JP5881017B2 - Plant lactic acid bacteria isolated from rice husk or brown rice and use thereof - Google Patents
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Description
本発明は、籾殻の有効利用に関し、より詳細には、籾殻または玄米から単離された植物乳酸菌およびその利用に関する。 The present invention relates to effective utilization of rice husks, and more particularly to plant lactic acid bacteria isolated from rice husks or brown rice and the utilization thereof.
籾殻は極めて身近な資材である。籾殻は、籾の最も外側の皮の部分であり、籾の内容物を外部から保護する役割を担っている。籾殻は、刈り取られた稲から玄米を得る過程である脱穀および籾摺りの際に生成する。生成した籾殻は、古くから、保温用資材（果実を木箱に詰める際の緩衝材、農作物の防寒用など）や、燻炭として有効利用されている。 Rice husk is a very familiar material. The rice husk is the outermost skin part of the cocoon and plays a role in protecting the contents of the cocoon from the outside. Rice husks are generated during threshing and rice hulling, which is the process of obtaining brown rice from the harvested rice. The produced rice husk has long been used effectively as a material for keeping warm (such as a cushioning material when packing fruits in a wooden box, for preventing cold crops, etc.) and as a charcoal.
イネは世界で最も多く生産されている穀物であり、排出される籾殻の量もまた非常に多い。植物性バイオマスからエタノールを生産する特定の微生物が開示されている（特許文献１参照）。特許文献１では、籾殻等を植物性バイオマスとして用いることを記載している。 Rice is the most produced grain in the world, and the amount of rice husk discharged is also very large. A specific microorganism that produces ethanol from plant biomass has been disclosed (see Patent Document 1). Patent Document 1 describes the use of rice husks and the like as plant biomass.
燻炭は土壌改良剤として用いられることが多いが、燻炭を作製するには手間がかかるので、有効な利用法とはいいづらい。近年、腐食菌を用いて籾殼の堆肥化がなされているが、肥料としての利便性や好ましい効果に乏しい。また、イネ科植物は土壌中の微生物によって分解されにくく、特に、籾殻は、表面がクチクラ層によって覆われているので、土壌中の微生物による分解に７〜８年という期間を必要とする。 Although charcoal is often used as a soil conditioner, it is difficult to produce effective charcoal because it takes time and effort. In recent years, compost has been composted using corrosive bacteria, but the convenience and favorable effects as a fertilizer are poor. Gramineae plants are difficult to be decomposed by microorganisms in the soil. In particular, since the surface of rice husk is covered with a cuticle layer, it takes a period of 7 to 8 years for decomposition by microorganisms in the soil.
このような状況下で、大量に発生する籾殻は焼却されることが多いが、籾殻の焼却は、煙による周囲環境への影響や、炭酸ガスの発生による地球温暖化などの観点から、余り好ましくない。特許文献１のようなエタノールを生産するための材料として用いられることは非常に好ましいが、特定の微生物を用いることが必要である。 Under such circumstances, rice husks that are generated in large quantities are often incinerated, but incineration of rice husks is much more preferable from the viewpoint of the effect of smoke on the surrounding environment and global warming due to the generation of carbon dioxide. Absent. Although it is very preferable to be used as a material for producing ethanol as in Patent Document 1, it is necessary to use a specific microorganism.
このように、籾殻をより有効に利用する技術の開発が期待されている。 In this way, development of a technology that uses rice husk more effectively is expected.
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、籾殻をより簡便かつ有効に利用するための技術を提供することにある。 This invention is made | formed in view of said problem, The objective is to provide the technique for using rice husk more simply and effectively.
上記の課題を解決するために、本発明者らは、籾殻に付着している微生物に着目し、従来知られていた籾殻の用途と大きく異なる機能を有している微生物を同定すべく鋭意検討を行い、その結果、哺乳動物の口腔内においてう蝕の原因菌として機能するS. mutansの、歯の表面への付着性およびバイオフィルム形成を阻害する物質を産生する植物乳酸菌を見出し、本発明を完成するに至った。 In order to solve the above-mentioned problems, the present inventors have focused on microorganisms attached to rice husks and intensively studied to identify microorganisms having functions greatly different from those of conventionally known rice husks. As a result, a plant lactic acid bacterium that produces a substance that inhibits adhesion to the tooth surface and biofilm formation of S. mutans that functions as a causative agent of caries in the oral cavity of mammals has been found. It came to complete.
すなわち、本発明は、Enterococcus属の植物乳酸菌を提供する。本発明の植物乳酸菌は、籾殻または玄米から単離されたものが好ましく、E. mundtii、E. villorum、E. avium、E. faecalis、E. casseliflavusおよびE. mundtiiからなる群より選択される物であることがより好ましく、籾殻から単離されたものがさらに好ましく、植物乳酸菌E. mundtii MG3株（受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ−９８３）であることが最も好ましい。 That is, the present invention provides plant lactic acid bacteria belonging to the genus Enterococcus. The plant lactic acid bacteria of the present invention are preferably those isolated from rice husk or brown rice, and selected from the group consisting of E. mundtii, E. villorum, E. avium, E. faecalis, E. casseliflavus and E. mundtii More preferably, those isolated from rice husks are more preferable, and plant lactic acid bacteria E. mundtii MG3 strain (Accession Number: NITE BP-983) is most preferable.
本発明にかかる植物乳酸菌は、培養条件が好気性または嫌気性であるかにかかわらずS. mutansのバイオフィルム形成能を阻害する。動物の体内で機能する微生物の作用を阻害する微生物が、植物から、しかも籾殻から得られたことは、全く予測し得なかった。 The plant lactic acid bacteria according to the present invention inhibit the ability of S. mutans to form a biofilm regardless of whether the culture conditions are aerobic or anaerobic. It was completely unpredictable that microorganisms that inhibit the action of microorganisms that function in the animal's body were obtained from plants and from rice husks.
