JP5881016B2 - ヒト膜タンパク質発現のための微生物 - Google Patents
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Description
carrier 2、(facilitated glucose transporter)、solute carrier 7、(cationic amino acid transporter、y+ System)、HCAT−2A、solute carrier 6 (neurotransmitter transporter、glycine)、sodium−dependent high−affinity dicarboxylate transporter、similar to solute carrier 26、solute carrier 21、UDP N−acetylglucosamine transporter、neutral amino acid transporter B(0)、solute carrier 2、facilitated glucose transporter、solute carrier 29 (nucleoside transporters)、member 1、solute carrier 26、solute carrier 10 (sodium/bile acid cotransporter )、H+/peptide transporter、similar to solute carrier 9、solute carrier 30、solute carrier 25、solute carrier 19 (folate transporter)、UDP−glucuronic acid/UDP−N−acetylgalactosamine transporter、solute carrier 16 (monocarboxylic acid transporters)、member 4、nucleoside transporter、sodium/nucleoside cotransporter 1、similar to Mus musculus putative thymic stromal co−transporter TSCOT mRNA、chromaffin granule amine transporter、acetyl−coenzyme A transporter、high affinity choline transporter、organic−cation transporter like、membrane−associated transporter protein、similar to amino acid transporter subunit B0、+AT、similar to non−green plastid triose phosphate translocator precursor、similar to peptide/histidine transporter、Rh type B glycoprotein、sodium/hydrogen exchanger 6、solute carrier 39 (zinc transporter)、member 4、peroxisomal Ca−dependent solute carrier、K−CL cotransporter、solute carrier 4、anion exchanger、sodium/iodide cotransporter、Chloride anion exchanger、similar to sodium/potassium/calcium exchanger 3 precursor (Na (+) /K (+) /Ca (2+) −exchange protein 3)、sodium dependent phosphate transporter、similar to solute carrier 20 (phosphate transporter、solute carrier 8 (sodium−calcium exchanger)、solute carrier 11 (sodium/phosphate symporters)、weakly similar to metal homeostasis factor ATX2、iron−regulated transporter IREG1、probable low−affinity copper uptake protein 2、similar to solute carrier 9 (sodium/hydrogen exchanger)、isoform 7、Voltage−gated sodium Channel alpha subunit、potassium Channel TASK−4、small conductance calcium−activated potassium Channel protein 2、long transient receptor potential Channel 2、ether−a−go−go−like potassium Channel 1、voltage−gated potassium Channel protein、sodium Channel、nonvoltage−gated 1、delta、voltage−dependent N−type calcium Channel、aquaporin、calcium Channel、voltage−dependent、alpha、similar to transient receptor potential cation Channel、ryanodine receptor 3、transient receptor potential cation Channel、potassium Channel sub K、cyclic nucleotide gated Channel alpha、similar to Rattus norvegicus potassium Channel regulator 1 mRNA、similar to Chloride Channel protein 3 (C1C−3)、calcium−activated Chloride channel−2、lens fiber membrane intrinsic protein、sperm ion Channel、similar to Shaw−related potassium Channel protein Rawl、dihydropyridine−sensitive L−type、calcium Channel alpha−2/delta subunits precursor、similar to voltage−dependent anion Channel 2、mid−1−related Chloride Channel、similar to potassium Channel subunit (Slack)、ATPase、Ca++ transporting、fast twitch 1、plasma membrane calcium−transporting、vacuolar proton translocating ATPase 116 kDa subunit A、sodium/potassium−transporting ATPase alpha−3 chain、copper−transporting ATPase 1 (Copper pump 1) (Menkes disease−associated protein)、probable cation−transporting ATPase 3 (Fragment)、vacuolar ATP synthase subunit S1 precursor、similar to Potential phospholipid−transporting ATPase ID、sodium/potassium−transporting ATPase beta−3 chain、tyrosine kinase、protein−tyrosine Phosphatase、non−receptor type 5、putative transmembrane GTPase (Fragment)、epidermal growth factor (beta−urogastrone)、protein kinase C−like 1、weakly similar to RAS suppressor protein 1、dioxin receptor repressor、cAMP−specific 3’,5’−cyclic Phosphodiesterase 4A、MAP−kinase activating death domain−containing protein、isoform g、ras guanine nucleotide exchange factor 2 (Fragment)、NADPH−dependent FMN and FAD containing oxidoreductase、dolichyl−diphosphooligosaccharide−−protein glycosyltransferase 63 kDa subunit precursor、phosphatidylinositol glycan、class B、A kinase (PRKA) anchor protein 13、85 kDa calcium−independent phospholipase A2、A−Raf proto−oncogene serine/threonine−protein kinase、similar to peptidylprolyl