JP5877587B2 - Production of microorganism-derived extracellular protease and its use - Google Patents
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Description
本発明は、シグナル配列及びプロ配列に関し、より詳しくは、シグナル配列及びプロ配列をコードするポリヌクレオチド、シグナル配列と、プロ配列と、中性プロテアーゼの成熟配列とが連結しているタンパク質をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有する発現ベクター、該発現ベクターで形質転換された宿主細胞、並びに、該宿主細胞から分泌された中性プロテアーゼを含む培養物に関する。また、本発明は、前記形質転換された宿主細胞を用いた中性プロテアーゼの製造方法、並びに、該製造方法によって製造された中性プロテアーゼを含むプロテアーゼ調製物に関する。 The present invention relates to a signal sequence and a pro sequence, and more specifically, a polynucleotide encoding the signal sequence and the pro sequence, and a protein in which the signal sequence, the pro sequence, and the mature sequence of the neutral protease are linked. The present invention relates to a polynucleotide, an expression vector containing the polynucleotide, a host cell transformed with the expression vector, and a culture containing a neutral protease secreted from the host cell. The present invention also relates to a method for producing a neutral protease using the transformed host cell, and a protease preparation containing the neutral protease produced by the production method.
微生物から菌体外に分泌されるプロテアーゼ（菌体外プロテアーゼ）は、グラム陰性菌に関しては、最初に菌体内でシグナル配列、プロ配列及び成熟配列が連結した不活性のプレプロ型として合成される。その後、シグナル配列により細胞内膜を通過してペリプラズムに移行し、シグナル配列は切断されプロ型に変換される。プロ配列は主に成熟配列部分をフォールディングする分子内シャペロンとして機能している。このプロ配列が切断されることにより、活性を有した成熟型プロテアーゼとして菌体外へ分泌される。また、グラム陽性菌に関しては、最初に菌体内で不活性のプレプロ型として合成された後、細胞壁付近でシグナル配列が細菌内酵素により切断され、菌体外に分泌される。そして、菌体外に分泌されると直ぐに自己触媒的切断（ａｕｔｏｃａｔａｌｙｔｉｃ ｃｌｅａｖａｇｅ）により速やかにプロ配列が切断され、活性を有した成熟配列となることが想定される。 Proteases secreted from microorganisms outside the cells (extracellular proteases) are first synthesized as inactive prepro forms of gram-negative bacteria in which signal sequences, pro sequences and mature sequences are linked. Thereafter, the signal sequence passes through the intracellular membrane and moves to the periplasm, where the signal sequence is cleaved and converted to the pro form. The pro sequence functions mainly as an intramolecular chaperone that folds the mature sequence portion. When this pro sequence is cleaved, it is secreted out of the cell as an active mature protease. As for Gram-positive bacteria, after first synthesized as an inactive prepro form in the microbial cells, the signal sequence is cleaved near the cell wall by an intracellular enzyme and secreted outside the microbial cells. As soon as it is secreted outside the cell, it is assumed that the prosequence is rapidly cleaved by autocatalytic cleavage and becomes an active mature sequence.
一方、糖尿病の根治療法として、膵臓から単離される膵島（インスリン産生細胞）を、糖尿病患者の門脈へ点滴にて移植する膵島移植が知られている。本移植法は、移植の際に患者の開腹手術が必要ないため、安全かつ簡便な糖尿病の根治療法として近年注目されている。通常、膵臓からの膵島の分離は、膵臓をコラゲナーゼ及び中性プロテアーゼにて処理することにより実施されるが、本目的に使用される中性プロテアーゼの一つとしてクロストリディウム・ヒストリティカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）由来の中性プロテアーゼ（亜鉛金属プロテアーゼ）がある。 On the other hand, islet transplantation in which islets (insulin-producing cells) isolated from the pancreas are transplanted by intravenous drip into the portal vein of diabetic patients is known as a root treatment method for diabetes. Since this transplantation method does not require a patient's laparotomy at the time of transplantation, it has recently attracted attention as a safe and simple root treatment for diabetes. Isolation of islets from the pancreas is usually carried out by treating the pancreas with collagenase and a neutral protease. As one of the neutral proteases used for this purpose, Clostridium histolyticum ( There is a neutral protease (zinc metal protease) from Clostridium histolyticum.
これまでクロストリディウム・ヒストリティカム由来の中性プロテアーゼは、前記菌体外プロテアーゼの１種であるため、クロストリディウム・ヒストリティカムの培養上清より製造されているが、クロストリディウム・ヒストリティカムの培養液には非常に多くのプロテアーゼ活性を有するタンパク質が含まれており、調製物にその他のプロテアーゼ様活性が混入する懸念があった。 So far, the neutral protease derived from Clostridium historicum is one of the extracellular proteases, and thus has been produced from the culture supernatant of Clostridium historicum. The culture fluid of Dium Historicum contains a large amount of protein having protease activity, and there is a concern that other protease-like activity may be mixed in the preparation.
そこで、他の中性プロテアーゼ様活性を混入させる恐れがなく、宿主細胞外に活性を有したまま多量に発現させるクロストリディウム・ヒストリティカム由来中性プロテアーゼの製造法が所望されていた。さらには、クロストリディウム・ヒストリティカム由来中性プロテアーゼの分泌機構が解明されることにより、中性プロテアーゼに限らず、目的とするタンパク質を中性プロテアーゼ由来のシグナル配列やプロ配列と融合させた形でクロストリディウム・ヒストリティカム等の宿主細胞内にて発現させ、その活性を維持しつつ、宿主細胞外に分泌された該タンパク質を効率良く調製することができるようになるため、クロストリディウム・ヒストリティカム由来中性プロテアーゼの分泌機構、特にシグナル配列及びプロ配列の同定が所望されていた。 Therefore, there has been a demand for a method for producing a neutral protease derived from Clostridium histolyticum that can be expressed in a large amount while remaining active outside the host cell without the possibility of mixing other neutral protease-like activity. Furthermore, by elucidating the secretory mechanism of Clostridium history cam-derived neutral protease, the target protein is fused not only with neutral protease but also with signal sequence and pro-sequence derived from neutral protease. In this way, the protein secreted to the outside of the host cell can be efficiently prepared while being expressed in a host cell such as Clostridium history cam and maintaining its activity. It has been desired to identify the secretory mechanism of the neutral protease derived from Clostridium histolyticum, in particular the signal sequence and the pro sequence.
そして、このような背景の中、特許文献１には、クロストリディウム・ヒストリティカム由来中性プロテアーゼをコードする核酸の塩基配列、並びに該配列を用いることによって、そのプロテアーゼの活性を有するタンパク質を製造できることも開示されている。 In such a background, Patent Document 1 discloses a nucleotide sequence of a nucleic acid encoding a neutral protease derived from Clostridium histolyticum, and a protein having the activity of the protease by using the sequence. It is also disclosed that can be manufactured.
しかしながら、特許文献１において、クロストリディウム・ヒストリティカム由来中性プロテアーゼの遺伝子組換え体を用いた製造法に関する記載はあるものの、実施例中には遺伝子組換え体による中性プロテアーゼの発現の結果ならびにその活性についての記載はない。また、特許文献１において開示されている配列は、成熟型中性プロテアーゼ部分のアミノ酸配列だけであり、シグナル配列及びプロ配列は開示されていない。そのため、特許文献１に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを用いても、宿主細胞外に活性を有した成熟型中性プロテアーゼを分泌できないことが想定され、実際、後述の比較例１において示す通り、特許文献１に記載の方法ではクロストリディウム・ヒストリティカム由来中性プロテアーゼを製造することはできなかった。 However, in Patent Document 1, although there is a description regarding a method for producing a neutral protease derived from Clostridium histolyticum using a gene recombinant, the expression of neutral protease by the gene recombinant is described in the Examples. There is no description of the results and their activities. Moreover, the sequence disclosed in Patent Document 1 is only the amino acid sequence of the mature neutral protease portion, and the signal sequence and the pro sequence are not disclosed. Therefore, even if the polynucleotide encoding the amino acid sequence described in Patent Document 1 is used, it is assumed that mature neutral protease having activity can not be secreted outside the host cell. As described above, the method described in Patent Document 1 could not produce a neutral protease derived from Clostridium histolyticum.
本発明は、前記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、目的とするタンパク質、特に中性プロテアーゼの宿主細胞外への分泌産生を可能とするシグナル配列及びプロ配列を提供することを目的とする。 The present invention has been made in view of the above-described problems of the prior art, and provides a signal sequence and a pro sequence that enable secretion production of a target protein, particularly a neutral protease, outside a host cell. Objective.
本発明者らは、前記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、クロストリディウム・ヒストリティカムのゲノム遺伝子を精査し、中性プロテアーゼのシグナル配列の開始コドンとなりうる部分を複数見出した。これらの配列について順に遺伝子組み換え体を造出し、発現を確認したところ、成熟配列のＮ末端からもっとも遠い位置に存在する開始コドンのみで中性プロテアーゼの発現が見られた。よって、配列番号１に示すシグナル配列及び配列番号３に示すプロ配列を含むポリヌクレオチドを用いることにより、クロストリディウム・ヒストリティカム以外の宿主においてもクロストリディウム・ヒストリティカム由来中性プロテアーゼ等のタンパク質を、宿主細胞外に分泌産生できることを見出した。なお、配列番号１に示すシグナル配列及び配列番号３に示すプロ配列は、他の遺伝子との相同性をほとんど持たない新規な配列であった。さらに、本発明者らは、当該シグナル配列と、当該プロ配列と、中性プロテアーゼの成熟配列とが連結しているタンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて形質転換された宿主細胞を用いることにより、中性プロテアーゼを活性を有した成熟型として宿主細胞外に分泌産生され、取得することができることを見出した。 As a result of intensive studies to achieve the above object, the present inventors have examined the genomic gene of Clostridium historicum and found a plurality of portions that can serve as start codons for the signal sequence of neutral protease. . Gene recombinants were produced in order for these sequences and their expression was confirmed. As a result, neutral protease expression was observed only at the start codon located farthest from the N-terminus of the mature sequence. Therefore, by using a polynucleotide comprising the signal sequence shown in SEQ ID NO: 1 and the pro sequence shown in SEQ ID NO: 3, neutrality derived from Clostridial historicum can be obtained in hosts other than Clostridial historicum. It has been found that proteins such as protease can be secreted and produced outside the host cell. Note that the signal sequence shown in SEQ ID NO: 1 and the pro sequence shown in SEQ ID NO: 3 were novel sequences having little homology with other genes. Furthermore, the present inventors use a host cell transformed with a polynucleotide encoding a protein in which the signal sequence, the pro sequence and the mature sequence of a neutral protease are linked, It has been found that a neutral protease can be secreted and produced outside the host cell as a mature form having activity.
