞれ上記以外の場合、例えば、当該増幅対象生物とその他の増幅対象生物及び非増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列の少なくともいずれかについて、上記フォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列の両方が、１２塩基以上連続で重複する場合、プライマー候補選択手段１４は、増幅対象である当該増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列から再度プライマーセットの候補となる塩基配列を選択し直して、これを当該増幅対象生物の識別情報に対応付けて一時的に記憶する。そして、再度、十二塩基連続重複判定手段１５による上記判定が行われる。 As a result of the determination by the twelve base continuous duplication determination means 15, in each case other than the above, for example, at least one of the base sequences of the DNA of the amplification target organism and other amplification target organisms and non-amplification target organisms, When both of the base sequences of the reverse primer and the reverse primer overlap with 12 bases or more in succession, the primer candidate selection means 14 again selects a base sequence that becomes a candidate for the primer set from the DNA base sequence of the amplification target organism to be amplified. The selection is performed again, and this is temporarily stored in association with the identification information of the amplification target organism. And the said determination by the 12 base continuous duplication determination means 15 is performed again.
プライマーセット記憶手段１６は、十二塩基連続重複判定手段１５により、作製に用いるプライマーセットとして決定されたプライマーセットの塩基配列を、増幅対象生物の識別情報に対応付けて記憶する。 The primer set storage means 16 stores the base sequence of the primer set determined as the primer set used for production by the twelve base continuous duplication determination means 15 in association with the identification information of the amplification target organism.
次に、図２を参照して、本実施形態のプライマーの設計方法における各工程について説明する。なお、プライマー設計装置１０における各手段の処理の順序は、適宜変更しても良い。これは以下の実施形態における各種プライマー設計装置についても同様である。
まず、プライマー設計装置１０における増幅対象生物選択手段１２は、塩基配列記憶手段１１から、記憶されている生物名称を一覧表示し、選択された一又は二以上の生物の名称とその識別情報を、増幅対象生物として記憶する（ステップ１０）。また、プライマー設計装置１０における非増幅対象生物選択手段１３は、塩基配列記憶手段１１から、記憶されている生物名称を一覧表示し、選択された一又は二以上の生物の名称とその識別情報を、非増幅対象生物として記憶する（ステップ１１）。
Next, with reference to FIG. 2, each step in the primer designing method of the present embodiment will be described. In addition, you may change suitably the order of the process of each means in the primer design apparatus 10. FIG. The same applies to various primer designing apparatuses in the following embodiments.
First, the amplification target organism selection unit 12 in the primer design apparatus 10 displays a list of stored organism names from the base sequence storage unit 11, and displays the names of one or more selected organisms and their identification information. It is stored as an amplification target organism (step 10). The non-amplification target organism selection means 13 in the primer design device 10 displays a list of stored organism names from the base sequence storage means 11, and displays the names of one or more selected organisms and their identification information. And stored as a non-amplification target organism (step 11).
次に、プライマー設計装置１０におけるプライマー候補選択手段１４により、増幅対象生物選択手段１２により選択された増幅対象生物の識別情報に対応する塩基配列を塩基配列記憶手段１１から検索して取得する。そして、取得された塩基配列からプライマーセットの候補となるフォワードプライマーとリバースプライマーの塩基配列を選択し、これを当該増幅対象生物の識別情報に対応付けて一時的に記憶する（ステップ１２）。なお、増幅対象生物選択手段１２により複数の増幅対象生物及び対象領域が選択されている場合は、各増幅対象生物毎及び対象領域毎にプライマーセットの候補を選択して記憶することができる。 Next, the base sequence corresponding to the identification information of the amplification target organism selected by the amplification target organism selection unit 12 is retrieved from the base sequence storage unit 11 by the primer candidate selection unit 14 in the primer design device 10 and acquired. Then, the base sequences of the forward primer and the reverse primer that are candidates for the primer set are selected from the obtained base sequences, and this is temporarily stored in association with the identification information of the amplification target organism (step 12). When a plurality of amplification target organisms and target regions are selected by the amplification target organism selection means 12, primer set candidates can be selected and stored for each amplification target organism and each target region.
次に、プライマー設計装置１０における十二塩基連続重複判定手段１５により、上記プライマーセットの候補のフォワードプライマーとリバースプライマーの塩基配列の少なくともいずれかが、非増幅対象生物選択手段１３により選択された非増幅対象生物の識別情報に対応する塩基配列と１２塩基以上連続して重複するか否かを判定する（ステップ１３）。このとき、プライマー設計装置１０における十二塩基連続重複判定手段１５により、上記プライマーセットの候補のフォワードプライマーとリバースプライマーの塩基配列の少なくともいずれかが、このプライマーセットの候補が選択された当該増幅対象生物の識別情報に対応する塩基配列の非増幅対象領域、他の増幅対象生物の識別情報に対応する塩基配列、又は非増幅対象生物選択手段１３により選択された非増幅対象生物の識別情報に対応する塩基配列と１２塩基以上連続して重複するか否かを判定することも好ましい。 Next, the non-amplification target organism selection unit 13 selects at least one of the base sequences of the forward primer and the reverse primer as candidates for the primer set by the twelve base continuous duplication determination unit 15 in the primer design apparatus 10. It is determined whether or not the base sequence corresponding to the identification information of the amplification target organism continuously overlaps 12 bases or more (step 13). At this time, at least one of the base sequences of the forward primer and the reverse primer as candidates for the primer set is selected by the twelve-base continuous overlap determination unit 15 in the primer design apparatus 10 as the amplification target in which the candidate for the primer set is selected. Corresponds to the non-amplification target region of the base sequence corresponding to the identification information of the organism, the base sequence corresponding to the identification information of another amplification target organism, or the identification information of the non-amplification target organism selected by the non-amplification target organism selection means 13 It is also preferable to determine whether or not the base sequence to be overlapped continuously by 12 bases or more.
そして、プライマーセットの候補のフォワードプライマーとリバースプライマーの塩基配列の両方が、非増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列のいずれかと１２塩基以上連続して重複した場合（ステップ１４のＹＥＳ）、再度ステップ１２のプライマーセットの候補の選択から繰り返す。このとき、プライマーセットの候補のフォワードプライマーとリバースプライマーの塩基配列の両方が、このプライマーセットの候補が選択された当該増幅対象生物の識別情報に対応する塩基配列の非増幅対象領域、他の増幅対象生物の識別情報に対応する塩基配列、又は非増幅対象生物選択手段１３により選択された非増幅対象生物の識別情報に対応する塩基配列のいずれかと１２塩基以上連続して重複した場合に、再度ステップ１２のプライマーセットの候補の選択から繰り返すようにすることも好ましい。 If both the base sequence of the forward primer and the reverse primer that are candidates for the primer set overlap with any of the base sequences of the DNA of the non-amplification target organism for 12 bases or more in succession (YES in step 14), step 12 again. Repeat from the selection of candidate primer sets. At this time, both the base sequence of the forward primer and the reverse primer of the primer set candidate are the non-amplification target region of the base sequence corresponding to the identification information of the amplification target organism from which this primer set candidate is selected, other amplification When the base sequence corresponding to the identification information of the target organism or the base sequence corresponding to the identification information of the non-amplification target organism selected by the non-amplification target organism selection means 13 is continuously duplicated for 12 bases or more, It is also preferable to repeat from the selection of candidate primer sets in step 12.
プライマーセットの候補のフォワードプライマーとリバースプライマーの塩基配列の少なくともいずれかが、非増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列と１２塩基以上連続して重複しない場合（ステップ１４のＮＯ）、十二塩基連続重複判定手段１５は、当該プライマーセットの候補を、ＰＣＲに用いるプライマーセットとして決定する（ステップ１５）。このとき、プライマーセットの候補のフォワードプライマーとリバースプライマーの塩基配列の少なくともいずれかが、このプライマーセットの候補が選択された当該増幅対象生物の識別情報に対応する塩基配列の非増幅対象領域、他の増幅対象生物の識別情報に対応する塩基配列、及び非増幅対象生物選択手段１３により選択された非増幅対象生物の識別情報に対応する塩基配列と、１２塩基以上連続して重複しない場合（ステップ１４のＮＯ）、当該プライマーセットの候補を、ＰＣＲに用いるプライマーセットとして決定することも好ましい。
十二塩基連続重複判定手段１５は、以上の工程を、ステップ１０で選択された全ての増幅対象生物について、それぞれ行うことができる。
If at least one of the base sequences of the forward primer and reverse primer of the primer set candidate does not overlap with the base sequence of the non-amplification target organism DNA by 12 bases or more in succession (NO in step 14), twelve base continuous overlaps The determination means 15 determines the candidate primer set as a primer set used for PCR (step 15). At this time, at least one of the base sequences of the primer set candidate forward primer and reverse primer is a non-amplification target region of the base sequence corresponding to the identification information of the amplification target organism from which this primer set candidate is selected, etc. When the base sequence corresponding to the identification information of the amplification target organism and the base sequence corresponding to the identification information of the non-amplification target organism selected by the non-amplification target organism selection means 13 do not overlap continuously by 12 bases or more (step 14)), it is also preferable to determine the candidate primer set as a primer set used for PCR.
The twelve base continuous duplication determination unit 15 can perform the above-described process for all the amplification target organisms selected in Step 10.
このような本実施形態のプライマーの設計方法によれば、非特異的な増幅を行い難いプライマーセットを設計することができる。このため、このような設計方法により作製されたプライマーセットは、マルチプレックスＰＣＲ用のプライマーセットに用いた場合にも、ＰＣＲにおける非特異的な増幅を抑制でき、好適に使用することが可能である。 According to the primer designing method of the present embodiment, a primer set that is difficult to perform nonspecific amplification can be designed. For this reason, the primer set prepared by such a design method can suppress non-specific amplification in PCR even when it is used as a primer set for multiplex PCR, and can be suitably used. .
［プライマーの設計方法の第二実施形態］
次に、図３〜図５を参照して、本発明のプライマーの設計方法の第二実施形態について説明する。図３は、本実施形態におけるプライマー設計装置の構成を示すブロック図であり、図４は、本実施形態において作製されたプライマーの配列の例を示す図であり、図５は、本実施形態におけるプライマーの設計方法を示すフローチャートである。
[Second Embodiment of Primer Design Method]
Next, a second embodiment of the primer designing method of the present invention will be described with reference to FIGS. FIG. 3 is a block diagram showing the configuration of the primer design apparatus in the present embodiment, FIG. 4 is a diagram showing an example of the primer sequence prepared in the present embodiment, and FIG. 5 is a diagram in the present embodiment. It is a flowchart which shows the design method of a primer.
微生物のＤＮＡの塩基配列において、ＧＣ配列は、ＧＣ含有量が少ない菌類で約２５％、多い菌類で約８０％程度（配列数の百分率。以下ＧＣ又はＡＴ含有量について同様。）含まれており、その範囲は非常に幅広くなっている。また、ＧＣリッチな部分やＡＴリッチな部分などがあるため、プライマーの設計において、ＧＣ含有量に適したプライマー配列の設計思想が求められる。
本実施形態は、主に塩基配列のＧＣ含有量が多い生物を増幅対象生物とする場合に、好適に用いられるものである。ここで、「ＧＣ含有量が多い」とは、塩基配列におけるＧ又はＣ塩基の含有量が５０％以上である場合を意味する。
In the base sequence of microbial DNA, the GC sequence is about 25% for fungi with a low GC content and about 80% for fungi with a high GC content (percentage of the number of sequences. The same applies to the GC or AT content). The range has become very wide. Further, since there are a GC-rich part, an AT-rich part, and the like, a primer design concept suitable for the GC content is required in the primer design.
This embodiment is preferably used when an organism mainly having a large GC content in the base sequence is used as an amplification target organism. Here, “the content of GC is large” means that the content of G or C base in the base sequence is 50% or more.
本実施形態におけるプライマー設計装置２０は、図３に示すように、塩基配列記憶手段２１、増幅対象生物選択手段２２、非増幅対象生物選択手段２３、プライマー候補選択手段２４、ＧＣ配列判定手段２５、及びプライマーセット記憶手段２６を備えている。
本実施形態では、ＧＣ配列判定手段２５により、候補のプライマーの塩基配列におけるＧ又はＣの連続配列にもとづいて、これをＰＣＲ用のプライマーセットとして用いるか否かを決定する点で第一実施形態と異なっている。その他の点については、第一実施形態と同様のものとすることができ、本実施形態におけるその他の各手段は、第一実施形態における同名の各手段とそれぞれ同様の処理を行うものとすることができる。また、図５に示す本実施形態のプライマーの設計方法の各工程は、図２の条件Ａ（ステップ１３，１４）を、条件Ｂ（ステップ２３，２４）に変更した点以外は同様である。
As shown in FIG. 3, the primer design apparatus 20 in the present embodiment includes a base sequence storage unit 21, an amplification target organism selection unit 22, a non-amplification target organism selection unit 23, a primer candidate selection unit 24, a GC sequence determination unit 25, And a primer set storage means 26.
In the present embodiment, the first embodiment is such that the GC sequence determination means 25 determines whether or not to use this as a primer set for PCR based on the continuous sequence of G or C in the base sequence of the candidate primer. Is different. The other points can be the same as those in the first embodiment, and the other means in the present embodiment perform the same processes as the respective means having the same names in the first embodiment. Can do. Further, the steps of the primer designing method of this embodiment shown in FIG. 5 are the same except that the condition A (steps 13 and 14) in FIG. 2 is changed to the condition B (steps 23 and 24).
ＧＣ配列判定手段２５は、プライマー候補選択手段２４により選択されたプライマーセットにおけるフォワードプライマー配列及びリバースプライマー配列が、３’末端側半分において、Ｇ又はＣを連続で３塩基以上備える配列を有するか否かを判定する（ステップ２３）。
ＧＣ配列判定手段２５による判定の結果、選択されたプライマーセットにおけるフォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列の少なくとも一方が、Ｇ又はＣを連続で３塩基以上備えている場合（ステップ２４のＹＥＳ）、ＧＣ配列判定手段２５は、当該プライマーセットの候補を、ＰＣＲに用いるプライマーセットとして決定する（ステップ２５）。そして、プライマーセット記憶手段２６は、この決定されたプライマーセットを記憶する。
The GC sequence determination unit 25 determines whether the forward primer sequence and the reverse primer sequence in the primer set selected by the primer candidate selection unit 24 have a sequence having 3 or more consecutive G or C in the 3 ′ end half. Is determined (step 23).
As a result of the determination by the GC sequence determination means 25, when at least one of the base sequences of the forward primer and the reverse primer in the selected primer set comprises 3 or more bases of G or C in succession (YES in step 24), GC The sequence determination means 25 determines the candidate primer set as a primer set used for PCR (step 25). The primer set storage unit 26 stores the determined primer set.
ＧＣ配列判定手段２５による判定の結果、選択されたプライマーセットにおけるフォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列の両方が、Ｇ又はＣを連続で３塩基以上備えていない場合（ステップ２４のＮＯ）、再度ステップ２２からの処理を繰り返す。すなわち、プライマー候補選択手段２４により増幅対象生物からフォワードプライマーとリバースプライマーの候補を選択し直して、ＧＣ配列判定手段２５により、Ｇ又はＣを連続で３塩基以上備えているプライマーを含むプライマーセットが見つかるまで、条件Ｂの処理を繰り返す。
ＧＣ配列判定手段２５による判定は、ステップ２０で選択された全ての増幅対象生物について、それぞれ行うことができる。
As a result of the determination by the GC sequence determination means 25, when both the base sequences of the forward primer and the reverse primer in the selected primer set do not have 3 or more consecutive G or C (NO in step 24), the step is repeated. The process from 22 is repeated. That is, the primer candidate selection unit 24 reselects the forward primer and reverse primer candidates from the organism to be amplified, and the GC sequence determination unit 25 includes a primer set including a primer having three or more consecutive G or C. The process of condition B is repeated until it is found.
The determination by the GC sequence determination means 25 can be performed for all the amplification target organisms selected in step 20.
このようにしてＰＣＲに用いるものとして決定されたプライマーセットにおける、Ｇ又はＣを連続で３塩基以上備えているプライマーの塩基配列の例を図４に示す。
同図において、リステリアのｄｎａＪ領域から選択されたリバースプライマー（配列番号１：GAGAATCCTCCACCGCTAAATCCGCC）は、３’末端側において、Ｇ又はＣを連続で５塩基備えている。
また、黄色ブドウ球菌のｄｎａＪ領域から選択されたフォワードプライマー（配列番号２：CACGCCTGGAGAGCCTTCACCAGC）は、３’末端側（中央を含む）において、Ｇ又はＣを連続で３塩基備えている。
FIG. 4 shows an example of the base sequence of a primer having three or more consecutive G or C in the primer set determined to be used for PCR in this way.
In the figure, the reverse primer selected from the dnaJ region of Listeria (SEQ ID NO: 1 GAGAATCCTCCACCGCTAAATCCGCC) has 5 or more consecutive G or C bases on the 3 ′ end side.
Moreover, the forward primer (SEQ ID NO: 2: CACGCCTGGAGAGCCTTCACCAGC) selected from the dnaJ region of S. aureus has 3 bases of G or C continuously on the 3 ′ end side (including the center).
また、サルモネラのｉｎｖＡ領域から選択されたフォワードプライマー（配列番号３：GAACAACCCATTTGTATTGGTTGTTACGGC）は、３’末端側において、Ｇ又はＣを連続で４塩基備えている。
さらに、大腸菌のｐｙｒＨ領域から選択されたフォワードプライマー（配列番号４：CGCTCGTCTGATGTCCGCTATTCCATTGAAT）は、３’末端側（中央を含む）において、Ｇ又はＣを連続で３塩基備えている。
また、カンピロバクターの１６ＳｒＤＮＡ領域から選択されたフォワードプライマー（配列番号５：GAAATCTAATGGCTTAACCATTAAACTGCTTGGG）は、３’末端側において、Ｇ又はＣを連続で３塩基備えている。
In addition, the forward primer selected from the Salmonella invA region (SEQ ID NO: 3: GAACAACCCATTTGTATTGGTTGTTACGGC) has 4 bases of G or C continuously on the 3 ′ end side.
Furthermore, the forward primer (SEQ ID NO: 4: CGCTCGTCTGATGTCCGCTATTCCATTGAAT) selected from the pyrH region of Escherichia coli has 3 bases of G or C continuously on the 3 ′ end side (including the center).
In addition, the forward primer (SEQ ID NO: 5: GAAATCTAATGGCTTAACCATTAAACTGCTTGGG) selected from the 16S rDNA region of Campylobacter has 3 bases of G or C continuously on the 3 ′ end side.
このようにして得られたプライマーを含むプライマーセットを用いてＰＣＲを行うことにより、増幅の特異性を、一層向上させることが経験上明らかとなっている。 Experience has shown that the amplification specificity can be further improved by performing PCR using a primer set containing the primer thus obtained.
［プライマーの設計方法の第三実施形態］
次に、図６〜図８を参照して、本発明の第三実施形態について説明する。図６は、本実施形態におけるプライマー設計装置の構成を示すブロック図であり、図７は、本実施形態において作製されたプライマーの配列の例を示す図であり、図８は、本実施形態のプライマーの設計方法を示すフローチャートである。
本実施形態は、主に塩基配列のＧＣ含有量が少ない生物を増幅対象生物とする場合に、好適に用いられるものである。ここで、「ＧＣ含有量が少ない」とは、塩基配列におけるＧ又はＣ塩基の含有量が５０％未満である場合を意味する。
[Third embodiment of primer design method]
Next, a third embodiment of the present invention will be described with reference to FIGS. FIG. 6 is a block diagram showing the configuration of the primer design apparatus in the present embodiment, FIG. 7 is a diagram showing an example of the primer sequence prepared in the present embodiment, and FIG. 8 is a diagram of the present embodiment. It is a flowchart which shows the design method of a primer.
This embodiment is preferably used when an organism mainly having a small GC content in the base sequence is used as an amplification target organism. Here, “the content of GC is low” means that the content of G or C base in the base sequence is less than 50%.
本実施形態におけるプライマー設計装置３０は、図６に示すように、塩基配列記憶手段３１、増幅対象生物選択手段３２、非増幅対象生物選択手段３３、プライマー候補選択手段３４、ＡＴ配列判定手段３５、及びプライマーセット記憶手段３６を備えている。
本実施形態では、ＡＴ配列判定手段３５により、候補のプライマーの塩基配列におけるＡ又はＴの連続配列にもとづいて、これをＰＣＲ用のプライマーセットとして用いるか否かを決定する点で第一実施形態と異なっている。その他の点については、第一実施形態と同様のものとすることができ、本実施形態におけるその他の各手段は、第一実施形態における同名の各手段とそれぞれ同様の処理を行うものとすることができる。また、図８に示す本実施形態のプライマーの設計方法の各工程は、図２の条件Ａ（ステップ１３，１４）を、条件Ｃ（ステップ３３，３４）に変更した点以外は、図２におけるものと同様である。
As shown in FIG. 6, the primer design apparatus 30 in the present embodiment includes a base sequence storage unit 31, an amplification target organism selection unit 32, a non-amplification target organism selection unit 33, a primer candidate selection unit 34, an AT sequence determination unit 35, And a primer set storage means 36.
In the present embodiment, the first embodiment is that the AT sequence determination means 35 determines whether or not to use this as a primer set for PCR based on the continuous sequence of A or T in the base sequence of the candidate primer. Is different. The other points can be the same as those in the first embodiment, and the other means in the present embodiment perform the same processes as the respective means having the same names in the first embodiment. Can do. Further, each step of the primer designing method of the present embodiment shown in FIG. 8 is the same as that in FIG. 2 except that the condition A (steps 13 and 14) in FIG. 2 is changed to the condition C (steps 33 and 34). It is the same as that.
ＡＴ配列判定手段３５は、プライマー候補選択手段３４により選択されたプライマーセットにおけるフォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列が、それぞれのプライマーの塩基配列の中心から３’末端側及び５’末端側の両方向に向かってそれぞれのプライマーの全長の四分の１の範囲を含む領域（以下、この領域を中央領域と称する。）に、Ａ又はＴを連続で４塩基以上備える配列を有するか否かを判定する（ステップ３３）。
ＡＴ配列判定手段３５による判定の結果、選択されたプライマーセットにおけるフォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列の少なくとも一方が、中央領域に、Ａ又はＴを連続で４塩基以上備えている場合（ステップ３４のＹＥＳ）、ＡＴ配列判定手段３５は、当該プライマーセットの候補を、ＰＣＲに用いるプライマーセットとして決定する（ステップ３５）。そして、プライマーセット記憶手段３６は、この決定されたプライマーセットを記憶する。
The AT sequence determination unit 35 is configured so that the base sequences of the forward primer and the reverse primer in the primer set selected by the primer candidate selection unit 34 are both in the 3 ′ end side and the 5 ′ end side from the center of the base sequence of each primer. Whether or not it has a sequence comprising 4 or more bases of A or T in a region including a quarter of the full length of each primer (hereinafter, this region is referred to as a central region) is determined. (Step 33).
As a result of the determination by the AT sequence determination means 35, when at least one of the base sequences of the forward primer and the reverse primer in the selected primer set has four or more bases of A or T in the central region (in step 34) YES), the AT sequence determination means 35 determines the candidate primer set as a primer set used for PCR (step 35). The primer set storage means 36 stores the determined primer set.
ＡＴ配列判定手段３５による判定の結果、選択されたプライマーセットにおけるフォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列の両方が、中央領域に、Ａ又はＴを連続で４塩基以上備えていない場合（ステップ３４のＮＯ）、再度ステップ３２からの処理を繰り返す。すなわち、プライマー候補選択手段３４により増幅対象生物からフォワードプライマーとリバースプライマーの候補を選択し直して、ＡＴ配列判定手段３５により、中央領域にＡ又はＴを連続で４塩基以上備えているプライマー配列を含むプライマーセットが見つかるまで、条件Ｃの処理を繰り返す。 As a result of the determination by the AT sequence determination means 35, when both the forward primer and reverse primer base sequences in the selected primer set do not have 4 or more consecutive A or T in the central region (NO in step 34) ) Repeat the process from step 32 again. That is, the candidate primer selection means 34 reselects the forward primer and reverse primer candidates from the organisms to be amplified, and the AT sequence determination means 35 provides a primer sequence having four or more consecutive A or T in the central region. Repeat condition C until a primer set is found.
ＡＴ配列判定手段３５による判定は、ステップ３０で選択された全ての増幅対象生物について、それぞれ行うことができる。
このようにしてＰＣＲに用いるものとして決定されたプライマーセットにおける、Ａ又はＴを連続で４塩基以上備えているプライマー配列の例を図７に示す。
The determination by the AT sequence determination unit 35 can be performed for all the amplification target organisms selected in step 30.
FIG. 7 shows an example of a primer sequence having four or more consecutive A or T in the primer set determined to be used for PCR in this way.
同図において、ビブリオのｔｄｈ領域から選択されたフォワードプライマー（配列番号６：TCAGTTTACTTTTTTGGGTTTTTTGGCTTTCATGAAACCTG）は、中央領域に、Ａ又はＴを連続で６塩基備えている。
また、セレウスのｎｈｅ領域から選択されたフォワードプライマー（配列番号７：CATCTGTTGATGCGGCTTTAAAAGGGAAGT）は、中央領域に、Ａ又はＴを連続で７塩基備えている。
さらに、セレウスのｃｅｓＢ領域から選択されたフォワードプライマー（配列番号８：CACCTGCCGGAGGAGCAAAAATGATACAAC）は、中央領域に、Ａ又はＴを連続で６塩基備えている。
In the figure, a forward primer (SEQ ID NO: 6: TCAGTTTACTTTTTTGGGTTTTTTGGCTTTCATGAAACCTG) selected from the vibrio tdh region has 6 bases of A or T in the central region.
Moreover, the forward primer (SEQ ID NO: 7: CATCTGTTGATGCGGCTTTAAAAGGGAAGT) selected from the nhe region of Cereus has 7 bases of A or T in the central region.
Furthermore, the forward primer (SEQ ID NO: 8: CACCTGCCGGAGGAGCAAAAATGATACAAC) selected from the cesB region of Cereus has 6 bases of A or T in the central region.
このようにして得られたプライマーを含むプライマーセットを用いてＰＣＲを行うことにより、増幅の特異性を、一層向上させることが経験上明らかとなっている。 Experience has shown that the amplification specificity can be further improved by performing PCR using a primer set containing the primer thus obtained.
［プライマーの設計方法の第四実施形態］
次に、図９及び図１０を参照して、本発明の第四実施形態について説明する。図９は、本実施形態におけるプライマー設計装置の構成を示すブロック図であり、図１０は、本実施形態のプライマーの設計方法を示すフローチャートである。
[Fourth Embodiment of Primer Design Method]
Next, with reference to FIG.9 and FIG.10, 4th embodiment of this invention is described. FIG. 9 is a block diagram showing the configuration of the primer design apparatus in this embodiment, and FIG. 10 is a flowchart showing the primer design method of this embodiment.
本実施形態におけるプライマー設計装置４０は、図９に示すように、塩基配列記憶手段４１、増幅対象生物選択手段４２、非増幅対象生物選択手段４３、プライマー候補選択手段４４、融解温度判定手段４５、及びプライマーセット記憶手段４６を備えている。
本実施形態におけるプライマー設計装置４０は、プライマー候補選択手段４４が増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列から所定の長さのフォワードプライマーとリバースプライマーの候補を選択するとともに、融解温度判定手段４５により、フォワードプライマーとリバースプライマーの融解温度が所定の範囲内である場合に、ＰＣＲに用いるプライマーセットとして用いることを決定する点で第一実施形態と異なっている。その他の点については、第一実施形態と同様のものとすることができ、本実施形態におけるその他の各手段は、第一実施形態における同名の各手段とそれぞれ同様の処理を行うものとすることができる。また、図１０に示す本実施形態のプライマーの設計方法の各工程は、ステップ４２の内容、及び図２の条件Ａ（ステップ１３，１４）を条件Ｄ（ステップ４３〜４５）に変更した点以外は、図２におけるものと同様である。
As shown in FIG. 9, the primer design device 40 in this embodiment includes a base sequence storage unit 41, an amplification target organism selection unit 42, a non-amplification target organism selection unit 43, a primer candidate selection unit 44, a melting temperature determination unit 45, And a primer set storage means 46.
