JP5828507B2 - Urine test method and urine test kit - Google Patents
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Description
本発明は、ヒト血清アルブミン又はα１−酸性糖蛋白質の結合サイトに対して特異的結合性を有しているサイト特異性プローブを用いる尿検査方法及び尿検査用キットに関する。 The present invention relates to a urinalysis method and a urinalysis kit using a site-specific probe having a specific binding property to a binding site of human serum albumin or α 1 -acid glycoprotein.
生体内における薬理効果の強弱は、標的組織への遊離形薬物の移行量に大きく依存し、
その主要な調節因子の一つが血清蛋白結合である。生体内に吸収された薬物は、循環血液中に移行した後、程度の差はあるものの様々な血清蛋白質と結合する。このような血清蛋白質の中で、薬物の蛋白結合を大きく左右するものに、ヒト血清アルブミン（以下「ＨＳＡ」という。）やα１−酸性糖蛋白質（以下「ＡＧＰ」という。）がある。それらの蛋白質分子上の主な薬物結合サイトに、例えば、ＨＳＡではサイトＩ及びサイトIIの２個、ＡＧＰでは一つの結合サイトが存在している。更に、ＨＳＡには遊離脂肪酸の結合サイトがサイトII近傍に存在するため、遊離脂肪酸の増大によりサイトIIは著しく阻害される。この遊離脂肪酸は１日のうち数回大きな幅で変動することが知られている。加えて、肝障害時のビリルビンや腎障害時の尿毒症物質などの内因性物質による各結合サイトへの阻害の影響も重要である。
The strength of the pharmacological effect in vivo depends largely on the amount of free drug transferred to the target tissue,
One of its major regulators is serum protein binding. The drug absorbed in the living body moves to the circulating blood and then binds to various serum proteins to some extent. Among such serum proteins, there are human serum albumin (hereinafter referred to as “HSA”) and α 1 -acid glycoprotein (hereinafter referred to as “AGP”) that greatly influence the protein binding of the drug. At the main drug binding sites on these protein molecules, for example, there are two binding sites, Site I and Site II in HSA, and one binding site in AGP. Furthermore, since a free fatty acid binding site is present in the vicinity of site II in HSA, site II is significantly inhibited by an increase in free fatty acid. It is known that this free fatty acid fluctuates within a large range several times a day. In addition, the influence of inhibition on each binding site by endogenous substances such as bilirubin at the time of liver damage and uremic substances at the time of kidney damage is also important.
また、内因性物質以外でも蛋白結合力が強く血中濃度が高い薬物は、各々の結合サイトを阻害する場合があるため注意が必要である。もし遊離脂肪酸や結合阻害能を有する薬物等により特定の結合サイトが大きく阻害されれば、その結合サイトに結合していた薬物の遊離濃度は一時的に増加し薬効の増強を生じる可能性が高くなる。これは少ない投与量で薬効を高める効果的な投与法として積極的に利用できる。 In addition, drugs other than endogenous substances, which have a strong protein binding force and a high blood concentration, need to be noted because each binding site may be inhibited. If a specific binding site is largely inhibited by free fatty acids or drugs that inhibit binding, etc., the free concentration of the drug bound to the binding site is likely to increase temporarily and increase the efficacy. Become. This can be positively used as an effective administration method for enhancing the drug efficacy with a small dose.
本発明者らは、既に、血液中の血清を用いＨＳＡやＡＧＰの結合サイトの結合能の差異を利用し、血清内の微環境の変動を把握するための薬学的分布診断法を確立している（特許文献１）。 The present inventors have already established a pharmaceutical distribution diagnostic method for grasping fluctuations in the microenvironment in serum by using the serum in blood and utilizing the difference in binding ability of the binding sites of HSA and AGP. (Patent Document 1).
しかしながら、血清等の血液試料を用いる検査は患者に穿刺するため侵襲性が高く、頻繁に繰り返すことは困難である。肝障害や腎障害時に尿中に排泄される内因性物質においては、その尿中濃度変化を経時的に調べることによって、病態変化を非侵襲的に評価することが可能になるが、指標となる物質を尿中から抽出する操作を伴うため煩雑である。 However, tests using blood samples such as serum are highly invasive because they puncture patients and are difficult to repeat frequently. Endogenous substances excreted in the urine at the time of liver or kidney injury can be evaluated non-invasively by examining changes in the urine concentration over time, but it is an index. Since it involves an operation of extracting a substance from urine, it is complicated.