本発明は、より詳しくは以下を提供するものである。
＜１＞ シグナル配列をコードする下記（a）から（e）のいずれかに記載のポリヌクレオチドと、プロ配列をコードする下記（f）から（j）のいずれかに記載のポリヌクレオチドと、中性プロテアーゼの成熟配列をコードする下記（k）から（o）のいずれかに記載のポリヌクレオチドとが連結しているポリヌクレオチド
（a）配列番号：２に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（b）配列番号：１に記載の塩基配列のコード領域を含むポリヌクレオチド
（c）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（d）配列番号：２に記載のアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（e）配列番号：１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド
（f）配列番号：４に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（g）配列番号：３に記載の塩基配列のコード領域を含むポリヌクレオチド
（h）配列番号：４に記載のアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（i）配列番号：４に記載のアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（j）配列番号：３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド
（ｋ）配列番号：６に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｌ）配列番号：５に記載の塩基配列のコード領域を含むポリヌクレオチド
（ｍ）配列番号：６に記載のアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｎ）配列番号：６に記載のアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（o）配列番号：５に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド
＜２＞ クロストリディウム・ヒストリティカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）由来である、＜１＞に記載のポリヌクレオチド。
＜３＞ ＜１＞又は＜２＞に記載のポリヌクレオチドを含有する発現ベクター。
＜４＞ ＜３＞に記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
＜５＞ ＜４＞に記載の形質転換された宿主細胞から分泌された中性プロテアーゼを含む培養物。
＜６＞ ＜４＞に記載の形質転換された宿主細胞を培養し、該宿主細胞および／またはその培養物から発現したタンパク質を採取する工程を含む、中性プロテアーゼまたは該中性プロテアーゼを含有するプロテアーゼ調製物の製造方法。
More specifically, the present invention provides the following .
<1> a polynucleotide according to any one of (a) to (e) below encoding a signal sequence , a polynucleotide according to any one of (f) to (j) below encoding a pro sequence , and A polynucleotide linked to a polynucleotide according to any one of (k) to (o) below which encodes a mature sequence of a sex protease
(A) a polynucleotide encoding a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2
(B) a polynucleotide comprising the coding region of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1
(C) a polynucleotide encoding a protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2
(D) a polynucleotide encoding a protein comprising an amino acid sequence having 95% or more identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2
(E) a polynucleotide that hybridizes with the polynucleotide comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 under stringent conditions
(F) a polynucleotide encoding a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4
(G) a polynucleotide comprising the coding region of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 3
(H) a polynucleotide encoding a protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4
(I) a polynucleotide encoding a protein comprising an amino acid sequence having 95% or more identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4
(J) a polynucleotide that hybridizes with the polynucleotide comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 3 under stringent conditions
(K) a polynucleotide encoding a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6
(L) a polynucleotide comprising the coding region of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 5
(M) a polynucleotide encoding a protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6
(N) a polynucleotide encoding a protein comprising an amino acid sequence having 95% or more identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6
(O) a polynucleotide that hybridizes with the polynucleotide comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 5 under stringent conditions
<2> The polynucleotide according to <1> , which is derived from Clostridium histolyticum.
<3> An expression vector containing the polynucleotide according to <1> or <2> .
<4> A host cell transformed with the expression vector according to <3> .
<5> A culture comprising a neutral protease secreted from the transformed host cell according to <4> .
<6> containing the neutral protease or the neutral protease, comprising culturing the transformed host cell according to <4> , and collecting the host cell and / or a protein expressed from the culture. Method for producing a protease preparation .
本発明によれば、目的とするタンパク質、特に中性プロテアーゼの宿主細胞外への分泌産生が可能となる。 According to the present invention, it is possible to secrete and produce a target protein, particularly a neutral protease, outside a host cell.
＜ポリヌクレオチド＞
本発明のシグナル配列をコードするポリヌクレオチドは、下記（ｉ）から（ｖ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドである。
（ｉ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｉｉ）配列番号：１に記載の塩基配列のコード領域を含むポリヌクレオチド
（ｉｉｉ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｉｖ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｖ）配列番号：１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
<Polynucleotide>
The polynucleotide encoding the signal sequence of the present invention is the polynucleotide described in any of (i) to (v) below.
(I) a polynucleotide encoding a protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 (ii) a polynucleotide comprising the coding region of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 (iii) the amino acid set forth in SEQ ID NO: 2 A polynucleotide encoding a protein consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added in the sequence (iv) 95% or more identical to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 A polynucleotide encoding a protein comprising an amino acid sequence having sex (v) A polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1.
また、本発明のプロ配列をコードするポリヌクレオチドは、下記（ｉ）から（ｖ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドである。
（ｉ）配列番号：４に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｉｉ）配列番号：３に記載の塩基配列のコード領域を含むポリヌクレオチド
（ｉｉｉ）配列番号：４に記載のアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｉｖ）配列番号：４に記載のアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｖ）配列番号：３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
Moreover, the polynucleotide which codes the pro sequence of this invention is a polynucleotide in any one of following (i) to (v).
(I) a polynucleotide encoding a protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4 (ii) a polynucleotide comprising the coding region of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 3 (iii) the amino acid set forth in SEQ ID NO: 4 A polynucleotide encoding a protein consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added in the sequence (iv) 95% or more identical to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4 A polynucleotide encoding a protein comprising an amino acid sequence having sex (v) a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 3.
本発明において、「シグナル配列」とは、その配列のＣ末端側に連結させる形で任意のタンパク質を宿主内において発現させた場合、該タンパク質を該宿主の外に分泌させる活性を有するタンパク質のことである。 In the present invention, the “signal sequence” refers to a protein having an activity of secreting the protein out of the host when an arbitrary protein is expressed in the host in a form linked to the C-terminal side of the sequence. It is.
また、本発明において、「プロ配列」とは、その配列のＣ末端側に連結させる形で任意のタンパク質の成熟配列部分を宿主内において発現させた場合、主に、該成熟配列部分をフォールディングする分子内シャペロンとして機能するタンパク質のことである。 In the present invention, the “pro sequence” mainly folds the mature sequence portion when the mature sequence portion of an arbitrary protein is expressed in the host in a form linked to the C-terminal side of the sequence. A protein that functions as an intramolecular chaperone.
本発明は、本発明のシグナル配列をコードするポリヌクレオチドと、本発明のプロ配列をコードするポリヌクレオチドと、中性プロテアーゼの成熟配列をコードする下記（ｉ）から（ｖ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドとが連結しているポリヌクレオチドも提供するものである。
（ｉ）配列番号：６に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｉｉ）配列番号：５に記載の塩基配列のコード領域を含むポリヌクレオチド
（ｉｉｉ）配列番号：６に記載のアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｉｖ）配列番号：６に記載のアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｖ）配列番号：５に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
The present invention is described in any one of (i) to (v) below, which encodes a polynucleotide encoding the signal sequence of the present invention, a polynucleotide encoding the pro sequence of the present invention, and a mature sequence of a neutral protease. There is also provided a polynucleotide in which the polynucleotide is linked.
(I) a polynucleotide encoding a protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6 (ii) a polynucleotide comprising the coding region of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 5 (iii) the amino acid set forth in SEQ ID NO: 6 A polynucleotide encoding a protein consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added in the sequence (iv) 95% or more identical to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6 A polynucleotide encoding a protein comprising an amino acid sequence having sex (v) a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 5.
本発明において、「中性プロテアーゼ」とは、その最適活性が中性ｐＨ範囲内にあり、カゼイン及び変性コラーゲンを解裂させる活性を有するタンパク質のことである。 In the present invention, a “neutral protease” is a protein having an activity that cleaves casein and denatured collagen, the optimum activity of which is within a neutral pH range.
後述の実施例において示す通り、Ｎ末端側から順に、配列番号：２に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質と、配列番号：４に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質と、配列番号：６に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質（クロストリディウム・ヒストリティカム由来中性プロテアーゼの成熟配列部分）とが連結しているタンパク質を宿主内において発現させた場合、活性を有した成熟型の中性プロテアーゼが該宿主の外に分泌された。従って、本発明のシグナル配列としては、配列番号：２に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質（配列番号：３に記載の塩基配列がコードするタンパク質）が挙げられ、本発明のプロ配列としては、配列番号：４に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質（配列番号：３に記載の塩基配列がコードするタンパク質）が挙げられ、本発明の中性プロテアーゼの成熟配列としては、配列番号：６に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質（配列番号：５に記載の塩基配列がコードするタンパク質）が挙げられる。 As shown in the Examples described later, in order from the N-terminal side, a protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, a protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4, and the amino acid set forth in SEQ ID NO: 6. When a protein linked to a protein containing a sequence (mature sequence portion of a neutral protease derived from Clostridium histolyticum) is expressed in the host, the active mature neutral protease is It was secreted out of the host. Therefore, the signal sequence of the present invention includes a protein comprising the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 (protein encoded by the base sequence described in SEQ ID NO: 3). The pro sequence of the present invention includes a sequence Examples include a protein containing the amino acid sequence described in No. 4 (protein encoded by the base sequence described in SEQ ID No. 3), and the mature sequence of the neutral protease of the present invention includes the amino acid described in SEQ ID No. 6 And a protein containing the sequence (a protein encoded by the base sequence described in SEQ ID NO: 5).
また、現在の技術水準においては、当業者であれば、かかるタンパク質をコードする塩基配列の情報が得られた場合、その塩基配列に対して種々の改変を行い、各活性や機能を有する、シグナル配列やプロ配列や中性プロテアーゼの製造を行うことが可能である。また、自然界においても、塩基配列が変異することは起こり得ることである。従って、本発明のシグナル配列をコードするポリヌクレオチドには、前記活性を有するタンパク質をコードする限り、配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドも含まれ、本発明のプロ配列をコードするポリヌクレオチドには、前記機能を有するタンパク質をコードする限り、配列番号：４に記載のアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドも含まれ、本発明の中性プロテアーゼの成熟配列をコードするポリヌクレオチドには、前記活性を有するタンパク質をコードする限り、配列番号：６に記載のアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドも含まれる。 In addition, in the current state of the art, if a person skilled in the art obtains information on a base sequence encoding such a protein, various modifications are made to the base sequence, and signals having various activities and functions are obtained. It is possible to produce sequences, prosequences and neutral proteases. Also in nature, it is possible that the base sequence is mutated. Therefore, in the polynucleotide encoding the signal sequence of the present invention, as long as it encodes the protein having the above activity, one or more amino acids in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 are substituted, deleted, inserted, and And / or a polynucleotide encoding a protein comprising the added amino acid sequence, and the polynucleotide encoding the prosequence of the present invention includes the amino acid set forth in SEQ ID NO: 4 as long as it encodes a protein having the above function. A polynucleotide encoding a protein consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added in the sequence, and encoding a mature sequence of the neutral protease of the present invention As long as it encodes a protein having the above activity SEQ ID NO: 6 1 or more amino acids in the amino acid sequence set forth in a substitution, deletion, insertion, and / or polynucleotides encoding proteins consisting added in the amino acid sequence are also included.
「１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列」とは、部位特異的突然変異誘発法等の周知の方法により、または天然に生じ得る程度の複数個の数のアミノ酸の置換等により改変がなされたことを意味する。アミノ酸の改変の個数は、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、最も好ましくは１〜２個である。 “Amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted, inserted, or added” refers to a plurality of numbers that can be generated by well-known methods such as site-directed mutagenesis, or the like. It means that it has been modified by amino acid substitution or the like. The number of amino acid modifications is preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, and most preferably 1 to 2.