In the primer design apparatus 40 in this embodiment, the primer candidate selection means 44 selects a forward primer and a reverse primer candidate of a predetermined length from the base sequence of the DNA of the organism to be amplified, and the melting temperature determination means 45 causes the forward When the melting temperature of the primer and the reverse primer is within a predetermined range, it is different from the first embodiment in that it is determined to be used as a primer set used for PCR. The other points can be the same as those in the first embodiment, and the other means in the present embodiment perform the same processes as the respective means having the same names in the first embodiment. Can do. Moreover, each process of the primer design method of this embodiment shown in FIG. 10 is the content of step 42 and the point which changed the condition A (steps 13 and 14) of FIG. 2 to the condition D (steps 43-45). Is the same as in FIG.
プライマー候補選択手段４４は、増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列からプライマーセットの候補となる塩基配列を選択し、これを当該増幅対象生物の識別情報に対応付けて一時的に記憶する。本実施形態におけるこのプライマー候補選択手段４４は、増幅対象領域の両端付近の領域から２３ｍｅｒ〜４１ｍｅｒ程度の長さのフォワードプライマー及びリバースプライマーを選択する。 The primer candidate selection means 44 selects a base sequence that is a candidate for a primer set from the DNA base sequence of the amplification target organism, and temporarily stores it in association with the identification information of the amplification target organism. The primer candidate selection means 44 in this embodiment selects a forward primer and a reverse primer having a length of about 23 mer to 41 mer from a region near both ends of the amplification target region.
融解温度判定手段４５は、プライマー候補選択手段４４により選択されたプライマーセットにおけるフォワードプライマー及びリバースプライマーの融解温度（Ｔｍ値）を算出し、その融解温度が７０〜７８℃であるか否かを判定することができる（ステップ４３、４４）。この判定において、融解温度が７３〜７８℃であるか否かを判定するようにすることがより好ましい。以下においても同様である。ＰＣＲにおけるアニーリング温度との関係で、プライマーの融解温度をこのような範囲にすれば、より特異性の高い増幅を実現することができる。 The melting temperature determination unit 45 calculates the melting temperature (Tm value) of the forward primer and the reverse primer in the primer set selected by the primer candidate selection unit 44, and determines whether the melting temperature is 70 to 78 ° C. (Steps 43 and 44). In this determination, it is more preferable to determine whether or not the melting temperature is 73 to 78 ° C. The same applies to the following. If the melting temperature of the primer is set to such a range in relation to the annealing temperature in PCR, amplification with higher specificity can be realized.
なお、融解温度判定手段４５によるフォワードプライマー及びリバースプライマーの融解温度の算出方法としては、例えばＷａｌｌａｃｅ法、ＧＣ％法、最近接塩基対法等を用いることができる。このうち、最近接塩基対法はプライマーの塩基組成、反応溶液の塩濃度、プライマーの長さや使用濃度、塩基の組成の他、塩濃度以外に隣接塩基間の熱力学エネルギー安定性を考慮するものであり、特に好ましい。以下の実施例では、この最近接塩基対法を用いて融解温度を算出している。 In addition, as a calculation method of the melting temperature of the forward primer and the reverse primer by the melting temperature determination means 45, for example, Wallace method, GC% method, nearest base pair method and the like can be used. Of these, the nearest base pair method considers the base composition of the primer, the salt concentration of the reaction solution, the length and usage concentration of the primer, the base composition, and the thermodynamic energy stability between adjacent bases in addition to the salt concentration. And particularly preferred. In the following Examples, the melting temperature is calculated using this closest base pair method.
融解温度判定手段４５による判定の結果、フォワードプライマー及びリバースプライマーの両方の融解温度が７０〜７８℃である場合（ステップ４５のＹＥＳ）、融解温度判定手段４５は、当該プライマーセットの候補を、ＰＣＲに用いるプライマーセットとして決定する（ステップ４６）。そして、プライマーセット記憶手段４６は、この決定されたプライマーセットを記憶する。 As a result of the determination by the melting temperature determination means 45, when the melting temperatures of both the forward primer and the reverse primer are 70 to 78 ° C. (YES in step 45), the melting temperature determination means 45 selects the candidate primer set as a PCR. (Step 46). The primer set storage means 46 stores the determined primer set.
融解温度判定手段４５による判定の結果、フォワードプライマー及びリバースプライマーの少なくともいずれか一方の融解温度が７０〜７８℃でない場合（ステップ４５のＮＯ）、再度ステップ４２からの処理を繰り返す。すなわち、プライマー候補選択手段４４は、増幅対象生物からフォワードプライマーとリバースプライマーの候補を選択し直して、融解温度判定手段４５によりフォワードプライマー及びリバースプライマーの融解温度を算出し、フォワードプライマー及びリバースプライマーの両方の融解温度が７０〜７８℃であるプライマーセットが見つかるまで、条件Ｄの処理を繰り返すことができる。 As a result of the determination by the melting temperature determination means 45, when the melting temperature of at least one of the forward primer and the reverse primer is not 70 to 78 ° C. (NO in step 45), the processing from step 42 is repeated again. That is, the primer candidate selection unit 44 reselects the forward primer and reverse primer candidates from the amplification target organism, calculates the melting temperature of the forward primer and the reverse primer by the melting temperature determination unit 45, and determines the forward primer and the reverse primer. The treatment of condition D can be repeated until a primer set is found in which both melting temperatures are 70-78 ° C.
融解温度判定手段４５による判定は、ステップ４０で選択された全ての増幅対象生物について、それぞれ行うことができる。
本実施形態のプライマーの設計方法によれば、作製されるプライマーセットによる増幅の特異性を、一層向上させることが可能となる。
The determination by the melting temperature determination means 45 can be performed for all the amplification target organisms selected in step 40, respectively.
According to the primer design method of this embodiment, the specificity of amplification by the prepared primer set can be further improved.
［プライマーの設計方法の第五実施形態］
次に、図１１及び図１２を参照して、本発明の第五実施形態について説明する。図１１は、本実施形態におけるプライマー設計装置の構成を示すブロック図であり、図１２は、本実施形態のプライマーの設計方法を示すフローチャートである。
[Fifth embodiment of primer design method]
Next, with reference to FIG.11 and FIG.12, 5th embodiment of this invention is described. FIG. 11 is a block diagram illustrating a configuration of a primer design apparatus according to the present embodiment, and FIG. 12 is a flowchart illustrating a primer design method according to the present embodiment.
上述したように、微生物のＤＮＡの塩基配列は、例えばＧＣ含有量が少ない菌類で２５％、多い菌類で８０％程度と非常に幅広い。このＧＣ含有量は、プライマーの融解温度に影響を与えるため、プライマーの設計にあたっては、フォワードプライマーとリバースプライマーの融解温度をできるだけ揃えることが好ましい。
さらに、マルチプレックスＰＣＲにおいては、複数の増幅対象生物間で、プライマーの融解温度を揃えることができればより好ましい。
そこで、本実施形態では、プライマーの融解温度に着目して、以下に説明する条件Ｅを行うものとしている。
As described above, the base sequence of microbial DNA is, for example, 25% for fungi with a low GC content and about 80% for many fungi. Since the GC content affects the melting temperature of the primer, it is preferable to make the melting temperatures of the forward primer and the reverse primer as uniform as possible when designing the primer.
Furthermore, in multiplex PCR, it is more preferable if the melting temperatures of the primers can be made uniform among a plurality of amplification target organisms.
Therefore, in this embodiment, focusing on the melting temperature of the primer, the condition E described below is performed.
本実施形態におけるプライマー設計装置５０は、図１１に示すように、塩基配列記憶手段５１、増幅対象生物選択手段５２、非増幅対象生物選択手段５３、プライマー候補選択手段５４、融解温度算出手段５５、温度差判定手段５６、及びプライマーセット記憶手段５７を備えている。
本実施形態におけるプライマー設計装置５０は、融解温度算出手段５５と温度差判定手段５６により、フォワードプライマーとリバースプライマーの融解温度差が所定の範囲内である場合に、ＰＣＲに用いるプライマーセットとして用いることを決定する点で第一実施形態と異なっている。その他の点については、第一実施形態と同様のものとすることができ、本実施形態におけるその他の各手段は、第一実施形態における同名の各手段とそれぞれ同様の処理を行うものとすることができる。また、図１２に示す本実施形態のプライマーの設計方法の各工程は、図２の条件Ａ（ステップ１３，１４）を、条件Ｅ（ステップ５３〜５５）に変更した点以外は、図２におけるものと同様である。
As shown in FIG. 11, the primer design device 50 in this embodiment includes a base sequence storage unit 51, an amplification target organism selection unit 52, a non-amplification target organism selection unit 53, a primer candidate selection unit 54, a melting temperature calculation unit 55, A temperature difference determination unit 56 and a primer set storage unit 57 are provided.
The primer design device 50 in this embodiment is used as a primer set for PCR when the melting temperature difference between the forward primer and the reverse primer is within a predetermined range by the melting temperature calculation means 55 and the temperature difference determination means 56. This is different from the first embodiment in that it is determined. The other points can be the same as those in the first embodiment, and the other means in the present embodiment perform the same processes as the respective means having the same names in the first embodiment. Can do. Each step of the primer designing method of the present embodiment shown in FIG. 12 is the same as that in FIG. 2 except that the condition A (steps 13 and 14) in FIG. 2 is changed to the condition E (steps 53 to 55). It is the same as that.
融解温度算出手段５５は、プライマー候補選択手段５４により選択されたプライマーセットにおけるフォワードプライマー及びリバースプライマーの融解温度を算出する。
また、温度差判定手段５６は、算出された融解温度の差（融解温度の差の絶対値。以下同様。）が、５℃未満であるか否かを判定する（ステップ５３，５４）。融解温度の差が、このような範囲であれば、特異性の高い増幅が行えるためである。
The melting temperature calculation means 55 calculates the melting temperature of the forward primer and the reverse primer in the primer set selected by the primer candidate selection means 54.
Further, the temperature difference determination means 56 determines whether or not the calculated difference in melting temperature (absolute value of difference in melting temperature; the same applies hereinafter) is less than 5 ° C. (steps 53 and 54). This is because, if the difference in melting temperature is within such a range, highly specific amplification can be performed.
温度差判定手段５６による判定の結果、算出された融解温度の差が、５℃未満である場合（ステップ５５のＹＥＳ）、温度差判定手段５６は、当該プライマーセットの候補を、ＰＣＲに用いるプライマーセットとして決定する（ステップ５６）。そして、プライマーセット記憶手段５７は、この決定されたプライマーセットを記憶する。 As a result of the determination by the temperature difference determining means 56, if the calculated difference in melting temperature is less than 5 ° C. (YES in step 55), the temperature difference determining means 56 uses the primer set candidate as a primer for PCR. The set is determined (step 56). The primer set storage unit 57 stores the determined primer set.
温度差判定手段５６による判定の結果、算出された融解温度の差が、５℃未満でない場合（ステップ５５のＮＯ）、再度ステップ５２からの処理を繰り返す。すなわち、プライマー候補選択手段５４は、増幅対象生物からフォワードプライマーとリバースプライマーの候補を選択し直して、融解温度算出手段５５によりフォワードプライマー及びリバースプライマーの融解温度を算出し、温度差判定手段５６により融解温度の差が５℃未満のフォワードプライマー及びリバースプライマーを含むプライマーセットが見つかるまで、条件Ｅの処理を繰り返すことができる。 As a result of the determination by the temperature difference determination means 56, if the calculated difference in melting temperature is not less than 5 ° C. (NO in step 55), the processing from step 52 is repeated again. That is, the primer candidate selection unit 54 reselects the forward primer and reverse primer candidates from the organisms to be amplified, calculates the melting temperature of the forward primer and the reverse primer by the melting temperature calculation unit 55, and the temperature difference determination unit 56 The condition E treatment can be repeated until a primer set is found that includes a forward primer and a reverse primer with a melting temperature difference of less than 5 ° C.
融解温度算出手段５５と温度差判定手段５６による判定は、ステップ５０で選択された全ての増幅対象生物について、それぞれ行うことができる。
本実施形態のプライマーの設計方法によれば、作製されるプライマーセットによる増幅の特異性を、一層向上させることが可能となる。
The determination by the melting temperature calculation means 55 and the temperature difference determination means 56 can be performed for all the amplification target organisms selected in step 50, respectively.
According to the primer design method of this embodiment, the specificity of amplification by the prepared primer set can be further improved.
［プライマーの設計方法の第六実施形態］
次に、図１３及び図１４を参照して、本発明の第六実施形態について説明する。図１３は、本実施形態におけるプライマー設計装置の構成を示すブロック図であり、図１４は、本実施形態のプライマーの設計方法を示すフローチャートである。
[Sixth embodiment of primer design method]
Next, a sixth embodiment of the present invention will be described with reference to FIGS. FIG. 13 is a block diagram illustrating a configuration of a primer design apparatus according to the present embodiment, and FIG. 14 is a flowchart illustrating a primer design method according to the present embodiment.
本実施形態におけるプライマー設計装置６０は、図１３に示すように、塩基配列記憶手段６１、増幅対象生物選択手段６２、非増幅対象生物選択手段６３、プライマー候補選択手段６４、融解温度算出手段６５、温度差判定手段６６、十二塩基連続重複判定手段６７、及びプライマーセット記憶手段６８を備えている。
本実施形態におけるプライマー設計装置６０は、上記条件の一部、すなわち第一実施形態における条件Ａと、第五実施形態における条件Ｅを組み合わせた構成を備えており、これによって、ＰＣＲに用いるプライマーセットを決定するものである。その他の点については、第一実施形態と同様のものとすることができ、本実施形態におけるその他の各手段は、第一実施形態における同名の各手段とそれぞれ同様の処理を行うことができる。
As shown in FIG. 13, the primer design device 60 in the present embodiment includes a base sequence storage means 61, an amplification target organism selection means 62, a non-amplification target organism selection means 63, a primer candidate selection means 64, a melting temperature calculation means 65, A temperature difference determination unit 66, a twelve base continuous overlap determination unit 67, and a primer set storage unit 68 are provided.
The primer design device 60 in the present embodiment has a configuration in which a part of the above conditions, that is, the condition A in the first embodiment and the condition E in the fifth embodiment are combined, and thereby a primer set used for PCR Is to determine. About another point, it can be set as the thing similar to 1st embodiment, and each other means in this embodiment can respectively perform the process similar to each means of the same name in 1st embodiment.
本実施形態のプライマーの設計方法は、条件Ｅを行うまでの動作（ステップ６０〜６５）については、第五実施形態における図１２の動作（ステップ５０〜５５）と同様のものとすることができる。
温度差判定手段６６による判定の結果、算出された融解温度の差が、５℃未満である場合（ステップ６５のＹＥＳ）、次に、条件Ａを第一実施形態と同様に行って（ステップ６６、６７）、選択されたプライマーセットにおけるフォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列の少なくともいずれかが、非増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列と、１２塩基以上連続で重複しない場合（ステップ６７のＮＯ）、当該プライマーセットを、作製に用いるプライマーセットとして決定する（ステップ６８）。このとき、選択されたプライマーセットにおけるフォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列の少なくともいずれかが、このプライマーセットの候補が選択された当該増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列の非増幅対象領域、他の増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列、及び非増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列と、１２塩基以上連続して重複しない場合、当該プライマーセットの候補を、ＰＣＲに用いるプライマーセットとして決定することも好ましい。
In the primer designing method of the present embodiment, the operation until the condition E is performed (steps 60 to 65) can be the same as the operation of FIG. 12 (steps 50 to 55) in the fifth embodiment. .
As a result of the determination by the temperature difference determination means 66, if the calculated difference in melting temperature is less than 5 ° C. (YES in step 65), then condition A is performed in the same manner as in the first embodiment (step 66). 67), when at least one of the base sequences of the forward primer and the reverse primer in the selected primer set does not overlap with the base sequence of the DNA of the non-amplification target organism for 12 bases or more in succession (NO in step 67), The primer set is determined as a primer set used for production (step 68). At this time, at least one of the base sequences of the forward primer and the reverse primer in the selected primer set is a non-amplification target region of the DNA base sequence of the amplification target organism for which this primer set candidate is selected, and other amplification When the base sequence of the DNA of the target organism and the base sequence of the DNA of the non-amplification target organism do not overlap with each other by 12 bases or more, it is also preferable to determine the candidate primer set as a primer set used for PCR.
また、十二塩基連続重複判定手段６７による判定の結果、上記以外の場合、すなわち、非増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列の少なくともいずれかについて、上記フォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列の両方が、１２塩基以上連続で重複する場合（ステップ６７のＹＥＳ）、プライマー候補選択手段６４により増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列から再度プライマーセットの候補となる塩基配列を選択し、ステップ６２からの動作を繰り返す。このとき、上記フォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列の両方が、このプライマーセットの候補が選択された当該増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列の非増幅対象領域、他の増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列、又は非増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列の少なくともいずれかと、１２塩基以上連続して重複する場合、再度プライマーセットの候補となる塩基配列を選択し直して、ステップ６２からの動作を繰り返すことも好ましい。 Further, as a result of the determination by the twelve base continuous duplication determination means 67, in the case other than the above, that is, for at least one of the base sequences of the DNA of the non-amplification target organism, both the base sequences of the forward primer and the reverse primer are When 12 or more bases are consecutively overlapped (YES in step 67), the primer candidate selection unit 64 selects a base sequence as a candidate for the primer set again from the DNA base sequence of the amplification target organism, and repeats the operation from step 62. . At this time, both of the base sequences of the forward primer and the reverse primer are the non-amplification target region of the DNA base sequence of the amplification target organism from which the candidate of this primer set is selected, and the base sequence of the DNA of another amplification target organism Alternatively, if at least one of the base sequences of the DNA of the non-amplification target organism overlaps continuously by 12 bases or more, the base sequence that is a candidate for the primer set is selected again, and the operation from step 62 may be repeated. preferable.
また、温度差判定手段６６による判定の結果、算出された融解温度の差が、５℃未満でない場合（ステップ６５のＮＯ）にも、再度ステップ６２からの処理を繰り返す。
これらの判定についても、ステップ６０で選択された全ての増幅対象生物について、それぞれ行うことができる。
本実施形態のプライマーの設計方法によれば、作製されるプライマーセットによる増幅の特異性を、より一層向上させることが可能となる。
In addition, as a result of the determination by the temperature difference determination means 66, when the calculated difference in melting temperature is not less than 5 ° C. (NO in step 65), the processing from step 62 is repeated again.
These determinations can also be made for all the amplification target organisms selected in step 60, respectively.
According to the primer design method of the present embodiment, the specificity of amplification by the prepared primer set can be further improved.
［プライマーの設計方法の第七実施形態］
次に、図１５及び図１６を参照して、本発明の第七実施形態について説明する。図１５は、本実施形態におけるプライマー設計装置の構成を示すブロック図であり、図１６は、本実施形態のプライマーの設計方法を示すフローチャートである。
[Seventh Embodiment of Primer Design Method]
Next, a seventh embodiment of the present invention will be described with reference to FIGS. 15 and 16. FIG. 15 is a block diagram showing the configuration of the primer design apparatus according to this embodiment, and FIG. 16 is a flowchart showing the primer design method of this embodiment.
本実施形態におけるプライマー設計装置７０は、図１５に示すように、塩基配列記憶手段７１、増幅対象生物選択手段７２、非増幅対象生物選択手段７３、プライマー候補選択手段７４、ＧＣ含量判定手段７５、ＧＣ配列判定手段７６、ＡＴ配列判定手段７７、融解温度判定手段７８、融解温度算出手段７９、温度差判定手段７ａ、十二塩基連続重複判定手段７ｂ、及びプライマーセット記憶手段７ｃを備えている。
本実施形態におけるプライマー設計装置７０は、このように第一実施形態〜第五実施形態における判定手段を全て備えるとともに、さらにＧＣ含量判定手段７５を備え、これらによってＰＣＲに用いるプライマーセットを決定するものである。具体的には、以下の通りであるが、その他の点については、第一実施形態と同様のものとすることができる。
As shown in FIG. 15, the primer design device 70 in this embodiment includes a base sequence storage unit 71, an amplification target organism selection unit 72, a non-amplification target organism selection unit 73, a primer candidate selection unit 74, a GC content determination unit 75, A GC sequence determination unit 76, an AT sequence determination unit 77, a melting temperature determination unit 78, a melting temperature calculation unit 79, a temperature difference determination unit 7a, a twelve base continuous overlap determination unit 7b, and a primer set storage unit 7c are provided.
The primer design device 70 in this embodiment includes all the determination means in the first embodiment to the fifth embodiment as described above, and further includes the GC content determination means 75, which determines the primer set used for PCR. It is. Specifically, as described below, the other points can be the same as those in the first embodiment.
なお、本実施形態では、条件Ａ〜Ｅのすべてを満たすプライマーセットを設計する例を示しているが、その一部の条件のみを満たすプライマーセットを設計することもできる。また、図１６における各条件の判定を行う順序は、入れ替えても良い。さらに、複数の条件において同じデータを用いる場合には、後の算出処理を省略しても良い。例えば、条件Ｅの処理において、融解温度算出手段７９による融解温度の算出処理を省略し、条件Ｄの処理で融解温度判定手段７８により算出された融解温度を用い、温度差判定手段７ａによる融解温度差を算出することが可能である。 In this embodiment, an example of designing a primer set that satisfies all of the conditions A to E is shown, but a primer set that satisfies only some of the conditions can also be designed. Further, the order of determining each condition in FIG. 16 may be switched. Further, when the same data is used under a plurality of conditions, the subsequent calculation process may be omitted. For example, in the process of condition E, the melting temperature calculation process by the melting temperature calculation unit 79 is omitted, and the melting temperature calculated by the melting temperature determination unit 78 in the process of condition D is used, and the melting temperature by the temperature difference determination unit 7a is used. It is possible to calculate the difference.
ＧＣ含量判定手段７５は、入力したフォワードプライマー及びリバースプライマーの候補のＧＣ含量を算出し、含有量が５０％であるか否かを判定する。ＧＣ含量は、これらのプライマーの全塩基配列数に対するＧ及びＣの塩基配列数の割合にもとづき算出することができる。
本実施形態では、プライマー候補選択手段７４により、増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列から長さが２３〜４１ｍｅｒのフォワードプライマー及びリバースプライマーが選択されて、これらがＧＣ含量判定手段７５に入力される。なお、条件Ｄの判定を省略する場合は、プライマー候補選択手段７４により、長さが２３〜４１ｍｅｒの制限なくプライマーセットの候補が選択され、ＧＣ含量判定手段７５による上記ＧＣ含量の判定を行うことができる。
The GC content determination means 75 calculates the GC content of the input forward primer and reverse primer candidates, and determines whether the content is 50%. The GC content can be calculated based on the ratio of the number of base sequences of G and C to the total number of base sequences of these primers.
In the present embodiment, the primer candidate selection unit 74 selects a 23-41mer long forward primer and a reverse primer from the DNA base sequence of the amplification target organism, and inputs these to the GC content determination unit 75. When the determination of condition D is omitted, the primer candidate selection unit 74 selects a primer set candidate without limitation of a length of 23 to 41 mer, and the GC content determination unit 75 determines the GC content. Can do.
本実施形態のプライマーの設計方法は、ＧＣ含量判定手段７５による判定が行われる前までの動作（ステップ７０〜７２）については、第四実施形態における図１０の動作（ステップ４０〜４２）と同様のものとすることができる。
次に、ＧＣ含量判定手段７５により、フォワードプライマー及びリバースプライマーの候補のＧＣ含量を算出し、含有量が５０％であるか否かを判定する（ステップ７３）。
In the primer designing method of the present embodiment, the operation (steps 70 to 72) before the determination by the GC content determination means 75 is the same as the operation of FIG. 10 (steps 40 to 42) in the fourth embodiment. Can be.
Next, the GC content determination means 75 calculates the GC content of the forward primer and reverse primer candidates, and determines whether the content is 50% (step 73).
そして、ＧＣ含量が５０％以上の場合、条件ＢのＧＣ配列判定処理を実行し（ステップ７４）、ＧＣ含量が５０％未満の場合、条件ＣのＡＴ配列判定処理を実行し（ステップ７５）、次いで条件Ｄにおける融解温度判定処理を実行する（ステップ７６）。ここで、ステップ７４は、第二実施形態における図５の動作（ステップ２３〜２４）と同様のものとすることができ、ステップ７５は、第三実施形態における図８の動作（ステップ３３〜３４）と同様のものとすることができ、ステップ７６は、第四実施形態における図１０の動作（ステップ４３〜４５）と同様のものとすることができる。 When the GC content is 50% or more, the GC sequence determination process of condition B is executed (step 74). When the GC content is less than 50%, the AT sequence determination process of condition C is executed (step 75). Next, a melting temperature determination process under condition D is executed (step 76). Here, step 74 can be the same as the operation of FIG. 5 (steps 23 to 24) in the second embodiment, and step 75 is the operation of FIG. 8 in the third embodiment (steps 33 to 34). ), And step 76 can be the same as the operation (steps 43 to 45) of FIG. 10 in the fourth embodiment.
続いて、条件Ｅの融解温度差判定処理を実行し（ステップ７７）、さらに条件Ａの１２塩基連続重複判定処理を実行して（ステップ７８）、全ての条件を満たすものを、プライマーセットとして決定することができる（ステップ７９）。ここで、ステップ７７は、第五実施形態における図１２の動作（ステップ５３〜５５）と同様のものとすることができ、ステップ７５は、第一実施形態における図２の動作（ステップ１３〜１４）と同様のものとすることができる。 Subsequently, a melting temperature difference determination process of condition E is executed (step 77), and a 12-base continuous overlap determination process of condition A is further executed (step 78), and those satisfying all the conditions are determined as primer sets. (Step 79). Here, step 77 can be the same as the operation of FIG. 12 (steps 53 to 55) in the fifth embodiment, and step 75 is the operation of FIG. 2 in the first embodiment (steps 13 to 14). ).
本実施形態のプライマーの設計方法によれば、作製されるプライマーセットによる増幅の特異性を、極めて高い精度にまで向上させることが可能となっている。 According to the primer design method of this embodiment, it is possible to improve the specificity of amplification by the prepared primer set to extremely high accuracy.
以上の通り、本発明のプライマーの作製方法、プライマーの使用方法、プライマーセット、ＰＣＲ用反応液、及びプライマーの設計方法によれば、作業者の経験や技能に関係なく簡単に、特異性の高いプライマーを作成することができるため、一回の試験で複数菌を検出することが可能となる。このため、検査コストを大幅に削減することが可能となる。
また、このように特異性の高いプライマーを設計できるため、特異性の検証に必要なプライマー量を削減することが可能となる。
さらに、本発明はＤＮＡを有する各種生物体の検出にも応用でき、産業の発展に寄与する有用性の高いものであると言える。
As described above, according to the primer preparation method, primer use method, primer set, PCR reaction solution, and primer design method of the present invention, the specificity is simple regardless of the experience and skill of the operator. Since a primer can be created, it is possible to detect multiple bacteria in a single test. For this reason, the inspection cost can be greatly reduced.
In addition, since a primer with high specificity can be designed in this way, it is possible to reduce the amount of primer necessary for verification of specificity.
Furthermore, the present invention can be applied to detection of various organisms having DNA, and can be said to be highly useful for contributing to industrial development.
＜実験１：「１２塩基以上連続で重ならない」に関して＞
本発明のプライマーの作製方法及びプライマーの設計方法にもとづいて、「プライマーセットにおけるフォワードプライマー及びリバースプライマーの少なくとも一方の塩基配列が、所定の非増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列と、１２塩基以上連続で重ならない（条件Ａ）」を満たすプライマーセットを１５５個作製し、これらをそれぞれ用いてＰＣＲ法を行うことにより、増幅対象領域が特異的に増幅されるか否かを確認した。その結果、全てのプライマーセットについて、特異的な増幅が行われ、非増幅対象領域が増幅されなかった。このうち３例について、以下の実施例１〜３に示す。
<Experiment 1: Regarding “12 bases or more that do not overlap”>
Based on the primer preparation method and primer design method of the present invention, “at least one base sequence of the forward primer and the reverse primer in the primer set is continuous with the base sequence of the DNA of a predetermined non-amplification target organism for 12 bases or more. 155 primer sets satisfying “No overlap (Condition A)” were prepared, and PCR was performed using each of them to confirm whether or not the region to be amplified was specifically amplified. As a result, specific amplification was performed for all the primer sets, and the non-amplification target region was not amplified. Three of these are shown in Examples 1 to 3 below.
