JP5847168B2 - 新規インターフェロンアルファ産生骨髄樹状細胞 - Google Patents

Description

本発明は、免疫治療の分野に関し、具体的には、樹状細胞によるインターフェロン（ＩＦ）の産生の分野に関する。本発明は、ＩＦＮアルファ（ＩＦＮ−α）の産生に関与する新規特異的樹状細胞型、およびそのインビトロおよびインビボでの用途に関する。本発明は、新規ＩＦＮ−α産生樹状細胞型に基づく治療応用に関する。本発明はまた、新規特異的樹状細胞型でのＩＦＮ−αの産生を誘発することによって、対象における抗感染応答、特に抗ウイルス応答を誘発することが可能な、２本鎖（ｄｓ）核酸の使用にも関する。本発明はさらに、ＩＦＮ−αを産生するための方法、および／または新規ＩＦＮ−α産生樹状細胞を生成するもしくは得るための方法にも関する。本発明はまた、新規ＩＦＮ−α産生樹状細胞を検出および／またはスクリーニングするための方法にも関する。加えて、本発明は、新規樹状細胞におけるＩＦＮ−αの産生を誘発するためのエクスビボでの方法、およびその用途に関する。

樹状細胞（ＤＣ）は、免疫系の前哨としての機能を果たす、不均一細胞である。この細胞は、異なるＤＣサブセットの間で差次的に発現する、多数の細胞表面、エンドソーム、および細胞質内パターン認識受容体（ＰＲＲ）の発現を介して、病原体およびそれらの産生を認識する（Ｄｉｅｂｏｌｄ ２００９、Ｈｏｃｈｒｅｉｎ ａｎｄ Ｏ’Ｋｅｅｆｆｅ ２００８、Ｌｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１０）。ＰＲＲの差次的発現は、異なるおよび重複する機構を介して病原体を認識する能力を異なるＤＣサブセットに与える。

ＤＣは、２つの主なカテゴリに分類することができる。すなわち、従来のＤＣ（ｃＤＣ）および形質細胞様ＤＣ（ｐＤＣ）である。「古典的な」または「従来の」ＤＣ（ｃＤＣ）という用語は、リンパ系器官常在のＤＣをｐＤＣと対抗させるために近年使用されている。一方で、非リンパ系器官ＤＣは、主に組織ＤＣと呼ばれる。非リンパ系組織ＤＣは、ｐＤＣとも異なり、また、主要な非リンパ系組織ＤＣは、体内移行時にリンパ節中に見られるが、ｃＤＣではなく、ｃＤＣという用語は、リンパ系組織中に存在するか、非リンパ系組織中に存在するかに関わらず、全ての非ｐＤＣを指す。

マウスｃＤＣは、高レベルのＣＤ１１ｃおよびＭＨＣIIの発現によって認識することができる（Ｈｏｃｈｒｅｉｎ ａｎｄ Ｏ’Ｋｅｅｆｆｅ ２００８）。マウスｐＤＣは、Ｉ型インターフェロンの特徴的な高い産生を有し、表現型ＣＤ１１ｃ^ｉｎｔＭＨＣＩＩ^ｌｏＣＤ１１ｂ⁻ＣＤ２０５⁻を有する。

マウスおよびヒトｐＤＣは、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＢ、およびＣＤ６８等の、多数の表面分子を共有する。それらは、細胞内のトール様受容体の類似したパターンも発現する。ＣＤ１１ｂの発現は、ヒトにおけるｃＤＣの２つの異なるサブセットを差別化することが可能である。
ヒトＤＣとマウスＤＣとの間には密接な関係がある（Ｏ’Ｋｅｅｆｆｅ ｅｔ ａｌ．２００３）。表現型ＣＤ１１ｃ^ｌｏＣＤ１１ｂ⁻ＣＤ４５ＲＡ^ｈｉを伴うマウス血液細胞は、形態および機能が、ヒトｐＤＣと極めて類似している。ヒト血液では、刺激に応じて大量のインターフェロンを産生できるＣＤ１１ｃ⁻ＩＬ３Ｒ^＋ＣＤ４５ＲＡ^＋ｐＤＣを見出すことができる。

ｃＤＣは、組織場所および表面表現型に基づいて、さらにいくつかのサブセットに分類することができる。マウスでは、表面マーカーＣＤ４およびＣＤ８^＋が、機能的に異なるＤＣサブセットを判別するための有用なマーカーである。全てのｃＤＣの統一的な機能は、ナイーブＴ細胞を細胞サイクルに誘導する能力である。ｃＤＣが抗原を処理および提示する特別な能力は、ＭＨＣＩおよびＭＨＣＩＩとの関連において、ｃＤＣに「専門的抗原提示細胞」という名称を与えている。ＣＤ８α^＋ｃＤＣは、「交差提示」という付加的な特徴、すなわち、ＭＨＣＩと関連において、外因性抗原を提示する能力を有する（Ｖｉｌｌａｄａｎｇｏｓ ａｎｄ Ｓｃｈｎｏｒｒｅｒ ２００７）。ｃＤＣの機能は、サイトカインおよびケモカインの産生にまでも及ぶ。ＩＬ−１２ｐ７０の高い産生量は、ＣＤ８α^＋ｃＤＣの特徴であり、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１α、およびＭＩＰ−１βを含む、高レベルのケモカインは、ＣＤ８α⁻ｃＤＣによって産生される（Ｈｏｃｈｒｅｉｎ ｅｔ ａｌ．２００１、Ｍａｌｄｏｎａｄｏ−Ｌｏｐｅｚ ｅｔ ａｌ．１９９９、Ｐｒｏｉｅｔｔｏ ｅｔ ａｌ．２００４）。加えて、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２３、ＩＬ−２７、およびＴＮＦ−αは、異なる刺激条件の下で、ｃＤＣによって発現することが報告されている。

一方で、一般にＤＣ「ファミリー」の一部とみなされるｐＤＣは、表面表現型および表面形態を含む、典型的なｃＤＣ特性が不十分であり、また、通常、ナイーブＴ細胞を刺激する能力も不十分である（Ｏ’Ｋｅｅｆｆｅ ｅｔ ａｌ．２００２）。特異的ＰＲＲ刺激物が与えられた場合、それらは、Ｂ細胞またはマクロファージよりも多い、かなりのＴ細胞分裂を誘発することができるが、典型的に、ｃＤＣの分裂のほぼ１０倍程度またはそれよりも少ない（Ｖｉｌｌａｄａｎｇｏｓ ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ ２００８）。ｃＤＣとは異なり、ｐＤＣは、ＭＨＣII分子が活性化されると該分子上に抗原を継続的に提示し、その結果、感染の過程で新しい抗原を提示し続けることができる（Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．２００８）。進行中の感染におけるｐＤＣのこの機能の重要性は、まだ解明されていない。その代わりに、天然インターフェロン産生細胞（ＮＩＰＣ）とも称されるｐＤＣは、ウイルスまたは細菌刺激物およびその擬態に応答してＩ型インターフェロン（ＩＦＮ−Ｉ）を産生することでよく知られている（Ｇｉｌｌｉｅｔ ｅｔ ａｌ．２００８、Ｋａｄｏｗａｋｉ ２００９）。ＤＣ「ファミリー」のメンバーとしてのｐＤＣの分類は、それらが活性化に応じて示す形態学的および表現型的な特徴に基づいている。すなわち、ｐＤＣは、共刺激マーカーおよびＭＨＣ分子を、ｃＤＣに類似したレベルまで上方制御し、それらはすぐにｃＤＣの典型的な星形の形態となる。これらの特徴に基づいて、最初に、このＩＦＮ−Ｉ産生ＤＣのサブセットが、同じ細胞内で生来のＩＦＮ応答および強力なＣＴＬ刺激を兼ね備えた、究極的な抗ウイルス細胞となり得ることが提案された。これまでのところ、こうした大きな期待は、現実のものとなってはいない。ｐＤＣのＩＦＮ−Ｉ応答は顕著であるが、ＣＴＬを誘発するためのその付随能力は、ほとんどの場合において比較的に不十分である。

この１０年で、生来の病原体認識に関する知識には、急激な広がりが見られている。（ＴＬＲ１〜１３の）トール様受容体（ＴＬＲ）ファミリーおよびそれらのリガンドの性質を含む、ますます多くのＰＲＲの発見は、数多くの病原体認識の態様を解明してきている。ＰＲＲの差次的発現を介して、マウスおよびヒトの生来の免疫系の細胞は、どちらも病原性の脂質および炭水化物を認識する能力を有し、注目すべきことに、ＰＲＲは、病原体起源および自己起源のどちらの核酸の認識も可能にするということは、明らかである。

核酸の認識は、４つの異なるＴＬＲを介して、可能である。すなわち、ＴＬＲ３は、ｄｓＲＮＡを認識し、ＴＬＲ７およびＴＬＲ８（マウスにおける遺伝子欠損）は、ｓｓＲＮＡを認識し、ＴＬＲ９は、ｓｓＤＮＡを認識する。核酸のＴＬＲ７、８、および９依存性認識は、細胞エンドソーム内で起こり、アダプター分子ＭｙＤ８８に大きく依存する。非ＴＬＲ依存性核酸認識経路も存在するが、ＴＬＲ媒介性認識経路に比べてあまり明らかになっていない。ＴＬＲおよびＭｙＤ８８非依存性であるＲＮＡ認識は、ＲｉｇＩおよびＭｄａ−５分子を伴う細胞質内に局在化した認識複合体を介して起こり、また、細胞質内のＮｏｄ様受容体を伴うこともできる。ＤＮＡの細胞質内認識、少なくとも、Ｂ−ＤＮＡ（右巻きのＢ型ＤＮＡ）の細胞質内認識は、ＲｉｇＩおよびＭｄａ−５分子に依存しないが、ＴＢＫ−１およびＩＫＫｉを含むシグナリング分子の下流のＲｉｇ経路と共有し、ＤＡＩおよび３´修復エキソヌクレアーゼ１（Ｔｒｅｘ１）等の分子を含むことができる。ｄｓＤＮＡへのＡＩＭ２の結合によって媒介されるインフラマソーム複合体も、細胞質内のｄｓＤＮＡを感知する際に関与する可能性があり、ＩＬ−１βのカスパーゼ−１依存性切断をもたらす。

マウスおよびヒトのｐＤＣは、どちらもＴＬＲ９を介してＤＮＡを認識する。ＴＬＲ９のリソソーム内部のトラフィッキングへの小胞体およびＩＲＦ７の高い構成的発現等の、ＴＬＲ９シグナリング複合体に関与する分子の差次的発現の結果として、ｐＤＣは、前述した任意の他の細胞とは異なり、ＴＬＲ９のライゲーション時に、極めて高レベルのＩＦＮ−Ｉを産生する能力を有する。合成ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）は、ｐＤＣからＩＦＮ−Ｉをトリガーするのに十分であり、実際に、ｐＤＣは、ＣｐＧ−ＯＤＮに対するＩＦＮ−Ｉを産生することが知られている唯一の細胞型である。この記述は、マウスにおける大部分のリンパ系臓器に当てはまる。しかしながら、前述したように、骨髄（ＢＭ）細胞がｐＤＣを枯渇させたとき、ＣｐＧ−ＯＤＮに応答したＩＦＮ−αの産生は存続している（Ｈｏｃｈｒｅｉｎ ｅｔ ａｌ．２００４）。これらのデータは、ＣＤ４５Ｒ^＋ＣＤ４５ＲＡ^＋ｐＤＣ以外の細胞が、ＴＬＲ９媒介性ＩＦＮ−αの産生が可能なことを示唆した。この発見は、ｐＤＣがＴＬＲ９媒介性ライゲーションに応答してＩＦＮ−Ｉを産生する唯一の細胞型である、という現在の定説と矛盾している。この観察の生物学的関連性は、ＣｐＧ−ＯＤＮに対する応答を超えて広がっている。多数のウイルスが、現在、ＴＬＲ９媒介性認識を介して細胞を活性化することがわかっており（Ｈｏｃｈｒｅｉｎ ａｎｄ Ｏ’Ｋｅｅｆｆｅ ２００８）、ＢＭ中の別の細胞型が、高レベルのＩＦＮ−α産生を伴うＴＬＲ９ライゲーションに迅速に応答し得る可能性が残っている。

ＢＭは、造血の発生場所であり、かつおよび生涯にわたる幹細胞の源である。また、血漿細胞および記憶Ｔ細胞、ならびに骨の形態形成に関与する細胞のための退避場所でもある。しかしながら、ウイルスによってしばしば感染する部位であるにもかかわらず、骨髄におけるウイルスおよび他の病原体に対する細胞応答の知識は極めて限られている。ＢＭ移植の出現、および移植の拒絶反応に潜在的に関与する細胞の実体を理解しようという願望によって、ＢＭ内の細胞型を明らかにすることが最も重要である。

ｐＤＣ表現型を共有しないヒトの早期前ｐＤＣもまた、高レベルのＩ型ＩＦＮを産生する能力を有することが報告されている（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．２００４）。これらのインターフェロン産生細胞（ＩＰＣ）は、形質細胞様形態を呈した。ＩＰＣは、ＣＤ１１ｃ⁻でもあり、ＴＬＲ９を強く発現した。論文は、ＣＤ１１ｃ^＋であり、ＴＬＲ３を選好的に発現した、未成熟ＤＣの単離も報告している。ＣＤ１１ｃ^＋未成熟ＤＣは除いて、ＩＰＣは、単純ヘルペスウイルスによる刺激に応じて、高レベルのＩＦＮ−αを産生する可能性がある。Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．２００４で説明されるＣＤ１１ｃ^＋未成熟ＤＣは、単純ヘルペスウイルスに応答して、ＴＬＲ９を発現せず、ＩＦＮ−αをほとんど産生しなかった。したがって、これらの細胞は、高レベルのＩＦＮ−α産生を伴うＴＬＲ９ライゲーションに迅速に応答することができない。

脾臓、胸腺、腸間膜、または皮下リンパ節が、ｐＤＣ特異的抗体および磁気ビーズを使用してｐＤＣを枯渇させたときに、ＣｐＧ−ＯＤＮに応答するＩＦＮ−α活性が消失する。しかしながら、骨髄（ＢＭ）細胞がｐＤＣを枯渇させたときに、ＣｐＧ−ＯＤＮに応答するＩＦＮ―α産生は残る（Ｈｏｃｈｒｅｉｎ ｅｔ ａｌ．２００４）。

上記を踏まえると、当技術分野では、高レベルのＩＦＮ−α産生を伴うＴＬＲ９ライゲーションに迅速に応答することができる、ｐＤＣ以外の細胞型の単離に対する必要性がある。

本出願の発明者らは、病原体起源および自己起源のどちらの核酸にも応答してＩＦＮ−αを産生する、ＢＭ内の非ｐＤＣ細胞型を確認した。これらの細胞は、骨髄インターフェロンＤＣ（ｍｉＤＣ）と称され、エクスビボで単離されたときに、未成熟ｃＤＣの表現型を示す。病原体関連パターン認識受容体（ＰＲＲ）によって認識されるリガンドの類似体に関して、ｍｉＤＣは、ｐＤＣによって細胞１個あたりで産生されるＩＦＮ−αに等しい、膨大な量のＩＦＮ−αを産生する。ｐＤＣとは異なり、ｍｉＤＣは、ＧＭ−ＣＳＦおよびＬＰＳによって活性化されて、成熟ｃＤＣの表現型を得る。ウイルスに感染すると、ｐＤＣと同様に、ｍｉＤＣは、ＩＦＮ−αを産生するが、ｐＤＣとは異なり、感染の前および後にかなり生存する。活性化によって、ｍｉＤＣは、同種異系混合リンパ球反応で、ナイーブＴ細胞を強く刺激する。さらに、ｍｉＤＣは、ナイーブＴ細胞に対するウイルスコードしたタンパク質の強力な提示体である。全体として、本出願の発明者らは、病原体関連ＰＲＲ依存性ＩＦＮ−α産生、ならびに強力なＴ細胞刺激能を保有する、非ｐＤＣ細胞型を提供する最初のものである。故に、本発明は、以下の項目を提供する。
［１］免疫療法剤を調製するための方法であって、（ａ）ＣＤ１１ｂ^−／ｌｏおよびＣＤ１７２^＋（Ｓｉｒｐα）である骨髄由来の非形質細胞様樹状細胞（非ｐＤＣ）を提供するステップと、（ｂ）１つ以上の抗原をステップ（ａ）の非ｐＤＣに負荷するように、該非ｐＤＣをエクスビボで修飾するステップと、を含む、方法。
［２］非ｐＤＣをエクスビボで修飾する前記ステップは、（ｉ）１つ以上の抗原および樹状細胞を培養物中でインキュベートすること、（ｉｉ）樹状細胞による１つ以上の抗原の免疫複合体媒介性の取り込み、（ｉｉｉ）１つ以上の抗原の存在下での細胞の電気穿孔法、（ｉｖ）１つ以上の抗原のウイルス形質導入、ならびに（ｖ）１つ以上の抗原をコードするｍＲＮＡまたはＤＮＡのリポフェクションまたは形質移入、から成る群から選択される、項目［１］に記載の方法。
［３］抗原は、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原、寄生虫抗原、または腫瘍抗原である、項目［１］または［２］に記載の方法。
［４］項目［１］〜［３］のいずれか１項に記載の方法によって得られる免疫療法剤を含み、任意で薬学的に許容される担体または希釈剤をさらに含む、医薬組成物。
［５］項目［１］〜［３］のいずれか１項に記載の方法によって得られる免疫療法剤を含み、任意で薬学的に許容されるアジュバントをさらに含む、ワクチン。
［６］対象における抗原特異的免疫応答を引き出す際に使用するための、項目［１］〜［３］のいずれか１項に記載の方法によって得られる免疫療法剤を含む、調製物。
［７］患者は、感染疾患または癌に罹患している、項目［６］に記載の調製物。
［８］感染疾患は、ウイルス感染、細菌感染、寄生虫感染、または真菌感染である、項目［７］に記載の調製物。
［９］抗原特異的免疫応答は、抗原特異的Ｔ細胞刺激、好ましくは、ナイーブＴ細胞の抗原特異的刺激である、項目［６］〜［８］のいずれか１項に記載の調製物。
［１０］骨髄の感染疾患または骨髄癌に罹患している対象を治療する際に使用するための、ＣＤ１１ｂ^−／ｌｏおよびＣＤ１７２^＋（Ｓｉｒｐα）である非形質細胞様樹状細胞（非ｐＤＣ）におけるＩＦＮ−αの産生を誘導するパターン認識受容体によって認識されるリガンドであって、該ＩＦＮ−α誘導リガンドは、該対象の骨髄に投与されるものである、リガンド。
［１１］感染疾患は、骨髄のウイルス感染、細菌感染、寄生虫感染、または真菌感染、好ましくは、骨髄のウイルス感染である、項目［１０］に記載のリガンド。
［１２］ＣＤ１１ｂ^−／ｌｏおよびＣＤ１７２^＋（Ｓｉｒｐα）である骨髄由来の非形質細胞様樹状細胞（非ｐＤＣ）を、該非ｐＣＤにおけるＩＦＮ−αの産生を誘導するパターン認識受容体によって認識されるリガンドとエクスビボで接触させることを含む、ＣＤ１１ｂ^−／ｌｏおよびＣＤ１７２^＋（Ｓｉｒｐα）である非ｐＤＣの集団において、ＩＦＮ−αの産生を誘導するための方法。
［１３］ＩＦＮ−α産生非形質細胞様樹状細胞（非ｐＤＣｓ）を単離、検出、またはスクリーニングするための、インビトロ方法であって、（ａ）ＣＤ１１ｂ^−／ｌｏおよびＣＤ１７２^＋（Ｓｉｒｐα）である骨髄由来の非ｐＤＣの集団を提供するステップと、（ｂ）該非ｐＣＤにおけるＩＦＮ−αの産生を誘導するパターン認識受容体によって認識されるリガンドで、ステップ（ａ）の細胞集団におけるＩＦＮ−αの産生を刺激または誘導した後に、ＩＦＮ−αの産生を検出するステップと、を含む、方法。
［１４］ＣＤ１１ｂ^−／ｌｏおよびＣＤ１７２^＋（Ｓｉｒｐα）である、ＩＦＮ−α産生骨髄由来の非形質細胞様樹状細胞（非ｐＤＣ）。
［１５］感染疾患または癌に罹患している対象を治療する際に使用するための、項目［１４］に記載の細胞。
［１６］感染疾患は、ウイルス感染、細菌感染、寄生虫感染、または真菌感染、好ましくは、ウイルス感染である、項目［１５］に記載の細胞。
［１７］該細胞は、対象への投与の前に、該細胞におけるＩＦＮ−αの産生を誘導するパターン認識受容体によって認識されるリガンドとエクスビボで接触させられる、項目［１５］または［１６］に記載の細胞。
［１８］パターン認識受容体は、病原体関連パターン認識受容体である、項目［１０］または［１１］のリガンド、項目［１２］もしくは［１３］に記載の方法、または項目［１７］に記載の細胞。
［１９］病原体関連パターン認識受容体は、細胞表面、エンドソーム、および／または細胞質内病原体関連パターン認識受容体である、項目［１８］に記載のリガンド、項目［１８］に記載の方法のいずれか、または項目［１８］に記載の細胞。
［２０］リガンドは、ＴＬＲ３リガンド、ＴＬＲ７リガンド、ＴＬＲ８リガンド、またはＴＬＲ９リガンドである、項目［１９］に記載のリガンド、項目［１９］に記載の方法のいずれか、または項目［１９］に記載の細胞。別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって共通に理解されるものと同じ意味を有する。例示的な方法および材料を下記で説明するが、本明細書で説明される方法および材料と類似する、または均等であるものを、本発明を実践または試験する際に使用することができる。本明細書で言及される全ての刊行物および他の参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。矛盾する場合は、定義を含めて、本明細書が優先される。材料、方法、および実施例は、例示的なものに過ぎず、限定することを意図していない。本発明の他の特徴および利点は、図面、詳細な説明、および特許請求の範囲から明らかになるであろう。

非ｐＤＣ細胞型は、病原体起源および自己起源のどちらの核酸にも応答してＩＦＮ−αを産生する骨髄（ＢＭ）内で確認された。これらの細胞は、骨髄（ｍｙｅｌｏｓ）（ギリシャ語の骨髄（ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ））インターフェロン樹状細胞（ｍｉＤＣ）と称される。本出願の発明者らによって確認された新規細胞型「ｍｉＤＣ」は、エクスビボで単離されたときに、未成熟ｃＤＣの表現型を示す。適切な刺激物、すなわち、病原体関連ＰＲＲ（病原性起源の核酸等）によって認識される病原体起源のリガンドによって、ｍｉＤＣは、ｐＤＣによって細胞１個あたりで産生されるＩＦＮ−αに等しい、膨大な量のＩ型ＩＦＮを産生する。ｍｉＤＣは、それらの表現型の特性によって、ｐＤＣおよび他のｃＤＣと区別することができる。