E. mundtii MG3株は、本発明者らによって分離された菌株であり、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）特許微生物寄託センター（２９２−０８１８ 千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）へ、受領番号「ＮＩＴＥ ＡＢＰ−９８３」（受領日：２０１０年１０月１日）として受領され、受託番号「ＮＩＴＥ ＢＰ−９８３」が付与されている。 The E. mundtii MG3 strain is a strain isolated by the present inventors, and is incorporated by the National Institute of Technology and Evaluation (NITE) Patent Microorganism Deposit Center (292-0818, Kisarazu City, Kazusa City, Chiba Prefecture 2-5-8 ) As a receipt number “NITE ABP-983” (reception date: October 1, 2010), and a deposit number “NITE BP-983” is assigned.
本発明にかかる組成物は、バイオフィルムの形成を阻害するために上記の植物乳酸菌を含有していることを特徴としている。本発明にかかる組成物は、S. mutansによるバイオフィルムの形成を阻害するのに用いることができる。また、本発明にかかる組成物は、う蝕を処置するために用いられることがより好ましい。なお、本発明の組成物は、医薬部外品であっても、食品であっても、医薬であってもよい。さらに、本発明の組成物は、キットとして提供されてもよい。 The composition according to the present invention is characterized by containing the above plant lactic acid bacteria in order to inhibit biofilm formation. The composition according to the present invention can be used to inhibit biofilm formation by S. mutans. Further, the composition according to the present invention is more preferably used for treating caries. In addition, the composition of this invention may be a quasi-drug, a foodstuff, or a pharmaceutical. Furthermore, the composition of the present invention may be provided as a kit.
本発明の方法は、う蝕を処置するために、上記植物乳酸菌または上記組成物を、被験体の口腔内にてS. mutansと接触させる工程を包含することを特徴としている。本発明の方法は、上記組成物を、被験体の口腔内へ供給する工程をさらに包含してもよい。 The method of the present invention is characterized by comprising the step of contacting the plant lactic acid bacteria or the composition with S. mutans in the oral cavity of a subject in order to treat caries. The method of the present invention may further include the step of supplying the composition into the oral cavity of the subject.
本発明を用いれば、S. mutansによるバイオフィルムの形成を阻害し得る。これにより、本発明を用いれば、う蝕を処置し得る。 By using the present invention, biofilm formation by S. mutans can be inhibited. Thus, caries can be treated using the present invention.
〔１〕う蝕
う蝕とは、葉の表面に付着した口腔内の原因菌の代謝産物によって歯の組織（エナメル質、象牙質、セメント質など）が破壊される感染性疾患である。ヒトの口腔内には約７００種類の細菌が、総数１００億個を超えて生息しており、う蝕の主な原因菌として、Streptococcus mutans、Streptococcus sobrinusなどが知られている。これらの原因菌が産生する不溶性の多糖に口腔内細菌が付着することによってバイオフィルムが歯面に形成され、形成されたバイオフィルム内の細菌が産生する酸によって歯面のｐＨが局所的に低下し、その結果、う蝕が形成されやすくなる。[1] Caries Caries are infectious diseases in which dental tissues (enamel, dentin, cementum, etc.) are destroyed by metabolites of causative bacteria in the oral cavity attached to the surface of leaves. About 700 types of bacteria live in the human oral cavity in total exceeding 10 billion, and Streptococcus mutans, Streptococcus sobrinus, etc. are known as the main causative bacteria of caries. A biofilm is formed on the tooth surface by attaching oral bacteria to the insoluble polysaccharide produced by these causative bacteria, and the pH of the tooth surface is locally lowered by the acid produced by the bacteria in the formed biofilm. As a result, caries are easily formed.
バイオフィルムは、微生物がコロニー上に凝集し、自ら産生した多糖体を主成分とするグリコカリックスに囲まれ、固相の物質表面に付着した細菌の集合体である。通常、バイオフィルムは、細菌が付着と脱離とを繰り返しながら、細胞外へ多糖類を産生しながら、徐々に形成されていく。バイオフィルムには、複数種の微生物が生息しており、細菌類以外(例えば酵母）も生息していることがある。単一種のみで形成されるコロニーは、自然界においては非常にまれである。バイオフィルム内の細菌は、抗生物質や免疫に対して抵抗性が高く、医学的には、難治性疾患の病態として注目されている。代表的な疾患として、細菌性心内膜炎、慢性骨髄炎、複雑性尿路感染症などがある。カテーテルの体内留置によって強固なバイオフィルムが形成されやすくなる。 A biofilm is an aggregate of bacteria attached to the surface of a solid phase substance, surrounded by glycocalyx, which is mainly composed of a polysaccharide produced by itself, which is aggregated on a colony. Usually, a biofilm is gradually formed while producing polysaccharides outside the cell while bacteria repeatedly attach and detach. A biofilm is inhabited by a plurality of types of microorganisms, and may be inhabited by other than bacteria (for example, yeast). Colonies formed by only a single species are very rare in nature. Bacteria in biofilms are highly resistant to antibiotics and immunity, and are medically attracting attention as pathologies of intractable diseases. Typical diseases include bacterial endocarditis, chronic osteomyelitis, and complicated urinary tract infections. A strong biofilm is easily formed by placing the catheter in the body.
う蝕の阻止するには、バイオフィルムの形成および／または固着を阻害することが必要である。しかし、一旦形成されたバイオフィルムは強固であり、歯ブラシなどによる物理的除去は困難である。また、歯の隙間にはブラシが届きにくい。さらに、殺菌剤を用いたとしても、バイオフィルムの表層に存在する細菌のみが殺菌される。よって、う蝕の阻止するには、バイオフィルムの形成を阻害することが好ましく、特に、その形成が完了する前に対処することが重要である。 To prevent caries, it is necessary to inhibit biofilm formation and / or sticking. However, once formed, the biofilm is strong, and physical removal with a toothbrush or the like is difficult. In addition, it is difficult for the brush to reach the gap between the teeth. Furthermore, even if a bactericidal agent is used, only bacteria present on the surface of the biofilm are sterilized. Therefore, in order to prevent caries, it is preferable to inhibit the formation of biofilm, and it is particularly important to deal with it before the formation is completed.
