JP5850702B2 - Differentiation regulator of mesenchymal cells, medicament using the same, and screening method for substances having differentiation regulating action on mesenchymal cells - Google Patents

Differentiation regulator of mesenchymal cells, medicament using the same, and screening method for substances having differentiation regulating action on mesenchymal cells Download PDF

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Description

本発明は、間葉系細胞の分化調節剤(分化促進剤/分化抑制剤)およびこれを用いた医薬、並びに間葉系細胞への分化調節作用を有する物質のスクリーニング方法に関する。   The present invention relates to a differentiation regulator (differentiation promoter / differentiation inhibitor) for mesenchymal cells, a drug using the same, and a method for screening a substance having a differentiation regulating action on mesenchymal cells.

近年、間葉系細胞の1種である骨芽細胞の分化を調節する様々なタンパク質が同定されているが、それらは骨形成蛋白質(Bone Morphogenetic Protein;BMP)のように種々の組織に作用してしまうような特異性の極めて低いタンパク質であるか、またはDNAに直接作用する転写制御因子である。例えばBMPは、強い骨誘導作用がある一方、筋肉等の軟部組織をも骨化させてしまうことから、医薬として用いるのは難しい。また。骨芽細胞の分化を調節する転写制御因子としてはcbfa1の他にホメオボックス遺伝子であるMsxやDlxが知られている。なかでも、Dlx5は、脊椎動物の個体の発生過程において骨組織に特異的に発現することが知られており、骨芽細胞の成熟に従ってDlx5遺伝子の発現レベルが増加し、Dlx5タンパク質が骨芽細胞の表現形質を遺伝子レベルで制御していることが報告されている。さらに、BMPの刺激によって骨芽細胞で特異的にDlx5遺伝子が誘導されること、このDlx5を過剰発現させた骨芽細胞では分化が著しく亢進していることが報告されている。   Recently, various proteins that regulate the differentiation of osteoblasts, a type of mesenchymal cell, have been identified, but they act on various tissues such as bone morphogenetic protein (BMP). Or a transcriptional regulator that acts directly on DNA. For example, BMP has a strong osteoinductive effect, but also ossifies soft tissues such as muscles, making it difficult to use as a medicine. Also. In addition to cbfa1, homeobox genes such as Msx and Dlx are known as transcriptional regulatory factors that regulate osteoblast differentiation. Among these, Dlx5 is known to be specifically expressed in bone tissue during the development of vertebrate individuals, and the expression level of Dlx5 gene increases as osteoblasts mature, and Dlx5 protein is expressed in osteoblasts. It has been reported that the phenotypic traits of the gene are controlled at the gene level. Furthermore, it has been reported that the Dlx5 gene is specifically induced in osteoblasts by stimulation of BMP, and that differentiation is remarkably enhanced in osteoblasts overexpressing this Dlx5.

ここで、従来、骨芽細胞の分化にmiRNA(マイクロRNA、microRNA)が関与する可能性が報告されている。miRNAは、細胞内在性の、20〜25塩基程度の非コードRNAである。miRNAは、ゲノムDNA上のmiRNA遺伝子から、まず数百〜数千塩基程度の長さの一次転写物(pri−miRNA)として転写される。次いで、プロセシングを受けて約60〜70塩基程度のヘアピン構造を有するpre−miRNAとなる。その後、核から細胞質内に移り、さらにプロセシングを受けて20〜25塩基程度の二量体(ガイド鎖およびパッセンジャー鎖)からなる成熟miRNAとなる。成熟miRNAは、そのうちのガイド鎖(アンチセンス鎖)がRISC(RNA-Induced Silencing Complex)と呼ばれるタンパク質と複合体を形成し、標的遺伝子のmRNAに作用することで、標的遺伝子の翻訳を阻害する働きをすることが知られている。   Here, conventionally, the possibility that miRNA (microRNA, microRNA) is involved in osteoblast differentiation has been reported. miRNA is a non-coding RNA of about 20 to 25 bases that is endogenous to cells. miRNA is first transcribed from a miRNA gene on genomic DNA as a primary transcript (pri-miRNA) having a length of about several hundred to several thousand bases. Then, it is processed to become a pre-miRNA having a hairpin structure of about 60 to 70 bases. Thereafter, the miRNA moves from the nucleus into the cytoplasm and is further processed to become a mature miRNA composed of a dimer (guide strand and passenger strand) of about 20 to 25 bases. In mature miRNA, the guide strand (antisense strand) of these forms a complex with a protein called RISC (RNA-Induced Silencing Complex) and acts on the mRNA of the target gene, thereby inhibiting the translation of the target gene. It is known to do.

具体的には、例えば特許文献1では、miR−125bが間葉系細胞の分化を抑制すること、および、当該miR−125bの機能抑制剤が間葉系細胞の分化を促進する分化促進剤として骨粗鬆症等の疾患を治療・予防するための医薬として用いられうること、が開示されている。   Specifically, for example, in Patent Document 1, miR-125b suppresses differentiation of mesenchymal cells, and the function inhibitor of miR-125b promotes differentiation of mesenchymal cells. It is disclosed that it can be used as a medicine for treating and preventing diseases such as osteoporosis.

また、本発明者らも、特許文献2において、別のmiRNAであるmiRNA−141、miRNA−200aが、ともにDlx5遺伝子の3’非翻訳領域への結合を介して間葉系細胞の分化を抑制すること、miRNA−208がEts1遺伝子を標的にして分化を抑制すること、これらのmiRNAの阻害剤が間葉系細胞の分化を促進する分化促進剤として骨粗鬆症等の疾患を予防・治療するための医薬として用いられうること、を開示している。   In addition, in the Patent Document 2, the present inventors also inhibited miRNA-141 and miRNA-200a, which are other miRNAs, from inhibiting the differentiation of mesenchymal cells through binding to the 3 ′ untranslated region of the Dlx5 gene. MiRNA-208 targets the Ets1 gene and suppresses differentiation, and these miRNA inhibitors promote differentiation of mesenchymal cells to prevent / treat diseases such as osteoporosis It is disclosed that it can be used as a medicine.

特開2008−184450号公報JP 2008-184450 A 国際公開第2010/058824号パンフレットInternational Publication No. 2010/058824 Pamphlet

上述したように、miRNAを利用して間葉系細胞の分化を調節する技術はこれまでにもいくつか提案されているが、種々の疾患の予防・治療剤として決定的に有効なものは依然として開発されてはいないのが現状である。また、疾患の種類やその重篤度に応じた予防・治療剤のラインアップを充実させるという観点からも、数多くの分化調節剤やこれを用いた医薬、並びにかような医薬の候補となりうる物質のスクリーニング方法を開発することの意義は大きい。   As described above, several techniques for regulating the differentiation of mesenchymal cells using miRNA have been proposed so far, but those that are decisively effective as preventive / therapeutic agents for various diseases remain. The current situation is that it has not been developed. In addition, from the viewpoint of enhancing the lineup of preventive and therapeutic agents according to the type of disease and its severity, many differentiation regulators, drugs using them, and substances that can be candidates for such drugs There is great significance in developing a screening method.

そこで本発明は、間葉系細胞の分化を調節するための新規な剤や、これを用いた医薬、並びにかような医薬の候補となりうる物質のスクリーニング方法を提供することを目的とする。   Therefore, an object of the present invention is to provide a novel agent for regulating the differentiation of mesenchymal cells, a drug using the same, and a screening method for substances that can be candidates for such drugs.

本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意研究を行った。その結果、miRNA−294が間葉系細胞の分化を促進する作用を有していることを見出し、本発明を完成させるに至った。   The present inventors have conducted intensive studies in view of the above problems. As a result, it was found that miRNA-294 has an action of promoting the differentiation of mesenchymal cells, and the present invention has been completed.