ＢＭは、一次リンパ器官として十分に確立されているが、血液由来抗原に対して原位置で応答する、Ｂ細胞およびナイーブＴ細胞のための適所も提供する。ＢＭは、したがって、重要な一意の二次リンパ系器官として確立される。また、記憶Ｔ細胞の帰巣および恒常的増殖、ならびに長寿命の血漿細胞のための選択的部位でもある。これらの因子を考慮すると、ＢＭにおいて原位置でリンパ球と相互作用し得る細胞型を理解することが重要である。

新規ＤＣ型は、ＢＭ中で確認された。ｐＤＣの他に、ＢＭの中には、多量のＩＦＮ−αを産生する別のＤＣがあること、すなわち、本出願の発明者らによって確認されたｍｉＤＣがあることが分かった。ｐＤＣと同様に、ｍｉＤＣは、病原体起源および自己起源のどちらの核酸にも応答してＩＦＮ−αを産生する強力な能力を有し、活性化に応じて、ＣＤ８およびＣＤ４５Ｒの発現を得る。しかしながら、これは、２つの細胞型の類似性が終了する場所である。

本発明によって提供されるｍｉＤＣは、ｐＤＣとは異なって、病原体関連ＰＲＲによって認識される病原体起源のリガンドに明確に応答する。ｍｉＤＣは、細胞表面で強く成熟し、そのような刺激物に対して極めて高いレベルのＩＬ−６を産生するが、ｐＤＣは、対応する刺激物に対しては、検出可能なＩＬ−６をほとんど産生しない。ｐＤＣと同様に、ｍｉＤＣは、ＴＬＲ７リガンド（Ｒ８３７等）に応答するが、そのような刺激に対して低レベルのＩＦＮ−αも産生する。ｐＤＣは除いて、ｍｉＤＣは、細胞表面活性化および低いＩＬ−６の産生を伴って、ＴＬＲ２およびＴＬＲ４リガンドにも応答する。ｍｉＤＣはまた、インビトロで、ｐＤＣの表面表現型にはいかなる影響も及ぼさない因子である、ＧＭ−ＣＳＦに応答して成熟する。

ｐＤＣとは際立って対照的に、試験した全ての条件においてｍｉＤＣの生存は高く、２日後で少なくとも６０％であった。ｐＤＣとは対照的に、死んだｍｉＤＣは、Ｂｃｌ２発現によって救出される可能性はない。これは、ｐＤＣの表現型とも対照的であった。高い生存性は、細胞の検出可能な増殖によるものではなかった。ｍｉＤＣは、１〜２回の分裂を受ける能力を有すると考えられるが、これは、ｍｉＤＣがＦＬＤＣの培養物に「スパイクされた」ときにだけしか観察されなかった。

ｍｉＤＣの際立った特徴は、ウイルスでコードした抗原を提示する能力、およびこの抗原に特異的なＴ細胞の増殖を誘導する能力である。ウイルス感染したｍｉＤＣの高い生存性を考慮すると、ｍｉＤＣは、潜在的に長寿命なウイルス抗原ソースであり、かつ骨髄におけるＣＴＬの誘導原である。

いくつかのウイルスは、ＢＭ中で見出されることが知られている。マウスにおける「ＢＭ栄養性」ウイルスの最良の例は、ＬＣＭＶ（リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス）である。マウスにおける急性ＬＣＭＶの感染は、Ｉ型ＩＦＮが媒介する造血前駆細胞の除去の、直接的な結果として、感染１週目の間にＢＭ不全に至る。ＢＭ細胞のＨＳＶ−１およびデング熱ウイルス感染は、造血欠陥に関係していた。加えて、ＨＩＶ患者の造血異常は、少なくとも部分的には、ＢＭ中の造血細胞におけるＨＩＶの複製に起因している。

サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）は、特にＢＭ中の造血前駆細胞を標的とし、免疫抑制された個体において特に懸念される、ヘルペスウイルスである。マウス痘感染症において、ＥＣＴＶ（エクトロメリアウイルス）は、耐性を示すマウス株および感受性のあるマウス株のどちらのＢＭでも見られる。ヒトワクチンの試用においてベクターとして使用される、鶏痘ウイルスＡＬＶＡＣおよびワクシニアを含む、ポックスウイルスの複製は、ＢＭ内で、まだ特徴付けられていないＣＤ３３^＋細胞として感染する。

ＢＭ内のｍｉＤＣ、すなわち、大量のＩＦＮ−Ｉを産生し、かつナイーブＴ細胞を強く刺激する能力を有する細胞の有意性は、この器官の一次および二次リンパ系器官のどちらの役割にも関連する。高レベルのＩＦＮ−Ｉが造血前駆体を除去することができ、後天性貧血症をもたらすか、または前駆体の発達を歪曲させることが証明されているので、ウイルスに応答してｍｉＤＣおよびｐＤＣによって産生されるＩＦＮ−Ｉは、造血に潜在的に影響を与える。ＩＦＮ−Ｉは、アジュバントとしての機能を果たし、ＤＣ、ＣＴＬ、およびＢ細胞の応答を活性化して、増強し、したがって、ＢＭが遭遇した抗原に対して生来および適応性の免疫応答を潜在的に増強する。ｍｉＤＣの場合、ＩＦＮ−Ｉの産生、ならびにＴ細胞を刺激する能力は、Ｔ細胞活性化におけるｍｉＤＣの直接関与を示唆する。これは、ｍｉＤＣが、ＢＭ移植状況において有害になり得る可能性も高め、移植片または宿主由来のＴ細胞を強く刺激する能力を有する。ＴＬＲ９およびＴＬＲ７の刺激に対するｍｉＤＣの応答はまた、ＳＬＥ病理に対する潜在的な寄与として、ｐＤＣとともに、ｍｉＤＣも特徴付ける。ｍｉＤＣの高いＩＬ−６の産生は、ｍｉＤＣがＢＭ血漿細胞の生存に関与し得ることも示唆する（Ｋａｗａｎｏ ｅｔ ａｌ．１９９５）。

本発明によって提供されるｍｉＤＣは、ＢＭからのウイルス排除を助ける潜在能力を有するだけでなく、移植状況において、またはＳＬＥ等の自己免疫状態において有害であり得る性状も伴う、新規細胞型である。ｐＤＣとは異なり、ｍｉＤＣは、ＧＭ−ＣＳＦおよびＬＰＳによって活性化されて、成熟ｃＤＣの表現型を得る。ウイルスに感染すると、ｐＤＣと同様に、ｍｉＤＣは、ＩＦＮ−αを産生するが、ｐＤＣとは異なり、感染の前および後にかなり生存する。活性化によって、ｍｉＤＣは、同種異系混合リンパ球反応で、ナイーブＴ細胞を強く刺激する。さらに、ｍｉＤＣは、ナイーブＴ細胞に対するウイルスコードしたタンパク質の強力な提示体である。したがって、ｍｉＤＣは、ＴＬＲ９依存性のＩＦＮ−αの産生および強力なＴ細胞刺激能を保有する。本発明のｍｉＤＣは、ＴＬＲリガンドによる刺激後に、さらにはウイルスに対しても極めて高い生存率を有し、ｐＤＣ、さらには他のＤＣ亜型とも大きな対照を示す。ｍｉＤＣは、高レベルの抗ウイルスサイトカインＩＦＮ−αを産生し、同時に、Ｔ細胞を強く刺激して増殖させることができる細胞の、最初の例である。

本発明は、ＣＤ１１ｂ^−／ｌｏである、骨髄（ＢＭ）由来の非形質細胞様樹状細胞（非ｐＤＣ）を提供する。これは、本出願の発明者らによって確認された、「ｍｉＤＣ」と称される新規細胞型の最小限の特徴付けである。本発明において、「ｍｉＤＣ」という用語は、ＣＤ１１ｂ^−／ｌｏである、ＢＭ由来の非ｐＤＣとして特徴付けられる細胞型を包含するだけでなく、本明細書で説明される新規細胞型の任意のさらなる特徴付けも包含する。例えば、新規細胞型は、好ましくは、ＣＤ１１ｂ^−／ｌｏおよびＣＤ１７２^＋（Ｓｉｒｐα）である。したがって、種々の実施形態において、本明細書で使用される「ｍｉＤＣ」という用語は、ＣＤ１１ｂ^−／ｌｏおよびＣＤ１７２^＋（Ｓｉｒｐα）である、ＢＭ由来の非ｐＤＣを包含する。故に、「ｍｉＤＣ」という用語は、本明細書で説明される新規細胞型のあらゆる定義を包含し、したがって、本明細書で与えられる新規細胞型の定義に従う新規細胞型の種々の実施形態を包含する。

本明細書で使用される「新規細胞型」という用語は、本出願の発明者らによって確認されたｍｉＤＣに関する。さらに、本明細書で使用される「新規細胞型」という用語は、基本的に、新規細胞型がＢＭ由来の非ｐＤＣであるという定義を含む。したがって、本出願の発明者らによって確認されたｍｉＤＣは、基本的にＢＭ由来の非ｐＤＣである。さらに、新規細胞型は、基本的にＣＤ１１ｂ^−／ｌｏである。

前述したように、新規細胞型は、好ましくは、ＣＤ１１ｂ^−／ｌｏおよびＣＤ１７２^＋（Ｓｉｒｐα）である。故に、本発明によって提供される新規細胞型が基本的にＢＭ由来の非ｐＤＣであるという理解に従って、好ましくは、ＣＤ１１ｂ^−／ｌｏおよびＣＤ１７２^＋（Ｓｉｒｐα）である新規細胞型は、好ましくは、ＣＤ１１ｂ^−／ｌｏおよびＣＤ１７２^＋（Ｓｉｒｐα）である、新規ＢＭ由来の非ｐＤＣである。より好ましくは、新規細胞型は、ＣＤ１１ｂ^−／ｌｏ、ＣＤ１７２^＋（Ｓｉｒｐα）、およびＣＤ４５ＲＡ⁻である。さらにより好ましくは、新規細胞型は、ＣＤ１１ｂ^−／ｌｏ、ＣＤ１７２^＋（Ｓｉｒｐα）、ＣＤ４５ＲＡ⁻、およびＣＤ１１ｃ^＋である。さらにより好ましくは、新規細胞型は、ＣＤ１１ｂ^−／ｌｏ、ＣＤ１７２^＋（Ｓｉｒｐα）、ＣＤ４５ＲＡ⁻、ＣＤ１１ｃ^＋、およびＣＤ２４^ｉｎｔである。

さらなる好ましい実施形態において、新規細胞型は、ＣＤ１１ｂ^−／ｌｏおよびＣＤ４５ＲＡ⁻である。好ましくは、新規細胞型は、ＣＤ１１ｂ^−／ｌｏ、ＣＤ４５ＲＡ⁻、およびＣＤ１１ｃ^＋である。より好ましくは、新規細胞型は、ＣＤ１１ｂ^−／ｌｏ、ＣＤ４５ＲＡ⁻、ＣＤ１１ｃ^＋、およびＣＤ２４^ｉｎｔである。

さらなる好ましい実施形態において、新規細胞型は、ＣＤ１１ｂ^−／ｌｏおよびＣＤ１１ｃ^＋である。より好ましくは、新規細胞型は、ＣＤ１１ｂ^−／ｌｏ、ＣＤ１１ｃ^＋、およびＣＤ２４^ｉｎｔである。

さらなる好ましい実施形態において、新規細胞型は、ＣＤ１１ｂ^−／ｌｏおよびＣＤ２４^ｉｎｔである。より好ましくは、新規細胞型は、ＣＤ１１ｂ^−／ｌｏ、ＣＤ２４^ｉｎｔ、およびＣＤ１７２^＋（Ｓｉｒｐα）である。さらにより好ましくは、新規細胞型は、ＣＤ１１ｂ^−／ｌｏ、ＣＤ２４^ｉｎｔ、ＣＤ１７２^＋（Ｓｉｒｐα）、およびＣＤ４５ＲＡ⁻である。

さらなる好ましい実施形態において、新規細胞型は、ＣＤ１１ｂ^−／ｌｏ、ＣＤ１７２^＋（Ｓｉｒｐα）、およびＣＤ１１ｃ^＋である。より好ましくは、新規細胞型は、ＣＤ１１ｂ^−／ｌｏ、ＣＤ１７２^＋（Ｓｉｒｐα）、ＣＤ１１ｃ^＋、およびＣＤ２４^ｉｎｔである。

さらなる好ましい実施形態において、新規細胞型は、ＣＤ１１ｂ^−／ｌｏ、ＣＤ４５ＲＡ⁻、およびＣＤ２４^ｉｎｔである。

したがって、本発明によって提供されるｍｉＤＣは、細胞表面マーカーであるＣＤ１１ｂ、ＣＤ１７２（Ｓｉｒｐα）、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ１１ｃ、およびＣＤ２４のうちの少なくとも１つを特徴としてもよい。これらの細胞表面マーカーは、本発明によって提供されるｍｉＤＣの構造定義を提供し得、したがって、当技術分野で説明される従来の樹状細胞との区別を提供し得る。当然、当業者は、本発明のｍｉＤＣが、該表面マーカーに限定されないことを理解するであろう。「細胞表面マーカー」および「表面マーカー」という用語は、本明細書では同じ意味で使用される。

したがって、本発明によって提供されるｍｉＤＣは、さらなる表面マーカーであるＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ４９ｂ、ＮＫ１．１、Ｌｙ６Ｇ、ＢＤＣＡ−１、ＢＤＣＡ−２、ＢＤＣＡ−３、ＢＤＣＡ−４、ＣＤ４、およびＣＤ８αのうちの少なくとも１つをさらなる特徴としてもよい。本発明によって提供されるｍｉＤＣは、当業者によって確認することができ、また、かつ本発明によって包含される、さらなる表面マーカーを示す。

本発明は、本発明に従って単離されるｍｉＤＣの細胞集団を提供する。故に、本発明は、基本的に、ＣＤ１１ｂ^−／ｌｏである、ＢＭ由来の非ｐＤＣの単離された細胞集団を提供する。本発明によって提供される単離された細胞集団は、本明細書で説明されるｍｉＤＣのいずれかを含むことができ、すなわち、本明細書で説明されるｍｉＣＤの表面マーカーのいずれかまたは全部を伴うｍｉＤＣを含む。好ましくは、単離された細胞集団は、本発明に従って、少なくとも１０％のｍｉＤＣを含む。より好ましくは、単離された細胞集団は、本発明に従って、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％のうちの少なくとも１つの割合のｍｉＤＣを含む。最も好ましくは、単離された細胞集団は、本発明に従って、ｍｉＤＣの１００％を含む。

種々の実施形態において、本発明によって提供される単離された細胞集団は、少なくとも１０^４個の本発明によるｍｉＤＣを含む。好ましくは、単離された細胞集団は、少なくとも１０^５個の本発明によるｍｉＤＣを含む。より好ましくは、単離された細胞集団は、少なくとも１０^６個の本発明によるｍｉＤＣを含む。さらにより好ましくは、単離された細胞集団は、少なくとも１０^７個の本発明によるｍｉＤＣを含む。さらにより好ましくは、単離された細胞集団は、少なくとも１０^８個の本発明によるｍｉＤＣを含む。さらなる好ましい実施形態において、単離された細胞集団は、少なくとも１０^９個の本発明によるｍｉＤＣを含む。

種々の実施形態において、単離された細胞集団は、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％のうちの少なくとも１つの割合の本発明によるｍｉＤＣを含み、および／または１０^４個、１０^５個、１０^６個、１０^７個、１０^８個、または１０^９個のうちの少なくとも１つの数の本発明によるｍｉＤＣを含む。

本発明は、本発明によるｍｉＤＣを単離するための方法を提供し、該方法は、本発明に従って、ｍｉＤＣの細胞集団を選択することと、選択した樹状細胞を培養することとを含む。種々の実施形態において、本発明に従ってｍｉＤＣの細胞集団を選択するステップは、適切な刺激に応答して、高レベルのＩＦＮ−αを産生する能力を有するｍｉＤＣの細胞集団を選択することを含む。そのような適切な刺激の性質は、本明細書の他の場所で説明する。ｍｉＤＣは、マウス、ラット、霊長類、およびヒトを含む、任意の哺乳動物から単離してもよい。

種々の実施形態において、前駆細胞は、インビトロおよびインビボで、ｍｉＤＣの形成を増強する薬剤とともにインキュベートしてもよい。好ましい実施形態において、ｍｉＤＣの形成を増強する薬剤は、Ｆｌｔ３−リガンド（ＦＬ）またはＭ−ＣＳＦ受容体リガンドであってもよい。ＦＬの添加は、ｍｉＤＣの数も増加させ得る。ｍｉＤＣを増加させるためのＦＬの投与は、ＩＦＮ−αの産生を増加させるための本発明による核酸またはその類似体によるｍｉＤＣの刺激と組み合わせてもよい。

さらに、本発明に従って、前駆細胞をサイトカインとともにインキュベートすることができる。好ましくは、サイトカインは、ＩＬ−３、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、およびＩＦＮ−γから成る群から選択される。

本発明は、マウスまたはラットｍｉＤＣとすることができる、ｍｉＤＣを提供する。本発明は、ヒトｍｉＤＣである、ｍｉＤＣも提供する。

種々の実施形態において、本発明によるｍｉＤＣを単離するための方法は、本明細書で説明される表面マーカー、すなわち、本明細書で説明される本発明のｍｉＤＣの表面マーカー、ならびに、当技術分野で確立された手法によって当業者が確認することができる、ｍｉＤＣのさらなる表面マーカーを指向する抗体によって、細胞集団からｍｉＤＣを除去することを含む。

種々の実施形態において、本発明によるｍｉＤＣを単離するための方法は、骨髄細胞を採集することと、採集した骨髄細胞のｐＤＣを枯渇させることとを含む。好ましくは、採集した骨髄細胞は、抗ＣＤ４５ＲＡ抗体を使用してｐＤＣを枯渇させる。ここで、抗ＣＤ４５ＲＡ抗体の使用は、当技術分野で知られている手法に従う。より好ましくは、抗ＣＤ４５ＲＡ抗体は、ｐＤＣから採集した骨髄細胞の枯渇を促進するために、磁気ビーズに連結される。磁気ビーズへの抗体の連結は、直接的または間接的であってもよい。

種々の実施形態において、本発明によるｍｉＤＣの単離のための方法は、本明細書で説明される採集または選択した細胞集団から低密度細胞を精製することを含む。例えば、採集または選択した細胞集団は、低密度細胞から高密度Ｔ細胞、Ｂ細胞、およびマクロファージを分離するために、勾配を受けてもよい。故に、種々の実施形態において、本発明は、低密度ｍｉＤＣを単離するための方法を提供する。種々の実施形態において、採集または選択した細胞集団は、低密度細胞から高密度Ｔ細胞、Ｂ細胞、およびマクロファージを分離するために、勾配を受け、その後に、低密度細胞からｍｉＤＣを単離または分離してもよい。種々の実施形態において、本発明に従って提供または採集される骨髄細胞は、この単離を達成するために、ＣＤ４５ＲＡおよび／またはＣＤ１１ｃに対する抗体に結合させ、次いで、選別してもよい。当然、この単離を達成するために、当技術分野で知られている他の方法が使用されてもよい。そのような他の方法も、本発明によって包含される。

種々の実施形態において、本発明によるｍｉＤＣを単離するための方法は、細胞または細胞の集団をＴＬＲ７リガンド、ＴＬＲ８リガンド、およびＴＬＲ９リガンドのうちの少なくとも１つとともにインキュベートすることと、ＩＦＮ−αの産生を検出することとを含む。したがって、種々の実施形態において、本発明によるｍｉＤＣを単離するための方法は、ＴＬＲ７リガンド、ＴＬＲ８リガンド、およびＴＬＲ９リガンドのうちの少なくとも１つで、本発明によるｍｉＤＣを含む細胞集団におけるＩＦＮ−αの産生を刺激または誘導することを含む。

種々の実施形態において、本発明のｍｉＤＣは、例えば、本明細書で説明される表面マーカーの少なくとも１つに対する抗体を使用して、細胞選別によって単離してもよい。好ましくは、表面マーカーは、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ４９ｂ、ＮＫ１．１、およびＬｙ６Ｇから成る群から選択される。

種々の実施形態において、本発明による単離された細胞集団は、本明細書で説明されるｍｉＤＣ表面マーカーを使用して、本発明のｍｉＤＣのために富化することができる。ここで、本発明のｍｉＤＣを富化するための表面マーカーの使用は、当技術分野で知られている標準的な手法に従う。

種々の実施形態において、本発明のｍｉＤＣは、高レベルのＣＤ１１ｂを発現する細胞を除去することによって単離される。種々の実施形態において、単離されたｍｉＤＣ細胞集団は、ＣＤ４５ＲＡ⁻、ＣＤ１１ｃ^＋、ＣＤ３⁻、ＣＤ１９⁻、ＣＤ４９ｂ⁻、ＮＫ１．１⁻、および／またはＬｙ６Ｇ⁻である細胞のために富化されることができる。好ましくは、単離された細胞集団は、ＣＤ１１ｂ^−／ｌｏ、ＣＤ４５ＲＡ⁻、およびＣＤ１１ｃ^＋である細胞のために富化される。より好ましくは、単離された細胞集団は、ＣＤ１１ｂ^−／ｌｏ、ＣＤ４５ＲＡ⁻、ＣＤ１１ｃ^＋、およびＣＤ３⁻である細胞のために富化される。さらに好ましくは、単離されたｍｉＤＣ細胞集団は、ＣＤ１１ｂ^−／ｌｏ、ＣＤ４５ＲＡ⁻、ＣＤ１１ｃ^＋、ＣＤ３⁻、およびＣＤ１９⁻である細胞のために富化される。さらに好ましくは、単離されたｍｉＤＣ細胞集団は、ＣＤ１１ｂ^−／ｌｏ、ＣＤ４５ＲＡ⁻、ＣＤ１１ｃ^＋、ＣＤ３⁻、ＣＤ１９⁻、そして、ＣＤ４９ｂ⁻である細胞のために富化される。さらなる好ましい実施形態において、単離された細胞集団は、ＣＤ１１ｂ^−／ｌｏ、ＣＤ４５ＲＡ⁻、ＣＤ１１ｃ^＋、ＣＤ３⁻、ＣＤ１９⁻、ＣＤ４９ｂ⁻、およびＮＫ１．１⁻である細胞のために富化される。さらなる好ましい実施形態において、単離された細胞集団は、ＣＤ１１ｂ^−／ｌｏ、ＣＤ４５ＲＡ⁻、ＣＤ１１ｃ^＋、ＣＤ３⁻、ＣＤ１９⁻、ＣＤ４９ｂ⁻、ＮＫ１．１⁻、およびＬｙ６Ｇ⁻である細胞のために富化される。