また、条件Ａを満たさず、フォワードプライマー及びリバースプライマーの両方が非増幅対象領域と１２塩基以上重複するプライマーセットを５６個作製して、増幅対象領域がＰＣＲ法により特異的に増幅されるか否かを確認した。その結果、全てのプライマーセットについて、非特異的な増幅が行われ、非増幅対象領域が増幅されていた。このうち２例について、以下の比較例１，２に示す。 Also, whether or not the amplification target region is specifically amplified by the PCR method by preparing 56 primer sets that do not satisfy the condition A and both the forward primer and the reverse primer overlap with the non-amplification target region by 12 bases or more. I confirmed. As a result, non-specific amplification was performed for all primer sets, and the non-amplification target region was amplified. Two of these are shown in Comparative Examples 1 and 2 below.
（実施例１）
まず、増幅対象生物として食中毒菌である以下のビブリオ（RIMD2210050）を選択するとともに、非増幅対象生物として以下の６種類の食中毒菌を選択した。なお、Negative Cont.は対照である。
１．非増幅対象生物 セレウス（Bacillus cereus TIFT 114011）
２．非増幅対象生物 カンピロバクター（Campylobacter jejuni ATCC 33560）
３．非増幅対象生物 大腸菌（Escherichia coli NBRC 102203）
４．非増幅対象生物 リステリア（Listeria monocytogenes ATCC 15313）
５．非増幅対象生物 サルモネラ（Salmonella enterica ATCC 9270）
６．非増幅対象生物 黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus NBRC 100910）
７．増幅対象生物 ビブリオ（Vibrio parahaemolyticus RIMD 2210050）
８．Negative Cont.
Example 1
First, the following vibrio (RIMD2210050), which is a food poisoning bacteria, was selected as an amplification target organism, and the following six types of food poisoning bacteria were selected as non-amplification target organisms. Negative Cont. Is a control.
1. Non-amplification target organism Cereus (Bacillus cereus TIFT 114011)
2. Non-amplification target organism Campylobacter jejuni ATCC 33560
3. Non-amplified organism Escherichia coli NBRC 102203
4). Non-amplified organism Listeria (Listeria monocytogenes ATCC 15313)
5. Non-amplified organism Salmonella (Salmonella enterica ATCC 9270)
6). Non-amplification target organism Staphylococcus aureus NBRC 100910
7). Vibrio to be amplified Vibrio (Vibrio parahaemolyticus RIMD 2210050)
8). Negative Cont.
これらの食中毒菌の菌株は、次の機関から分譲されたものである（以下においても同様）。
・NBRC 独立行政法人製品評価基盤機構
・TIFT 公益財団法人東洋食品研究所
・ATCC American type culture collection
・RIMD 大阪大学微生物病研究所
These strains of food poisoning bacteria have been distributed from the following institutions (the same applies hereinafter).
・ NBRC National Institute for Product Evaluation ・ TIFT Toyo Food Research Institute ・ ATCC American type culture collection
・ RIMD Institute for Microbial Diseases, Osaka University
次いで、ＤＮＡＳＩＳ（日立ソフトウェアエンジニアリング株式会社製）を用いてこれらの生物の塩基配列を比較した。そして、ビブリオの塩基配列から条件Ａを満たし、増幅対象領域ｔｄｈ（耐熱性溶血毒素遺伝子，３８０ｂｐ）を増幅するプライマーセットを設計した。
具体的には、図１７の実施例１に示すビブリオ検出用の両方のプライマー（配列番号９，１０）が、上記６種類の非増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列と１２塩基以上連続で重ならないもの（条件Ａ）である。
Subsequently, the base sequences of these organisms were compared using DNASIS (manufactured by Hitachi Software Engineering Co., Ltd.). Then, a primer set that satisfies the condition A from the base sequence of Vibrio and amplifies the amplification target region tdh (heat-resistant hemolytic toxin gene, 380 bp) was designed.
Specifically, both primers (SEQ ID NOs: 9 and 10) for vibrio detection shown in Example 1 of FIG. Things (Condition A).
なお、図１７において、配列番号は、配列表に示される塩基配列の配列番号を示している。Ｆ／Ｒは、フォワードプライマー及びリバースプライマーの区別を示しており、Ｆがフォワードプライマー、Ｒがリバースプライマーを示している。食中毒菌は、本実施形態のプライマーセットにより増幅する対象の食中毒菌の名称を表している。対象領域は、その食中毒菌における本実施形態のプライマーセットにより増幅される対象領域に存在する遺伝子の名称を示している。また、同図において、食中毒菌の増幅対象領域ごとに対応するＰＣＲ用プライマーセットの塩基配列を示している。これらの配列番号に示される塩基配列は、５’末端から３’末端方向の配列を示している。 In FIG. 17, the sequence number indicates the sequence number of the base sequence shown in the sequence table. F / R indicates a distinction between a forward primer and a reverse primer, where F indicates a forward primer and R indicates a reverse primer. The food poisoning bacterium represents the name of the food poisoning bacterium to be amplified by the primer set of the present embodiment. The target region indicates the name of a gene present in the target region amplified by the primer set of this embodiment in the food poisoning bacterium. In addition, the base sequence of the primer set for PCR corresponding to each amplification target region of food poisoning bacteria is shown in FIG. The base sequences shown in these SEQ ID NOs indicate sequences from the 5 'end to the 3' end.
次に、設計したプライマーセットを、ライフテクノロジージャパン株式会社によって人工合成を行うことで作製した。さらに、このプライマーセットを含有するＰＣＲ用反応液を作製した。具体的には、以下の組成のものを作製した。
・緩衝液（10× Ex Taq buffer (20mM Mg2＋ plus)，2.0μl）
・核酸合成基質（dNTP Mixture (dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2.5mM)，1.6μl）
・フォワードプライマー（10ng/μl，0.4μl）
・リバースプライマー（10ng/μl，0.4μl）
・核酸合成酵素（EX Taq(5U/μl)，0.1μl）
・試料のＤＮＡ（1.0μl）
・滅菌水（14.5μl）
（全量 20μl）
ここで、試料のＤＮＡは、増幅対象生物と６種類の非増幅対象生物のＤＮＡを個別に含めて、それぞれ別個にＰＣＲを行った。
Next, the designed primer set was produced by performing artificial synthesis by Life Technology Japan. Further, a PCR reaction solution containing this primer set was prepared. Specifically, the following composition was produced.
・ Buffer (10 × Ex Taq buffer (20 mM Mg2 + plus), 2.0 μl)
・ Nucleic acid synthesis substrate (dNTP Mixture (dATP, dCTP, dGTP, dTTP 2.5 mM each), 1.6 μl)
-Forward primer (10ng / μl, 0.4μl)
・ Reverse primer (10ng / μl, 0.4μl)
・ Nucleic acid synthase (EX Taq (5U / μl), 0.1μl)
・ Sample DNA (1.0μl)
・ Sterile water (14.5μl)
(Total 20 μl)
Here, the DNA of the sample was subjected to PCR separately, including the DNA of the amplification target organism and six types of non-amplification target organisms individually.
次に、ｅｐグラジエントs（エッペンドルフ社製）を用いて、以下の反応条件でＰＣＲ法による遺伝子の増幅を行った。
（１）９５℃ ２分
（２）９５℃ １０秒（ＤＮＡ鎖の乖離工程）
（３）６８℃ ３０秒（アニーリング工程）
（４）７２℃ ３０秒（ＤＮＡ合成工程）
（５）７２℃ ２分
（２）〜（４）を４０サイクル
Next, the gene was amplified by the PCR method under the following reaction conditions using an ep gradient s (Eppendorf).
(1) 95 ° C for 2 minutes (2) 95 ° C for 10 seconds (DNA strand dissociation step)
(3) 68 ° C. 30 seconds (annealing process)
(4) 72 ° C. for 30 seconds (DNA synthesis step)
(5) 72 ° C. 2 minutes (2) to (4) 40 cycles
最後に、ＰＣＲ法による産物を、ＭｕｌｔｉＮＡ（登録商標、株式会社島津製作所製）を用いて、マイクロキャピラリー電気泳動により、それぞれの生物ごとに泳動させ、正しい増幅産物が得られているか否かを確認した。その結果を図１８（ａ）に示す。
同図において、７の増幅対象生物（ビブリオ）から選択された、１〜６の非対象生物のＤＮＡと１２塩基以上連続で重ならないプライマーを含む本発明のプライマーセットによれば、ビブリオの増幅対象領域ｔｄｈ（３８０ｂｐ）のみが特異的に増幅され、非増幅対象領域については、増幅が行われていないことがわかる。なお、同図の縦軸にはｂｐの対数目盛りが示されているが、比較的大きな誤差があり、バンドの大凡の位置を確認することはできるが、厳密な値を示すものではない。また、電気泳動の結果を示す図において、プライマーやそのダイマーによるバンドが現れている場合があるが、これらは増幅によるものではない。以下においても同様である。
Finally, PCR products are migrated for each organism by microcapillary electrophoresis using MultiNA (registered trademark, manufactured by Shimadzu Corporation) to confirm whether the correct amplification products are obtained. did. The result is shown in FIG.
In the same figure, according to the primer set of the present invention comprising a primer that is selected from 7 amplification target organisms (Vibrio) and does not overlap with DNA of 1 to 6 non-target organisms continuously for 12 bases or more, the amplification target of Vibrio Only the region tdh (380 bp) is specifically amplified, and it can be seen that the non-amplification target region is not amplified. Although the logarithmic scale of bp is shown on the vertical axis of the figure, there is a relatively large error, and the approximate position of the band can be confirmed, but the exact value is not shown. Moreover, in the figure which shows the result of electrophoresis, although the band by a primer or its dimer may appear, these are not by amplification. The same applies to the following.
（実施例２）
増幅対象生物として食中毒菌である以下の大腸菌（NBRC102203）を選択するとともに、非増幅対象生物として以下の６種類の食中毒菌を選択した。
１．Negative Cont.
２．非増幅対象生物 セレウス（Bacillus cereus TIFT 114011）
３．非増幅対象生物 カンピロバクター（Campylobacter jejuni ATCC 33560）
４．増幅対象生物 大腸菌（Escherichia coli NBRC 102203）
５．非増幅対象生物 リステリア（Listeria monocytogenes ATCC 15313）
６．非増幅対象生物 サルモネラ（Salmonella enterica ATCC 9270）
７．非増幅対象生物 黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus NBRC 100910）
８．非増幅対象生物 ビブリオ（Vibrio parahaemolyticus RIMD 2210050）
(Example 2)
The following E. coli (NBRC102203), which is a food poisoning bacterium, was selected as an amplification target organism, and the following six types of food poisoning bacteria were selected as non-amplification target organisms.
1. Negative Cont.
2. Non-amplification target organism Cereus (Bacillus cereus TIFT 114011)
3. Non-amplification target organism Campylobacter jejuni ATCC 33560
4). Amplification target organism Escherichia coli NBRC 102203
5. Non-amplified organism Listeria (Listeria monocytogenes ATCC 15313)
6). Non-amplified organism Salmonella (Salmonella enterica ATCC 9270)
7). Non-amplification target organism Staphylococcus aureus NBRC 100910
8). Non-amplified organism Vibrio (Vibrio parahaemolyticus RIMD 2210050)
次いで、実施例１と同様に、これらの生物の塩基配列を比較して、大腸菌の塩基配列から条件Ａを満たし、増幅対象領域ｐｙｒＨ（ウリジンモノリン酸キナーゼ遺伝子，１５７ｂｐ）を増幅するプライマーセットを設計した。
具体的には、図１７の実施例２に示す大腸菌検出用の両方のプライマー（配列番号１１，１２）が、上記６種類の非増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列と１２塩基以上連続で重ならないものである。
Next, as in Example 1, the base sequences of these organisms are compared, and a primer set that satisfies the condition A from the base sequence of E. coli and amplifies the amplification target region pyrH (uridine monophosphate kinase gene, 157 bp) is designed. did.
Specifically, both primers for detection of E. coli (SEQ ID NOs: 11 and 12) shown in Example 2 of FIG. 17 do not overlap with the base sequences of the above-mentioned six types of non-amplification target organisms for 12 bases or more. Is.
次に、実施例１と同様に、本実施例において設計したプライマーセットを作製するとともに、このプライマーセットを含有するＰＣＲ用反応液を作製した。さらに、実施例１と同様にＰＣＲ法による遺伝子の増幅を行い、その増幅産物を、ＭｕｌｔｉＮＡにより、それぞれの生物ごとに泳動させ、正しい増幅産物が得られているか否かを確認した。その結果を図１８（ｂ）に示す。
同図において、４の増幅対象生物（大腸菌）から選択された、２，３，及び５〜８の非対象生物のＤＮＡと１２塩基以上連続で重ならないプライマーを含む本発明のプライマーセットによれば、大腸菌の増幅対象領域ｐｙｒＨ（１５７ｂｐ）のみが特異的に増幅され、非増幅対象領域については、増幅が行われていないことがわかる。
Next, in the same manner as in Example 1, a primer set designed in this example was prepared, and a PCR reaction solution containing this primer set was prepared. Furthermore, the gene was amplified by the PCR method in the same manner as in Example 1, and the amplified product was migrated for each organism with MultiNA to confirm whether or not the correct amplified product was obtained. The result is shown in FIG.
In the same figure, according to the primer set of the present invention, which includes primers selected from 4 amplification target organisms (E. coli), 2, 3, and 5-8 non-target organism DNAs and primers that do not overlap with 12 bases or more continuously. It can be seen that only the amplification target region pyrH (157 bp) of Escherichia coli is specifically amplified, and the non-amplification target region is not amplified.
（実施例３）
実施例２に示した７種類の菌株のうち、増幅対象生物として食中毒菌であるサルモネラ（ATCC9270）を選択するとともに、非増幅対象生物として残りの６種類の食中毒菌を選択し、以下のように８を対照とした。
１．非増幅対象生物 セレウス（Bacillus cereus TIFT 114011）
２．非増幅対象生物 カンピロバクター（Campylobacter jejuni ATCC 33560）
３．非増幅対象生物 大腸菌（Escherichia coli NBRC 102203）
４．非増幅対象生物 リステリア（Listeria monocytogenes ATCC 15313）
５．増幅対象生物 サルモネラ（Salmonella enterica ATCC 9270）
６．非増幅対象生物 黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus NBRC 100910）
７．非増幅対象生物 ビブリオ（Vibrio parahaemolyticus RIMD 2210050）
８．Negative Cont.
(Example 3)
Of the seven strains shown in Example 2, Salmonella (ATCC 9270), which is a food poisoning organism, is selected as an amplification target organism, and the remaining six types of food poisoning bacteria are selected as non-amplification target organisms, as follows: 8 served as a control.
1. Non-amplification target organism Cereus (Bacillus cereus TIFT 114011)
2. Non-amplification target organism Campylobacter jejuni ATCC 33560
3. Non-amplified organism Escherichia coli NBRC 102203
4). Non-amplified organism Listeria (Listeria monocytogenes ATCC 15313)
5. Amplification target Salmonella (Salmonella enterica ATCC 9270)
6). Non-amplification target organism Staphylococcus aureus NBRC 100910
7). Non-amplified organism Vibrio (Vibrio parahaemolyticus RIMD 2210050)
8). Negative Cont.
次いで、実施例１と同様に、これらの生物の塩基配列を比較して、サルモネラの塩基配列から条件Ａを満たし、増幅対象領域ｉｎｖＡ（侵入性因子関連遺伝子，１８０ｂｐ）を増幅するプライマーセットを設計した。
具体的には、図１７の実施例３に示すサルモネラ検出用の両方のプライマー（配列番号１３，１４）が、上記６種類の非増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列と１２塩基以上連続で重ならないものである。
Next, in the same manner as in Example 1, the base sequences of these organisms are compared, and a primer set that satisfies the condition A from the base sequence of Salmonella and amplifies the amplification target region invA (invasive factor-related gene, 180 bp) is designed. did.
Specifically, both primers (SEQ ID NOs: 13 and 14) for detecting Salmonella shown in Example 3 in FIG. 17 do not overlap with the base sequences of the above-mentioned six types of non-amplification target organisms for 12 bases or more. Is.
次に、実施例１と同様に、本実施例において設計したプライマーセットを作製するとともに、このプライマーセットを含有するＰＣＲ用反応液を作製した。さらに、実施例１と同様にＰＣＲ法による遺伝子の増幅を行い、その増幅産物をＭｕｌｔｉＮＡによりそれぞれの生物ごとに泳動させ、正しい増幅産物が得られているか否かを確認した。その結果を図１８（ｃ）に示す。
同図において、５の増幅対象生物（サルモネラ）から選択された、１〜４，及び６，７の非対象生物のＤＮＡと１２塩基以上連続で重ならないプライマーを含む本発明のプライマーセットによれば、サルモネラの増幅対象領域ｉｎｖＡ（１８０ｂｐ）のみが特異的に増幅され、非増幅対象領域については、増幅が行われていないことがわかる。
Next, in the same manner as in Example 1, a primer set designed in this example was prepared, and a PCR reaction solution containing this primer set was prepared. Furthermore, the gene was amplified by the PCR method in the same manner as in Example 1, and the amplified product was migrated for each organism with MultiNA to confirm whether or not the correct amplified product was obtained. The result is shown in FIG.
In the same figure, according to the primer set of the present invention comprising primers that are selected from 5 amplification target organisms (Salmonella) and that do not overlap with DNA of 1 to 4, and 6, 7 non-target organisms continuously for 12 bases or more. It can be seen that only the amplification target region invA (180 bp) of Salmonella is specifically amplified, and the non-amplification target region is not amplified.
（比較例１）
増幅対象生物として食中毒菌である以下の大腸菌（NBRC102203）を選択するとともに、非増幅対象生物として以下の６種類の食中毒菌を選択した。
１．非増幅対象生物 セレウス（Bacillus cereus TIFT 114011）
２．非増幅対象生物 カンピロバクター（Campylobacter jejuni ATCC 33560）
３．増幅対象生物 大腸菌（Escherichia coli NBRC 102203）
４．非増幅対象生物 リステリア（Listeria monocytogenes ATCC 15313）
５．非増幅対象生物 サルモネラ（Salmonella enterica ATCC 9270）
６．非増幅対象生物 黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus NBRC 100910）
７．非増幅対象生物 ビブリオ（Vibrio parahaemolyticus RIMD 2210050）
８．Negative Cont.
(Comparative Example 1)
The following E. coli (NBRC102203), which is a food poisoning bacterium, was selected as an amplification target organism, and the following six types of food poisoning bacteria were selected as non-amplification target organisms.
1. Non-amplification target organism Cereus (Bacillus cereus TIFT 114011)
2. Non-amplification target organism Campylobacter jejuni ATCC 33560
3. Amplification target organism Escherichia coli NBRC 102203
4). Non-amplified organism Listeria (Listeria monocytogenes ATCC 15313)
5. Non-amplified organism Salmonella (Salmonella enterica ATCC 9270)
6). Non-amplification target organism Staphylococcus aureus NBRC 100910
7). Non-amplified organism Vibrio (Vibrio parahaemolyticus RIMD 2210050)
8). Negative Cont.
次いで、これらの生物の塩基配列を比較して、大腸菌の塩基配列から条件Ａを満さない、増幅対象領域ｄｎａＪ（ヒートショック遺伝子）を増幅するプライマーセットを設計した。
具体的には、図１７の比較例１に示す大腸菌検出用のフォワードプライマー（配列番号１５）及びリバースプライマー（配列番号１６）の両方が、上記６種類の非増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列と１２塩基以上連続で重なっている。
Next, the base sequences of these organisms were compared, and a primer set for amplifying the amplification target region dnaJ (heat shock gene) that did not satisfy the condition A from the base sequence of E. coli was designed.
Specifically, both the forward primer (SEQ ID NO: 15) and reverse primer (SEQ ID NO: 16) for detection of E. coli shown in Comparative Example 1 in FIG. Overlapping with 12 bases or more.
次に、実施例１と同様に、本比較例において設計したプライマーセットを作製するとともに、このプライマーセットを含有するＰＣＲ用反応液を作製した。さらに、実施例１と同様にＰＣＲ法による遺伝子の増幅を行い、その増幅産物をＭｕｌｔｉＮＡによりそれぞれの生物ごとに泳動させ、正しい増幅産物が得られているか否かを確認した。その結果を図１９（ａ）に示す。
同図において、３の増幅対象生物（大腸菌）から選択された、条件Ａを満たさないプライマーセットによれば、１，５，６の非増幅対象生物についても、増幅が行われていることがわかる。
Next, as in Example 1, a primer set designed in this comparative example was prepared, and a PCR reaction solution containing this primer set was prepared. Furthermore, the gene was amplified by the PCR method in the same manner as in Example 1, and the amplified product was migrated for each organism with MultiNA to confirm whether or not the correct amplified product was obtained. The result is shown in FIG.
In the same figure, according to the primer set selected from 3 amplification target organisms (E. coli) that does not satisfy the condition A, it can be seen that amplification is also performed for 1, 5 and 6 non-amplification target organisms. .
（比較例２）
比較例１に示した７種類の菌株のうち、増幅対象生物として食中毒菌であるサルモネラ（ATCC9270）を選択するとともに、非増幅対象生物として残りの６種類の食中毒菌を選択した。
(Comparative Example 2)
Among the seven strains shown in Comparative Example 1, Salmonella (ATCC 9270), which is a food poisoning organism, was selected as an amplification target organism, and the remaining six types of food poisoning bacteria were selected as non-amplification target organisms.
次いで、これらの生物の塩基配列を比較して、サルモネラの塩基配列から条件Ａを満さない、増幅対象領域ｉｎｖＡ（侵入性因子関連遺伝子，１８０ｂｐ）を増幅するプライマーセットを設計した。
具体的には、図１７の比較例２に示すサルモネラ検出用のフォワードプライマー（配列番号１７）及びリバースプライマー（配列番号１８）の両方が、上記１〜４，６，７の非増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列と１２塩基以上連続で重なっている。
Next, the base sequences of these organisms were compared, and a primer set for amplifying the amplification target region invA (invasion factor-related gene, 180 bp) that did not satisfy the condition A from the base sequence of Salmonella was designed.
Specifically, both the forward primer (SEQ ID NO: 17) and reverse primer (SEQ ID NO: 18) for detecting Salmonella shown in Comparative Example 2 in FIG. It overlaps with the base sequence of DNA continuously for 12 bases or more.
次に、実施例１と同様に、本比較例において設計したプライマーセットを作製するとともに、このプライマーセットを含有するＰＣＲ用反応液を作製した。さらに、実施例１と同様にＰＣＲ法による遺伝子の増幅を行い、その増幅産物を、電気泳動により、それぞれの生物ごとに泳動させ、正しい増幅産物が得られているか否かを確認した。その結果を図１９（ｂ）に示す。
同図において、５の増幅対象生物（サルモネラ）から選択された、条件Ａを満たさないプライマーセットによれば、上記１及び３の非増幅対象生物についても、増幅を行っていることがわかる。
以上の通り、プライマーセットが（条件Ａ）を満足する場合、ＰＣＲ法によって増幅が特異的に行われることが確認された。
Next, as in Example 1, a primer set designed in this comparative example was prepared, and a PCR reaction solution containing this primer set was prepared. Further, the gene was amplified by the PCR method in the same manner as in Example 1, and the amplified product was electrophoresed for each organism to confirm whether or not the correct amplified product was obtained. The result is shown in FIG.
In the figure, according to the primer set that does not satisfy the condition A, selected from the five amplification target organisms (Salmonella), it can be seen that the above-described 1 and 3 non-amplification target organisms are also amplified.
As described above, when the primer set satisfies (Condition A), it was confirmed that amplification was performed specifically by the PCR method.
＜実験２：フォワードプライマーとリバースプライマーの融解温度の差に関して＞
本発明のプライマーの作製方法及びプライマーの設計方法にもとづいて、各種食中毒菌について、「フォワードプライマー及びリバースプライマーの融解温度（Ｔｍ値）の差が５℃未満（条件Ｅ）」を満たすプライマーセットを作製し、これを用いてＰＣＲ法を行うことにより、増幅対象領域が特異的に増幅されるか否かを確認した（実施例４〜１１）。
また、フォワードプライマー及びリバースプライマーの融解温度の差が５℃以上かつ１０℃未満になるプライマーセットと、１０℃以上になるプライマーセットを作製し、これを用いてＰＣＲ法を行うことにより、増幅対象領域が特異的に増幅されるか否かを確認した（比較例３〜１８）。
<Experiment 2: Regarding the difference in melting temperature between the forward primer and the reverse primer>
Based on the primer preparation method and primer design method of the present invention, a primer set satisfying “difference in melting temperature (Tm value) of forward primer and reverse primer is less than 5 ° C. (condition E)” for various food poisoning bacteria. It was produced and it was confirmed whether or not the region to be amplified was specifically amplified by performing PCR using this (Examples 4 to 11).
In addition, a primer set in which the difference in melting temperature between the forward primer and the reverse primer is 5 ° C. or more and less than 10 ° C. and a primer set that is 10 ° C. or more are prepared, and PCR is used to perform amplification. It was confirmed whether or not the region was specifically amplified (Comparative Examples 3 to 18).
（１）セレウス（対象領域：ｃｅｓＢ）検出用プライマー
（実施例４）
増幅対象生物として食中毒菌である以下のセレウス（TIFT114011）を選択するとともに、非増幅対象生物として以下に示す６種類の食中毒菌を選択した。
１．増幅対象生物 セレウス（Bacillus cereus TIFT 114011）
２．非増幅対象生物 カンピロバクター（Campylobacter jejuni ATCC 33560）
３．非増幅対象生物 大腸菌（Escherichia coli NBRC 102203）
４．非増幅対象生物 リステリア（Listeria monocytogenes ATCC 15313）
５．非増幅対象生物 サルモネラ（Salmonella enterica ATCC 9270）
６．非増幅対象生物 黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus NBRC 100910）
７．非増幅対象生物 ビブリオ（Vibrio parahaemolyticus RIMD 2210050）
８．Negative Cont.
(1) Primer for detecting cereus (target region: cesB) (Example 4)
The following cereus (TIFT114011), which is a food poisoning bacteria, was selected as an amplification target organism, and the following six types of food poisoning bacteria were selected as non-amplification target organisms.
1. Target organism for amplification Cereus (Bacillus cereus TIFT 114011)
2. Non-amplification target organism Campylobacter jejuni ATCC 33560
3. Non-amplified organism Escherichia coli NBRC 102203
4). Non-amplified organism Listeria (Listeria monocytogenes ATCC 15313)
5. Non-amplified organism Salmonella (Salmonella enterica ATCC 9270)
6). Non-amplification target organism Staphylococcus aureus NBRC 100910
7). Non-amplified organism Vibrio (Vibrio parahaemolyticus RIMD 2210050)
8). Negative Cont.
次いで、セレウスの塩基配列から上記条件Ｅを満たす、増幅対象領域ｃｅｓＢ（セレウリド合成酵素遺伝子，２３８ｂｐ）を増幅するプライマーセットを設計した。
具体的には、図２０の実施例４に示すセレウス検出用のフォワードプライマー（配列番号１９）及びリバースプライマー（配列番号２０）を設計した。これらの融解温度の差は、３．３３℃となっている。
Next, a primer set was designed to amplify the amplification target region cesB (cereulide synthase gene, 238 bp) satisfying the above condition E from the base sequence of Cereus.
Specifically, the forward primer (SEQ ID NO: 19) and reverse primer (SEQ ID NO: 20) for detecting Cereus shown in Example 4 of FIG. 20 were designed. The difference between these melting temperatures is 3.33 ° C.