口腔内のバイオフィルムの形成過程を阻害するために、S. mutansのような主要な病原細菌の生育を阻害すること以外に、病原細菌を予め共凝集させることによってバイオフィルムの形成に寄与しないようにする技術が検討されている。このような技術は、人体に対する副作用が十分に検討される必要があり、十分な安全性が求められる。安全性の観点から、天然物由来の物質（例えば、植物の乾燥粉末、抽出エキスなど）が研究されているが、口腔内への定着性をさらに考慮して、病原性のない細菌を用いることも研究されている。例えば、口腔粘膜に付着する乳酸菌を用いれば、乳酸菌自体の増殖によって乳酸菌を口腔内に定着させることができる。そして、乳酸菌の増殖によって細菌叢中の病原性細菌の割合を減少させることができる。 Other than inhibiting the growth of major pathogenic bacteria such as S. mutans to inhibit the biofilm formation process in the oral cavity, do not contribute to biofilm formation by co-aggregating pathogenic bacteria in advance Technology to make it is being studied. Such a technique requires sufficient consideration of side effects on the human body, and sufficient safety is required. From the viewpoint of safety, substances derived from natural products (for example, dry powders of plants, extract extracts, etc.) have been studied, but using non-pathogenic bacteria with further consideration for colonization in the oral cavity Has also been studied. For example, if a lactic acid bacterium that adheres to the oral mucosa is used, the lactic acid bacterium can be fixed in the oral cavity by the growth of the lactic acid bacterium itself. The proportion of pathogenic bacteria in the bacterial flora can be reduced by the growth of lactic acid bacteria.
〔２〕植物乳酸菌
植物乳酸菌は、植物由来の乳酸菌をいい、例えば穀物、野菜、果物、あるいはこれらを原材料に含む醗酵食品やナム等の醗酵食品の製造に関係するバナナ等の熱帯植物の葉等から分離されたものが意図される。本発明者らはこれまでに、種々の植物乳酸菌を分離しているが、他にも多くの植物乳酸菌が知られている。[2] Plant Lactic Acid Bacteria Plant lactic acid bacteria are plant-derived lactic acid bacteria, such as cereals, vegetables, fruits, leaves of tropical plants such as bananas related to the production of fermented foods containing these as raw materials and fermented foods such as nam. It is intended to be separated from The present inventors have isolated various plant lactic acid bacteria so far, but many other plant lactic acid bacteria are known.
本発明は、籾殻から単離された新規の植物乳酸菌が、S. mutansによるバイオフィルム形成を阻害することを見出したことに基づいて完成された。本発明にかかる植物乳酸菌は、籾殻から単離された腸球菌属（Enterococcus属）の植物乳酸菌E. mundtii MG3株（受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ−９８３）である。本発明にかかる植物乳酸菌は、S. mutansによって形成されるバイオフィルムの形成を阻害することができる。本発明にかかる植物乳酸菌はう蝕を処置するために用いられることが好ましい。 The present invention was completed based on the discovery that a novel plant lactic acid bacterium isolated from rice husks inhibits biofilm formation by S. mutans. The plant lactic acid bacterium according to the present invention is a plant lactic acid bacterium E. mundtii MG3 strain (accession number: NITE BP-983) of the genus Enterococcus isolated from rice husks. The plant lactic acid bacteria according to the present invention can inhibit the formation of a biofilm formed by S. mutans. The plant lactic acid bacteria according to the present invention are preferably used for treating caries.
Enterococcus属は、主にヒトを含む哺乳類の腸管内に存在する常在菌のうち、球菌の形態をとるものを指す。外界で増殖しにくく、人畜の糞尿で汚染されていない限り、環境中の水や土壌にはほとんど分布していないとされている。実際、健康な人間の腸内から一般的に検出され、通性嫌気性、かつ、グラム陽性の連鎖状の球菌で、グルコース、マルトース、ラクトース、スクロースを分解し、６０℃で加熱しても３０分間は耐えることができる。Enterococcusに属する主なspeciesとしては、E. faecalis、E. faecium、E. avium、E. casseliflavus、E. gallinarum、E. flavescensなどが従来からよく知られている。 The Enterococcus genus refers to those that take the form of cocci among resident bacteria that exist mainly in the intestinal tract of mammals including humans. It is said that it is hardly distributed in the water and soil in the environment unless it is difficult to multiply in the outside world and is not contaminated with human livestock manure. In fact, it is a facultative anaerobic and Gram-positive streptococci that is generally detected in the intestines of healthy humans and decomposes glucose, maltose, lactose, sucrose, and 30 Can withstand minutes. As main species belonging to Enterococcus, E. faecalis, E. faecium, E. avium, E. casseliflavus, E. gallinarum, E. flavescens and the like are well known.
う蝕の予防を目的として、S. mutansの増殖抑制やS. mutansによるバイオフィルムの形成阻害について、微生物を用いた研究が進められている（特許文献２〜６参照）。 For the purpose of preventing dental caries, studies using microorganisms have been conducted on the suppression of S. mutans growth and the inhibition of biofilm formation by S. mutans (see Patent Documents 2 to 6).