すなわち、本発明の一形態によれば、miRNA−294、その前駆体およびこれらをコードするDNA構築物からなる群から選択される1種または2種以上を有効成分として含有し、間葉系細胞の分化を促進する、間葉系細胞の分化調節剤が提供される。   That is, according to one aspect of the present invention, miRNA-294, its precursor, and one or more selected from the group consisting of DNA constructs encoding them are contained as active ingredients, and An agent for regulating differentiation of mesenchymal cells that promotes differentiation is provided.

また、本発明の他の形態によれば、miRNA−294の阻害剤を有効成分として含有し、間葉系細胞の分化を抑制する、間葉系細胞の分化調節剤が提供される。   Moreover, according to the other form of this invention, the differentiation regulator of a mesenchymal cell which contains the inhibitor of miRNA-294 as an active ingredient, and suppresses the differentiation of a mesenchymal cell is provided.

上述した分化調節剤において、間葉系細胞は、好ましくは骨芽細胞である。   In the differentiation regulator described above, the mesenchymal cell is preferably an osteoblast.

本発明のさらに他の形態によれば、間葉系細胞の分化異常に起因する疾患を予防または治療するための医薬もまた、提供される。当該医薬は、上述した分化調節剤を含むものである。   According to still another aspect of the present invention, a medicament for preventing or treating a disease caused by abnormal differentiation of mesenchymal cells is also provided. The medicament contains the differentiation regulator described above.

上述した医薬において、疾患は、好ましくは間葉系細胞の分化の障害に起因する疾患である。   In the medicament described above, the disease is preferably a disease caused by a disorder of mesenchymal cell differentiation.

また、上述した医薬において好ましくは、間葉系細胞が骨芽細胞であり、疾患が骨粗鬆症、骨形成不全、および発達期における成長阻害からなる群から選択される1種または2種以上である。   In the above-described medicament, preferably, the mesenchymal cell is an osteoblast, and the disease is one or more selected from the group consisting of osteoporosis, osteogenesis dysfunction, and growth inhibition in the developmental stage.

また、本発明のさらに他の形態によれば、間葉系細胞への分化調節作用を有する物質のスクリーニング方法もまた、提供される。当該方法は、miRNA−294を発現している間葉系幹細胞もしくは間葉系前駆細胞または非ヒト動物に対して被験物質を供給する工程と、前記間葉系幹細胞もしくは間葉系前駆細胞または非ヒト動物におけるmiRNA−294の発現または機能を、前記被験物質の非供給時におけるmiRNA−294の発現または機能と対比し、その対比結果に基づいて、前記被験物質の間葉系細胞への分化促進作用または分化抑制作用を評価する工程とを有するものである。   According to still another aspect of the present invention, there is also provided a method for screening a substance having an action of regulating differentiation into mesenchymal cells. The method comprises a step of supplying a test substance to a mesenchymal stem cell or mesenchymal progenitor cell or non-human animal expressing miRNA-294, and the mesenchymal stem cell or mesenchymal progenitor cell or non-human animal. The expression or function of miRNA-294 in a human animal is compared with the expression or function of miRNA-294 when the test substance is not supplied, and based on the comparison result, differentiation of the test substance into mesenchymal cells is promoted And the step of evaluating the action of inhibiting the differentiation.

本発明によれば、間葉系細胞の分化を調節するための新規な剤や、これを用いた医薬、並びにかような医薬の候補となりうる物質のスクリーニング方法が提供される。   According to the present invention, there are provided a novel agent for regulating differentiation of mesenchymal cells, a drug using the same, and a screening method for substances that can be candidates for such drugs.

マウスのpre−miRNA−294の模式図である。It is a schematic diagram of mouse pre-miRNA-294. 実施例1において、miRNA-294導入MC3T3-E1細胞におけるBMP-2誘導骨芽細胞分化への影響を調べた結果を示す写真である。In Example 1, it is a photograph which shows the result of having investigated the influence on BMP-2 induction osteoblast differentiation in miRNA-294 introduction | transduction MC3T3-E1 cell. 実施例2において、miRNA-294導入MC3T3-E1細胞のBMP-2誘導有無による分化への影響を調べた結果を示す写真である。In Example 2, it is a photograph which shows the result of having investigated the influence on the differentiation by the presence or absence of BMP-2 induction | guidance | derivation of miRNA-294 introduction | transduction MC3T3-E1 cell. 実施例3において、miRNA-294導入ヒト骨芽細胞株HFO-SV-40のBMP-2誘導有無による分化への影響を調べた結果を示す写真である。In Example 3, it is a photograph which shows the result of having investigated the influence on differentiation by the presence or absence of BMP-2 induction | guidance | derivation of miRNA-294 introduction | transduction human osteoblast cell line HFO-SV-40.

本明細書の開示は、miRNA−294およびその利用に関する。本明細書の開示は、miRNA−294が間葉系細胞の分化を促進する作用を有していることを見出したことに基づいている。すなわち、本明細書の開示によれば、miRNA−294、その前駆体およびこれらをコードするDNA構築物が間葉系細胞の分化を促進する分化調節剤として利用されうる。また、miRNA−294の阻害剤が間葉系細胞の分化を抑制する分化調節剤として利用されうる。さらに、本明細書の開示によれば、このような間葉系細胞の分化調節剤を用いた医薬や、間葉系細胞への分化調節作用を有する物質のスクリーニング方法も提供される。以下、本明細書の開示の実施形態について、より詳細に説明する。   The disclosure herein relates to miRNA-294 and uses thereof. The disclosure of the present specification is based on the discovery that miRNA-294 has an action of promoting differentiation of mesenchymal cells. That is, according to the disclosure of the present specification, miRNA-294, a precursor thereof, and a DNA construct encoding them can be used as a differentiation regulator that promotes differentiation of mesenchymal cells. In addition, miRNA-294 inhibitors can be used as differentiation regulators that suppress the differentiation of mesenchymal cells. Furthermore, according to the disclosure of the present specification, a medicine using such a mesenchymal cell differentiation regulator and a method for screening a substance having a differentiation regulating action on mesenchymal cells are also provided. Hereinafter, embodiments of the present disclosure will be described in more detail.

なお、以下の説明では、miRNA、pri−miRNA、pre−miRNAにおいて、最終的に標的となる遺伝子のmRNAと対合する、当該mRNAに対するアンチセンス鎖(または当該アンチセンス鎖を含むRNA領域)を「ガイド鎖」と表現する。一方、前記アンチセンス鎖に対するセンス鎖(または当該センス鎖を含むRNA領域)を「パッセンジャー鎖」と表現する。   In the following description, in miRNA, pri-miRNA, and pre-miRNA, an antisense strand (or an RNA region containing the antisense strand) against the mRNA that is finally paired with mRNA of a target gene is used. Expressed as “guide chain”. On the other hand, a sense strand (or an RNA region containing the sense strand) with respect to the antisense strand is expressed as a “passenger strand”.