改変アミノ酸配列の例は、好ましくは、そのアミノ酸が、１または複数個（好ましくは、１ないし数個あるいは１、２、３、または４個）の保存的置換を有するアミノ酸配列であることができる。ここで、「保存的置換」とは、１または複数個のアミノ酸残基を、別の化学的に類似したアミノ酸残基で置き換えることを意味する。例えば、ある疎水性残基を別の疎水性残基によって置換する場合、ある極性残基を同じ電荷を有する別の極性残基によって置換する場合などが挙げられる。このような置換を行うことができる機能的に類似のアミノ酸は、アミノ酸毎に当該技術分野において公知である。具体例を挙げると、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニンなどが挙げられる。極性（中性）アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システインなどが挙げられる。陽電荷をもつ（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジンなどが挙げられる。また、負電荷をもつ（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。 An example of a modified amino acid sequence can preferably be an amino acid sequence in which the amino acid has one or more (preferably 1 to several, 1, 2, 3, or 4) conservative substitutions. . Here, “conservative substitution” means that one or more amino acid residues are replaced with another chemically similar amino acid residue. For example, when a certain hydrophobic residue is substituted by another hydrophobic residue, a certain polar residue is substituted by another polar residue having the same charge, and the like. Functionally similar amino acids that can make such substitutions are known in the art for each amino acid. Specific examples include non-polar (hydrophobic) amino acids such as alanine, valine, isoleucine, leucine, proline, tryptophan, phenylalanine, and methionine. Examples of polar (neutral) amino acids include glycine, serine, threonine, tyrosine, glutamine, asparagine, and cysteine. Examples of positively charged (basic) amino acids include arginine, histidine, and lysine. Examples of negatively charged (acidic) amino acids include aspartic acid and glutamic acid.
さらに、現在の技術水準においては、当業者であれば、かかるタンパク質をコードする特定の塩基配列の情報が得られた場合、それらの塩基配列情報を利用して、同種若しくは他の菌種等から、各活性や機能を有するタンパク質をコードする相同遺伝子を単離することが可能である。このような相同遺伝子を取得するための菌種等としては枯草菌（例えばＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓやＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ ｒｏｋｋｏ）や麹菌（例えばＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）などが好ましい。 Furthermore, in the current state of the art, if information on a specific base sequence encoding such a protein is obtained by a person skilled in the art, the base sequence information is used to obtain information from the same species or other bacterial species. It is possible to isolate a homologous gene encoding a protein having each activity and function. As the bacterial species for obtaining such a homologous gene, Bacillus subtilis (for example, Bacillus subtilis and Bacillus thermoproteolyticus rokko), Neisseria gonorrhoeae (for example, Aspergillus oryzae) and the like are preferable.
相同遺伝子を取得するための方法としては、例えば、ハイブリダイゼーション技術（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｅ．Ｍ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，９８：５０３，１９７５）やポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術（Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０：１３５０−１３５４，１９８５、Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：４８７−４９１，１９８８）が挙げられる。相同遺伝子を単離するためには、通常、ストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーション反応を行なう。 Examples of a method for obtaining a homologous gene include a hybridization technique (Southern, EM, J. Mol. Biol., 98: 503, 1975) and a polymerase chain reaction (PCR) technique (Saiki, R. et al.). K., et al. Science, 230: 1350-1354, 1985, Saiki, RK et al. Science, 239: 487-491, 1988). In order to isolate a homologous gene, a hybridization reaction is usually performed under stringent conditions.
ここで、「ストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーション後のメンブレンの洗浄操作を、高温度低塩濃度溶液中で行うことを意味し、例えば、２×ＳＳＣ濃度（１×ＳＳＣ：１５ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸３ナトリウム、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム）、０．５％ＳＤＳ溶液中で、６０℃、２０分間の洗浄条件を意味する。 Here, “stringent conditions” means that the membrane is washed after hybridization in a high temperature, low salt concentration solution. For example, 2 × SSC concentration (1 × SSC: 15 mmol / L). (Sodium citrate, 150 mmol / L sodium chloride) in 0.5% SDS solution means washing conditions at 60 ° C. for 20 minutes.
従って、本発明のシグナル配列をコードするポリヌクレオチドには、前記活性を有するタンパク質をコードする限り、配列番号：１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドも含まれ、本発明のプロ配列をコードするポリヌクレオチドには、前記機能を有するタンパク質をコードする限り、配列番号：３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドも含まれ、本発明の中性プロテアーゼの成熟配列をコードするポリヌクレオチドには、前記活性を有するタンパク質をコードする限り、配列番号：５に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドも含まれる。 Therefore, the polynucleotide encoding the signal sequence of the present invention includes a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with the polynucleotide consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 as long as it encodes the protein having the above activity. The polynucleotide encoding the prosequence of the present invention includes a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with the polynucleotide comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 3 as long as it encodes a protein having the above-mentioned function. The polynucleotide encoding the mature sequence of the neutral protease of the present invention is a stringent condition with the polynucleotide comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 5 as long as it encodes the protein having the above activity. Hybridizing polynucleotides It is also included.
また、取得された相同遺伝子がコードするタンパク質は、通常、本発明のシグナル配列やプロ配列や中性プロテアーゼの成熟配列のアミノ酸配列と高い同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質である。本発明において、高い同一性とは、好ましくは、９５％以上、より好ましくは９６％以上、特に好ましくは９８％以上、そして最も好ましくは９９％以上の同一性を有する。 The protein encoded by the obtained homologous gene is usually a protein containing an amino acid sequence having high identity with the signal sequence of the present invention, the pro sequence, and the amino acid sequence of the mature sequence of the neutral protease. In the present invention, high identity preferably has 95% or more, more preferably 96% or more, particularly preferably 98% or more, and most preferably 99% or more.
従って、本発明のシグナル配列をコードするポリヌクレオチドには、前記活性を有するタンパク質をコードする限り、配列番号：２に記載のアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドも含まれ、本発明のプロ配列をコードするポリヌクレオチドには、前記機能を有するタンパク質をコードする限り、配列番号：４に記載のアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドも含まれ、本発明の中性プロテアーゼの成熟配列をコードするポリヌクレオチドには、前記活性を有するタンパク質をコードする限り、配列番号：６に記載のアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドも含まれる。 Accordingly, the polynucleotide encoding the signal sequence of the present invention encodes a protein comprising an amino acid sequence having 95% or more identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 as long as it encodes a protein having the above activity. As long as the polynucleotide encoding the prosequence of the present invention encodes a protein having the above function, the amino acid sequence having 95% or more identity with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4 A polynucleotide that encodes a mature protein of the neutral protease of the present invention includes a polynucleotide that encodes a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 and 95, as long as it encodes a protein having the above activity. % Encoding a protein containing an amino acid sequence having at least% identity Nucleotides are also included.
塩基配列またはアミノ酸配列についての「同一性」は、比較される配列間において、各々の配列を構成する塩基またはアミノ酸残基の一致の程度の意味で用いられる。本明細書において示した「同一性」の数値はいずれも、当業者に公知の相同性検索プログラムを用いて算出される数値であればよく、例えばＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ等においてデフォルト（初期設定）のパラメータを用いることにより、容易に算出することができる。より具体的には、配列の同一性は、ＢＬＡＳＴＸ（アミノ酸レベル）のプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０，１９９０）を利用して決定することができる。該プログラムは、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：２２６４−２２６８，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：５８７３−５８７７，１９９３）に基づいている。ＢＬＡＳＴＸによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。また、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを用いて、アミノ酸配列を解析する場合は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２，１９９７）に記載されているように行うことができる。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。 “Identity” with respect to a base sequence or amino acid sequence is used to mean the degree of coincidence of bases or amino acid residues constituting each sequence between compared sequences. Any numerical value of “identity” shown in the present specification may be a numerical value calculated using a homology search program known to those skilled in the art. For example, a default (initial setting) parameter in FASTA, BLAST, or the like. Can be easily calculated. More specifically, sequence identity can be determined using the BLASTX (amino acid level) program (Altschul et al. J. Mol. Biol., 215: 403-410, 1990). The program is based on the algorithm BLAST (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 2264-2268, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5873-5877, 1993) by Karlin and Altschul. Yes. When the amino acid sequence is analyzed by BLASTX, the parameters are, for example, score = 50 and wordlength = 3. Moreover, when analyzing an amino acid sequence using the Gapped BLAST program, it can carry out as described in Altschul et al. (Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, 1997). When using BLAST and Gapped BLAST programs, the default parameters of each program are used.
なお、特定のポリヌクレオチドがコードするタンパク質が、前記活性や機能を有するタンパク質をコードするか否かは、例えば、後述の実施例に記載するように、特定のポリヌクレオチドがコードするタンパク質が発現するような形で、プラスミドベクターにクローニングし、該発現ベクターを宿主細胞（例えば、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓ ＳＰ−３株、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＫＮ−２株）に導入することにより得られた培養上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分析し、予想される分子量を有するタンパク質のバンド（本発明にかかる中性プロテアーゼの成熟配列部分であれば、分子量 約３５ｋＤａのタンパク質が示すバンド）を検出できるか否かを検定することにより判定することができる（実施例２ 参照）。また、前記発現ベクターを導入した宿主細胞（形質転換体）や該形質転換体の培養上清を用いて、スキムミルク（カゼイン）の分解の程度（例えば、ハローの有無やその大きさ）を培地（スキムミルクプレート）上で検出できるか否かを検定することにより判定することができる（実施例２ 参照）。さらに、前記形質転換体や該形質転換体の培養上清を用い、アゾカゼインを基質とし、基質の分解によって生じる遊離チロシン量を３３５ｎｍの吸光度で測定することによって、アゾカゼイン分解活性を検出できるか否かを検定することにより判定することができる（実施例３ 参照）。 Whether or not a protein encoded by a specific polynucleotide encodes a protein having the above activity or function depends on whether the protein encoded by the specific polynucleotide is expressed, for example, as described in Examples below. In such a form, the culture supernatant obtained by cloning into a plasmid vector and introducing the expression vector into a host cell (for example, Brevibacillus choshinensis SP-3 strain, Bacillus subtilis strain KN-2) is introduced into SDS-PAGE. To determine whether or not a protein band having the expected molecular weight can be detected (in the case of the mature sequence portion of the neutral protease according to the present invention, a band represented by a protein having a molecular weight of about 35 kDa). (Implementation See Example 2). Further, the degree of degradation of skim milk (casein) (for example, the presence or absence of halo and its size) is determined using a host cell (transformant) into which the expression vector has been introduced and the culture supernatant of the transformant. It can be determined by examining whether it can be detected on a skim milk plate) (see Example 2). Further, whether or not azocasein degrading activity can be detected by measuring the amount of free tyrosine generated by degradation of the substrate using azocasein as a substrate and the absorbance of the 335 nm using the transformant or the culture supernatant of the transformant. Can be determined by testing (see Example 3).