種々の実施形態において、本発明のｍｉＤＣは、ＣＤ４および／またはＣＤ８αを発現する細胞を除去することによって単離される。好ましくは、単離された細胞集団は、ＣＤ１１ｂ^−／ｌｏ、ＣＤ４５ＲＡ⁻、ＣＤ１１ｃ^＋、ＣＤ４⁻、および／またはＣＤ８α⁻である細胞のために富化される。より好ましくは、単離された細胞集団は、ＣＤ１１ｂ^−／ｌｏ、ＣＤ４５ＲＡ⁻、ＣＤ１１ｃ^＋、ＣＤ３⁻、ＣＤ４⁻、および／またはＣＤ８α⁻である細胞のために富化される。さらに好ましくは、単離されたｍｉＤＣ細胞集団は、ＣＤ１１ｂ^−／ｌｏ、ＣＤ４５ＲＡ⁻、ＣＤ１１ｃ^＋、ＣＤ３⁻、ＣＤ１９⁻、ＣＤ４⁻、および／またはＣＤ８α⁻である細胞のために富化される。さらに好ましくは、単離されたｍｉＤＣ細胞集団は、ＣＤ１１ｂ^−／ｌｏ、ＣＤ４５ＲＡ⁻、ＣＤ１１ｃ^＋、ＣＤ３⁻、ＣＤ１９⁻、ＣＤ４９ｂ⁻、ＣＤ４⁻、および／またはＣＤ８α−である細胞のために富化される。さらなる好ましい実施形態において、単離された細胞集団は、ＣＤ１１ｂ^−／ｌｏ、ＣＤ４５ＲＡ⁻、ＣＤ１１ｃ^＋、ＣＤ３⁻、ＣＤ１９⁻、ＣＤ４９ｂ⁻、ＮＫ１．１⁻、ＣＤ４⁻、および／またはＣＤ８α⁻である細胞のために富化される。さらなる好ましい実施形態において、単離された細胞集団は、ＣＤ１１ｂ^−／ｌｏ、ＣＤ４５ＲＡ⁻、ＣＤ１１ｃ^＋、ＣＤ３⁻、ＣＤ１９⁻、ＣＤ４９ｂ⁻、ＮＫ１．１⁻、Ｌｙ６Ｇ⁻、ＣＤ４⁻、および／またはＣＤ８α−である細胞のために富化される。

種々の実施形態において、本発明のｍｉＤＣは、表面マーカーＣＤ２４、Ｆｌｔ３、ＣＤ４５Ｒ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、およびＭＨＣＩＩのうちの少なくとも１つに対する抗体を使用して単離されてもよい。

種々の実施形態において、本発明のｍｉＤＣは、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ７、およびＴＬＲ９のうちの少なくとも１つに対する抗体を使用して単離されてもよい。

種々の実施形態において、本発明のｍｉＤＣは、表面マーカーＣＤ２４、ＣＤ１１ｃ、および／またはＢＤＣＡ−１に対する抗体を使用して単離されてもよい。故に、種々の実施形態では、ＣＤ２４、ＣＤ１１ｃ、および／またはＢＤＣＡ−１を発現するｍｉＤＣを単離するために、本発明よる細胞選別が行われてもよい。同様に、ＣＤ２４、ＣＤ１１ｃ、および／またはＢＤＣＡ−１を発現する本発明のｍｉＤＣを単離するために、他のよく知られている手法を使用することができる。

本発明によるｍｉＤＣは、病原体関連ＰＲＲによって認識されるリガンドの類似体に関して、ｐＤＣによって細胞１個あたりで産生されるＩＦＮ−αに等しい、莫大な量のＩＦＮ−αを産生する。種々の実施形態において、本発明によるｍｉＤＣは、本明細書の他の場所で説明される適切な刺激に応答して、高レベルのＩＦＮ−αを産生する能力を有する。そのようなｍｉＤＣは、本発明によって包含される。同様に、種々の実施形態において、本発明によるｍｉＤＣを含む細胞集団は、適切な刺激に応答して、高レベルのＩＦＮ−αを産生する能力を有する。そのようなｍｉＤＣ細胞集団は、本発明によって包含される。本発明に従う高レベルのＩＦＮ−αの産生は、刺激されていないｍｉＤＣに関して測定可能なレベルよりも少なくとも５倍高いレベルを意味する。種々の実施形態において、ｍｉＤＣは、ＣｐＧ等の適切な刺激物による刺激に応じて、「非常に高レベル」のＩＦＮ−αを産生することができる。この文脈において、「非常に高レベル」のＩＦＮ−αの産生は、刺激されていないｍｉＤＣに関して測定可能なレベルよりも少なくとも２０倍高いレベルを意味する。さらなる実施形態において、刺激されたｍｉＤＣは、刺激されていないｍｉＤＣのＩＦＮ−αの産生レベルの少なくとも２倍、３倍、４倍、８倍、１５倍、２０倍、２５倍、５０倍、および１００倍のレベルのＩＦＮ−αを産生することができる。

本明細書で使用される、本発明によるｍｉＤＣにおけるＩＦＮ−αの産生を誘導するため適切な刺激は、病原体関連パターン認識受容体（ＰＲＲ）によって認識されるリガンドである。そのようなリガンドは、好ましくは病原体起源のものであるが、本発明は、本発明によるｍｉＤＣにおけるＩＦＮ−αの産生を誘導するために適切な刺激物である、刺激物としての非病原性リガンドも包含する。ただし、そのような非病原性のリガンドは、本発明に従って、病原体関連ＰＲＲによって認識されることを条件とする。本発明に従って、病原体関連ＰＲＲによって認識される非病原性リガンドの例は、ＣｐＧ（例えば、ＣｐＧ２２１６）である。

種々の実施形態において、本発明に従って、ｍｉＤＣにおけるＩＦＮ−αの産生を誘導するための適切な刺激物は、ＴＬＲ３リガンド、ＴＬＲ７リガンド、ＴＬＲ８リガンド、およびＴＬＲ９リガンドのうちの少なくとも１つである。好ましくは、刺激物は、ヘルペスウイルス起源のもの、またはポックスウイルス起源のものである。より好ましくは、刺激物は、ＭＶＡウイルス起源のものである。

種々の実施形態において、本発明に従って、ｍｉＤＣにおけるＩＦＮ−αの産生を誘導するための適切な刺激物は、核酸またはその類似体である。核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡであってもよく、好ましくは、ｄｓＤＮＡまたはｄｓＲＮＡ（その類似体を含む）である。好適なｄｓＤＮＡは、原核生物もしくは真核生物起源であるか、またはウイルス起源のものであってもよいゲノムＤＮＡ（例えば、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、または胸腺ＤＮＡ）等の、天然ｄｓＤＮＡを含んでもよい。ＤＮＡの取り込みを促進するために、リポソーム、電気穿孔、またはナノ粒子等の増強した取り込みのための方法を用いてもよい。

本発明において、核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡ（その類似体を含む）である。本発明の種々の実施形態において、核酸は、ｄｓ核酸（その類似体を含む）である。本発明の種々の実施形態において、核酸は、ｓｓ核酸（その類似体を含む）である。本発明の種々の実施形態において、ＤＮＡは、ｄｓＤＮＡ（その類似体を含む）である。種々の実施形態において、ＲＮＡは、ｄｓＲＮＡ（その類似体を含む）である。本発明の種々の実施形態において、ＤＮＡは、ｓｓＤＮＡ（その類似体を含む）である。本発明の種々の実施形態において、ＲＮＡは、ｓｓＲＮＡ（その類似体を含む）である。

種々の実施形態において、本発明によるｄｓ核酸またはその類似体は、ウイルスによって産生または提供される。好ましくは、ウイルスは、ｄｓＤＮＡウイルス、ｄｓＲＮＡウイルス、またはｓｓＲＮＡウイルスである。本発明によるｄｓＲＮＡまたはｄｓＤＮＡ（その類似体を含む）は、ｄｓＤＮＡウイルス、ｄｓＲＮＡウイルス、ｓｓＤＮＡウイルス、または陽性ｓｓＲＮＡウイルスによって産生または提供することができる。したがって、種々の実施形態において、本発明によるｄｓ核酸の類似体は、ｓｓ核酸であり、これは、ｄｓ核酸に処理されるか、または処理することができる。

種々の実施形態において、ウイルスは、トガウイルス、フラビウイルス、アストロウイルス、ピコルナウイルス、カリチウイルス、ヘペウイルス、ノダウイルス、アルテリウイルス、またはコロナウイルス等の、陽性ｓｓＲＮＡウイルスである。種々の実施形態において、ウイルスは、レオウイルスまたはビルナウイルス等の、ｄｓＲＮＡウイルスである。種々の実施形態において、ウイルスは、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、またはＳＩＶ等の、レトロウイルスである。種々の実施形態において、ウイルスは、アスファウイルス、イリドウイルス、ポリオーマウイルス、パピローマウイルス、パポーバウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルスまたはヘパドナウイルス等の、ｄｓＤＮＡウイルスである。好ましい実施形態において、ウイルスは、オルソポックスウイルスまたはパラポックスウイルス等の、ポックスウイルスである。好ましくは、ポックスウイルスは、痘瘡ウイルス、牛痘ウイルス、ラクダ痘ウイルス、またはワクシニアウイルスである。ＭＶＡウイルスが特に好ましい。種々の実施形態において、ウイルスは、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２）、水痘帯状疱疹ウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、エプスタインバーウイルス、およびカポジ肉腫関連ヘルペスウイルス等の、ヘルペスウイルスウイルスである。

種々の実施形態において、本発明のｍｉＤＣにおけるＩＦＮ−αの産生を刺激する核酸またはその類似体は、ＤＮＡまたはＲＮＡである。好ましくは、ＤＮＡは、ｄｓＤＮＡであり、ＲＮＡは、ｓｓＲＮＡである。種々の実施形態において、ＤＮＡまたはＲＮＡは、ＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスによって産生または提供される。好ましい実施形態において、ウイルスは、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、トガウイルス、またはコロナウイルスである。

種々の実施形態において、本発明によるｍｉＤＣは、インビトロ活性化ｍｉＤＣである。これは、本発明に従って、好ましくは、必要とする対象の治療で使用されるｍｉＤＣに適用する。本明細書で使用される活性化ｍｉＤＣは、本発明に従って、適切な刺激物によってＩＦＮ−αを産生するように活性化される抗原またはｍｉＤＣを提示するために、抗原に曝露することによって活性化されるｍｉＤＣを意味する。したがって、本発明による活性化ｍｉＤＣは、抗原を付加することによって活性化されるｍｉＤＣであってもよく、またはＩＦＮ−αを産生するように活性化されるｍｉＤＣであってもよい。

種々の実施形態において、ｍｉＤＣは、本明細書で説明される病原体関連パターン認識受容体（ＰＲＲ）によって認識されるリガンドとともにｍｉＤＣをインキュベートすることによって、ＩＦＮ−αを産生するように活性化される。

本発明は、本発明によるｍｉＤＣを使用してＩＦＮ−αを産生するための方法を提供し、該方法は、適切な刺激物とともにｍｉＤＣをインキュベートしてＩＦＮ−αを産生することを含む。そのような刺激物は、本明細書で説明される病原体関連パターン認識受容体（ＰＲＲ）によって認識される、リガンドである。好ましくは、リガンドは、ＴＬＲ９リガンドである。種々の実施形態において、本発明によるｍｉＤＣを使用してＩＦＮ−αを産生するための方法は、ｍｉＤＣを含む細胞集団の使用を含む。ここで、種々の実施形態において、ｍｉＤＣは、精製されるかまたは細胞集団から分離され、その後に、適切な刺激物とともにインキュベートされてＩＦＮ−αを産生する。種々の実施形態において、本方法は、ｍｉＤＣによって産生されるＩＦＮ−αを精製することも含む。本発明に従ってｍｉＤＣによって産生されるＩＦＮ−αは、当技術分野で知られている確立された標準的な方法によって精製することができる。

本発明は、本発明によるｍｉＤＣを使用してＩＬ−６を産生するための方法を提供し、該方法は、適切な刺激物とともにｍｉＤＣをインキュベートしてＩＬ−６を産生することを含む。そのような刺激物は、本明細書で説明される病原体関連パターン認識受容体（ＰＲＲ）によって認識される、リガンドである。好ましくは、リガンドは、ＴＬＲ２リガンド、ＴＬＲ４リガンド、ＴＬＲ７リガンド、およびＴＬＲ９リガンドのうちの少なくとも１つである。種々の実施形態において、ＴＬＲ２リガンドは、Ｐａｍ３Ｃｙｓである。種々の実施形態において、ＴＬＲ４リガンドは、ＬＰＳである。種々の実施形態において、ＴＬＲ７リガンドは、Ｒ８３７である。種々の実施形態において、ＴＬＲ９リガンドは、ＣｐＧ（例えば、ＣｐＧ２２１６−ＯＤＮ）またはウイルス起源のリガンドである。種々の実施形態において、本発明によるｍｉＤＣを使用してＩＬ−６を産生するための方法は、ｍｉＤＣを含む細胞集団の使用を含む。ここで、種々の実施形態において、ｍｉＤＣは、精製されるかまたは細胞集団から分離され、その後に、適切な刺激物とともにインキュベートされてＩＬ−６を産生する。種々の実施形態において、本方法は、ｍｉＤＣによって産生されるＩＬ−６を精製することも含む。本発明に従って、ｍｉＤＣによって産生されるＩＬ−６は、当技術分野で知られている確立された標準的な方法によって精製することができる。

本発明は、本発明によるｍｉＤＣを使用してＴＮＦ−αを産生するための方法も提供し、該方法は、適切な刺激物とともにｍｉＤＣをインキュベートしてＴＮＦ−αを産生することを含む。そのような刺激物は、本明細書で説明される病原体関連パターン認識受容体（ＰＲＲ）によって認識される、リガンドである。好ましくは、リガンドは、ＴＬＲ７リガンドおよびＴＬＲ９リガンドのうちの少なくとも１つである。種々の実施形態において、ＴＬＲ７リガンドは、Ｒ８３７である。種々の実施形態において、ＴＬＲ９リガンドは、ＣｐＧ（例えば、ＣｐＧ２２１６−ＯＤＮ）またはウイルス起源のリガンドである。種々の実施形態において、本発明によるｍｉＤＣを使用してＴＮＦ−αを産生するための方法は、ｍｉＤＣを含む細胞集団の使用を含む。ここで、種々の実施形態において、ｍｉＤＣは、精製されるかまたは細胞集団から分離され、その後に、適切な刺激物とともにインキュベートされてＴＮＦ−αを産生する。種々の実施形態において、本方法は、ｍｉＤＣによって産生されるＴＮＦ−αを精製することも含む。本発明に従って、ｍｉＤＣによって産生されるＴＮＦ−αは、当技術分野で知られている確立された標準的な方法によって精製することができる。

本明細書で説明されるように、本発明のｍｉＤＣは、Ｔ細胞を刺激することができる。故に、本発明は、Ｔ細胞を刺激するための本発明のｍｉＤＣの使用を包含する。Ｔ細胞を刺激するために、ｍｉＤＣは、適切な刺激物によって刺激（活性化）される。種々の実施形態において、ｍｉＤＣは、ＧＭ−ＣＳＦ、ＬＰＳ、およびＣｐＧのうちの少なくとも１つによって刺激（活性化）される。種々の実施形態において、Ｔ細胞を刺激するための本発明のｍｉＤＣの使用は、ｍｉＤＣを含む細胞集団の使用を含む。ここで、種々の実施形態において、ｍｉＤＣは、精製されるかまたは細胞集団から分離され、その後に、適切な刺激物とともにインキュベートされてｍｉＤＣを刺激する。Ｔ細胞を刺激するための本発明のｍｉＤＣの使用は、エクスビボまたはインビボのいずれかで、Ｔ細胞を本発明の刺激（活性化）されたｍｉＤＣとともにインキュベートすることを含む。故に、本発明は、必要とする対象のＴ細胞を刺激するための、本発明のｍｉＤＣの治療的使用も包含する。種々の実施形態において、ｍｉＤＣは、同種異系Ｔ細胞とともにインキュベートされる。種々の実施形態において、ｍｉＤＣは、抗原特異的Ｔ細胞とともにインキュベートされる。種々の実施形態において、ｍｉＤＣは、エクスビボで刺激（活性化）され、次いで、必要とする対象に投与されて、記憶Ｔ細胞を刺激する。刺激（活性化）されたｍｉＤＣは、高レベルのＴ細胞刺激を生成することができる。

種々の実施形態において、必要とする対象のＴ細胞を刺激するための本発明のｍｉＤＣの治療的使用は、宿主から得られたｍｉＤＣを使用することと、そのように得られたｍｉＤＣを刺激（活性化）することと、そのように刺激（活性化）されたｍｉＤＣを、刺激（活性化）されるｍｉＤＣが得られた宿主中に再導入（投与）することとを含む。ここで、宿主は、Ｔ細胞を刺激するためのｍｉＤＣによる治療を必要とする対象である。

Ｔ細胞を刺激するための本発明のｍｉＤＣの使用に関する種々の実施形態において、ｍｉＤＣは、生理学的緩衝液で洗浄し、適切な刺激物による刺激（活性化）の後、かつ必要とする対象への投与の前に、生理学的緩衝液中に懸濁させてもよい。種々の実施形態では、１０^４個、１０^５個、１０^６個、１０^７個、１０^８個、または１０^９個のうちの少なくとも１つの数の刺激（活性化）されたｍｉＤＣを含む懸濁液が、当技術分野で知られている手法によって、必要とする対象に投与される。

本発明は、インビボでのｍｉＤＣの活性化をさらに包含する。これは、ＣｐＧ（例えば、ＣｐＧ２２１６−ＯＤＮ）等の活性化化合物の、宿主の骨髄への直接適用によって達成することができる。直接適用は、インビボでのｍｉＤＣのＩＦＮ−αの産生を増加させることができる。骨髄への直接適用は、当技術分野で知られている種々の手法によって達成することができる。したがって、本発明は、必要とする対象の骨髄を治療するための薬剤の調製物に対する、ＣｐＧ等の、活性化化合物の使用を包含する。

本発明は、本発明のｍｉＤＣに特異的な試薬を包含する。故に、本発明によって提供されるｍｉＤＣのいずれかに特異的な抗体を、当技術分野で知られている確立された手法を使用して生成することができる。例えば、抗体は、ｍｉＤＣ抗原を使用して生成することができ、次いで、ｍｉＤＣには特異的に結合するが、ｐＤＣおよび他のｃＤＣ等の他の細胞には結合しない抗体を選択することができる。本発明のｍｉＤＣのいずれかに特異的な抗体は、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体の双方を包含する。ｍｉＤＣに特異的な抗体を生成することは、当技術分野で知られている標準的な免疫学的方法を使用して達成することができる。例えば、Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３３５：７３０、Ｍｃ Ｇｕｉｎｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，１９９６， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：１４４９を参照されたい。

本発明は、本発明のｍｉＤＣに特異的なｃＤＮＡライブラリーを包含する。そのようなｃＤＮＡライブラリーは、当技術分野で知られている手法を使用して生成することができる。例えば、ｃＤＮＡライブラリーは、ｍｉＤＣ由来のＲＮＡを使用して生成し、次いで、ｐＤＣおよび／または他のｃＤＣ等の他の細胞型由来のＲＮＡまたはＤＮＡをサブトラクトすることができる。これは、ｍｉＤＣにおいては発現するが、ｐＤＣおよび／または他のｐＤＣ等の他の細胞型では発現しないＲＮＡのｃＤＮＡを選択することを提供する。サブトラクションは、標準的な分子生物学的方法を使用して行うことができる。例えば、Ｗｅａｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｍｂｒｙｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｐ．Ｓｈａｒｐｅ ａｎｄ Ｉ．Ｍａｓｏｎ，ｅｄｓ．，ｐｐ．６０１−６０９、Ｗｅｌｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：１００２７−４４を参照されたい。

本発明は、ｍｉＤＣの機能に影響を及ぼす、または及ぼさない薬物のスクリーニングのためのｍｉＤＣの使用を包含する。種々の実施形態において、ｍｉＤＣは、ＩＦＮ−α、ＩＬ−６、およびＴＮＦ−αのうちの少なくとも１つの産生を阻害または促進する薬物のスクリーニングに使用される。種々の実施形態において、ｍｉＤＣは、ｍｉＤＣによるＴ細胞の活性化を阻害または促進する薬物のスクリーニングに使用される。ｍｉＤＣの機能に影響を及ぼす、または及ぼさない薬物のスクリーニングのためのｍｉＤＣの使用は、薬剤の存在下および非存在下でのｍｉＤＣのインキュベーションを含む。種々の実施形態において、ＩＦＮ−α、ＩＬ−６、およびＴＮＦ−αのうちの少なくとも１つの産生に対する影響は、本明細書の他の場所で説明されるｍｉＤＣにおけるＩＦＮ−α、ＩＬ−６、またはＴＮＦ−αの産生を通常は誘導する適切な刺激物によるｍｉＤＣの活性化に対する、試験薬剤の存在および非存在の影響を評価することによって評価される。種々の実施形態において、Ｔ細胞の活性化に対する影響は、本明細書の他の場所で説明されるｍｉＤＣを通常は活性化する適切な刺激物によるｍｉＤＣの活性化に対する、試験薬剤の存在および非存在の影響を評価することによって評価される。

本発明は、本発明のｍｉＤＣを含む医薬組成物（薬剤）を提供する。種々の実施形態において、医薬組成物は、免疫療法組成物である。本発明は、本発明による方法によって得られる免疫療法剤を含む医薬組成物も包含する。本明細書で説明されるように、種々の実施形態において、本発明のｍｉＤＣは、免疫療法剤として使用することができる。種々の実施形態において、本発明の免疫療法剤は、ワクチンである。これは、特に、本発明によって提供される、抗原を負荷したＡＰｍｉＤＣに適用する。

本発明は、医薬組成物（薬剤）の調製物のための本発明のｍｉＤＣの使用を包含する。本発明は、免疫療法剤の調製物のための本発明のｍｉＤＣの使用も包含する。本発明は、ワクチンの調製のための本発明のｍｉＤＣの使用をさらに包含する。

本発明は、免疫療法剤を調製するための方法を提供し、該方法は、（ａ）ＣＤ１１ｂ^−／ｌｏである骨髄由来の非形質細胞様樹状細胞（非ｐＤＣ）を提供するステップと、（ｂ）１つ以上の抗原をステップ（ａ）の非ｐＤＣに負荷するように、該非ｐＤＣをエクスビボで修飾するステップと、を含む。種々の好ましい実施形態において、本方法は、抗原を負荷したステップ（ｂ）の非ｐＤＣを樹状細胞成熟の活性化因子とともにインキュベートすることをさらに含む。種々の実施形態において、樹状細胞成熟の活性化因子は、サイトカインまたはインターフェロン（Ｉ型ＩＦＮおよびＩＦＮ−ガンマを含む）、成長因子（ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３−Ｌ、Ｇ−ＣＳＦ、ＬＩＦ、オンコスタチンＭ、およびＩＬ−３４を含む）、ＴＮＦファミリーメンバー（例えば、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０Ｌ、および４−１ＢＢＬを含む）、ＴＧＦファミリーメンバー（例えば、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、Ｎｏｄａｌを含む）、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１ａ、ＩＬ−１ｂ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２５、ＩＬ−３１、ＩＬ−３３、ＩＬ−３５を含む）のうちの少なくとも１つである。種々の他の実施形態において、樹状細胞成熟の活性化因子は、パターン認識受容体であり、好ましくは、ＴＬＲリガンド（例えば、ＴＬＲ２、−３、−４、−５、−７、−８、−９、−１０、−１１、−１２、および−１３のためのリガンドを含む）、Ｒｉｇ様ヘリカーゼ（Ｒｉｇ−Ｉ、およびＭＤＡ５リガンドを含む）、細胞質内ＤＮＡ受容体リガンド（例えば、ＤＡＩ、ＳＴＩＮＧのためのリガンドを含む）、ＰＫＲ、およびＮｏｄ様受容体（例えば、ＮＡＬＰ１、ＮＡＬＰ１ｂ、ＮＡＬＰ３、ＩＰＡＦ、ＮＡＩＰ、ＮＯＤ１、ＮＯＤ２、ＣＡＲＤのためのリガンドを含む）のうちの少なくとも１つである。