本発明の課題は、ＨＳＡやＡＧＰの結合サイトに対して特異的結合性を有している物質を非侵襲的、かつ簡便・迅速に測定するための方法及びキットを提供することである。 An object of the present invention is to provide a method and a kit for noninvasively, simply and rapidly measuring a substance having specific binding property to a binding site of HSA or AGP.
本発明の要旨は以下のとおりである。
（１）被検者の尿試料と、ＨＳＡ及びＡＧＰの少なくとも１種の蛋白質と、該蛋白質の結合サイトに対して特異的結合性を有しているサイト特異性プローブとを接触せしめ、前記サイト特異性プローブの遊離形の量を測定することを特徴とする尿検査方法。
（２）ＨＳＡ及び／又はＡＧＰの結合サイトに対して特異的結合性を有している物質の尿試料中の量を測定するために行う前記（１）に記載の方法。
（３）薬物又は内因性物質の蛋白質結合度を測定するために行う前記（１）又は（２）に記載の方法。
（４）前記（１）〜（３）のいずれかに記載の方法を実施するために用いるキットであって、ＨＳＡ及びＡＧＰの少なくとも１種の蛋白質と、該蛋白質の結合サイトに対して特異的結合性を有しているサイト特異性プローブを含む尿検査用キット。
The gist of the present invention is as follows.
(1) Contacting a urine sample of a subject with at least one protein of HSA and AGP and a site-specific probe having specific binding property to the binding site of the protein, A urinalysis method comprising measuring the amount of a free form of a specific probe.
(2) The method according to the above (1), which is carried out for measuring the amount of a substance having specific binding property to the binding site of HSA and / or AGP in a urine sample.
(3) The method according to (1) or (2), which is performed for measuring the protein binding degree of a drug or an endogenous substance.
(4) A kit used for carrying out the method according to any one of (1) to (3), wherein the kit is specific to at least one protein of HSA and AGP and a binding site of the protein. A kit for urinalysis comprising a site-specific probe having binding properties.
本発明によれば、ＨＳＡやＡＧＰの結合サイトに対して特異的結合性を有している物質を非侵襲的、かつ簡便・迅速に測定するための方法及びキットを提供することができる。本発明の方法及びキットを用いることにより、薬物の治療効果の予測、薬物の適切な選択・投与量の決定が可能になる。 ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the method and kit for measuring the substance which has specific binding property with respect to the binding site of HSA and AGP non-invasively, simply and rapidly can be provided. By using the method and kit of the present invention, it is possible to predict the therapeutic effect of a drug and to determine the appropriate selection and dosage of the drug.
本発明は、ＨＳＡやＡＧＰの結合サイトに対して特異的結合性を有している物質（薬物又はその他の有機化合物）を非侵襲的に測定するためのものであり、検査試料として尿試料を用いる。 The present invention is for noninvasively measuring a substance (drug or other organic compound) having a specific binding property to a binding site of HSA or AGP. A urine sample is used as a test sample. Use.
ネフローゼ症候群の患者のように、蛋白尿陽性の尿中にはＨＳＡやＡＧＰが含まれているが、腎機能が正常な患者の尿中にはＨＳＡやＡＧＰは含まれていない。 HSA and AGP are contained in urine positive for proteinuria, as in patients with nephrotic syndrome, but HSA and AGP are not contained in urine of patients with normal renal function.
尿試料は使用前に前処理、例えば、希釈や、濾過、留去、濃縮、妨害物質の不活性化、試薬の添加などをしてもよい。 The urine sample may be pretreated before use, such as dilution, filtration, distillation, concentration, inactivation of interfering substances, addition of reagents, and the like.
本明細書において「薬物」とは、生物学的な活性を期待されて利用されるものであれば何ら制限はないが、例えば治療目的で投与されるものなどが挙げられる。該薬物としては、合成医薬品、蛋白質、ペプチド、微生物、アミノ酸、核酸、ホルモン、ステロイド、ビタミン、抗生物質、治療薬、それらの代謝物などが挙げられる。該薬物としては、代表的には生体蛋白質（好ましくはＨＳＡ、ＡＧＰ）に存在する結合サイトに結合する活性を有するものあるいは該結合サイトに結合する部位を少なくとも一つ有するものが挙げられる。 In the present specification, the “drug” is not particularly limited as long as it is used in anticipation of biological activity, and examples thereof include those administered for therapeutic purposes. Examples of the drug include synthetic pharmaceuticals, proteins, peptides, microorganisms, amino acids, nucleic acids, hormones, steroids, vitamins, antibiotics, therapeutic agents, metabolites thereof, and the like. Examples of the drug typically include those having an activity of binding to a binding site present in a biological protein (preferably HSA or AGP) or those having at least one site binding to the binding site.