次に、実施例１と同様に、本実施例において設計したプライマーセットを作製するとともに、このプライマーセットを含有するＰＣＲ用反応液を作製した。
そして、以下の反応条件でＰＣＲ法による遺伝子の増幅を行った。
（１）９５℃ ２分
（２）９５℃ １０秒（ＤＮＡ鎖の乖離工程）
（３）６８℃ ３０秒（アニーリング工程）
（４）７２℃ ３０秒（ＤＮＡ合成工程）
（５）７２℃ ２分
（２）〜（４）を４０サイクル
なお、上記アニーリング温度は、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度から５℃低い温度に設定した。これは、実験２における以下の実施例及び比較例についても同様である。
Next, in the same manner as in Example 1, a primer set designed in this example was prepared, and a PCR reaction solution containing this primer set was prepared.
The gene was amplified by the PCR method under the following reaction conditions.
(1) 95 ° C for 2 minutes (2) 95 ° C for 10 seconds (DNA strand dissociation step)
(3) 68 ° C. 30 seconds (annealing process)
(4) 72 ° C. for 30 seconds (DNA synthesis step)
(5) 72 ° C. 2 minutes (2) to (4) 40 cycles Note that the annealing temperature was set to 5 ° C. lower than the lower melting temperature of the forward primer or reverse primer. The same applies to the following Examples and Comparative Examples in Experiment 2.
そして、ＰＣＲ法による産物を、電気泳動により、それぞれの生物ごとに泳動させ、正しい増幅産物が得られているか否かを確認した。その結果を図２４に示す。
同図において、本実施例の条件Ｅを満たす、フォワードプライマー及びリバースプライマーの融解温度の差が５℃未満のプライマーセットによれば、セレウスの増幅対象領域ｃｅｓＢ（２３８ｂｐ）のみが特異的に増幅され、非増幅対象領域については、増幅が行われていないことがわかる。
And the product by PCR method was electrophoresed for every organism by electrophoresis, and it was confirmed whether the correct amplification product was obtained. The result is shown in FIG.
In the same figure, according to the primer set that satisfies the condition E of this example and the difference in melting temperature between the forward primer and the reverse primer is less than 5 ° C., only the amplification target region cesB (238 bp) of cereus is specifically amplified. It can be seen that the non-amplification target region is not amplified.
（比較例３）
実施例４と同様に、増幅対象生物として食中毒菌であるセレウスを選択するとともに、非増幅対象生物として６種類の食中毒菌を選択した。
次いで、セレウスの塩基配列から条件Ｅを満たさない、フォワードプライマー及びリバースプライマーの融解温度の差が５℃以上１０℃未満である、増幅対象領域ｃｅｓＢ（セレウリド合成酵素遺伝子，２３８ｂｐ）を増幅するプライマーセットを設計した。
具体的には、図２０の比較例３に示すセレウス検出用のフォワードプライマー（配列番号１９）及びリバースプライマー（配列番号２１）を設計した。これらの融解温度の差は、６．１２℃となっている。
(Comparative Example 3)
In the same manner as in Example 4, Celeus, which is a food poisoning bacteria, was selected as an amplification target organism, and six types of food poisoning bacteria were selected as non-amplification target organisms.
Next, a primer set that amplifies the amplification target region cesB (cereulide synthase gene, 238 bp), which does not satisfy the condition E from the base sequence of Cereus, and the difference in melting temperature between the forward primer and the reverse primer is 5 ° C. or more and less than 10 ° C. Designed.
Specifically, a forward primer (SEQ ID NO: 19) and a reverse primer (SEQ ID NO: 21) for detecting Cereus shown in Comparative Example 3 in FIG. 20 were designed. The difference between these melting temperatures is 6.12 ° C.
次に、実施例４と同様に、本比較例において設計したプライマーセットを作製するとともに、このプライマーセットを含有するＰＣＲ用反応液を作製した。
そして、以下の反応条件でＰＣＲ法による遺伝子の増幅を行った。
（１）９５℃ ２分
（２）９５℃ １０秒（ＤＮＡ鎖の乖離工程）
（３）６５℃ ３０秒（アニーリング工程）
（４）７２℃ ３０秒（ＤＮＡ合成工程）
（５）７２℃ ２分
（２）〜（４）を４０サイクル
Next, as in Example 4, a primer set designed in this comparative example was prepared, and a PCR reaction solution containing this primer set was prepared.
The gene was amplified by the PCR method under the following reaction conditions.
(1) 95 ° C for 2 minutes (2) 95 ° C for 10 seconds (DNA strand dissociation step)
(3) 65 ° C. for 30 seconds (annealing process)
(4) 72 ° C. for 30 seconds (DNA synthesis step)
(5) 72 ° C. 2 minutes (2) to (4) 40 cycles
そして、ＰＣＲ法による産物を、電気泳動により、それぞれの生物ごとに泳動させ、正しい増幅産物が得られているか否かを確認した。その結果を図２４に示す。
同図において、本比較例の条件Ｅを満たさないプライマーセットによれば、セレウスの非増幅対象領域、及び非増幅対象生物の黄色ブドウ球菌における非増幅対象領域が増幅されており、非特異的増幅が行われていることがわかる。
And the product by PCR method was electrophoresed for every organism by electrophoresis, and it was confirmed whether the correct amplification product was obtained. The result is shown in FIG.
In the same figure, according to the primer set not satisfying the condition E of this comparative example, the non-amplification target region of Cereus and the non-amplification target region in Staphylococcus aureus of the non-amplification target organism are amplified and non-specific amplification Can be seen.
（比較例４）
フォワードプライマー及びリバースプライマーの融解温度の差が１０℃以上であるプライマーセットを設計した点、及びＰＣＲにおけるアニーリング温度を６０℃とした点以外は、比較例３と同様にして、実験を行った。図２０に示すように、比較例４のセレウス検出用のフォワードプライマー（配列番号１９）及びリバースプライマー（配列番号２２）の融解温度の差は、１１．２９℃である。その結果を図２４に示す。
同図において、本比較例のプライマーセットによっては、非増幅対象領域は増幅されておらず、非特異的増幅は行われていない。
(Comparative Example 4)
Experiments were performed in the same manner as in Comparative Example 3 except that a primer set in which the difference in melting temperature between the forward primer and the reverse primer was 10 ° C. or higher was designed, and that the annealing temperature in PCR was 60 ° C. As shown in FIG. 20, the difference in melting temperature between the forward primer (SEQ ID NO: 19) and the reverse primer (SEQ ID NO: 22) for detecting Cereus in Comparative Example 4 is 11.29 ° C. The result is shown in FIG.
In the figure, depending on the primer set of this comparative example, the non-amplification target region is not amplified and non-specific amplification is not performed.
（２）セレウス（対象領域：ｎｈｅ）検出用プライマー
（実施例５）
セレウスの塩基配列から条件Ｅを満たす、増幅対象領域ｎｈｅ（溶血活性を示さないエンテロトキシン分泌遺伝子，１９５ｂｐ）を増幅するプライマーセットを設計した点、及びＰＣＲにおけるアニーリング温度を６８℃とした点以外は、実施例４と同様にして実験を行った。図２０に示すように、実施例５のセレウス検出用のフォワードプライマー（配列番号２３）及びリバースプライマー（配列番号２４）の融解温度の差は、０．３１℃となっている。その結果を図２４に示す。
同図において、本実施例の条件Ｅを満たす、フォワードプライマー及びリバースプライマーの融解温度の差が５℃未満のプライマーセットによれば、セレウスの増幅対象領域ｎｈｅ（１９５ｂｐ）のみが特異的に増幅され、非増幅対象領域については、増幅が行われていないことがわかる。
(2) Cereus (target region: nhe) detection primer (Example 5)
Except that the primer set for amplifying the amplification target region nhe (enterotoxin secretion gene not showing hemolytic activity, 195 bp) satisfying the condition E from the base sequence of Cereus, and the annealing temperature in PCR was set to 68 ° C., The experiment was performed in the same manner as in Example 4. As shown in FIG. 20, the difference in melting temperature between the forward primer (SEQ ID NO: 23) and reverse primer (SEQ ID NO: 24) for detecting Cereus in Example 5 is 0.31 ° C. The result is shown in FIG.
In the same figure, according to the primer set satisfying the condition E of this example and the difference in melting temperature between the forward primer and the reverse primer is less than 5 ° C., only the amplification target region nhe (195 bp) of cereus is specifically amplified. It can be seen that the non-amplification target region is not amplified.
（比較例５）
セレウスの塩基配列から条件Ｅを満たさない、フォワードプライマー及びリバースプライマーの融解温度の差が５℃以上１０℃未満である、増幅対象領域ｎｈｅを増幅するプライマーセットを設計した点、及びＰＣＲにおけるアニーリング温度を６２℃とした点以外は、比較例３と同様にして実験を行った。図２０に示すように、比較例５のセレウス検出用のフォワードプライマー（配列番号２５）及びリバースプライマー（配列番号２４）の融解温度の差は、７．４７℃となっている。その結果を図２４に示す。
同図において、本比較例の条件Ｅを満たさないプライマーセットによれば、セレウスの非増幅対象領域が増幅されており、非特異的増幅が行われていることがわかる。
(Comparative Example 5)
Design of a primer set that amplifies the amplification target region nhe that does not satisfy the condition E from the base sequence of Cereus, the difference in melting temperature between the forward primer and the reverse primer is 5 ° C. or more and less than 10 ° C., and annealing temperature in PCR The experiment was performed in the same manner as in Comparative Example 3 except that the temperature was set to 62 ° C. As shown in FIG. 20, the difference in melting temperature between the forward primer (SEQ ID NO: 25) and the reverse primer (SEQ ID NO: 24) for detecting Cereus in Comparative Example 5 is 7.47 ° C. The result is shown in FIG.
In the figure, according to the primer set that does not satisfy the condition E of this comparative example, it can be seen that the non-amplification target region of Cereus is amplified and non-specific amplification is performed.
（比較例６）
フォワードプライマー及びリバースプライマーの融解温度の差が１０℃以上であるプライマーセットを設計した点、及びＰＣＲにおけるアニーリング温度を５８℃とした点以外は、比較例５と同様にして、実験を行った。図２０に示すように、比較例６のセレウス検出用のフォワードプライマー（配列番号２６）及びリバースプライマー（配列番号２４）の融解温度の差は、１１．０２℃となっている。その結果を図２４に示す。
同図において、本比較例の条件Ｅを満たさないプライマーセットによれば、非増幅対象生物のカンピロバクター及び大腸菌における非増幅対象領域が増幅されており、非特異的増幅が行われていることがわかる。
(Comparative Example 6)
Experiments were performed in the same manner as in Comparative Example 5 except that a primer set in which the difference between the melting temperatures of the forward primer and the reverse primer was 10 ° C. or more was designed and the annealing temperature in PCR was 58 ° C. As shown in FIG. 20, the difference in melting temperature between the forward primer (SEQ ID NO: 26) and the reverse primer (SEQ ID NO: 24) for detecting Cereus in Comparative Example 6 is 11.02 ° C. The result is shown in FIG.
In the figure, according to the primer set not satisfying the condition E of this comparative example, it can be seen that the non-amplification target region in Campylobacter and E. coli of the non-amplification target organism is amplified and non-specific amplification is performed. .
（３）カンピロバクター検出用プライマー
（実施例６）
増幅対象生物として実施例４に示したカンピロバクターを選択し、その塩基配列から条件Ｅを満たす、増幅対象領域１６Ｓ ｒＤＮＡ（リボソーム遺伝子，２６３ｂｐ）を増幅するプライマーセットを設計した点、及びＰＣＲにおけるアニーリング温度を６８℃とした点以外は、実施例４と同様にして実験を行った。図２１に示すように、実施例６のカンピロバクター検出用のフォワードプライマー（配列番号２７）及びリバースプライマー（配列番号２８）の融解温度の差は、１．９８℃となっている。その結果を図２５に示す。
同図において、本実施例の条件Ｅを満たす、フォワードプライマー及びリバースプライマーの融解温度の差が５℃未満のプライマーセットによれば、カンピロバクターの増幅対象領域１６Ｓ ｒＤＮＡ（２６３ｂｐ）のみが特異的に増幅され、非増幅対象領域については、増幅が行われていないことがわかる。
(3) Campylobacter detection primer (Example 6)
Campylobacter shown in Example 4 was selected as an amplification target organism, a primer set for amplifying the amplification target region 16S rDNA (ribosome gene, 263 bp) satisfying the condition E from its base sequence, and the annealing temperature in PCR The experiment was conducted in the same manner as in Example 4 except that the temperature was 68 ° C. As shown in FIG. 21, the difference in melting temperature between the forward primer (SEQ ID NO: 27) and the reverse primer (SEQ ID NO: 28) for detecting Campylobacter in Example 6 is 1.98 ° C. The result is shown in FIG.
In the figure, according to the primer set that satisfies the condition E of this example and the difference in melting temperature between the forward primer and the reverse primer is less than 5 ° C., only the amplification target region 16S rDNA (263 bp) of Campylobacter is specifically amplified. Thus, it can be seen that the non-amplification target region is not amplified.
（比較例７）
カンピロバクターの塩基配列から条件Ｅを満たさない、フォワードプライマー及びリバースプライマーの融解温度の差が５℃以上１０℃未満である、増幅対象領域１６Ｓ ｒＤＮＡを増幅するプライマーセットを設計した点、及びＰＣＲにおけるアニーリング温度を６３℃とした点以外は、比較例３と同様にして実験を行った。図２１に示すように、比較例７のカンピロバクター検出用のフォワードプライマー（配列番号２９）及びリバースプライマー（配列番号２８）の融解温度の差は、５．６℃となっている。その結果を図２５に示す。
同図において、本比較例の条件Ｅを満たさないプライマーセットによれば、カンピロバクターの非増幅対象領域が増幅されており、非特異的増幅が行われていることがわかる。
(Comparative Example 7)
Design of a primer set that amplifies target region 16S rDNA that does not satisfy condition E from the base sequence of Campylobacter and the difference in melting temperature between the forward primer and the reverse primer is 5 ° C. or more and less than 10 ° C., and annealing in PCR The experiment was performed in the same manner as in Comparative Example 3 except that the temperature was 63 ° C. As shown in FIG. 21, the difference in melting temperature between the forward primer (SEQ ID NO: 29) and the reverse primer (SEQ ID NO: 28) for detecting Campylobacter in Comparative Example 7 is 5.6 ° C. The result is shown in FIG.
In the figure, according to the primer set that does not satisfy the condition E of this comparative example, it can be seen that the non-amplification target region of Campylobacter is amplified and non-specific amplification is performed.
（比較例８）
フォワードプライマー及びリバースプライマーの融解温度の差が１０℃以上であるプライマーセットを設計した点、及びＰＣＲにおけるアニーリング温度を５８℃とした点以外は、比較例７と同様にして実験を行った。図２１に示すように、比較例８のカンピロバクター検出用のフォワードプライマー（配列番号３０）及びリバースプライマー（配列番号２８）の融解温度の差は、１０．８２℃となっている。その結果を図２５に示す。
同図において、本比較例の条件Ｅを満たさないプライマーセットによれば、カンピロバクターの非増幅対象領域が増幅されており、非特異的増幅が行われていることがわかる。
(Comparative Example 8)
Experiments were performed in the same manner as in Comparative Example 7 except that a primer set in which the difference between the melting temperatures of the forward primer and the reverse primer was 10 ° C. or more was designed and the annealing temperature in PCR was 58 ° C. As shown in FIG. 21, the difference in melting temperature between the forward primer (SEQ ID NO: 30) and the reverse primer (SEQ ID NO: 28) for detecting Campylobacter in Comparative Example 8 is 10.82 ° C. The result is shown in FIG.
In the figure, according to the primer set that does not satisfy the condition E of this comparative example, it can be seen that the non-amplification target region of Campylobacter is amplified and non-specific amplification is performed.
（４）大腸菌検出用プライマー
（実施例７）
増幅対象生物として実施例４に示した大腸菌を選択し、その塩基配列から条件Ｅを満たす、増幅対象領域ｐｙｒＨ（ウリジンモノリン酸キナーゼ遺伝子，１５７ｂｐ）を増幅するプライマーセットを設計した点、及びＰＣＲにおけるアニーリング温度を７２℃とした点以外は、実施例４と同様にして実験を行った。図２１に示すように、実施例７の大腸菌検出用のフォワードプライマー（配列番号３１）及びリバースプライマー（配列番号３２）の融解温度の差は、３．４３℃となっている。その結果を図２５に示す。
同図において、本実施例の条件Ｅを満たす、フォワードプライマー及びリバースプライマーの融解温度の差が５℃未満のプライマーセットによれば、大腸菌の増幅対象領域ｐｙｒＨ（１５７ｂｐ）のみが特異的に増幅され、非増幅対象領域については、増幅が行われていないことがわかる。
(4) Escherichia coli detection primer (Example 7)
In the PCR, the Escherichia coli shown in Example 4 was selected as an amplification target organism, and a primer set for amplifying the amplification target region pyrH (uridine monophosphate kinase gene, 157 bp) satisfying the condition E from the base sequence was designed. The experiment was performed in the same manner as in Example 4 except that the annealing temperature was 72 ° C. As shown in FIG. 21, the difference in melting temperature between the forward primer for detecting E. coli (SEQ ID NO: 31) and the reverse primer (SEQ ID NO: 32) in Example 7 is 3.43 ° C. The result is shown in FIG.
In the figure, according to the primer set that satisfies the condition E of this example and the difference in melting temperature between the forward primer and the reverse primer is less than 5 ° C., only the amplification target region pyrH (157 bp) of E. coli is specifically amplified. It can be seen that the non-amplification target region is not amplified.
（比較例９）
大腸菌の塩基配列から条件Ｅを満たさない、フォワードプライマー及びリバースプライマーの融解温度の差が５℃以上１０℃未満である、増幅対象領域ｐｙｒＨを増幅するプライマーセットを設計した点、及びＰＣＲにおけるアニーリング温度を６７℃とした点以外は、比較例３と同様にして実験を行った。図２１に示すように、比較例９の大腸菌検出用のフォワードプライマー（配列番号３３）及びリバースプライマー（配列番号３２）の融解温度の差は、７．８９℃となっている。その結果を図２５に示す。
同図において、本比較例の条件Ｅを満たさないプライマーセットによれば、非増幅対象生物のセレウス、カンピロバクター、リステリア、サルモネラ、及び黄色ブドウ球菌における非増幅対象領域が増幅されており、非特異的増幅が行われていることがわかる。
(Comparative Example 9)
Design of a primer set that amplifies the region to be amplified pyrH, which does not satisfy the condition E from the base sequence of E. coli, and the difference in melting temperature between the forward primer and the reverse primer is 5 ° C. or more and less than 10 ° C., and annealing temperature in PCR The experiment was performed in the same manner as in Comparative Example 3 except that was set at 67 ° C. As shown in FIG. 21, the difference in melting temperature between the forward primer for detection of E. coli (SEQ ID NO: 33) and the reverse primer (SEQ ID NO: 32) in Comparative Example 9 is 7.89 ° C. The result is shown in FIG.
In the same figure, according to the primer set that does not satisfy the condition E of this comparative example, the non-amplification target regions in the non-amplification target organisms Cereus, Campylobacter, Listeria, Salmonella, and Staphylococcus aureus are amplified and non-specific It can be seen that amplification is taking place.
（比較例１０）
フォワードプライマー及びリバースプライマーの融解温度の差が１０℃以上であるプライマーセットを設計した点、及びＰＣＲにおけるアニーリング温度を６４℃とした点以外は、比較例９と同様にして実験を行った。図２１に示すように、比較例１０の大腸菌検出用のフォワードプライマー（配列番号３４）及びリバースプライマー（配列番号３２）の融解温度の差は、１１．７９℃となっている。その結果を図２５に示す。
同図において、本比較例の条件Ｅを満たさないプライマーセットによれば、カンピロバクター、リステリア、サルモネラ、黄色ブドウ球菌、及びビブリオにおける非増幅対象領域が増幅されており、非特異的増幅が行われていることがわかる。
(Comparative Example 10)
The experiment was performed in the same manner as in Comparative Example 9 except that a primer set in which the difference in melting temperature between the forward primer and the reverse primer was 10 ° C. or more was designed and the annealing temperature in PCR was 64 ° C. As shown in FIG. 21, the difference in melting temperature between the forward primer (SEQ ID NO: 34) and the reverse primer (SEQ ID NO: 32) for detection of E. coli of Comparative Example 10 is 11.79 ° C. The result is shown in FIG.
In the same figure, according to the primer set not satisfying the condition E of this comparative example, the non-amplification target regions in Campylobacter, Listeria, Salmonella, Staphylococcus aureus, and Vibrio are amplified, and non-specific amplification is performed. I understand that.
（５）リステリア検出用プライマー
（実施例８）
増幅対象生物として実施例４に示したリステリアを選択し、その塩基配列から条件Ｅを満たす、増幅対象領域ｄｎａＪ （ヒートショックタンパク遺伝子，１７６ｂｐ）を増幅するプライマーセットを設計した点、及びＰＣＲにおけるアニーリング温度を７０℃とした点以外は、実施例４と同様にして実験を行った。図２２に示すように、実施例８のリステリア検出用のフォワードプライマー（配列番号３５）及びリバースプライマー（配列番号３６）の融解温度の差は、１．３３℃となっている。その結果を図２６に示す。
同図において、本実施例の条件Ｅを満たす、フォワードプライマー及びリバースプライマーの融解温度の差が５℃未満のプライマーセットによれば、リステリアの増幅対象領域ｄｎａＪ（１７６ｂｐ）のみが特異的に増幅され、非増幅対象領域については、増幅が行われていないことがわかる。
(5) Primer for Listeria detection (Example 8)
The Listeria shown in Example 4 was selected as an amplification target organism, and a primer set for amplifying the amplification target region dnaJ (heat shock protein gene, 176 bp) satisfying the condition E from its base sequence was designed, and annealing in PCR The experiment was performed in the same manner as in Example 4 except that the temperature was set to 70 ° C. As shown in FIG. 22, the difference in melting temperature between the forward primer (SEQ ID NO: 35) and the reverse primer (SEQ ID NO: 36) for detecting the listeria of Example 8 is 1.33 ° C. The result is shown in FIG.
In the same figure, according to the primer set that satisfies the condition E of this example and the difference in melting temperature between the forward primer and the reverse primer is less than 5 ° C., only the amplification target region dnaJ (176 bp) of Listeria is specifically amplified. It can be seen that the non-amplification target region is not amplified.
（比較例１１）
リステリアの塩基配列から条件Ｅを満たさない、フォワードプライマー及びリバースプライマーの融解温度の差が５℃以上１０℃未満である、増幅対象領域ｄｎａＪを増幅するプライマーセットを設計した点、及びＰＣＲにおけるアニーリング温度を６３℃とした点以外は、比較例３と同様にして実験を行った。図２２に示すように、比較例１１のリステリア検出用のフォワードプライマー（配列番号３５）及びリバースプライマー（配列番号３７）の融解温度の差は、６．９７℃となっている。その結果を図２６に示す。
同図において、本比較例の条件Ｅを満たさないプライマーセットによれば、非増幅対象生物のカンピロバクター、大腸菌、サルモネラ、及びビブリオにおける非増幅対象領域が増幅されており、非特異的増幅が行われていることがわかる。
(Comparative Example 11)
Design of a primer set that amplifies the amplification target region dnaJ that does not satisfy the condition E from the base sequence of Listeria, the difference in melting temperature between the forward primer and the reverse primer is 5 ° C. or more and less than 10 ° C., and annealing temperature in PCR The experiment was conducted in the same manner as in Comparative Example 3 except that the temperature was 63 ° C. As shown in FIG. 22, the difference in melting temperature between the forward primer (SEQ ID NO: 35) and the reverse primer (SEQ ID NO: 37) for detection of Listeria in Comparative Example 11 is 6.97 ° C. The result is shown in FIG.
In the same figure, according to the primer set not satisfying the condition E of this comparative example, the non-amplification target regions in Campylobacter, Escherichia coli, Salmonella, and Vibrio of the non-amplification target organisms are amplified, and non-specific amplification is performed. You can see that
（比較例１２）
フォワードプライマー及びリバースプライマーの融解温度の差が１０℃以上であるプライマーセットを設計した点、及びＰＣＲにおけるアニーリング温度を６０℃とした点以外は、比較例１１と同様にして実験を行った。図２２に示すように、比較例１２のリステリア検出用のフォワードプライマー（配列番号３５）及びリバースプライマー（配列番号３８）の融解温度の差は、１０．２７℃となっている。その結果を図２６に示す。
同図において、本比較例の条件Ｅを満たさないプライマーセットによれば、非増幅対象生物のサルモネラ、及びビブリオにおける非増幅対象領域が増幅されており、非特異的増幅が行われていることがわかる。
(Comparative Example 12)
Experiments were performed in the same manner as in Comparative Example 11 except that a primer set in which the difference between the melting temperatures of the forward primer and the reverse primer was 10 ° C. or more was designed and the annealing temperature in PCR was 60 ° C. As shown in FIG. 22, the difference in melting temperature between the forward primer (SEQ ID NO: 35) and the reverse primer (SEQ ID NO: 38) for detection of Listeria of Comparative Example 12 is 10.27 ° C. The result is shown in FIG.
In the same figure, according to the primer set not satisfying the condition E of this comparative example, the non-amplification target region in Salmonella and Vibrio of the non-amplification target organism is amplified and non-specific amplification is performed. Recognize.
（６）サルモネラ検出用プライマー
（実施例９）
増幅対象生物として実施例４に示したサルモネラを選択し、その塩基配列から条件Ｅを満たす、増幅対象領域ｉｎｖＡ（侵入性因子関連遺伝子，１８０ｂｐ）を増幅するプライマーセットを設計した点、及びＰＣＲにおけるアニーリング温度を６８℃とした点以外は、実施例４と同様にして実験を行った。図２２に示すように、実施例９のサルモネラ検出用のフォワードプライマー（配列番号３９）及びリバースプライマー（配列番号４０）の融解温度の差は、１．３３℃となっている。その結果を図２６に示す。
同図において、本実施例の条件Ｅを満たす、フォワードプライマー及びリバースプライマーの融解温度の差が５℃未満のプライマーセットによれば、サルモネラの増幅対象領域ｉｎｖＡ（１８０ｂｐ）のみが特異的に増幅され、非増幅対象領域については、増幅が行われていないことがわかる。
(6) Salmonella detection primer (Example 9)
In the PCR, Salmonella shown in Example 4 is selected as an amplification target organism, and a primer set that amplifies the amplification target region invA (invasion factor-related gene, 180 bp) that satisfies the condition E from its base sequence is designed. The experiment was performed in the same manner as in Example 4 except that the annealing temperature was 68 ° C. As shown in FIG. 22, the difference in melting temperature between the forward primer (SEQ ID NO: 39) and the reverse primer (SEQ ID NO: 40) for detecting Salmonella in Example 9 is 1.33 ° C. The result is shown in FIG.
In the figure, according to the primer set that satisfies the condition E of this example and the difference in melting temperature between the forward primer and the reverse primer is less than 5 ° C., only the Salmonella amplification target region invA (180 bp) is specifically amplified. It can be seen that the non-amplification target region is not amplified.
（比較例１３）
サルモネラの塩基配列から条件Ｅを満たさない、フォワードプライマー及びリバースプライマーの融解温度の差が５℃以上１０℃未満である、増幅対象領域ｉｎｖＡを増幅するプライマーセットを設計した点、及びＰＣＲにおけるアニーリング温度を６３℃とした点以外は、比較例３と同様にして実験を行った。図２２に示すように、比較例１３のサルモネラ検出用のフォワードプライマー（配列番号４１）及びリバースプライマー（配列番号４０）の融解温度の差は、５．６１℃となっている。その結果を図２６に示す。
同図において、本比較例の条件Ｅを満たさないプライマーセットによれば、サルモネラの非増幅対象領域、並びに非増幅対象生物のセレウス、大腸菌、黄色ブドウ球菌、及びビブリオにおける非増幅対象領域が増幅されており、非特異的増幅が行われていることがわかる。
(Comparative Example 13)
Design of a primer set that amplifies the target region invA that does not satisfy the condition E from the base sequence of Salmonella, the difference in melting temperature between the forward primer and the reverse primer is 5 ° C. or more and less than 10 ° C., and annealing temperature in PCR The experiment was conducted in the same manner as in Comparative Example 3 except that the temperature was 63 ° C. As shown in FIG. 22, the difference in melting temperature between the forward primer (SEQ ID NO: 41) and the reverse primer (SEQ ID NO: 40) for detecting Salmonella in Comparative Example 13 is 5.61 ° C. The result is shown in FIG.