種々のさらなる実施形態において、樹状細胞成熟の活性化因子は、ｃ型レクチンであり、好ましくは、ＣＤ２０５、ＣＤ２０６、ＣＤ２０９、Ｃｌｅｃ１Ｂ、Ｃｌｅｃ２、Ｃｌｅｃ３Ｂ、Ｃｌｅｃ４Ｆ、Ｃｌｅｃ６Ａ、Ｃｌｅｃ７Ａ、Ｃｌｅｃ９Ａ、Ｃｌｅｃ１１Ａ、Ｃｌｅｃ１２Ａ、Ｃｌｅｃ１３Ｄ、およびＣｌｅｃ１３Ｅのうちの少なくとも１つである。

本発明によって提供される免疫療法剤は、必要とする対象、好ましくはヒトを治療するために使用される。

種々の実施形態において、本発明に従って対象を治療することは、少なくとも１０^４個の本発明によるｍｉＤＣを投与することを含む。したがって、種々の実施形態において、本発明に従って対象を治療することは、インビトロで活性化した少なくとも１０^４個のｍｉＤＣを投与することを含む。

好ましくは、本発明に従って対象を治療することは、少なくとも１０^５個の本発明によるｍｉＤＣを投与することを含む。より好ましくは、本発明に従って対象を治療することは、少なくとも１０^６個の本発明によるｍｉＤＣを投与することを含む。さらに好ましくは、本発明に従って対象を治療することは、少なくとも１０^７個の本発明によるｍｉＤＣを投与することを含む。さらに好ましくは、本発明に従って対象を治療することは、少なくとも１０^８個の本発明によるｍｉＤＣを投与することを含む。さらに好ましい実施形態において、本発明に従って対象を治療することは、少なくとも１０^９個の本発明によるｍｉＤＣを投与することを含む。

本発明は、本明細書で説明されるＩＦＮ−αを産生し、その後に、活性化したｍｉＤＣを、必要とする対象に投与するための、ｍｉＤＣを含む細胞集団を含む、ｍｉＤＣのエクスビボでの活性化を包含する。具体的には、ｍｉＤＣまたはｍｉＤＣの集団を適切な刺激物、すなわち、本明細書の他の場所で説明されるｍｉＤＣにおけるＩＦＮ−αの産生を誘導するリガンド／刺激物と接触させることによってＩＦＮ−αを産生するように誘導されるｍｉＤＣの集団が、必要とする対象に投与されてもよい。故に、本発明は、感染疾患または癌に対する反応をインビボで誘導するための方法を提供し、該方法は、本発明のｍｉＤＣをｍｉＤＣにおけるＩＦＮ−αの産生を誘導する適切なリガンド／刺激物とエクスビボで接触させることと、該ｍｉＤＣを感染疾患または癌に罹患している対象に導入することとを含む。換言すれば、本発明は、感染疾患または癌に罹患している対象の予防および治療のための方法を提供し、該方法は、ｍｉＤＣの集団におけるＩＦＮ−αの産生を誘導するためのエクスビボ方法によって生成されるＩＦＮ−α産生ｍｉＤＣを該対象に投与することと、本発明によるｍｉＤＣを、ｍｉＤＣにおけるＩＦＮ−αの産生を誘導するリガンド／刺激物とエクスビボで接触させることとを含む。種々の実施形態において、本発明は、感染疾患または癌の予防または処理のための方法を提供し、該方法は、（ａ）感染疾患または癌に罹患している対象を提供することと、（ｂ）外対象からｍｉＤＣを得ることと、（ｃ）該ｍｉＤＣを、ｍｉＤＣにおけるＩＦＮ−αの産生を誘導する刺激物とエクスビボで接触させて、ＩＦＮ−αを産生するｍｉＤＣの集団を生成することと、（ｄ）感染疾患または癌に対するインビボ治療反応を誘導するように、ＩＦＮ−α産生ｍｉＤＣの集団を該対象に再導入することと、を含む。好ましくは、ｍｉＤＣの集団は、対象に再導入する前に洗浄される。別の好ましい実施形態では、ＩＦＮ−α産生ｍｉＤＣの集団を、必要とする対象への投与に好適な培地中、好ましくは、生理学的緩衝液中に再懸濁させる。ＩＦＮ−α産生ｍｉＤＣの集団は、例えば静脈内注射のような、数多くのよく知られている手法によって対象に再導入されてもよい。

ｍｉＤＣを、ｍｉＤＣおよび／またはｍｉＤＣを含む細胞の集団におけるＩＦＮ−αの産生を誘導するためのリガンド／刺激物とエクスビボで接触させることに関する、および／またはそれを含む、本発明による全ての実施形態において、好ましくは、Ｆｌｔ３、リガンド、および／またはＭ−ＣＳＦ受容体リガンドで前処理したｍｉＤＣは、ｍｉＤＣにおけるＩＦＮ−αの産生を誘導する適切な刺激物とエクスビボで接触させてもよい。これは、得られたｍｉＤＣをＩＦＮ−αの産生を誘導するリガンド／刺激物とエクスビボで接触させることによってＩＦＮ−αの産生を誘導するために、該対象からｍｉＤＣを得る前に、Ｆｌｔ３リガンドおよび／またはＭ−ＣＳＦ受容体リガンドを該対象に投与してもよいことを意味する。Ｆｌｔ３リガンドおよび／またはＭ−ＣＳＦ受容体リガンドによるこの前処理は、該前処理したｍｉＤＣをｍｉＤＣにおけるＩＦＮ−αの産生を誘導するリガンド／刺激物とエクスビボで接触させるために、該対象からそのように前処理したｍｉＤＣを得る前に、該対象におけるｍｉＤＣの形成／レベルの増加を提供し得る。

ｍｉＤＣおよび／またはｍｉＤＣを含む細胞の集団におけるＩＦＮ−αの産生を誘導する刺激物とエクスビボで接触させるために、対象からｍｉＤＣを得るという状況において、対象からｍｉＤＣを得る／単離するための方法は、当業者によく知られている。本発明において、「対象からｍｉＤＣを得る」および「対象からｍｉＤＣを単離する」という用語は、同じ意味で使用される。

ｍｉＤＣを、ｍｉＤＣおよび／またはｍｉＤＣを含む細胞の集団におけるＩＦＮ−αの産生を誘導する刺激物とエクスビボで接触させることに関する／それを含む、本発明による種々の実施形態において、対象から得た／単離されたｍｉＤＣは、ＴＬＲ２−、ＴＬＲ４−、ＴＬＲ９−、ＴＬＲ１０−、およびＣＤ４０−リガンド、好ましくは、Ｐａｍ３Ｃｙｓ、ＬＰＳ、ＣｐＧ−ＯＤＮ、またはＣＤ４０リガンドのうちの少なくとも１つとともにさらにインキュベートしてもよい。このインキュベーションは、ＩＦＮ−αの発現を増加させ得る。種々の実施形態において、対象から得た／単離されたｍｉＤＣは、サイトカイン、好ましくは、ＩＬ−３、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、またはＩＦＮ−ガンマ（ＩＦＮ−γ）とともにさらにインキュベートされてもよい。

本発明の種々の実施形態において、ｍｉＤＣにおけるＩＦＮ−αの産生を誘導するパターン認識受容体によって認識されるリガンド／刺激物は、パターン認識受容体（ＰＲＲ）、好ましくは、病原体関連ＰＲＲによって認識されるリガンド／刺激物である。換言すれば、本発明の種々の実施形態において、パターン認識受容体は、病原体関連パターン認識受容体である。本発明の種々の実施形態において、病原体関連パターン認識受容体によって認識されるリガンド／刺激物は、細胞表面、エンドソーム、および／または細胞質内病原体関連パターン認識受容体によって認識されるリガンドである。換言すれば、本発明の種々の実施形態において、病原体関連パターン認識受容体は、細胞表面、エンドソーム、および／または細胞質内病原体関連パターン認識受容体である。免疫系は、分子の特定の構造（パターン）に結合して、細胞中へのシグナル伝達を引き起こす、「パターン認識受容体」（ＰＲＲ）によって、病原体または他の形態の危険物を認識する。それらは、外部膜上、エンドソーム中、または細胞の細胞質内のいずれかに位置する。ＰＲＲの中で、異なるファミリーが説明されており、当業者に知られている。各ファミリーは、その中でシグナリングするために使用されるアダプター分子の構造または使用において特定の類似点を示す。

そのようなＰＲＲファミリーのうちの最良の検査例は、トール様受容体（ＴＬＲ）のファミリーであり、これは、構造的類似性として、ロイシンに富む反復およびいわゆるＴＩＲドメインを示す。故に、本発明の種々の実施形態において、ＰＲＲは、好ましくは、トール様受容体（ＴＬＲ）ファミリーのＰＲＲである。これらのシグナルは、アダプター分子ＭｙＤ８８またはＴＲＩＦを介する。

ＰＲＲファミリーの別の例は、活性メンバーとしてＲＩＧ−ＩおよびＭＤＡ５を伴う、Ｒｉｇ様ヘリカーゼである。故に、本発明の種々の実施形態において、ＰＲＲは、好ましくは、活性メンバーとしてＲＩＧ−ＩおよびＭＤＡ５を伴う、Ｒｉｇ様ヘリカーゼファミリーのＰＲＲである。それらの受容体は、細胞質中に位置して、ＩＰＳ−１、ＶＩＳＡ、またはＭＡＶＳとしても知られる、アダプター分子ＣＡＲＤＩＦを介してシグナリングする。それらは、ＲＮＡの特定の異なる形態を認識することが知られている。

さらに別のＰＲＲファミリーは、ＮＯＤ様受容体であり、これは、特定のカスパーゼを誘導し、したがって、活性ＩＬ−１およびＩＬ−１８の誘導に関連している。故に、本発明の種々の実施形態において、ＰＲＲは、好ましくは、ＮＯＤ様受容体ファミリーのＰＲＲである。

本発明の種々の実施形態において、ＰＲＲは、好ましくは、細胞質内ＤＮＡ認識受容体であり、これは、ＤＮＡウイルスを認識する。ここで、ＤＮＡウイルスは、好ましくは、アデノウイルス、ポックスウイルス、またはヘルペスウイルスである。

しばしば、病原体は、異なるパターンを収容しており、例えば、グラム陰性細菌は、ＴＬＲ４によって認識されるＬＰＳを有するが、病原体は、それぞれ、ＴＬＲ９またはＴＲＬ７によって認識され得るＤＮＡおよびＲＮＡも含有する。一方で、一部の病原体は、しばしば異なる細胞型によって発現される異なるＰＲＲを介して、同じパターンによって認識され得、例えば、ＤＮＡウイルス（ＨＳＶ−１）は、ＴＬＲ９を介して形質細胞様ＤＣによって認識されるのに対して、マクロファージ等の他の細胞型は、細胞質中の未知の受容体を介して該ウイルスを認識する。別の例は、インフルエンザまたはセンダイウイルス等の特定のｓｓＲＮＡウイルスの認識であり、これは、ＴＬＲ７を介して形質細胞様ＤＣによって認識されるのに対して、特定の従来のＤＣは、認識のためにＲＩＧ−Ｉを使用する。故に、本発明の種々の実施形態において、ＰＲＲによって認識されるリガンドは、好ましくは、異なるＰＲＲを介して同じパターンによって認識されるリガンドである。

非常に多くの文献がＰＲＲのリガンドおよび受容体相互作用を列記しており、例えば、Ａｋｉｒａ ２００９，Ｐａｔｈｏｇｅｎ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｂｙ ｉｎｎａｔｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ａｎｄ ｉｔｓ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．Ｐｒｏｃ．Ｊｐｎ．Ａｃａｄ．Ｓｅｒ．Ｂ．Ｐｈｙｓ．Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．８５（４）：１４３−５６、およびＬａｔｚ ａｎｄ Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ ２００８，Ｉｎｎａｔｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ：ｓｅｎｓｉｎｇ ａｎｄ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．Ｐｏｓｔｅｒ Ａｐｒｉｌ ２００８，Ｖｏｌ．８（４）である。ＰＲＲの特異的リガンドおよび受容体相互作用に関する該参考文献の開示は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明の種々の実施形態において、ＰＲＲのリガンドおよび受容体相互作用は、該参考文献で説明されるものである。すなわち、Ａｋｉｒａ ２００９およびＬａｔｚ ａｎｄ Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ ２００８で説明されるＰＲＲのリガンドおよび受容体相互作用は、本出願の一部を形成し、参照により本発明の好ましい実施形態を定義する。

本発明において、本発明によるパターン認識受容体によって認識されるリガンドは、好ましくは、ＴＬＲ３リガンド、ＴＬＲ７リガンド、ＴＬＲ８リガンド、またはＴＬＲ９リガンドである。

好ましい実施形態において、パターン認識受容体は、ＴＬＲ−リガンド（例えば、ＴＬＲ２、−３、−４、−５、−７、−８、−９、−１０、−１１、−１２、および−１３のためのリガンドを含む）、Ｒｉｇ様ヘリカーゼ（Ｒｉｇ−ＩおよびＭＤＡ５リガンドを含む）、細胞質内ＤＮＡ受容体リガンド（例えば、ＤＡＩ、ＳＴＩＮＧのためのリガンドを含む）、ＰＫＲ、およびＮｏｄ様受容体（例えば、ＮＡＬＰ１、ＮＡＬＰ１ｂ、ＮＡＬＰ３、ＩＰＡＦ、ＮＡＩＰ、ＮＯＤ１、ＮＯＤ２、ＣＡＲＤのためのリガンドを含む）のうちの少なくとも１つである。

本発明のｍｉＤＣの性質の１つは、エンドサイトーシスによって外因性タンパク質を取り込む能力であり、該タンパク質は、次いで、プロセスを受けて、ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩ分子と連動して、ペプチドエピトープとしてそれらの表面に提示される。

本発明のこれらの抗原提示ｍｉＤＣは、細胞毒性Ｔ細胞によって認識することができる。この性質は、腫瘍細胞抗原が、腫瘍溶解物または外因的に加えられたアポトーシス小体の形態で適用されるときに極めて重要である。本発明による抗原提示ｍｉＤＣ（ＡＰｍｉＤＣ）は、Ｔ細胞、好ましくはナイーブＴ細胞を活性化することが可能である。

本発明は、必要とする対象の免疫系を刺激するための組成物を提供し、該組成物は、細胞表面抗原を発現する本発明によるｍｉＤＣを含む。本発明は、免疫応答が抗体に基づく免疫応答ではなく主にＴ細胞に依存する、病原体および腫瘍に対して対象にワクチン接種をする手段および方法を提供する。本発明に従って、必要とする対象における抗原特異的免疫応答を引き出す際の、本発明によって提供されるｍｉＤＣの使用は、対象における免疫応答を誘導するのに十分な量の本発明のｍｉＤＣを、抗原提示細胞（ＡＰｍｉＤＣ）として、対象に投与することを含み、該ＡＰｍｉＤＣは、本明細書の他の場所で説明される抗原を発現する。本明細書では、そのような量を有効量と称する。

種々の実施形態において、本発明のｍｉＤＣは、１つ以上の抗原を負荷してもよい。
したがって、本発明のｍｉＤＣは、抗原を負荷した、または抗原をパルスしたｍｉＤＣを包含する。故に、これらの抗原をパルスしたｍｉＤＣまたは抗原を負荷したｍｉＤＣは、抗原提示ｍｉＤＣである。本発明は、そのような抗原提示ｍｉＤＣ（ＡＰｍｉＤＣ）を提供する。本明細書で使用される抗原を負荷したまたは抗原をパルスしたｍｉＤＣは、抗原に曝露した本発明のｍｉＤＣを含む。本発明のｍｉＤＣは、当技術分野で知られている多数の手法によって抗原を負荷することができる。一実施形態において、ｍｉＤＣは、ｍｉＤＣが抗原を取り込むこと、および抗原の処理を開始することを可能にするのに十分な時間にわたって、培養物中で抗原およびｍｉＤＣをインキュベート（「パルス」）することによって、可溶性抗原を負荷することができる。例えば、ｍｉＤＣは、３７℃で約１〜２時間、抗原をパルスしてもよい。例えば、Ｃｅｌｌｕｚｉ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３：２８３−７、Ｈｕ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５６：２４７９−２４８３を参照されたい。概して、本発明によるＡＰｍｉＤＣは、例えば、抗原の存在下での培養中に、インビトロで抗原を負荷した状態になり得る。ＡＰｍｉＤＣはまた、抗原への曝露によってインビボで負荷してもよい。本発明による「抗原を負荷したＡＰｍｉＤＣ」は、「抗原を負荷した抗原提示細胞（ＡＰＣ）」を調製する、以下の２つの既知の従来の方法に従って、調製されてもよい。すなわち、（１）抗原ペプチドとして知られるペプチド小断片を、ＡＰＣの外側に直接「パルス」すること、または（２）ＡＰＣを、ＡＰＣによって次いで摂取されるタンパク質全体またはタンパク質粒子とともにインキュベートすること、である。これらのタンパク質は、ＡＰＣによってペプチド小断片に消化され、ＡＰＣ表面に運搬されて、提示される。

ＡＰＣの抗原を負荷する、または抗原をパルスする、前述した既知の方法は、「抗原を負荷したＡＰｍｉＤＣ」または「抗原をパルスしたＡＰｍｉＤＣ」として使用するために、本発明によって提供されるｍｉＤＣの抗原を負荷する、または抗原をパルスするための本発明によって包含される。本発明による「抗原を負荷したＡＰｍｉＤＣ」または「抗原をパルスしたＡＰｍｉＤＣ」は、「抗原活性化ＡＰｍｉＤＣ」と称されてもよい。

さらに、米国特許第２００２／０１５５１０８で説明される、樹状細胞による抗原の免疫複合体媒介性の取り込みによって本発明によるｍｉＤＣの負荷が、本発明に包含される。樹状細胞による抗原の免疫複合体媒介性の取り込みに関する、対応する開示である米国特許第２００２／０１５５１０８号が、参照により本明細書に組み込まれる。

加えて、抗原を負荷したＡＰＣは、抗原をコードする核酸を細胞に導入することによって生成することもできる。本明細書で使用される、細胞表面抗原を発現するｍｉＤＣは、本発明による１つ以上の確認された抗原をそれぞれがコードする１つ以上の核酸構築体を事前に形質移入した、ｍｉＤＣである。種々の実施形態において、抗原をコードするＲＮＡは、例えば、電気穿孔法によって、またはカチオン性脂質の存在下でインキュベートし、次いで、ＲＮＡ−脂質複合体をｍｉＤＣと接触させることによって、ｍｉＤＣに送達されてもよい。例えば、Ｂｏｃｚｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８４：４６５−７２を参照されたい。他の実施形態では、抗原をコードするレトロウイルスベクターが、ｍｉＤＣに形質導入されてもよい。例えば、Ｓｚａｂｏｌｃｓ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｂｌｏｏｄ，９０：２１６０−７、Ａｓｈｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６：１１７７−８２を参照されたい。同様に、ｍｉＤＣを形質導入して、１つ以上の抗原を発現させて、提示するために、ＭＶＡベクター等の、アデノウイルスベクターまたはワクシニアウイルスベクターを、使用することができる。

種々の実施形態において、本発明によって提供されるｍｉＤＣは、ベクター、好ましくは、ウイルスベクター、より好ましくは、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを使用して遺伝子的に修飾してもよく、これは、ｍｉＤＣによる特異的タンパク質の発現を可能にする。ｍｉＤＣによって発現されるタンパク質は、次いで、処理して、ＭＨＣ受容体上の細胞表面に提示させることができる。修飾したｍｉＤＣは、次いで、本発明に従って、必要とする対象のタンパク質に対する耐性を誘導するために、免疫原性組成物または免疫療法剤として使用してもよい。種々の実施形態において、本発明によるｍｉＤＣを遺伝子的に修飾することは、本発明による抗原をコードする異種遺伝子をｍｉＤＣに導入するためのビヒクルとして、ウイルスベクターを使用することを含む。好ましくは、ウイルスベクターは、ＡＡＶベクターである。具体的には、ウイルスベクターは、少なくとも１つの異種遺伝子に操作可能に結合され、本発明による抗原をコードする。

したがって、種々の実施形態において、必要とする患者の免疫系を刺激するために使用されるｍｉＤＣは、少なくとも１つのウイルスベクター、好ましくは、ＡＡＶベクターを含むｍｉＤＣであり、該ベクターは、本発明による抗原をコードする遺伝子、サイトカインをコードする遺伝子、および１つ以上のこれらの遺伝子の組み合わせから成る群から選択される少なくとも１つの異種遺伝子を含み、それによって、異種遺伝子は、ｍｉＤＣ中に発現され、対象の免疫系は、対象のＴ細胞応答の刺激によって刺激される。

本明細書で使用される種々の方法は、ポリヌクレオチドを宿主細胞に形質移入するために使用することができる。該方法としては、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、粒子衝突、マイクロインジェクション、および電気穿孔法が挙げられるが、これらに限定されない。

本発明のｍｉＤＣは、抗原をコードする遺伝子を発現し、抗原を処理し、Ｔ細胞の初回刺激のための抗原エピトープとして、この抗原を提示する。しかし、サイトカインをコードする異種遺伝子を担持する、本発明の遺伝子的に変化させたｍｉＤＣであっても、ｍｉＤＣによるサイトカインの発現が基底レベルの腫瘍細胞認識を刺激して免疫応答を増強するので、サイトカイン治療による利益を得る、癌または他の疾患の治療に有用である。加えて、本発明によって同じく提供されるこれらの遺伝子的に変化させたｍｉＤＣは、患者自身のＴ細胞をインビボで刺激するのに有用であり、および／またはこれらの遺伝子的に変化させたｍｉＤＣは、Ｔ細胞をインビトロで刺激し、次いで、これらの初回刺激を受けたＴ細胞を、患者に投与して、養子免疫治療を介して患者の免疫系を刺激するのに有用である。