また、本発明のポリヌクレオチドとしては、その形態に特に制限はなく、ｃＤＮＡの他、ゲノムＤＮＡ、および化学合成ＤＮＡが含まれる。これらＤＮＡの調製は、当業者にとって常套手段を利用して行うことが可能である。ゲノムＤＮＡは、例えば、クロストリディウム・ヒストリティカムからゲノムＤＮＡを抽出し、ゲノミックライブラリー（ベクターとしては、プラスミド、ファージ、コスミド、ＢＡＣ、ＰＡＣなどが利用できる）を作製し、これを展開して、クロストリディウム・ヒストリティカム由来中性プロテアーゼのシグナル配列、プロ配列、成熟配列をコードする塩基配列（例えば、配列番号：１、３、５に記載のＤＮＡ）を基に調製したプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことにより調製することが可能である。また、クロストリディウム・ヒストリティカム由来中性プロテアーゼのシグナル配列、プロ配列、成熟配列をコードする塩基配列に特異的なプライマーを作製し、これを利用したＰＣＲを行うことによって調製することも可能である。また、ｃＤＮＡは、例えば、クロストリディウム・ヒストリティカムから抽出したｍＲＮＡを基にｃＤＮＡを合成し、これをλＺＡＰ等のベクターに挿入してｃＤＮＡライブラリーを作成し、これを展開して、上記と同様にコロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことにより、また、ＰＣＲを行うことにより調製することが可能である。さらに、市販のＤＮＡ合成機を用いれば、目的のＤＮＡを合成により調製することも可能である。また、前記配列番号：１等に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドや、前記配列番号：２等に記載のアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、前記ハイブリダイゼーション技術やＰＣＲ技術の他に、特定の塩基配列やアミノ酸配列に基づき、当業者に公知の部位特異的変異誘発（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）法（Ｋｒａｍｅｒ，Ｗ．＆Ｆｒｉｔｚ，ＨＪ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ，１９８７，１５４，３５０．）等の遺伝子増幅技術や組換え技術を利用して調製することも可能である。 The polynucleotide of the present invention is not particularly limited in its form, and includes genomic DNA and chemically synthesized DNA in addition to cDNA. These DNAs can be prepared by those skilled in the art using conventional means. For genomic DNA, for example, genomic DNA is extracted from Clostridium historical cam, and a genomic library (plasmid, phage, cosmid, BAC, PAC, etc. can be used as vectors) is developed. Then, it was prepared based on the nucleotide sequence (for example, the DNAs described in SEQ ID NOs: 1, 3, and 5) encoding the signal sequence, pro sequence, and mature sequence of the neutral protease derived from Clostridium history cam. It can be prepared by performing colony hybridization or plaque hybridization using a probe. It is also possible to prepare primers specific to the nucleotide sequence encoding the signal sequence, pro sequence and mature sequence of the neutral protease derived from Clostridium history cam and perform PCR using this primer. Is possible. In addition, cDNA is synthesized based on, for example, mRNA extracted from Clostridium historicum, inserted into a vector such as λZAP to create a cDNA library, and developed, It can be prepared by performing colony hybridization or plaque hybridization in the same manner as described above, or by performing PCR. Furthermore, if a commercially available DNA synthesizer is used, the target DNA can be prepared by synthesis. In addition, the polynucleotide hybridizes under stringent conditions with the polynucleotide comprising the base sequence described in SEQ ID NO: 1 or the like, and has 95% or more identity with the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 or the like. A polynucleotide encoding a protein containing an amino acid sequence is based on a site-directed mutagenesis method known to those skilled in the art based on a specific base sequence or amino acid sequence in addition to the hybridization technique or the PCR technique. (Kramer, W. & Fritz, HJ., Methods Enzymol, 1987, 154, 350.) and the like can also be used for preparation.
また、本発明のポリヌクレオチドとしては、クロストリディウム・ヒストリティカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）由来のポリヌクレオチド、すなわち、シグナル配列をコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号：１に記載の塩基配列のコード領域を含むポリヌクレオチドであり、プロ配列をコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号：３に記載の塩基配列のコード領域を含むポリヌクレオチドであり、中性プロテアーゼの成熟配列をコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号：４に記載の塩基配列のコード領域を含むポリヌクレオチドであることが好ましい。 In addition, as the polynucleotide of the present invention, a polynucleotide derived from Clostridium histolyticum, that is, a polynucleotide encoding a signal sequence, includes the code of the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 1. The polynucleotide that includes the region, and the polynucleotide that encodes the pro sequence is a polynucleotide that includes the coding region of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 3, and the polynucleotide that encodes the mature sequence of the neutral protease. A polynucleotide comprising the coding region of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 4 is preferred.
以上、本発明のポリヌクレオチドの好適な実施形態について説明したが、本発明のポリヌクレオチドは上記実施形態に限定されるものではない。例えば、本発明のポリヌクレオチドとしては、前記本発明のシグナル配列をコードするポリヌクレオチドの代わりに、公知のシグナル配列をコードするポリヌクレオチドと、前記本発明のプロ配列をコードするポリヌクレオチドと、前記本発明にかかる中性プロテアーゼの成熟配列をコードするポリヌクレオチドとが連結しているポリヌクレオチドであってもよい。かかる公知のシグナル配列としては、その配列に連結させる形で任意のタンパク質を宿主内において発現させた場合、該タンパク質を該宿主の外に分泌させる活性を有するタンパク質であればよく、例えば、大腸菌ではｐｅｌＢ、ＯｍｐＡ、ＰｈｏＡ、バチルス属ではα−アミラーゼまたはβ−ラクタマーゼのシグナル配列、ブレビバチルス属ではＨＷＰのシグナル配列、麹菌ではＡｍｙＢのシグナル配列が挙げられる。 As mentioned above, although preferred embodiment of the polynucleotide of this invention was described, the polynucleotide of this invention is not limited to the said embodiment. For example, as the polynucleotide of the present invention, instead of the polynucleotide encoding the signal sequence of the present invention, a polynucleotide encoding a known signal sequence, the polynucleotide encoding the pro sequence of the present invention, It may be a polynucleotide linked to a polynucleotide encoding the mature sequence of the neutral protease according to the present invention. Such a known signal sequence may be a protein having an activity of secreting the protein out of the host when an arbitrary protein is expressed in the host in a form linked to the sequence. Examples of pelB, OmpA, PhoA, and Bacillus include α-amylase or β-lactamase signal sequence, Brevibacillus genus HWP signal sequence, and Aspergillus oryzae, AmyB signal sequence.
また、本発明のポリヌクレオチドとして、前記本発明のシグナル配列をコードするポリヌクレオチドと、前記本発明にかかる中性プロテアーゼの成熟配列やその他の任意のタンパク質をコードするポリヌクレオチドとが連結しているポリヌクレオチドであってもよい。 Further, as the polynucleotide of the present invention, the polynucleotide encoding the signal sequence of the present invention and the polynucleotide encoding the mature sequence of the neutral protease according to the present invention or any other protein are linked. It may be a polynucleotide.
さらに、本発明のポリヌクレオチドとして、任意のシグナル配列をコードするポリヌクレオチド及び本発明にかかる中性プロテアーゼの成熟配列をコードするポリヌクレオチドが連結しているポリヌクレオチドと、任意のシグナル配列をコードするポリヌクレオチド及び本発明のプロ配列が連結しているポリヌクレオチドとの組み合わせであってもよい。かかる場合、「任意のシグナル配列」は本発明のシグナル配列であってもよく、前記公知のシグナル配列であってもよい。そして、これらのポリヌクレオチドの組み合わせを同一の宿主細胞内にて別々のタンパク質として発現させても、「Ｙａｓｕｋａｗａ Ｋ．ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ、２００７年、２０巻、８号、３７５〜３８３ページ」に記載されているように、活性を有した成熟型の中性プロテアーゼとして宿主細胞外に分泌産生させることができる。 Furthermore, as a polynucleotide of the present invention, a polynucleotide encoding an arbitrary signal sequence and a polynucleotide linked with a polynucleotide encoding a mature sequence of the neutral protease according to the present invention are encoded with an arbitrary signal sequence. It may be a combination of a polynucleotide and a polynucleotide to which a prosequence of the present invention is linked. In such a case, the “arbitrary signal sequence” may be the signal sequence of the present invention or the known signal sequence. Even if these polynucleotide combinations are expressed as separate proteins in the same host cell, “Yasukawa K. et al., Protein Engineering, Design & Selection, 2007, Vol. 20, No. 8, pages 375-383” Can be secreted and produced outside the host cell as a mature neutral protease having activity.
また、本発明のポリヌクレオチドがコードするタンパク質としては、本発明にかかる中性プロテアーゼの成熟配列やその他の任意のタンパク質のＮ末端及び／またはＣ末端に、その活性（本発明にかかる中性プロテアーゼの成熟配列であれば、中性プロテアーゼ活性）に影響を与えない範囲で、任意のポリペプチド配列を付与することができる。このようなポリペプチド配列としては、例えば、検出用マーカー（例えば、ＦＬＡＧタグ）、精製用ポリペプチド（例えば、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）を挙げることができる。 In addition, the protein encoded by the polynucleotide of the present invention includes the mature protease of the neutral protease according to the present invention and the activity (neutral protease according to the present invention) at the N-terminal and / or C-terminal of any other protein. As long as it is a mature sequence, an arbitrary polypeptide sequence can be added as long as neutral protease activity is not affected. Examples of such a polypeptide sequence include a detection marker (for example, FLAG tag) and a purification polypeptide (for example, glutathione S-transferase).
また、本発明のポリヌクレオチドがコードするタンパク質における、各配列間の「連結」は、各配列どうしを直接結合するものであってもよく、リンカーペプチドを介して結合するものであってもよい。かかるリンカーペプチドとしては、その両端に連結されたプロ配列やシグナル配列や中性プロテアーゼの成熟配列等の発現や、これらの機能や活性を抑制するものでなければ特に制限されない。リンカーペプチドの長さとしては、通常、１〜１００アミノ酸、好ましくは１〜５０アミノ酸、より好ましくは１〜３０アミノ酸、特に好ましくは１２〜１８アミノ酸（例えば１５アミノ酸）である。 In addition, the “linkage” between the sequences in the protein encoded by the polynucleotide of the present invention may be a sequence in which the sequences are directly linked to each other or may be linked through a linker peptide. Such a linker peptide is not particularly limited as long as it does not inhibit the expression of a pro sequence, a signal sequence, a mature sequence of a neutral protease, or the like linked to both ends thereof, or their functions and activities. The length of the linker peptide is usually 1 to 100 amino acids, preferably 1 to 50 amino acids, more preferably 1 to 30 amino acids, and particularly preferably 12 to 18 amino acids (for example, 15 amino acids).
＜発現ベクター、並びに該発現ベクターにより形質転換された宿主細胞＞
本発明は、本発明のシグナル配列をコードするポリヌクレオチドと、本発明のプロ配列をコードするポリヌクレオチドと、本発明の中性プロテアーゼの成熟配列をコードするポリヌクレオチドとが連結しているポリヌクレオチドを含有する発現ベクターも提供するものである。
<Expression vector and host cell transformed with the expression vector>
The present invention relates to a polynucleotide in which a polynucleotide encoding the signal sequence of the present invention, a polynucleotide encoding the pro sequence of the present invention, and a polynucleotide encoding the mature sequence of the neutral protease of the present invention are linked. There is also provided an expression vector containing
すなわち、本発明においては、前記シグナル配列、プロ配列及び中性プロテアーゼの成熟配列（以下、「中性プロテアーゼのプレプロ配列」とも称する）をコードするポリヌクレオチドを、宿主細胞内において複製することができ、かつ、該ポリヌクレオチドがコードするタンパク質を発現可能な状態で含んでなる発現ベクターが提供される。 That is, in the present invention, the polynucleotide encoding the signal sequence, the pro sequence and the mature sequence of the neutral protease (hereinafter also referred to as “neutral protease prepro sequence”) can be replicated in the host cell. And an expression vector comprising the protein encoded by the polynucleotide in an expressible state.