In the same figure, according to the primer set not satisfying the condition E of this comparative example, the non-amplification target region of Salmonella and the non-amplification target regions of the non-amplification target organisms Cereus, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, and Vibrio are amplified. It can be seen that non-specific amplification is performed.
（比較例１４）
フォワードプライマー及びリバースプライマーの融解温度の差が１０℃以上であるプライマーセットを設計した点、及びＰＣＲにおけるアニーリング温度を
５８℃とした点以外は、比較例１３と同様にして実験を行った。図２２に示すように、比較例１４のサルモネラ検出用のフォワードプライマー（配列番号４２）及びリバースプライマー（配列番号４０）の融解温度の差は、１０．７１℃となっている。その結果を図２６に示す。
同図において、本比較例の条件Ｅを満たさないプライマーセットによれば、非増幅対象生物の大腸菌、及びリステリアにおける非増幅対象領域が増幅されており、非特異的増幅が行われていることがわかる。
(Comparative Example 14)
Experiments were performed in the same manner as Comparative Example 13 except that a primer set in which the difference in melting temperature between the forward primer and the reverse primer was 10 ° C. or more was designed and the annealing temperature in PCR was 58 ° C. As shown in FIG. 22, the difference in melting temperature between the forward primer for detecting Salmonella (SEQ ID NO: 42) and the reverse primer (SEQ ID NO: 40) in Comparative Example 14 is 10.71 ° C. The result is shown in FIG.
In the same figure, according to the primer set that does not satisfy the condition E of this comparative example, the non-amplification target region in the non-amplification target organism E. coli and Listeria is amplified and non-specific amplification is performed. Recognize.
（７）黄色ブドウ球菌検出用プライマー
（実施例１０）
増幅対象生物として実施例４に示した黄色ブドウ球菌を選択し、その塩基配列から条件Ｅを満たす、増幅対象領域ｄｎａＪ（ヒートショックタンパク遺伝子，２３６ｂｐ）を増幅するプライマーセットを設計した点、及びＰＣＲにおけるアニーリング温度を６８℃とした点以外は、実施例４と同様にして実験を行った。図２３に示すように、実施例１０の黄色ブドウ球菌検出用のフォワードプライマー（配列番号４３）及びリバースプライマー（配列番号４４）の融解温度の差は、４．１２℃となっている。その結果を図２７に示す。
同図において、本実施例の条件Ｅを満たす、フォワードプライマー及びリバースプライマーの融解温度の差が５℃未満のプライマーセットによれば、黄色ブドウ球菌の増幅対象領域ｄｎａＪ（２３６ｂｐ）のみが特異的に増幅され、非増幅対象領域については、増幅が行われていないことがわかる。
(7) S. aureus detection primer (Example 10)
PCR was performed by selecting the S. aureus shown in Example 4 as an amplification target organism, and designing a primer set that amplifies the amplification target region dnaJ (heat shock protein gene, 236 bp) that satisfies the condition E from its base sequence, and PCR The experiment was performed in the same manner as in Example 4 except that the annealing temperature was set to 68 ° C. As shown in FIG. 23, the difference in melting temperature between the forward primer (SEQ ID NO: 43) and the reverse primer (SEQ ID NO: 44) for detecting S. aureus of Example 10 is 4.12 ° C. The result is shown in FIG.
In the same figure, according to the primer set that satisfies the condition E of this example and the difference in melting temperature between the forward primer and the reverse primer is less than 5 ° C., only the amplification target region dnaJ (236 bp) of S. aureus is specifically It can be seen that the amplified and non-amplified region is not amplified.
（比較例１５）
黄色ブドウ球菌の塩基配列から条件Ｅを満たさない、フォワードプライマー及びリバースプライマーの融解温度の差が５℃以上１０℃未満である、増幅対象領域ｄｎａＪを増幅するプライマーセットを設計した点、及びＰＣＲにおけるアニーリング温度を６６℃とした点以外は、比較例３と同様にして実験を行った。図２３に示すように、比較例１５の黄色ブドウ球菌検出用のフォワードプライマー（配列番号４３）及びリバースプライマー（配列番号４５）の融解温度の差は、６．２℃となっている。その結果を図２７に示す。
同図において、本比較例のプライマーセットによっては、非増幅対象領域は増幅されておらず、非特異的増幅は行われていない。
(Comparative Example 15)
Design of a primer set that amplifies the amplification target region dnaJ that does not satisfy the condition E from the base sequence of S. aureus, the difference in melting temperature between the forward primer and the reverse primer is 5 ° C. or more and less than 10 ° C., and in PCR The experiment was performed in the same manner as in Comparative Example 3 except that the annealing temperature was 66 ° C. As shown in FIG. 23, the difference in melting temperature between the forward primer (SEQ ID NO: 43) and the reverse primer (SEQ ID NO: 45) for detection of S. aureus in Comparative Example 15 is 6.2 ° C. The result is shown in FIG.
In the figure, depending on the primer set of this comparative example, the non-amplification target region is not amplified and non-specific amplification is not performed.
（比較例１６）
フォワードプライマー及びリバースプライマーの融解温度の差が１０℃以上であるプライマーセットを設計した点、及びＰＣＲにおけるアニーリング温度を
６２℃とした点以外は、比較例１５と同様にして実験を行った。図２３に示すように、比較例１６の黄色ブドウ球菌検出用のフォワードプライマー（配列番号４３）及びリバースプライマー（配列番号４６）の融解温度の差は、１１．５５℃となっている。その結果を図２７に示す。
同図において、本比較例の条件Ｅを満たさないプライマーセットによれば、非増幅対象生物の大腸菌、サルモネラ、及びビブリオにおける非増幅対象領域が増幅されており、非特異的増幅が行われていることがわかる。
(Comparative Example 16)
Experiments were performed in the same manner as in Comparative Example 15 except that a primer set in which the difference between the melting temperatures of the forward primer and the reverse primer was 10 ° C. or more was designed and the annealing temperature in PCR was 62 ° C. As shown in FIG. 23, the difference in melting temperature between the forward primer (SEQ ID NO: 43) and the reverse primer (SEQ ID NO: 46) for detection of S. aureus in Comparative Example 16 is 11.55 ° C. The result is shown in FIG.
In the same figure, according to the primer set not satisfying the condition E of this comparative example, the non-amplification target regions in the non-amplification target organisms E. coli, Salmonella, and Vibrio are amplified and non-specific amplification is performed. I understand that.
（８）ビブリオ検出用プライマー
（実施例１１）
増幅対象生物として実施例４に示したビブリオを選択し、その塩基配列から条件Ｅを満たす、増幅対象領域ｔｄｈ（耐熱性溶血毒素遺伝子，３８０ｂｐ）を増幅するプライマーセットを設計した点、及びＰＣＲにおけるアニーリング温度を６８℃とした点以外は、実施例４と同様にして実験を行った。図２３に示すように、実施例１１のビブリオ検出用のフォワードプライマー（配列番号４７）及びリバースプライマー（配列番号４８）の融解温度の差は、３．７℃となっている。その結果を図２７に示す。
同図において、本実施例の条件Ｅを満たす、フォワードプライマー及びリバースプライマーの融解温度の差が５℃未満のプライマーセットによれば、ビブリオの増幅対象領域ｔｄｈ（３８０ｂｐ）のみが特異的に増幅され、非増幅対象領域については、増幅が行われていないことがわかる。
(8) Vibrio detection primer (Example 11)
In the PCR, the Vibrio shown in Example 4 was selected as an amplification target organism, and a primer set for amplifying the amplification target region tdh (heat-stable hemolytic toxin gene, 380 bp) satisfying the condition E from its base sequence was designed. The experiment was performed in the same manner as in Example 4 except that the annealing temperature was 68 ° C. As shown in FIG. 23, the difference in melting temperature between the forward primer (SEQ ID NO: 47) and the reverse primer (SEQ ID NO: 48) for vibrio detection in Example 11 is 3.7 ° C. The result is shown in FIG.
In the figure, according to the primer set that satisfies the condition E of this example and the difference in melting temperature between the forward primer and the reverse primer is less than 5 ° C., only the amplification target region tdh (380 bp) of Vibrio is specifically amplified. It can be seen that the non-amplification target region is not amplified.
（比較例１７）
ビブリオの塩基配列から条件Ｅを満たさない、フォワードプライマー及びリバースプライマーの融解温度の差が５℃以上１０℃未満である、増幅対象領域ｔｄｈを増幅するプライマーセットを設計した点、及びＰＣＲにおけるアニーリング温度を６０℃とした点以外は、比較例３と同様にして実験を行った。図２３に示すように、比較例１７のビブリオ検出用のフォワードプライマー（配列番号４７）及びリバースプライマー（配列番号４９）の融解温度の差は、８．４３℃となっている。その結果を図２７に示す。
同図において、本比較例の条件Ｅを満たさないプライマーセットによれば、非増幅対象生物のサルモネラにおける非増幅対象領域が増幅されており、非特異的増幅が行われていることがわかる。
(Comparative Example 17)
Design of a primer set that amplifies the region to be amplified tdh that does not satisfy condition E from the base sequence of Vibrio, the difference in melting temperature between the forward primer and the reverse primer is 5 ° C. or more and less than 10 ° C., and annealing temperature in PCR The experiment was performed in the same manner as in Comparative Example 3 except that was set to 60 ° C. As shown in FIG. 23, the difference in melting temperature between the forward primer (SEQ ID NO: 47) and the reverse primer (SEQ ID NO: 49) for detecting the vibrio of Comparative Example 17 is 8.43 ° C. The result is shown in FIG.
In the figure, according to the primer set not satisfying the condition E of this comparative example, it can be seen that the non-amplification target region in the Salmonella of the non-amplification target organism is amplified and non-specific amplification is performed.
（比較例１８）
フォワードプライマー及びリバースプライマーの融解温度の差が１０℃以上であるプライマーセットを設計した点、及びＰＣＲにおけるアニーリング温度を５５℃とした点以外は、比較例１７と同様にして実験を行った。図２３に示すように、比較例１８のビブリオ検出用のフォワードプライマー（配列番号４７）及びリバースプライマー（配列番号５０）の融解温度の差は、１３．９１℃となっている。その結果を図２７に示す。
同図において、本比較例の条件Ｅを満たさないプライマーセットによれば、非増幅対象生物のセレウス、リステリア、サルモネラ、及び黄色ブドウ球菌における非増幅対象領域が増幅されており、非特異的増幅が行われていることがわかる。
(Comparative Example 18)
Experiments were performed in the same manner as in Comparative Example 17 except that a primer set in which the difference in melting temperature between the forward primer and the reverse primer was 10 ° C. or more was designed, and that the annealing temperature in PCR was 55 ° C. As shown in FIG. 23, the difference in melting temperature between the forward primer (SEQ ID NO: 47) and the reverse primer (SEQ ID NO: 50) for detecting vibrio in Comparative Example 18 is 13.91 ° C. The result is shown in FIG.
In the same figure, according to the primer set not satisfying the condition E of this comparative example, the non-amplification target regions in the non-amplification target organisms Cereus, Listeria, Salmonella, and Staphylococcus aureus are amplified, and non-specific amplification is performed. You can see that it is happening.
＜実験３：プライマーの長さに関して＞
本発明のプライマーの作製方法及びプライマーの設計方法にもとづいて、各種食中毒菌について、「フォワードプライマー及びリバースプライマーの長さが２３〜４１ｍｅｒ」を満たすプライマーセットを作製し、これを用いてＰＣＲ法を行うことにより、増幅対象領域が特異的に増幅されるか否かを確認した（参考例１，実施例１２）。なお、参考例１と実施例１２のプライマーセットは、条件Ｄを満たしている。
また、「フォワードプライマー及びリバースプライマーの長さが２３〜４１ｍｅｒ」を満たさないプライマーセットを作製し、これを用いてＰＣＲ法を行うことにより、増幅対象領域が特異的に増幅されるか否かを確認した（比較例１９〜２１）。
<Experiment 3: Regarding Primer Length>
Based on the primer preparation method and primer design method of the present invention, a primer set satisfying “the length of the forward primer and reverse primer is 23 to 41 mer” is prepared for various food poisoning bacteria, and PCR is performed using this primer set. It was confirmed whether or not the amplification target region was specifically amplified by performing (Reference Example 1, Example 12). In addition, the primer sets of Reference Example 1 and Example 12 satisfy the condition D.
Whether or not the amplification target region is specifically amplified by preparing a primer set that does not satisfy “the length of the forward primer and the reverse primer is 23 to 41 mer” and performing PCR using this primer set. It confirmed (Comparative Examples 19-21).
（参考例１）Ｆプライマー：４１ｍｅｒ，Ｒプライマー：２３ｍｅｒ
増幅対象生物として以下のサルモネラ（ATCC9270）を選択するとともに、非増幅対象生物として、以下の１０種類の食中毒菌を選択した。
１．非増幅対象生物 セレウス（Bacillus cereus NBRC 15305）
２．非増幅対象生物 セレウス（Bacillus cereus TIFT 114011）
３．非増幅対象生物 カンピロバクター（Campylobacter coli ATCC 43478）
４．非増幅対象生物 カンピロバクター（Campylobacter jejuni ATCC 33560）
５．非増幅対象生物 大腸菌（Escherichia coli NBRC 102203）
６．非増幅対象生物 リステリア（Listeria monocytogenes ATCC 15313）
７．増幅対象生物 サルモネラ（Salmonella enterica ATCC 9270）
８．非増幅対象生物 黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus NBRC 100910）
９．非増幅対象生物 ビブリオ（Vibrio parahaemolyticus RIMD 2210050）
１０．非増幅対象生物 ビブリオ（Vibrio parahaemolyticus ATCC 17802）
１１．非増幅対象生物 エルシニア（Yersinia enterocolitica ATCC 9610）
１２．Negative Cont.
(Reference Example 1) F primer: 41mer, R primer: 23mer
The following Salmonella (ATCC 9270) was selected as an amplification target organism, and the following 10 types of food poisoning bacteria were selected as non-amplification target organisms.
1. Non-amplification target organism Cereus (Bacillus cereus NBRC 15305)
2. Non-amplification target organism Cereus (Bacillus cereus TIFT 114011)
3. Unamplified organism Campylobacter coli ATCC 43478
4). Non-amplification target organism Campylobacter jejuni ATCC 33560
5. Non-amplified organism Escherichia coli NBRC 102203
6). Non-amplified organism Listeria (Listeria monocytogenes ATCC 15313)
7). Amplification target Salmonella (Salmonella enterica ATCC 9270)
8). Non-amplification target organism Staphylococcus aureus NBRC 100910
9. Non-amplified organism Vibrio (Vibrio parahaemolyticus RIMD 2210050)
10. Non-amplified organism Vibrio (Vibrio parahaemolyticus ATCC 17802)
11. Non-amplified organism Yersinia (Yersinia enterocolitica ATCC 9610)
12 Negative Cont.
次いで、サルモネラの塩基配列から「フォワードプライマー及びリバースプライマーの長さが２３〜４１ｍｅｒ」である、増幅対象領域ｉｎｖＡ（侵入性因子関連遺伝子，１８０ｂｐ）を増幅するプライマーセットを設計した。
具体的には、図２８の参考例１に示すサルモネラ検出用のフォワードプライマー（配列番号５１，４１ｍｅｒ）及びリバースプライマー（配列番号５２，２３ｍｅｒ）のプライマーセットを設計した。
Next, a primer set for amplifying the amplification target region invA (invasion factor-related gene, 180 bp) having a “forward primer and reverse primer length of 23 to 41 mer” from the Salmonella base sequence was designed.
Specifically, a primer set of a forward primer (SEQ ID NO: 51, 41 mer) and a reverse primer (SEQ ID NO: 52, 23 mer) for Salmonella detection shown in Reference Example 1 of FIG. 28 was designed.
次に、実施例１と同様に、本実施例において設計したプライマーセットを作製するとともに、このプライマーセットを含有するＰＣＲ用反応液を作製した。
そして、以下の反応条件でＰＣＲ法による遺伝子の増幅を行った。
（１）９５℃ ２分
（２）９５℃ １０秒（ＤＮＡ鎖の乖離工程）
（３）６９℃ ３０秒（アニーリング工程）
（４）７２℃ ３０秒（ＤＮＡ合成工程）
（５）７２℃ ２分
（２）〜（４）を４０サイクル
なお、上記アニーリング温度は、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度から５℃低い温度に設定した。これは、実験３における以下の実施例及び比較例についても同様である。
Next, in the same manner as in Example 1, a primer set designed in this example was prepared, and a PCR reaction solution containing this primer set was prepared.
The gene was amplified by the PCR method under the following reaction conditions.
(1) 95 ° C for 2 minutes (2) 95 ° C for 10 seconds (DNA strand dissociation step)
(3) 69 ° C 30 seconds (annealing process)
(4) 72 ° C. for 30 seconds (DNA synthesis step)
(5) 72 ° C. 2 minutes (2) to (4) 40 cycles Note that the annealing temperature was set to 5 ° C. lower than the lower melting temperature of the forward primer or reverse primer. The same applies to the following Examples and Comparative Examples in Experiment 3.
そして、ＰＣＲ法による産物を、電気泳動により、それぞれの生物ごとに泳動させ、正しい増幅産物が得られているか否かを確認した。その結果を図２９（ａ）に示す。
同図において、「フォワードプライマー及びリバースプライマーの長さが２３〜４１ｍｅｒ」のプライマーセットによれば、サルモネラの増幅対象領域ｉｎｖＡ（１８０ｂｐ）のみが特異的に増幅され、非増幅対象領域については、増幅が行われていないことがわかる。
And the product by PCR method was electrophoresed for every organism by electrophoresis, and it was confirmed whether the correct amplification product was obtained. The result is shown in FIG.
In the same figure, according to the primer set of “the length of the forward primer and the reverse primer is 23 to 41 mer”, only the amplification target region invA (180 bp) of Salmonella is specifically amplified, and the amplification target region is amplified. It can be seen that is not done.
（実施例１２）Ｆプライマー：４１ｍｅｒ，Ｒプライマー：３４ｍｅｒ
増幅対象生物として参考例１における供試菌株９のビブリオを選択し、その塩基配列から「フォワードプライマー及びリバースプライマーの長さが２３〜４１ｍｅｒ」を満たす、増幅対象領域ｔｄｈ（耐熱性溶血毒素遺伝子，３８０ｂｐ）を増幅するプライマーセットを設計した点、及びＰＣＲにおけるアニーリング温度を６８℃とした点以外は、参考例１と同様にして実験を行った。本実施例のプライマーセットは、図２８に示すように、フォワードプライマー（配列番号５３，４１ｍｅｒ）及びリバースプライマー（配列番号５４，３４ｍｅｒ）からなっている。実験結果を図２９（ｂ）に示す。
同図において、「フォワードプライマー及びリバースプライマーの長さが２３〜４１ｍｅｒ」を満たすプライマーセットによれば、ビブリオの増幅対象領域ｔｄｈ（３８０ｂｐ）のみが特異的に増幅され、非増幅対象領域については、増幅が行われていないことがわかる。なお、供試菌株１０のビブリオ（ATCC 17802）は、増幅対象領域ｔｄｈを有していない。
(Example 12) F primer: 41mer, R primer: 34mer
A vibrio of the test strain 9 in Reference Example 1 is selected as an amplification target organism, and the amplification target region tdh (heat-stable hemolysin toxin gene, which satisfies the lengths of the forward primer and reverse primer of 23 to 41 mer) from its base sequence The experiment was performed in the same manner as in Reference Example 1 except that a primer set for amplifying 380 bp) was designed and the annealing temperature in PCR was set to 68 ° C. As shown in FIG. 28, the primer set of this example consists of a forward primer (SEQ ID NO: 53, 41 mer) and a reverse primer (SEQ ID NO: 54, 34 mer). The experimental results are shown in FIG.
In the same figure, according to the primer set satisfying “the length of the forward primer and the reverse primer is 23 to 41 mer”, only the amplification target region tdh (380 bp) of Vibrio is specifically amplified. It can be seen that amplification is not performed. Note that the vibrio (ATCC 17802) of the test strain 10 does not have the amplification target region tdh.
（比較例１９）Ｆプライマー：２２ｍｅｒ，Ｒプライマー：３４ｍｅｒ
増幅対象生物として以下のビブリオを選択するとともに、非増幅対象生物として、以下に示す６種類の食中毒菌を選択した。
１．非増幅対象生物 セレウス（Bacillus cereus TIFT 114011）
２．非増幅対象生物 カンピロバクター（Campylobacter coli ATCC 43478）
３．非増幅対象生物 大腸菌（Escherichia coli NBRC 102203）
４．非増幅対象生物 リステリア（Listeria monocytogenes ATCC 15313）
５．非増幅対象生物 サルモネラ（Salmonella enterica ATCC 9270）
６．非増幅対象生物 黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus NBRC 100910）
７．増幅対象生物 ビブリオ（Vibrio parahaemolyticus RIMD 2210050）
８．Negative Cont.
(Comparative Example 19) F primer: 22mer, R primer: 34mer
The following vibrio was selected as an amplification target organism, and the following six types of food poisoning bacteria were selected as non-amplification target organisms.
1. Non-amplification target organism Cereus (Bacillus cereus TIFT 114011)
2. Unamplified organism Campylobacter coli ATCC 43478
3. Non-amplified organism Escherichia coli NBRC 102203
4). Non-amplified organism Listeria (Listeria monocytogenes ATCC 15313)
5. Non-amplified organism Salmonella (Salmonella enterica ATCC 9270)
6). Non-amplification target organism Staphylococcus aureus NBRC 100910
7). Vibrio to be amplified Vibrio (Vibrio parahaemolyticus RIMD 2210050)
8). Negative Cont.
増幅対象生物のビブリオの塩基配列から「フォワードプライマー及びリバースプライマーの長さが２３〜４１ｍｅｒ」を満たさない、増幅対象領域ｔｄｈ（耐熱性溶血毒素遺伝子，３８０ｂｐ）を増幅するプライマーセットを設計した。また、ＰＣＲにおけるアニーリング温度を４８℃とした。その他の点は、参考例１と同様にして実験を行った。本実施例のプライマーセットは、図２８に示すように、フォワードプライマー（配列番号５５，２２ｍｅｒ）及びリバースプライマー（配列番号５６，３４ｍｅｒ）からなっている。実験結果を図３０（ａ）に示す。
同図において、「フォワードプライマー及びリバースプライマーの長さが２３〜４１ｍｅｒ」を満たさないプライマーセットによれば、非増幅対象生物のセレウス、大腸菌、リステリア、サルモネラ、及び黄色ブドウ球菌における非増幅対象領域が増幅されており、非特異的増幅が行われていることがわかる。
A primer set for amplifying a region to be amplified tdh (heat-stable hemolysin toxin gene, 380 bp) that does not satisfy “the length of the forward primer and the reverse primer of 23 to 41 mer” was designed from the vibrio base sequence of the organism to be amplified. The annealing temperature in PCR was 48 ° C. For other points, the experiment was performed in the same manner as in Reference Example 1. As shown in FIG. 28, the primer set of this example consists of a forward primer (SEQ ID NO: 55, 22mer) and a reverse primer (SEQ ID NO: 56, 34mer). The experimental results are shown in FIG.
In the same figure, according to the primer set that does not satisfy “the length of the forward primer and the reverse primer of 23 to 41 mer”, the non-amplification target regions in the non-amplification target organisms Cereus, E. coli, Listeria, Salmonella, and Staphylococcus aureus It can be seen that non-specific amplification is performed.
（比較例２０）Ｆプライマー：３４ｍｅｒ，Ｒプライマー：２２ｍｅｒ
増幅対象生物として比較例１９に示すビブリオを選択し、そのＤＮＡの塩基配列から「フォワードプライマー及びリバースプライマーの長さが２３〜４１ｍｅｒ」を満たさない、増幅対象領域ｔｄｈ（耐熱性溶血毒素遺伝子，３８０ｂｐ）を増幅するプライマーセットを設計した。また、ＰＣＲにおけるアニーリング温度を５５℃とした。その他の点は、参考例１と同様にして実験を行った。本実施例のプライマーセットは、図２８に示すように、フォワードプライマー（配列番号５７，３４ｍｅｒ）及びリバースプライマー（配列番号５８，２２ｍｅｒ）からなっている。実験結果を図３０（ｂ）に示す。
同図において、「フォワードプライマー及びリバースプライマーの長さが２３〜４１ｍｅｒ」を満たさないプライマーセットによれば、非増幅対象生物のセレウス、カンピロバクター、サルモネラ、及び黄色ブドウ球菌における非増幅対象領域が増幅されており、非特異的増幅が行われていることがわかる。
(Comparative Example 20) F primer: 34 mer, R primer: 22 mer
The vibrio shown in Comparative Example 19 is selected as the amplification target organism, and the amplification target region tdh (heat-resistant hemolytic toxin gene, 380 bp, which does not satisfy the length of the forward primer and the reverse primer of 23 to 41 mer) from the base sequence of the DNA. ) Was designed. The annealing temperature in PCR was 55 ° C. For other points, the experiment was performed in the same manner as in Reference Example 1. As shown in FIG. 28, the primer set of this example consists of a forward primer (SEQ ID NO: 57, 34mer) and a reverse primer (SEQ ID NO: 58, 22mer). An experimental result is shown in FIG.30 (b).
In the same figure, according to the primer set that does not satisfy “the length of the forward primer and the reverse primer is 23 to 41 mer”, the non-amplification target regions in the non-amplification target organisms, such as Cereus, Campylobacter, Salmonella, and S. aureus are amplified. It can be seen that non-specific amplification is performed.
（比較例２１）Ｆプライマー：４２ｍｅｒ，Ｒプライマー：２３ｍｅｒ
増幅対象生物として比較例１９における供試菌株５のサルモネラを選択し、増幅対象生物のサルモネラの塩基配列から「フォワードプライマー及びリバースプライマーの長さが２３〜４１ｍｅｒ」を満たさない、増幅対象領域ｉｎｖＡ（侵入性因子関連遺伝子，１８０ｂｐ）を増幅するプライマーセットを設計した。また、ＰＣＲにおけるアニーリング温度を６９℃とした。その他の点は、参考例１と同様にして実験を行った。本実施例のプライマーセットは、図２８に示すように、フォワードプライマー（配列番号５９，４２ｍｅｒ）及びリバースプライマー（配列番号６０，２３ｍｅｒ）からなっている。実験結果を図３０（ｃ）に示す。
同図において、「フォワードプライマー及びリバースプライマーの長さが２３〜４１ｍｅｒ」を満たさないプライマーセットによれば、全ての非増幅対象生物における非増幅対象領域が増幅されており、非特異的増幅が行われていることがわかる。
(Comparative Example 21) F primer: 42mer, R primer: 23mer
As the amplification target organism, Salmonella of the test strain 5 in Comparative Example 19 is selected, and the amplification target region invA (the length of the forward primer and the reverse primer is 23 to 41 mer) from the base sequence of the Salmonella of the amplification target organism, A primer set for amplifying invasive factor-related genes (180 bp) was designed. The annealing temperature in PCR was 69 ° C. For other points, the experiment was performed in the same manner as in Reference Example 1. As shown in FIG. 28, the primer set of this example consists of a forward primer (SEQ ID NO: 59, 42 mer) and a reverse primer (SEQ ID NO: 60, 23 mer). An experimental result is shown in FIG.30 (c).