抗原を負荷した後に、前述したように遺伝子的に修飾したまたは遺伝子的に変化させたｍｉＤＣを含む、本発明のＡＰｍｉＤＣを、必要とする対象に投与することができる。種々の実施形態において、ＡＰｍｉＤＣは、生理学的緩衝液で洗浄し、必要とする対象に投与する前に生理学的緩衝液中に懸濁させてもよい。種々の実施形態では、１０^４個、１０^５個、１０^６個、１０^７個、１０^８個、または１０^９個のうちの少なくとも１つの数のＡＰｍｉＤＣを含む懸濁液が、当技術分野で知られている手法によって、必要とする対象に投与される。

抗原を発現する本発明のＡＰｍｉＤＣは、対象の体内に導入されてもよく、そこで、該ＡＰｍｉＤＣは、リンパ系組織（リンパ節または脾臓等）に移動し、高い細胞質レベルの免疫原性抗原を産生する。ＡＰｍｉＤＣがリンパ性組織内で死ぬときに、抗原は、交差−初回刺激を介してＴ細胞免疫を効率的に誘導する。

種々の実施形態において、ＡＰｍｉＤＣの調製物は、宿主から得られるｍｉＤＣを使用することと、そのように得られるｍｉＤＣに１つ以上の抗原を負荷することと、そのように調製されるＡＰｍｉＤＣを、１つ以上の抗原を負荷するｍｉＤＣが得られた宿主中に再導入（投与）することとを含む。ここで、宿主は、その免疫系を刺激することを必要とする対象である。

種々の実施形態において、ｍｉＤＣは、活性化したまたは不活性化した状態で必要とする対象に投与することができる。種々の実施形態において、必要とする対象に投与されるｍｉＤＣは、サイトカインおよび／または本発明によるパターン認識受容体によって認識されるリガンドによって、さらに活性化されてもよい。

本発明に従って、必要とする対象における抗原特異的免疫応答を引き出す際に、本発明によって提供されるｍｉＤＣの使用は、Ｔ細胞応答を誘導する既知の方法に勝る、いくつかの利点を提供する。

本発明の免疫療法剤および組成物は、対象の免疫系を刺激するために、対象（例えば、ヒト）に投与することができる。この対象は、感染疾患による免疫刺激、または癌疾患による、もしくは癌疾患を発達させる素因による、感染疾患に対する感受性を必要とし得る。好ましくは、感染疾患は、ウイルス感染、細菌感染、寄生虫感染症、および真菌感染のうちの少なくとも１つである。

本発明によるＡＰｍｉＤＣによる免疫系の刺激は、細胞表面抗原の異常な発現を特徴とする感染疾患または癌に対する対象の免疫の増強をもたらす。異常な発現とは、細胞表面抗原が、（ｉ）正常組織中では発現しないこと、（ｉｉ）所与の組織型の疾患細胞において、同じ型の正常細胞よりも非常に高いレベルで発現すること、または（ｉｉｉ）所与の組織型の疾患細胞において、同じ型の正常細胞とは異なって修飾（例えば、リン酸化）されること、を意味する。免疫の増強は、免疫系の細胞媒介もしくは体液機能、または双方の増強を伴う。

本明細書で使用される抗原は、ウイルス感染もしくは癌、好ましくは、ウイルス感染、細菌感染、真菌感染、または寄生虫感染から選択される疾患に関連する、自己抗原または抗原であってもよい。抗原は、必要とする対象の薬理学的または生物学的効果を達成するために、外因的に産生される治療用タンパク質であってもよい。

種々の実施形態において、ＡＰｍｉＤＣとして使用される本発明のｍｉＤＣは、多数のウイルス抗原を提示する。種々の実施形態において、ＡＰｍｉＤＣとして使用される本発明のｍｉＤＣは、多数の細菌抗原を提示する。種々の実施形態において、ＡＰｍｉＤＣとして使用される本発明のｍｉＤＣは、多数の真菌抗原を提示する。種々の実施形態において、ＡＰｍｉＤＣとして使用される本発明のｍｉＤＣは、多数の寄生虫抗原を提示する。種々の実施形態において、ＡＰｍｉＤＣとして使用される本発明のｍｉＤＣは、多数の腫瘍抗原を提示する。

種々の実施形態において、ＡＰｍｉＤＣとして使用される本発明のｍｉＤＣは、本発明による１つ以上の抗原をｍｉＤＣに負荷する前に、任意のサイトカインの有無に関わらず、成長培地においてエクスビボで培養される。種々の実施形態において、ＡＰｍｉＤＣとして使用される本発明のｍｉＤＣは、抗原を負荷した後に、成熟因子によって熟成する。

種々の実施形態において、抗原は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）である。ＴＡＡには２つの主要な型がある。すなわち、極めて少数の腫瘍にだけ存在し、したがって、一般的な標的としては有用でない一意の抗原、および数多くの腫瘍に存在する一般的なＴＡＡである。３つの主要な共有抗原群、すなわち、癌／精巣抗原（ＣＴ抗原）、腫瘍過剰発現した抗原、および系統特異的分化抗原は、免疫治療の潜在的な標的であり、全てが、胞毒性Ｔリンパ球の生成を誘導することを示した。これらの３つの抗原群は、本発明によって包含される。

ＣＴ抗原は、癌または生殖系列特異的遺伝子によってコードされ、最も大きい共通腫瘍関連群の１つを表す。ＣＴ抗原は、最初は黒色腫において発見されたが、数多くの他のヒト悪性腫瘍においても発見された。正常組織の中で、ＣＴ抗原は、精巣において、および一部の例では胎盤においてだけしか発現しない。これらの抗原を発現する正常細胞は、ＭＨＣ分子の発現が不十分であり、したがって、これらの抗原は、通常、Ｔリンパ球による認識には利用できない。これは、ＣＴ抗原を、特異的な癌免疫治療の非常に魅力的な目標としている。数多くのＣＴ抗原を、いくつかのメンバーを含むサブファミリーに分類することができる。そのようなサブファミリーは、ＭＡＧＥ−Ａ、ＭＡＧＥ−Ｂ、ＭＡＧＥ−Ｃ、ＧＡＧＥ、ＬＡＧＥ、およびＳＳＸサブファミリーである。他の抗原については、これまで、１つの個別メンバーだけしか発見されていない。そのような抗原は、ＢＡＧＥ、ＳＣＰ−１、ＴＳＰ−５０、ＴＲＡＧ−３、ＳＡＧＥ、ＩＬ−１３Ｒアルファ、ＣＴ９、およびＣＴｐ１１抗原である。これらのＣＴ抗原のそれぞれは、本発明の目的に従った免疫療法のための潜在的な標的として使用されてもよい。故に、種々の実施形態において、抗原は、ＭＡＧＥ−Ａ、ＭＡＧＥ−Ｂ、ＭＡＧＥ−Ｃ、ＧＡＧＥ、ＬＡＧＥ、およびＳＳＸサブファミリーから選択される。種々の他の実施形態において、ＣＴ抗原は、ＳＣＰ−１、ＴＳＰ−５０、ＴＲＡＧ−３、ＳＡＧＥ、ＩＬ−１３Ｒアルファ、およびＣＴｐ１１から選択される抗原を含む。

黒色腫細胞に基づく組成物または本発明によるワクチンを用いるための１つの条件は、宿主中に、疾患の進行した段階の悪性腫瘍が存在することである。別の条件は、原発腫瘍が存在することであり得、この場合、治療の目的は、原発腫瘍の拒絶反応を誘導するだけでなく、転移の進行も予防することであるが、その理由は、一群のＣＴ抗原の大部分が、転位の際に発現するからである。さらに別の条件は、他の手段（例えば、手術、照射）によって原発腫瘍または転移性腫瘍を除去することであり得、この場合、治療の目的は、腫瘍再発の予防である。

いくつかのＣＴ抗原を発現する腫瘍は、いかなるＣＴ抗原も有しないか、または１つだけしか有しない腫瘍よりも、拒絶されるかまたは成長が制限される可能性が高くなる。したがって、腫瘍生検におけるＣＴ抗原の発現の判定は、広範な黒色腫細胞に基づくワクチンを用いる有効性を予測する際に重要になり得る。

本発明に従う腫瘍を過剰発現した抗原は、ＣＥＡ、ｐ５３、ＨＥＲ−２／Ｎｅｕ、ＭＵＣ−１、およびアルファ−フェトプロテイン等の抗原を含む。

本発明に従う系統特異的抗原は、メラニン形成細胞分化抗原ｇｐI００、Ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、ＭＣ１Ｒ、ＡＩＭ−１、ならびに前立腺関連抗原ＰＳＡ（前立腺特異的抗原）、ＰＳＭＡ（前立腺特異的膜抗原）、ＰＡＰ（前立腺関連ホスファターゼ）およびＰＳＣＡ（前立腺幹細胞抗原）を含む。本発明によって包含される腫瘍抗原は、ＷＯ０２／０６１１１３、ＷＯ０３／０２５００２、ＷＯ０３／０２４９９４、ＷＯ０３／０２４３０４およびＷＯ０３／０２４３０２でさらに詳細に論じられている。

本発明の目的はまた、感染疾患または癌に罹患している対象におけるｍｉＤＣのレベルを増加させるための方法でもあり得、該方法は、Ｆｌｔ３−リガンド（ＦＬ）またはＭ−ＣＳＦ受容体リガンドを、必要とする対象に投与することを含む。換言すれば、本発明は、感染疾患または癌に罹患している対象におけるｍｉＤＣのレベルを増加させる際に使用するための、ＦＬまたはＭ−ＣＳＦ受容体リガンドを提供し得る。ＦＬまたはＭ−ＣＳＦ受容体リガンドは、対象における本発明によるｍｉＤＣのレベルを増加させるのに十分または有効な投薬量または量で該対象に投与されてもよい。Ｍ−ＣＳＦ受容体リガンドは、Ｍ−ＣＳＦまたはＩＬ−３４であってもよい。感染疾患または癌に罹患している対象におけるｍｉＤＣのレベルを増加させるための方法では、ＦＬまたはＭ−ＣＳＦ受容体リガンドに加えて、本発明による核酸またはその類似体が対象に投与されてもよい。本発明による核酸またはその類似体の該付加的な投与は、感染疾患または癌に罹患している対象におけるＩＦＮ−αの産生を刺激し得る。

本発明は、ｍｉＤＣの集団におけるＩＦＮ−αの産生を誘導するための方法をさらに提供し、該方法は、ｍｉＤＣを、病原体関連ＰＲＲによって認識されるリガンド、好ましくは、本発明による核酸またはその類似体とエクスビボで接触させることを含む。具体的には、エクスビボでのＩＦＮ−αの該産生を誘導するために、ｍｉＤＣを病原体関連ＰＲＲによって認識される適切なリガンドと接触させる前に、該ｍｉＤＣを対象から得る。本発明によるｍｉＤＣの集団におけるＩＦＮ−αの産生を誘導するための方法において、ｍｉＤＣが得られる対象は、好ましくは、大量のＩＦＮ−αを産生するように誘導されるｍｉＤＣによる治療を必要とする対象である。したがって、この対象は、感染疾患、好ましくは、ウイルス感染または癌の予防および／もしくは治療を必要とする対象であってもよい。より好ましくは、ｍｉＤＣは、持続性ウイルス感染、より好ましくは、肝臓のウイルス感染またはヘルペスウイルス感染、さらに好ましくは、肝炎ウイルス感染に罹患している対象から得てもよい。病原体関連ＰＲＲによって認識されるリガンド、好ましくは、本発明による核酸またはその類似体とのエクスビボでのインキュベーションに続いて、ｍｉＤＣを採取し、治療のために、すなわち、ｍｉＤＣが得られた対象に再導入するために、適切な倍地中に再懸濁させる。したがって、本発明によるｍｉＤＣの集団におけるＩＦＮ−αの産生を誘導するための方法において、ｍｉＤＣは、好ましくは、自己ｍｉＤＣである。必要とする対象への再導入は、例えば、静脈内注射等の、数多くの一般的に知られている手法によって行われてもよい。さらに、ＩＦＮ−αの産生のために誘導されるｍｉＤＣの集団は、種々の薬学的製剤中に再導入されてもよい。したがって、本発明は、本発明によるｍｉＤＣの集団におけるＩＦＮ−αの産生を誘導するための方法によって得ることができるＩＦＮ−α産生ｍｉＤＣの集団、ならびに該ＩＦＮ−α産生ｍｉＤＣの集団を含む医薬組成物を提供する。

本明細書で使用される感染疾患は、好ましくはウイルス感染である。より好ましくは、本発明による全ての治療応用において、ウイルス感染は、持続性ウイルス感染である。さらに好ましくは、持続性ウイルス感染は、肝臓のウイルス感染またはヘルペスウイルス感染である。具体的には、好ましい実施形態において、該肝臓のウイルス感染は、肝炎ウイルス感染である。故に、必要とする対象の感染疾患または癌の予防および／もしくは治療のための方法において、好ましくは、ウイルス感染は、持続性ウイルス感染であり、より好ましくは、肝臓のウイルス感染またはヘルペスウイルス感染であり、さらに好ましくは、肝炎ウイルス感染である。本発明において、肝炎ウイルス感染は、Ａ型肝炎ウイルス感染、Ｂ型肝炎ウイルス感染、Ｃ型肝炎ウイルス感染、Ｄ型肝炎ウイルス感染、およびＥ型肝炎ウイルス感染を含み、肝炎ウイルス感染は、好ましくは、Ｃ型肝炎ウイルス感染である。別の好ましい実施形態において、本発明において、持続性ウイルス感染は、レトロウイルス感染である。

本発明による対象としては、動物およびヒトが挙げられる。本発明に従って、「対象」は、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、サル、ラット、およびマウスを含む、ヒトまたは脊椎動物を意味するものとする。本発明による種々の実施形態において、対象は、好ましくはヒトである。

種々の本発明の好ましい実施形態において、癌に罹患している対象は、腫瘍疾患に罹患している対象である。好ましくは、腫瘍疾患は、癌腫、すなわち、対象の上皮細胞または上皮組織の癌または腫瘍である。好ましくは、癌腫は、扁平上皮細胞癌腫または腺癌腫である。より好ましくは、癌腫は、扁平上皮細胞肺癌である。前述した方法および治療応用において、本発明による核酸またはその類似体は、単独で、または１つ以上の他の抗癌または抗腫瘍治療用途および方法と組み合わせて使用することができ、そのような治療用途および方法は、好ましくは、抗腫瘍化学療法および免疫療法から選択される。したがって、本発明によるｍｉＤＣを標的とする、本発明による核酸またはその類似体、すなわち、ｍｉＤＣにおけるＩＦＮ−αの産生を刺激または誘導することが可能である核酸は、以降の化学療法または免疫療法に対する悪性細胞の反応性を増加させるために、化学療法または免疫療法の投与前に、投与とともに、または投与後に投与することができる。

また、対象におけるＩＦＮ−αの産生のための方法も本発明によって提供され、該方法は、本発明によるｍｉＤＣを標的とする、本発明による核酸またはその類似体を該対象に投与することを含む。

本発明は、ｍｉＤＣを標的とする核酸またはその類似体、および核酸に基づくＩＦＮ−αの産生を増強するリガンドを含む、組み合わせ調製物を提供し得る。核酸に基づくＩＦＮ−αの産生を増強するリガンドは、Ｆｌｔ３−リガンド、Ｍ−ＣＳＦ受容体リガンド、ＴＬＲ２リガンド、ＴＬＲ４リガンド、ＴＬＲ９リガンド、ＴＬＲ１０リガンド、ＴＬＲ１１リガンド、ＩＬ−３、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、またはＩＦＮ−γであってもよい。

本発明は、ＩＦＮ−αを産生するための、および／またはＩＦＮ−α産生ｍｉＤＣの集団を生成もしくは得るための方法を提供し、該方法は、（ａ）本発明によるｍｉＤＣを含む細胞の集団を提供することと、（ｂ）ｍｉＤＣを、本明細書で説明される病原体関連ＰＲＲ、好ましくは、本明細書による核酸またはその類似体によって認識されるリガンドと接触させることと、を含む。ｍｉＤＣを病原体関連ＰＲＲによって認識されるリガンドと接触させることは、ｍｉＤＣにおけるＩＦＮ−αの産生を刺激する。

種々の好ましい実施形態において、前述した方法は、病原体関連ＰＲＲによって認識されるリガンドで刺激されるｍｉＤＣによって産生されるＩＦＮ−αを確認および／または検出するステップをさらに含む。種々の好ましい実施形態において、前述した方法は、ｍｉＤＣによって産生されるＩＦＮ−αを単離および／または分離するステップをさらに含む。他の好適な実施態様において、前述した方法は、ＩＦＮ−α産生ｍｉＤＣを確認、および／もしくは単離、ならびに／または分離するステップをさらに含む。

本発明によるｍｉＤＣによって産生されるＩＦＮ−αは、当技術分野でよく知られている手法によって検出して数量化することができる。本発明に従ってｍｉＤＣによって産生されるＩＦＮ−αは、従来の生化学的手法によって採集、単離、および精製することもできる。

ＩＦＮ−αを産生するための、および／またはＩＦＮ−α産生ｍｉＤＣの集団を生成もしくは得るための前述した方法の好ましい実施形態において、細胞の集団は、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、および９９％のうちの１つの割合を超える本発明によるｍｉＤＣを含む。

本発明は、ＩＦＮ−α産生ｍｉＤＣの集団を生成または得るための前述した方法によって得ることが可能な、本発明によるＩＦＮ−α産生ｍｉＤＣの集団またはＩＦＮ−α産生ｍｉＤＣの細胞系を提供する。

本発明は、本発明に従ってＡＰｍｉＤＣを生成するために抗原をコードするｃＤＮＡをｍｉＤＣ中に導入する、例えば、１つ以上の所望の抗原をコードする核酸をｍｉＤＣに形質移入するのに有用である、キットをさらに提供する。例えば、１つ以上の抗原をｍｉＤＣに形質移入するのに有用であるキットは、適切な量の１つ以上の抗原、ならびに、随意に、形質移入を行うのに有用な任意の試薬を含む。種々の実施形態において、本キットは、さらに、キットを使用するための説明書、および／または本発明のｍｉＤＣの凍結アリコートを含む。

したがって、種々の実施形態において、本発明は、１つ以上の抗原の容器（単回使用または複数回使用に十分な量）と、１つ以上の抗原を、例えば、形質移入によって、ｍｉＤＣ中に導入するための説明書とを、含むキットを提供する。説明書は、文書の形態とすることができ、またはディスケットもしくはＣＤ−ＲＯＭ等の電子形式で提供することができる。説明書は、ビデオカセットの形態で提供することもできる。

本開示のさらなる実施形態は、対象におけるＴ細胞の応答を誘導するのに有用なキットを含む。例えば、対象におけるＴ細胞の応答を誘導するのに有用なキットは、本明細書で説明される１つ以上の抗原を形質移入した適切な量のｍｉＤＣ、ならびに、随意に、該キットを使用するための任意の説明書を含む。

本発明による治療応用において、ｍｉＤＣは、１ｍＬあたり約０．０１〜約５×１０^６個の細胞濃度で、適切な希釈剤中に懸濁させることができる。注射溶液のための好適な賦形剤は、緩衝食塩溶液または他の好適な賦形剤等の、ｍｉＤＣおよびレシピエントと生物学的および生理学的と適合するものである。任意の医薬組成物およびワクチンを含む、本発明による投与のための組成物は、適切な無菌性および安定性に適合する標準的な方法に従って調合、産生、および貯蔵することができる。

本明細書で使用される、本発明によるＡＰｍｉＤＣを含む、投与されるｍｉＤＣの投薬量（すなわち、有効量）は、広範な限度範囲内で変動し、また、各具体的事例において、対象／レシピエントに関する特定の要件に対して調整されてもよい。使用される細胞の数は、対象／レシピエントの重量および状態、投与の数および／または頻度、ならびに当業者に知られている他の変数に依存する。

１００ｋｇの体重あたり約１０^２個〜約１０^１３個のｍｉＤＣを、必要とする対象に投与することができる。種々の実施形態では、１００ｋｇの体重あたり約１．５×１０^６個〜約１．５×１０^１２個の細胞が投与される。種々の他の実施形態では、１００ｋｇの体重あたり約１×１０^９個〜５×１０^１１個の細胞が投与される。種々の他の実施形態では、１００ｋｇの体重あたり約４×１０^９個〜２×１０^１１個の細胞が投与される。種々の他の実施形態では、１００ｋｇの体重あたり約５×１０^８個〜１×１０^１0個の細胞が投与される。

本明細書で使用される交差−初回刺激は、末梢におけるアポトーシス細胞または死細胞からの外因性抗原の獲得、および二次リンパ器官への移動を伴う、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の特異的能力であり、ＡＰＣ、例えば、樹状細胞は、アポトーシスを受けて、二次ＡＰＣによって取り込まれる。これらのＡＰＣは、抗原を再処理して、それをＴ細胞に提示する。ワクチン接種の目的で、抗原を、（例えば、形質移入または注射によって）抗原提示細胞（ＡＰＣ）、例えば、樹状細胞に直接に導入して、細胞が脾臓またはリンパ節に移動するのを可能にすることによって、経路の一部をバイパスすることができる。二次ＡＰＣは、瀕死の一次ＡＰＣを食菌して、抗原をＴ細胞に提示する（検討のため、Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，「Ｃｕｒｒｅｎｔ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｌｏａｄｉｎｇ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｔｕｍｏｒ ａｎｔｉｇｅｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｉｍｍｕｎｉｔｙ」，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２５（４）：２８９−３０３，２００２を参照されたい）。

本発明に従う「有効量」という用語は、特に医学的および／または生物学的な、所望の効果を実現する、または有益なもしくは所望の結果を達成するのに必要なまたは十分な量を指す。有効量は、１回以上の投与、適用、または投薬で投与することができる。有効量は、単独で、または他の薬剤（他の抗感染剤または抗悪性腫瘍化学療法剤等）との組み合わせで有効である量とすることができる。

本明細書で使用される免疫応答は、刺激物に対するＢ細胞、Ｔ細胞、または単球等の免疫系の細胞の応答である。種々の実施形態において、応答は、特定の抗原に特異的である（「抗原特異的応答」）。免疫応答は、体液性応答（抗体応答またはＢ細胞応答）または細胞性（細胞媒介性応答またはＴ細胞応答）であり得る。種々の実施形態において、免疫応答は、ＣＤ４^＋Ｔ細胞応答またはＣＤ８^＋Ｔ細胞応答等のＴ細胞応答である。