本発明においては、薬物又はその他の有機化合物等の物質に対する結合サイトを有している蛋白質として、ＨＳＡ及びＡＧＰの少なくとも１種の蛋白質を用いる。腎機能が正常な患者の尿中にはＨＳＡやＡＧＰは含まれていない。 In the present invention, at least one protein of HSA and AGP is used as a protein having a binding site for a substance such as a drug or other organic compound. HSA and AGP are not contained in the urine of patients with normal renal function.
ＨＳＡには複数の結合サイトが存在することが知られており、例えば以下のサイトに下記のような薬物又はその他の有機化合物が結合することが知られている。 It is known that a plurality of binding sites exist in HSA. For example, it is known that the following drugs or other organic compounds bind to the following sites.
ＨＳＡ分子上の結合サイト
１）サイトＩ：ワルファリン、フェニルブタゾン、ダンシル−Ｌ−アスパラギン、フェニトイン、アザプロパゾン、バルプロ酸、ジクマロール、インドメタシン、ブコローム、３−カルボキシ−４−メチル−５−プロピル−２−フランプロパン酸など
２）サイトII：ジアゼパム、Ｌ−トリプトファン、ダンシルサルコシン、イブプロフェン、バルプロ酸、サリチル酸、ジクマロール、インドメタシン、インドール酢酸、インドキシル硫酸など
３）サイトIII：ジギトキシンなど
４）ビリルビンサイト：ビリルビンなど
Binding site on HSA molecule 1) Site I: Warfarin, phenylbutazone, dansyl-L-asparagine, phenytoin, azapropazone, valproic acid, dicoumarol, indomethacin, bucolome, 3-carboxy-4-methyl-5-propyl-2- 2) Site II: Diazepam, L-tryptophan, dansyl sarcosine, ibuprofen, valproic acid, salicylic acid, dicoumarol, indomethacin, indoleacetic acid, indoxyl sulfate, etc. 3) Site III: digitoxin, etc. 4) Bilirubin site: bilirubin, etc.
また、ＡＧＰでは、例えば以下のサイトに下記のような薬物が結合することが知られている。 In AGP, for example, the following drugs are known to bind to the following sites.
ＡＧＰ分子上の結合サイト
１）塩基性薬物結合サイト：ベラパミル、クロルプロマジン、ジソピラミド、リドカインなど
２）酸性薬物結合サイト：ジクマロールなど
３）酸・塩基共通サイト：プロプラノロールなど
Binding sites on AGP molecules 1) Basic drug binding sites: verapamil, chlorpromazine, disopyramide, lidocaine, etc. 2) Acidic drug binding sites: Dicoumarol, etc. 3) Acid / base common sites: Propranolol, etc.
使用プローブ物質としては、ＨＳＡ又はＡＧＰの結合サイトに対して特異的結合性を有しているサイト特異性プローブを、目的に応じて１種又は２種以上組み合わせて用いることができるが、その物質同士の交叉反応により当該測定に悪影響を与えないものを組み合わせることが好ましい。 As a probe substance to be used, a site-specific probe having a specific binding property to the binding site of HSA or AGP can be used alone or in combination of two or more according to the purpose. It is preferable to combine those that do not adversely affect the measurement due to the cross reaction between them.
代表的な場合、フェニトイン、ジアゼパム及びジソピラミドの組合せなどが挙げられる。例えば、ＨＳＡ分子上の結合サイト、すなわち、サイトＩ、サイトII、サイトIIIなどに特異的に結合する物質を任意に選択し、同様にＡＧＰ分子上の結合サイトすなわち、塩基性薬物結合サイト、酸性薬物結合サイトなどに特異的に結合する物質を任意に選択し、それらのうちの複数のものを使用し、好適には複数の結合サイトにつき、その結合性（結合阻害）を定量することが挙げられる。 Representative examples include a combination of phenytoin, diazepam and disopyramide. For example, a substance that specifically binds to a binding site on the HSA molecule, ie, Site I, Site II, Site III, etc. is arbitrarily selected, and similarly, a binding site on the AGP molecule, ie, a basic drug binding site, acidic A substance that specifically binds to a drug binding site or the like is arbitrarily selected, and a plurality of them are used, and preferably the binding properties (binding inhibition) of the plurality of binding sites are quantified. It is done.