isomerase A (cyclophilin A)、Ras−related GTP−binding protein、similar to sphingosine−1−phosphate Phosphatase 1、WNT−10A protein precursor、similar to ADP−ribosylation factor−like 1、transforming growth factor alpha precursor、guanine nucleotide exchange factor、protein−tyrosine Phosphatase、non−receptor、similar to putative serine/threonine protein kinase、calcium/calmodulin−dependent protein kinase type IV catalytic chain、similar to phosphatidylinositol−4−phosphate 5−kinase、type II、gamma、similar to 52 kDa repressor of the inhibitor of the protein kinase (p58IPK−interacting protein) (58 kDa interfe−ron−induced protein kinase−interacting protein) (P52rIPK) (Death associated protein 4)、apoptosis regulator、SH2 domain−containing Phosphatase anchor protein 1、similar to RHO−GAP hematopoietic protein C1、similar to phosphatidylinositol 3−kinase delta catalytic subunit、similar to tumor−associated calcium signal transducer 1 precursor (Major gastr
ointestinal tumor−associated protein GA733−2) (Epithelial cell surface antigen) (Epithelial glycoprotein) (EGP) (Adenocarcinoma−associated antigen) (KSA) (KS 1/4 antigen)、proto−oncogene tyrosine−protein kinase ROS precursor、membrane−bound transcription factor site 2 protease、inositol polyphosphate 5−phosphatase、microsomal signal peptidase 25 kDa subunit、similar to AMP−activated protein kinase gamma subunit、tumor necrosis factor ligand super member 8、sterol regulatory eleraent binding protein cleavage−activating protein、transmembrane protease、serine 3、isoform 3、similar to Ser−Thr protein kinase related to the myotonic dystrophy protein kinase、membrane−bound transcription factor site−1 protease precursor、similar to 52 kDa repressor of the inhibitor of the protein kinase (p58IPK−interacting protein) (58 kDa interferon−induced protein kinase−interacting protein) (P52rIPK) (Death associated protein 4)、PAS−kinase、serine/threonine protein Phosphatase 2B catalytic subunit、alpha isoform、signal transduction protein CBL、rab proteins geranylgeranyltransferase component A 2、similar to Rho−interacting protein 2 (Rho−guanine nucleotide exchange factor) (RhoGEF) (RIP2)、pre−mRNA splicing factor ATP−dependent RNA helicase PRP16、splicing factor 3b、subunit 1、155kD、SP110 nuclear body protein、isoform a、similar to SMC2 structural maintenance of chromosomes 2−like 1 (yeast)、similar to Polymerase (DNA directed)、theta、nuclear factor I/B、nurim (nuclear envelope membrane protein)、similar to nuclear receptor coactivator 4、weakly similar to splicing factor、arginine/serine−rich 4、similar to Elongation factor 1−alpha 1 (EF−1−alpha−1) (Elongation factor 1 A−1) (eEFlA−1) (Elongation factor Tu) (EF−Tu)、similar to 6OS ribosomal protein L7、deoxyribonuclease II alpha putative、nuclear factor of kappa light Polypeptide gene enhancer in B−cells inhibitor、epsilon、solute carrier 25 (mitochondrial carrier)、similar to cytochrome b−561、cytochrome oxidase subunit I、succinyl−CoA ligase [GDP−forming] beta−chain、mitochondrial precursor (Fragment)、similar to Cytochrome oxidase biogenesis protein OXA1、mitochondrial precursor (OXA1−like protein) (OXA1Hs)、NADH−Ubiquinone Oxidoreductase Chain 5、trifunctional enzyme beta subunit、mitochondrial precursor、methylcrotonyl−CoA carboxylase beta chain、mitochondrial precursor、similar to cytochrome c oxidase subunit III、putative ATP−dependent CIp protease proteolytic subunit、mitochondrial precursor、NADH−ubiquinone oxidoreductase 39 kDa subunit、mitochondrial precursor、second mitochondria−derived activator of caspase、isoform Smac−delta、precursor、similar to NADH dehydrogenase subunit 5、mitochondrial import inner membrane translocase subunit TIM23、similar to cytochrome b、mitochondrial precursor proteins import receptor、Cytochrome c oxidase Polypeptide II、short chain 3−hydroxyacyl−CoA dehydrogenase、mitochondrial precursor、similar to 60 kDa heat shock protein、mitochondrial precursor (Hsp 60)、Cytochrome c1、heme protein、mitochondrial precursor、protoheme IX farnesyltransferase、mitochondrial precursor、glycerol−3−phosphate dehydrogenase、mitochondrial precursor、homeobox protein Hox−A7、transcriptional regulator ATRX、similar to general transcription factor II、i、isoform 1、similar to general transcription factor IIIC、Polypeptide 1 (alpha subunit、220kD )、transcriptional activator SRCAP、sterol/retinol dehydrogenase、alkaline