In the figure, according to the primer set that does not satisfy the lengths of the forward primer and the reverse primer of 23 to 41 mer, the non-amplification target regions in all non-amplification target organisms are amplified, and non-specific amplification is performed. You can see that
以上の結果から、「フォワードプライマー及びリバースプライマーの長さが２３〜４１ｍｅｒ」を満たすプライマーセットを用いてＰＣＲを行うことで、増幅対象領域の増幅の特異性が向上することがわかる。 From the above results, it is understood that the amplification specificity of the amplification target region is improved by performing PCR using a primer set satisfying “the length of the forward primer and the reverse primer is 23 to 41 mer”.
＜実験４：アニーリング温度とプライマーの融解温度との関係に関して＞
本発明のプライマーの作製方法及びプライマーの設計方法にもとづき作製したプライマーセットを用いて、種々のアニーリング温度によりＰＣＲを行うことで、プライマーセットにおけるプライマーの融解温度とアニーリング温度との関係について検討した。
具体的には、各種食中毒菌について、アニーリング温度を、プライマーセットにおけるフォワードプライマー及びリバースプライマーの融解温度のうち、低い方の温度よりも所定の範囲で低くしてＰＣＲを行うことにより、増幅対象領域が特異的に増幅されるか否かを確認した（参考例２〜２５，実施例１３〜２８）。
<Experiment 4: Relationship between annealing temperature and primer melting temperature>
Using the primer set prepared based on the primer preparation method and primer design method of the present invention, PCR was performed at various annealing temperatures, thereby examining the relationship between the melting temperature of the primer and the annealing temperature in the primer set.
Specifically, for various food poisoning bacteria, PCR is performed by lowering the annealing temperature within a predetermined range from the lower one of the melting temperatures of the forward primer and the reverse primer in the primer set. It was confirmed whether or not was specifically amplified (Reference Examples 2 to 25, Examples 13 to 28).
（１）セレウス（ｃｅｓＢ）検出用プライマー
（参考例２）アニーリング温度：融解温度（Ｔｍ値）−２０℃
増幅対象生物として以下のセレウスを選択するとともに、非増幅対象生物として、以下の６種類の食中毒菌を選択した。
１．増幅対象生物 セレウス（Bacillus cereus TIFT 114011）
２．非増幅対象生物 カンピロバクター（Campylobacter jejuni ATCC 33560）
３．非増幅対象生物 大腸菌（Escherichia coli NBRC 102203）
４．非増幅対象生物 リステリア（Listeria monocytogenes ATCC 15313）
５．非増幅対象生物 サルモネラ（Salmonella enterica ATCC 9270）
６．非増幅対象生物 黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus NBRC 100910）
７．非増幅対象生物 ビブリオ（Vibrio parahaemolyticus RIMD 2210050）
８．Negative Cont.
(1) Cereus (cesB) detection primer (Reference Example 2) Annealing temperature: melting temperature (Tm value) -20 ° C
The following cereus was selected as an amplification target organism, and the following six types of food poisoning bacteria were selected as non-amplification target organisms.
1. Target organism for amplification Cereus (Bacillus cereus TIFT 114011)
2. Non-amplification target organism Campylobacter jejuni ATCC 33560
3. Non-amplified organism Escherichia coli NBRC 102203
4). Non-amplified organism Listeria (Listeria monocytogenes ATCC 15313)
5. Non-amplified organism Salmonella (Salmonella enterica ATCC 9270)
6). Non-amplification target organism Staphylococcus aureus NBRC 100910
7). Non-amplified organism Vibrio (Vibrio parahaemolyticus RIMD 2210050)
8). Negative Cont.
次いで、実施例１と同様に、これらの生物の塩基配列を比較して、セレウスの塩基配列から条件Ａを満たす、増幅対象領域ｃｅｓＢ（セレウリド合成酵素遺伝子，２３８ｂｐ）を増幅するプライマーセットを設計した。このプライマーセットは、図３１の参考例２に示すように、フォワードプライマー（配列番号１９）及びリバースプライマー（配列番号２０）からなっている。参考例３，４、及び実施例１３，１４においてもこのプライマーセットを使用して、実験を行った。 Next, in the same manner as in Example 1, the base sequences of these organisms were compared, and a primer set for amplifying the amplification target region cesB (cereulide synthase gene, 238 bp) satisfying the condition A from the base sequence of Cereus was designed. . This primer set consists of a forward primer (SEQ ID NO: 19) and a reverse primer (SEQ ID NO: 20) as shown in Reference Example 2 of FIG. In Reference Examples 3 and 4 and Examples 13 and 14, this primer set was also used for experiments.
次に、実施例１と同様に、本参考例において設計したプライマーセットを作製するとともに、このプライマーセットを含有するＰＣＲ用反応液を作製した。
そして、以下の反応条件でＰＣＲ法による遺伝子の増幅を行った。
（１）９５℃ ２分
（２）９５℃ １０秒（ＤＮＡ鎖の乖離工程）
（３）５３℃ ３０秒（アニーリング工程）
（４）７２℃ ３０秒（ＤＮＡ合成工程）
（５）７２℃ ２分
（２）〜（４）を４０サイクル
本参考例では、上記アニーリング温度として、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度から２０℃低い温度（Ｔｍ−２０℃）を設定した。
Next, in the same manner as in Example 1, a primer set designed in this reference example was prepared, and a PCR reaction solution containing this primer set was prepared.
The gene was amplified by the PCR method under the following reaction conditions.
(1) 95 ° C for 2 minutes (2) 95 ° C for 10 seconds (DNA strand dissociation step)
(3) 53 ° C. for 30 seconds (annealing process)
(4) 72 ° C. for 30 seconds (DNA synthesis step)
(5) 72 ° C. 2 minutes (2) to (4) 40 cycles In this reference example, the annealing temperature is 20 ° C. lower than the lower melting temperature of the forward primer or reverse primer (Tm−20 ° C. )It was set.
そして、ＰＣＲ法による産物を、電気泳動により、それぞれの生物ごとに泳動させ、正しい増幅産物が得られているか否かを確認した。その結果を図３５に示す。
同図において、本参考例におけるセレウス検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度−２０℃をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、セレウスの増幅対象領域ｃｅｓＢ（２３８ｂｐ）のみが増幅されており、非増幅対象領域の増幅は、行われていなかった。
And the product by PCR method was electrophoresed for every organism by electrophoresis, and it was confirmed whether the correct amplification product was obtained. The result is shown in FIG.
In the same figure, when PCR was performed using the cereus detection primer in the present reference example and the annealing temperature of −20 ° C., which is the lower melting point of the forward primer or the reverse primer, the cereus amplification target region cesB (238 bp) ) Only was amplified, and the non-amplification target region was not amplified.
（参考例３）アニーリング温度：融解温度−１５℃
ＰＣＲにおけるアニーリング温度を５８℃、すなわちフォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度から１５℃低い温度（Ｔｍ−１５℃）に設定した点以外は、参考例２と同様にして実験を行った。その結果を図３５に示す。
同図において、本参考例におけるセレウス検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度−１５℃をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、セレウス及びカンピロバクターにおける非増幅対象領域が増幅されており、非特異的増幅が行われていることがわかる。
(Reference Example 3) Annealing temperature: Melting temperature -15 ° C
The experiment was conducted in the same manner as in Reference Example 2 except that the annealing temperature in PCR was set to 58 ° C., that is, a temperature lower by 15 ° C. (Tm−15 ° C.) than the lower melting temperature of the forward primer or reverse primer. It was. The result is shown in FIG.
In the same figure, when PCR was performed using the primer for detecting Cereus in this reference example, with the annealing temperature of -15 ° C, which is the lower melting point of the forward primer or the reverse primer, non-amplification target regions in Cereus and Campylobacter It can be seen that non-specific amplification is performed.
（参考例４）アニーリング温度：融解温度−１０℃
ＰＣＲにおけるアニーリング温度を６３℃、すなわちフォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度から１０℃低い温度（Ｔｍ−１０℃）に設定した点以外は、参考例２と同様にして実験を行った。その結果を図３５に示す。
同図において、本参考例におけるセレウス検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度−１０℃をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、セレウスの増幅対象領域ｃｅｓＢ（２３８ｂｐ）のみが増幅されており、非増幅対象領域の増幅は、行われていなかった。
(Reference Example 4) Annealing temperature: Melting temperature −10 ° C.
The experiment was conducted in the same manner as in Reference Example 2 except that the annealing temperature in PCR was set to 63 ° C., that is, a temperature lower by 10 ° C. (Tm−10 ° C.) than the lower melting temperature of the forward primer or reverse primer. It was. The result is shown in FIG.
In the same figure, when PCR was carried out using the primer for cereus detection in the present reference example and the annealing temperature of −10 ° C., which is the lower melting temperature of the forward primer or the reverse primer, the celeus amplification target region cesB (238 bp) ) Only was amplified, and the non-amplification target region was not amplified.
（実施例１３）アニーリング温度：融解温度−５℃
ＰＣＲにおけるアニーリング温度を６８℃、すなわちフォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度から５℃低い温度（Ｔｍ−５℃）に設定した点以外は、参考例２と同様にして実験を行った。その結果を図３５に示す。
同図において、本実施例におけるセレウス検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度−５℃をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、セレウスの増幅対象領域ｃｅｓＢ（２３８ｂｐ）のみが増幅されており、非増幅対象領域の増幅は、行われていなかった。
(Example 13) Annealing temperature: Melting temperature -5 ° C
The experiment was carried out in the same manner as in Reference Example 2 except that the annealing temperature in PCR was set to 68 ° C., that is, a temperature lower by 5 ° C. (Tm−5 ° C.) than the lower melting temperature of the forward primer or reverse primer. It was. The result is shown in FIG.
In the same figure, when PCR was carried out using the Cereus detection primer in the present example and the annealing temperature of −5 ° C., which is the lower melting point of the forward primer or the reverse primer, the cereus amplification target region cesB (238 bp) ) Only was amplified, and the non-amplification target region was not amplified.
（実施例１４）アニーリング温度：融解温度−０℃
ＰＣＲにおけるアニーリング温度を７３℃、すなわちフォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度（Ｔｍ−０℃）に設定した点以外は、参考例２と同様にして実験を行った。その結果を図３５に示す。
同図において、本実施例におけるセレウス検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、セレウスの増幅対象領域ｃｅｓＢ（２３８ｂｐ）のみが増幅されており、非増幅対象領域の増幅は、行われていなかった。
(Example 14) Annealing temperature: Melting temperature-0 ° C
Experiments were performed in the same manner as in Reference Example 2 except that the annealing temperature in PCR was set to 73 ° C., that is, the temperature of the lower melting temperature of the forward primer or reverse primer (Tm−0 ° C.). The result is shown in FIG.
In the same figure, when PCR was performed using the primer for cereus detection in the present example and the annealing temperature as the lower melting temperature of the forward primer or the reverse primer, only the cereus amplification target region cesB (238 bp) was present. Amplified, and the non-amplification target region was not amplified.
（２）セレウス（ｎｈｅ）検出用プライマー
（参考例５）アニーリング温度：融解温度−２０℃
セレウスの塩基配列から増幅対象領域ｎｈｅ（溶血活性を示さないエンテロトキシン分泌遺伝子，１９５ｂｐ）を増幅するプライマーセットを設計した点以外は、参考例２と同様にして実験を行った。このプライマーセットは、図３１の参考例５に示すように、フォワードプライマー（配列番号２３）及びリバースプライマー（配列番号２４）からなっている。参考例６，７、及び実施例１５，１６においてもこのプライマーセットを使用して、実験を行った。アニーリング温度は５３℃とした。その結果を図３６に示す。
同図において、本参考例におけるセレウス検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度−２０℃をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、セレウスの増幅対象領域ｎｈｅ（１９５ｂｐ）のみが増幅されており、非増幅対象領域の増幅は、行われていなかった。
(2) Cereus (nhe) detection primer (Reference Example 5) Annealing temperature: melting temperature -20 ° C
Experiments were performed in the same manner as in Reference Example 2 except that a primer set was designed to amplify the amplification target region nhe (enterotoxin secretion gene that does not show hemolytic activity, 195 bp) from the base sequence of Cereus. This primer set consists of a forward primer (SEQ ID NO: 23) and a reverse primer (SEQ ID NO: 24) as shown in Reference Example 5 of FIG. In Reference Examples 6 and 7 and Examples 15 and 16, experiments were also performed using this primer set. The annealing temperature was 53 ° C. The result is shown in FIG.
In the same figure, when PCR was carried out using the cereus detection primer in the present reference example with an annealing temperature of −20 ° C. which is the lower melting temperature of the forward primer or the reverse primer, the amplification target region nhe (195 bp) of cereus ) Only was amplified, and the non-amplification target region was not amplified.
（参考例６）アニーリング温度：融解温度−１５℃
ＰＣＲにおけるアニーリング温度を５８℃、すなわちフォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度から１５℃低い温度（Ｔｍ−１５℃）に設定した点以外は、参考例５と同様にして実験を行った。その結果を図３６に示す。
同図において、本参考例におけるセレウス検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度−１５℃をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、セレウスの増幅対象領域ｎｈｅ（１９５ｂｐ）のみが増幅されており、非増幅対象領域の増幅は、行われていなかった。
(Reference Example 6) Annealing temperature: Melting temperature -15 ° C
The experiment was conducted in the same manner as in Reference Example 5 except that the annealing temperature in PCR was set to 58 ° C., that is, a temperature lower by 15 ° C. (Tm−15 ° C.) than the lower melting temperature of the forward primer or reverse primer. It was. The result is shown in FIG.
In the same figure, when PCR was carried out using the cereus detection primer in the present reference example with an annealing temperature of -15 ° C., which is the lower melting point of the forward primer or the reverse primer, the amplification target region nhe (195 bp) of cereus ) Only was amplified, and the non-amplification target region was not amplified.
（参考例７）アニーリング温度：融解温度−１０℃
ＰＣＲにおけるアニーリング温度を６３℃、すなわちフォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度から１０℃低い温度（Ｔｍ−１０℃）に設定した点以外は、参考例５と同様にして実験を行った。その結果を図３６に示す。
同図において、本参考例におけるセレウス検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度−１０℃をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、セレウスの増幅対象領域ｎｈｅ（１９５ｂｐ）のみが増幅されており、非増幅対象領域の増幅は、行われていなかった。
(Reference Example 7) Annealing temperature: Melting temperature −10 ° C.
The experiment was performed in the same manner as in Reference Example 5 except that the annealing temperature in PCR was set to 63 ° C., that is, the temperature lower than the melting temperature of the forward primer or the reverse primer by 10 ° C. (Tm−10 ° C.) It was. The result is shown in FIG.
In the same figure, when PCR was carried out using the cereus detection primer in the present reference example with an annealing temperature of −10 ° C. which is the lower melting temperature of the forward primer or the reverse primer, the amplification target region nhe (195 bp) of cereus ) Only was amplified, and the non-amplification target region was not amplified.
（実施例１５）アニーリング温度：融解温度−５℃
ＰＣＲにおけるアニーリング温度を６８℃、すなわちフォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度から５℃低い温度（Ｔｍ−５℃）に設定した点以外は、参考例５と同様にして実験を行った。その結果を図３６に示す。
同図において、本実施例におけるセレウス検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度−５℃をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、セレウスの増幅対象領域ｎｈｅ（１９５ｂｐ）のみが増幅されており、非増幅対象領域の増幅は、行われていなかった。
(Example 15) Annealing temperature: Melting temperature -5 ° C
The experiment was carried out in the same manner as in Reference Example 5 except that the annealing temperature in PCR was set to 68 ° C., that is, a temperature lower by 5 ° C. (Tm−5 ° C.) than the lower melting temperature of the forward primer or reverse primer. It was. The result is shown in FIG.
In the same figure, when PCR was carried out using the primer for detecting Cereus in this example, with the annealing temperature of −5 ° C. being the lower melting point of the forward primer or the reverse primer, the region to be amplified by cereus nhe (195 bp) ) Only was amplified, and the non-amplification target region was not amplified.
（実施例１６）アニーリング温度：融解温度−０℃
ＰＣＲにおけるアニーリング温度を７３℃、すなわちフォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度（Ｔｍ−０℃）に設定した点以外は、参考例５と同様にして実験を行った。その結果を図３６に示す。
同図において、本実施例におけるセレウス検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、セレウスの増幅対象領域ｎｈｅ（１９５ｂｐ）のみが増幅されており、非増幅対象領域の増幅は、行われていなかった。
(Example 16) Annealing temperature: Melting temperature-0 ° C
The experiment was performed in the same manner as in Reference Example 5 except that the annealing temperature in PCR was set to 73 ° C., that is, the lower melting temperature of the forward primer or reverse primer (Tm-0 ° C.). The result is shown in FIG.
In the same figure, when PCR was carried out using the cereus detection primer in the present example and the annealing temperature as the lower melting temperature of the forward primer or the reverse primer, only the cereus amplification target region nhe (195 bp) was obtained. Amplified, and the non-amplification target region was not amplified.
（３）カンピロバクター検出用プライマー
（参考例８）アニーリング温度：融解温度−２０℃
増幅対象生物として参考例２における供試菌株２のカンピロバクターを選択し、カンピロバクターの塩基配列から条件Ａを満たす、増幅対象領域１６Ｓ ｒＤＮＡ（リボソーム遺伝子，２６３ｂｐ）を増幅するプライマーセットを設計した点以外は、参考例２と同様にして実験を行った。このプライマーセットは、図３２の参考例８に示すように、フォワードプライマー（配列番号２７）及びリバースプライマー（配列番号２８）からなっている。アニーリング温度は５３℃とした。参考例９，１０、及び実施例１７，１８においてもこのプライマーセットを使用して、実験を行った。その結果を図３７に示す。
同図において、本参考例におけるカンピロバクター検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度−２０℃をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、カンピロバクターにおける非増幅対象領域が増幅されており、非特異的増幅が行われていることがわかる。なお、同図の点線囲み内における下側のバンドが非特異的増幅を示し、上側のバンドは検出対象のものである。以下の参考例９，１０においても同様である。
(3) Campylobacter detection primer (Reference Example 8) Annealing temperature: melting temperature -20 ° C
Except that Campylobacter of test strain 2 in Reference Example 2 was selected as the amplification target organism, and a primer set for amplifying the amplification target region 16S rDNA (ribosome gene, 263 bp) satisfying Condition A from the base sequence of Campylobacter was designed. The experiment was conducted in the same manner as in Reference Example 2. This primer set consists of a forward primer (SEQ ID NO: 27) and a reverse primer (SEQ ID NO: 28) as shown in Reference Example 8 in FIG. The annealing temperature was 53 ° C. In Reference Examples 9 and 10 and Examples 17 and 18, experiments were also performed using this primer set. The result is shown in FIG.
In the same figure, when PCR was performed using the Campylobacter detection primer in this Reference Example, with the annealing temperature of −20 ° C. being the lower melting point of the forward primer or the reverse primer, the non-amplification target region in Campylobacter was amplified. It can be seen that non-specific amplification is performed. In addition, the lower band within the dotted line in the figure shows non-specific amplification, and the upper band is a detection target. The same applies to Reference Examples 9 and 10 below.
（参考例９）アニーリング温度：融解温度−１５℃
ＰＣＲにおけるアニーリング温度を５８℃、すなわちフォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度から１５℃低い温度（Ｔｍ−１５℃）に設定した点以外は、参考例８と同様にして実験を行った。その結果を図３７に示す。
同図において、本参考例におけるカンピロバクター検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度−１５℃をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、カンピロバクターにおける非増幅対象領域が増幅されており、非特異的増幅が行われていることがわかる。
(Reference Example 9) Annealing temperature: Melting temperature -15 ° C
The experiment was conducted in the same manner as in Reference Example 8 except that the annealing temperature in PCR was set to 58 ° C, that is, the temperature lower than the melting temperature of the forward primer or reverse primer by 15 ° C (Tm-15 ° C). It was. The result is shown in FIG.
In the same figure, when PCR was performed using the Campylobacter detection primer in this Reference Example, with the annealing temperature of −15 ° C. being the lower melting temperature of the forward primer or the reverse primer, the non-amplification target region in Campylobacter was amplified. It can be seen that non-specific amplification is performed.
（参考例１０）アニーリング温度：融解温度−１０℃
ＰＣＲにおけるアニーリング温度を６３℃、すなわちフォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度から１０℃低い温度（Ｔｍ−１０℃）に設定した点以外は、参考例８と同様にして実験を行った。その結果を図３７に示す。
同図において、本参考例におけるカンピロバクター検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度−１０℃をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、カンピロバクターにおける非増幅対象領域が増幅されており、非特異的増幅が行われていることがわかる。
(Reference Example 10) Annealing temperature: melting temperature −10 ° C.
The experiment was performed in the same manner as in Reference Example 8 except that the annealing temperature in PCR was set to 63 ° C., that is, the temperature lower than the melting temperature of the forward primer or reverse primer by 10 ° C. (Tm−10 ° C.). It was. The result is shown in FIG.
In the same figure, when PCR was carried out using the Campylobacter detection primer in this Reference Example with an annealing temperature of −10 ° C., which is the lower melting temperature of the forward primer or the reverse primer, the non-amplification target region in Campylobacter was amplified. It can be seen that non-specific amplification is performed.
（実施例１７）アニーリング温度：融解温度−５℃
ＰＣＲにおけるアニーリング温度を６８℃、すなわちフォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度から５℃低い温度（Ｔｍ−５℃）に設定した点以外は、参考例８と同様にして実験を行った。その結果を図３７に示す。
同図において、本実施例におけるカンピロバクター検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度−５℃をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、カンピロバクターの増幅対象領域１６Ｓ ｒＤＮＡ（２６３ｂｐ）のみが増幅されており、非増幅対象領域の増幅は、行われていなかった。
(Example 17) Annealing temperature: Melting temperature -5 ° C
The experiment was conducted in the same manner as in Reference Example 8, except that the annealing temperature in PCR was set to 68 ° C., that is, a temperature lower by 5 ° C. (Tm−5 ° C.) than the lower melting temperature of the forward primer or reverse primer. It was. The result is shown in FIG.
In the same figure, when PCR was carried out using the Campylobacter detection primer in this example, with the annealing temperature of −5 ° C. being the lower melting point of the forward primer or reverse primer, the amplification target region 16S rDNA of Campylobacter ( Only 263 bp) was amplified, and the non-amplification target region was not amplified.
（実施例１８）アニーリング温度：融解温度−０℃
ＰＣＲにおけるアニーリング温度を７２℃、すなわちフォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度（Ｔｍ−０℃）に設定した点以外は、参考例８と同様にして実験を行った。その結果を図３７に示す。
同図において、本実施例におけるカンピロバクター検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、カンピロバクターの増幅対象領域１６Ｓ ｒＤＮＡ（２６３ｂｐ）のみが増幅されており、非増幅対象領域の増幅は、行われていなかった。
(Example 18) Annealing temperature: Melting temperature-0 ° C
The experiment was performed in the same manner as in Reference Example 8 except that the annealing temperature in PCR was set to 72 ° C., that is, the temperature of the lower melting temperature of the forward primer or the reverse primer (Tm−0 ° C.). The result is shown in FIG.
In the same figure, when PCR was performed using the primer for detection of Campylobacter in the present example and using the lower melting temperature of the forward primer or reverse primer as the annealing temperature, only the amplification target region 16S rDNA (263 bp) of Campylobacter was used. Was amplified, and the non-amplification target region was not amplified.
（４）大腸菌検出用プライマー
（参考例１１）アニーリング温度：融解温度−２０℃
増幅対象生物として食中毒菌である大腸菌を選択し、大腸菌の塩基配列から条件Ａを満たす、増幅対象領域ｐｙｒＨ（ウリジンモノリン酸キナーゼ遺伝子，１５７ｂｐ）を増幅するプライマーセットを設計し、アニーリング温度を５７℃とした点以外は、参考例２と同様にして実験を行った。このプライマーセットは、図３２の参考例１１に示すように、フォワードプライマー（配列番号３１）及びリバースプライマー（配列番号３２）からなっている。参考例１２，１３、及び実施例１９，２０においてもこのプライマーセットを使用して、実験を行った。その結果を図３８に示す。
同図において、本参考例における大腸菌検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度−２０℃をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、大腸菌における非増幅対象領域が増幅されており、非特異的増幅が行われていることがわかる。
(4) Primer for detecting E. coli (Reference Example 11) Annealing temperature: melting temperature -20 ° C
E. coli, which is a food poisoning bacterium, is selected as an amplification target organism, a primer set for amplifying the amplification target region pyrH (uridine monophosphate kinase gene, 157 bp) that satisfies the condition A from the base sequence of E. coli is designed, and the annealing temperature is 57 ° C. The experiment was performed in the same manner as in Reference Example 2 except for the points described above. This primer set consists of a forward primer (SEQ ID NO: 31) and a reverse primer (SEQ ID NO: 32) as shown in Reference Example 11 of FIG. In Reference Examples 12 and 13 and Examples 19 and 20, experiments were also performed using this primer set. The result is shown in FIG.
In the same figure, when PCR was carried out using the primer for detection of E. coli in this Reference Example with an annealing temperature of −20 ° C., which is the lower melting temperature of the forward primer or reverse primer, the non-amplification target region in E. coli was amplified. It can be seen that non-specific amplification is performed.
（参考例１２）アニーリング温度：融解温度−１５℃
ＰＣＲにおけるアニーリング温度を６２℃、すなわちフォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度から１５℃低い温度（Ｔｍ−１５℃）に設定した点以外は、参考例１１と同様にして実験を行った。その結果を図３８に示す。
同図において、本参考例における大腸菌検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度−１５℃をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、大腸菌における非増幅対象領域が増幅されており、非特異的増幅が行われていることがわかる。
(Reference Example 12) Annealing temperature: Melting temperature -15 ° C
The experiment was performed in the same manner as in Reference Example 11 except that the annealing temperature in PCR was set to 62 ° C., that is, a temperature lower by 15 ° C. (Tm−15 ° C.) than the lower melting temperature of the forward primer or reverse primer. It was. The result is shown in FIG.
In the same figure, when PCR was carried out using the primer for detection of E. coli in this Reference Example with an annealing temperature of -15 ° C, which is the lower melting point of the forward primer or reverse primer, the non-amplification target region in E. coli was amplified. It can be seen that non-specific amplification is performed.
（参考例１３）アニーリング温度：融解温度−１０℃
ＰＣＲにおけるアニーリング温度を６７℃、すなわちフォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度から１０℃低い温度（Ｔｍ−１０℃）に設定した点以外は、参考例１１と同様にして実験を行った。その結果を図３８に示す。
同図において、本参考例における大腸菌検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度−１０℃をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、大腸菌の増幅対象領域ｐｙｒＨ（１５７ｂｐ）のみが増幅されており、非増幅対象領域の増幅は、行われていなかった。
(Reference Example 13) Annealing temperature: Melting temperature −10 ° C.
The experiment was conducted in the same manner as in Reference Example 11 except that the annealing temperature in PCR was set to 67 ° C., that is, a temperature lower by 10 ° C. (Tm−10 ° C.) than the lower melting temperature of the forward primer or reverse primer. It was. The result is shown in FIG.
In the same figure, when PCR was carried out using the primer for detection of E. coli in this Reference Example with an annealing temperature of −10 ° C. which is the lower melting temperature of the forward primer or reverse primer, the amplification target region pyrH (157 bp) of E. coli was used. ) Only was amplified, and the non-amplification target region was not amplified.
（実施例１９）アニーリング温度：融解温度−５℃
ＰＣＲにおけるアニーリング温度を７２℃、すなわちフォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度から５℃低い温度（Ｔｍ−５℃）に設定した点以外は、参考例１１と同様にして実験を行った。その結果を図３８に示す。
同図において、本実施例における大腸菌検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度−５℃をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、大腸菌の増幅対象領域ｐｙｒＨ（１５７ｂｐ）のみが増幅されており、非増幅対象領域の増幅は、行われていなかった。
(Example 19) Annealing temperature: Melting temperature -5 ° C
The experiment was conducted in the same manner as in Reference Example 11 except that the annealing temperature in PCR was set to 72 ° C., that is, a temperature lower by 5 ° C. (Tm−5 ° C.) than the lower melting temperature of the forward primer or reverse primer. It was. The result is shown in FIG.