薬物又はその他の有機化合物としては、公知のものであってもあるいは新規なものであってもよいが、生体に存在する結合サイトを有する蛋白質に結合するものが挙げられ、例えば、メルク・インデックス (Susan Budavari (Ed.), The Merck Index: an encyclopedia of chemicals, drugs, and biologicals, 13th Edition, Whitehouse Station, N.J.: Merck Research Laboratories Division of Merck, 2001) などに記載のものなどが挙げられる。 The drug or other organic compound may be a known one or a new one, and examples thereof include those that bind to a protein having a binding site existing in a living body, for example, Merck Index ( Susan Budavari (Ed.), The Merck Index: an encyclopedia of chemicals, drugs, and biologicals, 13th Edition, Whitehouse Station, NJ: Merck Research Laboratories Division of Merck, 2001).
本発明方法では、尿試料と、ＨＳＡ及びＡＧＰの少なくとも１種の蛋白質と、該蛋白質の結合サイトに対して特異的結合性を有しているサイト特異性プローブとを接触せしめる。この際の混合の順序は特に制限されない。例えば、尿試料に、ＨＳＡ及びＡＧＰの少なくとも１種の蛋白質、前記サイト特異性プローブを順次添加してもよく、また、ＨＳＡ及びＡＧＰの少なくとも１種の蛋白質を含む水溶液、例えば緩衝液に、前記サイト特異性プローブ、尿試料を順次添加してもよい。 In the method of the present invention, a urine sample, at least one protein of HSA and AGP, and a site-specific probe having a specific binding property to the binding site of the protein are contacted. The order of mixing at this time is not particularly limited. For example, at least one protein of HSA and AGP and the site-specific probe may be sequentially added to a urine sample, and the aqueous solution containing at least one protein of HSA and AGP, for example, a buffer solution, A site-specific probe and a urine sample may be added sequentially.
異種サイト特異性プローブ間の相互作用を防止する点から、サイト特異性プローブの添加濃度はＨＳＡ及びＡＧＰの添加濃度の１／１０以下にすることが好ましく、１／２０以下にすることが更に好ましい。 From the viewpoint of preventing the interaction between different site-specific probes, the concentration of the site-specific probe is preferably 1/10 or less, more preferably 1/20 or less of the concentration of HSA and AGP. .
また、添加試料によって増加した各サイト特異性プローブの遊離率をサイト間で一律に評価できる点から、各サイト特異性プローブは、ＨＳＡ及びＡＧＰへの結合能がほぼ同じものを選択することが好ましい。 In addition, it is preferable to select the site-specific probes having substantially the same binding ability to HSA and AGP from the viewpoint that the release rate of each site-specific probe increased by the added sample can be uniformly evaluated between the sites. .
本発明の分析方法の具体例の概略を図１、２、４及び５に示す。
例えば、図４に示す方法では、ＨＳＡ、ＡＧＰ及び各種サイト特異性プローブを含有する緩衝液を調製し、経時的に採取した一定量の尿試料Ａ１とＡ２を添加する。その後、それらを限外濾過し、得られたろ液より、各種サイト特異性プローブの遊離濃度を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、標識イムノアッセイ法、液体クロマトグラフ質量分析（ＬＣ−ＭＳ）等で測定する。添加した尿試料中には血液から除去された尿毒症物質（例えば、インドール酢酸、インドキシル硫酸、３−カルボキシ−４−メチル−５−プロピル−２−フランプロパン酸）や遊離脂肪酸などの内因性物質が多く含まれており、それらの物質によりＨＳＡとＡＧＰの結合サイトに結合していたサイト特異性プローブが置換され遊離サイト特異性プローブ濃度が増大する（この逆の結合増強も起こる）。これら各種サイト特異性プローブの結合阻害の程度や変動パターンと尿の生化学検査値及び透明度・色などの変化の関係を解析することで、体内で生じている動態学的変化を尿中内の経時的変化から把握することができる。
Outlines of specific examples of the analysis method of the present invention are shown in FIGS.