本明細書で使用される医薬組成物または薬剤は、対象または細胞に適切に投与したときに、所望の治療的または予防的効果を誘導することが可能な組成物である。

本発明の医薬組成物は、薬学的に許容される担体または薬学的に許容されるアジュバントを含んでもよい。本明細書で使用される「薬学的に許容される希釈剤または担体」という用語は、薬剤の活性化合物と同時に投与することができ、活性化合物がその意図する機能を行うことを可能にする物質を含むことを意図している。そのような担体の例としては、溶液、溶媒、分散培、遅延剤、エマルジョン等が挙げられる。薬学的に活性な物質のためのそのような培地の使用は、当技術分野でよく知られている。本発明での使用に好適な任意の他の従来の担体が、本発明の範囲に含まれる。したがって、この開示において有用な薬学的に許容される担体およびアジュバントは、従来のものである。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ´ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ｂｙ Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９７５）は、薬学的送達に好適な組成物および製剤を説明している。概して、担体の性質は、用いられている特定の投与様式に依存する。例えば、非経口製剤は、通常、ビヒクルとして、水、生理食塩水、平衡塩類溶液、水性デキストロース、グリセロール等の薬学的および生理学的に許容される流体を含む、注射可能な流体を含む。固体組成物（例えば、粉末、錠剤、タブレットまたはカプセル形態）の場合、従来の非毒性固体担体は、例えば、薬学的等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、またはステアリン酸マグネシウムを含むことができる。生物学的に中性の担体に加えて、投与される医薬組成物は、少量の、湿潤剤もしくは乳化剤、防腐剤、およびｐＨ緩衝剤等の非毒性補助物質、例えば、酢酸ナトリウムまたはソルビタンモノラウレートを含有することができる。

本発明による腫瘍の例としては、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨性肉腫、骨原性肉種および他の肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌腫、リンパ性悪性腫瘍、膵臓癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、肝臓癌腫、偏平上皮細胞癌腫、基底細胞癌腫、腺癌腫、汗腺癌腫、皮脂腺癌腫、乳頭状癌腫、乳頭状腺癌腫、髄様癌腫、気管支原性癌腫、腎細胞癌腫、肝臓癌、胆管癌腫、絨毛癌腫、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、膀胱癌腫、ならびにＣＮＳ腫瘍（神経膠腫、星状腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起腫、髄膜腫（ｍｅｎａｎｇｉｏｍａ）、黒色腫、神経芽腫、および網膜芽腫等）が挙げられるが、これらに限定されない、肉腫および癌腫が挙げられる。

本明細書で使用される「癌抗原」という用語は、癌を担持している個体の正常細胞とは対照的に、主としてまたは全体的に癌細胞によって発現される、抗原分子を意味する。「癌抗原」および「腫瘍抗原」という用語は、本明細書では同じ意味で使用される。

本明細書で使用される、病原体関連ＰＲＲは、細胞表面、エンドソーム、および細胞質内病原体関連ＰＲＲのうちの少なくとも１つであってもよい。

本明細書で使用される「ｄｓ」という用語は、「２本鎖」および「２本鎖の」という用語について、それぞれ、等しく使用される。同様に、「ｓｓ」という用語は、「１本鎖」および「１本鎖の」という用語について、等しく使用される。

ポリＩＣは、一方の鎖がイノシン酸のポリマーであり、もう一方がシチジル酸のポリマーである、ミスマッチｄｓＲＮＡである。ポリＩＣは、合成２本鎖ＲＮＡであり、したがって、ｄｓＲＮＡの合成類似体とみなすことができる。ポリＩＣは、免疫系に関する科学研究のための一般的なツールである。好ましい実施形態において、本発明による核酸またはその類似体は、ポリＩＣである。しかしながら、核酸のさらなる合成類似体は、本発明によれば、例えば、合成ｄｓＲＮＡであり、ＴＬＲ３を介して排他的にシグナリングする、ポリアデニル酸−ポリウリジル酸（ポリＡＵ）と等しく好適である。同様に、カルボキシメチルセルロースおよびポリＬ−リシンと複合体化したポリＩＣである、ポリ（ＩＣＬＣ）、またはリポソームと複合体化したポリ（ｄＡ−ｄＴ）^＊ｐｏｌｙ（ｄＡ：ｄＴ）の合成ｄｓＤＮＡである、ポリ（ｄＡ：ｄＴ）も等しく好適である。
なお、本願は特許請求の範囲に記載の発明に関するものであるが、他の態様として以下も包含し得る：
１．免疫療法剤を調製するための方法であって、（ａ）ＣＤ１１ｂ ^−／ｌｏ およびＣＤ１７２ ^＋ （Ｓｉｒｐα）である、ＩＦＮ−α産生骨髄由来の非形質細胞様樹状細胞（非ｐＤＣ）を提供するステップと、（ｂ）１つ以上の抗原をステップ（ａ）の前記非ｐＤＣに負荷するように、前記非ｐＤＣをエクスビボで修飾するステップと、を含む、方法。
２．前記非ｐＤＣをエクスビボで修飾する前記ステップは、（ｉ）前記１つ以上の抗原および前記樹状細胞を培養物中でインキュベートすること、（ｉｉ）前記樹状細胞による前記１つ以上の抗原の免疫複合体媒介性の取り込み、（ｉｉｉ）前記１つ以上の抗原の存在下での前記細胞の電気穿孔、（ｉｖ）前記１つ以上の抗原のウイルス形質導入、ならびに（ｖ）前記１つ以上の抗原をコードするｍＲＮＡまたはＤＮＡのリポフェクションまたは形質移入、から成る群から選択される、上記１に記載の方法。
３．前記抗原は、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原、寄生虫抗原、または腫瘍抗原である、上記１または２に記載の方法。
４．上記１〜３のいずれか１項に記載の方法によって得られる前記免疫療法剤を含み、任意で薬学的に許容される担体または希釈剤をさらに含む、医薬組成物。
５．上記１〜３のいずれか１つに記載の方法によって得られる前記免疫療法剤を含み、任意で薬学的に許容されるアジュバントをさらに含む、ワクチン。
６．対象における抗原特異的免疫応答を引き出す際に使用するための、上記１〜３のいずれか１項に記載の方法によって得られる前記免疫療法剤を含む、調製物。
７．患者は、感染疾患または癌に罹患している、上記６に記載の調製物。
８．前記感染疾患は、ウイルス感染、細菌感染、寄生虫感染、または真菌感染である、上記７に記載の調製物。
９．前記抗原特異的免疫応答は、抗原特異的Ｔ細胞刺激、好ましくは、ナイーブＴ細胞の抗原特異的刺激である、上記６〜８のいずれか１項に記載の調製物。
１０．骨髄の感染疾患または骨髄癌に罹患している対象を治療する際に使用するための、ＣＤ１１ｂ ^−／ｌｏ およびＣＤ１７２ ^＋ （Ｓｉｒｐα）である非形質細胞様樹状細胞（非ｐＤＣ）におけるＩＦＮ−αの産生を誘導するパターン認識受容体によって認識されるリガンドであって、前記ＩＦＮ−α誘導リガンドは、前記対象の骨髄に投与されるものである、リガンド。
１１．前記感染疾患は、骨髄のウイルス感染、細菌感染、寄生虫感染、または真菌感染、好ましくは、骨髄のウイルス感染である、上記１０に記載のリガンド。
１２．ＣＤ１１ｂ ^−／ｌｏ およびＣＤ１７２ ^＋ （Ｓｉｒｐα）である骨髄由来の非形質細胞様樹状細胞（非ｐＤＣ）を、前記非ｐＤＣにおけるＩＦＮ−αの産生を誘導するパターン認識受容体によって認識されるリガンドとエクスビボで接触させることを含む、ＣＤ１１ｂ ^−／ｌｏ およびＣＤ１７２ ^＋ （Ｓｉｒｐα）である非ｐＤＣの集団において、ＩＦＮ−αの産生を誘導するための方法。
１３．ＩＦＮ−α産生非形質細胞様樹状細胞（非ｐＤＣ）を単離、検出、またはスクリーニングするための、インビトロ方法であって、
（ａ）ＣＤ１１ｂ ^−／ｌｏ およびＣＤ１７２ ^＋ （Ｓｉｒｐα）である骨髄由来の非ｐＤＣの集団を提供するステップと、
（ｂ）前記非ｐＤＣにおけるＩＦＮ−αの産生を刺激または誘導するパターン認識受容体によって認識されるリガンドで、前記ステップ（ａ）の細胞集団におけるＩＦＮ−αの産生を刺激または誘導した後に、ＩＦＮ−αの産生を検出するステップと、
を含む、方法。
１４．ＣＤ１１ｂ ^−／ｌｏ およびＣＤ１７２ ^＋ （Ｓｉｒｐα）である、ＩＦＮ−α産生骨髄由来の非形質細胞様樹状細胞（非ｐＤＣ）。
１５．ＣＤ１１ｂ ^−／ｌｏ 、ＣＤ１７２ ^＋ （Ｓｉｒｐα）、およびＣＤ４５ＲＡ ⁻ である、上記１４に記載の細胞。
１６．感染疾患または癌に罹患している対象を治療する際に使用するための、上記１４または１５に記載の細胞。
１７．前記感染疾患は、ウイルス感染、細菌感染、寄生虫感染、または真菌感染、好ましくは、ウイルス感染である、上記１６に記載の細胞。
１８．前記細胞は、前記対象への投与の前に、前記細胞におけるＩＦＮ−αの産生を誘導するパターン認識受容体によって認識されるリガンドとエクスビボで接触させられる、上記１６または１７に記載の細胞。
１９．前記パターン認識受容体は、病原体関連パターン認識受容体である、上記１０もしくは１１に記載のリガンド、上記１２もしくは１３に記載の方法、または上記１８に記載の細胞。
２０．前記病原体関連パターン認識受容体は、細胞表面、エンドソーム、および／または細胞質内病原体関連パターン認識受容体である、上記１９に記載のリガンド、上記１９に記載の方法のいずれか、または上記１９に記載の細胞。
２１．前記リガンドは、ＴＬＲ３リガンド、ＴＬＲ７リガンド、ＴＬＲ８リガンド、またはＴＬＲ９リガンドである、上記２０に記載のリガンド、上記２０に記載の方法のいずれか、または上記２０に記載の細胞。
２２．前記非形質細胞様樹状細胞（非ｐＤＣ）は、ＣＤ１１ｂ ^−／ｌｏ 、ＣＤ１７２ ^＋ （Ｓｉｒｐα）、およびＣＤ４５ＲＡ ⁻ である、上記１〜３、１２、１３のいずれか１項に記載の方法、または上記１０もしくは１１に記載のリガンド。

ＢＭにおいてＣｐＧ−ＯＤＮに応答して産生されるＩＦＮ−αが低密度細胞に由来することを示す図である。ＢＭ細胞は、１０ｍＬ、１．０７７ｇ／ｃｍ^３のＮｙｃｏｄｅｎｚ（登録商標）勾配上で分離させて、「軽」細胞（上部６ｍＬ以内）および「重」細胞（底部４ｍＬ）を採集した。細胞は、Ａ型ＯＤＮ ＣｐＧ−２２１６（黒色の棒）、またはＢ型ＯＤＮ ＣｐＧ−１６６８（透明な棒）で刺激し、上清をＩＦＮ−α産生について試験した。データは、２件の別々の実験を代表する、１件の実験によるものである。エラーバーは、重複試料間のＳＤを表す。 非ｐＤＣのＣＤ１１ｃ^＋ＣＤ４５ＲＡ⁻ＢＭ細胞が、ＣｐＧ−２２１６に応答して、高レベルのＩＦＮ−αも産生することを示す図である。ＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ１１ｃで染色した低密度細胞を示す図である。２Ａは、２件の実験を代表している。 非ｐＤＣのＣＤ１１ｃ^＋ＣＤ４５ＲＡ⁻ＢＭ細胞が、ＣｐＧ−２２１６に応答して、高レベルのＩＦＮ−αも産生することを示す図である。ＣＤ３^＋、ＣＤ１９^＋、ＣＤ４９ｂ^＋細胞を枯渇させた、２Ａの枠で囲まれた細胞の表面表現型（塗りつぶした黒色の線）を、ｐＤＣの表面表現型（塗りつぶされていない黒色の線）と比較した図である。染色されなかった細胞は、黒色の点線で示す。２Ｂは、３件の実験を代表している。 非ｐＤＣのＣＤ１１ｃ^＋ＣＤ４５ＲＡ⁻ＢＭ細胞が、ＣｐＧ−２２１６に応答して、高レベルのＩＦＮ−αも産生することを示す図である。ＣＤ２４およびＣＤ１１ｂで共染色した２Ｂの非ｐＤＣ細胞を示す図である。全てのＩＦＮ−αの産生は、枠で囲まれて示されるＣＤ２４^ｉｎｔＣＤ１１ｂ⁻細胞で生じた。ＣｐＧ２２１６に応答した該細胞のＩＦＮ−αの産生を示し（黒色の棒）、ＢＭのｐＤＣ（透明な棒）と比較する。２Ｃは、１０件を超える実験を代表している。 非ｐＤＣのＣＤ１１ｃ^＋ＣＤ４５ＲＡ⁻ＢＭ細胞が、ＣｐＧ−２２１６に応答して、高レベルのＩＦＮ−αも産生することを示す図である。ＣＤ１１ｃおよびＣＤ２４に関して、ＩＦＮ−αを産生する細胞の表現型を示す、ＣＤ１１ｂ⁻細胞上にゲートした２Ｂの低密度細胞を示す図である。２Ｄは、１０件を超える実験を代表している。 非ｐＤＣのＣＤ１１ｃ^＋ＣＤ４５ＲＡ⁻ＢＭ細胞が、ＣｐＧ−２２１６に応答して、高レベルのＩＦＮ−αも産生することを示す図である。単独培地中、ＧＭ−ＣＳＦ、またはＣｐＧ−２２１６中で一晩インキュベーションした後の、ｐＤＣ（２Ｄの上側の枠）および２Ｄにおいて枠で囲まれたＩＦＮ−αを産生するＣＤ４５ＲＡ⁻細胞の形態の比較を示す図である。２Ｅは、１０件を超える実験を代表している。 非ｐＤＣのＣＤ１１ｃ^＋ＣＤ４５ＲＡ⁻ＢＭ細胞が、ＣｐＧ−２２１６に応答して、高レベルのＩＦＮ−αも産生することを示す図である。２Ｄにおいて枠で囲まれたＩＦＮ−αを産生するＣＤ４５ＲＡ⁻細胞の表現型を、塗りつぶした黒色の線で示した図である。黒色の点線は、染色されなかったバックグラウンド対照を示す。黒色の線は、ｐＤＣを示す。２Ｆは、２件の実験を代表している。 複数のＴＬＲリガンドに対するサイトカインの産生に応答するＣＤ１１ｃ^＋ＣＤ２４^ｉｎｔＣＤ１１ｂ⁻細胞を表す図である。選別して、示されるＴＬＲリガンド、ＭＶＡ、またはＧＭ−ＣＳＦで刺激した、ＣＤ１１ｃ^＋ＣＤ２４^ｉｎｔＣＤ１１ｂ⁻およびＣＤ１１ｃ^＋ＣＤ２４^ｉｎｔＣＤ１１ｂ^＋ＢＭ細胞を示す図である。上清は、ＩＦＮ−αの産生についてＥＬＩＳＡによって試験した。エラーバーは、重複試料のＳＤを表す。ＣＤ１１ｂ⁻細胞のデータは、５件を超える実験を代表している。ＣＤ１１ｂ^＋細胞のデータは、２件の実験を代表している。 複数のＴＬＲリガンドに対するサイトカインの産生に応答するＣＤ１１ｃ^＋ＣＤ２４^ｉｎｔＣＤ１１ｂ⁻細胞を表す図である。示された刺激物によって測定した、ＩＬ−６およびＴＮＦの産生を示す図である。 複数のＴＬＲリガンドに対する表面活性化に応答するＣＤ１１ｃ^＋ＣＤ２４^ｉｎｔＣＤ１１ｂ⁻細胞、およびそれらの表面でのＣＤ４５Ｒの上方制御を示す図である。ｐＤＣまたはＣＤ１１ｃ^＋ＣＤ２４^ｉｎｔＣＤ１１ｂ⁻細胞は、少なくとも２０匹のマウスのプールしたＢＭから選別したＦＡＣＳによって精製した。ＣｐＧ−２２１６で１８時間刺激し、次いで、示される表面マーカーで染色した細胞を示す図である。黒色の点線は、ＧＭ−ＣＳＦにおけるｍｉＤＣを示し、塗りつぶしたヒストグラムは、ＣｐＧ−２２１６におけるｐＤＣの染色を示し、黒色の線は、ＣｐＧ−２２１６におけるＣＤ１１ｃ^＋ＣＤ２４^ｉｎｔＣＤ１１ｂ⁻細胞の染色を示す図である。ＣＤ１１ｃ^＋ＣＤ２４^ｉｎｔＣＤ１１ｂ⁻細胞およびｐＤＣの染色されなかった対照は、全てのマーカーについて最初のログにおけるものであるが、明確にするために示していない。データは、ＣＤ４０染色について３件の実験、ならびにＣＤ８αおよびＣＤ８６染色について５件を超える実験を代表する、１つの実験によるものである。 複数のＴＬＲリガンドに対する表面活性化に応答するＣＤ１１ｃ^＋ＣＤ２４^ｉｎｔＣＤ１１ｂ⁻細胞、およびそれらの表面でのＣＤ４５Ｒの上方制御を示す図である。ｐＤＣまたはＣＤ１１ｃ^＋ＣＤ２４^ｉｎｔＣＤ１１ｂ⁻細胞は、少なくとも２０匹のマウスのプールしたＢＭから選別したＦＡＣＳによって精製した。ｐＤＣ（塗りつぶした黒色の線）、ＧＭ−ＣＳＦ（黒色の点線）、またはＣｐＧ２２１６（黒色の線）におけるＣＤ１１ｃ^＋ＣＤ２４^ｉｎｔＣＤ１１ｂ⁻細胞上のＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）の発現を示す図である。データは、５件を超える実験を表す。 複数のＴＬＲリガンドに対する表面活性化に応答するＣＤ１１ｃ^＋ＣＤ２４^ｉｎｔＣＤ１１ｂ⁻細胞、およびそれらの表面でのＣＤ４５Ｒの上方制御を示す図である。ｐＤＣまたはＣＤ１１ｃ^＋ＣＤ２４^ｉｎｔＣＤ１１ｂ⁻細胞は、少なくとも２０匹のマウスのプールしたＢＭから選別したＦＡＣＳによって精製した。示される刺激物とともに１８時間インキュベーションした後の、ＣＤ１１ｃ^＋ＣＤ２４^ｉｎｔＣＤ１１ｂ⁻細胞上のＣＤ８６の発現（塗りつぶした黒色の線）を示す図である。黒色の点線は、染色されなかったバックグラウンド対照である。データは、１０件を超える実験（ＣｐＧ２２１６および媒体）、または他の刺激物に関する少なくとも３件の実験を代表する、１つの実験によるものである。 ｍｉＤＣのウイルス活性化を表す図である。ＦＡＣＳ分類によって精製し、示されるウイルスで２０時間刺激して、上清をＩＦＮ−αの産生についてＥＬＩＳＡによって試験した、ＢＭｐＤＣ、ｍｉＤＣ、または脾臓ｃＤＣを示す図である。データは、各ウイルスについて少なくとも２件の実験を代表する、１つの実験によるものである。エラーバーは、重複試料のＳＤを表す。 ｍｉＤＣのウイルス活性化を表す図である。示されるように刺激したｍｉＤＣ（塗りつぶされていない黒色の線）またはｐＤＣ（黒色の点線）上のＣＤ８６およびＣＤ４５Ｒの染色を示す図である。塗りつぶした黒色の線は、媒体だけにおける２０ｈ後のｍｉＤＣの染色を表す。 ｍｉＤＣのウイルス活性化を表す図である。２０時間培養した後のｐＤＣｍｉＤＣの生存を示す図である。データは、少なくとも３件の実験を代表する、１件の実験によるものである。 ｍｉＤＣおよびｐＤＣのＲａｇの発現を表す図である。Ｒａｇ−ＧＦＰマウスの低密度ＢＭ細胞から富化し、ｐＤＣ（塗りつぶされていない黒色の線）またはｍｉＤＣ（塗りつぶした黒色の線）をゲートして、ＧＦＰの発現について分析した、ＤＣを示す図である。結果は、３匹のプールしたマウスの１つの実験からのものである。 ｍｉＤＣの増殖能を表す図である。ＣＦＳＥで標識し、ＣｐＧ−２２１６、Ｒ８３７、ＧＭ−ＣＳＦ、ＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）、または媒体でインキュベートして、２４時間後に、ＣＦＳＥ蛍光の消失についてＦＡＣＳによって分析した、ｍｉＤＣを示す図である。全ての軌跡を互いに重ね合わせた。ＧＭ−ＣＳＦ、Ｒ８３７、および培地の重ね合わせた結果を示す。どの軌跡も、いかなるｍｉＤＣ増殖の証拠も類似的に示さなかった。データは、２０匹のプールしたマウスのＢＭから精製したＤＣの１つの実験のものであり、２件の実験を代表している。 ｍｉＤＣの増殖能を表す図である。ＦＬＤＣ培養物中にスパイクし、未分裂ピーク１、または分裂ピーク２もしくは３、４日目もしくは５日目に対する、ＣＤ１１ｃおよびＣＤ４５Ｒの表面発現について分析した、ＣＦＳＥで標識したｍｉＤＣを示す図である。データは、１２匹のプールしたＣ５７ＢＬ／６マウスのＢＭから精製したｍｉＤＣの１つの実験のものであり、２件の別々の実験を代表している。 ｍｉＤＣの増殖能を表す図である。６日目までＣＤ４５Ｒの発現が実質的にないという、表面表現型に関して類似した結果をもたらした、Ｌｙ５．１ｍｉＤＣを使用した第３の実験を示す図である。 ｍｉＤＣが抗原特異的Ｔ細胞の強力な刺激物であることを表す図である。Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来のｍｉＤＣ、ＢＭｐＤＣ、または脾臓ｃＤＣを精製し、ＣＦＳＥで標識したＢａｌｂ／ｃリンパ節Ｔ細胞とともにインキュベートした、同種異系ＭＬＲを示す図である。示されるように刺激剤を培養物に添加した。３日後にＴ細胞によるＣＦＳＥ発現を分析した。ＦＡＣＳのデータは、プールした３つのウエルを代表している。データは、２件の別々の実験を代表している。 ｍｉＤＣが抗原特異的Ｔ細胞の強力な刺激物であることを表す図である。３７℃で１時間、ＭＶＡ−ＯＶＡとともにインキュベートし、次いで洗浄した、ｍｉＤＣ、ＢＭｐＤＣ、または脾臓ＣＤ８^＋ｃＤＣもしくはＣＤ８⁻ｃＤＣを示す図である。滴定したＤＣを、５０，０００個のＣＦＳＥ標識したＯＴＩ−Ｔ細胞に添加した。示されるデータは、１０^４個のＤＣの各亜型のものである。３日後に、ＯＴＩ−Ｔ細胞のＣＦＳＥ蛍光をＦＡＣＳによって測定し、細胞を採取する前に各細胞にスパイクした既知の数の定量ビーズを参照することにより、増殖細胞の数を数量化した。プールした３つのウエルの値を示す。データは、３件の別々の実験を代表している。 ｍｉＤＣが抗原特異的Ｔ細胞の強力な刺激物であることを表す図である。３７℃で１時間、可溶性オバルブミンとともにインキュベートし、次いで洗浄した、ｍｉＤＣを示す図である。示された刺激物を添加した１０^４個のＤＣを、５０，０００個のＯＴＩ−Ｔ細胞に添加し、３日後にＣＦＳＥ増殖を分析した。データは、プールした３つのウエルの１つの実験からの結果であり、２件の実験を代表している。 指示された刺激物に対するＢｃｌ２遺伝子導入または非遺伝子導入マウスからの指示されたＤＣのサイトカイン応答を表す図である。本発明を以下の実施例によってさらに例証するが、さらに限定するものとして一切解釈すべきではない。本出願の全体を通して引用される全ての参考文献の内容は、参照により明示的に本明細書に組み込まれる。