phytoceramidase、carnitine O−palmitoyltransferase I、mitochondrial liver isoform、similar to bA84N7.1 (novel protein similar to diacylglycerol kinase eta (DGKH) )、1−acyl−sn−glycerol−3−phosphate acyltransferase epsilon、mannose−P−dolichol utilization defect 1 protein、sterol O−acyltransferase 2、apolipoprotein L1 precursor、phosphatidylcholine−sterol acyltransferase precursor、fatty acid hydroxylase、moderately similar to Mus musculus putative lysophosphatidic acid acyltransferase mRNA、weakly similar to phospholipase A2 inhibitor subunit B precursors、phosphatidylinositol−glycan biosynthesis、class F protein、serine palmitoyltransferase 1、phosphatidylserine synthase I、similar to 1−acyl−sn−glycerol−3−phosphate acyltransferase gamma (1−AGP acyltransferase 3) (1−AGPAT 3) (Lysophosphatidic acid acyltransferase−gamma) (LPAAT−gamma) (1−acylglycerol−3−phosphate O−acyltransferase 3)、similar to Triacylglycerol lipase、gastric precursor (Gastric lipase) (GL)、3−hydroxy−3−methylglutaryl−coenzyme A reductase、ceramide glucosyltransferase、dolichyl−P−Man:Man (5) GIcNAc (2) −PP−dolichyl mannosyltransferase、N−acetylglucosaminyl−phosphatidylinositol de−N−acetylase、dolichyl−diphosphooligosaccharide−protein glycosyltransferase 67 kDa subunit precursor、diacylglycerol kinase、zeta、apolipoprotein F、similar to fatty acid amide hydrolase、similar to Long−chain−fatty−acid−CoA ligase 6 (LACS 6)、farnesyl pyrophosphate synthetase (FPP synthetase)、sphingomyelin Phosphodiesterase 2、neutral membrane (neutral sphingomyelinase)、estradiol 17 beta−dehydrogenase 7、phosphatidyl inositol glycan class S、24−dehydrocholesterol reductase precursor、oxysterol−binding protein 1、1−acyl−sn−glycerol−3−phosphate acyltransferase beta、myo−inositol−1 (or 4) −monophosphatase、estradiol 17 beta−dehydrogenase7、
1−acyl−sn−glycerol−3−phosphate acyltransferase beta、putative fatty acid desaturase MLD、CDP−diacylglycerol−inositol 3−phosphatidyltransferase、lysosomal apyrase−like protein 1、acyl−malonyl condensing enzyme、ubiquitin−conjugating enzyme E2、thyroid peroxidase precursor (2 members)、UDP−N−acetylglucosamine−−dolichyl−phosphate N−acetylglucosaminephosphotransferase、N−acetylglucosamine−1−phosphodiester alpha−N−acetylglucosaminidase、3 beta−hydroxysteroid dehydrogenase/delta 5−−>4−isomerase type II、similar to adenylate cyclase 6、isoform a、similar to cytochrome P450 IID6、GaINAc 4−sulfotransferase、GPI transamidase、proprotein convertase subtilisin/kexin type 7、NEDD4−like ubiquitin ligase 1、hyaluronan synthase 2、ketohexokinas、testis ecto−ADP−ribosyltransferase precursor、alkaline Phosphatase、intestinal precursor、5,6−dihydroxyindole−2−carboxylic acid oxidase precursor、biotin−−protein ligase、dolichyl−diphosphooligosaccharide−protein glycosyltransferase、squalene monooxygenase、ubiquitin specific protease、similar to glycerol kinase、probable dolichyl pyrophosphate Glc1Man9G1cNAc2 alpha−1,3−glucosyltransferase、gamma−glutamyltranspeptidase 1 precursor、serine hydrolase−like protein、phosphatidate cytidylyltransferase 2、DNA topoisomerase II、beta isozyme、lysosomal acid Phosphatase precursor、muscle−specific DNase I−like precursor、similar to kynurenine 3−monooxygenase、similar to Peptidylglycine alpha−amidating monooxygenase、N−acetylglucosamyl transferase component GPI1、similar to cGMP−inhibited 3,5−cyclic Phosphodiesterase A (Cyclic GMP inhibited Phosphodiesterase A) (CGI−PDE A)、beta−1,4 mannosyltransferase、cholinephosphotransferase 1、moderately similar to Homo sapiens neuropathy target esterase、CAAX prenyl protease 1 homolog、pantothenate kinase lalpha、similar to N−acetylglucosaminyltransferase VI、Cytochrome P450 39A1、similar to Glyceraldehyde 3−phosphate dehydrogenase、liver、similar to Beta−1,4 N−acetylgalactosaminyltransferase、CAAX prenyl protease 2、beta−1,3−galactosyltransferase−6、hexosaminidase A、carbonic anhydrase−related protein 2 precursor、vitamin K−dependent gamma−carboxylase、malate dehydrogenase、cytoplasmic、mannosyltransferase、long form of N−acetylglucosamine−6−O−sulfotransferase、sialic acid−specific acetylesterase II、similar to uracil DNA glycosylase、beta−hexosaminidase beta chain precursor、similar to L−lactate dehydrogenase B chain (LDH−B)、probable serine protease HTRA3 precursor、weakly similar to UDP−N−acetylglucosamine−−peptide N−acetylglucosaminyltransferase 110 kDa subunit、neutral sphingomyelinase