For example, in the method shown in FIG. 4, a buffer solution containing HSA, AGP and various site-specific probes is prepared, and a certain amount of urine samples A1 and A2 collected over time are added. Thereafter, they are ultrafiltered, and the free concentrations of various site-specific probes are measured from the obtained filtrate by high performance liquid chromatography (HPLC), labeled immunoassay, liquid chromatograph mass spectrometry (LC-MS) or the like. . In the added urine sample, endogenous substances such as uremic substances removed from blood (for example, indoleacetic acid, indoxyl sulfate, 3-carboxy-4-methyl-5-propyl-2-furanpropanoic acid) and free fatty acids Many substances are contained, and the site-specific probes bound to the binding sites of HSA and AGP are displaced by these substances, and the concentration of free site-specific probes increases (the reverse binding enhancement also occurs). By analyzing the relationship between the degree and fluctuation pattern of binding of these site-specific probes and changes in biochemical test values, transparency, and color of urine, kinetic changes occurring in the body can be analyzed in the urine. It can be grasped from changes over time.
なお、ネフローゼ症候群の患者のように、蛋白尿陽性の尿試料には、ＨＳＡ及びＡＧＰが含まれているので、尿試料中のＨＳＡ及びＡＧＰが検査結果に影響するのを防止する必要がある場合には、尿試料の添加量を一定量以下にすることが好ましい。 If the proteinuria-positive urine sample contains HSA and AGP, as in patients with nephrotic syndrome, it is necessary to prevent the HSA and AGP in the urine sample from affecting the test results. In this case, it is preferable that the amount of the urine sample added is not more than a certain amount.
以下、実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example is given and this invention is demonstrated further more concretely, the scope of the present invention is not limited to these Examples.
（実施例１）
（方法）
健常人から採取した尿（Ａ）にＨＳＡを溶解して疑似ネフローゼ尿を調製した（Ａ１；ＨＳＡ１００μＭ、Ａ２；ＨＳＡ３００μＭ）。また、別の健常人から採取した尿（Ｂ）についても同様に疑似ネフローゼ尿を調製した（Ｂ１；ＨＳＡ１００μＭ、Ｂ２；ＨＳＡ３００μＭ）。ＨＳＡの薬物結合サイトの結合能を評価するために、各サイト特異性プローブとして、ワルファリン（サイトＩ）及びイブプロフェン（サイトII）を最終濃度が１０μＭとなるように疑似ネフローゼ尿に添加して、試験液を調製した。試験液を限外ろ過して得たろ液中の各サイト特異性プローブ濃度（遊離形濃度）をＨＰＬＣを用いて測定し、遊離形分率を求めた。
Example 1
(Method)
Pseudonephrotic urine was prepared by dissolving HSA in urine (A) collected from a healthy person (A1;
サイト特異性プローブの遊離形分率＝［サイト特異性プローブの遊離形濃度］／［サイト特異性プローブ総濃度（１０μＭ）］ Free form fraction of site-specific probe = [free form of site-specific probe] / [total concentration of site-specific probe (10 μM)]
ＨＰＬＣ測定条件
移動相；アセトニトリル：０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．７）＝３５：６５
カラム；Ｓｕｎｎｉｅｓｔ Ｃ１８（５μｍ）４．６ｍｍ ｉ．ｄ．×１５０ｍｍ
カラム温度：４０℃
流速；０．５ｍｌ／ｍｉｎ
測定波長；ワルファリン（励起波長３０９ｎｍ、蛍光波長４０５ｎｍ）、イブプロフェン（励起波長２２３ｎｍ、蛍光波長２８５ｎｍ）
HPLC measurement condition mobile phase; acetonitrile: 0.1 M acetate buffer (pH 5.7) = 35: 65
Column; Sunnyest C18 (5 μm) 4.6 mm i. d. × 150mm
Column temperature: 40 ° C
Flow rate: 0.5 ml / min
Measurement wavelength: warfarin (excitation wavelength 309 nm, fluorescence wavelength 405 nm), ibuprofen (excitation wavelength 223 nm, fluorescence wavelength 285 nm)
患者個々の経時的病態変化を想定した場合の本発明の分析方法の一例の概略を図１に示す。
患者ＡとＢの比較を想定した場合の本発明の分析方法の一例の概略を図２に示す。
FIG. 1 shows an outline of an example of the analysis method of the present invention in a case where changes in pathological conditions of individual patients are assumed.