≪間葉系細胞の分化調節剤≫
本明細書に開示の分化調節剤は、間葉系細胞への分化を調節するものである。したがって、分化調節剤の適用対象は、間葉系細胞への分化能を有する細胞である。間葉系細胞への分化能を有する細胞の種類としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、間葉系幹細胞および間葉系前駆細胞が挙げられる。間葉系幹細胞および間葉系前駆細胞の入手方法としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、個体の骨髄等から単離することにより得ることもできるし、既にクローン化された間葉系幹細胞として各種機関から入手することもできる。このような既にクローン化された間葉系幹細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。例えば、マウス由来の間葉系幹細胞としては、頭蓋骨由来前駆骨芽細胞であるMC3T3−E1、骨髄由来前脂肪細胞であるST2細胞、NRG細胞などが挙げられる(それぞれ独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンター(BRC)から入手可能である)。なお、間葉系幹細胞以外の細胞であっても、間葉系細胞への分化能を有する細胞であれば、分化調節剤の適用対象として用いられうる。
<< Mesenchymal cell differentiation regulator >>
The differentiation regulator disclosed in the present specification regulates differentiation into mesenchymal cells. Therefore, the application target of the differentiation regulator is a cell having the ability to differentiate into mesenchymal cells. There is no restriction | limiting in particular as a kind of cell which has the differentiation ability to a mesenchymal cell, According to the objective, it can select suitably, For example, a mesenchymal stem cell and a mesenchymal progenitor cell are mentioned. The method for obtaining mesenchymal stem cells and mesenchymal progenitor cells is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose.For example, it can be obtained by isolation from the bone marrow of an individual, It can also be obtained from various organizations as already mesenchymal stem cells that have been cloned. Such already cloned mesenchymal stem cells are not particularly limited and may be appropriately selected depending on the purpose. For example, examples of mouse-derived mesenchymal stem cells include MC3T3-E1, which is a skull-derived progenitor osteoblast, ST2 cells, which are bone marrow-derived preadipocytes, and NRG cells (each of which is a RIKEN BioResource Center). (Available from (BRC)). In addition, even cells other than mesenchymal stem cells can be used as an application target of a differentiation regulator as long as they are cells capable of differentiating into mesenchymal cells.

また、間葉系細胞の種類についても特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、骨芽細胞、脂肪細胞、筋細胞、軟骨細胞などが挙げられる。なかでも、特に骨芽細胞が好ましい。   Moreover, there is no restriction | limiting in particular also about the kind of mesenchymal cell, According to the objective, it can select suitably, For example, an osteoblast, an adipocyte, a muscle cell, a chondrocyte etc. are mentioned. Of these, osteoblasts are particularly preferable.

本発明の一形態に係る間葉系細胞の分化調節剤は、miRNA−294、その前駆体およびこれらをコードするDNA構築物からなる群から選択される1種または2種以上を有効成分として含有する。この場合、当該分化調節剤は、間葉系細胞の分化を促進する作用を有するものである。   The differentiation regulator for mesenchymal cells according to one aspect of the present invention contains, as an active ingredient, one or more selected from the group consisting of miRNA-294, a precursor thereof, and a DNA construct encoding them. . In this case, the differentiation regulator has an action of promoting the differentiation of mesenchymal cells.

(miRNA−294)
上述した分化調節剤が有効成分として含みうるマウスmiRNA−294の成熟配列(ガイド鎖の配列)は、以下に示すとおりである。
(MiRNA-294)
The mature sequence (guide strand sequence) of mouse miRNA-294 that the above-mentioned differentiation regulator can contain as an active ingredient is as shown below.

なお、ヒトmiRNA−294の存在については、文献(Gurman Singh Pall et al., Nucleic Acids Research, 2007, Vol. 35, No. 8, e60)において示唆されている。当該文献においてヒトmiRNA−294の塩基配列は記載されていないが、後述する実施例において上記マウスmiRNA−294が間葉系細胞の分化誘導作用を示していることから、ヒトmiRNA−294の塩基配列はマウスmiRNA−294のものとほとんど同一であると考えられる。   The presence of human miRNA-294 has been suggested in literature (Gurman Singh Pall et al., Nucleic Acids Research, 2007, Vol. 35, No. 8, e60). Although the base sequence of human miRNA-294 is not described in this document, since the mouse miRNA-294 shows the mesenchymal cell differentiation-inducing action in Examples described later, the base sequence of human miRNA-294 Is considered to be almost identical to that of mouse miRNA-294.

このようなmiRNA−294は、その塩基配列に基づき、従来公知の手法を用いて、天然物から単離することにより、化学的に合成することにより、あるいはin vivoまたはin vitroで遺伝子工学的に生産させることができる。また、このmiRNA−294は、内在性の成熟型miRNAを模倣するように合成された類縁体であってもよい。こうした類縁体としては、例えば、Ambion社などから入手可能である。こうしたmiRNA−294は、一本鎖であってもよいし、相補鎖を備える二本鎖であってもよい。   Such miRNA-294 is based on its base sequence and is isolated from natural products, chemically synthesized, or genetically engineered in vivo or in vitro using a conventionally known method. Can be produced. The miRNA-294 may be an analog synthesized so as to mimic an endogenous mature miRNA. Such analogs are available from Ambion, for example. Such miRNA-294 may be single-stranded or double-stranded with a complementary strand.

(miRNA−294の前駆体)
miRNA−294の前駆体としては、例えば、pri−miRNA、pre−miRNAなどが挙げられる。その具体例としては、例えば、マウスについて以下に示すpre−miRNA−294がそれぞれ挙げられる。ここで、図1に、マウスのpre−miRNA−294の模式図を示す。なお、ヒトのpri−miRNA−294やpre−miRNA−294の塩基配列についても、マウスのものに対して高度に保存されていると考えられる。
(Precursor of miRNA-294)
Examples of the precursor of miRNA-294 include pri-miRNA and pre-miRNA. Specific examples thereof include pre-miRNA-294 shown below for mice. Here, FIG. 1 shows a schematic diagram of mouse pre-miRNA-294. In addition, it is considered that the base sequences of human pri-miRNA-294 and pre-miRNA-294 are highly conserved with respect to those of mice.

このようなmiRNA−294の前駆体も、従来公知の手法を用いて、天然物から単離することにより、化学的に合成することにより、あるいはin vivoまたはin vitroで遺伝子工学的に生産させることができる。さらに、miRNA−294の前駆体としては、内在性のmiRNA−294の前駆体を模倣するように合成された、miRNA−294の前駆体の類縁体を同様に用いることもできる。miRNA−294の前駆体は、一本鎖であってもよいし、二本鎖であってもよい。   Such miRNA-294 precursors can also be produced by isolation from natural products, chemical synthesis, or in vivo or in vitro genetic engineering using conventionally known methods. Can do. Furthermore, as the precursor of miRNA-294, an analog of the precursor of miRNA-294 synthesized so as to mimic the precursor of endogenous miRNA-294 can also be used. The precursor of miRNA-294 may be single-stranded or double-stranded.

(miRNA等のDNA構築物)
上述したmiRNA−294またはその前駆体をコードするDNAを転写可能に保持するDNA構築物は、in vivoまたはin vitroでこれらのmiRNA−294またはその前駆体を転写可能にコードしたDNAコンストラクトである。たとえば、in vitroでmiRNA−294またはその前駆体を転写可能なコンストラクトは、ウイルスプロモーターの制御下にmiRNA−294またはその前駆体をコードするDNAを連結したベクターが挙げられる。また、in vivoでmiRNA−294またはその前駆体を転写可能なコンストラクトは、哺乳類細胞で有効なプロモーターの制御下にmiRNA−294またはその前駆体をコードするDNAを連結したベクターが挙げられる。このようなin vivoまたはin vitro転写用のベクターは商業的に入手が可能であり、そのプロトコールに従い、miRNA−294またはその前駆体の塩基配列に基づけば、容易にかかるベクターを構築できる。
(DNA constructs such as miRNA)
The above-described DNA construct capable of transcribing miRNA-294 or its precursor-encoding DNA is a DNA construct encoding such miRNA-294 or its precursor in a transcribable manner in vivo or in vitro. For example, a construct capable of transcribing miRNA-294 or a precursor thereof in vitro includes a vector in which a DNA encoding miRNA-294 or a precursor thereof is linked under the control of a viral promoter. Examples of the construct capable of transcribing miRNA-294 or a precursor thereof in vivo include a vector in which a DNA encoding miRNA-294 or a precursor thereof is linked under the control of a promoter effective in mammalian cells. Such vectors for in vivo or in vitro transcription are commercially available, and such vectors can be easily constructed based on the base sequence of miRNA-294 or its precursor according to the protocol.