II、similar to putative N−acetyltransferase Camello 2、weakly similar to NADPH−cytochrome P450 reductase、sirailar to ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase 5、similar to 3−OXO−5−alpha−steroid 4−dehydrogenase 2、blood plasma glutamate carboxypeptidase precursor、xylosyltransferase II、casein kinase I、epsilon isoform、selenide、water dikinase 2、paraoxonase 2、similar to NADH−ubiquinone oxidoreductase MLRQ subunit、similar to ADAMTS−5 precursor (A disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 5) (ADAM−TS 5) (ADAM−TS5) (Aggrecanase−2) (ADMP−2) (ADAM−TS 11)、galactose−3−O−sulfotransferase、valyl−tRNA synthetase 2、ribonuclease H1、acetyl−CoA carboxylase 2、similar to alpha−L−iduronidase precursor、similar to ADAMTS−5 precursor (A disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 5) (ADAM−TS 5) (ADAM−TS5) (Aggrecanase−2) (ADMP−2) (ADAM−TS 11)、kunitz−type Protease inhibitor 1 precursor、putative sialoglycoprotease type 2、ubiquitin−activating enzyme E1 homolog、prenylcysteine lyase precursor、dimeric dihydrodiol dehydrogenase、glycosyltransferase、integrin alpha−V precursor、axoneraal dynein heavy chain (Fragment)、cop−coated vesicle membrane protein p24 precursor、protocadherin ARCADLIN、Keratin、type I cytoskeletal、nuclear envelope pore membrane protein、gamma−tubulin complex component 6、Cleft lip and palate associated transmembrane protein 1、Sec61 homolog、presenilins associated rhomboid−like protein、putative prostate Cancer tumor suppressor、signal recognition particle receptor (’docking protein’)、HLA class I histocompatibility antigen、B−8 B*0801 alpha chain precursor、weakly similar to peregrine、HLA class II histocompatibility antigen、beta chain precursor、Kit ligand precursor、Ret finger protein 2、ASPP1 protein、neuronal membrane glycoprotein M6−a、membrane cofactor protein (CD46、trophoblast−lymphocyte cross−reactive antigen)、vesicle trafficking protein、epithelial membrane protein−1、neurexin 3−beta precursor、intercellular adhesion molecule−3 precursor、presenilin 2、BCL2/adenovirus E1B 19−kDa protein−interacting protein 2、corticosteroid−binding globulin precursor、T−cell surface glycoprotein CD8 alpha chain precursor、capillary morphogenesis protein−2 precursor、trans−golgi network protein 2、bax inhibitor−1、vang−like 1 (van gogh、Drosophila)、tuberous sclerosis 2 isoform 2、P protein、down Syndrome cell adhesion molecule precursor、vascular cell adhesion protein 1 precursor、clathrin assembly lymphoid myeloid leukemia protein、kelch−like protein 2、myeloid/lymphoid or mixed−lineage leukemia (trithorax homolog、Drosophila)、transmembrane 4 super、microtubule−associ
ated protein 1A、tetraspanin、synaptotagmin XI、spinster−Like Protein、integrin beta 1 isoform 1A precursor、weakly similar to patched protein homolog 1、pro−neuregulin−2 precursor、tumor metastasis−suppressor、sel−1 homolog precursor、150 kDa oxygen−regulated protein precursor、mu−protocadherin related protein splice variant、weakly similar to protein PTM1 precursor、weakly similar to cochlin precursor、similar to TRAM protein (Translocating chain−associating membrane protein)、COP9 complex subunit 7A、calcium binding atopy−related autoantigen 1、similar to metaxin 1、envelope protein precursor、protein associated with Myc、ocular albinism type 1 protein、PL6 protein、unknown function but deleted in small cell lung Cancer (Fragment)、tumor endothelial marker 5 precursor、tumor suppressor protein DCC precursor、mucin、tumor endothelial marker 7−related precursor、zinc finger protein 179、alpha integrin binding protein 63、similar to Stromal interaction molecule 1 precursor、similar to Homo sapiens squamous cell Carcinoma antigen recognized by T cell、P400 SWI2/SNF2−related protein、NgCAM−related related cell adhesion molecule (Fragment)、similar to transmembrane protein induced by tumor necrosis factor alpha、similar to Apobec−1 complementation factor、APOBEC−1 stimulating protein、malignant cell expression−enhanced gene/tumor progression−enhanced gene、putative ferritin (Fragment)、weakly similar to human DHHC−domain−containing cysteine−rich protein mRNA、similar to multiple endocrine neoplasia I、similar to HIRA protein (TUP1 like enhancer of split protein 1)、envelope protein、transmembrane 7 super protein member 3 precursor、bladder Cancer overexpressed protein、transmembrane protein vezatin、golgi apparatus protein 