FIG. 2 shows an outline of an example of the analysis method of the present invention when comparison between patients A and B is assumed.
（結果）
結果を図３に示す。
（１）Ａ１とＡ２又はＢ１とＢ２における各サイト特異性プローブの遊離形分率の差異は、患者の腎臓の病態が変化したこと（この場合は腎尿細管へ漏出したＨＳＡ濃度の変化）を示す。したがって、サイト特異性プローブの遊離形分率の変化を経時的に調べることによって、患者の病態の重症度を評価することが可能になる。
(result)
The results are shown in FIG.
(1) The difference in the free fraction of each site-specific probe in A1 and A2 or B1 and B2 is that the pathology of the patient's kidney has changed (in this case, the change in the concentration of HSA leaked to the renal tubule) Show. Therefore, it is possible to evaluate the severity of the patient's pathological condition by examining the change in the free form fraction of the site-specific probe over time.
（２）Ａ１とＢ１又はＡ２とＢ２における各サイト特異性プローブの遊離形分率の差異は、ＡとＢの尿中物質の量や割合が異なることを示す。 (2) The difference in the free fraction of each site-specific probe in A1 and B1 or A2 and B2 indicates that the amount and ratio of A and B urine substances are different.
（３）（１）と（２）における各サイト特異性プローブの遊離形分率の差異からは、患者の病態や尿中物質の変化を簡便に評価することが可能になるが、これらの結果から薬物投与計画を企てることも可能になる。例えば、薬理作用部位が腎尿細管中にある薬物で、特に蛋白結合性の高い薬物（利尿薬など）は、尿細管中でＨＳＡと強く結合すると薬理効果に影響する遊離形濃度（蛋白非結合形濃度）が低下し、薬理作用部位への移行が減少するため治療効果が減弱する。この薬物の効果的な投与計画を（１）のケースで考えてみると、各サイト特異性プローブの遊離形分率は、Ａ２よりもＨＳＡ濃度の低いＡ１（又はＢ２よりもＢ１）において大きいことから、Ａ１（又はＢ１）の状態で薬物を投与すると薬物とＨＳＡの結合が阻害されて遊離形濃度が上昇するため、治療効果も増強する可能性が高くなる。次に、（２）のケースで考えてみると、各サイト特異性プローブの遊離形分率は、Ａ１よりもＢ１（又はＡ２よりもＢ２）において大きいことから、Ｂ１（又はＢ２）の状態で薬物を投与すると、薬物とＨＳＡの結合が阻害されて遊離形濃度が上昇するため、治療効果も増強する可能性が高くなる。 (3) From the difference in the free fraction of each site-specific probe in (1) and (2), it becomes possible to easily evaluate the patient's pathology and urinary substance changes. It is also possible to plan drug administration plans. For example, drugs whose pharmacological site of action is in renal tubules, especially drugs with high protein binding properties (diuretics, etc.) are free concentrations (protein non-binding) that affect pharmacological effects when strongly bound to HSA in tubules The therapeutic effect is diminished because the form concentration is reduced and the transition to the pharmacological site of action is reduced. Considering the effective administration schedule of this drug in the case of (1), the free form fraction of each site-specific probe is larger in A1 (or B1 than B2) where the HSA concentration is lower than A2. Therefore, when a drug is administered in the state of A1 (or B1), the binding between the drug and HSA is inhibited and the free form concentration increases, so that the possibility of enhancing the therapeutic effect is increased. Next, in the case of (2), since the free form fraction of each site-specific probe is larger in B1 (or B2 than A2) than in A1, in the state of B1 (or B2) When a drug is administered, the binding between the drug and HSA is inhibited and the free form concentration increases, so that the possibility of enhancing the therapeutic effect is increased.