[実施例]
１．マウス
メスのＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを、Ｈａｒｌａｎ Ｗｉｎｋｅｌｍａｎｎ ＧｍｂＨ，Ｂｏｒｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙから購入し、６〜１０週齢で使用した。同種異系刺激性混合白血球応答（ａｌｌｏ−ＭＬＲ）で使用したＴ細胞は、Ｂａｌｂ／ｃマウス由来のものであり、Ｈａｒｌａｎ Ｗｉｎｋｅｌｍａｎｎ ＧｍｂＨからも購入した。ユビキチンプロモータ（Ｃ５７ＢＬ／６−Ｔｇ（ＵＢＣ−ＧＦＰ）３０Ｓｃｈａ／Ｊ、以下、ＵＢＣ−ＧＦＰマウスと称する）の下で緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するマウスは、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｓｕｌｚｆｅｌｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入し、ハウス内で飼育した。Ｃ５７ＢＬ／６−Ｔｇ（ＴｃｒａＴｃｒｂ）１１００Ｍｊｂ／ｊ（ＯＴＩ）マウス、および破壊したＮＦｋｂ１遺伝子（Ｂ６；１２９Ｐ−Ｎｆｋｂ１^{ｔｍ１Ｂａｌ}／Ｊ）を収容しているマウスは、最初にＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入し、ハウス内で飼育した。ＦＬＫＯマウスは、ＭｃＫｅｎｎａ ｅｔ ａｌ．２０００によって説明されており、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒｔｉｅｒｋｕｎｄｅ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｚｕｒｉｃｈ）で飼育した。ｖａｖプロモータの下で発現したヒトＢｃｌ−２導入遺伝子を発現するマウスは、以前に説明されており（Ｏｇｉｌｖｙ ｅｔ ａｌ．１９９９）、Ｇ．Ｈａｃｋｅｒ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｈｙｇｉｅｎｅ，Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｕｎｉｃｈから入手した。

動物実験は、地方自治体の動物倫理当局の承認を受け、そのガイドラインの下で行った。

２．抗体および試薬
組み換え（ｒｅｃ）ＦＬＡＧタグを付したマウス（ｍｕ）ＦＬを、ＣＨＯ細胞中で発現させて、前に説明したように精製した（Ｏ’Ｋｅｅｆｆｅ ｅｔ ａｌ．２００２ｂ）。ｒｅｃｍｕＧＭ−ＣＳＦおよびｒｅｃｍｕＭ−ＣＳＦは、Ｔｅｂｕ−Ｂｉｏ（Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手した。ＣｐＧモチーフ（ＣｐＧ２２１６およびＣｐＧ１６６８）を含有するオリゴヌクレオチドは、公表された配列（Ｓｐｉｅｓ ｅｔ ａｌ．２００３）に従って、ＴＩＢ ＭＯＬＢＩＯＬ（Ｂｅｒｌｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって合成した。イミキモド（Ｒ８３７）およびパルミトイル−３−システイン−セリン−リシン−４（Ｐａｍ−３−Ｃｙｓ）は、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＵＳＡ）から購入した。ポリ（シチジル−イノシン）酸（ポリＩ：Ｃ）およびリポ多糖類（ＬＰＳ）は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。

この研究に使用されるＭＶＡは、Ｂａｖａｒｉａｎ Ｎｏｒｄｉｃによって開発され、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）（Ｖ０００８３００８）で寄託され、ＭＶＡ発現オバルブミンである、ＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）とした。ＭＶＡは、胚形成後１１日目の病原体を含まない雌のニワトリ卵（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）から調製し、１０％のＦＣＳを補充したＲＰＭＩ−１６４０培地で培養した、ニワトリの一次胚（ＣＥＦ）上で増殖させて力価測定した。ＥＣＴＶ株Ｍｏｓｃｏｗは、ＶＲ−１３７２としてＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手し、Ｖｅｒｏ Ｃ１００８細胞（ＥＣＡＣＣ ８５０２０２０６）上で増殖させて力価測定した。ＳＦＶは、ＡＴＣＣ（ＶＲ−３６４）から入手し、ＡＴＣＣ（ＣＣＬ−６０）から入手したウサギ角膜細胞系ＳＩＲＣ上で増殖させて力価測定した。全ての細胞系は、抗生物質を伴わない１０％のＦＣＳを補充したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中で維持した。

抗体は、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＧｍｂＨ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙから入手した。ただし、精製およびＦＩＴＣ抱合した抗ＣＤ１１ｃ（ラットクローン２２３Ｈ７）および抗Ｌｙ４９Ｑ（Ｂｉｏｚｏｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｖｅｒｔｒｉｅｂ ＧｍｂＨ、Ｅｃｈｉｎｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、抗ｍＰＤＣＡ−１（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、および抗Ｆ４／８０（ＮａｔｕＴｅｃ ＧｍｂＨ，Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を除く。ハイブリドーマは、その上清をエクスビボでのＤＣの精製、またＢＭのＤＣの精製のための枯渇カクテルで使用し、Ｋｅｎ Ｓｈｏｒｔｍａｎ教授（ＷＥＨＩ，Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）より快く提供していただいた。

３．骨髄由来の細胞の単離およびＤＣの精製
マウスの大腿骨および脛骨を取り除き、２％のＦＣＳを含むＲＰＭＩ−１６４０（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ（マウスの浸透性に調整する）を充填し、２１ｇの針を取り付けた２０ｍＬの注射器で、細胞を骨からフラッシングした。細胞は、注射器によって繰り返してフラッシングすることによって再懸濁させた。低密度細胞の調製のために、細胞を、遠心分離によってペレット化し、Ｎｙｃｏｄｅｎｚ（登録商標）１．０７７Ａ（Ｐｒｏｇｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｋ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ、マウスの浸透性３０８ｍＯｓｍに調整する）中に再懸濁させた。抗ＣＤ４９ｂ ｍＡｂも枯渇カクテルに添加したこと、および抗Ｔｈｙ１．１を省略したことを除いて、密度分離、抗体枯渇カクテルとのインキュベーション、および磁気ビーズ枯渇は、本質的に、前に説明したもの（Ｏ’Ｋｅｅｆｆｅ ｅｔ ａｌ．２００２ａ）である。ハイブリドーマは、その上清を枯渇カクテルで使用し、Ｋｅｎ Ｓｈｏｒｔｍａｎ教授（ＷＥＨＩ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）より快く提供していただいた。ＢＭ ｍｉＤＣおよびｐＤＣを選別するために、枯渇ステップの後に、細胞を、ＣＤ１１ｃ（ＰＥ−Ｃｙ７またはＦＩＴＣ）、ＣＤ４５ＲＡ−ＰＥ、およびＣＤ１１ｂ（ＡＰＣまたはＰａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ）でルーチン的に染色した。ＣＤ２４−ＦＩＴＣが染色剤に含まれる場合もあった。細胞は、ｐＤＣ（ＣＤ１１ｃ^ｉｎｔＣＤ４５ＲＡ^ｈｉＣＤ１１ｂ⁻）またはｍｉＤＣ（ＣＤ１１ｃ^ｉｎｔＣＤ４５ＲＡ⁻ＣＤ１１ｂ⁻ＨＳＡ^ｉｎｔ）として選別した。

脾臓ＤＣは、前述したＮｙｃｏｄｅｎｚ（登録商標）および枯渇カクテルを使用して、前述したように単離した（Ｏ’Ｋｅｅｆｆｅ ｅｔ ａｌ．２００２ａ）。

４．ＤＣの刺激剤
ＣｐＧモチーフ（ＣｐＧ２２１６およびＣｐＧ１６６８）を含有するオリゴヌクレオチドを、公表された配列に従って、ＴＩＢ ＭＯＬＢＩＯＬ（Ｂｅｒｌｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって合成した。Ｓｐｉｅｓ Ｂ，ｅｔ ａｌ．（２００３） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １７１（１１）：５９０８−５９１２。イミキモド（Ｒ８３７）およびパルミトイル−３−システイン−セリン−リシン−４（Ｐａｍ−３−Ｃｙｓ）は、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＵＳＡ）から購入した。レシキモド（Ｒ８４８）は、Ａｌｅｘｉｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ａｘｘｏｒａ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ，Ｌoｒｒａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。ポリ（シチジル−イノシン）酸（ポリＩ：Ｃ）およびリポ多糖類（ＬＰＳ）は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。

組み換えＦＬＡＧタグを付したマウスＦＬを、ＣＨＯ細胞中で発現させて、前に説明したように精製した（Ｏ’Ｋｅｅｆｆｅ ｅｔ ａｌ．２００２ｂ）。組み換えマウスＧＭ−ＣＳＦおよびＭ−ＣＳＦは、Ｔｅｂｕ−Ｂｉｏ（Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。

この研究に使用されるＭＶＡは、Ｂａｖａｒｉａｎ Ｎｏｒｄｉｃによって開発され、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）（Ｖ０００８３００８）で寄託された、ＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）とした。ＭＶＡは、胚形成後１１日目の病原体を含まない雌のニワトリ卵（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）から調製し、１０％のＦＣＳを補充したＲＰＭＩ−１６４０培地で培養した、ニワトリの一次胚（ＣＥＦ）上で増殖させて力価測定した。エクトロメリアウイルス（ＥＣＴＶ）株Ｍｏｓｃｏｗは、ＶＲ−１３７２としてＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手し、Ｖｅｒｏ Ｃ１００８細胞（ＥＣＡＣＣ ８５０２０２０６）上で増殖させて力価測定した。ショープ線維腫ウイルス（ＳＦＶ）は、ＡＴＣＣ（ＶＲ−３６４）から入手し、ＡＴＣＣ（ＣＣＬ−６０）から入手したウサギ角膜細胞系ＳＩＲＣ上で増殖させて力価測定した。全ての細胞系は、抗生物質を伴わない１０％のＦＣＳを補充したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中で維持した。

５．ＤＣの刺激およびサイトカインの定量
樹状細胞の刺激は、５０μＬ以下の容積のための丸底プレートまたはＶ底プレートにおいて０．２５〜０．５×１．０×１０^６個の細胞で行った。細胞は、添加した刺激物の有無に関わらず、完全培地（１０％のＦＣＳ、５０μＭのベータメルカプトエタノール、１００ＩＵ／ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシンを補充した、ＲＰＭＩ−１６４０倍地）中で、１８〜４８時間刺激した。使用した刺激物は、１０ｎｇ／ｍＬのＧＭ−ＣＳＦ、１μｇ／ｍＬのＰａｍ−３−Ｃｙｓ、１００μｇ／ｍＬのポリ（Ｉ：Ｃ）、１μｇ／ｍＬのＬＰＳ、１μｇ／ｍＬのＲ８３７、０．５μＭのＣｐＧ２２１６、または０．５μＭのＣｐＧ１６６８であった。

培養上清を、前述したように（Ｏ’Ｋｅｅｆｆｅ ｅｔ ａｌ．２００２ａ）、２部位ＥＬＩＳＡによってＩＦＮ−αおよびＲＡＮＴＥＳについてアッセイした。Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌのＭａｂクローン８．Ｓ．４１５（ＴＨＰ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｖｅｒｔｒｉｅｂｓ ＧｍｂＨ，Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ）を、ＩＦＮ−ベータＥＬＩＳＡの捕獲Ｍａｂとして使用し、ＰＢＬ ＩｎｔｅｒｆｅｒｏｎＳｏｕｒｃｅの検出抗体（ウサギ抗マウスＩＦＮ−β）およびマウスＩＦＮ−ベータ標準は、Ｔｅｂｕ−Ｂｉｏから購入した。他のサイトカイン（ＩＬ−１２、ｐ７０、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＴＮＦ−α、ＭＣＰ−１、およびＭＩＰ−３アルファ）は、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ Ｂｅａｄ Ａｒｒａｙ，Ｍｏｕｓｅ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して測定した。

６．ＣＦＳＥの標識
Ｔ細胞またはｍｉＤＣを、製造業者の説明書に従って、（ＣｅｌｌＴｒａｃｅ ＣＦＳＥ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＧｍｂＨ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、最終濃度の２μＭのＣＦＳＥで標識した。

７．同種異系ＭＬＲ
ＤＣサブセットを、ＢＭおよび脾臓から精製して、ＦＡＣＳ−ＡＲＩＡを使用して９５％を超える純度に選別した。Ｂａｌｂ／ｃマウスからのＴ細胞を、皮下および腸間膜リンパ節から精製した。精製したＴ細胞を、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ ＣＦＳＥ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＧｍｂＨ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、２μＭのＣＦＳＥで標識した。３つの５０，０００個のＴ細胞を、媒体中のＤＣサブセットとともに、またはＧＭ−ＣＳＦ、ＬＰＳ、またはＣｐＧ２２１６を含む刺激物の添加とともにインキュベートした。４日後、Ｔ細胞分裂（ＣＦＳＥ蛍光の消失）の程度を確認するために、ＦＡＣＳによって、３７℃で、反復試料を分析した。分裂したＴ細胞の絶対数を数えることができるように、定量に使用されるビーズのアリコートも各ウエルに添加した。

８．ＯＴＩ−Ｔ細胞刺激
前述のＭＬＲに対して交差提示アッセイを同様に行い、それによって、ＯＴＩ遺伝子導入マウス由来のＴ細胞をＢａｌｂ／ｃ Ｔ細胞の代わりに利用し、ＤＣは、最初に、３７℃で１時間、オバルブミンとともにインキュベートし、洗浄し、次いで、Ｔ細胞に添加した。

ＭＶＡによって提示されるオバルブミンを提示するＤＣサブセットの能力は、最初に、ＤＣを、３７℃で１時間、ＭＶＡ−ＯＶＡとともにインキュベートし、続いて、完全培地中で洗浄することによって分析した。ＣＦＳＥで標識したＴ細胞の複製を、次いで、１０^３個、３×１０^３個、または１０^４個の感染したＤＣとともにインキュベートした。対照として、ＭＶＡ（ＯＶＡを発現していない）とともにインキュベートしたもの、または未処理のものも含めた。含まれるＴ細胞対照は、Ｔ細胞単独のもの、およびＤＣのいかなる添加も伴わない、ＤＣ亜集団に関してＭＶＡ−ＯＶＡとともにインキュベートしたＴ細胞とした。インキュベーションの４日後、プールした複製試料由来の細胞を、ＣＦＳＥ発現について分析し、細胞数を数えるために、定量ビーズを各試料に含めた。

９．Ｃ５７ＢＬ／６マウスへのＵＢＣ−ＧＦＰ ＤＣの移入
ＢＭのｐＤＣおよびｍｉＤＣを、ＵＢＣ−ＧＦＰマウスから精製して選別し、ＭＴＰＢＳ中で洗浄し、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの尾静脈に注射した。マウス１匹あたり１００μＬのＭＴＰＢＳ中の０．６×１０^６個のｐＤＣまたは０．３×１０^６個のｍｉＤＣを、１つの細胞群あたり３匹のマウスに注射した。３匹のマウスには、ＭＴＰＢＳだけを受容させた。移入後約９０時間に、レシピエントマウスを安楽死させ、ＢＭおよび脾臓ＤＣを調製し、細胞を受容した各マウスを、別々にしておいた。ドナー細胞は、ＧＦＰ（ＦＩＴＣ）^ｈｉおよびＰＩ^ｎｅｇ細胞上でゲートすることによって選択した。

１０．ＢＭの非ｐＤＣ ＩＦＮ−αを産生する細胞は、Ｂ、Ｔ、またはＮＫ特異的マーカーを発現しない、ＣＤ１１ｃ^ｌｏＣＤ１１ｂ^−／ｌｏ細胞である
ＢＭにおけるｐＤＣの除去をもたらす条件は、ＣｐＧ−ＯＤＮ刺激に応答して、全てのＩＮＦ−αの産生を除去しないことが以前に示されている（Ｈｏｃｈｒｅｉｎ ｅｔ ａｌ．２００４）。Ｌｉｕおよび同僚は、まだ完全なｐＤＣ表現型を有していないヒトの初期ｐｒｅ−ＰＤＣが、高レベルのＩＦＮ−Ｉを産生する能力も有することを以前に公表している（Ｂｌｏｍ ｅｔ ａｌ．２０００）。最初にｐＤＣを除去した場合に、ＢＭ以外のいかなる他の器官もＣｐＧ−ＯＤＮに対していかなるＩＮＦ−αを産生する能力も保持しないことが分かり、ｐＤＣ前駆体は、マウスＢＭ細胞のＣＤ４５Ｒ／ＣＤ４５ＲＡの枯渇後に残った細胞であり得ると考えられた。

ＢＭ細胞の低密度分離は、ＣｐＧ−ＯＤＮに応答した全てのＩＦＮ−αの活性がＢＭ細胞の低密度画分によって分離されたことを明らかにした（図１）。
低密度ＢＭ細胞を、次いで、精製して、ＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ１１ｃで染色した（図２Ａ）。粗製細胞集団を、ｐＤＣ、ＣＤ１１ｃ^＋推定のＢＭのｃＤＣ、および「残り」の３つに選別した。これらの３つの集団のそれぞれを、ＣｐＧ−２２１６で一晩刺激し、上清を、ＩＦＮ−α活性について試験した。ｐＤＣ以外に、ＣＤ１１ｃ^＋ＣＤ４５ＲＡ⁻細胞集団も、ＩＦＮ−αを産生した。ＣＤ１１ｃ^＋細胞集団は、異種のものであり、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ４９ｂ、およびＮＫ１．１を発現する少数の細胞を含有していた。細胞選別は、ジャンクチャネルにおいて、これらの表面マーカーに対する抗体を含めて繰り返した。ＣＤ１１ｃ^＋ＣＤ３⁻ＣＤ１９⁻ＣＤ４９ｂ⁻Ｌｙ６Ｇ⁻ＮＫ１．１⁻細胞は、ＣｐＧ−２２１６に応答して、高レベルのＩＦＮ−αの発現を保持した。ＣＤ４９ｂ^＋ＣＤ１１ｃ^＋細胞を含む、残りのＣＤ１１ｃ^＋細胞は、ＣｐＧ−２２１６に応答して、ＩＦＮ−αを産生しなかった。

ＣＤ３^＋、ＣＤ１９^＋、およびＣＤ４９ｂ^＋細胞を枯渇させたＣＤ１１ｃ^＋ＣＤ４５ＲＡ⁻ＢＭ細胞の大規模な表面表現型分類を行った（図２Ｂ）。細胞は、ＣＤ１１ｂおよびＣＤ２４の発現について異種のものであり、細胞の４０〜５０％が中レベルおよび高レベルのＣＤ１１ｂを発現し、残りは、ＣＤ１１ｂ^−／ｌｏであることが分かった（図２）。Ｌｙ６Ｇ^＋細胞の小集団が存在し、Ｇｒ−１特異的抗体によるこれらの除去は、ＩＦＮ−αの産生に影響を及ぼさず、よって、抗Ｇｒ−１抗体をルーチン的に精製に含めた。細胞は、ＣＤ３⁻ＣＤ１９⁻ＣＤ４９ｂ⁻Ｌｙ６Ｇ⁻ＮＫ１．１⁻ＢＭ細胞を、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ２４およびＣＤ１１ｂ（図２Ｃ）で染色することによって、別個の集団に選別することができた。ＣＤ４５ＲＡ⁻細胞の、ＣＤ２４^ｉｎｔＣＤ１１ｂ⁻細胞によって正確に分離されるＩＦＮ−α産生能、および産生量は、ＢＭｐＤＣによって産生されたものと類似していた（図２Ｄ）。

図２に示されるように、ＣＤ１１ｂ^−／ｌｏＣＤ２４^ｉｎｔ細胞は、ＣＤ４またはＣＤ８αの発現が不十分であった。この細胞は、中間レベルのＣＤ２４、高レベルのＦｌｔ３、高レベルのＣＤ１７２（Ｓｉｒｐα）、低レベルの共刺激マーカーＣＤ４０およびＣＤ８０、中間レベルのＣＤ８６、および低レベルのＭＨＣＩＩを発現した。この細胞は、Ｃｌｅｃ９ａを発現しなかった。したがって、表現型の比較によれば、ＢＭの非ｐＤＣ ＩＦＮ−αを産生する細胞は、Ｌｉｎ−ＭＤＰまたはＣＤＰ前駆体と異なっており（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．２００７）、また、脾臓ＣＤ３⁻ＣＤ１９⁻ＮＫ１．１⁻Ｔｅｒ１１９⁻ＣＤ４５ＲＡ^{ｎｅｇ−ｌｏ}ＣＤ１１ｃ^＋ＣＤ４３^＋ＳＩＲＰ_−α ^ｌｏｐｒｅ−ｃＤＣ（Ｎａｉｋ ｅｔ ａｌ．２００６）、またはＣＤ１１ｂ^＋ＢＭｐｒｅ−ＤＣ（Ｎａｉｋ ｅｔ ａｌ．２００７）、または脾臓もしくはＢＭのＣＤ１１ｃ−ｐｒｏ−ＤＣと異なっていた。

１１．ＢＭの非ｐＤＣ ＩＦＮ−αを産生する細胞の活性化は、ＤＣのような形質転換を誘導するが、ｍｉＤＣは、ｐＤＣと異なって、ＴＬＲリガンドおよび成長因子に応答する
ＣＤ１１ｃ^＋ＣＤ４５ＲＡ⁻ＣＤ２４^ｉｎｔＣＤ１１ｂ⁻細胞またはＢＭｐＤＣを、ＣｐＧ２２１６、ＧＭ−ＣＳＦ、または培地で一晩刺激し、それらの形態を比較した。培地において、ＣＤ１１ｃ^＋ＣＤ４５ＲＡ⁻ＣＤ２４^ｉｎｔＣＤ１１ｂ⁻細胞およびｐＤＣは、同様に振る舞い、いずれの集団においても、いかなる典型的なＤＣ形態の徴候も示さなかった。しかしながら、驚くべきことに、ＣＤ１１ｃ^＋ＣＤ４５ＲＡ⁻ＣＤ２４^ｉｎｔＣＤ１１ｂ⁻細胞は、ｐＤＣとは異なって、ＧＭ−ＣＳＦにおいて、明らかに成熟していた（図２Ｅ）。さらに、この細胞は、ＣｐＧ−２２１６に非常に良好に応答し、ｐＤＣ培養物中に形成される小さい細胞塊とは異なり、典型的な細胞質突起を伴う大きい細胞塊を形成した。