(miRNA−294の阻害剤)
miRNA−294の阻害剤は、miRNA−294の機能を低下させる物質であればよく、その具体的な形態について特に制限はない。このような阻害剤としては、例えば、miRNA−294またはその前駆体のガイド鎖の少なくとも一部の相補鎖である第1のRNA鎖(いわゆる「アンチセンスmiRNA」)が挙げられる。この第1のRNA鎖における相補鎖は、必ずしもmiRNA−294またはその前駆体の全体の相補鎖である必要はなく、その機能を低下させる作用を有する限り、その一部の相補鎖であってもよい。また、完全な相補鎖である必要はなく、miRNA−294やその前駆体の機能を低下させる作用を有する限り、不完全な相補鎖であってもよい。
(Inhibitor of miRNA-294)
The inhibitor of miRNA-294 may be any substance that reduces the function of miRNA-294, and its specific form is not particularly limited. Examples of such an inhibitor include a first RNA strand (so-called “antisense miRNA”) which is a complementary strand of at least a part of the guide strand of miRNA-294 or a precursor thereof. The complementary strand in this first RNA strand does not necessarily have to be the entire complementary strand of miRNA-294 or its precursor, and may be a partial complementary strand as long as it has an action of reducing its function. Good. Moreover, it is not necessary to be a complete complementary strand, and an incomplete complementary strand may be used as long as it has an action of reducing the functions of miRNA-294 and its precursor.

第1のRNA鎖は、内在性のmiRNA−294またはその前駆体におけるガイド鎖に対するパッセンジャー鎖と比較して相補性が高められているものであることが好ましい。すなわち、内在性のmiRNA−294において、ガイド鎖とパッセンジャー鎖との間に、ミスマッチが存在する場合、そのようなミスマッチの個数が第1のRNA鎖において低減されていることが好ましい。ミスマッチをどの程度低減すればよいかは特に限定されないが、第1のRNA鎖が阻害剤として機能する限り、すべてのミスマッチを解消する必要はなく、当該ミスマッチの一部のみが解消されているものであってもよい。阻害剤としての相補鎖において解消されるミスマッチの箇所(内在性miRNA−294のガイド鎖における位置)は特に限定されないが、3’末端側にあるミスマッチが解消されているものが、阻害剤としては好ましい。   The first RNA strand is preferably one that has increased complementarity compared to the passenger strand for the guide strand in endogenous miRNA-294 or its precursor. That is, in the case of endogenous miRNA-294, when there is a mismatch between the guide strand and the passenger strand, the number of such mismatches is preferably reduced in the first RNA strand. How much the mismatch should be reduced is not particularly limited, but as long as the first RNA strand functions as an inhibitor, it is not necessary to eliminate all mismatches, and only a part of the mismatches are eliminated It may be. The position of the mismatch (position in the guide strand of endogenous miRNA-294) that is eliminated in the complementary strand as an inhibitor is not particularly limited, but the inhibitor that has been eliminated in the mismatch at the 3 ′ end side is an inhibitor. preferable.

miRNA−294の阻害剤は、第1のRNA鎖とmiRNA−294またはその前駆体のガイド鎖である第2のRNA鎖とを備えていてもよい。こうした二本鎖状態であっても阻害剤として有効である。   The inhibitor of miRNA-294 may comprise a first RNA strand and a second RNA strand that is a guide strand of miRNA-294 or a precursor thereof. Even in such a double-stranded state, it is effective as an inhibitor.

上述した第1のRNA鎖および第2のRNA鎖は、化学合成により、または遺伝子工学的に製造できるほか、Ambion社等から商業的に入手することも可能である。第1のRNA鎖および第2のRNA鎖には、細胞内等における安定性を確保する観点から、その塩基、糖等において適宜修飾が施されていてもよい。例えば、miRNA−294またはその前駆体とより強固に二本鎖を形成し、より効果的にmiRNA−294またはその前駆体の機能を阻害する(低下させる)ことができる点で、例えば、PNA(ペプチド核酸)やLNA(Locked Nucleic Acid)等の修飾を有したものであることが好ましい。前記LNA(Locked Nucleic Acid)等の修飾を有する相補鎖としては、例えば、miRCURY Knockdown Probes(Exiqon社)などを利用することができる(例えば、Biomedecine & Pharmacotherapy, Volume 60, Issue 9, November 2006, Pages 633-638参照)。また、相補鎖としては、細胞内で分解されることを阻止してより安定に存在することができ、例えば、2’−O−メチル等の修飾を有したものであることも好ましい(例えば、Nucleic Acids Research, 2003, Vol. 31, No. 11, 2705-2716参照)。   The first RNA strand and the second RNA strand described above can be produced by chemical synthesis or genetic engineering, and can also be obtained commercially from Ambion or the like. The first RNA strand and the second RNA strand may be appropriately modified in their bases, sugars, etc. from the viewpoint of ensuring stability in the cell or the like. For example, PNA (for example) is a point which can form a duplex more strongly with miRNA-294 or its precursor, and can inhibit (reduce) the function of miRNA-294 or its precursor more effectively. Peptide nucleic acid and LNA (Locked Nucleic Acid) are preferred. As a complementary strand having a modification such as LNA (Locked Nucleic Acid), for example, miRCURY Knockdown Probes (Exiqon) can be used (for example, Biomedecine & Pharmacotherapy, Volume 60, Issue 9, November 2006, Pages). 633-638). In addition, the complementary strand can be present more stably by preventing degradation in the cell, and preferably has a modification such as 2′-O-methyl (for example, Nucleic Acids Research, 2003, Vol. 31, No. 11, 2705-2716).

阻害剤としては、miRNA−294またはその前駆体に対する第1のRNA鎖をコードするDNA、あるいは、第1のRNA鎖および第2のRNA鎖をコードするDNAを転写可能に保持するDNA構築物であってもよい。かかるDNA構築物は、in vivoまたはin vitro転写用のベクターを用いることで容易に得ることができる。   The inhibitor may be a DNA construct encoding the first RNA strand against miRNA-294 or a precursor thereof, or a DNA construct that holds the DNA encoding the first RNA strand and the second RNA strand in a transcribable manner. May be. Such a DNA construct can be easily obtained by using a vector for in vivo or in vitro transcription.

本明細書に開示の分化調節剤の有効成分は、目的に応じて選択される。すなわち、分化調節剤を、間葉系細胞の分化を促進する目的で利用する場合、miRNA−294、その前駆体およびこれらをコードするDNA構築物からなる群から選択される1種または2種以上を有効成分として含有させることができる。また、分化調節剤を間葉系細胞の分化を抑制する目的で利用する場合、上述したmiRNA−294の阻害剤を有効成分として含有させることができる。有効成分は、同一の目的に寄与する有効成分を1種単独で使用してもよいし、2種以上を併用してもよい。また、間葉系細胞の分化調節剤中の有効成分の含有量について特に制限はなく、目的に応じて適宜設定することができる。   The active ingredient of the differentiation regulator disclosed in the present specification is selected according to the purpose. That is, when a differentiation regulator is used for the purpose of promoting the differentiation of mesenchymal cells, one or more selected from the group consisting of miRNA-294, a precursor thereof, and a DNA construct encoding them are used. It can be contained as an active ingredient. Moreover, when using a differentiation regulator for the purpose of suppressing the differentiation of mesenchymal cells, the above-described inhibitor of miRNA-294 can be contained as an active ingredient. As the active ingredient, one active ingredient contributing to the same purpose may be used alone, or two or more active ingredients may be used in combination. Moreover, there is no restriction | limiting in particular about content of the active ingredient in the differentiation regulator of a mesenchymal cell, According to the objective, it can set suitably.