（実施例２）
（方法）
ＨＳＡ２０μＭ、ＡＧＰ２０μＭを６７ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解し、これらの薬物結合サイトに結合する各サイト特異性プローブ（２μＭ）を添加して試験液（３００μＬ）を調製した。サイト特異性プローブは、ＨＳＡのサイト特異性プローブとして、ワルファリン（サイトＩ）及びイブプロフェン（サイトII）を用い、ＡＧＰのサイト特異性プローブとして、ベラパミルを用いた。次に、この試験液に一定量（１００μＬ）の試料（３人の健常男性から採取した尿Ａ、Ｂ、Ｃを用いた。コントロールには緩衝液を用いた。）を添加し、限外ろ過法により得たろ液中の各サイト特異性プローブ濃度（遊離形濃度）をＨＰＬＣを用いて測定し、遊離形分率を求めた。
(Example 2)
(Method)
20 μM of HSA and 20 μM of AGP were dissolved in 67 mM phosphate buffer (pH 7.4), and each site-specific probe (2 μM) that binds to these drug binding sites was added to prepare a test solution (300 μL). As site-specific probes, warfarin (site I) and ibuprofen (site II) were used as site-specific probes for HSA, and verapamil was used as a site-specific probe for AGP. Next, a fixed amount (100 μL) of a sample (urine A, B, C collected from three healthy men was used. A buffer was used as a control) was added to the test solution, and ultrafiltration was performed. The concentration of each site-specific probe (free form concentration) in the filtrate obtained by the method was measured using HPLC, and the free form fraction was determined.
サイト特異性プローブの遊離形分率＝［サイト特異性プローブの遊離形濃度］／［サイト特異性プローブ総濃度（２μＭ）］ Free form fraction of site-specific probe = [free form concentration of site-specific probe] / [total concentration of site-specific probe (2 μM)]
ＨＰＬＣ測定条件
移動相；アセトニトリル：０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．７）＝３５：６５
カラム；Ｓｕｎｎｉｅｓｔ Ｃ１８（５μｍ）４．６ｍｍ ｉ．ｄ．×１５０ｍｍ
カラム温度；４０℃、
流速；０．５ｍｌ／ｍｉｎ
測定波長；ワルファリン（励起波長３０９ｎｍ、蛍光波長４０５ｎｍ）、イブプロフェン（励起波長２２３ｎｍ、蛍光波長２８５ｎｍ）、ベラパミル（励起波長２７８ｎｍ、蛍光波長３１２ｎｍ）
HPLC measurement condition mobile phase; acetonitrile: 0.1 M acetate buffer (pH 5.7) = 35: 65
Column; Sunnyest C18 (5 μm) 4.6 mm i. d. × 150mm
Column temperature: 40 ° C.
Flow rate: 0.5 ml / min
Measurement wavelength: warfarin (excitation wavelength 309 nm, fluorescence wavelength 405 nm), ibuprofen (excitation wavelength 223 nm, fluorescence wavelength 285 nm), verapamil (excitation wavelength 278 nm, fluorescence wavelength 312 nm)
経時的に採取した試料（Ａ１とＡ２）を用いて、各サイト特異性プローブ遊離形分率の変化から試料に含まれる物質量の経時変化を評価する場合の本発明の分析方法の一例の概略を図４に示す。 Outline of an example of the analysis method of the present invention when evaluating temporal changes in the amount of a substance contained in a sample from changes in each site-specific probe free form fraction using samples (A1 and A2) collected over time Is shown in FIG.
含有物質や量が不明な複数の試料（ＡとＢ）を用いて、各サイト特異性プローブ遊離形分率の変化から各試料に含まれる物質量の多少を評価する場合の本発明の分析方法の一例の概略を図５に示す。 Analysis method of the present invention in the case where a plurality of samples (A and B) whose contained substances and amounts are unknown are used to evaluate the amount of a substance contained in each sample from a change in each site-specific probe free form fraction An outline of an example is shown in FIG.
尿の評価の場合は、尿中尿素窒素（ＵＮ）濃度（血中ではＢＵＮ濃度）を生化学検査値として測定することで、尿毒症物質を含む尿中物質の総濃度をおおよそではあるが推察できる。 In the case of urine evaluation, the total concentration of urinary substances including uremic substances is estimated by measuring the urinary urea nitrogen (UN) concentration (BUN concentration in blood) as a biochemical test value. it can.