1 precursor、vascular non−inflammatory molecule 2 precursor、E−selectin precursor、myeloid cell surface antigen CD33 precursor、similar to FH1/FH2 domains−containing protein (Formin homolog overexpressed in spieen) (FHOS)、patched protein homolog 1、pannexin 3、scleroderma−associated autoantigen、ecotropic viral Integration site 2B、alpha−sarcoglycan precursor、hematopoietic progenitor cell antigen CD34 precursor、hepatocellular carcinoma−associated antigen 112、neuropilin 1、basigin precursor、pregnancy−associated plasma preproprotein−A2、basement membrane−specific heparan sulfate proteoglycan core protein precursor、high−risk human papilloma viruses E6 oncoproteins targeted protein E6TP1 beta、highly similar to Rattus norvegicus db83 mRNA、transducin−like enhancer protein 2、protocadherin fat 2、Unc−93 related protein、retinoblastoma−associated factor 600、CD44 antigen (homing function and Indian blood group System)、meprin A alpha−subunit precursor、similar to Podocalyxin−like protein 1 precursor、similar to Mus musculus ganglioside−induced differentiation associated protein 1、leucine−rich repeat protein LRRC3 precursor、endothelial and smooth muscle cell−derived neuropilin−like protein、source of immunodominant MHC−associated peptides、fibulin 2 precursor、CD3Z antigen、zeta Polypeptide、T−cell surface glycoprotein CD3 gamma chain precursor、pancreatic secretory granule membrane major glycoprotein GP2 precursor、signaling lymphocytic activation molecule precursor、alzheimer ’ s disease amyloid A4 protein precursor、protein pM5 precursor、similar to dynein light chain−A、lymphocyte−activation protein 3 precursor、progressive ankylosis protein homolog、erythrocyte band 7 integral membrane protein、SYG1 protein、similar to SYNAPSINS IA and IB、similar to amyotrophic lateral sclerosis 2 (juvenile) chromosome region、candidate 2、polycystic kidney disease 1 protein、niemann−Pick C1 protein precursor、DNAJ protein homolog 1、thrombomodulin precursor、weakly similar to occluding、Occludin、similar to rennin、junctophilin type3、similar to homeotic protein CHox3 − chicken、similar to Glycolipid transfer protein (GLTP)、proteasome subunit alpha type、extracellular matrix protein、delta−sarcoglycan、prominin−like protein 1 precursor、translocon−associated protein、delta subunit precursor、peroxisome biogenesis factor 1、neuroglycan C、SH3 adapter protein SPIN90、Mcd4p homolog、T lymphocyte activation antigen CD80 precursor、similar to calcium−binding protein CaBP7、tight junction protein ZO−1、dysferlin、dachshund 2、barttin、T−cell surface glycoprotein CD5 precursor、brain specific membrane−anchored protein precursor、similar to Fatty acid−binding protein、heart (H−FABP) (Muscle fatty acid−binding protein) (M−FABP) (Mammary−derived growth inhibitor) (MDGI)、peroxisome assembly factor−1、pentaxin−related protein PTX3 precursor、neuropilin and tolloid like−1、cat eye Syndrome critical region protein 6、peptidoglycan recognition protein−I−alpha precursor、signal recognition particle receptor beta subunit、similar to ralA binding protein 1、T−cell surface protein tactile precursor、transmeitibrane gamma−carboxyglutamic acid protein 4 precursor、JAW1−related protein MRVI1A long isoform、peroxisomal membrane protein PEX13、zona pellucida sperm−binding protein 2 precursor、similar to proteasome (prosome、macropain) subunit、beta type、3、cell surface glycoprotein MUC18 precursor、similar to golgi autoantigen、golgin sub a、2、ISS〜homolog to INHIBITOR OF CAR
BONIC ANHYDRASE PRECURSOR〜putative、similar to Alpha−2 catenin (Alpha−catenin related protein) (Alpha N−catenin)、sterol regulatory element binding protein−1、similar to Transcription elongation factor S−II (Transcription elongation factor A)、protocadherin 15 precursor、homolog of DROSOPHILA HEADCASE、calmin、oxysterol binding protein−related protein 8、Nesprin−1 alpha、SOX−13 protein、DNA−directed RNA Polymerase I largest subunit、ANTHRACYCLINE−associated resistance ARX、similar to Matrin 3、blood vessel epicardial substance、wolframin、fibroblast growth factor−4 precursor、noggin precursor、transcobalamin I precursor、von Willebrand factor precursor、laminin beta−3 chain precursor、similar to CAP−binding protein complex interacting protein 2、calsyntenin−2、brother of CDO、hepatocellular carcinoma−associated antigen 137、testis−specific protein TEX28、megakaryocyte−enhanced gene transcript 