本明細書に開示の分化調節剤は、上記の有効成分のみを含有していてもよいが、必要に応じてそのほかの成分を含むことができる。その他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。例えば、上記の有効成分を所望の濃度に希釈等するための、水、各種緩衝液などが挙げられる。また、前記その他の成分としては、間葉系細胞への分化を抑制または促進したい細胞(対象細胞;例えば、骨芽細胞等の間葉系幹細胞)に有効成分を導入するための、導入用試薬なども挙げられる。前記導入用試薬としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、Lipofectamine 2000(Invitrogen社)などが挙げられる。   The differentiation regulator disclosed in the present specification may contain only the above-mentioned active ingredient, but may contain other ingredients as necessary. There is no restriction | limiting in particular as another component, According to the objective, it can select suitably. Examples thereof include water and various buffer solutions for diluting the above active ingredient to a desired concentration. In addition, as the other component, a reagent for introduction for introducing an active ingredient into a cell (target cell; for example, mesenchymal stem cell such as osteoblast) that wants to suppress or promote differentiation into mesenchymal cells And so on. The introduction reagent is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include Lipofectamine 2000 (Invitrogen).

本明細書に開示の分化調節剤は、間葉系幹細胞または間葉系前駆細胞等の間葉系細胞への分化を促進または抑制することができる。したがって、当該分化調節剤は、間葉系細胞への分化に関連する疾患を予防または治療するための医薬として用いられうる。また、間葉系細胞への分化に関連する研究試薬や医薬の評価並びにスクリーニングにも好ましく用いられうる。   The differentiation regulator disclosed in the present specification can promote or suppress differentiation into mesenchymal cells such as mesenchymal stem cells or mesenchymal progenitor cells. Therefore, the differentiation regulator can be used as a medicament for preventing or treating a disease associated with differentiation into mesenchymal cells. Moreover, it can be preferably used for evaluation and screening of research reagents and drugs related to differentiation into mesenchymal cells.

≪間葉系細胞の分化異常に起因する疾患を予防または治療するための医薬≫
本明細書に開示の医薬は、間葉系細胞の分化異常に起因する疾患を予防または治療するための医薬であって、上述した分化調節剤を有効成分として含むものである。この際、分化調節剤としては、本明細書に既に開示した各種の分化調節剤から、医薬が対象とする疾患の種類に応じて選択される。本明細書に開示の医薬が間葉系細胞の分化の障害に起因する疾患であるときには、miRNA−294、その前駆体およびこれらをコードするDNA構築物からなる群から選択される1種または2種以上が医薬の有効成分として用いられうる。一方、本明細書に開示の医薬が間葉系細胞の分化過剰に起因する疾患であるときには、上述したmiRNA−294の阻害剤が医薬の有効成分として用いられうる。
≪Pharmaceuticals for preventing or treating diseases caused by abnormal differentiation of mesenchymal cells≫
The medicament disclosed in the present specification is a medicament for preventing or treating a disease caused by abnormal differentiation of mesenchymal cells, and contains the above-described differentiation regulator as an active ingredient. At this time, the differentiation regulator is selected from the various differentiation regulators already disclosed in the present specification according to the type of disease targeted by the medicine. When the medicament disclosed in the present specification is a disease caused by impaired differentiation of mesenchymal cells, one or two selected from the group consisting of miRNA-294, a precursor thereof, and a DNA construct encoding them The above can be used as an active ingredient of a medicine. On the other hand, when the medicament disclosed in the present specification is a disease caused by excessive differentiation of mesenchymal cells, the aforementioned miRNA-294 inhibitor can be used as an active ingredient of the medicament.

本明細書に開示の医薬における分化調節剤の含有量について特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。また、本明細書に開示の医薬は、有効成分のみからなっていてもよいが、必要に応じてそのほかの成分を含むことができる。その他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。典型的には、薬学上許容されうる担体などが挙げられる。前記担体としても特に制限はなく、例えば、医薬の剤型等に応じて適宜選択することができる。また、医薬中のその他の成分の含有量としても特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。   There is no restriction | limiting in particular about content of the differentiation regulator in the pharmaceutical disclosed by this specification, According to the objective, it can select suitably. Moreover, the medicament disclosed in the present specification may be composed of only active ingredients, but may contain other ingredients as necessary. There is no restriction | limiting in particular as another component, According to the objective, it can select suitably. Typically, a pharmaceutically acceptable carrier and the like can be mentioned. There is no restriction | limiting in particular as said carrier, For example, it can select suitably according to a pharmaceutical dosage form etc. Moreover, there is no restriction | limiting in particular as content of the other component in a pharmaceutical, According to the objective, it can select suitably.

本明細書に開示の医薬は、従来公知の各種の製剤形態を採ることができる。後述するような所望の投与方法に応じて適宜選択することができ、例えば、経口固形剤(錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等)、経口液剤(内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤等)、注射剤(溶液、懸濁液、用時溶解用固形剤等)、軟膏剤、貼付剤、ゲル剤、クリーム剤、外用散剤、スプレー剤、吸入散剤などが挙げられる。こうした各種製剤において適宜必要とされる添加剤は、当業者において周知であり、当業者であれば目的に応じて種々の製剤を製造することができる。   The medicament disclosed in the present specification can take various conventionally known preparation forms. It can be appropriately selected according to the desired administration method as will be described later. For example, oral solid preparations (tablets, coated tablets, granules, powders, capsules, etc.), oral liquid preparations (internal solutions, syrups, elixirs) Etc.), injections (solutions, suspensions, solid agents for dissolution at the time of use), ointments, patches, gels, creams, powders for external use, sprays, inhaled powders and the like. Additives that are appropriately required in these various preparations are well known to those skilled in the art, and those skilled in the art can produce various preparations according to the purpose.

本明細書に開示の医薬は、好ましくは、投与対象または投与対象から採取された細胞を含む組織に対して、細胞内への医薬のトランスフェクションに適した製剤形態を採る。例えば、適用部位に応じた注射製剤(皮下注射、静脈注射、筋肉注射、骨髄注射、歯髄注射、腹腔内注射等)の形態をとることができる。注射剤は、例えば、有効成分のほか、pH調節剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤、局所麻酔剤等を添加し、常法により皮下用、筋肉内用、静脈内用等の注射剤を製造することができる。なお、pH調節剤および緩衝剤としては、例えば、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウムなどが挙げられる。安定化剤としては、例えば、ピロ亜硫酸ナトリウム、EDTA、チオグリコール酸、チオ乳酸などが挙げられる。等張化剤としては、例えば、塩化ナトリウム、ブドウ糖などが挙げられる記局所麻酔剤としては、例えば、塩酸プロカイン、塩酸リドカインなどが挙げられる。   The medicament disclosed in the present specification preferably takes a dosage form suitable for transfection of a medicament into a cell with respect to an administration subject or a tissue containing cells collected from the administration subject. For example, it can take the form of an injection preparation (subcutaneous injection, intravenous injection, intramuscular injection, bone marrow injection, dental pulp injection, intraperitoneal injection, etc.) according to the application site. Injections include, for example, active ingredients, pH regulators, buffers, stabilizers, isotonic agents, local anesthetics, etc., and are used for subcutaneous, intramuscular, intravenous, etc. by conventional methods. An injection can be produced. Examples of the pH adjuster and buffer include sodium citrate, sodium acetate, sodium phosphate and the like. Examples of the stabilizer include sodium pyrosulfite, EDTA, thioglycolic acid, thiolactic acid and the like. Examples of the isotonic agent include sodium chloride and glucose. Examples of the local anesthetic include procaine hydrochloride and lidocaine hydrochloride.

本明細書に開示の医薬の投与方法は特に限定されないが、医薬の剤型に応じて適宜選択される。上記のとおり、本明細書に開示の医薬は、例えば、有効成分を、患者における細胞や組織に対して導入することにより投与することができる。なお、細胞や組織は、間葉系幹細胞や間葉系前駆細胞が存在する箇所であることが好ましい。例えば、骨芽細胞への分化異常に起因する疾患においては、骨芽細胞への幹細胞や前駆細胞が存在する箇所、典型的には骨髄等を投与対象とすることが好ましい。   The administration method of the medicine disclosed in the present specification is not particularly limited, but is appropriately selected according to the dosage form of the medicine. As described above, the medicament disclosed in the present specification can be administered, for example, by introducing an active ingredient into cells or tissues in a patient. The cells and tissues are preferably locations where mesenchymal stem cells and mesenchymal progenitor cells are present. For example, in a disease caused by abnormal differentiation into osteoblasts, it is preferable to administer a site where stem cells or progenitor cells to osteoblasts are present, typically bone marrow.