（結果）
結果を図６に示す。
（１）尿Ａ、Ｂ、Ｃにおいて、ワルファリンとベラパミルの遊離形分率はコントロールに対して大きくなり、イブプロフェンの遊離形分率はコントロールに対して著しく増大した。これより、尿Ａ、Ｂ、Ｃには、ＨＳＡやＡＧＰの結合に影響する物質が存在し、特に、サイトIIに結合する物質が多量に存在するか、又はサイトIIに対する結合定数の大きな物質が存在することが示唆された。実際、尿中には腎から排泄された尿毒症物質であるインドール酢酸やインドキシル硫酸のようなサイトIIに強く結合する物質が存在する。本診断法により、尿毒症物質を含む尿中物質の存在を類推できる。
(result)
The results are shown in FIG.
(1) In urine A, B, and C, the free form fractions of warfarin and verapamil were greater than the control, and the free form fraction of ibuprofen was significantly increased relative to the control. As a result, in urine A, B, and C, there are substances that affect the binding of HSA and AGP. In particular, there are substances that bind to Site II in large quantities, or substances that have a large binding constant for Site II. It was suggested to exist. In fact, there are substances in the urine that strongly bind to Site II, such as indoleacetic acid and indoxyl sulfate, which are uremic substances excreted from the kidney. By this diagnostic method, the existence of urinary substances including uremic substances can be inferred.
（２）尿Ａ、Ｂ、Ｃに存在する蛋白結合に影響する尿中物質の量の多少について考えてみると、ワルファリン、イブプロフェン及びベラパミルの遊離形分率は、それぞれ尿Ｂ、尿Ｃ及び尿Ｃが最も高かったことから、尿ＢはサイトＩに結合する尿中物質の量が最も多いこと、尿ＣはサイトIIとＡＧＰに結合する尿中物質の量が最も多いこと、尿Ａは蛋白結合に影響する尿中物質の量が３つの試料の中で最も少ないことがわかった。これは、尿中に排泄される種々の尿中物質の量は個人の生体環境によって異なっているためであり、本診断法により、各結合サイトに結合する尿毒症物質を含む尿中物質の量の多少についても調べることが可能になった。 (2) Considering the amount of urinary substance that affects protein binding in urine A, B, and C, the free form fractions of warfarin, ibuprofen, and verapamil are urine B, urine C, and urine, respectively. Since C was the highest, urine B had the highest amount of urinary substance binding to site I, urine C had the highest amount of urinary substance binding to site II and AGP, and urine A was protein It was found that the amount of urinary material affecting binding was the lowest of the three samples. This is because the amount of various urinary substances excreted in the urine varies depending on the individual's biological environment. By this diagnostic method, the amount of urinary substances including uremic substances that bind to each binding site. It became possible to investigate about some of.
（３）尿Ａ、Ｂ、Ｃの尿中尿素窒素（ＵＮ）濃度（血中ではＢＵＮ濃度）は、尿Ａが３７８ｍｇ／ｄＬ、尿Ｂが３５６ｍｇ／ｄＬ、尿Ｃが４４６ｍｇ／ｄＬであり、尿Ｃが最も高かった。この結果は、尿Ｃが尿Ａや尿Ｂよりも各々の結合サイトの結合を最も強く阻害する要因の１つであることを予測させる。 (3) The urinary urea nitrogen (UN) concentration (BUN concentration in blood) of urine A, B, and C is 378 mg / dL for urine A, 356 mg / dL for urine B, and 446 mg / dL for urine C. Urine C was the highest. This result predicts that urine C is one of the factors that most strongly inhibits the binding of each binding site than urine A and urine B.
（実施例２の補足）
本診断法は、試料の液量が少量であっても試料中に含まれる物質の量的変化を評価することが可能であること、また、ＨＳＡやＡＧＰは試料の液量よりも多い緩衝液中に存在するため、蛋白質が試料の液性の影響を受けることがなく、サイト特異性プローブの遊離形濃度変化を正確に評価することが可能になるなど、これまでみられなかった画期的な分析法である。また、必要に応じて高感度かつ安定した評価を行うために、使用するサイト特異性プローブや測定条件を変更・追加することもできる。
(Supplement to Example 2)
This diagnostic method is capable of evaluating quantitative changes in substances contained in a sample even when the amount of the sample is small, and HSA and AGP are buffer solutions with a larger amount than the sample. The protein is not affected by the liquidity of the sample, making it possible to accurately evaluate changes in the free form of the site-specific probe. It is a simple analysis method. Moreover, in order to perform highly sensitive and stable evaluation as necessary, the site-specific probe to be used and measurement conditions can be changed or added.
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