ＣＤ１１ｃ^＋ＣＤ３⁻ＣＤ１９⁻ＣＤ４９ｂ⁻Ｌｙ６Ｇ⁻ＮＫ１．１⁻ＣＤ２４^ｉｎｔＣＤ１１ｂ^−／ｌｏ細胞は、ＣｐＧ−２２１６に対するＩＦＮ−αの強力な産生株であり、この細胞は、ＧＭ−ＣＳＦにおいて活性化されたようであった。ＴＬＲリガンドおよびＧＭ−ＣＳＦの範囲に対するこの細胞サイトカイン応答を試験した。図３Ａに示されるように、細胞は、ＣｐＧ−２２１６に対して高レベルのＩＦＮ−αを産生し、ＴＬＲ７リガンドＲ８３７に対して再現的に低レベルのＩＦＮ−αを産生した。この細胞は、ＭＶＡウイルスに対しても低レベルのＩＦＮ−αを産生した。ＩＦＮ−αの産生は、ＣＤ１１ｃ^＋ＣＤ３⁻ＣＤ１９⁻ＣＤ４９ｂ⁻Ｌｙ６Ｇ⁻ＮＫ１．１⁻ＣＤ２４^ｉｎｔＣＤ１１ｂ^−／ｌｏ細胞の間でだけしか検出されず、ＣＤ１１ｂ^＋ 細胞ではいかなる産生も検出できなかった。

ＣＤ１１ｃ^＋ＣＤ３⁻ＣＤ１９⁻ＣＤ４９ｂ⁻Ｌｙ６Ｇ⁻ＮＫ１．１⁻ＣＤ２４^ｉｎｔＣＤ１１ｂ^−／ｌｏ細胞は、ＴＬＲ９およびＴＬＲ７リガンドに応答して、ＩＬ−６およびＴＮＦ−αを産生し、また、再現可能であるが、ＴＬＲ２（Ｐａｍ３Ｃｙｓ）およびＴＬＲ４リガンド（ＬＰＳ）に応答して、より低レベルのＩＬ−６を産生した（図３Ｂ）。ＣｐＧ−２２１６に対するＩＬ−６応答は、特に高かった。同じ条件で、ＣｐＧ−Ａ−ＯＤＮを使用したところ、ＢＭのｐＤＣからは、ほとんどＩＬ−６を検出することができなかった。ＩＬ−１０およびＭＩＰ−３αも測定したが、いずれの条件においても検出されなかった。いくつかの実験では、ＣｐＧ−２２１６に応答して、非常に低レベルのＩＬ−１２ｐ７０（＜１００ｐｇ／ｍＬ）を産生したが、これは、ＧＭ−ＣＳＦが培地に含まれている場合だけであった。いずれのサイトカインも、単独のＧＭ−ＣＳＦに応答して産生されなかった。Ｍ−ＣＳＦおよびＦｌｔ３−リガンドに対する細胞の応答も試験したが、いずれの試験でもサイトカインは産生されず、また、いかなる形態学的変化も見られなかった。

この細胞の活性化した表面表現型は、いくつかの点でｐＤＣの表現型に類似しており、ＣｐＧ−２２１６に応答して、ＣＤ８α、ＣＤ４０、ＣＤ８６、およびＣＤ１１ｃの上方制御を示した（図４Ａ）。しかしながら、ＭＨＣＩＩ、およびＣＤ４０、ＣＤ８０、およびＣＤ８６を含む共刺激マーカーの発現は、試験した全ての条件において、活性化したＣＤ４９ｂ⁻Ｌｙ６Ｇ⁻ＮＫ１．１⁻ＣＤ２４^ｉｎｔＣＤ１１ｂ^−／ｌｏ細胞上で少なくとも５〜１０倍高かった。

ＣＤ４５Ｒの発現は、全ての条件において、ｐＤＣ上ほど高くないが、ＣＤ４９ｂ⁻Ｌｙ６Ｇ⁻ＮＫ１．１⁻ＣＤ２４^ｉｎｔＣＤ１１ｂ^−／ｌｏ細胞上で上方調節されたが（図４Ｂ）、それでも、ＣＤ４５Ｒの発現は、ｐＤＣとの関係を示唆した。しかしながら、ＴＬＲ２およびＴＬＲ４リガンドも、共刺激マーカーの上方調節を誘導したが（図４Ｃ）、ｐＤＣにはいかなる影響も及ぼさなかった。さらに、ｐＤＣとは異なり、単独培地中で一晩インキュベーションした後に、低レベルの共刺激マーカーが観察され、これは、ＧＭ−ＣＳＦによってさらに増強された（図４Ａおよび４Ｃ）。

これらの観察によって、下記で説明される差次的な機能と共に、このＣＤ１１ｃ^＋ＣＤ３⁻ＣＤ１９⁻ＣＤ４９ｂ⁻Ｌｙ６Ｇ⁻ＮＫ１．１⁻ＣＤ１１ｂ^−／ｌｏ細胞を、新規ＢＭのＤＣ集団、すなわち骨髄（ｍｙｅｌｏｓ）（ギリシャ語の骨髄（ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ））インターフェロンＤＣ（すなわち、ｍｉＤＣ）と名付けるに至った。

１２．ｍｉＤＣは、ウイルスによって感染するが、十分に生存し、ｐＤＣとは異なって種々のウイルスに応答する
ＩＦＮ−αの産生および表面活性化を含む、ＣｐＧ２２１６に対するｍｉＤＣの応答は、ｐＤＣに類似しており、これは、この細胞が、ｐＤＣの分化状態または異なるサブセットであった可能性を示唆した。しかしながら、ＬＰＳおよびＧＭ−ＣＳＦに対するｍｉＤＣの応答は、ｍｉＤＣがｐＤＣとは根本的に異なることを示唆した。種々のウイルスによるｍｉＤＣの活性化は、これらの２つの細胞型間の差をさらに明らかにした。ＨＳＶは、ＴＬＲ９およびＴＬＲ９非依存性経路を介してＢＭのｐＤＣを活性化することが知られており、ｍｉＤＣの表面活性化およびＩＦＮ−αの産生の強力な誘導原でもあった（図５）。ｍｉＤＣは、ＨＳＶに応答して、実質的なレベルのＩＦＮ−αを産生したが、それでもこれは、ｐＤＣによる産生の約５０％であった。ＨＳＶは、ＣｐＧ−２２１６のように、ｍｉＤＣからの高いＩＬ−６の産生も誘導し、それは、ｐＤＣによる産生の約１０倍であり、また、脾臓ｃＤＣによる産生の２倍以上でもあった。ＭＶＡは、ｍｉＤＣ上でのＣＤ８６の上方調節、および、ｐＤＣによる産生の約１／３である、低レベルのＩＦＮ−αの産生を誘導した。ＩＦＮ−αは、脾臓ｃＤＣ由来の上清では検出されなかったことに留意されたい。

エクトロメリアおよびショープ線維腫ウイルスは、どちらもポックスウイルスファミリーのメンバーであり、ＴＬＲ９を介してｐＤＣを活性化するが、ｃＤＣの主にＴＬＲ９非依存性活性化経路を強力に阻害することが以前に示されている。これらのウイルス、すなわち、ショープ線維腫（ＳＦＶ）およびエクトロメリア（ＥＣＴＶ）は、どちらも、いかなるｍｉＤＣの表面活性化も、測定可能なＩＦＮ−α、ＩＬ−６、またはＴＮＦ−αの産生も誘導しなかった（図５）。したがって、ｍｉＤＣは、ｃＤＣと同様にこれらのポックスウイルスに応答し、これらの病原性ポックスウイルスに応答して、いかなる活性化も呈しなかった。

試験した全てのウイルスおよび他の刺激物に対するｍｉＤＣの応答の一般的な特徴は、ｍｉＤＣが、活性化したかどうかに関わらず、高い生存（６５％を超える、図５）を示し、これらの細胞を、これらの全てのウイルスで刺激したときに不十分な生存を示すｐＤＣと差別化していることである。

Ｂｃｌ２遺伝子導入マウス由来のｐＤＣが、培養および活性化時に非常に良好に生存することが以前に分かっている（Ｏ’Ｋｅｅｆｆｅ ｅｔ ａｌ．２００５）。Ｂｃｌ２遺伝子導入マウスから精製したｍｉＤＣは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスのｍｉＤＣに勝る生存優位性を有しないことが分かった。実際に、Ｃ５７ＢＬ／６マウスのｍｉＤＣの生存は、Ｂｃｌ２遺伝子導入マウス由来のｐＤＣの生存と類似していた。Ｂｃｌ２遺伝子導入マウス由来のｍｉＤＣも、ＳＦＶまたはＥＣＴＶに応答してサイトカインを産生しなかったが（図９）、ｐＤＣは、これらのウイルスに対して増加したＩＦＮ−αの産生を示したことが分かった。

１３． ｍｉＤＣとｐＤＣとの質的な差
ｍｉＤＣは、ＣｐＧ−２２１６に応答して、ＢＭのｐＤＣよりもはるかに優れた細胞表面活性化を明らかに示した（図４）。特に、ＣｐＧ２２１６−ＯＤＮは、ｐＤＣからの検出可能なＩＬ−６の産生をほとんど誘導しないが、全く対照的に、ＣｐＧ２２１６−ＯＤＮは、ｍｉＤＣからの高レベルのＩＬ−６の産生を誘導する（図３）。さらに、ｍｉＤＣは、ｐＤＣに対する極めて優れた生存を示し、これは、Ｂｃｌ２遺伝子導入マウス由来のｐＤＣの生存に類似している。ｍｉＤＣのｐＤＣとの関係をさらに試験するために、ＮＦ−ｋｂのｐ５０サブユニットが不十分であるマウス（ｎｆｋｂ１^−／−マウス）由来の精製したｐＤＣおよびｍｉＤＣのＴＬＲ９応答を試験した。脾臓ｐＤＣおよびＦＬＤＣ培養物由来のｐＤＣについて以前に示したように、ｎｆｋｂ１^−／−マウスのＢＭのｐＤＣは、ＣｐＧ１６６８−ＯＤＮによる活性化時に、実質的に減少したＩＬ−６の産生（＞８０％の減少）を示す。しかしながら、ｎｆｋｂ１^−／−マウス由来のｍｉＤＣは、ＩＬ−６産生の軽度の減少（約２０％）しか示さず、これは、以前にｎｆｋｂ１^−／−マウスの従来の脾臓ＤＣで見られた応答に類似している（Ｏ’Ｋｅｅｆｆｅ ｅｔ ａｌ．２００５）。

Ｐｅｌａｙｏ他は、Ｒａｇ−ＧＦＰを発現するＢＭのｐＤＣマウスが、２つの群、すなわち、異なるサイトカインの産生を示す、ＧＦＰ^＋（ｐＤＣ１）細胞およびＧＦＰ⁻（ｐＤＣ２）細胞から成ることを示した（Ｐｅｌａｙｏ ｅｔ ａｌ．２００５）。Ｐｅｌａｙｏ他は、ｐＤＣ２が、ｐＤＣ１細胞よりもかなり多くのＩＦＮ−αを産生したこと、加えて、ｐＤＣ２が、ＣｐＧ−ＯＤＮに応答して、非常に高レベルのＩＬ−６およびＩＦＮ−αを産生したことを実証した。これらのＲａｇ−ＧＦＰマウスから精製したｍｉＤＣのＧＦＰ発現を検査した。ｍｉＤＣは、ＧＦＰを発現せず、したがって、それらをｐＤＣ１と明らかに差別化するＲａｇの「シグネチャ」が不十分であったことが分かった（図６）。さらに、ｍｉＤＣは、かなり量のＩＬ−６を産生し、ｐＤＣ２に類似していることを示したが、ｍｉＤＣは、試験した任意のＴＬＲまたはウイルス刺激物に対するＩＦＮ−αの産生が不十分であり、刺激時のｍｉＤＣの表面活性化は、ｐＤＣ１またはｐＤＣ２についてＰｅｌａｙｏ他によって示されたものよりもかなり強かった（２６）。したがって、刺激および生存データに加えて、ｍｉＤＣによる不十分なＲａｇの発現は、それらをＢＭのｐＤＣと差別化している。

１４．ｍｉＤＣは、活性化時に分裂しない
活性化時に、ｍｉＤＣは、ＣｐＧ２２１６−ＯＤＮ刺激時のＣＤ４５Ｒの発現および高レベルのＩＦＮ−αの産生を含む、ｐＤＣに類似する特徴を示した。同時に、ｍｉＤＣは、ＧＭ−ＣＳＦに応答する成熟、ＴＬＲ４リガンドに対する反応性、およびｎｆｋｂ１の非存在下での高レベルのＩＬ−６の産生といった、ｃＤＣの特徴を示した。さらに、ｍｉＤＣの生存は、培地においても、刺激時においても極めて高かった（図６）。これらの因子を考慮すると、ｍｉＤＣが、実際は、ｐＤＣおよびｃＤＣ様のどちらの子孫も生じさせる分裂前駆体集団であったという可能性が考えられた。この仮説を試験するために、ｍｉＤＣを、ＣＦＳＥで標識し、単独培地中で、またはＴＬＲ４、ＴＬＲ７、もしくはＴＬＲ９、またはＧＭ−ＣＳＦに対するリガンドの存在下で、４０時間培養した。培養期間後の、ｍｉＤＣのＦＡＣＳ分析から、培養条件のいずれにおいても、いかなるＣＦＳＥ標識の消失もなかったことが分かり、これは、ｍｉＤＣが、非分裂細胞であったことを示している（図７Ａ）。ＣＦＳＥで標識したおよび標識していないｍｉＤＣを、刺激後のＩＦＮ−α、ＩＬ−６、およびＴＮＦ−αを産生するそれらの能力について比較した。ＣＦＳＥで標識した細胞は、正確にそれらの標識していない対照物として振舞った。

１５．ｍｉＤＣは、ＦＬＢＭ培養物内で１〜２回分裂する。
ＦＬＢＭ培養物は、ＦＬによるＤＣ前駆体からのｃＤＣおよびｐＤＣの発達を推進する。ｍｉＤＣの増殖能をさらに調査するために、培養物をＣＦＳＥで標識し、ＦＬＢＭ培養物中に「スパイク」した。４日目の後に、大部分のｍｉＤＣが１回の分裂を受け、５日目までに、細胞は、主に、１回または２回分裂した細胞であった（図７Ｂ）。培養物において、細胞は、ＣＤ４５Ｒを上方制御したが、分裂時に、ＣＤ４５Ｒは、細胞表面から消失した。細胞は、高レベルのＳｉｒｐα（ＣＤ１７２）およびごくわずかなＣｌｅｃ９Ａを発現した。したがって、これらの細胞は、ＣＤ８⁻型ＦＬＤＣにさらに類似していた。

１６．ｍｉＤＣは、同種異系および抗原特異的Ｔ細胞の強力な刺激を示す
ｍｉＤＣの刺激能を判定するために、ｍｉＤＣを、最初に、同種異系ＭＬＲで試験した。ｐＤＣと同様に、ｍｉＤＣは、事前の活性化を伴わない同種異系Ｔ細胞の不十分な刺激因子であった。活性化によって、ｍｉＤＣは、ｐＤＣよりも効率的にナイーブＴ細胞を刺激したが（図８Ａ）、ＣＤ８⁻脾臓ＤＣよりも小さい範囲であった。

ｍｉＤＣが抗原特異的Ｔ細胞を刺激する能力を有したがどうかを判定するために、ｍｉＤＣを、初期ウイルスプロモータの下で、ＭＶＡを発現するオバルブミン（ＭＶＡ−ＯＶＡ）とともに共インキュベートした。細胞を、１時間後に洗浄し、次いで、ＯＴＩ−Ｔ細胞とともに共インキュベートした。ＭＶＡ−ＯＶＡで刺激したｍｉＤＣは、ウイルスでコードした抗原を明らかに提示し、ＯＴＩ Ｔ細胞の刺激時に、ｐＤＣよりもさらに効果的であった。実際に、ｍｉＤＣは、ＯＴＩ細胞を刺激する際に、少なくともＣＤ８⁻脾臓ｃＤＣと同じくらい効率的であり、また、ＣＤ８^＋脾臓ｃＤＣよりも効率的であった。

ｍｉＤＣが抗原を交差提示する能力も試験した。ｐＤＣおよびＣＤ８⁻ｃＤＣと同様に、ｍｉＤＣは、可溶性オバルブミンからのペプチドの交差提示において非効率的であった（図８Ｃ）。

したがって、特にウイルスをコードした抗原を提示するときに、ＴＬＲ９リガンドおよび特定のウイルスに応答して高レベルのＩＦＮ−αを産生し、かつナイーブＴ細胞の刺激において非常に効率的であるＢＭ細胞が確認された。ＴＬＲの反応性（ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ７、およびＴＬＲ９）、提示能、およびＦＬＤＣ培養物中の表現型に関して、ｍｉＤＣは、マウスＣＤ８⁻ｃＤＣに類似している。しかしながら、ＴＬＲ７およびＴＬＲ９リガンド、およびウイルス反応に対するＣＤ８αおよびＩＦＮ−αの産生の上方調節とともに、ｍｉＤＣは、一意的な細胞型として際立っている。

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Claims (20)

1. 免疫療法剤を調製するための方法であって、
   骨髄から単離され、ＣＤ１１ｂ^−／ｌｏおよびＣＤ１７２^＋（Ｓｉｒｐα）である、単離されたＩＦＮ−α産生非形質細胞様樹状細胞（非ｐＤＣ）に、１つ以上の抗原を負荷するように、前記非ｐＤＣをエクスビボで修飾するステップ
   を含み、前記抗原が、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原、寄生虫抗原または腫瘍抗原である方法。
2. 前記非ｐＤＣをエクスビボで修飾する前記ステップは、（ｉ）前記１つ以上の抗原および前記樹状細胞を培養物中でインキュベートすること、（ｉｉ）前記樹状細胞による前記１つ以上の抗原の免疫複合体に媒介される取り込み、（ｉｉｉ）前記１つ以上の抗原の存在下での前記細胞の電気穿孔、（ｉｖ）前記１つ以上の抗原のウイルス形質導入、ならびに（ｖ）前記１つ以上の抗原をコードするｍＲＮＡまたはＤＮＡのリポフェクションまたは形質移入、から成る群から選択される、請求項１に記載の方法。
3. 請求項１または２に記載の方法によって得られる前記免疫療法剤を含み、薬学的に許容される担体または希釈剤をさらに含むかまたは含まない、医薬組成物。
4. 請求項１または２に記載の方法によって得られる前記免疫療法剤を含み、薬学的に許容されるアジュバントをさらに含むかまたは含まない、ワクチン。
5. 対象における抗原特異的免疫応答を引き出す際に使用するための、請求項１または２に記載の方法によって得られる前記免疫療法剤を含む、調製物。
6. 患者は、感染疾患または癌に罹患している、請求項５に記載の調製物。
7. 前記感染疾患は、ウイルス感染、細菌感染、寄生虫感染、または真菌感染である、請求項６に記載の調製物。
8. 前記抗原特異的免疫応答は、抗原特異的Ｔ細胞刺激である、請求項５〜７のいずれか１項に記載の調製物。
9. 前記抗原特異的免疫応答は、ナイーブＴ細胞の抗原特異的刺激である、請求項８に記載の調製物。
10. ＣＤ１１ｂ^−／ｌｏおよびＣＤ１７２^＋（Ｓｉｒｐα）である骨髄から単離されたＩＦＮ−α産生非形質細胞様樹状細胞（非ｐＤＣ）を、前記非ｐＤＣにおけるＩＦＮ−αの産生を誘導するパターン認識受容体によって認識されるリガンドとエクスビボで接触させることを含み、前記リガンドが、Ｐａｍ３Ｃｙｓ、ＬＰＳ、ＣｐＧ−ＯＤＮおよびＣＤ４０リガンドからなる群から選択される少なくとも１つのリガンドである、ＣＤ１１ｂ^−／ｌｏおよびＣＤ１７２^＋（Ｓｉｒｐα）である骨髄から単離された非ｐＤＣの集団において、ＩＦＮ−αの産生を誘導するための方法。
11. ＩＦＮ−α産生非形質細胞様樹状細胞（非ｐＤＣ）を単離、検出、またはスクリーニングするための、インビトロ方法であって、
    ＣＤ１１ｂ^−／ｌｏおよびＣＤ１７２^＋（Ｓｉｒｐα）である、骨髄から単離された非ｐＤＣの集団におけるＩＦＮ−αの産生を、前記非ｐＤＣにおけるＩＦＮ−αの産生を刺激または誘導するパターン認識受容体によって認識されるリガンドで刺激または誘導した後に、ＩＦＮ−αの産生を検出するステップ、
    を含み、前記リガンドが、Ｐａｍ３Ｃｙｓ、ＬＰＳ、ＣｐＧ−ＯＤＮおよびＣＤ４０リガンドからなる群から選択される少なくとも１つのリガンドである方法。
12. ＣＤ１１ｂ^−／ｌｏおよびＣＤ１７２^＋（Ｓｉｒｐα）である、骨髄から単離された、ＩＦＮ−α産生非形質細胞様樹状細胞（非ｐＤＣ）。
13. ＣＤ１１ｂ^−／ｌｏ、ＣＤ１７２^＋（Ｓｉｒｐα）、およびＣＤ４５ＲＡ⁻である、請求項１２に記載の細胞。
14. ＣＤ１１ｂ ^−／ｌｏ 、ＣＤ１７２ ^＋ （Ｓｉｒｐα）、ＣＤ４５ＲＡ ⁻ およびＣＤ２４ ^ｉｎｔ である、請求項１３に記載の細胞。
15. 感染疾患または癌に罹患している対象を治療する際に使用するための、請求項１２〜１４のいずれか１つに記載の細胞。
16. 前記感染疾患は、ウイルス感染、細菌感染、寄生虫感染、または真菌感染である、請求項１５に記載の細胞。
17. 前記感染疾患は、ウイルス感染である、請求項１６に記載の細胞。
18. 前記細胞は、前記対象への投与の前に、前記細胞におけるＩＦＮ−αの産生を誘導するパターン認識受容体によって認識されるリガンドとエクスビボで接触させられ、前記リガンドが、Ｐａｍ３Ｃｙｓ、ＬＰＳ、ＣｐＧ−ＯＤＮおよびＣＤ４０リガンドからなる群から選択される少なくとも１つのリガンドである、請求項１２〜１７のいずれか１つに記載の細胞。
19. 前記非形質細胞様樹状細胞（非ｐＤＣ）は、ＣＤ１１ｂ^−／ｌｏ、ＣＤ１７２^＋（Ｓｉｒｐα）、およびＣＤ４５ＲＡ⁻である、請求項１、２、１０、１１のいずれか１項に記載の方法。
20. 前記非ｐＤＣは、ＣＤ１１ｂ ^−／ｌｏ 、ＣＤ１７２ ^＋ （Ｓｉｒｐα）、ＣＤ４５ＲＡ ⁻ およびＣＤ２４ ^ｉｎｔ である、請求項１９に記載の方法。

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