1 protein、similar to vitelliform macular dystrophy (Best disease、bestrophin)、similar to integrin alpha−2b chain precursor − human、mucin 2 precursor、male−specific lethal−3 homolog 1、protocadherin Flamingo 2、STRA6 isoform 1、cystinosin、ELK4 protein、isoform b、similar to apoptosis regulator bcl−x isoform −human、endoglin precursor、similar to 1 beta dynein heavy chain、similar to WNT−5A protein precursor、similar to H3.3 like histone MH321 − mouse、MHC class II regulatory factor RFX1、sarcospan、mandaselin long form、matrilin−2 precursor、similar to DESC1 protein、interphotoreceptor matrix proteoglycan 200、inhibin alpha chain precursor、interphotoreceptor matrix proteoglycan 200、male−specific lethal−3 homolog 1、nephrin precursor、matrilin−2 precursor、M130 antigen cytoplasmic variant 2 precursor、cleavage and polyadenylation specificity factor、160 kDa subunit、blood vessel epicardial substance、transmembrane 6 super member 2 (Fragment)、similar to Zinc finger protein HRX (ALL−1) (Trithorax−like protein)、NgCAM−related related cell adhesion molecule (Fragment)、polycystin−1L1、similar to Dynamin−1、similar to OTK27、platelet glycoprotein Ib beta chain precursor、NMD protein、intersectin 2、matrilin−2 precursor、ERGIC−53 protein precursor、translocon−associated protein、gamma subunit、weakly similar to zinc/cadmium resistance protein、quiescin、similar to prot GOR、megakaryocyte−enhanced gene transcript 1 protein。
ある酵素がフェコステロールからエピステロールへ、および/またはチモステロールからコレスタ−7−24−ジエン−3β−オールへの反応を触媒できる場合、その酵素はデルタ7−デルタ8−異性化酵素活性を備えている。このような酵素は、好ましくはすでに本発明による有機体野生型中で発現される。野生型がこの酵素を発現しない、または十分に発現しない場合は、本発明による有機体が、この酵素のためにコード化された遺伝子により、好ましくは構成的に活性のプロモーターの支配下で有機体が追加的に転換されてよい。
すべてのプライマーは、Metabion社(マルティンスリート)によって合成された。
pFlat−ベクター系(Veen, M., Dissertation, TU−Berlin(2002))
以下の試験では、異なった株の酵母S. cerevisiaeがpFlat−ベクター系のpFlat1−またはpFlat3ベクターによって転換される(非特許文献4)。この大腸菌<−>S. cerevisiae「シャトルベクター」は、NotIおよびXhoIの制限酵素切断部位を「Multible cloning site(多重クローニング部位)」内に含んでおり、この部位はクローニングのための本作業で使用される。さらに、この核外遺伝子はLEU2−(pFlat3)またはURA3−遺伝子(pFlat1)を持っており、これらは栄養要求性マーカー遺伝子として、核外遺伝子を持つ株を選択するために適切な最少培地上で使用される。
真核の発現ベクターpCisは、ラット−セロトニントランスポーターのcDNAを含み、このトランスポーターは制限酵素切断部位XhoIとHpaIの間に挿入された。
Escherichia coli K12 JM109
[recAI endA1 gyrA96 thi hsdR17 supE44 λ−relA1 Δ(lac−proAB)/F’ traD36 proA+B+lacIqlacZΔM15]
(非特許文献5)
Saccharomyces cerevisiae GRFura3
[MATa leu2−3, leu2−112, his4−519, can1, ura3Δ]
(Veen, 2002, 上記参照)
Saccharomyces cerevisiae GRFcol
[MATa tHMG1−leu2, ERG1−erg5, ERG11−erg6, his3, ura3, can1 ]
(Veen, 2002, 上記参照)
LB培地
1%トリプトン;0.5%酵母抽出物;0.5%NaCl;pH7.4
YE培地:
0.5%酵母抽出物;2%グルコース;pH6.3
YNB培地:
0.67%YNB(「yeast nitrogen base」、Difco、アウグスブルク);2%グルコース
WMVIII:
(LangおよびLooman、上記参照)。1リットルの培地に対して:50gのサッカロース;250mgのNH4H2PO4;2.8NH4Cl;250mgのMgCl2x6H2O;100mgのCaCl2x2H2O;2gのKH2PO4;550mgのMgSO4x7H2O;75mgのメソイノシトール;10gのNaグルタミン酸;1mlの1000x微量元素溶液;4mlの250xビタミン溶液
微量元素:
1000x濃縮:1.75gのZnSO4x7H2O;0.5gのFeSO4X7H2O;0.1gのCuSO4x5H2O;0.1gのMnCl2x4H2O;0.1gのNaMoO4x2H2O、1リットルに対して
ビタミン溶液:
250x濃縮:2.5gのニコチン酸;6.25gのピリドキシン;2.5gのチアミン;0.625gのビオチン;12.5gのCa−パントテナート、1リットルに対して
アンピシリン(Boehringer、マンハイム)50μg/ml
培地サプリメント:
ロイシン(0.4g/l);ヒスチジン−HCl(20mg/l)
Laemmliバッファー(4x):
0.2Mのトリス−HCl、pH6.8;8%のSDS;0.4%のブロモフェノールブルー;40%のグリセロール;400mMのDTT;4%のトリトン−X
PBS(「Phosphat buffered saline(リン酸緩衝生理食塩水)」):
150mMのNaCl;8.4mMのNa2HPO4;1.6mMのKH2PO4、pH7.4
PBS−T:
1xPBS、pH7.4;0.05%のツイーン20
ストッパー溶液(4x):
60%(w/v)サッカロース;20mMのEDTA;0.025%(w/v)ブロモフェノールブルーTAEバッファー:20mMの酢酸ナトリウム;40mMのトリス;2mMのEDTA;pH8.3
TB−1バッファー:
100mMのNaCl;2mMのKCl;1mMのCaCl2、1mMのMgCl2、10mMのHEPES;pH7.5
TEバッファー(10x):
0.1Mのトリス−HCl;0.01MのEDTA、pH8.0
TEDバッファー:
10mMのトリス−HCL、pH7.6;1mMのEDTA;1mMのDTT
1.6.1:培養
好気培養
大腸菌の培養は100mlの三角フラスコ中で37℃でおよび160rpmで回転式振盪培養機上のLB培地で行った。核外遺伝子を持つ株を選択するために抗生物質アンピシリン(50μg/ml)が投入された。酵母S. cerevisiaeの前培養は、30℃および160rpmで100 mlの三角フラスコ中で、および本培養は250mlのバッフル付き三角フラスコ中で回転式振盪培養機上で培養された。明確に異なった記述がない限り、酵母S. cerevisiaeの培養全体はWMVIII培地(非特許文献6)に1mg/mlのヒスチジンを補足して行っている。
明確に記載されている場合、Stammes S. cerevisiae GRFura3、pFlat3−rSERTまたはpFlat3−leerの株培養は、厳密な嫌気条件下で、以下のように行われた:20mlの前培養が、「好気培養」のところに記述されているように、48時間培養された。本培養は、1%の前培養で植菌され、および250mlのバッフル付き三角フラスコ中で50mlのWMVIII培地に1mg/lのヒスチジンおよび40mg/lのコレステロールを補足して、厳格な嫌気条件下で30℃および160rpmで回転式振盪培養機上で培養された。これに関して、バッフル付き三角フラスコは、2.5lの嫌気性ポット(Merck、ダルムシュタット)で2つのガスパック(Anaerocult A, Merck、ダルムシュタット)と共にインキュベートされた。コレステロール補足は0.5ml(培地50ml当たり)のコレステロール溶液(2.5gのエタノール;2.5gのツイーン80;20mgのコレステロール)で行われ、その結果終末濃度が1リットルの培地当たり40mgのコレステロールとなった。
制限