また、患者等から採取した間葉系幹細胞や間葉系前駆細胞またはこれらを含む組織に導入し、その細胞を患者に移植することにより投与することができる。導入方法について特に制限はなく、例えば、従来公知のリポフェクションやエレクトロポレーション等の方法を適宜選択して利用することができる。患者の生体外でトランスフェクションを行った細胞を患者に移植する方法としても特に制限なく、例えば、従来公知の細胞移植方法が適宜利用されうる。例えば、体外でリポソームやその他のナノ粒子に包埋して全身投与、または局所投与すればよい。   In addition, it can be administered by introducing it into mesenchymal stem cells or mesenchymal progenitor cells collected from a patient or the like or a tissue containing these cells and transplanting the cells into the patient. The introduction method is not particularly limited, and for example, a conventionally known method such as lipofection or electroporation can be appropriately selected and used. There is no particular limitation on the method for transplanting the cells transfected in vitro to the patient, and for example, conventionally known cell transplantation methods can be appropriately used. For example, systemic administration or local administration may be performed by embedding in liposomes or other nanoparticles outside the body.

なお、本明細書に開示の医薬の投与量としては、特に制限はなく、投与対象である患者の年齢、体重、所望の効果の程度等に応じて適宜選択することができる。また、その投与回数としては、特に制限はなく、投与対象である患者の年齢、体重、所望の効果の程度等に応じて適宜選択することができる。さらに、その投与時期としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、間葉系細胞の分化異常(抑制や過剰)に起因する疾患に対して、予防的に投与されてもよいし、治療的に投与されてもよい。本明細書に開示の医薬の投与対象となる哺乳動物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒトのほか、マウス、ラット、ウシ、ブタ、サル、イヌ、ネコなどの非ヒト哺乳動物が挙げられる。   In addition, there is no restriction | limiting in particular as dosage of the medicine disclosed by this specification, According to the age of a patient who is an administration object, a body weight, the grade of a desired effect, etc., it can select suitably. The number of administrations is not particularly limited, and can be appropriately selected according to the age, weight, desired degree of effect, etc. of the patient to be administered. Furthermore, there is no restriction | limiting in particular as the administration time, According to the objective, it can select suitably, For example, it administers prophylactically with respect to the disease resulting from the differentiation abnormality (suppression or excess) of a mesenchymal cell. May be administered therapeutically. The mammal to be administered with the medicament disclosed in the present specification is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose. For example, in addition to humans, mice, rats, cows, pigs, monkeys, dogs And non-human mammals such as cats.

本明細書に開示の医薬が予防または治療の対象とする疾患は、間葉系細胞の分化異常(抑制や過剰)に起因する疾患である。間葉系細胞の分化抑制(分化不足)に起因する疾患としては、骨芽細胞の分化抑制または分化不足に起因する、骨粗鬆症(閉経後骨粗鬆症、老人性骨粗鬆症、ステロイド治療による骨粗鬆症、糖尿病性骨粗鬆症)、骨形成不全、発達期における成長阻害等が挙げられる。また、間葉系細胞の分化過剰に起因する疾患としては、例えば、骨芽細胞の分化過剰に起因する、骨芽細胞型骨肉腫等が挙げられる。   The disease targeted for prevention or treatment by the medicament disclosed in the present specification is a disease caused by abnormal differentiation (suppression or excess) of mesenchymal cells. Examples of diseases caused by suppression of differentiation (insufficient differentiation) of mesenchymal cells include osteoporosis (postmenopausal osteoporosis, senile osteoporosis, osteoporosis due to steroid treatment, diabetic osteoporosis) caused by suppression of differentiation or insufficient differentiation of osteoblasts. Bone dysplasia, growth inhibition during development, and the like. Examples of the diseases caused by excessive differentiation of mesenchymal cells include osteoblast type osteosarcoma caused by excessive differentiation of osteoblasts.

≪分化調節剤の評価方法および間葉系細胞への分化調節作用を有する物質のスクリーニング方法≫
本明細書の開示によれば、間葉系細胞の分化調節剤の評価方法もまた、提供される。当該評価方法では、miRNA−294の発現および/または機能の増大または低下を指標とすることができる。この評価方法によれば、間葉系細胞の分化を調節(促進または抑制)できる分化調節剤を得ることができる。
≪Method for evaluating differentiation regulator and screening method for substances having differentiation regulating action on mesenchymal cells≫
According to the disclosure of the present specification, a method for evaluating a differentiation regulator of mesenchymal cells is also provided. In the evaluation method, an increase or decrease in the expression and / or function of miRNA-294 can be used as an index. According to this evaluation method, a differentiation regulator capable of regulating (promoting or inhibiting) the differentiation of mesenchymal cells can be obtained.

上記評価方法は、典型的には、miRNA−294を発現している間葉系幹細胞もしくは間葉系前駆細胞または非ヒト動物に対して被験物質を供給する工程(供給工程)と、前記間葉系幹細胞もしくは間葉系前駆細胞または非ヒト動物におけるmiRNA−294の発現または機能を、前記被験物質の非供給時におけるmiRNA−294の発現または機能と対比し、その対比結果に基づいて、前記被験物質の間葉系細胞への分化促進作用または分化抑制作用を評価する工程(評価工程)とを有する。当該評価方法は、上述した「評価する工程」の後に、間葉系幹細胞の分化を促進または抑制する被験物質を選択する工程を備えることができる。言い換えれば、上記評価方法は、間葉系細胞への分化調節作用を有する物質のスクリーニング方法であるとも言える。   The evaluation method typically includes a step of supplying a test substance to a mesenchymal stem cell or a mesenchymal progenitor cell or a non-human animal expressing miRNA-294 (a supply step), and the mesenchyme The expression or function of miRNA-294 in a stem cell or mesenchymal progenitor cell or a non-human animal is compared with the expression or function of miRNA-294 when the test substance is not supplied, and the test is performed based on the comparison result. And a step (evaluation step) for evaluating differentiation promoting action or differentiation inhibiting action on mesenchymal cells of the substance. The evaluation method may include a step of selecting a test substance that promotes or suppresses differentiation of mesenchymal stem cells after the above-described “evaluating step”. In other words, it can be said that the evaluation method is a screening method for a substance having an action of regulating differentiation into mesenchymal cells.

被験物質としては、例えばタンパク質、ペプチド、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが挙げられ、これらの物質は新規なものであってもよいし、公知のものであってもよい。   Examples of the test substance include proteins, peptides, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, and the like. It may be a well-known one.

上記した供給工程には、既に説明したように、本明細書に開示の分化調節剤や医薬を細胞または患者等に投与する際に用いられる従来公知のトランスフェクトの方法が採用されうる。   As described above, a conventionally known transfection method used when administering the differentiation regulator or medicine disclosed in the present specification to cells or patients can be adopted for the above-described supplying step.