例えば、特開２０１０−１２４７７２号公報には、う蝕などを予防するための口腔用組成物が開示されており、S. mutansに起因するバイオフィルム形成を抑制する作用を有する特定の乳酸菌（Lactococcus lactis、Lactobacillus rhamnosusおよびLactobacillus curvatus）が用いられている。特開２００８−２３７１９８号公報には、S. thermophilusと併用してS. mutansの増殖を抑制するLb. delbrueckii subspecies lactis、および該乳酸菌を含有する虫歯予防用組成物が開示されている。特開２００３−２９９４８０号公報には、S. mutansの増殖を抑制することによって虫歯の予防等に有効な乳酸菌（Lb. reuteri）が開示されている。また、特開２０１０−５３０６２号公報には、口腔疾患の予防や治療のための口腔用組成物が開示されており、口腔内細菌との共凝集を行い、さらに口腔内組織への付着性を有する特定の乳酸菌（Lenuconostoc属）が用いられている。ＷＯ２００２／０８０９４６には、乳酸菌、乳酸菌培養液等が、S. mutans等の増殖を抑制する効果を示すことや、キシリトール等の甘味料や砂糖等の糖類、各種植物抽出物が、単独では口腔病原菌の増殖抑制効果を示さないものの、上記乳酸菌、乳酸菌培養液等による効果を顕著に増強することが記載されている。しかし、う蝕の処置に利用可能なEnterococcus属の植物乳酸菌を籾殻から単離することを動機付ける事項は全く記載されていない。 For example, JP 2010-124772 A discloses a composition for oral cavity for preventing caries and the like, and a specific lactic acid bacterium (Lactococcus) having an action of suppressing biofilm formation caused by S. mutans. lactis, Lactobacillus rhamnosus and Lactobacillus curvatus) have been used. JP-A-2008-237198 discloses Lb. delbrueckii subspecies lactis that suppresses the growth of S. mutans in combination with S. thermophilus, and a composition for preventing dental caries containing the lactic acid bacteria. Japanese Patent Application Laid-Open No. 2003-299480 discloses a lactic acid bacterium (Lb. reuteri) effective in preventing caries by suppressing the growth of S. mutans. JP 2010-53062 A discloses a composition for oral cavity for the prevention and treatment of oral diseases, and co-aggregates with oral bacteria, and further adheres to oral tissues. Certain lactic acid bacteria (genus Lenuconostoc) are used. In WO2002 / 080946, a lactic acid bacterium, a lactic acid bacterium culture solution or the like shows an effect of suppressing the growth of S. mutans, a sweetener such as xylitol, a saccharide such as sugar, and various plant extracts alone are oral pathogenic bacteria. Although it does not show the growth inhibitory effect, it is described that the effect of the lactic acid bacteria, lactic acid bacteria culture medium, etc. is remarkably enhanced. However, there is no mention of the motivation for isolating Enterococcus plant lactic acid bacteria that can be used for caries treatment from rice husks.
後述する実施例にて示すように、４７種類の米サンプル（籾殻及び玄米）から乳酸菌が多数分離された。これらの乳酸菌は花から分離されたものと異なり、分離株の５５％をEnterococcus属の乳酸菌が占めていた。このように、分離されたEnterococcus属の生育環境は、これまでの技術常識と異なっており、当業者が容易に取得し得るものでない。なお、籾殻または玄米からE. mundtii以外にE. villorum、E. avium、E. faecalis、E. casseliflavus、E. mundtii等が分離されている。 As shown in the Example mentioned later, many lactic acid bacteria were isolate | separated from 47 types of rice samples (chaff and brown rice). Unlike those isolated from flowers, 55% of the isolates were Enterococcus lactic acid bacteria. Thus, the growth environment of the isolated Enterococcus genus is different from conventional technical common sense and cannot be easily obtained by those skilled in the art. In addition to E. mundtii, E. villorum, E. avium, E. faecalis, E. casseliflavus, E. mundtii, etc. are separated from rice husk or brown rice.
このように、本発明は、S. mutansによって形成されるバイオフィルムの形成を阻害することができる植物乳酸菌を提供する。本発明にかかる植物乳酸菌は、う蝕を処置するために用いられることが好ましく、E. mundtii、E. villorum、E. avium、E. faecalis、E. casseliflavusおよびE. mundtiiからなる群より選択されるものが好ましく、E. mundtiiがより好ましく、E. mundtii MG3株（受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ−９８３）が最も好ましい。 Thus, the present invention provides a plant lactic acid bacterium that can inhibit the formation of a biofilm formed by S. mutans. The plant lactic acid bacterium according to the present invention is preferably used for treating caries and is selected from the group consisting of E. mundtii, E. villorum, E. avium, E. faecalis, E. casseliflavus and E. mundtii. Are preferred, E. mundtii is more preferred, and E. mundtii MG3 strain (Accession Number: NITE BP-983) is most preferred.
〔３〕植物乳酸菌の利用
（１）組成物
本発明にかかる組成物は、バイオフィルムの形成を阻害するために上記の植物乳酸菌を含有していることを特徴としている。本発明にかかる組成物は、S. mutansによるバイオフィルムの形成を阻害するのに用いることができる。また、本発明にかかる組成物は、う蝕を処置するために用いられることがより好ましい。なお、本発明の組成物は、医薬部外品であっても、食品であっても、医薬であってもよい。[3] Utilization of plant lactic acid bacteria (1) Composition The composition according to the present invention is characterized by containing the above-mentioned plant lactic acid bacteria in order to inhibit biofilm formation. The composition according to the present invention can be used to inhibit biofilm formation by S. mutans. Further, the composition according to the present invention is more preferably used for treating caries. In addition, the composition of this invention may be a quasi-drug, a foodstuff, or a pharmaceutical.
本発明は、バイオフィルムの形成を阻害するための植物乳酸菌を含有する組成物を提供する。本発明の組成物は、う蝕を処置するために用いられることが好ましい。本明細書中にて使用される場合、用語「処置」は、症状の軽減、改善または排除が意図され、予防的（発症前）に行われ得るものだけでなく、治療的（発症後）に行われ得るものもまた包含されるが、バイオフィルムの形成を阻害する際に好適に用いられるので、予防的な処置であることが好ましい。 The present invention provides a composition containing plant lactic acid bacteria for inhibiting biofilm formation. The composition of the present invention is preferably used to treat caries. As used herein, the term “treatment” is intended to alleviate, ameliorate, or eliminate symptoms and can be performed prophylactically (before onset), as well as therapeutically (after onset). Although what can be performed is also included, since it is used suitably when inhibiting formation of a biofilm, it is preferable that it is a prophylactic treatment.
本発明の組成物は、使用前に水等に溶解される固形剤であっても、懸濁液等の液体であっても、あるいは塗布に好ましいペーストであってもよい。本発明の組成物は、植物乳酸菌が含有されており、その生理作用を発現させるための有効量が含有されていれば特にその形状が限定されることはなく、タブレット状、顆粒状、カプセル状などの経口的に摂取可能な形状物も包含する。また、本発明の組成物における植物乳酸菌の含有量は特に限定されず、その官能と作用発現の観点から適宜選択できる。 The composition of the present invention may be a solid agent dissolved in water or the like before use, a liquid such as a suspension, or a paste preferable for coating. The composition of the present invention contains plant lactic acid bacteria, and the shape is not particularly limited as long as it contains an effective amount for expressing its physiological action, and is in the form of tablets, granules, capsules. Orally ingestible forms such as are also included. In addition, the content of the plant lactic acid bacteria in the composition of the present invention is not particularly limited, and can be appropriately selected from the viewpoint of its function and expression of action.