DNA制限(1〜10μg)は、30μlのバッチ中で行い、これはDNA、3μlの適切なバッファー、1μlのRSA(3mg/ml)および1Uの酵素(NotIおよびXhoI、BioLabs、シュヴァルバッハ)(投入したDNA1μg当たり)から構成されている。このバッチは、37℃で2時間インキュベートされた。PCR単位複製配列の制限のため、4時間インキュベートされた。
アガロースゲル電気泳動法は、Minigelゲル装置(BioRad、ミュンヘン)中で実施された。ゲルはTAEバッファー中の1%のアガロースから構成された。ランニングバッファーとして同様にTAEバッファーが使用された。10μlの試料が3μlのストッパー溶液で処理された。フラグメントの基準として、2kb〜13kbの間のλ−DNA(BioLabs、シュヴァルバッハ)が、Hindlll(バンドサイズ:23.1kb;9.4kb;6.6kb;4.4kb;2.3kb;2.0kbおよび0.6kb)によって制限された。500bp〜3kbの間のより小さいフラグメントのためにはマーカーGeneRuler(MBI Fermentas、ザンクト・レオン=ロート)が、および3kb〜10kbのフラグメントのためにはマーカー1kbのDNAラダー(New England Biolabs)が使用された。DNAフラグメントの分離のために、100Vの電圧が30〜45分間かけられた。その後でゲルがエチジウムブロマイド溶液(0.4mg/1TAEバッファー)で着色され、およびUVライト(254nm)照射下で記録された。
DNAは水溶液から、析出を使用して濃縮された。そのためにDNA溶液が1/10量の3Mの酢酸ナトリウム(pH4.8)および2.5倍量のエタノール(96%)で処理された。バッチは30分間20℃でインキュベートされ、および続いて14000xgで遠心分離された。次いでDNAペレットは再度70%のエタノールで洗浄され、および14000gで5分間遠心分離された。風乾ペレットは、所望の量のTEバッファー中で再懸濁され、および−20℃で保管された。
T4−DNA−リガーゼは、二重鎖DNA中のヌクレオチドの3’−ヒドロキシル基と第二のヌクレオチドの5’−リン酸塩基の間の共有リン酸ジエステル結合の結合を触媒する。核酸連結するべきフラグメントは、DNA精製キット(Qiagen、ヒルデン)を使用して、メーカーの指示に従って精製しおよびベクター中で挿入DNA比率3:1で統合し、および17μlの量で収容された。続いて2μlのリガーゼバッファー(MBI Fermentas、ザンクト・レオン=ロート)および1μlのT4−リガーゼ(1U/μl)を加え、バッチを2時間、「sticky−end−Ligation(付着末端ライゲーション)」の場合は16℃でインキュベートされた。
大腸菌細胞と核外遺伝子DNAとの転換は、電気穿孔法によって行われる。電気的コンピテント細胞の準備のために、一夜培養物1%が500mlの新鮮LB培地に植菌され、および好気的に37℃で、光学的濃度が0.5〜0.7になるまで培養された。続いて細胞が5000xgで10分間遠心分離され、および200mlの氷温の10%グリセロールで再懸濁された。さらなる遠心分離段階(5000xgで10分間)の後、細胞が100mlの氷温の10%グリセロールで再懸濁された。再度5000xgで10分間遠心分離され、50mlの氷温の10%グリセロールで再懸濁された後、細胞は10分間5000xgで遠心分離され、上澄みが捨てられ、およびペレットが逆流したグリセロールで再懸濁され、65μlのアリコートに分割され、および−80℃で凍結された。転換のために、100〜200ngの核外遺伝子DNAが30μlのコンピテント細胞と1.5mlのサンプリングチューブ中で混合され、および1分間氷の上でインキュベートされた。続いてバッチが、滅菌されて氷上であらかじめ冷やされた電気穿孔キュベットに移され、および電気穿孔(1.67kV、25μF、200Ω、5ミリ秒)がマルチポレーター(Eppendorf、ハンブルク)で実施された。パルス付与後、即座に1mlのYE培地が添加され、1.5mlのサンプリングチューブに移された。バッチはここで再生のために1時間、37℃でインキュベートされ、および続いてLB寒天プレート上でアンピシリンと、選択のためにプレート化された。
該当する大腸菌株は5mlのLB培地中に50mg/lのアンピシリンと植菌され、および一晩37℃で培養された。次に細胞が5000xgで遠心分離された。上澄みが捨てられ、核外遺伝子DNAがミニプレップキット(Qiagen、ヒルデン)を使用して、メーカーの指示に従って処理された。
ポリメラーゼ連鎖反応により特殊なプライマーを使用して、分離されたDNAから、または直接完全な大腸菌細胞からDNAフラグメントを増幅することができる。標準的には、PCR反応のために100ngのテンプレートDNAが1μlのH2Oに溶かされるか、または1つの大腸菌コロニーが爪楊枝を使用してPCRチューブ内に移され(コロニーPCR)適用される。テンプレートのほかに、反応バッチは、4μlのdNTP−Mix(2.5mM)、5μlの10x反応バッファー、それぞれ2μlのプライマー(フォワードおよびリバース)、0.2μl(1U)のTaq−ポリメラーゼ(Promega、マンハイム)またはTakara−ポリメラーゼ(Takara、東京、日本)およびH2Oから構成され、総量が50μlである。PCRはサーモサイクラー(Biorad、ミュンヘン)中でバッチ毎に実施された。分析のために、10μlのPCRバッチがアガロースゲル上で分離されるかまたは別の使用のためにPCR精製キット(Qiagen、ヒルデン)を使用して精製され、および30μlの量に濃縮された。
酵母転換のために前培養が20mlのYE培地中で一晩培養された。50mlの本培養が、0.3の光学的濃度OD600で植菌されおよび約4時間培養された。0.8〜1.0のOD600が達成された後、細胞は4000gで10分間遠心分離され、および細胞ペレットが10mlの滅菌されたH2Oで洗浄された。続いて細胞が1.5mlのH2Oに入れられ、およびサンプリングチューブ内に移された。細胞が遠心分離され、(4000g、2分間)および1mlの酢酸リチウム溶液(100mMのLiAc、TEバッファー中)で再懸濁され、遠心分離され(4000xg、2分間)および再度1mlの酢酸リチウム溶液で洗浄された。続いて細胞が200μlの酢酸リチウム溶液に入れられた(コンピテント細胞)。転換バッチのために、40μlのコンピテント細胞、10μlのニシン精子DNA(10mg/ml)、230μlのPEG溶液(40%のPEG4000を0.1Mの酢酸リチウム中、1xTE、pH8.0)および1〜20μgの転換するべきDNAが入れられた。このバッチは、30分間30℃でインキュベートされ、および続いて熱ショックに42℃で8分間さらされた。室温まで冷却された後、800μlのH2Oが加えられ、およびバッチが7000xgで20秒間遠心分離された。続いて細胞が直接適切が選択培地上に寒天と共にプレート化され、および3〜5日間30℃でインキュベートされた。4.2.2章に言及された二重転換、つまり2つのベクターによる同時転換は、それぞれのベクターに転換バッチを約30μg含んでいる。それに加えてベクターDNAが沈降され、および10μlのH2O中に入れられた。40μlのコンピテント細胞が加えられ、およびPEG溶液およびニシン精子DNAが加えられる前にこのバッチが30分間37℃でインキュベートされた。その後、上述の方法で実施された。
ステロール分析の培養条件
ステロール分析は酵母培養液で以下のスキームが実施された:20mlの前培養が50μlの凍結培養物で植菌され、および2日間培養された。本培養が250mlのバッフル付き三角フラスコ中で50mlの培地(WMVIII培地、1mg/mlのヒスチジンを補足)と回転式振盪培養機上で160rpm、30℃で1ないし3日間実施された。本培養は1%の前培養で植菌された。
乾燥物質を判定するために、3×6mlの培養量があらかじめ正確に軽量された15mlのGreinerチューブに移された。細胞は3500gで5分間遠心分離され、および10mlのH2Oで洗浄された。続いて細胞ペレットは乾燥戸棚で12時間80℃で乾燥された。試料は計量される前に乾燥器内で冷まされた。
検査するべき細胞が集められ、および40mlのH2Oで洗浄された。次に光学的濃度OD600が規定され、および酵母ペレットが、125のOD600に相当する、5mlの0.5NのHCl−溶液に入れられた。それから懸濁液が50mlのFalconチューブ中で20分間100℃で煮沸された。このようにして弱体化された細胞が、次に氷上で冷却され、および3gのKOHの溶液が加えられた。KOHの溶解後、0.25g/lメタノールピロガロール溶液が12.5ml加えられた。抽出標準として、追加的に10μlのコレステロール溶液(10mg/ml)が加えられた。鹸化混合物は1時間45分70℃でインキュベートされた。このバッチが室温まで冷まされた後、ステロールが2x20mlのn−ヘキサンで抽出された。n−ヘキサン−段階と組み合わせて、回転蒸発装置で制限され、および残留物が、内部標準として0.2g/lのノナデカンを含む2x1mlのクロロホルムで溶解され、茶色のガラス瓶に移された。ステロール抽出物は分析まで−20℃で保管された。