上記した評価工程では、間葉系幹細胞もしくは間葉系前駆細胞または非ヒト動物におけるmiRNA−294の発現または機能を、前記被験物質の非供給時におけるmiRNA−294の発現または機能と対比し、その対比結果に基づいて、前記被験物質の間葉系細胞への分化促進作用または分化抑制作用を評価する。評価の具体的な方法については特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。例えば、被験物質の存在下(供給時)および非存在下(非供給時)での内在性miRNA−294の発現量を測定し、発現の評価指標とすることができる。また、骨芽細胞に対する間葉系幹細胞や間葉系前駆細胞を細胞として用いる場合には、アルカリフォスファターゼの活性等の各種の骨芽細胞への分化指標を評価指標として用いることもできる。   In the evaluation step described above, the expression or function of miRNA-294 in a mesenchymal stem cell or mesenchymal progenitor cell or a non-human animal is compared with the expression or function of miRNA-294 when the test substance is not supplied. Based on the comparison result, the differentiation promoting action or differentiation inhibiting action on mesenchymal cells of the test substance is evaluated. There is no restriction | limiting in particular about the specific method of evaluation, According to the objective, it can select suitably. For example, the expression level of endogenous miRNA-294 in the presence (at the time of supply) and absence (at the time of non-supply) of the test substance can be measured and used as an evaluation index for expression. In addition, when mesenchymal stem cells or mesenchymal progenitor cells for osteoblasts are used as cells, differentiation indexes to various osteoblasts such as alkaline phosphatase activity can also be used as evaluation indexes.

評価工程では、例えば、被験物質の非存在下(非供給時)と比べて、被験物質の存在下(供給時)においてmiRNA−294等の発現量等が増大するときには、当該被験物質が内在性miRNA−294の作用を増大させると評価することができる。すなわち、被験物質は、間葉系細胞への分化を促進する作用を有する物質であると評価できる。一方、被験物質の存在下においてmiRNA−294等の発現量等が低下するときには、当該被験物質は、内在性miRNA−294の作用を低下させると評価することができる。すなわち、被験物質は、間葉系細胞への分化を抑制する作用を有する物質であと評価できる。   In the evaluation step, for example, when the expression level of miRNA-294 or the like increases in the presence of the test substance (during supply) compared to the absence of the test substance (during supply), the test substance is endogenous. It can be evaluated that the action of miRNA-294 is increased. That is, the test substance can be evaluated as a substance having an action of promoting differentiation into mesenchymal cells. On the other hand, when the expression level of miRNA-294 or the like decreases in the presence of the test substance, it can be evaluated that the test substance decreases the action of endogenous miRNA-294. That is, the test substance can be evaluated as a substance having an action of suppressing differentiation into mesenchymal cells.

なお、以上の供給工程または評価工程のいずれかあるいはこれらの工程の間において、適宜、間葉系幹細胞や間葉系前駆細胞の間葉系細胞への分化を誘導する処理を施しておいてもよい。分化誘導処理としては、例えば、骨芽細胞への誘導処理には、BMP−2等を用いることができる。かかる分化誘導処理下で被験物質の作用を評価することで、一層明確に被験物質の分化抑制能や分化促進能を検出することができる。   In addition, any of the above supply steps or evaluation steps, or between these steps, may be appropriately subjected to a treatment for inducing differentiation into mesenchymal cells of mesenchymal stem cells or mesenchymal progenitor cells. Good. As the differentiation induction process, for example, BMP-2 or the like can be used for the induction process to osteoblasts. By evaluating the action of the test substance under such differentiation induction treatment, it is possible to more clearly detect the differentiation inhibiting ability and differentiation promoting ability of the test substance.

また、上述したように、本発明に係る評価方法(スクリーニング方法)は、上述した評価工程の後に、間葉系幹細胞の分化を促進または抑制する被験物質を選択する工程(選択工程)を備えることができる。選択工程は、間葉系細胞への分化を促進または抑制する作用を有する物質であると評価された被験物質を間葉系細胞への分化調節剤として選択する工程である。選択された被験物質は、本明細書に開示の分化調節剤および医薬の有効成分として、またはその候補として、有用である。   Moreover, as described above, the evaluation method (screening method) according to the present invention includes a step (selection step) of selecting a test substance that promotes or suppresses differentiation of mesenchymal stem cells after the above-described evaluation step. Can do. The selection step is a step of selecting a test substance evaluated as a substance having an action of promoting or suppressing differentiation into mesenchymal cells as a regulator of differentiation into mesenchymal cells. The selected test substance is useful as, or as a candidate for, the active ingredient of the differentiation regulators and medicaments disclosed herein.

以下、本発明の実施例を説明するが、本発明は、これらの実施例に何ら限定されるものではない。   Examples of the present invention will be described below, but the present invention is not limited to these examples.

[実施例1:miRNA-294導入MC3T3-E1細胞におけるBMP-2誘導骨芽細胞分化への影響]
以下の手法により、BMP-2で誘導されたマウスMC3T3-E1細胞(頭蓋骨由来前駆骨芽細胞)の骨芽細胞への分化にmiRNA-294の導入が及ぼす影響を調べた。なお、マウスMC3T3-E1細胞は、間葉系幹細胞の1種である。
[Example 1: Effect on BMP-2-induced osteoblast differentiation in miRNA-294-introduced MC3T3-E1 cells]
The effect of miRNA-294 introduction on the differentiation of BMC-2 induced mouse MC3T3-E1 cells (skull-derived progenitor osteoblasts) into osteoblasts was examined by the following procedure. Mouse MC3T3-E1 cells are one type of mesenchymal stem cells.

具体的には、マウス内在性miRNA分子を模倣するように合成されたmiRNA-294、そのアンチセンス阻害剤であるAnti-miRNA-294、および、miRNA-Negative Control(いずれも、アプライドバイオサイエンス社製)を、それぞれLipofectamime(登録商標)RNAiMAX(Invitrogen社製)を用いたリポフェクション法により、MC3T3-E1細胞に終濃度が40nMとなるように導入した。   Specifically, miRNA-294 synthesized to mimic mouse endogenous miRNA molecules, its antisense inhibitor Anti-miRNA-294, and miRNA-Negative Control (all from Applied Biosciences) ) Were introduced into MC3T3-E1 cells to a final concentration of 40 nM by the lipofection method using Lipofectamime (registered trademark) RNAiMAX (manufactured by Invitrogen).

次いで、上述した各導入細胞と何も導入していないコントロール細胞(BMP-2添加あり、なし)のそれぞれを、OPTI-MEM無血清培地(Invitrogen社製)で18時間培養後、MEM-α(10%FBS,100U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン含有)に培地交換後72時間培養した。その後、96ウェルマルチプレートに1×105細胞/mlに調整した細胞を500μl/ウェルずつ播種し、播種3時間後にBMP-2(ベクトンディッキンソン社製)を終濃度が200ng/mlとなるように加えて分化を誘導し、72時間培養した。 Subsequently, each of the introduced cells described above and a control cell into which nothing has been introduced (with or without BMP-2 added) were cultured in an OPTI-MEM serum-free medium (Invitrogen) for 18 hours, and then MEM-α ( 10% FBS, 100 U / ml penicillin, containing 100 μg / ml streptomycin), and cultured for 72 hours after the medium was changed. Thereafter, cells adjusted to 1 × 10 5 cells / ml are seeded in a 96-well multiplate at 500 μl / well, and BMP-2 (Becton Dickinson) is added to a final concentration of 200 ng / ml 3 hours after seeding. In addition, differentiation was induced and cultured for 72 hours.

その後、PBS(-)により2度洗浄し、エタノールにて細胞固定後、分化指標であるアルカリフォスファターゼ(ALP;Alkaline phosphatase)をTRACP&ALP double-staining Kit (タカラバイオ社製)を用いて染色し、各細胞の分化の程度を評価した。結果を図2に示す。   Thereafter, the cells were washed twice with PBS (−), fixed with ethanol, and stained with alkaline phosphatase (ALP), a differentiation index, using TRACP & ALP double-staining Kit (manufactured by Takara Bio Inc.). The degree of cell differentiation was evaluated. The results are shown in FIG.