本発明の組成物は、任意の形態を採り得るが、バイオフィルムの形成阻害、あるいはう蝕の処置を目的としているので、口腔内に留まりやすい形態であることが好ましく、例えば、錠剤、散剤、顆粒剤、ペースト剤、丸剤、チュアブル剤、含嗽剤、トローチ剤、パッチ剤等であり得、錠剤、散剤、顆粒剤、ペースト剤、チュアブル剤、含嗽剤、トローチ剤、またはパッチ剤であることがより好ましい。 Although the composition of the present invention can take any form, it is intended to inhibit the formation of biofilm or treat caries, and thus is preferably in a form that tends to stay in the oral cavity, such as tablets, powders, It can be a granule, paste, pill, chewable, gargle, troche, patch, etc., and must be a tablet, powder, granule, paste, chewable, gargle, troche, or patch Is more preferable.
バイオフィルムの形成阻害、あるいはう蝕の処置を目的としているため、本発明の組成物は、口腔用組成物として提供されることが好ましい。「口腔用組成物」は、口腔内への適用可能な形態であれば限定されず、医薬部外品であっても食用組成物であっても医薬組成物であってもよい。なお、本発明の植物乳酸菌は、公知の種々の口腔用組成物に配合可能である。 The composition of the present invention is preferably provided as a composition for oral cavity because it aims to inhibit the formation of biofilm or treat caries. The “oral composition” is not limited as long as it is a form applicable to the oral cavity, and may be a quasi-drug, an edible composition, or a pharmaceutical composition. In addition, the plant lactic acid bacteria of this invention can be mix | blended with various well-known oral compositions.
なお、口腔用組成物は、従来公知の方法に従って調製され得、その剤型に応じて、通常配合される任意の成分を単独または複数適宜組み合わせても調製されてもよい。配合される成分としては、例えば、研磨剤、界面活性剤、粘結剤、粘稠剤、甘味料、防腐剤、香料、着色剤、ｐＨ調整剤、賦形剤、各種薬効成分等が挙げられるがこれらに限定されない。 In addition, the composition for oral cavity can be prepared in accordance with a conventionally well-known method, and may be prepared even if it mixes arbitrarily the arbitrary components normally mix | blended according to the dosage form. Examples of the components to be blended include abrasives, surfactants, binders, thickeners, sweeteners, preservatives, fragrances, colorants, pH adjusters, excipients, various medicinal ingredients, and the like. However, it is not limited to these.
本発明に好ましい口腔用組成物としては、歯磨き剤（練り歯磨き剤、粉歯磨き剤、液状歯磨き剤）、チュアブル錠、マウスウオッシュ、うがい薬（錠剤、散剤を含む。）、軟膏、クリーム（歯肉マッサージクリームを含む。）、口中清涼剤、義歯洗浄剤、トローチ、ガム等が挙げられるがこれらに限定されない。特に、トローチ、ガムなどを用いれば、植物乳酸菌の口腔内への放出が徐放性であるので、口腔内にて植物乳酸菌を所望の時間にわたって持続させることができる。 Preferred oral compositions for the present invention include dentifrices (toothpastes, powder dentifrices, liquid dentifrices), chewable tablets, mouthwashes, mouthwashes (including tablets and powders), ointments, creams (gingival massage). Cream), mouth fresheners, denture cleaners, troches, gums and the like, but are not limited to these. In particular, if troches, gums, or the like are used, the release of plant lactic acid bacteria into the oral cavity is sustained release, so that the plant lactic acid bacteria can be maintained in the oral cavity for a desired time.
本発明に好ましい食用組成物としては、キャンデー、チョコレート、ドリンク、発酵品等が挙げられるがこれらに限定されない。植物乳酸菌の発酵品が食用組成物として用いられる場合には、発酵食品または発酵飲料等に配合することが知られている種々の成分、例えば甘味料、風味剤、増粘剤、矯味剤、着色剤、着香剤等が配合されてもよい。本発明の食用組成物は、バイオフィルムの形成阻害、あるいはう蝕の処置を目的とした食用組成物であり、健康食品（機能性食品）として極めて有用である。本発明の食用組成物の製造法は特に限定されず、調理、加工および一般に用いられている食品または飲料の製造法による製造を挙げることができ、上述した植物乳酸菌が、その食品または飲料中に含有されていればよい。 Preferred edible compositions for the present invention include, but are not limited to, candy, chocolate, drinks, fermented products and the like. When a fermented product of plant lactic acid bacteria is used as an edible composition, various components known to be blended in fermented foods or fermented beverages, such as sweeteners, flavors, thickeners, flavoring agents, coloring agents, etc. An agent, a flavoring agent, etc. may be blended. The edible composition of the present invention is an edible composition for the purpose of inhibiting biofilm formation or treating caries, and is extremely useful as a health food (functional food). The production method of the edible composition of the present invention is not particularly limited, and examples thereof include cooking, processing, and production by a generally used food or beverage production method. The above-described plant lactic acid bacteria are contained in the food or beverage. It should just be contained.
本発明に好ましい医薬組成物としては、歯周ポケット内へ投与するための徐放性製剤等が挙げられるがこれに限定されない。医薬組成物として提供される場合、本発明の組成物は、製薬分野における公知の方法を用いて所望の剤型を採り得る。例えば、賦形剤、必要に応じて結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤などを加えて固形剤として形成された後に、常法に従って、散剤、細粒剤、顆粒剤、錠剤、被覆錠剤、カプセル剤等の剤型にて提供され得る。 Preferred pharmaceutical compositions for the present invention include, but are not limited to, sustained release formulations for administration into periodontal pockets. When provided as a pharmaceutical composition, the composition of the present invention can take a desired dosage form using a known method in the pharmaceutical field. For example, after forming as a solid agent by adding excipients, binders, disintegrating agents, lubricants, coloring agents, flavoring agents, etc., if necessary, powders, fine granules, granules , Tablets, coated tablets, capsules and the like.