In the same figure, when PCR was carried out using the primer for detection of E. coli in the present example and the annealing temperature of −5 ° C. which is the lower melting point of the forward primer or the reverse primer, the amplification target region pyrH (157 bp) of E. coli was used. ) Only was amplified, and the non-amplification target region was not amplified.
（実施例２０）アニーリング温度：融解温度−０℃
ＰＣＲにおけるアニーリング温度を７７℃、すなわちフォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度（Ｔｍ−０℃）に設定した点以外は、参考例１１と同様にして実験を行った。その結果を図３８に示す。
同図において、本実施例における大腸菌検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、大腸菌の増幅対象領域ｐｙｒＨ（１５７ｂｐ）のみが増幅されており、非増幅対象領域の増幅は、行われていなかった。
(Example 20) Annealing temperature: Melting temperature-0 ° C
Experiments were performed in the same manner as in Reference Example 11 except that the annealing temperature in PCR was set to 77 ° C., that is, the temperature of the lower melting temperature of the forward primer or reverse primer (Tm−0 ° C.). The result is shown in FIG.
In the same figure, when PCR was carried out using the primer for detection of E. coli in the present example and the annealing temperature as the lower melting temperature of the forward primer or the reverse primer, only the amplification target region pyrH (157 bp) of E. coli was found. Amplified, and the non-amplification target region was not amplified.
（５）リステリア検出用プライマー
（参考例１４）アニーリング温度：融解温度−２０℃
増幅対象生物として参考例２における供試菌株４のリステリアを選択し、リステリアの塩基配列から条件Ａを満たす、増幅対象領域ｄｎａＪ（ヒートショックタンパク遺伝子，１７６ｂｐ）を増幅するプライマーセットを設計し、アニーリング温度を５４℃とした点以外は、参考例２と同様にして実験を行った。このプライマーセットは、図３３の参考例１４に示すように、フォワードプライマー（配列番号３５）及びリバースプライマー（配列番号３６）からなっている。参考例１５，１６、及び実施例２１，２２においてもこのプライマーセットを使用して、実験を行った。その結果を図３９に示す。
同図において、本参考例におけるリステリア検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度−２０℃をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、大腸菌における非増幅対象領域が増幅されており、非特異的増幅が行われていることがわかる。
(5) Primer for Listeria detection (Reference Example 14) Annealing temperature: Melting temperature -20 ° C
Select Listeria of test strain 4 in Reference Example 2 as an amplification target organism, design a primer set that amplifies the amplification target region dnaJ (heat shock protein gene, 176 bp) satisfying condition A from the base sequence of Listeria, and annealing The experiment was performed in the same manner as in Reference Example 2 except that the temperature was 54 ° C. This primer set consists of a forward primer (SEQ ID NO: 35) and a reverse primer (SEQ ID NO: 36) as shown in Reference Example 14 of FIG. In Reference Examples 15 and 16, and Examples 21 and 22, experiments were also performed using this primer set. The result is shown in FIG.
In the same figure, when PCR was performed using the primer for detection of Listeria in this Reference Example with an annealing temperature of −20 ° C. which is the lower melting temperature of the forward primer or the reverse primer, the non-amplification target region in E. coli was amplified. It can be seen that non-specific amplification is performed.
（参考例１５）アニーリング温度：融解温度−１５℃
ＰＣＲにおけるアニーリング温度を５９℃、すなわちフォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度から１５℃低い温度（Ｔｍ−１５℃）に設定した点以外は、参考例１４と同様にして実験を行った。その結果を図３９に示す。
同図において、本参考例におけるリステリア検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度−１５℃をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、リステリアの増幅対象領域ｄｎａＪ（１７６ｂｐ）のみが増幅されており、非増幅対象領域の増幅は、行われていなかった。
(Reference Example 15) Annealing temperature: Melting temperature -15 ° C
The experiment was conducted in the same manner as in Reference Example 14 except that the annealing temperature in PCR was set to 59 ° C., that is, a temperature lower by 15 ° C. (Tm−15 ° C.) than the lower melting temperature of the forward primer or reverse primer. It was. The result is shown in FIG.
In the same figure, when PCR was carried out using the primer for detection of Listeria in the present Reference Example with an annealing temperature of −15 ° C., which is the lower melting point of the forward primer or the reverse primer, the region to be amplified for Listeria dnaJ (176 bp) ) Only was amplified, and the non-amplification target region was not amplified.
（参考例１６）アニーリング温度：融解温度−１０℃
ＰＣＲにおけるアニーリング温度を６４℃、すなわちフォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度から１０℃低い温度（Ｔｍ−１０℃）に設定した点以外は、参考例１４と同様にして実験を行った。その結果を図３９に示す。
同図において、本参考例におけるリステリア検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度−１０℃をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、リステリアの増幅対象領域ｄｎａＪ（１７６ｂｐ）のみが増幅されており、非増幅対象領域の増幅は、行われていなかった。
(Reference Example 16) Annealing temperature: Melting temperature −10 ° C.
The experiment was conducted in the same manner as in Reference Example 14 except that the annealing temperature in PCR was set to 64 ° C., that is, a temperature lower by 10 ° C. (Tm−10 ° C.) than the lower melting temperature of the forward primer or reverse primer. It was. The result is shown in FIG.
In the same figure, when PCR was performed using the primer for detection of Listeria in this Reference Example, with the annealing temperature of −10 ° C. being the lower melting point of the forward primer or the reverse primer, the amplification target region dnaJ (176 bp) of Listeria ) Only was amplified, and the non-amplification target region was not amplified.
（実施例２１）アニーリング温度：融解温度−５℃
ＰＣＲにおけるアニーリング温度を６９℃、すなわちフォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度から５℃低い温度（Ｔｍ−５℃）に設定した点以外は、参考例１４と同様にして実験を行った。その結果を図３９に示す。
同図において、本実施例におけるリステリア検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度−５℃をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、リステリアの増幅対象領域ｄｎａＪ（１７６ｂｐ）のみが増幅されており、非増幅対象領域の増幅は、行われていなかった。
(Example 21) Annealing temperature: Melting temperature -5 ° C
The experiment was conducted in the same manner as in Reference Example 14 except that the annealing temperature in PCR was set to 69 ° C., that is, the temperature lower by 5 ° C. (Tm−5 ° C.) than the lower melting temperature of the forward primer or reverse primer. It was. The result is shown in FIG.
In the same figure, when PCR was carried out using the primer for detection of Listeria in the present example with an annealing temperature of −5 ° C. which is the lower melting temperature of the forward primer or reverse primer, the amplification target region dnaJ (176 bp) of Listeria ) Only was amplified, and the non-amplification target region was not amplified.
（実施例２２）アニーリング温度：融解温度−０℃
ＰＣＲにおけるアニーリング温度を７４℃、すなわちフォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度（Ｔｍ−０℃）に設定した点以外は、参考例１４と同様にして実験を行った。その結果を図３９に示す。
同図において、本実施例におけるリステリア検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、リステリアの増幅対象領域ｄｎａＪ（１７６ｂｐ）のみが増幅されており、非増幅対象領域の増幅は、行われていなかった。
(Example 22) Annealing temperature: Melting temperature-0 ° C
The experiment was performed in the same manner as in Reference Example 14 except that the annealing temperature in PCR was set to 74 ° C., that is, the temperature of the lower melting temperature of the forward primer or reverse primer (Tm−0 ° C.). The result is shown in FIG.
In the same figure, when PCR was performed using the primer for detection of Listeria in the present example with the lower melting temperature of the forward primer or reverse primer as the annealing temperature, only the amplification target region dnaJ (176 bp) of Listeria was present. Amplified, and the non-amplification target region was not amplified.
（６）サルモネラ検出用プライマー
（参考例１７）アニーリング温度：融解温度−２０℃
増幅対象生物として参考例２における供試菌株５のサルモネラを選択し、サルモネラの塩基配列から条件Ａを満たす、増幅対象領域ｉｎｖＡ（侵入性因子関連遺伝子，１８０ｂｐ）を増幅するプライマーセットを設計した点以外は、参考例２と同様にして実験を行った。このプライマーセットは、図３３の参考例１７に示すように、フォワードプライマー（配列番号３９）及びリバースプライマー（配列番号４０）からなっている。参考例１８，１９、及び実施例２３，２４においてもこのプライマーセットを使用して、実験を行った。アニーリング温度は５３℃とした。その結果を図４０に示す。
同図において、本参考例におけるサルモネラ検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度−２０℃をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、大腸菌における非増幅対象領域が増幅されており、非特異的増幅が行われていることがわかる。
(6) Salmonella detection primer (Reference Example 17) Annealing temperature: melting temperature -20 ° C
A point of designing a primer set that amplifies the amplification target region invA (invasive factor-related gene, 180 bp) satisfying the condition A from the base sequence of Salmonella, selecting Salmonella of test strain 5 in Reference Example 2 as the amplification target organism The experiment was performed in the same manner as Reference Example 2 except for the above. This primer set is composed of a forward primer (SEQ ID NO: 39) and a reverse primer (SEQ ID NO: 40) as shown in Reference Example 17 in FIG. In Reference Examples 18 and 19 and Examples 23 and 24, experiments were performed using this primer set. The annealing temperature was 53 ° C. The result is shown in FIG.
In the same figure, when PCR was performed using the Salmonella detection primer in this Reference Example with an annealing temperature of −20 ° C., which is the lower melting temperature of the forward primer or the reverse primer, the non-amplification target region in E. coli was amplified. It can be seen that non-specific amplification is performed.
（参考例１８）アニーリング温度：融解温度−１５℃
ＰＣＲにおけるアニーリング温度を５８℃、すなわちフォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度から１５℃低い温度（Ｔｍ−１５℃）に設定した点以外は、参考例１７と同様にして実験を行った。その結果を図４０に示す。
同図において、本参考例におけるサルモネラ検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度−１５℃をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、大腸菌における非増幅対象領域が増幅されており、非特異的増幅が行われていることがわかる。
(Reference Example 18) Annealing temperature: Melting temperature -15 ° C
The experiment was conducted in the same manner as in Reference Example 17 except that the annealing temperature in PCR was set to 58 ° C., that is, a temperature lower by 15 ° C. (Tm−15 ° C.) than the lower melting temperature of the forward primer or reverse primer. It was. The result is shown in FIG.
In the same figure, when PCR was performed using the Salmonella detection primer in this reference example with an annealing temperature of −15 ° C. which is the lower melting temperature of the forward primer or the reverse primer, the non-amplification target region in E. coli was amplified. It can be seen that non-specific amplification is performed.
（参考例１９）アニーリング温度：融解温度−１０℃
ＰＣＲにおけるアニーリング温度を６３℃、すなわちフォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度から１０℃低い温度（Ｔｍ−１０℃）に設定した点以外は、参考例１７と同様にして実験を行った。その結果を図４０に示す。
同図において、本参考例におけるサルモネラ検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度−１０℃をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、サルモネラ及び黄色ブドウ球菌における非増幅対象領域が増幅されており、非特異的増幅が行われていることがわかる。
(Reference Example 19) Annealing temperature: Melting temperature −10 ° C.
The experiment was conducted in the same manner as in Reference Example 17 except that the annealing temperature in PCR was set to 63 ° C., that is, a temperature lower than the melting temperature of the forward primer or reverse primer by 10 ° C. (Tm−10 ° C.). It was. The result is shown in FIG.
In the same figure, when PCR was performed using the Salmonella detection primer in this Reference Example, with the annealing temperature of -10 ° C, which is the lower melting point of the forward primer or reverse primer, non-amplification in Salmonella and Staphylococcus aureus It can be seen that the target region is amplified and non-specific amplification is performed.
（実施例２３）アニーリング温度：融解温度−５℃
ＰＣＲにおけるアニーリング温度を６８℃、すなわちフォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度から５℃低い温度（Ｔｍ−５℃）に設定した点以外は、参考例１７と同様にして実験を行った。その結果を図４０に示す。
同図において、本実施例におけるサルモネラ検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度−５℃をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、サルモネラの増幅対象領域ｉｎｖＡ（１８０ｂｐ）のみが増幅されており、非増幅対象領域の増幅は、行われていなかった。
(Example 23) Annealing temperature: Melting temperature -5 ° C
The experiment was carried out in the same manner as in Reference Example 17 except that the annealing temperature in PCR was set to 68 ° C., that is, a temperature lower by 5 ° C. (Tm−5 ° C.) than the lower melting temperature of the forward primer or reverse primer. It was. The result is shown in FIG.
In the same figure, when PCR was performed using the primer for detecting Salmonella in this example, with the annealing temperature of −5 ° C. which is the lower melting point of the forward primer or reverse primer, the amplification target region invA (180 bp) of Salmonella ) Only was amplified, and the non-amplification target region was not amplified.
（実施例２４）アニーリング温度：融解温度−０℃
ＰＣＲにおけるアニーリング温度を７３℃、すなわちフォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度（Ｔｍ−０℃）に設定した点以外は、参考例１７と同様にして実験を行った。その結果を図４０に示す。
同図において、本実施例におけるサルモネラ検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、サルモネラの増幅対象領域ｉｎｖＡ（１８０ｂｐ）のみが増幅されており、非増幅対象領域の増幅は、行われていなかった。
(Example 24) Annealing temperature: Melting temperature-0 ° C
The experiment was conducted in the same manner as in Reference Example 17 except that the annealing temperature in PCR was set to 73 ° C., that is, the lower melting temperature of the forward primer or reverse primer (Tm−0 ° C.). The result is shown in FIG.
In the same figure, when PCR was performed using the Salmonella detection primer in the present example with the lower melting temperature of the forward primer or reverse primer as the annealing temperature, only the Salmonella amplification target region invA (180 bp) was present. Amplified, and the non-amplification target region was not amplified.
（７）黄色ブドウ球菌検出用プライマー
（参考例２０）アニーリング温度：融解温度−２０℃
増幅対象生物として参考例１における供試菌株６の黄色ブドウ球菌を選択し、黄色ブドウ球菌の塩基配列から条件Ａを満たす、増幅対象領域ｄｎａＪ（ヒートショックタンパク遺伝子，２３６ｂｐ）を増幅するプライマーセットを設計した点以外は、参考例２と同様にして実験を行った。このプライマーセットは、図３４の参考例２０に示すように、フォワードプライマー（配列番号４３）及びリバースプライマー（配列番号４４）からなっている。参考例２１，２２、及び実施例２５，２６においてもこのプライマーセットを使用して、実験を行った。アニーリング温度は５３℃とした。その結果を図４１に示す。
同図において、本参考例における黄色ブドウ球菌検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度−２０℃をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、黄色ブドウ球菌の増幅対象領域ｄｎａＪ（２３６ｂｐ）のみが増幅されており、非増幅対象領域の増幅は、行われていなかった。
(7) Primer for detecting Staphylococcus aureus (Reference Example 20) Annealing temperature: melting temperature -20 ° C
A primer set for amplifying the amplification target region dnaJ (heat shock protein gene, 236 bp) satisfying the condition A from the base sequence of S. aureus by selecting S. aureus of the test strain 6 in Reference Example 1 as an amplification target organism The experiment was performed in the same manner as Reference Example 2 except for the designed points. This primer set consists of a forward primer (SEQ ID NO: 43) and a reverse primer (SEQ ID NO: 44) as shown in Reference Example 20 of FIG. In Reference Examples 21 and 22 and Examples 25 and 26, experiments were performed using this primer set. The annealing temperature was 53 ° C. The result is shown in FIG.
In the same figure, when PCR is performed using the primer for detecting S. aureus in this Reference Example, with the annealing temperature of -20 ° C. which is the lower melting point of the forward primer or the reverse primer, the target for amplification of S. aureus Only the region dnaJ (236 bp) was amplified, and the non-amplification target region was not amplified.
（参考例２１）アニーリング温度：融解温度−１５℃
ＰＣＲにおけるアニーリング温度を５８℃、すなわちフォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度から１５℃低い温度（Ｔｍ−１５℃）に設定した点以外は、参考例２０と同様にして実験を行った。その結果を図４１に示す。
同図において、本参考例における黄色ブドウ球菌検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度−１５℃をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、黄色ブドウ球菌の増幅対象領域ｄｎａＪ（２３６ｂｐ）のみが増幅されており、非増幅対象領域の増幅は、行われていなかった。
(Reference Example 21) Annealing temperature: Melting temperature -15 ° C
The experiment was conducted in the same manner as in Reference Example 20, except that the annealing temperature in PCR was set to 58 ° C, that is, the temperature lower than the melting temperature of the forward primer or reverse primer by 15 ° C (Tm-15 ° C). It was. The result is shown in FIG.
In the same figure, when PCR is performed using the primer for detecting S. aureus in the present reference example, with the annealing temperature of −15 ° C. which is the lower melting temperature of the forward primer or the reverse primer, the target for amplification of S. aureus Only the region dnaJ (236 bp) was amplified, and the non-amplification target region was not amplified.
（参考例２２）アニーリング温度：融解温度−１０℃
ＰＣＲにおけるアニーリング温度を６３℃、すなわちフォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度から１０℃低い温度（Ｔｍ−１０℃）に設定した点以外は、参考例２０と同様にして実験を行った。その結果を図４１に示す。
同図において、本参考例における黄色ブドウ球菌検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度−１０℃をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、黄色ブドウ球菌の増幅対象領域ｄｎａＪ（２３６ｂｐ）のみが増幅されており、非増幅対象領域の増幅は、行われていなかった。
(Reference Example 22) Annealing temperature: Melting temperature −10 ° C.
The experiment was carried out in the same manner as in Reference Example 20, except that the annealing temperature in PCR was set to 63 ° C., that is, a temperature lower by 10 ° C. (Tm−10 ° C.) than the lower melting temperature of the forward primer or reverse primer. It was. The result is shown in FIG.
In the same figure, when PCR is performed using the primer for detecting S. aureus in this Reference Example, with the annealing temperature of -10 ° C, which is the lower melting temperature of the forward primer or the reverse primer, the target for amplification of S. aureus Only the region dnaJ (236 bp) was amplified, and the non-amplification target region was not amplified.
（実施例２５）アニーリング温度：融解温度−５℃
ＰＣＲにおけるアニーリング温度を６８℃、すなわちフォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度から５℃低い温度（Ｔｍ−５℃）に設定した点以外は、参考例２０と同様にして実験を行った。その結果を図４１に示す。
同図において、本実施例における黄色ブドウ球菌検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度−５℃をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、黄色ブドウ球菌の増幅対象領域ｄｎａＪ（２３６ｂｐ）のみが増幅されており、非増幅対象領域の増幅は、行われていなかった。
(Example 25) Annealing temperature: Melting temperature -5 ° C
The experiment was conducted in the same manner as in Reference Example 20, except that the annealing temperature in PCR was set to 68 ° C., that is, the temperature lower by 5 ° C. (Tm−5 ° C.) than the lower melting temperature of the forward primer or reverse primer. It was. The result is shown in FIG.
In the same figure, when PCR is carried out using the primer for detecting S. aureus in this example, the annealing temperature of -5 ° C., which is the lower melting temperature of the forward primer or the reverse primer, the target for amplification of S. aureus Only the region dnaJ (236 bp) was amplified, and the non-amplification target region was not amplified.
（実施例２６）アニーリング温度：融解温度−０℃
ＰＣＲにおけるアニーリング温度を７３℃、すなわちフォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度（Ｔｍ−０℃）に設定した点以外は、参考例２０と同様にして実験を行った。その結果を図４１に示す。
同図において、本実施例における黄色ブドウ球菌検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、黄色ブドウ球菌の増幅対象領域ｄｎａＪ（２３６ｂｐ）のみが増幅されており、非増幅対象領域の増幅は、行われていなかった。
(Example 26) Annealing temperature: Melting temperature-0 ° C
The experiment was performed in the same manner as in Reference Example 20 except that the annealing temperature in PCR was set to 73 ° C., that is, the temperature of the lower melting temperature of the forward primer or the reverse primer (Tm−0 ° C.). The result is shown in FIG.
In the same figure, when PCR was performed using the primer for detecting S. aureus in the present example and the annealing temperature as the lower melting temperature of the forward primer or the reverse primer, the amplification target region dnaJ ( Only 236 bp) was amplified, and the non-amplification target region was not amplified.
（８）ビブリオ検出用プライマー
（参考例２３）アニーリング温度：融解温度−２０℃
増幅対象生物として参考例２における供試菌株７のビブリオを選択し、ビブリオの塩基配列から条件Ａを満たす、増幅対象領域ｔｄｈ（耐熱性溶血毒素遺伝子，３８０ｂｐ）を増幅するプライマーセットを設計した点以外は、参考例２と同様にして実験を行った。このプライマーセットは、図３４の参考例２３に示すように、フォワードプライマー（配列番号４７）及びリバースプライマー（配列番号４８）からなっている。参考例２４，２５、及び実施例２７，２８においてもこのプライマーセットを使用して、実験を行った。アニーリング温度は５３℃とした。その結果を図４２に示す。
同図において、本参考例におけるビブリオ検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度−２０℃をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、全ての非増幅対象生物における非増幅対象領域が増幅されており、非特異的増幅が行われていることがわかる。
(8) Vibrio detection primer (Reference Example 23) Annealing temperature: Melting temperature -20 ° C
The vibrio of the test strain 7 in Reference Example 2 was selected as the amplification target organism, and a primer set for amplifying the amplification target region tdh (heat-stable hemolytic toxin gene, 380 bp) satisfying the condition A from the base sequence of Vibrio was designed. The experiment was performed in the same manner as Reference Example 2 except for the above. As shown in Reference Example 23 of FIG. 34, this primer set consists of a forward primer (SEQ ID NO: 47) and a reverse primer (SEQ ID NO: 48). In Reference Examples 24 and 25 and Examples 27 and 28, experiments were performed using this primer set. The annealing temperature was 53 ° C. The result is shown in FIG.
In the same figure, when PCR was performed using the Vibrio detection primer in the present reference example with an annealing temperature of −20 ° C., which is the lower melting temperature of the forward primer or the reverse primer, non-amplification in all non-amplification target organisms. It can be seen that the amplification target region is amplified and nonspecific amplification is performed.
（参考例２４）アニーリング温度：融解温度−１５℃
ＰＣＲにおけるアニーリング温度を５８℃、すなわちフォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度から１５℃低い温度（Ｔｍ−１５℃）に設定した点以外は、参考例２３と同様にして実験を行った。その結果を図４２に示す。
同図において、本参考例におけるビブリオ検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度−１５℃をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、全ての非増幅対象生物における非増幅対象領域が増幅されており、非特異的増幅が行われていることがわかる。
(Reference Example 24) Annealing temperature: Melting temperature -15 ° C
The experiment was performed in the same manner as in Reference Example 23 except that the annealing temperature in PCR was set to 58 ° C., that is, the temperature lower than the melting temperature of the forward primer or reverse primer by 15 ° C. (Tm−15 ° C.). It was. The result is shown in FIG.
In the same figure, when PCR was performed using the Vibrio detection primer in this Reference Example, with the annealing temperature of -15 ° C, which is the lower melting point of the forward primer or reverse primer, non-amplification in all non-amplification target organisms. It can be seen that the amplification target region is amplified and nonspecific amplification is performed.
（参考例２５）アニーリング温度：融解温度−１０℃
ＰＣＲにおけるアニーリング温度を６３℃、すなわちフォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度から１０℃低い温度（Ｔｍ−１０℃）に設定した点以外は、参考例２３と同様にして実験を行った。その結果を図４２に示す。
同図において、本参考例におけるビブリオ検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度−１０℃をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、セレウスを除く全ての非増幅対象生物における非増幅対象領域が増幅されており、非特異的増幅が行われていることがわかる。
(Reference Example 25) Annealing temperature: Melting temperature −10 ° C.
The experiment was performed in the same manner as in Reference Example 23, except that the annealing temperature in PCR was set to 63 ° C., that is, the temperature lower than the melting temperature of the forward primer or reverse primer by 10 ° C. (Tm−10 ° C.) It was. The result is shown in FIG.
In the same figure, when PCR was performed using the Vibrio detection primer in this reference example, with the annealing temperature of -10 ° C, which is the lower melting temperature of the forward primer or the reverse primer, all non-amplification objects except Cereus It can be seen that the non-amplification target region in the organism is amplified and non-specific amplification is performed.
（実施例２７）アニーリング温度：融解温度−５℃
ＰＣＲにおけるアニーリング温度を６８℃、すなわちフォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度から５℃低い温度（Ｔｍ−５℃）に設定した点以外は、参考例２３と同様にして実験を行った。その結果を図４２に示す。
同図において、本実施例におけるビブリオ検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度−５℃をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、ビブリオの増幅対象領域ｔｄｈ（３８０ｂｐ）のみが増幅されており、非増幅対象領域の増幅は、行われていなかった。
(Example 27) Annealing temperature: Melting temperature -5 ° C
The experiment was conducted in the same manner as in Reference Example 23 except that the annealing temperature in PCR was set to 68 ° C., that is, a temperature lower by 5 ° C. (Tm−5 ° C.) than the lower melting temperature of the forward primer or reverse primer. It was. The result is shown in FIG.
In the same figure, when PCR was performed using the Vibrio detection primer in the present example with an annealing temperature of −5 ° C. which is the lower melting temperature of the forward primer or the reverse primer, the amplification target region tdh (380 bp) of Vibrio ) Only was amplified, and the non-amplification target region was not amplified.
（実施例２８）アニーリング温度：融解温度−０℃
ＰＣＲにおけるアニーリング温度を７２℃、すなわちフォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度（Ｔｍ−０℃）に設定した点以外は、参考例２３と同様にして実験を行った。その結果を図４２に示す。
同図において、本実施例におけるビブリオ検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、ビブリオの増幅対象領域ｔｄｈ（３８０ｂｐ）のみが増幅されており、非増幅対象領域の増幅は、行われていなかった。
(Example 28) Annealing temperature: Melting temperature-0 ° C
The experiment was conducted in the same manner as in Reference Example 23, except that the annealing temperature in PCR was set to 72 ° C., that is, the lower melting temperature of the forward primer or reverse primer (Tm−0 ° C.). The result is shown in FIG.
In the same figure, when PCR was performed using the Vibrio detection primer in the present example with the lower melting temperature of the forward primer or reverse primer as the annealing temperature, only the amplification target region tdh (380 bp) of Vibrio was present. Amplified, and the non-amplification target region was not amplified.
以上の結果から、アニーリング温度を、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度から０〜５℃低い温度に設定して、ＰＣＲを行うことで、増幅対象領域の増幅の特異性が向上することがわかる。 From the above results, PCR is performed with the annealing temperature set to a temperature 0 to 5 ° C lower than the lower melting temperature of the forward primer or reverse primer, thereby improving the amplification specificity of the amplification target region. I understand that
＜実験５：本発明におけるマルチプレックスＰＣＲ法における単独菌での増幅試験に関して＞
本発明のプライマーの作製方法及びプライマーの設計方法にもとづき作製したプライマーセットを複数同時に用いるとともに、増幅対象生物を単独として、その増幅対象領域を特異的に増幅できるかを検証した。
<Experiment 5: Regarding Amplification Test with Single Bacteria in Multiplex PCR Method in the Present Invention>
A plurality of primer sets prepared based on the primer preparation method and primer design method of the present invention were used simultaneously, and it was verified whether the amplification target region could be specifically amplified with the amplification target organism alone.