膜ステロール分析用の試料を準備するため、まず形質膜が検査するべき酵母S. cerevisiaeの株から分離されなければならなかった。これはSerranoの方法(非特許文献7)にいくつかの修正を加えて行われた。この修正は、以下に短く記述される:細胞が集められ、およびH2Oを使った洗浄工程の後で、1mlの1Mのトリス(pH8)、200μlの0.5MのEDTAおよび100μlの200mMのPMSF中に入れられた。続いてガラスビーズを使用して温浸が行われた。遠心分離工程の後、上澄みが除去され、ガラスビーズがTEDバッファーと共に洗浄され、および上澄みがSS34−チューブ中で統合される。より大きな膜小胞および形質膜がここで20000gで30分間ペレット化され、および4mlの20%グリセロール中のペレットが、TEDバッファー中に200μlの0.2MのPMSFと共に入れられ、およびダンス型ホモジェナイザーで均質化された。このホモジェネート3mlが、6ml、53%(w/w)および3ml、43%(w/w)のサッカロースから成り、Beckman社の超遠心分離チューブに入れられて不連続勾配遠心分離器にかけられた。遠心分離は6時間、100,000gで、Beckman SW41−Tiローターで実施された。浄化された形質膜は、パスツールピペットを使用して中間相から取り出すことができ、およびH2Oが充填された新しいBeckman社チューブに移された。形質膜は、続いて80000gで30分間ペレット化され、およびペレットが2mlのTEDバッファー中で再懸濁されて−20℃で保管された。ステロールの抽出のために、1mlの形質膜懸濁液を500μlのクロロホルムで処理され、1分間ボルテックスされた。続いて相分離が13000rpmで15分間行われた。450μlの下部有機相がここでGCチューブに移され、50μlのN−メチル−N−トリメチルシリルトリフルオロアセトアミド(MSTFA, Sigma、ミュンヘン)が加えられた。ステロールの誘導体化は、1時間、80℃で行われた。作られた試料はこれでガスクロマトグラフィーで分析できるようになった。
GC分析はAgilent 6890Nガスクロマトグラフ装置(Agilent、ヴァルトブロン)にAutosampier Agilent 7683Bを取りつけたものを使用して行われた。検出器としてAgilent 5975 VL質量分析計が使用された。以下の条件が選択された:カラムとして、30mの長さのHP−5MSカラム(J&W Scientific、米国)、内径0.25mmおよびフィルム厚0.25μm、が使用された。ヘリウムが移動相として使用された。GC/MSシステムが温度プログラム(100℃0.5分、50℃/分270℃まで、270℃10分間、5℃/分290℃まで、290℃4分間、5℃/分325℃まで、325℃20分間5℃/分340℃まで、340℃2分間)スプリットレスモードで作動した。インジェクター温度は280℃で、検出器の温度は150℃であった。より良好に分離するためおよびステロール中間体の揮発性を高めるために、ステロール試料がMSTFAと共に1時間80℃で乾燥戸棚内で誘導体化された。検査ステロール中間体のモル質量の判定、およびイオン化パターンを使用したその同定は、Agilent 5975 VL質量分析計によって行われた。試料の注入量は2μlであった。
2002年、コレスタ−5,7,24−トリエン−3−オールを酵母S.cerevisiae中で生合成することが確立された(Veen, 2002, 上記参照)。そのために自由に入手可能な実験室株GRF18が以下のように、遺伝子工学的な方法で変更された。
Claims (12)
- 分離された、遺伝的に改変された、生きている非哺乳類有機体であって、野生型に比べて高められたHMG−CoA−還元酵素活性と、野生型に比べて低められたC24−メチル基転移酵素および/またはデルタ22−不飽和化酵素活性を持つ有機体において、野生型に比べて高められたデヒドロコレステロール−デルタ7−還元酵素活性を備えており、
前記有機体は、哺乳類の膜タンパク質のためにコード化された遺伝子により、プロモーターの支配下で有機体が追加的に転換されたものであることを特徴とする、有機体。 - 前記有機体が追加的に野生型と比べて高いデヒドロコレステロール−デルタ24−還元酵素活性を備えていることを特徴とする、請求項1に記載の有機体。
- 野生型と比べて高められたスクアレン−エポキシダーゼ−および/またはラノステロール−デメチラーゼ活性を備えていることを特徴とする、請求項1または2のいずれか一項に記載の有機体。
- 前記有機体が、Bacillus、Escherichia、Lactobacillus、Corynebacterium、Acetobacter、AcinetobacterおよびPseudomonas属の細菌から構成されるグループから選ばれた原核有機体、または海藻、酵母、菌類、昆虫細胞、蘚苔類および植物から構成されるグループから選ばれた真核有機体であることを特徴とする、請求項1〜3のいずれか一項に記載の有機体。
- 前記酵母が、Saccharomyces cerevisiae、Saccharomyces delbrueckii、Saccharomyces italicus、Saccharomyces ellipsoideus、Saccharomyces fermentati、Saccharomyces kluyveri、Saccharomyces krusei、Saccharomyces lactis、Saccharomyces marxianus、Saccharomyces microellipsoides、Saccharomyces montanus、Saccharomyces norbensis、Saccharomyces oleaceus、Saccharomyces paradoxus、Saccharomyces pastorianus、Saccharomyces pretoriensis、Saccharomyces rosei、Saccharomyces rouxii、Saccharomyces uvarum および Saccharomycodes ludwigiiから構成されたグループ、並びにK. lactis K. marxianus var. marxianus、K. thermotoleransのようなKluyveromyces属の酵母、並びにCandida utilis、Candida tropicalis、Candida albicans、Candida lipolyticaおよびCandida versatilisのようなCandida属の酵母、並びにPichia stipidis、Piachia pastoris および Pichia sorbitophilaのようなPichia属の酵母、およびCryptococcus、Debaromyces、Hansenula、Saccharomycecopsis、Saccharomycodes、Schizosaccharomyces、Wickerhamia、Debayomyces、Hanseniaspora、Kloeckera、Zygosaccharomyces、Ogataea、Kuraishia、Komagataella、Metschnikowia、Williopsis、Nakazawaea、Cryptococcus、Torulaspora、Bullera、Rhodotorula、WillopsisおよびSporobolomycesの各属の酵母から構成されるグループから選ばれることを特徴とする、請求項4に記載の有機体。
- 前記有機体の形質膜が、野生型と比べて含有量が高められたデスモステロールおよび/またはコレステロールおよび/または7−デヒドロ−コレステロールおよび/またはラトステロールを備えていることを特徴とする、請求項1〜5のいずれか一項に記載の有機体。
- 哺乳類の前記膜タンパク質が、ヒト形質膜タンパク質であり、構成的に活性のプロモーターの支配下で有機体が追加的に転換されることを特徴とする、請求項1〜6のいずれか一項に記載の有機体。
- デスモステロールおよび/またはコレステロールおよび/または7−デヒドロコレステロールを産生するための、請求項1〜7のいずれか一項に記載の有機体の使用において、前記有機体が好気培養されることを特徴とする、有機体の使用。
- 哺乳類の膜タンパク質を産生するための、請求項7に記載の有機体の使用において、転換された有機体が培養され、コレステロールおよび/またはデスモステロールを加える、または、加えることなく、所与の培養期間の経過後に、膜タンパク質が培養上清からおよび/または有機体から分離されることを特徴とする、有機体の使用。
- 哺乳類の膜タンパク質に結合する物質スクリーニングのための、請求項7に記載の有機体の使用において、前記有機体または前記有機体の膜抽出物が、有機体の事前の培養後に、所与の物質または所与の物質の混合物と接触させられ、有機体、膜抽出物の変化または性質の変化の不在、および/または物質の膜タンパク質との結合または非結合が測定されること、および変化および/または結合の測定時に物質または物質の混合物が膜タンパク質への結合として段階付けされることを特徴とする、有機体の使用。
- 請求項10に記載の方法を実行するためのキットであって、請求項1〜6のいずれか一項に記載の有機体を備え、
有機体を転換するために適切な核酸構造体を含み、
哺乳類の膜タンパク質のためにコード化された、活性のプロモーターの支配下にある核酸を含み、
および、含有しているまたは別に提供される核酸構造体を備えた有機体の転換のため、転換前後の有機体の培養のため、有機体と所与の物質または所与の物質の混合物を接触するため、および有機体の性質の変化および/または物質または物質の混合物の膜タンパク質との結合を測定するためのプロセスを説明する、取扱説明書を含んでいる、キット。 - 形質膜抽出物である膜抽出物であって、請求項1〜7のいずれか一項に記載の有機体から、有機体の温浸、および、膜である形質膜の切り離しによって得られる、膜抽出物であって、
前記膜は、デスモステロールおよび/またはコレステロールおよび/または7−デヒドロ−コレステロールおよび/またはラトステロール、および哺乳類の膜タンパク質のためにコード化された遺伝子から得た膜タンパク質から構成される膜抽出物。
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