本発明において、「発現ベクター」は、自己複製ベクター、すなわち、染色体外の独立体として存在し、その複製が染色体の複製に依存しない、例えば、プラスミドを基本に構築することができる。また、本発現ベクターは、宿主細胞に導入されたとき、その宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、それが組み込まれた染色体と一緒に複製されるものであってもよい。本発明によるベクター構築の手順及び方法は、遺伝子工学の分野で慣用されているものを用いることができる。 In the present invention, an “expression vector” can be constructed on the basis of a self-replicating vector, that is, as an extrachromosomal independent entity whose replication does not depend on chromosomal replication, for example, a plasmid. Further, when the expression vector is introduced into a host cell, it may be integrated into the genome of the host cell and replicated together with the chromosome into which it has been integrated. As the procedure and method for constructing the vector according to the present invention, those conventionally used in the field of genetic engineering can be used.
本発明の発現ベクターは、これを宿主細胞に導入して中性プロテアーゼを発現させるために、前記の中性プロテアーゼのプレプロ配列をコードするポリヌクレオチドの他に、その発現を制御するＤＮＡ配列や形質転換された宿主細胞を選択するための遺伝子マーカー等を含んでいるのが望ましい。発現を制御するＤＮＡ配列としては、プロモーター、エンハンサー及びターミネーター等がこれに含まれる。プロモーターは宿主細胞において転写活性を示すものであれば特に限定されず、宿主細胞と同種若しくは異種のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子の発現を制御するＤＮＡ配列として得ることができる。また、前記発現を制御するＤＮＡ配列以外に発現を誘導するＤＮＡ配列を含んでいても良い。かかる発現を誘導するＤＮＡ配列としては、宿主細胞が細菌である場合には、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加により、下流に配置された遺伝子の発現を誘導することのできるラクトースオペロンが挙げられる。本発明における遺伝子マーカーは、形質転換された宿主細胞の選択の方法に応じて適宜選択されてよいが、例えば薬剤耐性をコードする遺伝子、栄養要求性を相補する遺伝子を利用することができる。 In order to introduce the expression vector of the present invention into a host cell to express a neutral protease, in addition to the polynucleotide encoding the prepro sequence of the neutral protease, a DNA sequence or a trait that controls its expression is used. It preferably contains a genetic marker or the like for selecting the transformed host cell. Examples of DNA sequences that control expression include promoters, enhancers, and terminators. The promoter is not particularly limited as long as it exhibits transcriptional activity in the host cell, and can be obtained as a DNA sequence that controls the expression of a gene encoding a protein that is the same or different from the host cell. In addition to the DNA sequence that controls the expression, a DNA sequence that induces expression may be included. As a DNA sequence that induces such expression, when the host cell is a bacterium, isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) is added to induce the expression of the gene located downstream. The lactose operon that can be used. The gene marker in the present invention may be appropriately selected according to the method of selecting transformed host cells. For example, a gene encoding drug resistance and a gene complementary to auxotrophy can be used.
更に本発明によれば、この発現ベクターによって形質転換された宿主細胞（形質転換体）が提供される。この宿主細胞は特に限定されず、例えば、大腸菌、放線菌、酵母、糸状菌、植物細胞、昆虫細胞、動物細胞が挙げられるが、特に発現させた中性プロテアーゼによる溶菌の問題を回避するという観点から、グラム陽性菌を宿主細胞として利用するのが好ましく、ブレビバチルス・コシネンシス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓ）、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）を利用するのがより好ましい。 Furthermore, according to the present invention, a host cell (transformant) transformed with this expression vector is provided. This host cell is not particularly limited, and examples thereof include Escherichia coli, actinomycetes, yeast, filamentous fungi, plant cells, insect cells, and animal cells. In particular, the viewpoint of avoiding the problem of lysis caused by the expressed neutral protease. Therefore, it is preferable to use a Gram-positive bacterium as a host cell, and it is more preferable to use Brevibacillus choshinensis or Bacillus subtilis.
また、これらの発現ベクターによる宿主細胞の形質転換も、この分野で慣用されている方法に従い実施することができる。例えば、大腸菌、放線菌、酵母、糸状菌、グラム陽性菌等の細菌の形質転換の方法としては、ヒートショック法、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法が挙げられ、植物細胞の形質転換の方法としては、アグロバクテリウムを用いる方法やパーティクルガン法が挙げられ、昆虫細胞の形質転換の方法としては、バキュロウィルスを用いる方法やエレクトロポレーション法が挙げられ、動物細胞の形質転換の方法としては、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法が挙げられる。 In addition, transformation of host cells with these expression vectors can also be performed according to methods commonly used in this field. For example, methods for transformation of bacteria such as Escherichia coli, actinomycetes, yeast, filamentous fungi, and Gram positive bacteria include heat shock method, electroporation method, spheroplast method, lithium acetate method, Examples of transformation methods include Agrobacterium methods and particle gun methods. Insect cell transformation methods include baculovirus methods and electroporation methods, and animal cell transformations. Examples of the method include a calcium phosphate method, a lipofection method, and an electroporation method.
＜形質転換体の培養物、中性プロテアーゼの製造方法、並びにプロテアーゼ調製物＞
前述の通り、また後述の実施例に示す通り、本発明の発現ベクターを宿主細胞に導入し、該宿主細胞内で発現させ、該宿主細胞を培養することにより、活性を有した成熟型の中性プロテアーゼが該宿主細胞の外へ分泌されることになる。従って、本発明は、本発明の形質転換体から分泌された中性プロテアーゼを含む培養物をも提供することができる。
<Transformant culture, neutral protease production method, and protease preparation>
As described above and as shown in the Examples below, the expression vector of the present invention is introduced into a host cell, expressed in the host cell, and the host cell is cultured. Sex protease will be secreted out of the host cell. Therefore, the present invention can also provide a culture containing a neutral protease secreted from the transformant of the present invention.
本発明において「培養物」とは、前記本発明の形質転換体を、その宿主細胞に対して適当な培地で培養することによって得られる、増殖した形質転換体、該形質転換体の分泌産物及び該形質転換体の代謝産物等を含有する培地のことであり、それらの希釈物、濃縮物を含む。 In the present invention, the term “culture” refers to a proliferated transformant obtained by culturing the transformant of the present invention in an appropriate medium for the host cell, a secreted product of the transformant, and It is a medium containing the metabolite etc. of the transformant, and includes dilutions and concentrates thereof.
かかる培地としては、宿主細胞が資化し得るものが含有されていればよく、炭素源、窒素源、硫黄源、無機塩類、金属、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、カゼイン加水分解物、血清等が含有物として挙げられる。また、かかる培地には、例えば、中性プロテアーゼのプレプロ配列をコードするポリヌクレオチドの発現を誘導するためのＩＰＴＧや、本発明の発現ベクターがコードし得る薬剤耐性遺伝子に対応する抗生物質（例えば、ネオマイシン、クロラムフェニコール）や、本発明の発現ベクターがコードし得る栄養要求性を相補する遺伝子に対応する栄養物（例えば、アルギニン、ヒスチジン）を添加してもよい。 Such a medium only needs to contain something that can be assimilated by the host cell, and includes carbon sources, nitrogen sources, sulfur sources, inorganic salts, metals, peptone, yeast extract, meat extract, casein hydrolyzate, serum, and the like. Listed as inclusions. In addition, in such a medium, for example, IPTG for inducing expression of a polynucleotide encoding a prepro sequence of a neutral protease, or an antibiotic corresponding to a drug resistance gene that can be encoded by the expression vector of the present invention (for example, Neomycin, chloramphenicol) and nutrients (for example, arginine, histidine) corresponding to genes that complement the auxotrophy that can be encoded by the expression vector of the present invention may be added.
本発明にかかる培養の条件としては、本発明の形質転換体が前記培地中に活性を有した成熟型の中性プロテアーゼを分泌産生できる条件であればよく、当業者であれば、宿主細胞の種類、用いる培地等に合わせて、温度、空気の添加の有無、酸素の濃度、二酸化炭素の濃度、培地のｐＨ、培養温度、培養時間、湿度等を適宜調整し、設定することができる。 The culture conditions according to the present invention may be any conditions as long as the transformant of the present invention can secrete and produce a mature neutral protease having activity in the medium. The temperature, the presence or absence of addition of air, the concentration of oxygen, the concentration of carbon dioxide, the pH of the medium, the culture temperature, the culture time, the humidity, and the like can be appropriately adjusted and set according to the type, the medium to be used, and the like.
前述の通り、また後述の実施例に示す通り、本発明の形質転換体を培養することにより、活性を有した成熟型の中性プロテアーゼが該宿主細胞の外へ分泌されることになる。従って、本発明は、本発明の形質転換体を培養し、該形質転換体および／またはその培養物から発現したタンパク質を採取する工程を含む、中性プロテアーゼの製造方法をも提供することができる。 As described above and as shown in the Examples below, by culturing the transformant of the present invention, mature neutral protease having activity is secreted out of the host cell. Therefore, the present invention can also provide a method for producing a neutral protease, comprising the steps of culturing the transformant of the present invention and collecting a protein expressed from the transformant and / or its culture. .
「本発明の形質転換体を培養」とは前記の通りである。また、「本発明の形質転換体および／またはその培養物から発現したタンパク質を採取する」方法としては、フィルター（例えば、孔径０．２μｍ以下のフィルター）によって宿主細胞を除去する方法や、脱塩用フィルターを用いた脱塩濃縮により、培養物中のタンパク質の濃度を高める方法や、カラム（例えば、陰イオン交換カラムや疎水性カラム）を用いたタンパク質の濃縮方法が挙げられる。 “Cultivation of the transformant of the present invention” is as described above. In addition, as a method of “collecting a protein expressed from the transformant of the present invention and / or its culture”, a method of removing host cells with a filter (for example, a filter having a pore size of 0.2 μm or less), desalting, Examples include a method of increasing the concentration of protein in a culture by desalting and concentration using a filter, and a method of concentrating protein using a column (for example, an anion exchange column or a hydrophobic column).