本発明の医薬組成物にて使用される医薬用担体は、医薬組成物の投与形態および剤型に応じて選択することができる。経口剤の場合、例えばデンプン、乳糖、白糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩などが医薬用担体として利用される。また経口剤を調製する際、更に結合剤、崩壊剤、界面活性剤、潤滑剤、流動性促進剤、矯味剤、着色剤、香料などを配合してもよい。 The pharmaceutical carrier used in the pharmaceutical composition of the present invention can be selected according to the administration form and dosage form of the pharmaceutical composition. In the case of oral preparations, for example, starch, lactose, sucrose, mannitol, carboxymethylcellulose, corn starch, inorganic salts and the like are used as pharmaceutical carriers. Moreover, when preparing an oral preparation, you may mix | blend a binder, a disintegrating agent, surfactant, a lubricant, a fluidity promoter, a corrigent, a coloring agent, a fragrance | flavor, etc. further.
本発明の医薬組成物は、製薬分野における公知の方法により製造することができる。本発明の医薬組成物における植物乳酸菌の含有量は、投与形態、投与方法などを考慮し、この医薬組成物を適切な量にて投与できるような量であれば特に限定されない。本発明の医薬組成物の投与量は、その製剤形態、投与方法、使用目的および当該医薬の投与対象である患者の年齢、体重、症状によって適宜設定され一定ではない。投与は、所望の投与量範囲内において、１日内において単回で、または数回に分けて行ってもよい。また、本発明の医薬組成物はそのまま経口投与するほか、任意の飲食品に添加して日常的に摂取させることもできる。 The pharmaceutical composition of the present invention can be produced by a known method in the pharmaceutical field. The content of the plant lactic acid bacteria in the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited as long as it is an amount that allows the pharmaceutical composition to be administered in an appropriate amount in consideration of the administration form, the administration method, and the like. The dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is appropriately set according to the formulation form, administration method, purpose of use, and age, weight, and symptom of the patient to whom the pharmaceutical is administered, and is not constant. Administration may be carried out in a single dose or divided into several doses within a desired dose range. Moreover, the pharmaceutical composition of the present invention can be orally administered as it is, or can be added to any food or drink and taken daily.
なお、本明細書中にて使用される場合、用語「組成物」はその含有成分を単一組成物中に含有する態様と、単一キット中に別個に備えている態様であってもよい。すなわち、本明細書中にて使用される場合、「キット」は、「組成物」の一態様であるといえる。 As used herein, the term “composition” may be an embodiment in which the component is contained in a single composition or an embodiment in which the component is separately provided in a single kit. . That is, as used herein, “kit” can be said to be an embodiment of “composition”.
（２）キット
本発明は、バイオフィルムの形成を阻害するための植物乳酸菌を備えているキットを提供する。本発明のキットは、う蝕を処置するために用いられることが好ましい。本明細書中にて使用される場合、用語「キット」は、特定の材料を内包する容器（例えば、ボトル、プレート、チューブ、ディッシュなど）を備えた包装が意図される。好ましくは、上記材料を使用するための指示書を備えている。指示書には、本発明のキットを、バイオフィルムの形成を阻害するために使用する際の手順が記載されていることが好ましく、う蝕を処置するために使用する際の手順が記載されていることがより好ましい。本明細書中にてキットの局面において使用される場合、「備えた（備えている）」は、キットを構成する個々の容器のいずれかの中に内包されている状態が意図される。また、本発明のキットは、複数の異なる組成物を１つに梱包した包装であってもよく、容器中に内包された溶液形態の組成物を梱包していてもよい。本発明のキットは、異なる２つ以上の物質を同一の容器に混合して備えても別々の容器に備えてもよい。「指示書」は、紙またはその他の媒体に書かれていても印刷されていてもよく、あるいは磁気テープ、コンピューター読み取り可能ディスクまたはテープ、CD-ROMなどのような電子媒体に付されてもよい。本発明のキットは、上述した組成物を構成するためにもちいられてもよく、上述した組成物に含まれる物質を別々に備えていても、上述した組成物とさらなる成分とを別々に備えていてもよい。(2) Kit The present invention provides a kit comprising plant lactic acid bacteria for inhibiting biofilm formation. The kit of the present invention is preferably used for treating caries. As used herein, the term “kit” intends a package with a container (eg, bottle, plate, tube, dish, etc.) containing a particular material. Preferably, an instruction for using the material is provided. The instructions preferably describe the procedure for using the kit of the present invention to inhibit biofilm formation, and describe the procedure for using to treat caries. More preferably. As used herein in the context of a kit, “comprising” is intended to mean being contained within any of the individual containers that make up the kit. Further, the kit of the present invention may be a package in which a plurality of different compositions are packed together, or may be a solution in a form of a solution contained in a container. The kit of the present invention may be prepared by mixing two or more different substances in the same container or in separate containers. The “instructions” may be written or printed on paper or other media, or may be affixed to electronic media such as magnetic tape, computer readable disk or tape, CD-ROM, etc. . The kit of the present invention may be used to constitute the above-described composition, and may comprise separately the substances contained in the above-described composition, or separately comprise the above-described composition and further components. May be.
（３）方法
本発明はさらに、う蝕を処置するための方法を提供する。本発明の方法は、本発明の植物乳酸菌（または該植物乳酸菌を含有する組成物）と、う蝕の原因菌とを接触させる工程を包含する。本発明の植物乳酸菌とう蝕の原因菌とを接触させる工程は、歯磨き、指でのペーストの塗布、パッチの貼付であっても、トローチ剤またはチュアブル剤等を口に含むことであってもよく、含嗽剤を用いてうがいをする工程であってもよい。なお、本工程において、本発明の植物乳酸菌とう蝕の原因菌とを接触させる時間は、採用される手段に応じて適宜設計されるが、１０秒間〜１０分間の範囲内が好ましく、３０秒間〜１０分間の範囲内がより好ましく、１分間〜５分間の範囲内がさらに好ましい。(3) Method The present invention further provides a method for treating caries. The method of the present invention includes the step of bringing the plant lactic acid bacterium of the present invention (or a composition containing the plant lactic acid bacterium) into contact with a causative bacterium of caries. The step of bringing the plant lactic acid bacteria of the present invention into contact with the causative agent of caries may be brushing teeth, applying a paste with fingers, applying a patch, or including a lozenge or chewable agent in the mouth. The step of gargleing with a gargle may be used. In this step, the time for bringing the plant lactic acid bacterium of the present invention into contact with the causative agent for caries is appropriately designed according to the means employed, but is preferably within a range of 10 seconds to 10 minutes, preferably 30 seconds to More preferably within the range of 10 minutes, more preferably within the range of 1 minute to 5 minutes.