図2に示すように、BMP-2を添加するとMC3T3-E1細胞の骨芽細胞への分化が誘導されるが、miRNA-294を導入すると、BMP-2により誘導されたMC3T3-E1細胞の骨芽細胞への分化がよりいっそう増強されることが確認された。一方、miRNA-294のアンチセンス阻害剤であるAnti-miRNA-294を導入すると、BMP-2により誘導されたMC3T3-E1細胞の骨芽細胞への分化が減弱することが確認された。なお、miRNA-Negative Controlを導入しても、BMP-2により誘導されたMC3T3-E1細胞の骨芽細胞への分化に影響はなかった。   As shown in FIG. 2, when BMP-2 is added, differentiation of MC3T3-E1 cells into osteoblasts is induced, but when miRNA-294 is introduced, bones of MC3T3-E1 cells induced by BMP-2 are induced. It was confirmed that differentiation into blast cells was further enhanced. On the other hand, when anti-miRNA-294, an antisense inhibitor of miRNA-294, was introduced, it was confirmed that differentiation of MC3T3-E1 cells induced by BMP-2 into osteoblasts was attenuated. Introducing miRNA-Negative Control did not affect the differentiation of MC3T3-E1 cells induced by BMP-2 into osteoblasts.

以上のことから、miRNA-294は間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化を促進する作用を有することが示された。また、Anti-miRNA-294は間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化を抑制する作用を有することが示された。   From the above, it was shown that miRNA-294 has an action of promoting the differentiation of mesenchymal stem cells into osteoblasts. It was also shown that Anti-miRNA-294 has an action of suppressing the differentiation of mesenchymal stem cells into osteoblasts.

[実施例2:miRNA-294導入MC3T3-E1細胞のBMP-2誘導有無による分化への影響]
BMP-2を添加しなかったこと以外は、上述した実施例1と同様の手法により、マウスMC3T3-E1細胞の骨芽細胞への分化にmiRNA-294の導入が及ぼす影響を調べた。その結果を、BMP-2を添加した場合と比較して図3に示す。なお、図3において、「BMP-2(-)」はBMP-2を添加しなかった群の結果を示し、「BMP-2(+)」はBMP-2を添加した群の結果を示す。
[Example 2: Effect of differentiation on presence or absence of BMP-2 induction in miRNA-294-introduced MC3T3-E1 cells]
Except that BMP-2 was not added, the effect of miRNA-294 introduction on the differentiation of mouse MC3T3-E1 cells into osteoblasts was examined by the same method as in Example 1 described above. The results are shown in FIG. 3 in comparison with the case where BMP-2 was added. In FIG. 3, “BMP-2 (−)” indicates the result of the group to which BMP-2 was not added, and “BMP-2 (+)” indicates the result of the group to which BMP-2 was added.

図3の「BMP-2(+)」に示すように、BMP-2を添加するとMC3T3-E1細胞の分化は誘導され、miRNA-294を導入したMC3T3-E1細胞ではさらにその分化能が著しく高まった(上述した実施例1の確認)。一方、図3の「BMP-2(-)」に示すように、BMP-2を添加しなくても(予め分化を誘導しなくても)、miRNA-294を導入したMC3T3-E1細胞では、その分化能が上昇した。   As shown in “BMP-2 (+)” in FIG. 3, differentiation of MC3T3-E1 cells is induced by the addition of BMP-2, and the differentiation potential of MC3T3-E1 cells introduced with miRNA-294 is further enhanced. (Confirmation of Example 1 described above). On the other hand, as shown in “BMP-2 (−)” of FIG. 3, MC3T3-E1 cells into which miRNA-294 has been introduced, without adding BMP-2 (without inducing differentiation), Its differentiation ability increased.

以上のことから、miRNA-294は単独で用いられて細胞へ導入されても分化促進作用を示すことが示唆された。   From the above, it was suggested that miRNA-294 exhibits differentiation promoting action even when used alone and introduced into cells.

[実施例3:miRNA-294導入ヒト骨芽細胞株のBMP-2誘導有無による分化への影響]
MC3T3-E1細胞に代えて、ヒト骨芽細胞株であるHFO-SV-40細胞を用いたこと以外は、上述した実施例2と同様の実験を行った。結果を図4に示す。なお、図4において、「BMP-2(-)」はBMP-2を添加しなかった群の結果を示し、「BMP-2(+)」はBMP-2を添加した群の結果を示す。
[Example 3: Effect of differentiation on presence or absence of BMP-2 induction in miRNA-294-introduced human osteoblast cell line]
An experiment similar to Example 2 described above was performed except that HFO-SV-40 cells, which are human osteoblast cell lines, were used instead of MC3T3-E1 cells. The results are shown in FIG. In FIG. 4, “BMP-2 (−)” indicates the result of the group to which BMP-2 was not added, and “BMP-2 (+)” indicates the result of the group to which BMP-2 was added.

図4に示すように、MC3T3-E1細胞を用いた同様の実験(実施例2、図3)よりも作用は弱いものの、miRNA-294はやはり骨芽細胞の分化を促進する作用を示した。   As shown in FIG. 4, miRNA-294 also showed an action of promoting osteoblast differentiation, although the action was weaker than that of the same experiment using MC3T3-E1 cells (Example 2, FIG. 3).

以上のことから、miRNA-294は種を越えても同様に間葉系細胞の分化促進作用を示すことが示唆された。   From the above, it was suggested that miRNA-294 shows the mesenchymal cell differentiation promoting effect even across species.

〔配列番号:1〕
マウスmiRNA−294の成熟配列(ガイド鎖の配列)のRNA配列である。
〔配列番号:2〕
マウスpre−miRNA−294のRNA配列である。
[SEQ ID NO: 1]
It is the RNA sequence of the mature sequence of mouse miRNA-294 (guide strand sequence).
[SEQ ID NO: 2]
It is the RNA sequence of mouse pre-miRNA-294.

Claims (4)

miRNA−294、その前駆体およびこれらをコードするDNA構築物からなる群から選択される1種または2種以上を有効成分として含有し、骨芽細胞の分化を促進する、骨芽細胞の分化調節剤。 miRNA-294, contain one or more members selected from the group consisting of DNA constructs encoding the precursor and these as active ingredients, promotes the differentiation of osteoblasts, osteoblast differentiation-regulating agent . miRNA−294のアンチセンス阻害剤を有効成分として含有し、骨芽細胞の分化を抑制する、骨芽細胞の分化調節剤。 Antisense inhibitors of miRNA-294 contains as an active ingredient, inhibits the differentiation of osteoblasts, differentiation-regulating agent of osteoblast. 骨粗鬆症、骨形成不全、および発達期における成長阻害からなる群から選択される1種または2種以上の疾患を予防または治療するための医薬であって、請求項1または2に記載の分化調節剤を含む、医薬。 A pharmaceutical agent for preventing or treating one or more diseases selected from the group consisting of osteoporosis, bone dysplasia, and growth inhibition in the developmental stage, wherein the differentiation regulator according to claim 1 or 2 Containing a medicament. miRNA−294を発現している間葉系幹細胞もしくは間葉系前駆細胞または非ヒト動物に対して被験物質を供給する工程と、
前記間葉系幹細胞もしくは間葉系前駆細胞または非ヒト動物におけるmiRNA−294の発現または機能を、前記被験物質の非供給時におけるmiRNA−294の発現または機能と対比し、その対比結果に基づいて、前記被験物質の骨芽細胞への分化促進作用または分化抑制作用を評価する工程と、
を有する、骨芽細胞の分化調節作用を有する物質のスクリーニング方法。
supplying a test substance to a mesenchymal stem cell or mesenchymal progenitor cell or a non-human animal expressing miRNA-294;
The expression or function of miRNA-294 in the mesenchymal stem cell or mesenchymal progenitor cell or non-human animal is compared with the expression or function of miRNA-294 when the test substance is not supplied, and based on the comparison result A step of evaluating the differentiation promoting action or differentiation inhibiting action of the test substance on osteoblasts ,
A screening method for a substance having an osteoblast differentiation-regulating action.
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