（実施例２９）
まず、本発明のプライマーの作製方法及びプライマーの設計方法にもとづいて、図４３に示すプライマーセットを設計した。すなわち、配列番号６１のフォワードプライマー及び配列番号６２のリバースプライマーとからなる、セレウスにおける増幅対象領域ｎｈｅ（溶血活性を示さないエンテロトキシン分泌遺伝子，１９５ｂｐ）を増幅するプライマーセット１、配列番号６３のフォワードプライマー及び配列番号６４のリバースプライマーとからなる、セレウスにおける増幅対象領域ｃｅｓＢ（セレウリド合成酵素遺伝子，２３８ｂｐ）を増幅するプライマーセット２、配列番号６５のフォワードプライマー及び配列番号６６のリバースプライマーとからなる、カンピロバクターにおける増幅対象領域１６Ｓ ｒＤＮＡ（リボソーム遺伝子，２６３ｂｐ）を増幅するプライマーセット３、配列番号６７のフォワードプライマー及び配列番号６８のリバースプライマーとからなる、大腸菌における増幅対象領域ｐｙｒＨ（ウリジンモノリン酸キナーゼ遺伝子，１５７ｂｐ）を増幅するプライマーセット４、配列番号６９のフォワードプライマー及び配列番号７０のリバースプライマーとからなる、リステリアにおける増幅対象領域ｄｎａＪ（ヒートショックタンパク遺伝子，１７６ｂｐ）を増幅するプライマーセット５、配列番号７１のフォワードプライマー及び配列番号７２のリバースプライマーとからなる、サルモネラにおける増幅対象領域ｉｎｖＡ（侵入性因子関連遺伝子，１８０ｂｐ）を増幅するプライマーセット６、配列番号７３のフォワードプライマー及び配列番号７４のリバースプライマーとからなる、黄色ブドウ球菌における増幅対象領域ｄｎａＪ（ヒートショックタンパク遺伝子，２３６ｂｐ）を増幅するプライマーセット７、配列番号７５のフォワードプライマー及び配列番号７６のリバースプライマーとからなる、ビブリオにおける増幅対象領域ｔｄｈ（耐熱性溶血毒素遺伝子，３８０ｂｐ）を増幅するプライマーセット８を設計した。また、図４３において、これらのプライマーセットを用いた場合の各増幅産物の理論上の塩基配列の長さを示している。
(Example 29)
First, the primer set shown in FIG. 43 was designed based on the primer production method and primer design method of the present invention. That is, a primer set 1 for amplifying the amplification target region nhe (enterotoxin secretion gene not showing hemolytic activity, 195 bp) in Cereus, comprising a forward primer of SEQ ID NO: 61 and a reverse primer of SEQ ID NO: 62, a forward primer of SEQ ID NO: 63 And a reverse primer of SEQ ID NO: 64, comprising a primer set 2 for amplifying an amplification target region cesB (Cereulide synthase gene, 238 bp) in Cereus, a forward primer of SEQ ID NO: 65, and a reverse primer of SEQ ID NO: 66 A primer set 3 for amplifying the amplification target region 16S rDNA (ribosome gene, 263 bp), a forward primer of SEQ ID NO: 67 and a reverse primer of SEQ ID NO: 68 Amplification target region dnaJ in Listeria comprising primer set 4 for amplifying amplification target region pyrH (uridine monophosphate kinase gene, 157 bp) in E. coli, forward primer of SEQ ID NO: 69 and reverse primer of SEQ ID NO: 70 (A heat shock protein gene, 176 bp) amplifying the amplification target region invA (invasion factor-related gene, 180 bp) in Salmonella comprising primer set 5 for amplifying, forward primer of SEQ ID NO: 71 and reverse primer of SEQ ID NO: 72 Amplification target region dnaJ (heat shock protein gene, 23) in S. aureus, comprising primer set 6, forward primer of SEQ ID NO: 73 and reverse primer of SEQ ID NO: 74 a primer set 8 for amplifying the amplification target region tdh (heat-stable hemolysin toxin gene, 380 bp) in Vibrio, comprising a primer set 7 for amplifying (bp), a forward primer of SEQ ID NO: 75, and a reverse primer of SEQ ID NO: 76 . In addition, FIG. 43 shows the theoretical base sequence length of each amplification product when these primer sets are used.
これらのプライマーセットは、フォワードプライマー及びリバースプライマーの少なくとも一方が、当該対象生物の非増幅対象領域や他の増幅対象生物及び所定の非増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列と、１２塩基以上連続で重ならない。また、フォワードプライマー及びリバースプライマーの少なくとも一方が、３’末端側半分において、Ｇ又はＣを連続で３塩基以上備える配列を有する、あるいは、フォワードプライマー及びリバースプライマーの少なくとも一方が、それぞれのプライマーの配列の中心から３’末端側及び５’末端側の両方向に向かってプライマーの全長の四分の１の範囲を含む領域に、Ａ又はＴを連続で４塩基以上備える配列を有している。また、フォワードプライマー及びリバースプライマーの融解温度（Ｔｍ値）の差が５℃未満である。さらに、フォワードプライマー及びリバースプライマーの長さが２３〜４１ｍｅｒであり、かつ融解温度が７３〜７８℃となっている。 In these primer sets, at least one of the forward primer and the reverse primer overlaps with the non-amplification target region of the target organism, the other amplification target organism and the DNA base sequence of the predetermined non-amplification target organism in a continuous manner of 12 bases or more. Don't be. In addition, at least one of the forward primer and the reverse primer has a sequence having 3 or more bases of G or C in the 3 ′ end half, or at least one of the forward primer and the reverse primer is a sequence of each primer. Has a sequence comprising 4 or more bases of A or T in a region including a range of a quarter of the total length of the primer in both the 3 ′ end side and the 5 ′ end side from the center. Moreover, the difference of the melting temperature (Tm value) of a forward primer and a reverse primer is less than 5 degreeC. Furthermore, the lengths of the forward primer and the reverse primer are 23 to 41 mer, and the melting temperature is 73 to 78 ° C.
また、上記プライマーセット１〜８の設計にあたり、それぞれ順に対応する番号の以下の食中毒菌を増幅対象生物にすると共に、他の食中毒菌を非増幅対象生物として使用した。
１．セレウス（Bacillus cereus NBRC 15305）
２．セレウス（Bacillus cereus TIFT 114011）
３．カンピロバクター（Campylobacter coli ATCC 43478）
４．大腸菌（Escherichia coli NBRC 102203）
５．リステリア（Listeria monocytogenes ATCC 15313）
６．サルモネラ（Salmonella enterica ATCC 9270）
７．黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus NBRC 100910）
８．ビブリオ（Vibrio parahaemolyticus RIMD 2210050）
In designing the primer sets 1 to 8, the following food poisoning bacteria having the corresponding numbers were sequentially used as amplification target organisms, and other food poisoning bacteria were used as non-amplification target organisms.
1. Cereus (Bacillus cereus NBRC 15305)
2. Cereus (Bacillus cereus TIFT 114011)
3. Campylobacter coli (ATCC 43478)
4). Escherichia coli NBRC 102203
5. Listeria monocytogenes ATCC 15313
6). Salmonella (Salmonella enterica ATCC 9270)
7). Staphylococcus aureus NBRC 100910
8). Vibrio (Vibrio parahaemolyticus RIMD 2210050)
次に、実施例１と同様に、設計したプライマーセットを、ライフテクノロジージャパン株式会社によって人工合成を行うことで作製した。
次に、ＰＣＲ用反応液として、上記プライマーセット１〜８を全て含有させ、以下の組成のものを作製した。
・緩衝液 10×Ex Taq buffer（20mM Mg 2＋ plus） 2.0μl
・核酸合成基質 dNTP Mixture（dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2.5mM） 1.6μl
・ビブリオ検出用primer R（10ng/μl、final conc.4ng） 0.4μl
・ビブリオ検出用primer F（10ng/μl、final conc.4ng） 0.4μl
・その他のprimer R（10ng/μl、final conc.2ng） 0.2μl×7
・その他のprimer F（10ng/μl、final conc.2ng） 0.2μl×7
・核酸合成酵素 EX Taq（5U/μl） 0.1μl
・試料のＤＮＡ 1.0μl
・滅菌水 11.7μl
（全量 20μl）
Next, in the same manner as in Example 1, the designed primer set was produced by performing artificial synthesis by Life Technology Japan.
Next, as a reaction solution for PCR, all of the above primer sets 1 to 8 were contained to prepare the following composition.
・ Buffer 10 × Ex Taq buffer (20 mM Mg 2+ plus) 2.0 μl
・ Nucleic acid synthesis substrate dNTP Mixture (2.5 mM each for dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 1.6 μl
・ Primer R for detection of Vibrio (10ng / μl, final conc.4ng) 0.4μl
・ Primer F for detection of Vibrio (10ng / μl, final conc.4ng) 0.4μl
・ Other primer R (10ng / μl, final conc.2ng) 0.2μl × 7
・ Other primer F (10ng / μl, final conc.2ng) 0.2μl × 7
・ Nucleic acid synthase EX Taq (5U / μl) 0.1μl
・ Sample DNA 1.0μl
・ Sterile water 11.7μl
(Total 20 μl)
また、試料のＤＮＡは、次の１〜７に示す食中毒菌のＤＮＡをそれぞれ別個に含有させ、個別にＰＣＲを行った。
１．セレウス（Bacillus cereus TIFT 114011）
２．カンピロバクター（Campylobacter jejuni ATCC 33560）
３．大腸菌（Escherichia coli NBRC 102203）
４．リステリア（Listeria monocytogenes ATCC 15313）
５．サルモネラ（Salmonella enterica ATCC 9270）
６．黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus NBRC 100910）
７．ビブリオ（Vibrio parahaemolyticus GTC 2055）
なお、ビブリオは、次の機関から分譲されたものである。
・GTC 岐阜大学大学院医学系研究科病原体制御分野
Further, the DNA of the sample was separately contained with the DNA of food poisoning bacteria shown in the following 1 to 7, and PCR was performed individually.
1. Cereus (Bacillus cereus TIFT 114011)
2. Campylobacter jejuni ATCC 33560
3. Escherichia coli NBRC 102203
4). Listeria monocytogenes ATCC 15313
5. Salmonella (Salmonella enterica ATCC 9270)
6). Staphylococcus aureus NBRC 100910
7). Vibrio (Vibrio parahaemolyticus GTC 2055)
Vibrio was sold by the following organization.
・ GTC Gifu University Graduate School of Medicine
ＰＣＲ法による遺伝子の増幅は、ｅｐグラジエントｓ（エッペンドルフ株式会社製）を使用して、以下の条件で行った。
（１）９５℃ ２分
（２）９５℃ １０秒（ＤＮＡ鎖の乖離工程）
（３）６８℃ ３０秒（アニーリング工程）
（４）７２℃ ３０秒（ＤＮＡ合成工程）
（５）７２℃ ２分
（２）〜（４）を４０サイクル
Amplification of the gene by the PCR method was performed under the following conditions using an ep gradient s (Eppendorf Co., Ltd.).
(1) 95 ° C for 2 minutes (2) 95 ° C for 10 seconds (DNA strand dissociation step)
(3) 68 ° C. 30 seconds (annealing process)
(4) 72 ° C. for 30 seconds (DNA synthesis step)
(5) 72 ° C. 2 minutes (2) to (4) 40 cycles
次に、実施例１と同様に、ＰＣＲ法による産物を、電気泳動により、それぞれの生物ごとに泳動させ、正しい増幅産物が得られているか否かを確認した。その結果を図４４に示す。
同図において、各試料の生物ごとに、それぞれ以下のピークが示されている。
１．セレウス １９８ｂｐ及び２５２ｂｐ
２．カンピロバクター ２７０ｂｐ
３．大腸菌 １５８ｂｐ
４．リステリア １９５ｂｐ
５．サルモネラ １７７ｂｐ
６．黄色ブドウ球菌 ２３８ｂｐ
７．ビブリオ ３９０ｂｐ
Next, in the same manner as in Example 1, the PCR product was electrophoresed for each organism, and it was confirmed whether or not a correct amplification product was obtained. The result is shown in FIG.
In the figure, the following peaks are shown for each organism of each sample.
1. Cereus 198bp and 252bp
2. Campylobacter 270bp
3. E. coli 158 bp
4). Listeria 195 bp
5. Salmonella 177 bp
6). S. aureus 238bp
7). Vibrio 390bp
ここで、ＰＣＲによる増幅産物を電気泳動した場合、ＭｕｌｔｉＮＡ(株式会社島津製作所製)に用いる試薬などの影響から、理論上の増幅産物の塩基配列と完全には一致せず、近似する値の結果が得られる。
図４４に示す結果は、それぞれの理論上の増幅産物の塩基配列の長さに近似するものであり、それぞれ対象とする食中毒菌の増幅対象領域が増幅されていると考えられる。
Here, when the amplified product by PCR is electrophoresed, due to the influence of reagents used for MultiNA (manufactured by Shimadzu Corporation), the result is an approximate value that does not completely match the theoretical base sequence of the amplified product Is obtained.
The result shown in FIG. 44 approximates the length of the base sequence of each theoretical amplification product, and it is considered that the amplification target region of each food poisoning bacterium is amplified.
このように、本発明のプライマーの作製方法及びプライマーの設計方法にもとづき作製したプライマーセットを複数同時に用いた場合でも、それぞれ対象とする食中毒菌の増幅対象領域をそれぞれ個別に特異的に増幅できることが明らかとなった。
なお、リステリアの増幅産物は１９５ｂｐとなっており、理論上の増幅産物１７６ｂｐに比較して２０ｂｐ近く長くなっているが、これは誤差又は当該菌株（ATCC 15313）に配列の挿入が生じていることなどによるものと推定される。
Thus, even when a plurality of primer sets prepared based on the primer preparation method and primer design method of the present invention are used at the same time, the amplification target regions of food poisoning bacteria can be specifically amplified individually. It became clear.
The Listeria amplification product is 195 bp, which is nearly 20 bp longer than the theoretical amplification product 176 bp. This is due to an error or insertion of the sequence in the strain (ATCC 15313). It is estimated that
＜実験６：本発明におけるマルチプレックスＰＣＲ法における複数菌での増幅試験に関して＞
（実施例３０）
実施例２９と同じプライマーセットを同様に作製すると共に、ＰＣＲ用反応液として、作製したプライマーセット１〜８を全て含有させた、以下の組成のものを作製した。
・緩衝液 10×Ex Taq buffer（20mM Mg 2＋ plus） 2.0μl
・核酸合成基質 dNTP Mixture（dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2.5mM） 1.6μl
・ビブリオ検出用primer R（10ng/μl、final conc.4ng） 0.4μl
・ビブリオ検出用primer F（10ng/μl、final conc.4ng） 0.4μl
・その他のprimer R（10ng/μl、final conc.2ng） 0.2μl×7
・その他のprimer F（10ng/μl、final conc.2ng） 0.2μl×7
・核酸合成酵素 EX Taq（5U/μl） 0.1μl
・試料のＤＮＡ 1.0μl×7
・滅菌水 5.7μl
（全量 20μl）
<Experiment 6: Regarding amplification test with multiple bacteria in multiplex PCR method in the present invention>
(Example 30)
The same primer set as that of Example 29 was prepared in the same manner, and a PCR reaction solution containing the prepared primer sets 1 to 8 and having the following composition was prepared.
・ Buffer 10 × Ex Taq buffer (20 mM Mg 2+ plus) 2.0 μl
・ Nucleic acid synthesis substrate dNTP Mixture (2.5 mM each for dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 1.6 μl
・ Primer R for detection of Vibrio (10ng / μl, final conc.4ng) 0.4μl
・ Primer F for detection of Vibrio (10ng / μl, final conc.4ng) 0.4μl
・ Other primer R (10ng / μl, final conc.2ng) 0.2μl × 7
・ Other primer F (10ng / μl, final conc.2ng) 0.2μl × 7
・ Nucleic acid synthase EX Taq (5U / μl) 0.1μl
・ Sample DNA 1.0μl × 7
・ Sterile water 5.7μl
(Total 20 μl)
また、本実施例では、試料のＤＮＡとして、実施例２９と同じものを全て同時に含有させた。次いで、実施例１と同様のＰＣＲの条件によって、各試料のＤＮＡを複数のプライマーセット１〜８を用いて同時に増幅するマルチプレックスＰＣＲを行った。そして、増幅産物を電気泳動によりそれぞれの生物ごとに泳動させ、正しい増幅産物が得られているか否かを確認した。その結果を図４５に示す。 In this example, the same DNA as in Example 29 was simultaneously contained as the sample DNA. Then, under the same PCR conditions as in Example 1, multiplex PCR was performed to simultaneously amplify the DNA of each sample using a plurality of primer sets 1-8. Then, the amplified product was electrophoresed for each organism, and it was confirmed whether or not the correct amplified product was obtained. The result is shown in FIG.
同図に示すように、次の８つの増幅産物のピークが見られた。
（１）１６８ｂｐ （２）１７２ｂｐ （３）１８７ｂｐ （４）２０１ｂｐ
（５）２２４ｂｐ （６）２４３ｂｐ （７）２７３ｂｐ （８）３８７ｂｐ
これらのピークは、それぞれ大腸菌、サルモネラ、リステリア、セレウス（ｎｈｅ）、黄色ブドウ球菌、セレウス（ｃｅｓＢ）、カンピロバクター、ビブリオの理論上の増幅産物の塩基配列の長さに近似するものであり、各食中毒菌の増幅対象領域が特異的に増幅されていると考えられる。
このように、本発明のプライマーの作製方法及びプライマーの設計方法にもとづき作製したプライマーセットを複数同時に用いることで、それぞれ対象とする食中毒菌の増幅対象領域を同時に特異的に増幅できることが明らかとなった。
As shown in the figure, the following eight amplification product peaks were observed.
(1) 168 bp (2) 172 bp (3) 187 bp (4) 201 bp
(5) 224 bp (6) 243 bp (7) 273 bp (8) 387 bp
These peaks are approximate to the lengths of the theoretical amplification sequences of Escherichia coli, Salmonella, Listeria, Cereus (nhe), Staphylococcus aureus, Cereus (cesB), Campylobacter, and Vibrio, respectively. It is considered that the amplification target region of the bacteria is specifically amplified.
As described above, it is clear that by using simultaneously a plurality of primer sets prepared based on the primer preparation method and primer design method of the present invention, the amplification target regions of food poisoning bacteria can be specifically and simultaneously amplified. It was.
本発明は、以上の実施形態や実施例に限定されるものではなく、本発明の範囲内において、種々の変更実施が可能であることは言うまでもない。
例えば、上記各実施形態や実施例の内容の適宜組み合わせたものとすることが可能である。また、生物の遺伝子のみならず、人工のＤＮＡの塩基配列の増幅に使用するなど適宜変更することが可能である。
The present invention is not limited to the above-described embodiments and examples, and it goes without saying that various modifications can be made within the scope of the present invention.
For example, it is possible to appropriately combine the contents of the above embodiments and examples. Moreover, it can be appropriately changed such as being used for amplification of base sequences of not only living organism genes but also artificial DNA.
本発明は、食品製造現場や臨床現場における微生物検査や、遺伝子診断、遺伝子検査等の産業や研究開発において、好適に利用することが可能である。 INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention can be suitably used in industries and research and development such as microbial testing, genetic diagnosis, and genetic testing at food manufacturing sites and clinical sites.
１０，２０，３０，４０，５０，６０，７０ プライマー設計装置
１１，２１，３１，４１，５１，６１，７１ 塩基配列記憶手段
１２，２２，３２，４２，５２，６２，７２ 増幅対象生物選択手段
１３，２３，３３，４３，５３，６３，７３ 非増幅対象生物選択手段
１４，２４，３４，４４，５４，６４，７４ プライマー候補選択手段
１５，６７，７ｂ 十二塩基連続重複判定手段
１６，２６，３６，４６，５７，６８，７ｃ プライマーセット記憶手段
７５ ＧＣ含量判定手段
２５，７６ ＧＣ配列判定手段
３５，７７ ＡＴ配列判定手段
５５，６５，７９ 融解温度算出手段
５６，６６，７ａ 温度差判定手段
４５，７８ 融解温度判定手段
10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 Primer design apparatus 11, 21, 31, 41, 51, 61, 71 Base sequence storage means 12, 22, 32, 42, 52, 62, 72 Selection of amplification target organism Means 13, 23, 33, 43, 53, 63, 73 Non-amplification target organism selection means 14, 24, 34, 44, 54, 64, 74 Primer candidate selection means 15, 67, 7b Twelve bases continuous duplication judgment means 16 , 26, 36, 46, 57, 68, 7c Primer set storage means 75 GC content determination means 25, 76 GC sequence determination means 35, 77 AT sequence determination means 55, 65, 79 Melting temperature calculation means 56, 66, 7a Temperature Difference judging means 45, 78 Melting temperature judging means
Claims (7)
ＤＮＡの塩基配列を増幅する対象の一又は二以上の増幅対象生物を選択するステップと、
ＤＮＡの塩基配列を増幅しない対象の一又は二以上の非増幅対象生物を選択するステップと、
選択された増幅対象生物のＤＮＡからフォワードプライマーとリバースプライマーの候補を選択するステップと、
前記フォワードプライマー及び前記リバースプライマーの候補の塩基配列が、選択された他の増幅対象生物又は前記非増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列と１２塩基以上連続で重なるか否かを判定するステップと、
前記フォワードプライマー及び前記リバースプライマーの候補の塩基配列が、３’末端側半分において、Ｇ又はＣを連続で３塩基以上備える否かを判定するステップと、
判定の結果、前記フォワードプライマー及び前記リバースプライマーの候補の両方の塩基配列が、選択された他の増幅対象生物又は前記非増幅対象生物のいずれかのＤＮＡの塩基配列と１２塩基以上連続で重なる場合、又は、前記フォワードプライマー及び前記リバースプライマーの候補の両方の塩基配列が、３’末端側半分において、Ｇ又はＣを連続で３塩基以上備えていない場合、再度前記選択された増幅対象生物からフォワードプライマーとリバースプライマーの候補を選択し直して、前記１２塩基以上連続で重なるか否かの判定と、前記Ｇ又はＣを連続で３塩基以上備えるか否かの判定を行うステップと、
判定の結果、前記フォワードプライマー及び前記リバースプライマーの候補の少なくとも一方の塩基配列が、選択された他の増幅対象生物又は前記非増幅対象生物の全てのＤＮＡの塩基配列と１２塩基以上連続で重なっておらず、３’末端側半分において、Ｇ又はＣを連続で３塩基以上備えている場合、前記フォワードプライマーと前記リバースプライマーの候補を前記ＰＣＲ法によってＤＮＡの塩基配列を増幅するために用いるプライマーセットとして決定するステップと、を有する
ことを特徴とするプライマーの設計方法。 A method of designing a primer used for amplifying a DNA base sequence by a PCR method,
Selecting one or more target organisms to be amplified to amplify the DNA base sequence;
Selecting one or more non-amplified target organisms that do not amplify the DNA base sequence;
Selecting a forward primer and a reverse primer candidate from the DNA of the selected amplification target organism;
Determining whether the candidate base sequences of the forward primer and the reverse primer overlap with the selected base sequence of DNA of another amplification target organism or the non-amplification target organism continuously for 12 bases or more;
Determining whether or not the candidate base sequences of the forward primer and the reverse primer comprise 3 or more bases in succession in G or C in the 3 ′ end half; and
As a result of the determination, when the base sequences of both the forward primer and the reverse primer candidates overlap with the base sequence of the DNA of any of the other selected amplification target organisms or the non-amplification target organisms continuously for 12 bases or more. Or when the base sequence of both the forward primer and the reverse primer candidate does not have 3 or more consecutive G or C in the 3 ′ terminal half, it is forward again from the selected amplification target organism. Reselecting a candidate for a primer and a reverse primer, determining whether or not the 12 bases or more continuously overlap, and determining whether or not the G or C is continuously provided with 3 or more bases;
As a result of the determination, at least one base sequence of the candidate forward primer and the reverse primer overlaps with the base sequence of all the DNAs of other selected amplification target organisms or the non-amplification target organisms continuously for 12 bases or more. In the case where 3 or more G or C is continuously provided in the 3 ′ terminal half, the primer set used for amplifying the DNA base sequence by the PCR method using the forward primer and the reverse primer candidates And a step for determining as a primer design method.
判定の結果、前記フォワードプライマー及び前記リバースプライマーの候補の両方の塩基配列が、Ａ又はＴを連続で４塩基以上備えていない場合、再度前記増幅対象生物からフォワードプライマーとリバースプライマーの候補を選択し直して前記Ａ又はＴを連続で４塩基以上備えるか否かの判定を行うステップと、
判定の結果、前記フォワードプライマー及び前記リバースプライマーの候補の少なくとも一方の塩基配列が、Ａ又はＴを連続で４塩基以上備えている場合、前記フォワードプライマーと前記リバースプライマーの候補を前記ＰＣＲ法によってＤＮＡの塩基配列を増幅するために用いるプライマーセットとして決定するステップと、を有する
ことを特徴とする請求項１記載のプライマーの設計方法。 The candidate base sequences of the forward primer and the reverse primer include a range of a quarter of the total length of each primer from the center of each primer sequence toward both the 3 ′ end side and the 5 ′ end side. Determining whether the region comprises 4 or more bases of A or T continuously;
As a result of the determination, if the base sequences of both the forward primer and the reverse primer candidates do not have 4 or more consecutive A or T, the candidates for the forward primer and the reverse primer are selected again from the organism to be amplified. A step of determining whether or not the above-mentioned A or T is continuously provided with 4 or more bases;
As a result of the determination, if at least one of the base sequences of the forward primer and the reverse primer candidate comprises 4 or more bases of A or T in succession, the forward primer and the reverse primer candidates are converted into DNA by the PCR method. primer design method according to claim 1, comprising the steps of: determining as a primer set used to amplify a nucleotide sequence, the.
算出した融解温度の差が、５℃未満であるか否かを判定するステップと、
判定の結果、５℃未満でない場合、再度前記増幅対象生物からフォワードプライマーとリバースプライマーの候補を選択し直して５℃未満であるか否かの判定を行うステップと、
判定の結果、５℃未満である場合、前記フォワードプライマーと前記リバースプライマーの候補を前記ＰＣＲ法によってＤＮＡの塩基配列を増幅するために用いるプライマーセットとして決定するステップと、を有する
ことを特徴とする請求項１又は２記載のプライマーの設計方法。 Calculating melting temperatures of the forward primer and the reverse primer candidates;
Determining whether the calculated difference in melting temperature is less than 5 ° C .;
As a result of the determination, if it is not less than 5 ° C., reselecting the forward primer and reverse primer candidates from the amplification target organism again to determine whether it is less than 5 ° C .;
If the determination result is less than 5 ° C., the forward primer and the reverse primer candidates are determined as primer sets to be used for amplifying the DNA base sequence by the PCR method. The method for designing a primer according to claim 1 or 2 .
前記フォワードプライマー及び前記リバースプライマーの候補の融解温度を算出するステップと、
算出した融解温度が、７０〜７８℃であるか否かを判定するステップと、
判定の結果、前記フォワードプライマー及び前記リバースプライマーの候補の融解温度の少なくとも一方が、７０〜７８℃でない場合、再度前記増幅対象生物からフォワードプライマーとリバースプライマーの候補を選択し直して前記７０〜７８℃であるか否かの判定を行うステップと、
判定の結果、前記フォワードプライマー及び前記リバースプライマーの候補の両方の融解温度が、７０〜７８℃である場合、前記フォワードプライマーと前記リバースプライマーの候補を前記ＰＣＲ法によってＤＮＡの塩基配列を増幅するために用いるプライマーセットとして決定するステップと、を有する
ことを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のプライマーの設計方法。 Selecting a forward primer and a reverse primer candidate having a length of 23 to 41 mer from the DNA of the selected amplification target organism;
Calculating melting temperatures of the forward primer and the reverse primer candidates;
Determining whether the calculated melting temperature is 70-78 ° C .;
As a result of the determination, when at least one of the melting temperatures of the forward primer and the reverse primer candidates is not 70 to 78 ° C., the forward primer and the reverse primer candidates are again selected from the amplification target organisms and the 70 to 78 are selected. A step of determining whether or not the temperature is;
As a result of the determination, when the melting temperature of both the forward primer and the reverse primer candidate is 70 to 78 ° C., the DNA sequence of the forward primer and the reverse primer candidate is amplified by the PCR method. And determining a primer set to be used for the primer design method according to any one of claims 1 to 3 .
ことを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のプライマーの設計方法。 The primer design method according to any one of claims 1 to 4 , wherein the PCR method is a multiplex PCR method in which the base sequences of DNAs of a plurality of organisms are simultaneously amplified.
ことを特徴とするプライマーの使用方法。 The annealing temperature of PCR is set to be lower than the melting temperature of the primer having the lowest melting temperature among the forward primer and the reverse primer in the primer set obtained by using the primer designing method according to any one of claims 1 to 6. A method of using a primer, characterized in that PCR is carried out at a temperature lower by 0 to 5 ° C.
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