また、本発明は前記製造方法によって製造された中性プロテアーゼを含む、プロテアーゼ調製物をも提供する。本発明のプロテアーゼ調製物としては、前記製造方法によって製造された中性プロテアーゼを含んでいればよいが、本発明の中性プロテアーゼの他、プロテアーゼ調製物として許容される他の成分を含むことができる。このような他の成分としては、例えば、担体、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩が挙げられる。賦形剤としては乳糖、デンプン、ソルビトール、Ｄ−マンニトール、白糖等を用いることができる。崩壊剤としてはデンプン、カルボキシメチルセルロース、炭酸カルシウム等を用いることができる。緩衝剤としてはリン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩等を用いることができる。乳化剤としてはアラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、トラガント等を用いることができる。懸濁剤としてはモノステアリン酸グリセリン、モノステアリン酸アルミニウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ラウリル硫酸ナトリウム等を用いることができる。安定剤としてはプロピレングリコール、ジエチリン亜硫酸塩、アスコルビン酸等を用いることができる。保存剤としてはフェノール、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルパラベン等を用いることができる。防腐剤としてはアジ化ナトリウム、塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、クロロブタノール等を用いることができる。 The present invention also provides a protease preparation containing a neutral protease produced by the production method. The protease preparation of the present invention may contain the neutral protease produced by the above production method, but may contain other components acceptable as a protease preparation in addition to the neutral protease of the present invention. it can. Examples of such other components include carriers, excipients, disintegrants, buffers, emulsifiers, suspending agents, stabilizers, preservatives, preservatives, and physiological saline. As the excipient, lactose, starch, sorbitol, D-mannitol, sucrose and the like can be used. As the disintegrant, starch, carboxymethylcellulose, calcium carbonate and the like can be used. Phosphate, citrate, acetate, etc. can be used as the buffer. As the emulsifier, gum arabic, sodium alginate, tragacanth and the like can be used. As the suspending agent, glyceryl monostearate, aluminum monostearate, methyl cellulose, carboxymethyl cellulose, hydroxymethyl cellulose, sodium lauryl sulfate and the like can be used. As the stabilizer, propylene glycol, diethylin sulfite, ascorbic acid or the like can be used. As preservatives, phenol, benzalkonium chloride, benzyl alcohol, chlorobutanol, methylparaben, and the like can be used. As a preservative, sodium azide, benzalkonium chloride, paraoxybenzoic acid, chlorobutanol and the like can be used.
さらに、本発明のプロテアーゼ調製物を、糖尿病等の治療を目的とし、膵臓等の臓器から膵島等の細胞群やβ細胞等の細胞を単離するための薬剤として利用する場合には、例えばコラゲナーゼ、エラステラーゼ、トリプシン、キモトリプシン等の他の酵素を含有していてもよい。また、本発明のプロテアーゼ調製物を、中性洗剤として利用する場合には、例えば、プロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、マンナーゼ、ペクチナーゼ、クチナーゼ、オキシドレダクターゼ、ヘミセルラーゼ、セルラーゼ等の他の酵素を含有していてもよい。 Furthermore, when the protease preparation of the present invention is used as a drug for isolating cell groups such as islets and cells such as β cells from organs such as pancreas for the treatment of diabetes and the like, for example, collagenase , Other enzymes such as elastase, trypsin, chymotrypsin may be contained. When the protease preparation of the present invention is used as a neutral detergent, it contains other enzymes such as protease, amylase, lipase, mannase, pectinase, cutinase, oxidoreductase, hemicellulase, and cellulase. May be.
以下、実施例及び比較例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。また、各実施例及び比較例で用いたプライマーの配列を表１に示す。 EXAMPLES Hereinafter, although this invention is demonstrated more concretely based on an Example and a comparative example, this invention is not limited to a following example. Table 1 shows the primer sequences used in each Example and Comparative Example.
（比較例１）
＜特許文献１に記載の遺伝子配列を用いた中性プロテアーゼの発現＞
（１−１） 特許文献１に記載の塩基配列を用いた中性プロテアーゼ発現用プラスミドの構築
Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓにおいて強力に作用するＰ２プロモータの配列についてはｐＮＣＭＯ２ベクター（タカラバイオ株式会社製）を鋳型としてＰ２−Ｆ及びＰ２−Ｒプライマーを用いて、中性プロテアーゼ遺伝子についてはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍのゲノムＤＮＡを鋳型としてＮＰ−Ｆ１及びＮＰ−Ｒプライマーを用いてＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲはＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いて、９８℃で１０秒、５５℃で５秒、７２℃で３０秒を４０サイクル実施した。増幅された約７００ｂｐのＤＮＡ断片及び１ｋｂｐのＤＮＡ断片（配列番号：７に記載の６０１〜１５９９番目の塩基配列を含むＤＮＡ断片）をＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔにより回収した。回収したＤＮＡ断片をそれぞれ１μＬずつ鋳型としてＰ２−Ｆ及びＮＰ−Ｒプライマーを用いてＰＣＲを行った。なお、ＮＰ−Ｆ１プライマーの１〜２０位はＰ２−Ｒプライマーと相補的な配列となっており、該相補的な配列を介して回収したＤＮＡ断片どうしはアニーリングすることができる。そのため、回収したＤＮＡ断片を鋳型としてＰ２−Ｆ及びＮＰ−Ｒプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、Ｐ２プロモータ−の下流に中性プロテアーゼをコードする塩基配列が連結している配列を増幅することができる。そして、このようにして増幅して得られた約１．７ｋｂｐのＤＮＡ断片、及びＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ用発現ベクターであるｐＮＣＭＯ２をＢａｌＩ及びＢａｍＨＩで制限酵素処理した後に、ライゲーション反応を行い、プラスミドｐＮＣＭＯ２−Ｐ２−ＮＰ（Ｆ１）を得た。
(Comparative Example 1)
<Expression of neutral protease using gene sequence described in Patent Document 1>
(1-1) Construction of Neutral Protease Expression Plasmid Using Base Sequence Described in Patent Document 1 For the P2 promoter sequence that acts strongly in Brevibacterium, the pNCMO2 vector (manufactured by Takara Bio Inc.) is used as a template. Using F and P2-R primers, the neutral protease gene was amplified by PCR using Clostridium histolyticum genomic DNA as a template and NP-F1 and NP-R primers. For PCR, PrimeSTAR Max DNA Polymerase (manufactured by Takara Bio Inc.) was used for 40 cycles of 98 ° C. for 10 seconds, 55 ° C. for 5 seconds, and 72 ° C. for 30 seconds. The amplified about 700 bp DNA fragment and 1 kbp DNA fragment (DNA fragment containing the 601st to 1599th base sequences described in SEQ ID NO: 7) were collected by the QIAquick PCR Purification Kit. PCR was performed using P2-F and NP-R primers with 1 μL of each recovered DNA fragment as a template. The NP-F1 primer has positions 1 to 20 complementary to the P2-R primer, and DNA fragments recovered via the complementary sequence can be annealed. Therefore, by performing PCR using the recovered DNA fragment as a template and P2-F and NP-R primers, a sequence in which a base sequence encoding a neutral protease is linked downstream of the P2 promoter is amplified. Can do. The about 1.7 kbp DNA fragment obtained by amplification in this way, and pNCMO2, which is an expression vector for Brevibacterium, were treated with restriction enzymes with BalI and BamHI, followed by ligation reaction, and plasmid pNCMO2-P2-NP. (F1) was obtained.
（１−２） 特許文献１に記載の遺伝子配列を用いた中性プロテアーゼの発現
プラスミドｐＮＣＭＯ２−Ｐ２−ＮＰ（Ｆ１）をエレクトロポレーションによりＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓ ＳＰ−３株に導入し、ネオマイシン耐性株（ｐＮＣＭＯ２−Ｐ２−ＮＰ（Ｆ１）形質転換体）を得た。次いで、ＴＭＮＭ液体培地（グルコース１０．０ｇ／Ｌ、ポリペプトン１０．０ｇ／Ｌ、肉エキス５．０ｇ／Ｌ、酵母エキス２．０ｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １０ｍｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ １０ｍｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １ｍｇ／Ｌ、ネオマイシン １０μｇ／ｍＬ）にて、ｐＮＣＭＯ２−Ｐ２−ＮＰ（Ｆ１）形質転換体の培養を行った。そして、得られた培養液を遠心し、菌体と培養上清に分離した後、該培養上清をフィルター（孔径：０．２μｍ）に通してろ過滅菌することにより、電気泳動用のサンプルとして調製した。次いで、このサンプルをＸＶ ＰＡＮＴＥＲＡ Ｇｅｌ １５％（ＤＲＣ社製）に供し、電気泳動分離を行った後、クマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色を行った。得られた結果を図１に示す。
(1-2) Expression of neutral protease using gene sequence described in Patent Document 1 Plasmid pNCMO2-P2-NP (F1) was introduced into Brevibacillus choshinensis SP-3 strain by electroporation, and neomycin resistant strain (pNCMO2) -P2-NP (F1) transformant) was obtained. Next, TM NM liquid medium (glucose 10.0 g / L, polypeptone 10.0 g / L, meat extract 5.0 g / L, yeast extract 2.0 g / L, FeSO 4 · 7H 2 O 10 mg / L, MnSO 4 · The pNCMO2-P2-NP (F1) transformant was cultured in 4H 2 O 10 mg / L, ZnSO 4 · 7H 2 O 1 mg / L, neomycin 10 μg / mL). And after centrifuging the obtained culture solution and separating into bacterial cells and culture supernatant, the culture supernatant is filtered and sterilized through a filter (pore size: 0.2 μm) to obtain a sample for electrophoresis. Prepared. Next, this sample was subjected to XV PANTERA Gel 15% (manufactured by DRC) and subjected to electrophoretic separation, followed by Coomassie brilliant blue (CBB) staining. The obtained results are shown in FIG.
また、ｐＮＣＭＯ２−Ｐ２−ＮＰ（Ｆ１）形質転換体を、１％スキムミルクを含むＬＢ培地（スキムミルクプレート）に接種して３７℃で一夜培養し、スキムミルクの分解の程度を調べた。得られた結果を図２のＡに示す。 In addition, the pNCMO2-P2-NP (F1) transformant was inoculated into LB medium (skimmed milk plate) containing 1% skimmed milk and cultured overnight at 37 ° C., and the degree of degradation of skimmed milk was examined. The obtained results are shown in FIG.
図１に示した結果から明らかなように、ｐＮＣＭＯ２−Ｐ２−ＮＰ（Ｆ１）形質転換体の培養上清中に約３５ｋＤａの中性プロテアーゼとおもわれるタンパク質は検出されなかった。また、図２のＡに示した結果から明らかなように、当該形質転換体をスキムミルクプレートで培養しても、スキムミルクの分解に起因するハローは検出されなかった。 As is clear from the results shown in FIG. 1, a protein considered to be about 35 kDa neutral protease was not detected in the culture supernatant of the pNCMO2-P2-NP (F1) transformant. Further, as apparent from the results shown in FIG. 2A, even when the transformant was cultured on a skim milk plate, no halo due to the degradation of skim milk was detected.