本発明の方法は、本発明の植物乳酸菌とう蝕の原因菌とを接触させることが必要であるので、被験体への投与は口腔内投与であることが好ましい。すなわち、本発明の方法は、う蝕を処置するための植物乳酸菌を、被験体の口腔内へ供給する工程をさらに包含してもよい。 Since it is necessary for the method of the present invention to contact the plant lactic acid bacteria of the present invention with the causative bacteria of caries, it is preferable that the administration to a subject is oral administration. That is, the method of the present invention may further include a step of supplying a plant lactic acid bacterium for treating caries into the oral cavity of the subject.
また、本発明の方法は、う蝕の処置が実現したことを確認するために、う蝕の原因菌のバイオフィルム形成能を、本発明の植物乳酸菌と接触させる前後で比較する工程をさらに包含してもよい。 The method of the present invention further includes a step of comparing the biofilm-forming ability of the causative bacteria of the caries before and after contacting with the plant lactic acid bacteria of the present invention in order to confirm that the caries treatment has been realized. May be.
本発明の方法における植物乳酸菌の具体的な適用は、上述した組成物およびキットの使用形態に準じればよいことを、本明細書を読んだ当業者は容易に理解する。 Those skilled in the art who have read this specification will easily understand that the specific application of the plant lactic acid bacteria in the method of the present invention may be in accordance with the use form of the composition and kit described above.
なお、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中にて参考として援用される。 In addition, all the academic literatures and patent literatures described in this specification are incorporated by reference in this specification.
本発明は、以下の実施例によってさらに詳細に説明されるが、これに限定されるべきではない。 The invention is illustrated in more detail by the following examples, but should not be limited thereto.
広島大学病院小児歯科を受診した患児の歯面およびう蝕病巣から、口腔内細菌を分離した。分離した株を同定するために、それぞれの１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列を決定した後に相同性検索を行った。また、分離株のバクテリオシン産生能を、寒天拡散法にて評価した。また、S. mutans MT8148Rのバイオフィルム形成に対する乳酸菌の影響を調べるために、所定濃度のスクロースを含有するBHI培地（全量２００μＬ）の入った９６穴プレートにS. mutansおよび各乳酸菌（１×１０４ＦＰＵ）を植菌した。これらを、好気性条件下または嫌気性条件下にて静置培養した後に、１（ｗ／ｖ）％ゲンチアナバイオレット溶液にて染色し、Ａ５９８の値からバイオフィルム形成度を評価した。Oral bacteria were isolated from the tooth surfaces and caries lesions of children who visited pediatric dentistry at Hiroshima University Hospital. In order to identify the isolate | separated strain | stump | stock, the homology search was performed after determining each 16S rDNA base sequence. Moreover, the bacteriocin-producing ability of the isolate was evaluated by the agar diffusion method. In order to examine the effect of lactic acid bacteria on the biofilm formation of S. mutans MT8148R, S. mutans and each lactic acid bacterium (1 × 10 4 ) were placed in a 96-well plate containing BHI medium (total amount 200 μL) containing sucrose at a predetermined concentration. FPU) was inoculated. These were statically cultured under aerobic conditions or anaerobic conditions, then stained with 1 (w / v)% gentian violet solution, and the degree of biofilm formation was evaluated from the value of A598 .
５０人の患児の歯面および３人の患児のう蝕病巣から、それぞれ１５２株および２４株の乳酸菌を分離し、前者について１１０株、後者について２３株を同定した。その結果、ｄｍｆ歯率（う蝕を経験した歯の数）の高い患児では、Lactobacillus属が多く検出され、特に、Lb. fermentum、Lb. gasseri、Lb. salivariusが多く検出された。また、う蝕病巣からは、S. mutans、Lb. fermentumおよびLb. caseiが分離された。上記１５２株にバクテリオシン産生性は認められなかった。さらに、ＭＴ８１４８Ｒ株に対して抗菌活性を示すバクテリオシン産生株は認められなかった。 152 strains and 24 strains of lactic acid bacteria were isolated from the tooth surfaces of 50 children and caries lesions of 3 children, respectively, and 110 strains were identified for the former and 23 strains for the latter. As a result, many Lactobacillus genera were detected in children with a high dmf tooth rate (the number of teeth experiencing caries), and in particular, Lb. fermentum, Lb. gasseri, and Lb. salivarius were frequently detected. S. mutans, Lb. fermentum and Lb. casei were isolated from the carious lesion. No bacteriocin productivity was observed in the above 152 strain. Furthermore, no bacteriocin producing strain showing antibacterial activity against the MT8148R strain was found.
全国２５都道府県から集めた４７種類の米サンプル（表１）を分離源として、植物乳酸菌を分離した。ＭＲＳ ｂｒｏｔｈ（ＭＥＲＣＫ社）を蒸留水に溶解（５．２２％（ｗ／ｖ））した後に、１１８℃で１５分間オートクレーブしたものを培地（ＭＲＳ培地）として用い，２８℃または３７℃にて嫌気培養した。なお、ＭＲＳ培地を寒天培地として使用する場合には、ａｇａｒを最終濃度１．５％（ｗ／ｖ）となるように添加した。 Plant lactic acid bacteria were separated using 47 types of rice samples (Table 1) collected from 25 prefectures nationwide as the separation source. MRS broth (MERCK) dissolved in distilled water (5.22% (w / v)) and autoclaved at 118 ° C. for 15 minutes was used as a medium (MRS medium) and anaerobic at 28 ° C. or 37 ° C. Cultured. In addition, when using MRS culture medium as an agar culture medium, agar was added so that it might become final concentration 1.5% (w / v).