（実施例１）
＜中性プロテアーゼのシグナル配列ならびにプロ配列のクローニング＞
（２−１） 中性プロテアーゼのシグナル配列ならびにプロ配列の取得
中性プロテアーゼ成熟配列の上流部分を同定するために、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍのゲノムＤＮＡを鋳型としてＮＰ５−１及びＮＰ３プライマーを用いてＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲはＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いて、９８℃で１０秒、５５℃で５秒、７２℃で３０秒を３０サイクル実施した。増幅された約１．１ｋｂｐのＤＮＡ断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔにより回収した。ＰＣＲにより取得したＤＮＡ断片のシークエンスは、ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｂｃｉｎｇ Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ社製）とＡＢＩ ＰＲＩＳＭジェネティックアナライザー（アプライドバイオシステムズ社製）を用い、添付のプロトコールに従って決定した。そして、得られた塩基配列をアミノ酸配列に翻訳し、そのアミノ酸配列から４箇所のメチオニン（開始コドン：配列番号７に記載の１〜３番目、６１〜６３番目、２９５〜２９７番目及び６０１〜６０３番目のａｔｇがコードするメチオニン）を見出した。
Example 1
<Cloning of neutral protease signal sequence and pro sequence>
(2-1) Acquisition of Neutral Protease Signal Sequence and Pro Sequence Amplification by PCR using Clostridium histolyticum genomic DNA as a template and NP5-1 and NP3 primers to identify the upstream portion of the neutral protease mature sequence did. PCR was performed using PrimeSTAR Max DNA Polymerase (manufactured by Takara Bio Inc.) for 30 cycles of 98 ° C. for 10 seconds, 55 ° C. for 5 seconds, and 72 ° C. for 30 seconds. The amplified DNA fragment of about 1.1 kbp was recovered by QIAquick PCR Purification Kit. The sequence of the DNA fragment obtained by PCR was determined according to the attached protocol using BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) and ABI PRISM Genetic Analyzer (Applied Biosystems). Then, the obtained base sequence is translated into an amino acid sequence, and four methionines (start codons: first to third, 61st to 63rd, 295th to 297th and 601 to 603 described in SEQ ID NO: 7) from the amino acid sequence. Methionine encoded by the second atg) was found.
（実施例２）
＜シグナル配列及びプロ配列を含む中性プロテアーゼ遺伝子を用いたＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓ ＳＰ−３株での発現＞
（３−１） シグナル配列及びプロ配列を含む中性プロテアーゼ遺伝子発現用プラスミドの構築
シグナル配列及びプロ配列を含む中性プロテアーゼ遺伝子をＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍのゲノムＤＮＡを鋳型としてＮＰ−Ｆ２及びＮＰ−Ｒプライマーを用いてＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲはＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いて、９８℃で１０秒、５５℃で５秒、７２℃で３０秒を４０サイクル実施した。増幅された１．６ｋｂｐのＤＮＡ断片（配列番号：７に記載の塩基配列を含むＤＮＡ断片）をＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔにより回収した。回収したＤＮＡ断片と比較例１（１−１）で作製したＰ２プロモータ配列の断片をそれぞれ１μＬずつ鋳型としてＰ２−Ｆ及びＮＰ−Ｒプライマーを用いてＰＣＲを行い、Ｐ２プロモータ−の下流にシグナル配列ならびにプロ配列を含む中性プロテアーゼをコードする塩基配列が連結している配列を増幅した。増幅された約２．３ｋｂｐのＤＮＡ断片を、ＴＯＰＯ ＴＡクローニングキット（インビトロジェン社製）により、添付のプロトコールに従ってｐＣＲ２．１ ＴＯＰＯプラスミドベクターに挿入しプラスミドｐＣＲ−Ｐ２−ＮＰを得た。そして、ｐＣＲ−Ｐ２−ＮＰ及びｐＮＣＭＯ２を、ＢａｌＩ及びＢａｍＨＩで制限酵素処理した後に、ｐＣＲ−Ｐ２−ＮＰのインサート部分（約２．３ｋｂｐのＤＮＡ断片）とｐＮＣＭＯとのライゲーション反応を行い、プラスミドｐＮＣＭＯ２−Ｐ２−ＮＰを得た。
(Example 2)
<Expression in Brevibacterium choshinensis SP-3 strain using neutral protease gene containing signal sequence and pro sequence>
(3-1) Construction of Neutral Protease Gene Expression Plasmid Containing Signal Sequence and Pro Sequence Using Neutral Protease Gene Containing Signal Sequence and Pro Sequence as Clostridium histolyticum Genomic DNA as Template and Using NP-F2 and NP-R Primers And amplified by PCR. For PCR, PrimeSTAR Max DNA Polymerase (manufactured by Takara Bio Inc.) was used for 40 cycles of 98 ° C. for 10 seconds, 55 ° C. for 5 seconds, and 72 ° C. for 30 seconds. The amplified 1.6 kbp DNA fragment (DNA fragment containing the base sequence described in SEQ ID NO: 7) was recovered using the QIAquick PCR Purification Kit. PCR was performed using P2-F and NP-R primers with 1 μL each of the recovered DNA fragment and the P2 promoter sequence fragment prepared in Comparative Example 1 (1-1) as a template, and a signal sequence downstream of the P2 promoter. In addition, a sequence in which a base sequence encoding a neutral protease including a pro sequence was linked was amplified. The amplified DNA fragment of about 2.3 kbp was inserted into a pCR2.1 TOPO plasmid vector using a TOPO TA cloning kit (manufactured by Invitrogen) according to the attached protocol to obtain a plasmid pCR-P2-NP. Then, after pCR-P2-NP and pNCMO2 were treated with restriction enzymes BalI and BamHI, a ligation reaction was performed between pCR-P2-NP insert part (about 2.3 kbp DNA fragment) and pNCMO to obtain plasmid pNCMO2- P2-NP was obtained.
（３−２） 中性プロテアーゼの発現
プラスミドｐＮＣＭＯ−Ｐ２−ＮＰをエレクトロポレーション法によりＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓ ＳＰ−３株に導入し、ネオマイシン耐性株（ｐＮＣＭＯ２−Ｐ２−ＮＰ形質転換体）を得た。そして、ｐＮＣＭＯ２−Ｐ２−ＮＰ形質転換体の培養をＴＭＮＭ液体培地にて行い、得られた培養液を遠心し、菌体と培養上清に分離した後、該培養上清をフィルター（孔径：０．２μｍ）に通してろ過滅菌することにより、電気泳動用のサンプルとして調製した。次いで、このサンプルをＸＶ ＰＡＮＴＥＲＡ Ｇｅｌ １５％（ＤＲＣ社製）に供し、電気泳動分離を行った後、クマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色を行った。得られた結果を図３に示す。
(3-2) Expression of neutral protease Plasmid pNCMO-P2-NP was introduced into Brevibacillus choshinensis SP-3 strain by electroporation to obtain a neomycin resistant strain (pNCMO2-P2-NP transformant). Then, the pNCMO2-P2-NP transformant is cultured in TM NM liquid medium, and the obtained culture solution is centrifuged to separate the cells and culture supernatant, and then the culture supernatant is filtered (pore size: 0.2 μm) and sterilized by filtration to prepare a sample for electrophoresis. Next, this sample was subjected to XV PANTERA Gel 15% (manufactured by DRC) and subjected to electrophoretic separation, followed by Coomassie brilliant blue (CBB) staining. The obtained results are shown in FIG.
また、ｐＮＣＭＯ２−Ｐ２−ＮＰ形質転換体を、１％スキムミルクを含むＬＢ培地（スキムミルクプレート）に接種して３７℃で一夜培養し、スキムミルクの分解の程度を調べた。得られた結果を図２のＢに示す。 In addition, the pNCMO2-P2-NP transformant was inoculated into an LB medium (skimmed milk plate) containing 1% skimmed milk and cultured overnight at 37 ° C., and the degree of degradation of skimmed milk was examined. The obtained results are shown in FIG.
図３に示した結果から明らかなように、ｐＮＣＭＯ２−Ｐ２−ＮＰ形質転換体の培養上清中に約３５ｋＤａの中性プロテアーゼとおもわれるタンパク質が検出された。また、図２のＢに示した結果から明らかなように、当該形質転換体をスキムミルクプレートで培養したところ、スキムミルクの分解に起因するハローが検出された。 As is clear from the results shown in FIG. 3, a protein considered to be about 35 kDa neutral protease was detected in the culture supernatant of the pNCMO2-P2-NP transformant. As is clear from the results shown in FIG. 2B, when the transformant was cultured on a skim milk plate, a halo resulting from the degradation of skim milk was detected.
また、図には示さないが、配列番号７に記載の６１〜６３番目のａｔｇを開始コドンとする中性プロテアーゼをコードする塩基配列及び配列番号７に記載の２９５〜２９７番目のａｔｇを開始コドンとする中性プロテアーゼをコードする塩基配列についても前記同様に各々発現ベクターを作製し、これらの発現ベクターを導入した宿主細胞を用いて、中性プロテアーゼの活性を評価した。しかし、比較例１に示した配列番号７に記載の６０１〜６０３番目のａｔｇを開始コドンとする中性プロテアーゼをコードする塩基配列を用いた場合と同じく、いずれも中性プロテアーゼの活性は検出されなかった。 Although not shown in the figure, the nucleotide sequence encoding the neutral protease having the 61st to 63rd atg described in SEQ ID NO: 7 as the start codon and the 295th to 297th atg described in SEQ ID NO: 7 are used as the start codon. As for the base sequence encoding the neutral protease, an expression vector was prepared in the same manner as described above, and the activity of the neutral protease was evaluated using host cells into which these expression vectors were introduced. However, as in the case of using a base sequence encoding a neutral protease having the 601st to 603rd atg described in SEQ ID NO: 7 shown in Comparative Example 1 as an initiation codon, the activity of the neutral protease was detected in all cases. There wasn't.
（実施例３）
＜シグナル配列及びプロ配列を含む中性プロテアーゼ遺伝子を用いたＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＫＮ−２株での発現＞
（４−１） シグナル配列及びプロ配列を含む中性プロテアーゼ遺伝子発現用プラスミドの構築
両端にＢａｍＨＩ及びＳｍａＩの制限酵素サイトを導入するため、プラスミドｐＣＲ−Ｐ２−ＮＰを鋳型としてＮＰ−ＢａｍＨＩ−Ｎ０及びＮＰ−ＳｍａＩ−Ｃ０プライマーを用いて、ＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲはＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いて、９８℃で１０秒、５５℃で５秒、７２℃で３０秒を３５サイクル実施した。増幅された１．６ｋｂｐのＤＮＡ断片（配列番号：７に記載の塩基配列を含むＤＮＡ断片）をＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔにより回収した。回収したＤＮＡ断片及びＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ発現用ベクターｐＨＴ０１（Ｍｏ Ｂｉ Ｔｅｃ社）をＢａｍＨＩ及びＳｍａＩで制限酵素処理した後に、ライゲーション反応を行い、プラスミドｐＨＴ０１−ＮＰを得た。
(Example 3)
<Expression in Bacillus subtilis KN-2 strain using neutral protease gene including signal sequence and pro sequence>
(4-1) Construction of Neutral Protease Gene Expression Plasmid Containing Signal Sequence and Pro Sequence In order to introduce BamHI and SmaI restriction enzyme sites at both ends, NP-BamHI-N0 and plasmid pCR-P2-NP were used as templates. Amplification was performed by PCR using NP-SmaI-C0 primer. For PCR, PrimeSTAR Max DNA Polymerase (manufactured by Takara Bio Inc.) was used for 35 cycles of 98 ° C. for 10 seconds, 55 ° C. for 5 seconds, and 72 ° C. for 30 seconds. The amplified 1.6 kbp DNA fragment (DNA fragment containing the base sequence described in SEQ ID NO: 7) was recovered using the QIAquick PCR Purification Kit. The recovered DNA fragment and Bacillus subtilis expression vector pHT01 (Mo Bi Tec) were treated with BamHI and SmaI, followed by ligation reaction to obtain plasmid pHT01-NP.