米から分離した籾殻（約１０粒相当）または玄米（それぞれ約１０粒相当）を１０ｍＬのＭＲＳ培地入のフタ付き試験管に入れて、十分に懸濁した後に、その１００μＬを液体培地に植菌し、さらに２〜３日間にわたって嫌気培養した。培養後の液体の一部を寒天培地にさらに塗菌してコロニーを形成させ、さらに２〜３日間にわたって培養した。大きさ、形、色、つやなどが異なるコロニーを全てピックアップし、寒天培地にて別々に分離培養した。この操作を２回行った。ピックアップしたコロニーが単一コロニーからなることを確認した後に、ＫＯＨ／Ｈ２Ｏ２テストを行い、ＫＯＨ（−）、Ｈ２Ｏ２（−）と判定されたコロニーをそれぞれ液体培地で培養してグリセロールストックを作製した。Rice husks separated from rice (equivalent to about 10 grains) or brown rice (equivalent to about 10 grains each) are placed in a test tube with a lid containing 10 mL of MRS medium and suspended sufficiently. The anaerobic culture was further performed for 2 to 3 days. A part of the cultured liquid was further spread on an agar medium to form colonies, and further cultured for 2-3 days. All colonies with different sizes, shapes, colors, gloss, etc. were picked up and separated and cultured separately on an agar medium. This operation was performed twice. After confirming that the picked-up colonies consist of a single colony, the KOH / H 2 O 2 test was performed, and the colonies determined as KOH (−) and H 2 O 2 (−) were cultured in a liquid medium, respectively. A glycerol stock was made.
上記手順に従って、４７種類の米サンプルから乳酸菌を４７株分離した（表２）。また、籾殻および玄米の両方から乳酸菌が分離された。玄米の糠層は、発芽に必要なビタミン類や脂肪分などが含まれているために栄養価が高く、乳酸菌にとっては好適な生育環境であるといえる。今回得られた乳酸菌は、花から分離された乳酸菌と異なり、Enterococcus属が多かった（全体の５５％）。 According to the above procedure, 47 strains of lactic acid bacteria were isolated from 47 types of rice samples (Table 2). In addition, lactic acid bacteria were isolated from both rice husk and brown rice. The brown rice bran layer has high nutritional value because it contains vitamins and fats necessary for germination, and can be said to be a suitable growth environment for lactic acid bacteria. The lactic acid bacteria obtained this time differed from the lactic acid bacteria isolated from flowers, and there were many Enterococcus species (55% of the total).
籾殻から単離した乳酸菌には通し番号としてＭＧ株と命名した。ＭＧ３株はバクテリオシン（抗菌性ポリペプチド）を生産することから、本株の分類学的同定を行い、E. mundtiiであると同定し、E. mundtii ＭＧ３と命名した。MG3株の産生するバクテリオシンは、S. sobrinus、Listeria monocytogenes、E. aviumおよびE. faeciumに対して抗菌活性を示した。S. mutans MT8148R株のバイオフィルム形成能は、ＭＧ３株と共培養した場合に、好気性または嫌気性の環境にかかわらず、著しく阻害された。S. mutans MT8148R株のバイオフィルム形成能に対するE. mundtii 15-1Aによる阻害活性はわずかであった。なお、15-1A株は壬生菜から分離された植物乳酸菌である。また、ＭＧ３株の培養液上清には、S. mutansに対する抗菌活性は認められなかった。さらに、ＭＴ８１４８Ｒ株に対して抗菌活性を示すバクテリオシン産生株Lb. brevis 174Aを共培養した場合には、バイオフィルム形成阻害が認められなかった(図１）。
A MG strain was named as a serial number for lactic acid bacteria isolated from rice husks. Since MG3 strain produces bacteriocin (antibacterial polypeptide), the strain was identified taxonomically, identified as E. mundtii, and named E. mundtii MG3. The bacteriocin produced by MG3 strain showed antibacterial activity against S. sobrinus, Listeria monocytogenes, E. avium and E. faecium. The biofilm-forming ability of the S. mutans MT8148R strain was significantly inhibited when co-cultured with the MG3 strain, regardless of the aerobic or anaerobic environment. The inhibitory activity by E. mundtii 15-1A on the biofilm-forming ability of S. mutans MT8148R was slight. Note that the 15-1A strain is a plant lactic acid bacterium isolated from raw vegetables. Moreover, antibacterial activity against S. mutans was not observed in the culture supernatant of the MG3 strain. Furthermore, when the bacteriocin-producing strain Lb.
なお、ＭＧ３株にはバイオフィルム形成能力がないことがわかった。また、バイオアッセイ法によって、ＭＧ３株の培養上清中に抗菌活性を調べ、ＭＧ３株が抗生物質を産生しないことがわかった。さらに、ＭＧ３株の培養上清を添加した際に、S. mutansによるバイオフィルム形成が若干阻害された（データ示さず）。 The MG3 strain was found to have no biofilm forming ability. Further, antibacterial activity was examined in the culture supernatant of MG3 strain by bioassay method, and it was found that MG3 strain did not produce antibiotics. Furthermore, when the culture supernatant of MG3 strain was added, biofilm formation by S. mutans was slightly inhibited (data not shown).
このように、本発明者らは、ヒトの口腔内に生息する乳酸菌叢を解析し、植物乳酸菌株および口腔内から分離された細菌について、バクテリオシン産生性およびバイオフィルム形成阻害能を調べ、その結果として、植物乳酸菌を利用した口腔内ケアの技術を開発した。 Thus, the present inventors analyzed the lactic acid bacterial flora inhabiting the human oral cavity, investigated the bacteriocin productivity and the ability to inhibit biofilm formation for plant lactic acid strains and bacteria isolated from the oral cavity. As a result, we developed an oral care technology using plant lactic acid bacteria.
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。 The present invention is not limited to the above-described embodiments, and various modifications are possible within the scope shown in the claims, and embodiments obtained by appropriately combining technical means disclosed in different embodiments. Is also included in the technical scope of the present invention.
本発明を用いれば、新たなう蝕処置剤を開発することができるので、歯磨き剤、嗽薬等の口腔衛生医療分野での技術開発に貢献することができる。 Since a new caries treatment agent can be developed by using the present invention, it can contribute to the technical development in the oral hygiene medical field such as a dentifrice and a glaze.
Claims (8)
A method for inhibiting the formation of a biofilm comprising the step of contacting the plant lactic acid bacterium of claim 1 or the composition of any one of claims 2 to 7 with Streptococcus mutans in vitro .
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