（４−２） Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＫＮ−２株での中性プロテアーゼ発現
プラスミドｐＨＴ０１−ＮＰをＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＫＮ−２株のコンピテントセルに導入し、クロラムフェニコール耐性株（ｐＨＴ０１−ＮＰ形質転換体）を得た。クロラムフェニコールを含むＬＢ液体培地（バクトトリプトン １０．０ｇ／Ｌ、イースト ５．０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ １０．０ｇ／Ｌ、クロラムフェニコール ２５μｇ／ｍＬ）にて３７℃で２４時間、ｐＨＴ０１−ＮＰ形質転換体を培養した後、ＩＰＴＧにてタンパク質の発現誘導を３７℃で４時間行なった。
(4-2) Neutral protease expression in Bacillus subtilis KN-2 strain Plasmid pHT01-NP was introduced into competent cells of Bacillus subtilis KN-2 strain, and chloramphenicol resistant strain (pHT01-NP transformant) Got. LB liquid medium containing chloramphenicol (bactotryptone 10.0 g / L, yeast 5.0 g / L, NaCl 10.0 g / L, chloramphenicol 25 μg / mL) at 37 ° C. for 24 hours, pHT01 -After cultivating NP transformants, protein expression was induced with IPTG at 37 ° C for 4 hours.
そして、得られた培養液を遠心し、菌体と培養上清に分離した後、該培養上清をフィルター（孔径：０．２μｍ）に通してろ過滅菌することにより、電気泳動用のサンプルとして調製した。次いで、このサンプルを１２％ Ｇｅｌ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ ｍｉｎｉ（テフコ社製）に供し、電気泳動分離を行った後、クマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色を行った。得られた結果を図４に示す。 And after centrifuging the obtained culture solution and separating into bacterial cells and culture supernatant, the culture supernatant is filtered and sterilized through a filter (pore size: 0.2 μm) to obtain a sample for electrophoresis. Prepared. Next, this sample was subjected to 12% Gel SDS-PAGE mini (manufactured by Tefco), subjected to electrophoretic separation, and then stained with Coomassie Brilliant Blue (CBB). The obtained results are shown in FIG.
図４に示した結果から明らかなように、宿主をＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓ ＳＰ−３株からＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＫＮ−２株に変えても、実施例２の結果と同様に、ｐＨＴ０１−ＮＰ形質転換体の培養上清においても約３５ｋＤａの中性プロテアーゼと思われるタンパク質が検出された。 As is clear from the results shown in FIG. 4, even when the host was changed from Brevibacillus choshinensis SP-3 strain to Bacillus subtilis KN-2 strain, the pHT01-NP transformant was cultured in the same manner as in Example 2. A protein that was considered to be a neutral protease of about 35 kDa was also detected in the silkworm.
（４−３） 発現した中性プロテアーゼのＮ末端アミノ酸配列の同定
実施例３の（４−２）で発現させたタンパク質がクロストリディウム・ヒストリティカム由来中性プロテアーゼであることを確認するために、Ｎ末端アミノ酸配列を決定した。まず、培養上清中のタンパク質について１２％ Ｇｅｌ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ ｍｉｎｉ（テフコ社製）を用いて電気泳動による分離を行い、ＰＶＤＦ膜（ミリポア社製）上にブロットした。得られた約３５ｋＤａのバンドを切り出し、プロテインシークエンサーＭｏｄｅｌ ４９２（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて、Ｎ末端アミノ酸配列を決定した。その結果、クロストリディウム・ヒストリティカム由来中性プロテアーゼのＮ末端アミノ酸配列（配列番号：６に記載の１〜５番目のアミノ酸配列）と一致した。
(4-3) Identification of N-terminal amino acid sequence of expressed neutral protease It is confirmed that the protein expressed in (4-2) of Example 3 is a Clostridium history cam-derived neutral protease. Therefore, the N-terminal amino acid sequence was determined. First, proteins in the culture supernatant were separated by electrophoresis using 12% Gel SDS-PAGE mini (manufactured by Tefco) and blotted onto a PVDF membrane (manufactured by Millipore). The obtained band of about 35 kDa was cut out, and the N-terminal amino acid sequence was determined using a protein sequencer Model 492 (manufactured by Applied Biosystems). As a result, it was consistent with the N-terminal amino acid sequence of the neutral protease derived from Clostridium historicum (the first to fifth amino acid sequences described in SEQ ID NO: 6).
（４−４） 形質転換体における中性プロテアーゼ活性の測定
実施例３の（４−２）で得られたｐＨＴ０１−ＮＰ形質転換体の培養上清を用いてアゾカゼイン分解活性を測定した。測定は、アゾカゼインを基質とし、基質の分解によって生じる遊離チロシン量を３３５ｎｍの吸光度で測定する方法を用い、文献（Ｎａｇａｓｅ Ｈ， Ｈａｒｒｉｓ ＥＤ Ｊｒ；Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． １９８３ Ｊｕｎ ２５；２５８（１２）：７４９０−８）に記載の方法に準じて行った。
(4-4) Measurement of neutral protease activity in transformant The azocasein degrading activity was measured using the culture supernatant of the pHT01-NP transformant obtained in (4-2) of Example 3. The measurement uses a method in which azocasein is used as a substrate and the amount of free tyrosine produced by the decomposition of the substrate is measured at an absorbance of 335 nm, and the literature (Nagase H, Harris ED Jr; J Biol Chem. It was carried out according to the method described in -8).
なお、アゾカゼイン分解活性は、反応条件においてＯ．Ｄ．（３３５ｎｍ）＝１．０になるのに必要な酵素量を１ ｕｎｉｔと定義し、培養上清１ｍＬ当りの活性（Ｕ／ｍＬ）として表した。得られた結果を表２に示す。表２に示した結果から明らかなように、ｐＨＴ０１−ＮＰ形質転換体は親株（遺伝子を導入していない株）の約１９倍の活性を示した。 The azocasein degrading activity is O.D. D. The amount of enzyme required to reach (335 nm) = 1.0 was defined as 1 unit, and expressed as activity (U / mL) per 1 mL of culture supernatant. The obtained results are shown in Table 2. As is clear from the results shown in Table 2, the pHT01-NP transformant showed about 19 times the activity of the parent strain (strain into which no gene was introduced).
以上の結果から、配列番号７：に記載の１〜６５７番目の塩基配列がコードするポリペプチド（配列番号８：に記載の１〜２１９番目のアミノ酸配列からなるポリペプチド）が、中性プロテアーゼの宿主細胞外への分泌産生を可能としていることが明らかになった。また、配列番号８：に記載のアミノ酸配列をシグナル配列予測ソフトウェア（ＳｉｇｎａｌＰ ３．０、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ／）を用いて解析したところ、配列番号：２に記載のアミノ酸配列（配列番号：１に記載の塩基配列がコ―ドするアミノ酸配列）がシグナル配列と推定され、結果、配列番号：４に記載のアミノ酸配列（配列番号：３に記載の塩基配列がコ―ドするアミノ酸配列）がプロ配列として機能していることが推定された。 From the above results, the polypeptide encoded by the 1st to 657th base sequence described in SEQ ID NO: 7 (polypeptide consisting of the 1st to 219th amino acid sequence described in SEQ ID NO: 8) is a neutral protease. It became clear that secretion production outside the host cell was enabled. The amino acid sequence described in SEQ ID NO: 8 was analyzed using signal sequence prediction software (SignalP 3.0, http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/). SEQ ID NO: 2 The amino acid sequence described in (the amino acid sequence encoded by the base sequence described in SEQ ID NO: 1) is presumed to be a signal sequence, and as a result, the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 4 (the base described in SEQ ID NO: 3). It was presumed that the amino acid sequence that the sequence codes) functions as a pro sequence.
以上説明したように、本発明によれば、目的とするタンパク質の宿主細胞外への分泌産生が可能となる。特に、本発明のシグナル配列やプロ配列をコードするポリヌクレオチドを利用して得られる中性プロテアーゼは、クロストリディウム・ヒストリティカム以外の宿主細胞から、活性を有した成熟型として分泌産生することができる。 As described above, according to the present invention, it is possible to secrete and produce the target protein outside the host cell. In particular, the neutral protease obtained by using the polynucleotide encoding the signal sequence or pro sequence of the present invention is secreted and produced as a mature form having activity from host cells other than Clostridium histolyticum. be able to.
したがって、クロストリディウム・ヒストリティカムの培養液に含まれる非常に多くのプロテアーゼ活性を有するタンパク質を混入させることなく、中性プロテアーゼを調製することができるため、本発明のシグナル配列やプロ配列を利用して得られる中性プロテアーゼは、糖尿病等の治療を目的とし、膵臓等の臓器から膵島等の細胞群やβ細胞等の細胞を単離するための薬剤や、中性洗剤等として有用である。 Therefore, since a neutral protease can be prepared without mixing a protein having a large amount of protease activity contained in a culture solution of Clostridium history cam, the signal sequence and the pro sequence of the present invention can be prepared. Neutral proteases obtained by using lysine are useful as agents for isolating cell groups such as islets and cells such as β cells from organs such as pancreas and neutral detergents for the purpose of treating diabetes and the like It is.
配列番号９〜１７
＜２２３＞ 人工的に合成されたプライマーの配列
SEQ ID NOs: 9-17
<223> Artificially synthesized primer sequences
Claims (6)
（a）配列番号：２に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（b）配列番号：１に記載の塩基配列のコード領域を含むポリヌクレオチド
（c）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（d）配列番号：２に記載のアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（e）配列番号：１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド
（f）配列番号：４に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（g）配列番号：３に記載の塩基配列のコード領域を含むポリヌクレオチド
（h）配列番号：４に記載のアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（i）配列番号：４に記載のアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（j）配列番号：３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド
（k）配列番号：６に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（l）配列番号：５に記載の塩基配列のコード領域を含むポリヌクレオチド
（m）配列番号：６に記載のアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（n）配列番号：６に記載のアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（o）配列番号：５に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド。 A polynucleotide according to any one of (a) to (e) below that encodes a signal sequence, a polynucleotide according to any of (f) to (j) below that encodes a pro sequence, and a neutral protease: A polynucleotide linked to a polynucleotide according to any one of (k) to (o) below encoding a mature sequence
(A) a polynucleotide encoding a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2
(B) a polynucleotide comprising the coding region of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1
(C) a polynucleotide encoding a protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2
(D) a polynucleotide encoding a protein comprising an amino acid sequence having 95% or more identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2
(E) a polynucleotide that hybridizes with the polynucleotide comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 under stringent conditions
(F) a polynucleotide encoding a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4
(G) a polynucleotide comprising the coding region of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 3
(H) a polynucleotide encoding a protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4
(I) a polynucleotide encoding a protein comprising an amino acid sequence having 95% or more identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4
(J) a polynucleotide that hybridizes with the polynucleotide comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 3 under stringent conditions
(K) a polynucleotide encoding a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6
(L) a polynucleotide comprising the coding region of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 5
(M) a polynucleotide encoding a protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6
(N) a polynucleotide encoding a protein comprising an amino acid sequence having 95% or more identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6
(O) a polynucleotide that hybridizes with the polynucleotide comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 5 under stringent conditions.
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